JPS5916874A - エトサクシミド免疫原、抗体、標識化複合体および関連誘導体 - Google Patents
エトサクシミド免疫原、抗体、標識化複合体および関連誘導体Info
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- JPS5916874A JPS5916874A JP58095108A JP9510883A JPS5916874A JP S5916874 A JPS5916874 A JP S5916874A JP 58095108 A JP58095108 A JP 58095108A JP 9510883 A JP9510883 A JP 9510883A JP S5916874 A JPS5916874 A JP S5916874A
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、生物学的液体のような液体媒体重の工ｌ・サ
クシミドを測定するための免疫試験に適する新規なエト
サクシミド：Ａ導体に関する。この誘導体は、慣用的手
法により、宿主動物中において、エトサクシミドに対す
る抗体の産生を刺激するのに用いられるエトサクシミド
免疫原からなる。また、特定の免疫試験において、エト
サクシミド抗体とともに、試薬として用いられる標識化
工］・サクシミド複合体が提供される。さらに、前述の
、免疫原および標識化複合体の合成における中間体が提
供される。 エトサクシミド ［２−エチル−２−メチルサクシンイ
ミド、メルク争インデンクス （Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ
Ｉｎｄｅｘ ）第９版、４８３頁（１９７Ｂ）参照］は
、式：の鎮痙薬剤である。 大多数の鎮痙薬剤のように、エトサクシミドは低い治療
指数を有し、しかも、血液中の薬剤濃度範囲が、それぞ
れ、効果なし、治療効果ありまたは毒性ありに、明確に
区別されている。十分に高い濃度では、この薬剤は、潜
在的に有毒であり、かつ、体外へ枯山されるが、その排
出速度は個々によって広範囲に変化しうるので、同一投
与量が、被投与者次第で、効果なし、治療効果あり。 またはｙｌｆ性ありになりうる。かくして、各患者にお
いて、正しい投与量を知るために、血液中の薬剤濃度を
監視することが望ましい。 免疫試験によるエトサクシミドのＪｌｌｌ定は周知であ
る。血清エトサクシミドおよびプラズマエトサクシミド
を測定するために、市販の゛免疫試験用試験キントが人
手可能である。薬剤を含有する種々の分析対象物を測定
するための均一系免疫試験は米国特許第４，２７９，９
９２号；第４，２３［１，５８５号；および第３，８１
７，８３７号ならびに英国特許第１，５５２．Ｈ７号に
記載されている。 動物において、薬剤に対する抗体の産生を刺激するのに
有用な、従来の免疫性担体材に結合したエトサクシミド
からなる免疫原複合体は文献に示唆されている。英国特
肋明Ａｍ ｆ’ｒ第１，５１１，５７１ 号は、薬剤が
、そのＮ−５位において、またはＣ−２のアルキル置換
基の１つを介して担体へ連結しているエトサクシミド免
疫原を提案している。１−１本特許公開明細書第５１１
ｔ−０４６，８２０号 ［テルウェント（Ｄｅｒｗｅｎ
ｔｌ第４４７４２Ｄ／２５号１は、薬剤がＣ−２のエチ
ルｉ０換基を介して特定のフェニレン連結基と連結して
いるエトサクシミド免疫原について記載している。薬剤
のようなハプテン類に対する抗体を産生ずることについ
ての技術水へ１マは、ワインリブ等（Ｗｅｉｎｒｙｂ
ｅｔ ａｊｌ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ １０ｉ ：２７１頁（１９７９） ；プレ
イフェアＱ’ｐ （Ｐｌａｙｆａｉｒ ｅｔａｌｌ
、 Ｂｒ、Ｍｅｄ、Ｂｕｌｌ、３０巻：２４頁（＋９７
４）； プロートン等ｔＢｒｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔａｔ
） 、 Ｃｌ１ｎ、ＣｈｅＩｌｌ、２２巻ニア２８頁（
＋９７［１）、およびパトラ−（Ｂｕｔｌｅｒ） Ｊ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ。 Ｍｅｔｈ、７＠：１頁（＋９７５）により提示されてい
る。 標識物質と結合した、分析対象物もしくは誘導体、また
は、他のそれらの類縁体からなる標識化複合体は、例え
ば、標識が蛍光原性酵素Ｊ＆質β−ガラクトシル−ウン
ベリフェロンである前述の米国特許第４，２７９，９９
２号ならびに米国特許第４．！［１２゜８５６号；第４
，２５９，２３３号；および第４，２９２，４２５−号
の文献に種々記載されている。 本発明は、Ｃ−３位での、薬剤との結合または誘導体化
を包含する、エトサクシミド免疫試験に用いるための試
薬を提供することを特徴とする。その３−位で免疫性担
体材と共イ１結合しているハプテン性薬剤からなる１本
発明のエトサクシミド免疫原は、有利な交差反応特性を
有する抗体の産生を刺激する。元の薬剤に置換基が全く
ない３−位において、薬剤と結合することにより、免疫
原複合体は、薬剤」二のいかなる官能基または１別基を
修正することなしに製造される。 （！ｒましい実施態様においては、本発明は３−置換エ
トサクシミド試薬の製造における新規な中間体を提供す
る。本発明の新規な抗体を用いて、エトサクシミド測定
用の改良された、免疫試験法および試薬もまた提供され
る。本発明は、また、かかる免疫試験の特に好ましい実
施態様のための標識化エトサクシミド複合体をも提供す
る。 本発明は、すべての相互に関連する実施態様において、
３−置換エトサクシミド誘導体の製造に焦点をあわせて
おり、これらの誘導体は、次いで、慣用される担体材に
結合することにより免疫原を形成することに用いられ、
次いで、エトサクシミド抗体を得るために用いられ、ま
た、工トザクシミド免疫試験において、検出試薬として
働く標識化複合体を形成するのに用いられる。 エトサクシミド 言 原 本免疫原は、一般式： （式［１）、Ｒは、適切な連結ノんであり、Ｔは、従来
の免疫性１［１体材であり、かつ、ｐは担体に結合して
いるエトザクシミ１部分の数である）をイＴする。数Ｐ
は、しばしば、免疫原のエピトープ密度（Ｅｐｉｔｏｐ
ｉｃ ｄｅｎｓｉｔｙ）と呼ばれ１通常の状態では。 ｉＦ均して、ｌから約５０までであり、さらに普通には
、ｌから約２５となるであろう。免疫原の合成および抗
体応答の容易さおよび再現性を考慮すれば、最適のエピ
トープ密度は、約２および約２０の間、さ）に通常には
、５と１５の間になる。 免疫性担体材は、従来公知のもののいずれからも選択す
ることができる。十分な大きさおよび免疫性を有する、
炭水化物類、多糖類、リポ多糖類、核酸類等のような他
の材料もまた同様に用いることができるが、はとんどの
場合、担体は蛋白質またはポリペプチドであろう。大部
分、免疫性蛋白質類およびポリペプチド類は、’５，０
００およびＩＱ 、０００．０００間の、好ましくは、
１５，０００より大きい、および、さらに通常には、５
０，０００より大きい分子量を有するであろう。通常、
一つの動物種から取り出された蛋白質類は、他の種の血
液流に導入された際、免疫性を示すであろう。特に、有
用な蛋白質類は、アルブミン類、グロブリン類、酵素類
、ヘモシアニン類、グロブリン類、例えば、グリコ蛋白
質類のような有為の非蛋白質性成分を有すζ蛋白質類等
である。分子量が、３０，０００おより ２００．００
０の間であるアルブミン類およびグロブリン類は、特に
、ｔＩｆましい。さらに、従来の免疫性担体材およびハ
プテン類を、それらに結合させるだめの方法に関する技
術水準については、次のものを参照してもよい： パー
カー （Ｐａｒｋｅｒｌ、Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａ７ ｏｆ 旧ｏ１ｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔ
ｉｔｅ Ｃｏｍ−■エリ」、プレンティス−ホール（
イングルウ・ンド・クリフス、ニューやシャーシー、ア
メリカ合衆国（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−１１ａｌｌ（Ｅｎｇ
ｌｅｗｏｏｄ Ｃｌ１ｆｆｓ、Ｎｅｗ ＪｅｒｓｅｙＵ
ＳＡ、１９７１３） ）；へトラ−（ＢｕｔｌｅｒｌＪ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ。 ７巻：１−２４頁（１９７５） ；ワインリブおよびシ
ュロフ（Ｗｅｉｎｒｙｂ ａｎｄ ５ｈｒｏｆｆ ｌ
Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ、Ｒｅｗ、ｌＯ＠ ：２７１−２
８３頁（１９７５） ；プロートンおよびストロング（
Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｏｎｇ ｌ、 Ｃ
ｌ１ｎ、Ｇｈｅｌｌ、 ２２巻ニア２Ｂ−７３２頁（１
９７８） ； ならびに、プレイフェア等１Ｐｌａｙ
ｆａｉｒ’ｅｔ ａｊｌ、Ｂｒ、Ｍｅｄ、Ｂｕｌｌ、
３０巻：２４−３１頁（１１１７４）。 適切な３−置換エトサクシミド誘導体は周知の手法によ
り、免疫性担体材に結合可能である。例えほ、３−カル
ボキシル基、（化エトサクシミＨ： Ｂ４誘導は、圏…
凰」、グンドマンおよびマイエンホンファー＃ｌｌｌ
＋ シ”１ン・ワイリー・アント拳すンスにニューヨー
ク １９７７ ）（ｅｄ、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｍ
ｅｉｅｎ−ｈｏｆｅｒ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７？）ｌｆｉ頁以
降に記載されているような標準ペプチドチ１４合生成反
応により、アミ７基を有する免疫性担体に結合させるこ
とができる。３−チオールノＡ化エトサクシミド誘導体
は、ジスルフィド交換反応［マーヂン等 （Ｈａ を日
ｎ ｅｔ ａｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ２０巻：４
２２９頁（＋９８１）］ により、ヂオール基を有する
担体に伺加させることができる。またリウ等 （１，ｉ
ｕ ｅｔ ａｌ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １８巻・６８０
頁（１９７９）Ｉこより記■成されたものと同様の方法
で、チオールハを反応体の一力に誘導し、かつ、ヤレイ
ミト基を他力ｉこ誘導して、両者を−Ｘに結合させるこ
とができる。３−アミノ基化エトサクシミド ［工ールネ等（八ｈｅｒｎｅ ｅｔ ａｔ）Ｂｒｉｔ．
ｊ．ＣＩｉｎ．Ｐｈａｒｍ。 ３−ａ：５６＋頁（１９？ｆ（））］、混合隼水物類［
エルランガ− 等 （Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａ
ｔ）、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙウィリ
アムスおよＵチェ４２編アカデミツク令プレス （ニュ
ーヨーク ＋９６７）（ｅｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａ
ｎｄ Ｃｈａｓｅ，八ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
（ ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９ｆｉ７）ｌ ！４９
頁］のようなアミド結合生成反応を包含するもの、なら
びに酸アジドおよび活１′１エステル反１イス〔コンプ
ル（ＫｏｐＰＩＩｌ！ｌ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄＡ
ｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ タブリュー・エイφペンジア
ミンにニューヨーク ｌＨ６Ｈ’１１．八．Ｂｅｎｊａ
ｍｉｎ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９８１３）１１ より、
カルボキシル基１（をイ１する１１！体へ結合させるこ
とができる。ＣＩ ｉｎ．ｃｈｅｍ．２２巻 ・７２８
頁（１９７６）も参照されたい。同様に、アミン誘導体
も、ビスーイソシアネ−１・類、ビス−イミドエステル
類，およびタルクールアルデヒドのような従来の２官能
性試薬を用いて、アミン基を右する１１！体へ結合させ
ることができる［ Ｉ ｍ ｍ ｕ ｎ ｏ ｃ ｈ
ｅ ｍ 、 ８ 巻：５３頁（ １９８９） ｌ 、
、１ｍｌ ップル（Ｘｏｐｐｌｅ）同上：ならびにロウ
エおよびテ４ − ン（Ｌｏｗｅ ａｎｄ Ｄｅａｎ）
、 ＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａ ｂｙ
ジゴン・ワイリー・アントサンスにニューヨーク １９
７４）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（Ｎ
ｅｗＹｏｒに１９７４））もまた参照されたい。本発明
の種々の３−エトサクシミド誘導体を，慣用される免疫
性担体材と結合させるために、数多くの他の結合力法が
、通常の当業名にとって利用可能である。 特に、 ＩＩＴましいものは、式： （式中，Ｙはアミド基すなわち一旧＋ＣＯ−、Ｔは免疫
性蛋白質または免疫性ポリペプチド、ｎは１から１０ま
での整数、かつ、ｐは平均してｌから担体上の利用しう
るアミド結合部分の数までであり、好ましくは、」二に
定義したとうりである）の工ｉ・サクシミド免疫原であ
る．アミド結合基は、次の２つの可能な方法のいずれか
により適応さゼてもよく、その１つは、アミド基中の窒
素原子が担体アミノ基からのものであり、かつ、炭素原
子が適ジノなエトサクシミド誘導体（例えば、カルボン
酸）からのものであり、ｐは、したがって、Ｊｔ４体中
の結合アミン基の平均数を表わす（Ｕましくは、−にに
定義したとうりである）ものであり、もう１つは、窒素
原子が適し」な工ｌ・サクシミド誘導体（例えば、アミ
ノＦＪ ｙＩ体′）からのものであり、かつ、炭素原子
が担体カルボキシル基からのものであり、ｐは、したが
って、扛！体中の結合カルボキシル基の平均数を表わす
（＆ｆましくは，再び、上に定義したとラリである）も
のである。 エトサクシミ ド打 本免疫原複合体を用いての、特異的抗体の産生け、いか
なる従来手法に従ってもよい。抗体生成を誘導する基本
的な！ハ１様を記載した数多くのテキストが入手可能で
あり、例えばパーカー（Ｐａｒｋｅｒ）Ｒａｄｉｏｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｃａｍ−ｐｏｕｎｄｓ ７
’レンチスーホール（イングルウｙ ｌ” ｅクリフス
、ニュー・シャーシー、アメリカ合衆国１９７Ｂ）（Ｐ
ｒｅ’ｎｔｉｃｅ−１１ａｌｌ （ Ｅｎｇｌｅｗｏｏ
ｄ Ｃｌｉｆｆｓ， ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ，１
９７Ｅｌ））を参ｊ（ｑ してもよい。通常の場合、ラ
ビッ′ト、ヤギ、マウス、モルモア）、またはウマのよ
うな宿主動物に、ｌまたはそれ以上の種々の部位に、通
ｔθ、アジュバントとの混合物の状ｙｌ）で、免疫原複
合体を注射する。さらに、注Ｑ４を、同一・部位にまた
は異なる部位に、定期的間隔でまたは不定期的間隔で施
こした後、最適の適宜量が達成されたと測定されるまで
、抗体滴定量を評価するために採血される。宿主動物を
採血すると、適νＪ量の特異的抗血清が得られる。必要
ならば、抗」ｒｌ′ｌ清が、実際の試験の遂行に用いる
のに適νｊだと考えられる前に、非特異的抗体のような
望ましくない物質を除去するために、精製工程を行って
もよい。 抗体は、体細胞融合反応法 （Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌ
ｌｈ７ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
）によっても得られ、かかる抗体は、通常、モノクロ
ナール抗体と呼ばれる６かかるモノクロナール抗体法に
ついての概説は、Ｌ！五ｈｏｃｙｔｅ ｌｌｙｂｒｉｄ
ｏｍａｓ 、 メルチャーズ等編、スプリンカーーフェ
ルラーグにューヨーク１９７８）（ｅｄ、Ｍｅｌｃｈｅ
ｒｓ ｅｔ ａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（
ＮｅｗＹｏｒｋ １９７Ｂ）ｌ； Ｎａｔｕｒｅ
２ＢＢ−巻 ２４９５頁（１９？？）。 ５ＣＩｅｎＣＩ！ ２０８巻：６９２頁（＋９１１Ｑ
）、およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
７３巻（パーｌ−８）：３−４８頁（１９８１）に見
出される。 ３−置 エトツクシミ１ζ誘導体 薬剤エトサクシミド（１）（２−エチル−２−メチルサ
クシンイミド）は、下記のようにして、合成する。 メチルエチルケトン（２）はエチルシアノアセテート（
３）と縮合して、不飽和のシアノエステル（４）を生成
する。これは１．シアン化物イオンと反応して、ジニト
リル（５）を生成し、これを、硫酸で処理すると、脱カ
ルボエトキシ化および閉環を行って、エトサクシミド（
１）を生成する［モレルおよび７オウＤ −Ｆ’ （Ｍ
ｏｒｅｌ ａｎｄ Ｆｏｕｃａｕｄ）、Ｂｕｌｌ。 Ｓａｃ、 Ｃｈｉｍ 、 ７ランス） ３１２３頁（＋
９７０）］ 。 ］３−置換エトサクシミド誘導の合成は、種々のルート
により達成できる０通常、かかる誘導体は、本薬剤の上
述の合成法を適切に修正したものによるか、または１元
の薬剤の直接アルキル化等により生成されるであろう。 前者の場合には、広範囲の官能基をエトサクシミドの３
−位に４＝１加することができる。 例えば、工程２に示すように、シアン化物イオンを（４
）へ伺加することにより生じる中間体（５）は、Ｘが脱
＃基（ｌｅａｖｉｎｇ ｇｒｏｕｐ） （例えば、ハ
ロゲン、Ｐ−）シアンスルホニル基、メタンスルホニル
基等）であり、Ｚが官能基、または、蛋白質もしくは他
の免疫性担体と共有結合を形成しうる適ジノに保護され
た形の官能基であるＸ−Ｒ’−Ｚ（ｉｔ）と、または、
免疫試験に用いられる標識と直接に反応させることがで
きる。 工程 ？ （８） かくして、Ｚは、ＣＤ Ｄ １１基、 Ｃ［ｌＯＲジ／
、：（Ｒは、低級アルキル基） 、 ＣＮ基、マレイミ
ド基、チオール基［または、適切に保護された形のチオ
ール基；ヒＡＩ±１■見」エリ１Ｌユｌ−見郵工這工」
１μｍユｔｒｙ・グリーン、ジョン・ワイリー・アンド
拳リンズにューヨーク、 １９８１）（Ｇｒｅｅｎｅ、
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄＳｏｒ＋Ｓ、（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ １９８１）ｌ １９３頁 参照］、Ｊ！、Ｉ
Ｊに保護されたアミノ基［グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、
同上２１８頁； Ｔｈｅ Ｐｅ ｔｉｄｅｓ ３巻、グ
ロスおよびマイエンホンファー編 アカデミツク・プ１
／ス にューヨーク １９８１） （Ｇｒｏｓｓ
ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、ｅｄｓ、 。 ＾ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
１９８１）） ３頁；およびハープイー （Ｉｌａｒ
ｄｙｌ 、 Ｃｈｅｍ、Ａｎａｌ、 ６１？頁（１９
７９）参照］であってもよい。連結基Ｒ°の構造は、そ
れが、中間体（５）にＸ−Ｒ’ −Ｚ 刺着させるの
に用いられる反応条件に対し安定であるという要件によ
ってのみ制限される。 先に述べたように、本発明の３−置換エトサクシミド誘
導体への別のルートとして、元の薬剤の直接アルキル化
が挙げられる。エトサクシミＩＣ’（１）は、テトラヒ
ドロフラン（Ｔ ＩＩ Ｆ ）およびヘキサメチルホス
ホリンクトリアミド（）ＩＭＰ＾）の混合物中での、２
等量の、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）との
反応により、ジ−アニオン（９）に転換することができ
る。 工程 ３ （９） ジ−アニオン（９）は、先に論じたＸ−Ｒ’−２（６）
でアルキル化されて、３−置換？Ａ誘導体８）を生成す
る。 誘導体（８）が、適νＪな方法により、免疫性担体材１
こ結合してエトサクシミド免疫原を生成する際、複合体
クシミドを測定するための免疫試験に適する新規なエト
サクシミド：Ａ導体に関する。この誘導体は、慣用的手
法により、宿主動物中において、エトサクシミドに対す
る抗体の産生を刺激するのに用いられるエトサクシミド
免疫原からなる。また、特定の免疫試験において、エト
サクシミド抗体とともに、試薬として用いられる標識化
工］・サクシミド複合体が提供される。さらに、前述の
、免疫原および標識化複合体の合成における中間体が提
供される。 エトサクシミド ［２−エチル−２−メチルサクシンイ
ミド、メルク争インデンクス （Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ
Ｉｎｄｅｘ ）第９版、４８３頁（１９７Ｂ）参照］は
、式：の鎮痙薬剤である。 大多数の鎮痙薬剤のように、エトサクシミドは低い治療
指数を有し、しかも、血液中の薬剤濃度範囲が、それぞ
れ、効果なし、治療効果ありまたは毒性ありに、明確に
区別されている。十分に高い濃度では、この薬剤は、潜
在的に有毒であり、かつ、体外へ枯山されるが、その排
出速度は個々によって広範囲に変化しうるので、同一投
与量が、被投与者次第で、効果なし、治療効果あり。 またはｙｌｆ性ありになりうる。かくして、各患者にお
いて、正しい投与量を知るために、血液中の薬剤濃度を
監視することが望ましい。 免疫試験によるエトサクシミドのＪｌｌｌ定は周知であ
る。血清エトサクシミドおよびプラズマエトサクシミド
を測定するために、市販の゛免疫試験用試験キントが人
手可能である。薬剤を含有する種々の分析対象物を測定
するための均一系免疫試験は米国特許第４，２７９，９
９２号；第４，２３［１，５８５号；および第３，８１
７，８３７号ならびに英国特許第１，５５２．Ｈ７号に
記載されている。 動物において、薬剤に対する抗体の産生を刺激するのに
有用な、従来の免疫性担体材に結合したエトサクシミド
からなる免疫原複合体は文献に示唆されている。英国特
肋明Ａｍ ｆ’ｒ第１，５１１，５７１ 号は、薬剤が
、そのＮ−５位において、またはＣ−２のアルキル置換
基の１つを介して担体へ連結しているエトサクシミド免
疫原を提案している。１−１本特許公開明細書第５１１
ｔ−０４６，８２０号 ［テルウェント（Ｄｅｒｗｅｎ
ｔｌ第４４７４２Ｄ／２５号１は、薬剤がＣ−２のエチ
ルｉ０換基を介して特定のフェニレン連結基と連結して
いるエトサクシミド免疫原について記載している。薬剤
のようなハプテン類に対する抗体を産生ずることについ
ての技術水へ１マは、ワインリブ等（Ｗｅｉｎｒｙｂ
ｅｔ ａｊｌ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ １０ｉ ：２７１頁（１９７９） ；プレ
イフェアＱ’ｐ （Ｐｌａｙｆａｉｒ ｅｔａｌｌ
、 Ｂｒ、Ｍｅｄ、Ｂｕｌｌ、３０巻：２４頁（＋９７
４）； プロートン等ｔＢｒｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔａｔ
） 、 Ｃｌ１ｎ、ＣｈｅＩｌｌ、２２巻ニア２８頁（
＋９７［１）、およびパトラ−（Ｂｕｔｌｅｒ） Ｊ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ。 Ｍｅｔｈ、７＠：１頁（＋９７５）により提示されてい
る。 標識物質と結合した、分析対象物もしくは誘導体、また
は、他のそれらの類縁体からなる標識化複合体は、例え
ば、標識が蛍光原性酵素Ｊ＆質β−ガラクトシル−ウン
ベリフェロンである前述の米国特許第４，２７９，９９
２号ならびに米国特許第４．！［１２゜８５６号；第４
，２５９，２３３号；および第４，２９２，４２５−号
の文献に種々記載されている。 本発明は、Ｃ−３位での、薬剤との結合または誘導体化
を包含する、エトサクシミド免疫試験に用いるための試
薬を提供することを特徴とする。その３−位で免疫性担
体材と共イ１結合しているハプテン性薬剤からなる１本
発明のエトサクシミド免疫原は、有利な交差反応特性を
有する抗体の産生を刺激する。元の薬剤に置換基が全く
ない３−位において、薬剤と結合することにより、免疫
原複合体は、薬剤」二のいかなる官能基または１別基を
修正することなしに製造される。 （！ｒましい実施態様においては、本発明は３−置換エ
トサクシミド試薬の製造における新規な中間体を提供す
る。本発明の新規な抗体を用いて、エトサクシミド測定
用の改良された、免疫試験法および試薬もまた提供され
る。本発明は、また、かかる免疫試験の特に好ましい実
施態様のための標識化エトサクシミド複合体をも提供す
る。 本発明は、すべての相互に関連する実施態様において、
３−置換エトサクシミド誘導体の製造に焦点をあわせて
おり、これらの誘導体は、次いで、慣用される担体材に
結合することにより免疫原を形成することに用いられ、
次いで、エトサクシミド抗体を得るために用いられ、ま
た、工トザクシミド免疫試験において、検出試薬として
働く標識化複合体を形成するのに用いられる。 エトサクシミド 言 原 本免疫原は、一般式： （式［１）、Ｒは、適切な連結ノんであり、Ｔは、従来
の免疫性１［１体材であり、かつ、ｐは担体に結合して
いるエトザクシミ１部分の数である）をイＴする。数Ｐ
は、しばしば、免疫原のエピトープ密度（Ｅｐｉｔｏｐ
ｉｃ ｄｅｎｓｉｔｙ）と呼ばれ１通常の状態では。 ｉＦ均して、ｌから約５０までであり、さらに普通には
、ｌから約２５となるであろう。免疫原の合成および抗
体応答の容易さおよび再現性を考慮すれば、最適のエピ
トープ密度は、約２および約２０の間、さ）に通常には
、５と１５の間になる。 免疫性担体材は、従来公知のもののいずれからも選択す
ることができる。十分な大きさおよび免疫性を有する、
炭水化物類、多糖類、リポ多糖類、核酸類等のような他
の材料もまた同様に用いることができるが、はとんどの
場合、担体は蛋白質またはポリペプチドであろう。大部
分、免疫性蛋白質類およびポリペプチド類は、’５，０
００およびＩＱ 、０００．０００間の、好ましくは、
１５，０００より大きい、および、さらに通常には、５
０，０００より大きい分子量を有するであろう。通常、
一つの動物種から取り出された蛋白質類は、他の種の血
液流に導入された際、免疫性を示すであろう。特に、有
用な蛋白質類は、アルブミン類、グロブリン類、酵素類
、ヘモシアニン類、グロブリン類、例えば、グリコ蛋白
質類のような有為の非蛋白質性成分を有すζ蛋白質類等
である。分子量が、３０，０００おより ２００．００
０の間であるアルブミン類およびグロブリン類は、特に
、ｔＩｆましい。さらに、従来の免疫性担体材およびハ
プテン類を、それらに結合させるだめの方法に関する技
術水準については、次のものを参照してもよい： パー
カー （Ｐａｒｋｅｒｌ、Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａ７ ｏｆ 旧ｏ１ｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔ
ｉｔｅ Ｃｏｍ−■エリ」、プレンティス−ホール（
イングルウ・ンド・クリフス、ニューやシャーシー、ア
メリカ合衆国（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−１１ａｌｌ（Ｅｎｇ
ｌｅｗｏｏｄ Ｃｌ１ｆｆｓ、Ｎｅｗ ＪｅｒｓｅｙＵ
ＳＡ、１９７１３） ）；へトラ−（ＢｕｔｌｅｒｌＪ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ。 ７巻：１−２４頁（１９７５） ；ワインリブおよびシ
ュロフ（Ｗｅｉｎｒｙｂ ａｎｄ ５ｈｒｏｆｆ ｌ
Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ、Ｒｅｗ、ｌＯ＠ ：２７１−２
８３頁（１９７５） ；プロートンおよびストロング（
Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｏｎｇ ｌ、 Ｃ
ｌ１ｎ、Ｇｈｅｌｌ、 ２２巻ニア２Ｂ−７３２頁（１
９７８） ； ならびに、プレイフェア等１Ｐｌａｙ
ｆａｉｒ’ｅｔ ａｊｌ、Ｂｒ、Ｍｅｄ、Ｂｕｌｌ、
３０巻：２４−３１頁（１１１７４）。 適切な３−置換エトサクシミド誘導体は周知の手法によ
り、免疫性担体材に結合可能である。例えほ、３−カル
ボキシル基、（化エトサクシミＨ： Ｂ４誘導は、圏…
凰」、グンドマンおよびマイエンホンファー＃ｌｌｌ
＋ シ”１ン・ワイリー・アント拳すンスにニューヨー
ク １９７７ ）（ｅｄ、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｍ
ｅｉｅｎ−ｈｏｆｅｒ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７？）ｌｆｉ頁以
降に記載されているような標準ペプチドチ１４合生成反
応により、アミ７基を有する免疫性担体に結合させるこ
とができる。３−チオールノＡ化エトサクシミド誘導体
は、ジスルフィド交換反応［マーヂン等 （Ｈａ を日
ｎ ｅｔ ａｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ２０巻：４
２２９頁（＋９８１）］ により、ヂオール基を有する
担体に伺加させることができる。またリウ等 （１，ｉ
ｕ ｅｔ ａｌ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １８巻・６８０
頁（１９７９）Ｉこより記■成されたものと同様の方法
で、チオールハを反応体の一力に誘導し、かつ、ヤレイ
ミト基を他力ｉこ誘導して、両者を−Ｘに結合させるこ
とができる。３−アミノ基化エトサクシミド ［工ールネ等（八ｈｅｒｎｅ ｅｔ ａｔ）Ｂｒｉｔ．
ｊ．ＣＩｉｎ．Ｐｈａｒｍ。 ３−ａ：５６＋頁（１９？ｆ（））］、混合隼水物類［
エルランガ− 等 （Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａ
ｔ）、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙウィリ
アムスおよＵチェ４２編アカデミツク令プレス （ニュ
ーヨーク ＋９６７）（ｅｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａ
ｎｄ Ｃｈａｓｅ，八ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
（ ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９ｆｉ７）ｌ ！４９
頁］のようなアミド結合生成反応を包含するもの、なら
びに酸アジドおよび活１′１エステル反１イス〔コンプ
ル（ＫｏｐＰＩＩｌ！ｌ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄＡ
ｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ タブリュー・エイφペンジア
ミンにニューヨーク ｌＨ６Ｈ’１１．八．Ｂｅｎｊａ
ｍｉｎ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９８１３）１１ より、
カルボキシル基１（をイ１する１１！体へ結合させるこ
とができる。ＣＩ ｉｎ．ｃｈｅｍ．２２巻 ・７２８
頁（１９７６）も参照されたい。同様に、アミン誘導体
も、ビスーイソシアネ−１・類、ビス−イミドエステル
類，およびタルクールアルデヒドのような従来の２官能
性試薬を用いて、アミン基を右する１１！体へ結合させ
ることができる［ Ｉ ｍ ｍ ｕ ｎ ｏ ｃ ｈ
ｅ ｍ 、 ８ 巻：５３頁（ １９８９） ｌ 、
、１ｍｌ ップル（Ｘｏｐｐｌｅ）同上：ならびにロウ
エおよびテ４ − ン（Ｌｏｗｅ ａｎｄ Ｄｅａｎ）
、 ＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａ ｂｙ
ジゴン・ワイリー・アントサンスにニューヨーク １９
７４）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（Ｎ
ｅｗＹｏｒに１９７４））もまた参照されたい。本発明
の種々の３−エトサクシミド誘導体を，慣用される免疫
性担体材と結合させるために、数多くの他の結合力法が
、通常の当業名にとって利用可能である。 特に、 ＩＩＴましいものは、式： （式中，Ｙはアミド基すなわち一旧＋ＣＯ−、Ｔは免疫
性蛋白質または免疫性ポリペプチド、ｎは１から１０ま
での整数、かつ、ｐは平均してｌから担体上の利用しう
るアミド結合部分の数までであり、好ましくは、」二に
定義したとうりである）の工ｉ・サクシミド免疫原であ
る．アミド結合基は、次の２つの可能な方法のいずれか
により適応さゼてもよく、その１つは、アミド基中の窒
素原子が担体アミノ基からのものであり、かつ、炭素原
子が適ジノなエトサクシミド誘導体（例えば、カルボン
酸）からのものであり、ｐは、したがって、Ｊｔ４体中
の結合アミン基の平均数を表わす（Ｕましくは、−にに
定義したとうりである）ものであり、もう１つは、窒素
原子が適し」な工ｌ・サクシミド誘導体（例えば、アミ
ノＦＪ ｙＩ体′）からのものであり、かつ、炭素原子
が担体カルボキシル基からのものであり、ｐは、したが
って、扛！体中の結合カルボキシル基の平均数を表わす
（＆ｆましくは，再び、上に定義したとラリである）も
のである。 エトサクシミ ド打 本免疫原複合体を用いての、特異的抗体の産生け、いか
なる従来手法に従ってもよい。抗体生成を誘導する基本
的な！ハ１様を記載した数多くのテキストが入手可能で
あり、例えばパーカー（Ｐａｒｋｅｒ）Ｒａｄｉｏｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｃａｍ−ｐｏｕｎｄｓ ７
’レンチスーホール（イングルウｙ ｌ” ｅクリフス
、ニュー・シャーシー、アメリカ合衆国１９７Ｂ）（Ｐ
ｒｅ’ｎｔｉｃｅ−１１ａｌｌ （ Ｅｎｇｌｅｗｏｏ
ｄ Ｃｌｉｆｆｓ， ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ，１
９７Ｅｌ））を参ｊ（ｑ してもよい。通常の場合、ラ
ビッ′ト、ヤギ、マウス、モルモア）、またはウマのよ
うな宿主動物に、ｌまたはそれ以上の種々の部位に、通
ｔθ、アジュバントとの混合物の状ｙｌ）で、免疫原複
合体を注射する。さらに、注Ｑ４を、同一・部位にまた
は異なる部位に、定期的間隔でまたは不定期的間隔で施
こした後、最適の適宜量が達成されたと測定されるまで
、抗体滴定量を評価するために採血される。宿主動物を
採血すると、適νＪ量の特異的抗血清が得られる。必要
ならば、抗」ｒｌ′ｌ清が、実際の試験の遂行に用いる
のに適νｊだと考えられる前に、非特異的抗体のような
望ましくない物質を除去するために、精製工程を行って
もよい。 抗体は、体細胞融合反応法 （Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌ
ｌｈ７ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
）によっても得られ、かかる抗体は、通常、モノクロ
ナール抗体と呼ばれる６かかるモノクロナール抗体法に
ついての概説は、Ｌ！五ｈｏｃｙｔｅ ｌｌｙｂｒｉｄ
ｏｍａｓ 、 メルチャーズ等編、スプリンカーーフェ
ルラーグにューヨーク１９７８）（ｅｄ、Ｍｅｌｃｈｅ
ｒｓ ｅｔ ａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（
ＮｅｗＹｏｒｋ １９７Ｂ）ｌ； Ｎａｔｕｒｅ
２ＢＢ−巻 ２４９５頁（１９？？）。 ５ＣＩｅｎＣＩ！ ２０８巻：６９２頁（＋９１１Ｑ
）、およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
７３巻（パーｌ−８）：３−４８頁（１９８１）に見
出される。 ３−置 エトツクシミ１ζ誘導体 薬剤エトサクシミド（１）（２−エチル−２−メチルサ
クシンイミド）は、下記のようにして、合成する。 メチルエチルケトン（２）はエチルシアノアセテート（
３）と縮合して、不飽和のシアノエステル（４）を生成
する。これは１．シアン化物イオンと反応して、ジニト
リル（５）を生成し、これを、硫酸で処理すると、脱カ
ルボエトキシ化および閉環を行って、エトサクシミド（
１）を生成する［モレルおよび７オウＤ −Ｆ’ （Ｍ
ｏｒｅｌ ａｎｄ Ｆｏｕｃａｕｄ）、Ｂｕｌｌ。 Ｓａｃ、 Ｃｈｉｍ 、 ７ランス） ３１２３頁（＋
９７０）］ 。 ］３−置換エトサクシミド誘導の合成は、種々のルート
により達成できる０通常、かかる誘導体は、本薬剤の上
述の合成法を適切に修正したものによるか、または１元
の薬剤の直接アルキル化等により生成されるであろう。 前者の場合には、広範囲の官能基をエトサクシミドの３
−位に４＝１加することができる。 例えば、工程２に示すように、シアン化物イオンを（４
）へ伺加することにより生じる中間体（５）は、Ｘが脱
＃基（ｌｅａｖｉｎｇ ｇｒｏｕｐ） （例えば、ハ
ロゲン、Ｐ−）シアンスルホニル基、メタンスルホニル
基等）であり、Ｚが官能基、または、蛋白質もしくは他
の免疫性担体と共有結合を形成しうる適ジノに保護され
た形の官能基であるＸ−Ｒ’−Ｚ（ｉｔ）と、または、
免疫試験に用いられる標識と直接に反応させることがで
きる。 工程 ？ （８） かくして、Ｚは、ＣＤ Ｄ １１基、 Ｃ［ｌＯＲジ／
、：（Ｒは、低級アルキル基） 、 ＣＮ基、マレイミ
ド基、チオール基［または、適切に保護された形のチオ
ール基；ヒＡＩ±１■見」エリ１Ｌユｌ−見郵工這工」
１μｍユｔｒｙ・グリーン、ジョン・ワイリー・アンド
拳リンズにューヨーク、 １９８１）（Ｇｒｅｅｎｅ、
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄＳｏｒ＋Ｓ、（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ １９８１）ｌ １９３頁 参照］、Ｊ！、Ｉ
Ｊに保護されたアミノ基［グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、
同上２１８頁； Ｔｈｅ Ｐｅ ｔｉｄｅｓ ３巻、グ
ロスおよびマイエンホンファー編 アカデミツク・プ１
／ス にューヨーク １９８１） （Ｇｒｏｓｓ
ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、ｅｄｓ、 。 ＾ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
１９８１）） ３頁；およびハープイー （Ｉｌａｒ
ｄｙｌ 、 Ｃｈｅｍ、Ａｎａｌ、 ６１？頁（１９
７９）参照］であってもよい。連結基Ｒ°の構造は、そ
れが、中間体（５）にＸ−Ｒ’ −Ｚ 刺着させるの
に用いられる反応条件に対し安定であるという要件によ
ってのみ制限される。 先に述べたように、本発明の３−置換エトサクシミド誘
導体への別のルートとして、元の薬剤の直接アルキル化
が挙げられる。エトサクシミＩＣ’（１）は、テトラヒ
ドロフラン（Ｔ ＩＩ Ｆ ）およびヘキサメチルホス
ホリンクトリアミド（）ＩＭＰ＾）の混合物中での、２
等量の、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）との
反応により、ジ−アニオン（９）に転換することができ
る。 工程 ３ （９） ジ−アニオン（９）は、先に論じたＸ−Ｒ’−２（６）
でアルキル化されて、３−置換？Ａ誘導体８）を生成す
る。 誘導体（８）が、適νＪな方法により、免疫性担体材１
こ結合してエトサクシミド免疫原を生成する際、複合体
【１】に存在する一Ｒ’−Ｚ残基は、ここで、連結基Ｒ
と呼ばれるようになる。かくして、当業者が、本発明の
誘導体および複合体に誘導しうる広範囲の連結基Ｒ°お
よびＲを有するということが容易に判る。かかる選択の
例としては、１から１５個に至るまでの、さらに、通゛
畠には１０個以下。 および、普通には、６個未満の炭素原子からなる線状お
よび枝状アルキレン基類（例えば、メチレフ ）、ｋ
、エチレン基、＋１−フロピレン基、イソ−プロピレン
ツ＆、ｎ−ブヂレン基等）がある、加えるに、かかるア
ルキレン基類は、シアノ基、アミノ基（置換アミン基を
含む）、アシルアミノ基、ハロゲン、チオール基、ヒド
ロキシル基、カルボニル基、カルボキシル基（エステル
類、アミド類および置換アミド類のような置換カルボキ
シル基類を含む）のような他の置換基を含むこともでき
る。 連結基Ｒ′およびＲもまた置換または非置換アリール基
、アラルキル基またはヘテロアリール基（例えば、フェ
ニレン基、フェニレン基等）を含有するか、または、か
ら成ることができる。さらに、かかる連結は、エーテル
基、゛エステル基、アミド基、アミノ基、チオエーテル
基、アミジノ）＋（、スルホンノ＾またはスルホキシド
基の形で、窒素、硫賛および酸素から選択されたｌまた
はそれ以上のへテロ原子を含有することもできる。また
、かかる連結は、オレフィン結合もしくはアセチレン結
合、イミノ基またはオキシ・イミノ基のような不飽和基
を含有することもできる。好ましくは、ＲおよびＲｏは
原子鎖であり、通常は、水素を除くｌおよび約２０個の
間の原子から成る、さらに、通常には、ｌおよび１０個
の間の原子から成る脂肪族基であり、そのうちのＯから
５個は窒素、酸素および硫負から選択されたヘテロ原子
である０式中、Ｒｏが−（ＣＩ＋２−− （ｎは］から
１０までの整数）であり、Ｚが７ミノ基またはカルボキ
シルである誘導体が，特にｔＩＩましい。したがって、
連結，！Ａ ｎ ’およびＨの選択は，本発明では特に
制限されず、安定な化合物が製造されるべく通への注意
を払って、普通の熟練者によって、選択されてもよい。 同様に、末端官能基Ｚは、アミノ基、カルボキシル基、
チオール基，ヒドロキシル基およびマレイミドノ＾が好
ましいであろうが、広範囲に変化することができる。か
かるｔＩｒましい末端官能基を有する３−工Ｉ・サクシ
ミド誘導体を得るのに利用しうる，合成ルートの例は次
のようである。 （ａ） ３− （カルボキシルツ（−官能〕，（化）エ
トサクシミド類 工程２または３の操作にしたがって、中間体（５）また
は（９）は、Ｘが、先に定義したような脱１！ＩＮ基で
あり、Ｚが、カルボキシル基またはカルボキシル基、（
に転換しうる置換体である試薬（６）を用いてアルキル
化することができる。脱離基Ｘが、典型的な求核置換を
行うような方法で、Ｒ゛に伯加されることが、唯一の制
限である［ ヨールド（Ｇｏｕｌｄｌ Ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍ ａｎｄ ５ｔｒ１Ｊｃｔｕｒｅ ｉｎ 肛世山
旺」凪コ ホルト、ラインハートおよびウィンストン
、インコーボレーテンｌ”にューＥ＝り１９５９）（ｌ
１ｏｌｔ、Ｒｉｎｅｈａｒｔ ａｎｄ Ｗｉｎｓｔｏｎ
、Ｉｎｃ、 （ＮｅｗＹｏｒｋ １９５９））２５０
頁以降参照］。 例えば、（５）は、パンクラ−”Ｊ （Ｂｕｃｋｌｅｒ
ｅｔａｌｌ 、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、 ２１巻：１
２５４頁（１９７Ｂ）により記載されているように、３
−クロロプロピオン酸のカリウム用を用いて、アルキル
化すると、環化後、（８） （Ｒ’＝Ｃ１１２ＣＩ＋２
． Ｚ＝ＧＯＯ１ｌ）を生成することができる。中間体
（８）は、２−（３−クロロプロピル）１！１化ベンジ
ルを用いて、アルキル化すると、（７）） を生成することができ、これは、シアン化物イオンと反
応し、酸で処理すると、カルボキシルエトサクシミド（
８） （式中、 ） を生成するであろう［パンクラ−等（Ｂｕｃｋｌｅｒ
ｅｔａｌｌ 、 Ｅｕｒｏ 、Ｊ、Ｍｅｄｌｌ；ｈ
ｅｍ、 １２巻：４６３頁（１９７７）参照］。また
、中間体（５）または（８）のいずれも、エヂルーω−
ブロモアルカノアート類 Ｂｒ（Ｃｌ１２）。 −６００Ｃ２１１５（ｎ ＝ ２を除く）を用いて、ア
ルキル化すると、醜で処理すれば、Ｒ’ ＝（ＣＩ＋２
）ｎ およびＺ ＝Ｃ’００１ｉである３−置換工ト
サクシミド誘導体を４：。 成する中間体を生成することができる。ｎ ７！Ｉ”−
１カ）ら４であるエチル−ω−ブロモアルカノアート類
は、市１■されている［アルドリンチ金ケミカル−カン
パニー、ミルウオーキー、ライスコンシン（八１ｄｒｉ
ｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、、Ｍｉｌｗａｕｋ
ｅｅ、Ｗｌｌ］； ｎ カ＜ ５から９のものは
公知の化合物である；ノ＜−カー等（Ｂａｒｇｅｒ ｅ
ｔ ａｌｌ、Ｊ、Ｃｈｅｍ、５ｏｃｙ−、（１９７３）
７１４頁）；４Ｊ−−モア −１／ ＩＪグツイア
−（Ｓａｌｍｏｎ−ＬＢａｇｎｅｕｒｌ、Ｂｕｌｌ、Ｓ
ｏｃ、Ｇｈｅｍ、 （７ランス） （１９５Ｇ） ４１
１頁；ならヒニリンネルオヨびポーラ（Ｌｉｎｎｅｌｌ
ａｎｄ Ｖｏｒａｌ、Ｊ、Ｐｈａｒｍ、Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ、４巻＝５５頁（１９５’２）参照。 （ｂ） ３− （アミツノ１（−官能基化）エトサクシ
ミド類 先の（ａ） ’］において定義したＸおよびＲ゛をｊ１
１１／Ａて、中間体（５）または（９）は、Ｚがアミン
基である。さらに、好ましくは、アミノ基番こ転換され
うるブロックされたアミノ基または官能基である試薬（
０）と反応させることができる。 例えば、（５）は、Ｎ−（ω−ブロモアルキルクルイミ
（・類で、アルキル化すると，中間体げ）（式中、 ） を生成することができ、これは、酪で、次しＸで、ヒド
ラジンで，処理すると，アミノーエトサクシミト（８）
（Ｒ’＝（Ｇ）ｌ ） 、Ｚ＝ＮＨ，、）を生成す
るであるｎ う。ト（ω−ブロモアルキル）フタルイミド類（ｎ＝２
−４）は市阪されている。類縁体（ｎ＝５−９）は、公
知の化合物である；デイルシャールおよびワインカート
ンｉＤｉｒｓｃｈｅｒｌ ａｎｄ Ｗｓｉｎｇａｒｔｅ
ｎ）、 Ａｎｎ。 ５７４巻；１３１頁（＋９５１） ； ミュラーおよ
びクラウス［Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｋｒａｕｓｓｉ
６１ 巻＝２１９頁（＋９３２）；エルダーフィールド
等 （Ｅｌｄｅｒｆｉｅｌｄ ｅＬ ａｌｌ、Ｊ，＾ｍ
ｅｒ．Ｇｈｅｍ．ｓｏｃＪ８巻：１５６８ Ｊ：Ｌ（１
９４６）； ｌ’ナウエ等 （［ｌｏｎａｕｅ
ｅＬ ａｌｌ、 Ｊ．Ｏｒｇ．ＣＩ＋ｅｍ ２２
巻 二 ６８ 頁（＋９５７）参照。 シーアニオン（９）は、塩化アリルでアルキル化すると
、（８） （Ｒ’＝Ｃ！１２．Ｚ ＝Ｃｌ１＝ＣＩ＋
２）を生成することができる。Ｏｓ Ｏａ ／ Ｎ ａ
Ｉ Ｏａを用いて、これを酸化すると、アルデヒド
（８） （Ｒ’＝Ｃ１１２，Ｚ＝ＣＩＩＯ）全生成し］
パボー等（Ｐａｐｐｏ ｅｔ ａｌ） Ｊ、肛Ｌ■Ｊ、
２１巻＝４７８頁（１９５Ｂ）） 、 これを、還元
的に、アルキル化すれば、Ｚ＝旧（２の１級アミン（８
）を生成することができる［ポルチ等、（Ｂｏｒｃｈ
ｅｔ ａｉ 、 Ｊ、＾ｍｅｒ、Ｇｈｅｍ。 針ム９３巻：２８９７頁（１９７１）］ 。 （Ｃ） ３− （チオール基−官能基化）エトサクシミ
ド類 上述のＸおよびＲｏを用いて、３−（アミン置換）化合
物をトサクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオン酸エステルと反応させ、かつ、生成物を、Ｚ
＝Ｓ）ｌの、ｍ＃のチオール化合物（８）に還元するこ
とにより、チオール基を、エトサクシミドの３−位に、
伺加することができる［カールソン等 （Ｃａｒｌｓ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ）、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、
１７３巻＝７２３頁（１９７８）］ 。 チオール置換体は、また、ハロゲンを硫Ｍ求核子で置換
することにより、３−（ハロゲン置換）エトサクシミド
類より得ることもできる［し」１先り二ｔｉｖｅ Ｏ
ｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４版、ヒルゲター
グおよびマルチー二編、ジョン・ワイリー・アンドΦサ
ンズ（三ニーヨーク、＋９７２） （Ｉｌｉｌｇｅｔａ
ｇ ａｎｄＭａｒｔｉｎｉ、ｅｄｓ、、Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅ７ ａｎｄ ５ｏｎｓ、（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。 （＋９７２）） ８３４頁１゜かかるハロゲン誘導体は
、適切なビス−ハロゲン化合物と（５）または（８）と
の反応により、（ａ）項および（ｂ）項において１．に
に示したようにして、製造することができる。 （ｄ）３−（マレイミド基−官能基化）エトサクシミド
類 マレイミド基で官能基イ「「れたエトサクシミド誘導体
は、相当するアミン化合物を、無水マレイン酸と反応さ
ゼで、（１０）を生成し、かつ、これを環化してマレイ
ミド誘導体（１１）を生成することにより、下記の工程
４において示すようにして製造することができる。また
、この薬剤のアミノ誘導体はマレイミド−置換カルボン
酸類と反応して、にの（ｂ）項のアミン類に存在する元
の連結基Ｒ′が、マレイミドカルボン酸によって与えら
れたＲ” およびアミド官能基により拡張されているマ
レイミド−置換エトサクシミド類（１２）を生成するこ
とができる。後者の試薬の例としては、Ｒ”がフェニル
基ならびに線状および枝状アルキル基であるものが知ら
れている［キタガワおよびアイカワ、Ｊ、旧ｏｃｈｅｍ
、７９巻：２３３頁（１９７８）； ケラ−およびルデ
ィン刀−（Ｋｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｕｄｉｎｇｅｒ）
１ｌｅｌｖ、Ｃｈｉｍ。 （ｅ） ３−（ヒドロキシル基、（−官能〕、′５化
）エトサクシミド類 ヒドロキシル基−官能基化工トザクシミド類は、中間体
（５）、ｔ：３ヨび（９） ヲＸ−Ｒ’−Ｚ（Ｂ） ト
反応させることにより製造することができ、式中、Ｘお
よびＲｏは上に定義したとうりであり、Ｚはヒドロキシ
ル基、または、さらに通常には、保護されたヒドロキシ
ル基またはヒドロキシルノ人に転換しうる官能基である
。 例えば、（５）はω−ヒドロキシアルデヒド類の群から
入手しうるＸ −（ＣＩシ） ｎ−ＣＩＩ Ｏを用いて
アルキル化し［ハード等（Ｈｕｒｄ ｅｔ ａｌｌ
Ｊ、八ｍｅｒ、ｃｈｅｍ、ｓＯｃ。 ７４巻： ５３２４頁（１９５２）］ 、かつ、生成物
を環化および還元すると、（８） （Ｚ＝０１１．Ｒ
’＝（Ｃ：１１．、）ｎ）を生成することができる。 上記の合成ルートから、式： ％式％ （式中、Ｚは、免疫性担体材または適切な標識残基と結
合するだめの活性基である（例えば、Ｚは、アミン基、
カルボキシル 基、メルカプトノルまたはマレイミド基であってもよい
）である）の３−ｗ換エトサクシミド誘導体が，連結基
Ｒ°の性質において広範囲の自由度をもって生成するこ
とができることは明らかである。 かかる誘導体は、利用しうる手法により、免疫性担体材
および櫟識物賀に結合させることができる。カルボキシ
ル基−含有薬剤部分は、４１１体および標識のアミノ基
に、普通のペプヂド結合生成反応，例えば、アルキルク
ロロホルメート類およびカルボジイミド類のような試薬
でカルボキシル基を活性化することに基づく反応 ［Ｔ
ｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １巻、クロスおよびブイエン
ホフγ−編．アカデミ、クープレスにューヨーク、１９
７９）（ Ｇｒｏｓｓａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，
ｅｄｔｓ．、＾ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ １９７９）ｌ ２４２頁以降］により、カル
ポニルジイミタゾール［ヒルゲターグおよびマルチーニ
（ｌｌｉｌｇｅｔａｇ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎｉｌ、前
出、４８２頁］により、または、そのアシルアジドとじ
て、活＋１化することにより結合させることができる。 アミノ基−官能基化化合物は，カルボキシル基誘導体の
ために引用されたアミド結合生成反＋ｇ、を用いて、カ
ルボン酸含有Ｊｌｌ１体および標識に結合させるごとが
できる。さらに、薬剤部分のアミン基は、次の試薬を用
いて４目体または標識のアミノ基に連結することができ
る ：トルエンー２．４ージインシアネート［バーズお
よびタイマシェフ ｆｌｌｉｒｓ ａｎｄ Ｔｉｍａ−
ｓｈｅｆｆ）Ｍｅｔ ｈｏｄＳ ｉｎ ＥｎＺｙｆｆ
ｌｏｌ． ２５ ０ （ パ ー ト Ｂ）
二６２５頁（＋９７２）］； ］４，４’ージフルオ
ロー３．３′ジニトロ−ジフェニルスルホン［コートレ
カサス等（Ｃ：ｕａｔｒｅｃａｓａｓ ｅｔ ａｌｌ
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ：ｈｅｍ． ２４４巻＝４０６
頁（１９Ｈ）］；ゲルタールアルデヒド［フローマン等
（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌｌ 、 Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌ． ８７巻＋１０５５頁（１９７０）］ ；
］２ー官能性イミドエステル類タラトン’Ｊ （Ｄｕｔ
ｔｏｎ ｅｔ ａｌｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｎｕ＋。 ２３０ ： ７３０頁（１９［ＩＢ）］またはククロロ
トリリアジン［ケイおよびクルンク（Ｋａｙ ａｎｄ
Ｃｒｏｏｋ） 、 ＮａＬｕｒｅ２１６巻；５１４頁（
１９８７） ］。チオール基−含有類縁体は、二値化物
交換操作によって，チオール基−含有担体または標識に
結合させることができる（マーチン等（Ｍａｒｔｉｎ
ｅｔ ａｌ）、Ｂｉｎｃｈｅｍ． ２０巻：４２２９
頁（１９８１） ］。また、アミノ基−含有担体または
標識は、マレイミド基置換カルボン酩と反応さセ［ケラ
−ｔ−３よびルディンガ− （ Ｋｅｌｌｅｒ ａｎｄ
Ｒｕｄｉｎｇｅｔｌ 、 ｎｉｊ ＩＬＩ ］ 、 −
ｒ−れをチオール基−官能基化薬剤ど結合させることが
できる［キタガワおよびアイカワ、前出］。これらの化
合物は，チオール基−含有担体または標識に、キタガワ
およびアイカワ（ ｒｔｉｊｆｉｌ ）により記載され
た方法により結合させることができる。チオール基は、
アミノ基−含有１１！体または標識、特に、蛋白質に、
ホワイト（Ｗｈｉｔｅｌ 、 Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙ＋ｓｏ１．２５ 巻゛ （
バ ー ）Ｂ）：５４１亘（ＩＱ７２）により記載され
た方法により、導入することができる。 勉１区翌ユ」 本発明の３−エトサクシミド免疫原から産生される抗体
は、凝集反応法、放射性免疫試験，不拘ー系ｆＷ素免疫
試験（米国特許第３，［１５４，０９０号参照）不均一
系蛍光性免疫試験（米国特許第４，２０１。 ７６３号；第４，１７１，３１１す；第４，１３３，６
３９号および第３，９９２，ｔ＋３１吋参照）および均
−系（分＃操作を含まない）免疫試験をはじめとする、
エトサクシミド測定用の免疫試験法および相当する試薬
に用いることができる．最後のものは、特に、々ｆまし
く、蛍光減光または増加（米国特許第４，１８０，Ｏｌ
ｌｌｔ号参照）、蛍光偏光 （ Ｊ，Ｅｘ．Ｍｅｄ．
１２２６ ： ｌ ０２９頁（１９＋（５）参照）、酵
素基質−標識化免疫試験（米国特許第４ 、２７９ 、
９９２号および英国特許明細書第１ 、５５２ 、８０
７号参照）、補欠分子族−標識化免疫試験（米国特許第
４，２３８，５８５吟参ｊｉｌ；ｌ，）、例えば阻害物
標識（米国特許第４，１３４，７９２″′ｆおよび第４
，２７３。 ｅｅｅ号参照）を用いる酵素活性調整物−標識化免疫試
験、酵素−標識免疫試ＶＪ！（米国特許第３，８１７。 ８３７号参照）、エネルギー移動免疫試験（米国特許第
３ 、９１１ｆ（ 、３４５号参照）、化学的−励起イ
）？尤免疫試験（米国特許第４．２３（１，１９５号参
照）おＪ、び二組抗体立体障害免疫試験（米国時３″Ｉ
第３ 、 ９ ３ ５ 、 ９ ７ ４ ’Ｉ−。 および第３，９９８，９４３号参照）のような手法を包
含する。 さらに、本発明の３−工トサクシミド誘導体は、１、記
の種々の免疫試験を遂行するのに必要とされる標識化複
合体を９Ａ造するのに、用いることができる。適切な誘
導体は、標準方法により、放射性標識化またはイ１を光
性部分を用いて標識化を゛行ってもよい。同様に、例え
ば、酵素基質、補欠分子族、酵素活性調整物または酵素
（蛋白質であり、がっ、上述の免疫性Ｉｕ体に同様に結
合されうるちの）のような好ましい均−系法のための適
切な標識部分は、３−エトサクシミト誘導体と結合して
、標識化複合体を生成することができる。 １、シに、（！ｆましい標識化複合体は４式：（ ％式％） （式中、−（ＣＯ）βＧＵは １ であり、ｎはｌかも１０までの整数である）のβ−ガラ
クトシルーウンベリフェロンーエトサクシミト複合体で
ある。かがる複合体は、適切な３−（アミノアルキル ルーウンベリフェロンカルボン酸（米国’＋Ｉ ｉ ｆ
ｆｉ ４ 。 ２２８、９７８号）との標準ペブヂ１：縮合によって製
造される。 本発明の試薬系は、本発明により包含される所望のエト
サクシミド免疫試験法を行うのに必要と・されるすべて
の必須の化学的な要素からなる。試薬は箱詰め状の市販
品の形で、試薬間での両立ができる範囲で組成物もしく
１士混合物として；試験具の形で；または、試験キント
すなわち８星な試薬を保管するｌまたはそれ以上の容器
の箱詰め組合ゼどして提供される６所望の結合反応系に
は、適９」な試薬、例えば、本発明の抗体および標識化
複合体か含まれる。勿論、この試薬系は、当業者に公知
の緩挿ｉ糠、稀釈剤、標準液等のような商業上およびユ
ーザーの立場から望ましい他の物質を含有してもよい。 特に１１ｒましいものは、本発明の（ａ）エトサクシミ
ド る際変化する検出ｎ（能な性質を有する標識化工トザク
シミト複合体からなる本発明の均一系競争結合免疫試験
用の試験キントである。また、本発明の工Ｉ・サクシミ
ド抗体および抗体と結合する際。 変化する検出Ｔ＋ｆ能な性質を有する標識化エトサクシ
ミド複合体、ならびに、その試薬組成物を包含せしめた
、固体状１＋３体材からなる試験具が好ましい。種々の
形のかかる試験具は、１９８０年１０月３０［Ｉ出願の
米国！１１．Ｖ ４１出願ｆｆｉ ２０２，３７８吟に
記「成されている。ｆｆｆましい．ｉｌ（９キントおよ
び試験具に用いられる特異的標識は、−１．述のように
、用いられる方法に依るであろう。 ここに、本発明を説明するか、次の実施例にＪ：り限定
されるものではない。 実施例 Ａ 、 工ｌ・ナクシミド誘導体の製造エチル−２−シ
アノ−３−メヂルー２−ペンテノエートエチルシアノア
セテ−１・５０グラ１、（ｇ） ［０．４４ｍｏｌ（モ
ル）］、メヂルエチルケトン３２ｇ（０．４４ｍｏｌ）
、ピペリジン１３ ミリリンドル（ｍｌ）、氷量％１．
３ｍｌおよびトルエン１５０加１の混合１勿を１ ７
＋１＋ｉ間，伺設されたウォター・トランプを用いて還
流した。溶媒を除去し，残渣を高減圧下で７Ａ！’／ｆ
シて、ｌ）ｐ ８２−６５”Ｃ １０．１ ｔｏｒｒ
（ ） −ル） （７）−Ｌ ステル６０ｇを１１１
だ。 」−記のエチルエステル２０．ｆｆｇ（（１．１２２ｍ
ｏｌ）を、メタノ−）ｌｙ （ＭｅＯｌｌ）２５０ｍ
ｌにシアン化カリＬ２ｇ（ｏ．＋２２ｍ０１）を溶解し
たスラリーに添加し，室温で，−晩、攪拌した。ここで
、Ｎ−（４−ブロモブチル）フタルイミド３４．５ｇ（
０．１２３ｍｏｌ） を添加し、反応物を、５０間、不
活性カス雰囲気下で還流した。それを室温に冷却し、か
つ、ろ過して無機物質を除去した。−・晩冷却すると、
ろ液から、賛白色固体としてジニトリル１７．１ｇが析
出した。この物質はメチルエステルであり、タルク（シ
リカゲル板−Ｌで９＝１の四Ｊ１２化炭素（ＣＣＩ、）
：アセトン）上で均一である。Ｍ ｅ ＯＩＩから再
結晶して、ｍｐ １１３−１＋５°Ｃの白色結晶を生成
することにより、分析試ネ′１を得た。 分析” ２１”２３Ｎ３０４として。 具１ 算 イーオ ： Ｃ，ｅｅ、ｔ ３； ＩＩ
、 ｅ、ｏａ； Ｎ、 １１．０２実験値：
Ｃ，６ｅ、ｏａ； １１． ｅ、ｏｅ； ？ｌ、 １０
．７０」二重のメチルエステルジニトリル７．７ｇ （
０，０２ｍｏｌ）、塩化ナトリウム２．３４ｇ（０，０
４ｍｏｌ）、水（１１，、Ｏ）０．５４ｇ’ （０，０
３ｍｏｌ ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
の混合物を、１８５分間、正確に１２５℃で加熱した。 次に、ＤＭＳＯを、浴温８０℃で、ロータリーエバポレ
ーター（回転蒸発器）で、８０分かけて除去した。残渣
をクロロフォルム（ＣＩＩＣＩ、）で溶解し一回、木で
洗浄した。水洗液をＣｌＩＣｌ３で再洗ｆ７１ Ｌだ。 合せた有機抽出液を水洗し、無水硫酸すトリウム上で乾
燥し、ろ過、蒸発させると、淡赤色の油状物質として、
２−エチル−２−メチル−３−（４−Ｎ−フタルイミド
ブチル）サクシノニトリル５．５ｇを生成した、この油
状物質のＩＩＮＭＲスペクトル（ｃｏａ１３）は、予期
したピークをイーした：６１．５（ＣＩ＋３− 爪）お
よび６１．２（Ｃ１１３三重）、この物質を、これ以上
の゛精製を行わずに用いた。 ｅ、ｅｘの水を含む儂硫
酸２０ｍ１に、このニトリル３．６ｇを溶解した溶消を
、室温で２時間ＩＷ拌し、次に、１００℃で２．５時間
加熱した。これを、氷１００ｇ上に注ぎ、かつ、氷が溶
解してから、混合物を０１１０１３で二回抽出した。合
せた有機抽出液を水洗し、乾燥蒸発した。残渣をシリカ
ゲル１００ｇを用いて、クロマトグラフにかけＣｌＩＣ
ｌ３中２．５＄７ セ） ン（３９：１ ｖ：ｖ）テ溶
出し、両分１７ｍ１を採集した０両分７５−１００を合
せ、かつ、蒸発して、ビス−イミド８５０ ミリグラ
ム （ｍ ｇ ）を重い油状物質として得た。 分析：質酢分析（７０ｅ、Ｖ、） ａｌｅ ３４２［Ｍ
”ｌ ； ３１３［Ｋ” −Ｃ２１１５１ ’ＩＩ ＮＭＲスペクトル （ＣＤＣｌ２）；６７．８
（芳香族基 多重）、 ６３．８ （ｅｌ＋ 広い三重）。 ６２．８ （Ｇｌ＋、広い多重）、 δ１．３ １．２ （０１１８，二重）、δ０．９
（Ｃ１１３，三重）、。 無水エタノール５０ｍ１中に溶解した上記のビス−イミ
ド３．２９ｇ（０，０１ｍｏｌ）および８５％ヒドラジ
ン３７０ｍｇの溶液を加熱して、４５分間還流した。さ
ら（こ。 ヒドラジン５９ｍｇ（０，０５ｍ１）を添加し、３０分
間加熱を続けた。冷却して、溶媒を蒸発させ、力＼つ、
残渣をシリカゲル２５０ｇを用いてクロイドグラフ１３
力）け、８０：１０：１（ｖハハ） Ｇ ｌｌ Ｃｌ
３： Ｍ ｅ ＯＨ： 濃水酸イヒアンモニウム（Ｎ
ｌｌ ＯＨ）で溶出した０画分１４−１を採集した０画
分８３−１４０をひとまとめにし、かつ、蒸発して、３
−７ミノエトサクシミド誘導体１．５ｇを１ｊ１澄な油
状物質として得た。この油状物質のＩｔ ＮＭＲスペ
クトルは、芳香族水素原子を示さず、かつ、脂肪族ＧＨ
Ｊ＆として予期される多重を示した。少Ｉをエタノール
より、 ｍｐ １４０−目８℃の粉末１１０１ ｊｌに
転換した。 分析” １１”２ＯＮ２０２・ＩＩｃＩとして計算値Ｃ
，５３，＋１；ＩＩ、８．５１；Ｎ、１１．２Ｅｌ実験
値Ｃ，５２，９８；ＩＩ、８．５１；Ｎ、１１．２０Ｂ
５標識化工トザクシミド複合体の製造乾燥ＤＭＦ５ｍｌ
中に溶解した７−β−ガラクトシルクマリン−３−カル
ボン酸（４００ｍｇ、 Ｉｍｍｏｌ） ［米国特許第４
．２２８，９７８号］、トヒドロキシサクシンイミト゛
１２０Ｉ１ｇ（Ｉｍｍｏｌ）、および、ジシクロへキシ
ルカルボジイミド２００請ｇ（１ｍ＋＊ｏｌ）の混合物
を、１５分間 ０℃で攪拌し、次に、室温まで温めた。 ４１１！ｉ゛間後、ろ過し、ろ液を、上記パート八から
の３−アミノエトサクシミドの１１０１塩１９５腸ｇ（
Ｉｍｍｏｌ）および）友酸水素すトリウム（Ｎａｌｌ（
０３）１７０ｍｇ （２１＋１１０１）を水４ｍｌに溶
解することにより調製された第２の溶液に滴下（−５℃
で５分間にわたって）した０合せた溶液を水浴中で１時
間＋１１！！拌し、次に、冷蔵塵中に一晩放置した。シ
リカゲルＩＯｇを添加し、高減圧下で溶媒を除去した。 含浸せしめた吸着体を、エチルアセテート中で調製した
シリカゲル１００ｇのカラムの頂部にｎいた。カラムを
エチルアセテート（ＥｔＯ＾Ｃ）Ｉして溶出し、次に、
２Ｌ ＥｔＯ＾Ｃから、２Ｌエタノール（Ｅｔｏｌｌ）
まで徐々に変化する直線状勾配溶液を用いて溶出した。 適Ｆ）Ｊな画分をひとまとめにし、かつ蒸発させて、標
識化複合体１２０１１ｇを’ｍｐ １５７−１８１’ｃ
＋の白色固体として得た・ 分析” ２７’３４’２０１１ ’ ”２０としての
ＡＩ ３二（イ直 Ｃ，５５，８？、ｌ＋、６．
２５．Ｎ、４．８２実験値 Ｃ，５５，５２；Ｉｔ、Ｂ
、１０；Ｎ、４．７１Ｃ，エトサクシミド免疫原および
抗体の製造蒸留水（５℃）１０ｍｌを、小さな磁気攪拌
林を備えた試験管中に取った。磁気ＩＷ拌器を用いて、
穏やかに攪拌しながら、 ２−（４−７ミノブチル）−
３−エチル−３−メチルサクシンイミト（前出 ） ９
ｆ１．ｌ＋ｓｇ（０，３９ｍｍｏ、Ｉ）を水に溶解した
。溶液のｐＨ（−２，５）を１Ｍ水酸化すトリウ１．（
ＮａＯＩＩ）を滴下することにより、４．５に調整した
０次に、溶液を氷水浴中で５°Ｃに冷却した。穏やかに
、攪拌しながら、仔牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）１０
０ｍｇ（１，５２ｐ、 ｍｏｌｅ）を、小さなバッチ中
で、冷却したエトザクシミｌ’誘導体溶液に、 ｌｌ５
Ａをさらに添加する前に各バッチが完全に溶解したこと
をｍ認しながら、徐々に添加した。すべてのＢＳＡが溶
解した後、溶液のｐｌ＋を調べ必要ならば、ｐｌ＋４．
５に再調整した。ふたたび、穏へ５かに撹拌しながら、
１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カ
ルボジイミド１ｌｃＮｉｌ （ＥＤＣ）２７１）ｍｇ（
１，４ａ＋ｇｏ＋）を、冷却した溶液混合物に徐々に添
加した（すべてのＥＤＣを１分以内に添加した）。 この溶液を冷室で一晩４℃で穏やかにＩＷ、拌した。 翌軌、反応混合物を室温まで温め、セファデックス（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５のカラムに施した。 反応混合物を、５＋ｗＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０
）で先に平衡化したセファデックスＧ−２５（微粒）［
フルマシア、ビスカタウェ仁ニュー・シャーシーアメリ
カ合衆国 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｇｃａｔａｗａ
ｙ、 ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ ＵＳＡＩ］のカラム（３
，０ｘ５５ｃｍ）に施した６画分４．３ｍｌを採集し、
２８０ｎｍでの吸光度を監視した。 カラムの室容積中に溶出されたエトサクシミド−ＢＳＡ
複合体およびこれらのカラム画分（２５−３０）をひと
まとめにした１次に、免疫原プールの蛋白質濃度を、適
切な方法を用いて測定し【例えば（ローリ−等（Ｌｏｗ
ｒ７ ｅｔ ａｌ））Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１９３
０：２Ｏ２頁（＋９５７）］ 蛋白質濃度がＩＢ／ｍｌ
より大きければ。 免疫原を食塩水（０，８５Ｘ Ｍａｉｌ）でｌａｇ／ｍ
ｌに稀釈した。 免疫原（ＩＩＩｌｇ）１）６ミリリツトルを、フロイン
ト完全アジュバント１２１および食塩水６１と合せた。 それぞれ、この混合物２ｍｌを用いて、皮下注射で、ラ
ビットを免疫化した。３週間後、不完全フロイント・ア
ジュバントを用いて調製した同一混合物で、かれらを再
免疫化した。ブースター免疫化を４週間毎に繰返した。 試験採血をブースター後ｌｉＩ！１間で行った。適９Ｊ
な適宜量を有した抗血清が、最初の免疫化後６ケ月まで
に得られた。 双疲茗） エトサクシミドのための均−系基質一標識化蛍光性免疫
試験（ＳＬＦＩＡ−米国特許第４，２７９，９９２号）
が、次のように確立された： ＾５ 試薬 １、抗体／ｎツ素試薬−１、５ｆｉｔ位／１β −ガラ
クトシダーゼ、抗血清が存在しない場合の蛍光の５ｚま
で蛍光を減光するに十分な、エトサクシミド免疫原（試
薬、上記パートＣ）に対して産生された抗血清、わよび
１５．４＋＊Ｍアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＮ八
イシへｍａｌ（ＨＭ、Ｈ−ビス−（２−ヒドロキシエチ
ル）グリシン、カルビオケＪ１−ベーリング・コーポレ
ーション、ラジョラ、カリフォルニア。 アメリカ合衆国 （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−ロｅｈｒｉ
ｎｇ Ｃａｒｐ、。 ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａυＳ＾）］（ｐ
Ｈ８，５）。 ２、 複合体試薬−０，００１！（マ／マ）トウィーン
（丁ｗｅｅｎ）２０ 、ならびに、 ０．Ｉ９ｐＬＭ（
マイクロモル）β−ＧＵ−エトサクシミド（試薬、上記
パー）Ｂ）および１５．４ｍＭアジ化すトリウムを含イ
■する３０腸Ｎ−￥酸工ステル緩衝液（ｐｌ＋３．５）
。 ３．工トザクシミド標準液−正富なヒト血清に添加され
た米国薬局法ｉ準品エトサクシミド ；５．４ ｍＷア
ジ化ナナトリウム含有する、５０＋ｓＭバイシン緩衝液
で５１倍に稀釈したもの。 Ｂ、 試験方法 キュベント中の３ｍｌ容琶の抗体／酵素試薬に、稀釈エ
トサクシミド標準液 ＋００ｐ！（マイクロリンドル）
を添加した。次に、反応を開始するために、複合体試薬
＋００ｐＬｌをＩ兇拌しながら各キュベ、１・に添加
した。２０分後、イ１ｆ光強度を各キュベント中で３１
１足した（励起４００ｎｍ、発光４５０ｎｍ）。 Ｃ１結果 試験を行ったところ次の結果を得た エトサクシミＦ 蛍光単位 （ジノ１リー −←１皿ｍ Ｑ ３９．０ ２０ ５０．５ ５０ ８４ θ１０Ｄ
００．０１５０
９０．０この免疫
試験は、血清試料中のエトサクシミド濃度を測定するの
に用いることができた。 手続補正前 Ｏｄ和５８年８月２５日 ｑ、′ｒ許庁長官 若 杉 和 夫 殿１、事件の表
示 昭和５８年 特 許 願第 ９５１０８ ５２、発明の
名称 エトサクシミド免疫原、抗体、標識化複合体および関連
誘導体 ３．７山正をする者 事（′１−との関係 ｌ待ｌｉ／［出願人４、代 理
人 ５、補正命令の日イ；１ 自 発 （５，補正ｔこより増加する発明の数 な し８、浦
゛正の内容 １、＃ｊＩｌの発明の名称の欄を以下のとおり補正する
。 ［エト→）”クシミド免疫原、抗体およびそれを用いる
免疫試験によるエトラクシミド測定用試薬」 Ｕ、明細書の発明の名称の欄を以下のとお）補正する。 「エトラクシミド免疫原、抗体およびそノＬを用いる免
疫試験によるエトツク７ミド測定用試薬」 肩、明細書の特許請求の範囲の欄を別紙のとおり補正す
る。 ２、特許請求の範囲 １．免疫ヤｌ」！−！体材と、共イ１結合で、その３−
４：ｔで連結した工Ｉ・サクシミドからなることを特徴
とする工トサクシミ）・免疫原。 ２、該４１１体月が、蛋白質またはポリペプチドである
特許請求の範囲第１項記載の免疫原。 （式中、Ｒは連結基であり、Ｔは免疫性押体材であり、
かつ、ｐは平均して１から約５０ま項記載の免疫原。 ４、該連結基が、水素を除くｌおよび約２０個の間の原
子からなる原子鎖である特許請求の範囲第３ Ｊａｒ記
載の免疫原。 ５、該担体材が、蛋白質またはポリペプチドである特許
請求の範囲第３項またはｔ５４項記載の免疫原。 （式中、Ｙはアミド基であり、Ｔは免疫性蛋白質担体材
または免疫性ポリペプチド担体材であり、ｎは１からＩ
Ｏまでの整数であり、かつｐは、平均して■から該担体
材」−１の利用しうるアミド結合部位の数までである）
で示される特許請求の範囲第３項記載の免疫原。 ７、アミド基Ｙ中の炭素原子が、担体材中のカルボキシ
ル基からのものであり、アミド基Ｙ中の窒素原子が、式
中のアルキレン基と結合しており、かつ、Ｐが、平均し
てｌから該担体材中の利用しうるカルボキシル基の数ま
でである特の免疫原。 体。 抗体６ ＋４ 、 、ｊ４式中の−Ｒ−が−（ＣＨ２几−Ｙ−詐
請求の範囲第１ｆ項記載の抗体。 の抗体。 薬。 １８、該１１１体材が、蛋白質またはポリペプチドであ
る特許請求の範囲第１７項記載の免疫試験によるエトサ
クシミド測定用試薬。 １８、該エトサクシミド免疫原が、式：（式中、Ｒは連
結基であり、Ｔは免疫性相体材であり、かつ、ｐは平均
して１から約５ｏま試薬。 間の原子からなる原子鎖である特許請求の範囲第１８項
記載の免疫試験によるエトサクシミド測定用試薬。 ある特許請求の範囲第１８項または第２０項記載の免疫
試験によるエトサクンミドｆｉｌｌ定用試薬。 （式中、Ｙはアミド基であり、Ｔは免疫性蛋白質担体材
または免疫性ポリペプチド担体材であり、ｎは１から１
０までの整数であり、かつｐは、平均してｌから該担体
材−１−の利用しうるアミド結合部位の数までである）
で示される特許請求の範囲第１８項記載の免疫試験によ
るエトサクシミド測定用試薬。 ２３、アミド基Ｙ中の炭素原子が、担体材中のカルボキ
シル基からのものであり、アミド基’１’ 中の窒素原
子が、式中のアルキレン基と結合しており、かつ、ｐが
、平均してｌから該１１体材中の利用しうるカルボキシ
ル基の数までである特許請求の範囲第２２項記載の免疫
試験によるエトサクシミド測定用試薬。 ２４、ｎが、４である特許請求の範囲第２３項記載の免
疫試験によるエトサクシミド測定用試薬。
と呼ばれるようになる。かくして、当業者が、本発明の
誘導体および複合体に誘導しうる広範囲の連結基Ｒ°お
よびＲを有するということが容易に判る。かかる選択の
例としては、１から１５個に至るまでの、さらに、通゛
畠には１０個以下。 および、普通には、６個未満の炭素原子からなる線状お
よび枝状アルキレン基類（例えば、メチレフ ）、ｋ
、エチレン基、＋１−フロピレン基、イソ−プロピレン
ツ＆、ｎ−ブヂレン基等）がある、加えるに、かかるア
ルキレン基類は、シアノ基、アミノ基（置換アミン基を
含む）、アシルアミノ基、ハロゲン、チオール基、ヒド
ロキシル基、カルボニル基、カルボキシル基（エステル
類、アミド類および置換アミド類のような置換カルボキ
シル基類を含む）のような他の置換基を含むこともでき
る。 連結基Ｒ′およびＲもまた置換または非置換アリール基
、アラルキル基またはヘテロアリール基（例えば、フェ
ニレン基、フェニレン基等）を含有するか、または、か
ら成ることができる。さらに、かかる連結は、エーテル
基、゛エステル基、アミド基、アミノ基、チオエーテル
基、アミジノ）＋（、スルホンノ＾またはスルホキシド
基の形で、窒素、硫賛および酸素から選択されたｌまた
はそれ以上のへテロ原子を含有することもできる。また
、かかる連結は、オレフィン結合もしくはアセチレン結
合、イミノ基またはオキシ・イミノ基のような不飽和基
を含有することもできる。好ましくは、ＲおよびＲｏは
原子鎖であり、通常は、水素を除くｌおよび約２０個の
間の原子から成る、さらに、通常には、ｌおよび１０個
の間の原子から成る脂肪族基であり、そのうちのＯから
５個は窒素、酸素および硫負から選択されたヘテロ原子
である０式中、Ｒｏが−（ＣＩ＋２−− （ｎは］から
１０までの整数）であり、Ｚが７ミノ基またはカルボキ
シルである誘導体が，特にｔＩＩましい。したがって、
連結，！Ａ ｎ ’およびＨの選択は，本発明では特に
制限されず、安定な化合物が製造されるべく通への注意
を払って、普通の熟練者によって、選択されてもよい。 同様に、末端官能基Ｚは、アミノ基、カルボキシル基、
チオール基，ヒドロキシル基およびマレイミドノ＾が好
ましいであろうが、広範囲に変化することができる。か
かるｔＩｒましい末端官能基を有する３−工Ｉ・サクシ
ミド誘導体を得るのに利用しうる，合成ルートの例は次
のようである。 （ａ） ３− （カルボキシルツ（−官能〕，（化）エ
トサクシミド類 工程２または３の操作にしたがって、中間体（５）また
は（９）は、Ｘが、先に定義したような脱１！ＩＮ基で
あり、Ｚが、カルボキシル基またはカルボキシル基、（
に転換しうる置換体である試薬（６）を用いてアルキル
化することができる。脱離基Ｘが、典型的な求核置換を
行うような方法で、Ｒ゛に伯加されることが、唯一の制
限である［ ヨールド（Ｇｏｕｌｄｌ Ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍ ａｎｄ ５ｔｒ１Ｊｃｔｕｒｅ ｉｎ 肛世山
旺」凪コ ホルト、ラインハートおよびウィンストン
、インコーボレーテンｌ”にューＥ＝り１９５９）（ｌ
１ｏｌｔ、Ｒｉｎｅｈａｒｔ ａｎｄ Ｗｉｎｓｔｏｎ
、Ｉｎｃ、 （ＮｅｗＹｏｒｋ １９５９））２５０
頁以降参照］。 例えば、（５）は、パンクラ−”Ｊ （Ｂｕｃｋｌｅｒ
ｅｔａｌｌ 、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、 ２１巻：１
２５４頁（１９７Ｂ）により記載されているように、３
−クロロプロピオン酸のカリウム用を用いて、アルキル
化すると、環化後、（８） （Ｒ’＝Ｃ１１２ＣＩ＋２
． Ｚ＝ＧＯＯ１ｌ）を生成することができる。中間体
（８）は、２−（３−クロロプロピル）１！１化ベンジ
ルを用いて、アルキル化すると、（７）） を生成することができ、これは、シアン化物イオンと反
応し、酸で処理すると、カルボキシルエトサクシミド（
８） （式中、 ） を生成するであろう［パンクラ−等（Ｂｕｃｋｌｅｒ
ｅｔａｌｌ 、 Ｅｕｒｏ 、Ｊ、Ｍｅｄｌｌ；ｈ
ｅｍ、 １２巻：４６３頁（１９７７）参照］。また
、中間体（５）または（８）のいずれも、エヂルーω−
ブロモアルカノアート類 Ｂｒ（Ｃｌ１２）。 −６００Ｃ２１１５（ｎ ＝ ２を除く）を用いて、ア
ルキル化すると、醜で処理すれば、Ｒ’ ＝（ＣＩ＋２
）ｎ およびＺ ＝Ｃ’００１ｉである３−置換工ト
サクシミド誘導体を４：。 成する中間体を生成することができる。ｎ ７！Ｉ”−
１カ）ら４であるエチル−ω−ブロモアルカノアート類
は、市１■されている［アルドリンチ金ケミカル−カン
パニー、ミルウオーキー、ライスコンシン（八１ｄｒｉ
ｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、、Ｍｉｌｗａｕｋ
ｅｅ、Ｗｌｌ］； ｎ カ＜ ５から９のものは
公知の化合物である；ノ＜−カー等（Ｂａｒｇｅｒ ｅ
ｔ ａｌｌ、Ｊ、Ｃｈｅｍ、５ｏｃｙ−、（１９７３）
７１４頁）；４Ｊ−−モア −１／ ＩＪグツイア
−（Ｓａｌｍｏｎ−ＬＢａｇｎｅｕｒｌ、Ｂｕｌｌ、Ｓ
ｏｃ、Ｇｈｅｍ、 （７ランス） （１９５Ｇ） ４１
１頁；ならヒニリンネルオヨびポーラ（Ｌｉｎｎｅｌｌ
ａｎｄ Ｖｏｒａｌ、Ｊ、Ｐｈａｒｍ、Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ、４巻＝５５頁（１９５’２）参照。 （ｂ） ３− （アミツノ１（−官能基化）エトサクシ
ミド類 先の（ａ） ’］において定義したＸおよびＲ゛をｊ１
１１／Ａて、中間体（５）または（９）は、Ｚがアミン
基である。さらに、好ましくは、アミノ基番こ転換され
うるブロックされたアミノ基または官能基である試薬（
０）と反応させることができる。 例えば、（５）は、Ｎ−（ω−ブロモアルキルクルイミ
（・類で、アルキル化すると，中間体げ）（式中、 ） を生成することができ、これは、酪で、次しＸで、ヒド
ラジンで，処理すると，アミノーエトサクシミト（８）
（Ｒ’＝（Ｇ）ｌ ） 、Ｚ＝ＮＨ，、）を生成す
るであるｎ う。ト（ω−ブロモアルキル）フタルイミド類（ｎ＝２
−４）は市阪されている。類縁体（ｎ＝５−９）は、公
知の化合物である；デイルシャールおよびワインカート
ンｉＤｉｒｓｃｈｅｒｌ ａｎｄ Ｗｓｉｎｇａｒｔｅ
ｎ）、 Ａｎｎ。 ５７４巻；１３１頁（＋９５１） ； ミュラーおよ
びクラウス［Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｋｒａｕｓｓｉ
６１ 巻＝２１９頁（＋９３２）；エルダーフィールド
等 （Ｅｌｄｅｒｆｉｅｌｄ ｅＬ ａｌｌ、Ｊ，＾ｍ
ｅｒ．Ｇｈｅｍ．ｓｏｃＪ８巻：１５６８ Ｊ：Ｌ（１
９４６）； ｌ’ナウエ等 （［ｌｏｎａｕｅ
ｅＬ ａｌｌ、 Ｊ．Ｏｒｇ．ＣＩ＋ｅｍ ２２
巻 二 ６８ 頁（＋９５７）参照。 シーアニオン（９）は、塩化アリルでアルキル化すると
、（８） （Ｒ’＝Ｃ！１２．Ｚ ＝Ｃｌ１＝ＣＩ＋
２）を生成することができる。Ｏｓ Ｏａ ／ Ｎ ａ
Ｉ Ｏａを用いて、これを酸化すると、アルデヒド
（８） （Ｒ’＝Ｃ１１２，Ｚ＝ＣＩＩＯ）全生成し］
パボー等（Ｐａｐｐｏ ｅｔ ａｌ） Ｊ、肛Ｌ■Ｊ、
２１巻＝４７８頁（１９５Ｂ）） 、 これを、還元
的に、アルキル化すれば、Ｚ＝旧（２の１級アミン（８
）を生成することができる［ポルチ等、（Ｂｏｒｃｈ
ｅｔ ａｉ 、 Ｊ、＾ｍｅｒ、Ｇｈｅｍ。 針ム９３巻：２８９７頁（１９７１）］ 。 （Ｃ） ３− （チオール基−官能基化）エトサクシミ
ド類 上述のＸおよびＲｏを用いて、３−（アミン置換）化合
物をトサクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオン酸エステルと反応させ、かつ、生成物を、Ｚ
＝Ｓ）ｌの、ｍ＃のチオール化合物（８）に還元するこ
とにより、チオール基を、エトサクシミドの３−位に、
伺加することができる［カールソン等 （Ｃａｒｌｓ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ）、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、
１７３巻＝７２３頁（１９７８）］ 。 チオール置換体は、また、ハロゲンを硫Ｍ求核子で置換
することにより、３−（ハロゲン置換）エトサクシミド
類より得ることもできる［し」１先り二ｔｉｖｅ Ｏ
ｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４版、ヒルゲター
グおよびマルチー二編、ジョン・ワイリー・アンドΦサ
ンズ（三ニーヨーク、＋９７２） （Ｉｌｉｌｇｅｔａ
ｇ ａｎｄＭａｒｔｉｎｉ、ｅｄｓ、、Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅ７ ａｎｄ ５ｏｎｓ、（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。 （＋９７２）） ８３４頁１゜かかるハロゲン誘導体は
、適切なビス−ハロゲン化合物と（５）または（８）と
の反応により、（ａ）項および（ｂ）項において１．に
に示したようにして、製造することができる。 （ｄ）３−（マレイミド基−官能基化）エトサクシミド
類 マレイミド基で官能基イ「「れたエトサクシミド誘導体
は、相当するアミン化合物を、無水マレイン酸と反応さ
ゼで、（１０）を生成し、かつ、これを環化してマレイ
ミド誘導体（１１）を生成することにより、下記の工程
４において示すようにして製造することができる。また
、この薬剤のアミノ誘導体はマレイミド−置換カルボン
酸類と反応して、にの（ｂ）項のアミン類に存在する元
の連結基Ｒ′が、マレイミドカルボン酸によって与えら
れたＲ” およびアミド官能基により拡張されているマ
レイミド−置換エトサクシミド類（１２）を生成するこ
とができる。後者の試薬の例としては、Ｒ”がフェニル
基ならびに線状および枝状アルキル基であるものが知ら
れている［キタガワおよびアイカワ、Ｊ、旧ｏｃｈｅｍ
、７９巻：２３３頁（１９７８）； ケラ−およびルデ
ィン刀−（Ｋｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｕｄｉｎｇｅｒ）
１ｌｅｌｖ、Ｃｈｉｍ。 （ｅ） ３−（ヒドロキシル基、（−官能〕、′５化
）エトサクシミド類 ヒドロキシル基−官能基化工トザクシミド類は、中間体
（５）、ｔ：３ヨび（９） ヲＸ−Ｒ’−Ｚ（Ｂ） ト
反応させることにより製造することができ、式中、Ｘお
よびＲｏは上に定義したとうりであり、Ｚはヒドロキシ
ル基、または、さらに通常には、保護されたヒドロキシ
ル基またはヒドロキシルノ人に転換しうる官能基である
。 例えば、（５）はω−ヒドロキシアルデヒド類の群から
入手しうるＸ −（ＣＩシ） ｎ−ＣＩＩ Ｏを用いて
アルキル化し［ハード等（Ｈｕｒｄ ｅｔ ａｌｌ
Ｊ、八ｍｅｒ、ｃｈｅｍ、ｓＯｃ。 ７４巻： ５３２４頁（１９５２）］ 、かつ、生成物
を環化および還元すると、（８） （Ｚ＝０１１．Ｒ
’＝（Ｃ：１１．、）ｎ）を生成することができる。 上記の合成ルートから、式： ％式％ （式中、Ｚは、免疫性担体材または適切な標識残基と結
合するだめの活性基である（例えば、Ｚは、アミン基、
カルボキシル 基、メルカプトノルまたはマレイミド基であってもよい
）である）の３−ｗ換エトサクシミド誘導体が，連結基
Ｒ°の性質において広範囲の自由度をもって生成するこ
とができることは明らかである。 かかる誘導体は、利用しうる手法により、免疫性担体材
および櫟識物賀に結合させることができる。カルボキシ
ル基−含有薬剤部分は、４１１体および標識のアミノ基
に、普通のペプヂド結合生成反応，例えば、アルキルク
ロロホルメート類およびカルボジイミド類のような試薬
でカルボキシル基を活性化することに基づく反応 ［Ｔ
ｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １巻、クロスおよびブイエン
ホフγ−編．アカデミ、クープレスにューヨーク、１９
７９）（ Ｇｒｏｓｓａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，
ｅｄｔｓ．、＾ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ １９７９）ｌ ２４２頁以降］により、カル
ポニルジイミタゾール［ヒルゲターグおよびマルチーニ
（ｌｌｉｌｇｅｔａｇ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎｉｌ、前
出、４８２頁］により、または、そのアシルアジドとじ
て、活＋１化することにより結合させることができる。 アミノ基−官能基化化合物は，カルボキシル基誘導体の
ために引用されたアミド結合生成反＋ｇ、を用いて、カ
ルボン酸含有Ｊｌｌ１体および標識に結合させるごとが
できる。さらに、薬剤部分のアミン基は、次の試薬を用
いて４目体または標識のアミノ基に連結することができ
る ：トルエンー２．４ージインシアネート［バーズお
よびタイマシェフ ｆｌｌｉｒｓ ａｎｄ Ｔｉｍａ−
ｓｈｅｆｆ）Ｍｅｔ ｈｏｄＳ ｉｎ ＥｎＺｙｆｆ
ｌｏｌ． ２５ ０ （ パ ー ト Ｂ）
二６２５頁（＋９７２）］； ］４，４’ージフルオ
ロー３．３′ジニトロ−ジフェニルスルホン［コートレ
カサス等（Ｃ：ｕａｔｒｅｃａｓａｓ ｅｔ ａｌｌ
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ：ｈｅｍ． ２４４巻＝４０６
頁（１９Ｈ）］；ゲルタールアルデヒド［フローマン等
（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌｌ 、 Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌ． ８７巻＋１０５５頁（１９７０）］ ；
］２ー官能性イミドエステル類タラトン’Ｊ （Ｄｕｔ
ｔｏｎ ｅｔ ａｌｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｎｕ＋。 ２３０ ： ７３０頁（１９［ＩＢ）］またはククロロ
トリリアジン［ケイおよびクルンク（Ｋａｙ ａｎｄ
Ｃｒｏｏｋ） 、 ＮａＬｕｒｅ２１６巻；５１４頁（
１９８７） ］。チオール基−含有類縁体は、二値化物
交換操作によって，チオール基−含有担体または標識に
結合させることができる（マーチン等（Ｍａｒｔｉｎ
ｅｔ ａｌ）、Ｂｉｎｃｈｅｍ． ２０巻：４２２９
頁（１９８１） ］。また、アミノ基−含有担体または
標識は、マレイミド基置換カルボン酩と反応さセ［ケラ
−ｔ−３よびルディンガ− （ Ｋｅｌｌｅｒ ａｎｄ
Ｒｕｄｉｎｇｅｔｌ 、 ｎｉｊ ＩＬＩ ］ 、 −
ｒ−れをチオール基−官能基化薬剤ど結合させることが
できる［キタガワおよびアイカワ、前出］。これらの化
合物は，チオール基−含有担体または標識に、キタガワ
およびアイカワ（ ｒｔｉｊｆｉｌ ）により記載され
た方法により結合させることができる。チオール基は、
アミノ基−含有１１！体または標識、特に、蛋白質に、
ホワイト（Ｗｈｉｔｅｌ 、 Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙ＋ｓｏ１．２５ 巻゛ （
バ ー ）Ｂ）：５４１亘（ＩＱ７２）により記載され
た方法により、導入することができる。 勉１区翌ユ」 本発明の３−エトサクシミド免疫原から産生される抗体
は、凝集反応法、放射性免疫試験，不拘ー系ｆＷ素免疫
試験（米国特許第３，［１５４，０９０号参照）不均一
系蛍光性免疫試験（米国特許第４，２０１。 ７６３号；第４，１７１，３１１す；第４，１３３，６
３９号および第３，９９２，ｔ＋３１吋参照）および均
−系（分＃操作を含まない）免疫試験をはじめとする、
エトサクシミド測定用の免疫試験法および相当する試薬
に用いることができる．最後のものは、特に、々ｆまし
く、蛍光減光または増加（米国特許第４，１８０，Ｏｌ
ｌｌｔ号参照）、蛍光偏光 （ Ｊ，Ｅｘ．Ｍｅｄ．
１２２６ ： ｌ ０２９頁（１９＋（５）参照）、酵
素基質−標識化免疫試験（米国特許第４ 、２７９ 、
９９２号および英国特許明細書第１ 、５５２ 、８０
７号参照）、補欠分子族−標識化免疫試験（米国特許第
４，２３８，５８５吟参ｊｉｌ；ｌ，）、例えば阻害物
標識（米国特許第４，１３４，７９２″′ｆおよび第４
，２７３。 ｅｅｅ号参照）を用いる酵素活性調整物−標識化免疫試
験、酵素−標識免疫試ＶＪ！（米国特許第３，８１７。 ８３７号参照）、エネルギー移動免疫試験（米国特許第
３ 、９１１ｆ（ 、３４５号参照）、化学的−励起イ
）？尤免疫試験（米国特許第４．２３（１，１９５号参
照）おＪ、び二組抗体立体障害免疫試験（米国時３″Ｉ
第３ 、 ９ ３ ５ 、 ９ ７ ４ ’Ｉ−。 および第３，９９８，９４３号参照）のような手法を包
含する。 さらに、本発明の３−工トサクシミド誘導体は、１、記
の種々の免疫試験を遂行するのに必要とされる標識化複
合体を９Ａ造するのに、用いることができる。適切な誘
導体は、標準方法により、放射性標識化またはイ１を光
性部分を用いて標識化を゛行ってもよい。同様に、例え
ば、酵素基質、補欠分子族、酵素活性調整物または酵素
（蛋白質であり、がっ、上述の免疫性Ｉｕ体に同様に結
合されうるちの）のような好ましい均−系法のための適
切な標識部分は、３−エトサクシミト誘導体と結合して
、標識化複合体を生成することができる。 １、シに、（！ｆましい標識化複合体は４式：（ ％式％） （式中、−（ＣＯ）βＧＵは １ であり、ｎはｌかも１０までの整数である）のβ−ガラ
クトシルーウンベリフェロンーエトサクシミト複合体で
ある。かがる複合体は、適切な３−（アミノアルキル ルーウンベリフェロンカルボン酸（米国’＋Ｉ ｉ ｆ
ｆｉ ４ 。 ２２８、９７８号）との標準ペブヂ１：縮合によって製
造される。 本発明の試薬系は、本発明により包含される所望のエト
サクシミド免疫試験法を行うのに必要と・されるすべて
の必須の化学的な要素からなる。試薬は箱詰め状の市販
品の形で、試薬間での両立ができる範囲で組成物もしく
１士混合物として；試験具の形で；または、試験キント
すなわち８星な試薬を保管するｌまたはそれ以上の容器
の箱詰め組合ゼどして提供される６所望の結合反応系に
は、適９」な試薬、例えば、本発明の抗体および標識化
複合体か含まれる。勿論、この試薬系は、当業者に公知
の緩挿ｉ糠、稀釈剤、標準液等のような商業上およびユ
ーザーの立場から望ましい他の物質を含有してもよい。 特に１１ｒましいものは、本発明の（ａ）エトサクシミ
ド る際変化する検出ｎ（能な性質を有する標識化工トザク
シミト複合体からなる本発明の均一系競争結合免疫試験
用の試験キントである。また、本発明の工Ｉ・サクシミ
ド抗体および抗体と結合する際。 変化する検出Ｔ＋ｆ能な性質を有する標識化エトサクシ
ミド複合体、ならびに、その試薬組成物を包含せしめた
、固体状１＋３体材からなる試験具が好ましい。種々の
形のかかる試験具は、１９８０年１０月３０［Ｉ出願の
米国！１１．Ｖ ４１出願ｆｆｉ ２０２，３７８吟に
記「成されている。ｆｆｆましい．ｉｌ（９キントおよ
び試験具に用いられる特異的標識は、−１．述のように
、用いられる方法に依るであろう。 ここに、本発明を説明するか、次の実施例にＪ：り限定
されるものではない。 実施例 Ａ 、 工ｌ・ナクシミド誘導体の製造エチル−２−シ
アノ−３−メヂルー２−ペンテノエートエチルシアノア
セテ−１・５０グラ１、（ｇ） ［０．４４ｍｏｌ（モ
ル）］、メヂルエチルケトン３２ｇ（０．４４ｍｏｌ）
、ピペリジン１３ ミリリンドル（ｍｌ）、氷量％１．
３ｍｌおよびトルエン１５０加１の混合１勿を１ ７
＋１＋ｉ間，伺設されたウォター・トランプを用いて還
流した。溶媒を除去し，残渣を高減圧下で７Ａ！’／ｆ
シて、ｌ）ｐ ８２−６５”Ｃ １０．１ ｔｏｒｒ
（ ） −ル） （７）−Ｌ ステル６０ｇを１１１
だ。 」−記のエチルエステル２０．ｆｆｇ（（１．１２２ｍ
ｏｌ）を、メタノ−）ｌｙ （ＭｅＯｌｌ）２５０ｍ
ｌにシアン化カリＬ２ｇ（ｏ．＋２２ｍ０１）を溶解し
たスラリーに添加し，室温で，−晩、攪拌した。ここで
、Ｎ−（４−ブロモブチル）フタルイミド３４．５ｇ（
０．１２３ｍｏｌ） を添加し、反応物を、５０間、不
活性カス雰囲気下で還流した。それを室温に冷却し、か
つ、ろ過して無機物質を除去した。−・晩冷却すると、
ろ液から、賛白色固体としてジニトリル１７．１ｇが析
出した。この物質はメチルエステルであり、タルク（シ
リカゲル板−Ｌで９＝１の四Ｊ１２化炭素（ＣＣＩ、）
：アセトン）上で均一である。Ｍ ｅ ＯＩＩから再
結晶して、ｍｐ １１３−１＋５°Ｃの白色結晶を生成
することにより、分析試ネ′１を得た。 分析” ２１”２３Ｎ３０４として。 具１ 算 イーオ ： Ｃ，ｅｅ、ｔ ３； ＩＩ
、 ｅ、ｏａ； Ｎ、 １１．０２実験値：
Ｃ，６ｅ、ｏａ； １１． ｅ、ｏｅ； ？ｌ、 １０
．７０」二重のメチルエステルジニトリル７．７ｇ （
０，０２ｍｏｌ）、塩化ナトリウム２．３４ｇ（０，０
４ｍｏｌ）、水（１１，、Ｏ）０．５４ｇ’ （０，０
３ｍｏｌ ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
の混合物を、１８５分間、正確に１２５℃で加熱した。 次に、ＤＭＳＯを、浴温８０℃で、ロータリーエバポレ
ーター（回転蒸発器）で、８０分かけて除去した。残渣
をクロロフォルム（ＣＩＩＣＩ、）で溶解し一回、木で
洗浄した。水洗液をＣｌＩＣｌ３で再洗ｆ７１ Ｌだ。 合せた有機抽出液を水洗し、無水硫酸すトリウム上で乾
燥し、ろ過、蒸発させると、淡赤色の油状物質として、
２−エチル−２−メチル−３−（４−Ｎ−フタルイミド
ブチル）サクシノニトリル５．５ｇを生成した、この油
状物質のＩＩＮＭＲスペクトル（ｃｏａ１３）は、予期
したピークをイーした：６１．５（ＣＩ＋３− 爪）お
よび６１．２（Ｃ１１３三重）、この物質を、これ以上
の゛精製を行わずに用いた。 ｅ、ｅｘの水を含む儂硫
酸２０ｍ１に、このニトリル３．６ｇを溶解した溶消を
、室温で２時間ＩＷ拌し、次に、１００℃で２．５時間
加熱した。これを、氷１００ｇ上に注ぎ、かつ、氷が溶
解してから、混合物を０１１０１３で二回抽出した。合
せた有機抽出液を水洗し、乾燥蒸発した。残渣をシリカ
ゲル１００ｇを用いて、クロマトグラフにかけＣｌＩＣ
ｌ３中２．５＄７ セ） ン（３９：１ ｖ：ｖ）テ溶
出し、両分１７ｍ１を採集した０両分７５−１００を合
せ、かつ、蒸発して、ビス−イミド８５０ ミリグラ
ム （ｍ ｇ ）を重い油状物質として得た。 分析：質酢分析（７０ｅ、Ｖ、） ａｌｅ ３４２［Ｍ
”ｌ ； ３１３［Ｋ” −Ｃ２１１５１ ’ＩＩ ＮＭＲスペクトル （ＣＤＣｌ２）；６７．８
（芳香族基 多重）、 ６３．８ （ｅｌ＋ 広い三重）。 ６２．８ （Ｇｌ＋、広い多重）、 δ１．３ １．２ （０１１８，二重）、δ０．９
（Ｃ１１３，三重）、。 無水エタノール５０ｍ１中に溶解した上記のビス−イミ
ド３．２９ｇ（０，０１ｍｏｌ）および８５％ヒドラジ
ン３７０ｍｇの溶液を加熱して、４５分間還流した。さ
ら（こ。 ヒドラジン５９ｍｇ（０，０５ｍ１）を添加し、３０分
間加熱を続けた。冷却して、溶媒を蒸発させ、力＼つ、
残渣をシリカゲル２５０ｇを用いてクロイドグラフ１３
力）け、８０：１０：１（ｖハハ） Ｇ ｌｌ Ｃｌ
３： Ｍ ｅ ＯＨ： 濃水酸イヒアンモニウム（Ｎ
ｌｌ ＯＨ）で溶出した０画分１４−１を採集した０画
分８３−１４０をひとまとめにし、かつ、蒸発して、３
−７ミノエトサクシミド誘導体１．５ｇを１ｊ１澄な油
状物質として得た。この油状物質のＩｔ ＮＭＲスペ
クトルは、芳香族水素原子を示さず、かつ、脂肪族ＧＨ
Ｊ＆として予期される多重を示した。少Ｉをエタノール
より、 ｍｐ １４０−目８℃の粉末１１０１ ｊｌに
転換した。 分析” １１”２ＯＮ２０２・ＩＩｃＩとして計算値Ｃ
，５３，＋１；ＩＩ、８．５１；Ｎ、１１．２Ｅｌ実験
値Ｃ，５２，９８；ＩＩ、８．５１；Ｎ、１１．２０Ｂ
５標識化工トザクシミド複合体の製造乾燥ＤＭＦ５ｍｌ
中に溶解した７−β−ガラクトシルクマリン−３−カル
ボン酸（４００ｍｇ、 Ｉｍｍｏｌ） ［米国特許第４
．２２８，９７８号］、トヒドロキシサクシンイミト゛
１２０Ｉ１ｇ（Ｉｍｍｏｌ）、および、ジシクロへキシ
ルカルボジイミド２００請ｇ（１ｍ＋＊ｏｌ）の混合物
を、１５分間 ０℃で攪拌し、次に、室温まで温めた。 ４１１！ｉ゛間後、ろ過し、ろ液を、上記パート八から
の３−アミノエトサクシミドの１１０１塩１９５腸ｇ（
Ｉｍｍｏｌ）および）友酸水素すトリウム（Ｎａｌｌ（
０３）１７０ｍｇ （２１＋１１０１）を水４ｍｌに溶
解することにより調製された第２の溶液に滴下（−５℃
で５分間にわたって）した０合せた溶液を水浴中で１時
間＋１１！！拌し、次に、冷蔵塵中に一晩放置した。シ
リカゲルＩＯｇを添加し、高減圧下で溶媒を除去した。 含浸せしめた吸着体を、エチルアセテート中で調製した
シリカゲル１００ｇのカラムの頂部にｎいた。カラムを
エチルアセテート（ＥｔＯ＾Ｃ）Ｉして溶出し、次に、
２Ｌ ＥｔＯ＾Ｃから、２Ｌエタノール（Ｅｔｏｌｌ）
まで徐々に変化する直線状勾配溶液を用いて溶出した。 適Ｆ）Ｊな画分をひとまとめにし、かつ蒸発させて、標
識化複合体１２０１１ｇを’ｍｐ １５７−１８１’ｃ
＋の白色固体として得た・ 分析” ２７’３４’２０１１ ’ ”２０としての
ＡＩ ３二（イ直 Ｃ，５５，８？、ｌ＋、６．
２５．Ｎ、４．８２実験値 Ｃ，５５，５２；Ｉｔ、Ｂ
、１０；Ｎ、４．７１Ｃ，エトサクシミド免疫原および
抗体の製造蒸留水（５℃）１０ｍｌを、小さな磁気攪拌
林を備えた試験管中に取った。磁気ＩＷ拌器を用いて、
穏やかに攪拌しながら、 ２−（４−７ミノブチル）−
３−エチル−３−メチルサクシンイミト（前出 ） ９
ｆ１．ｌ＋ｓｇ（０，３９ｍｍｏ、Ｉ）を水に溶解した
。溶液のｐＨ（−２，５）を１Ｍ水酸化すトリウ１．（
ＮａＯＩＩ）を滴下することにより、４．５に調整した
０次に、溶液を氷水浴中で５°Ｃに冷却した。穏やかに
、攪拌しながら、仔牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）１０
０ｍｇ（１，５２ｐ、 ｍｏｌｅ）を、小さなバッチ中
で、冷却したエトザクシミｌ’誘導体溶液に、 ｌｌ５
Ａをさらに添加する前に各バッチが完全に溶解したこと
をｍ認しながら、徐々に添加した。すべてのＢＳＡが溶
解した後、溶液のｐｌ＋を調べ必要ならば、ｐｌ＋４．
５に再調整した。ふたたび、穏へ５かに撹拌しながら、
１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カ
ルボジイミド１ｌｃＮｉｌ （ＥＤＣ）２７１）ｍｇ（
１，４ａ＋ｇｏ＋）を、冷却した溶液混合物に徐々に添
加した（すべてのＥＤＣを１分以内に添加した）。 この溶液を冷室で一晩４℃で穏やかにＩＷ、拌した。 翌軌、反応混合物を室温まで温め、セファデックス（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５のカラムに施した。 反応混合物を、５＋ｗＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０
）で先に平衡化したセファデックスＧ−２５（微粒）［
フルマシア、ビスカタウェ仁ニュー・シャーシーアメリ
カ合衆国 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｇｃａｔａｗａ
ｙ、 ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ ＵＳＡＩ］のカラム（３
，０ｘ５５ｃｍ）に施した６画分４．３ｍｌを採集し、
２８０ｎｍでの吸光度を監視した。 カラムの室容積中に溶出されたエトサクシミド−ＢＳＡ
複合体およびこれらのカラム画分（２５−３０）をひと
まとめにした１次に、免疫原プールの蛋白質濃度を、適
切な方法を用いて測定し【例えば（ローリ−等（Ｌｏｗ
ｒ７ ｅｔ ａｌ））Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１９３
０：２Ｏ２頁（＋９５７）］ 蛋白質濃度がＩＢ／ｍｌ
より大きければ。 免疫原を食塩水（０，８５Ｘ Ｍａｉｌ）でｌａｇ／ｍ
ｌに稀釈した。 免疫原（ＩＩＩｌｇ）１）６ミリリツトルを、フロイン
ト完全アジュバント１２１および食塩水６１と合せた。 それぞれ、この混合物２ｍｌを用いて、皮下注射で、ラ
ビットを免疫化した。３週間後、不完全フロイント・ア
ジュバントを用いて調製した同一混合物で、かれらを再
免疫化した。ブースター免疫化を４週間毎に繰返した。 試験採血をブースター後ｌｉＩ！１間で行った。適９Ｊ
な適宜量を有した抗血清が、最初の免疫化後６ケ月まで
に得られた。 双疲茗） エトサクシミドのための均−系基質一標識化蛍光性免疫
試験（ＳＬＦＩＡ−米国特許第４，２７９，９９２号）
が、次のように確立された： ＾５ 試薬 １、抗体／ｎツ素試薬−１、５ｆｉｔ位／１β −ガラ
クトシダーゼ、抗血清が存在しない場合の蛍光の５ｚま
で蛍光を減光するに十分な、エトサクシミド免疫原（試
薬、上記パートＣ）に対して産生された抗血清、わよび
１５．４＋＊Ｍアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＮ八
イシへｍａｌ（ＨＭ、Ｈ−ビス−（２−ヒドロキシエチ
ル）グリシン、カルビオケＪ１−ベーリング・コーポレ
ーション、ラジョラ、カリフォルニア。 アメリカ合衆国 （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−ロｅｈｒｉ
ｎｇ Ｃａｒｐ、。 ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａυＳ＾）］（ｐ
Ｈ８，５）。 ２、 複合体試薬−０，００１！（マ／マ）トウィーン
（丁ｗｅｅｎ）２０ 、ならびに、 ０．Ｉ９ｐＬＭ（
マイクロモル）β−ＧＵ−エトサクシミド（試薬、上記
パー）Ｂ）および１５．４ｍＭアジ化すトリウムを含イ
■する３０腸Ｎ−￥酸工ステル緩衝液（ｐｌ＋３．５）
。 ３．工トザクシミド標準液−正富なヒト血清に添加され
た米国薬局法ｉ準品エトサクシミド ；５．４ ｍＷア
ジ化ナナトリウム含有する、５０＋ｓＭバイシン緩衝液
で５１倍に稀釈したもの。 Ｂ、 試験方法 キュベント中の３ｍｌ容琶の抗体／酵素試薬に、稀釈エ
トサクシミド標準液 ＋００ｐ！（マイクロリンドル）
を添加した。次に、反応を開始するために、複合体試薬
＋００ｐＬｌをＩ兇拌しながら各キュベ、１・に添加
した。２０分後、イ１ｆ光強度を各キュベント中で３１
１足した（励起４００ｎｍ、発光４５０ｎｍ）。 Ｃ１結果 試験を行ったところ次の結果を得た エトサクシミＦ 蛍光単位 （ジノ１リー −←１皿ｍ Ｑ ３９．０ ２０ ５０．５ ５０ ８４ θ１０Ｄ
００．０１５０
９０．０この免疫
試験は、血清試料中のエトサクシミド濃度を測定するの
に用いることができた。 手続補正前 Ｏｄ和５８年８月２５日 ｑ、′ｒ許庁長官 若 杉 和 夫 殿１、事件の表
示 昭和５８年 特 許 願第 ９５１０８ ５２、発明の
名称 エトサクシミド免疫原、抗体、標識化複合体および関連
誘導体 ３．７山正をする者 事（′１−との関係 ｌ待ｌｉ／［出願人４、代 理
人 ５、補正命令の日イ；１ 自 発 （５，補正ｔこより増加する発明の数 な し８、浦
゛正の内容 １、＃ｊＩｌの発明の名称の欄を以下のとおり補正する
。 ［エト→）”クシミド免疫原、抗体およびそれを用いる
免疫試験によるエトラクシミド測定用試薬」 Ｕ、明細書の発明の名称の欄を以下のとお）補正する。 「エトラクシミド免疫原、抗体およびそノＬを用いる免
疫試験によるエトツク７ミド測定用試薬」 肩、明細書の特許請求の範囲の欄を別紙のとおり補正す
る。 ２、特許請求の範囲 １．免疫ヤｌ」！−！体材と、共イ１結合で、その３−
４：ｔで連結した工Ｉ・サクシミドからなることを特徴
とする工トサクシミ）・免疫原。 ２、該４１１体月が、蛋白質またはポリペプチドである
特許請求の範囲第１項記載の免疫原。 （式中、Ｒは連結基であり、Ｔは免疫性押体材であり、
かつ、ｐは平均して１から約５０ま項記載の免疫原。 ４、該連結基が、水素を除くｌおよび約２０個の間の原
子からなる原子鎖である特許請求の範囲第３ Ｊａｒ記
載の免疫原。 ５、該担体材が、蛋白質またはポリペプチドである特許
請求の範囲第３項またはｔ５４項記載の免疫原。 （式中、Ｙはアミド基であり、Ｔは免疫性蛋白質担体材
または免疫性ポリペプチド担体材であり、ｎは１からＩ
Ｏまでの整数であり、かつｐは、平均して■から該担体
材」−１の利用しうるアミド結合部位の数までである）
で示される特許請求の範囲第３項記載の免疫原。 ７、アミド基Ｙ中の炭素原子が、担体材中のカルボキシ
ル基からのものであり、アミド基Ｙ中の窒素原子が、式
中のアルキレン基と結合しており、かつ、Ｐが、平均し
てｌから該担体材中の利用しうるカルボキシル基の数ま
でである特の免疫原。 体。 抗体６ ＋４ 、 、ｊ４式中の−Ｒ−が−（ＣＨ２几−Ｙ−詐
請求の範囲第１ｆ項記載の抗体。 の抗体。 薬。 １８、該１１１体材が、蛋白質またはポリペプチドであ
る特許請求の範囲第１７項記載の免疫試験によるエトサ
クシミド測定用試薬。 １８、該エトサクシミド免疫原が、式：（式中、Ｒは連
結基であり、Ｔは免疫性相体材であり、かつ、ｐは平均
して１から約５ｏま試薬。 間の原子からなる原子鎖である特許請求の範囲第１８項
記載の免疫試験によるエトサクシミド測定用試薬。 ある特許請求の範囲第１８項または第２０項記載の免疫
試験によるエトサクンミドｆｉｌｌ定用試薬。 （式中、Ｙはアミド基であり、Ｔは免疫性蛋白質担体材
または免疫性ポリペプチド担体材であり、ｎは１から１
０までの整数であり、かつｐは、平均してｌから該担体
材−１−の利用しうるアミド結合部位の数までである）
で示される特許請求の範囲第１８項記載の免疫試験によ
るエトサクシミド測定用試薬。 ２３、アミド基Ｙ中の炭素原子が、担体材中のカルボキ
シル基からのものであり、アミド基’１’ 中の窒素原
子が、式中のアルキレン基と結合しており、かつ、ｐが
、平均してｌから該１１体材中の利用しうるカルボキシ
ル基の数までである特許請求の範囲第２２項記載の免疫
試験によるエトサクシミド測定用試薬。 ２４、ｎが、４である特許請求の範囲第２３項記載の免
疫試験によるエトサクシミド測定用試薬。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、免疫性担体材と、共有結合で、その３−位で連結し
たエトサクシミドからなることを特徴とするエトサクシ
ミド免疫原。 ２、該担体材が、蛋白質またはポリペプチドである特許
請求の範囲第１項記載の免疫原。 ３、式： （式中、Ｒは連結基であり、Ｔは免疫性担体材であり、
かつ、ｐは平均してｌから約５０までの数である）で示
されることを特徴とするエトサクシミド免疫原。 ４、該連結基が、水素を除くｌおよび約２０個の間の原
子からなる特許請求の範囲第３項記載の免疫原。 ５、該担体材が、蛋白質またはポリペプチドである特許
請求の範囲第３項または第４項記載の免疫原。 ６、ｐが、平均してｌから約２５までの数である特許請
求の範囲第５項記載の免疫原。 ７、式： （式中、Ｙはアミド基であり、Ｔは免疫性蛋白質担体材
または免疫性ポリペプチド担体材であり、ｎは１からｌ
Ｏまでの整数であり、かつｐは、平均してｌから該担体
材上の利用しうるアミド結合部位の数までである）で示
されることを特徴とするエトサクシミド免疫原。 ８、該担体材が、アルブミンである特許請求の範囲第７
項記載の免疫原。 ９、アミド基Ｙ中の炭素原子が、担体材中のカルボキシ
ル基からのものであり、アミド基Ｙ中の窒素原子ｊが、
式中のアルキレン基と結合しており、かつ、ｐが、平均
してｌから該担体材中の利用しうるカルボキシル基の数
までである特許請求の範囲第７項または第８項記載の免
疫原６ １０、ｎが、４である特許請求の範囲第９ダ１記載の免
疫原。 ＋１．特許請求の範囲第１項記′載の免疫原に対して産
生じたことを特徴とする抗体。 ＋２、特許請求の範囲第３項記載の免疫原に対して産生
したことを特徴とする抗体。 ＋３．特許請求の範囲第７項記載の免疫原に対して産生
したことを特徴とする抗体。 ＋４．特許請求の範囲第９項記載の免疫原に対して産生
じたことを特徴とする抗体。 ＋５．特許請求の範囲第１０項記載の免疫原に対して産
生したことを特徴とする抗体。 １６、式： （式中、Ｒｏは連結基であり、かつ、Ｚはアミン基、カ
ルボキシル基、チオール基、マレイミド基またはヒドロ
キシル基である）で示されることを一特徴とするエトサ
クシミド誘導体。 ＋７．Ｒ’が、水素を除くｌおよび約２０個の間の原子
からなる原子鎖である特許請求の範囲第１６項記載の誘
導体。 １Ｂ、Ｒ’が、水素を除く１および１０個の間の原子か
らなる脂肪族基である特許請求の範囲第１６項記載の誘
導体。 １８、式： （式中、Ｚはカルボキシル基またはアミノ基であり、か
つ、ｎは１から１０までの整数である）で示されること
を特徴とするエトザクシミ）Ｓ誘導体。 ２０、Ｚが、カルボキシル基である特許請求の範囲第１
９項記載の誘導体。 ２＋、Ｚが、アミノ基である特許請求の範囲第１９項記
載の誘導体。 ２２、ｎが、４である特許請求の範囲第２０項または第
２１項記載の誘導体。 ２３、エトサクシミドに対する抗体として、特許請求の
範囲第１１項記戦の抗体を用いることを特徴とするエト
サクシミドＪｌｌｌ定用免疫試験法。 ２４、エトサクシミドに対する抗体として、特許請求の
範囲第１１ＪＪｉ記載の抗体を用いることを特徴とする
、免疫試験によるエトサクシミド測定用試薬。 ２５、（ａ）特許請求の範囲第１１項記載の抗体および
（ｂ）該抗体と結合する際、変化する検出可能な性質を
有する標識化エトサクシミド複合体からなることを特徴
とする、均一系免疫試験によるエトサクシミド測定用試
験キット。 ２Ｂ、（ａ）特許請求の範囲第１１項記載の抗体および
該抗体と結合する際、変化する検出ｎｌ能な性質を有す
る標識化エトサクシミド複合体、ならびに、（ｂ）該試
薬組成物を包含せしめた固体状担体部材からなることを
特徴とする、均一系免疫試験によるエトサクシミドＭｌ
ｌｌ定用試験具。 ２７、式： ％式％） （式中、−（ＣＯ）βＧυは。 １） であり、かつｎは１から１０までの整数である）で示さ
れることを特徴とするβ−ガラクトシル−ウンベリフェ
ロン−エトサクシミド複合体。 ２８．１が、４である特許請求の範囲第２７項記載の複
合体。
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|---|---|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58095108A Pending JPS5916874A (ja) | 1982-06-01 | 1983-05-31 | エトサクシミド免疫原、抗体、標識化複合体および関連誘導体 |
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| JP (1) | JPS5916874A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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