JPS5871886A - Monomethylamine oxidase and its preparation - Google Patents
Monomethylamine oxidase and its preparationInfo
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- JPS5871886A JPS5871886A JP16791081A JP16791081A JPS5871886A JP S5871886 A JPS5871886 A JP S5871886A JP 16791081 A JP16791081 A JP 16791081A JP 16791081 A JP16791081 A JP 16791081A JP S5871886 A JPS5871886 A JP S5871886A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なモノメチル−アミノ酸化酵素およびその
製造法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a novel monomethyl-amino acid converting enzyme and a method for producing the same.
従来アミン酸化酵素についてはアスペルギルスム
・ニガー、ペニシリウ禽・クリソゲナム、モナスカスΦ
アンカ、フサリウム・プルビゲナムに属する菌株がアミ
ン酸化酵素を生産することが報告されている〔アグリカ
ルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agr、
Biol、、Chem、 ) Voi、 29 。Conventional amine oxidases include Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Monascus Φ
It has been reported that a strain belonging to Fusarium pulvigenum produces amine oxidase [Agricultural Biological Chemistry (Agr.
Biol, Chem, ) Voi, 29.
扁2 、 P、 //7〜/23./9乙り。Bian 2, P, //7~/23. /9 Otori.
しかしながら、これらの既知のアミン酸化酵素は、いず
れもモノメチルアミンには酵素活性を示さない。However, none of these known amine oxidases exhibits enzymatic activity on monomethylamine.
そこで、本発明者等は、種ス検討・した結果バチルス属
に属する菌株を培地に培養し、該培養物よυ、モノメチ
ルアミンに対する基質特異性が極めて高いモノメチルア
ミン酸化酵素が得られることを知り本発明を完成した。Therefore, the present inventors investigated the species and found that by culturing a strain belonging to the genus Bacillus in a medium, monomethylamine oxidase with extremely high substrate specificity for monomethylamine could be obtained from the culture. The invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の理化学的性質を有するモノメ
チルアミン酸化酵素である。That is, the present invention is a monomethylamine oxidase having the following physical and chemical properties.
a)作 用:
モノメチルアミンのアミノ基を水と酸素の存在下に酸化
的に脱アミノしてホルムアルデヒド、アンモニアおよび
過酸化水素を生成する作用を有するO
b)基質特異性:
モノメチルアミンに対する基質特異性が最も高く、次い
でエチルアミン、n−プロピルアミンの順に作用し、ベ
ンジルアミン、ジメチルアミン、トリメチルア゛ミン、
エチレンジアミンおよびチラミンには作用しない。a) Action: O has the action of oxidatively deaminating the amino group of monomethylamine in the presence of water and oxygen to generate formaldehyde, ammonia and hydrogen peroxide b) Substrate specificity: Substrate specificity for monomethylamine ethylamine, n-propylamine, benzylamine, dimethylamine, trimethylamine,
It has no effect on ethylenediamine and tyramine.
C)モノメチルアミンに対するh値がt、2×1’0−
’ M (pH9,0)である。C) The h value for monomethylamine is t, 2×1'0-
' M (pH 9,0).
d)至適pHおよび安定pH範囲:
至適pH+r〜9
安定pH範囲二乙〜9
e)作用適温の範囲:
pH7のとき≠0−SO℃、pH9のとき30〜≠θ℃
の範囲が作用適温である。d) Optimal pH and stable pH range: Optimal pH+r~9 Stable pH range 2~9 e) Range of suitable temperature for action: ≠0-SO℃ when pH 7, 30~≠θ℃ when pH 9
The range of is the optimum temperature for action.
f)温度による失活の条件:
pH7,70℃以上の温度で70分処理、またはpHq
、t3℃以上の温度で70分処理した場合、それぞれ失
活する。f) Conditions for inactivation by temperature: pH 7, treatment at a temperature of 70°C or higher for 70 minutes, or pHq
, tWhen treated at a temperature of 3°C or higher for 70 minutes, each is inactivated.
(3)力価測定法
基質モノメチルアミン塩酸塩を0.7MのKHaPOg
−NaxBλ0り緩衝液(pH70)中に、溶かして基
質濃度/ mMに調製する。この基質溶液i、 Omg
に同じ緩衝液で稀釈した酵素液θ、/−を混和し、3θ
℃で/θ0分間反応せた後J−N −KOH/ mlを
加え酵素反応を停止する。このような酵素反応によりモ
ノメチルアミンは酸化分解され、該酵素反応停止液には
ホルムアルデヒド、アンモニアおよび過酸化水素が生成
する。次いで、酵素反応停止液にO0j係のび一アミノ
ー3−ヒドラジノーj−メルカプト−/、2.≠−トリ
アゾール(以下AHMTと略記する)のO,,5−NH
QI溶液を/d加え、30℃でlj分間反応させたのち
これに0.7 j−% K工Oy (7) 0.2 N
KOH溶液を7m7?加え、充分に攪拌し、得られた発
色液を透明セルに入れ、zsorxmでの吸収を測定し
、前記ホルムアルデヒドを定量する。(3) Titer determination method Substrate monomethylamine hydrochloride was added to 0.7M KHaPOg
- Dissolve in NaxBλ0 buffer (pH 70) to adjust substrate concentration/mM. This substrate solution i, Omg
Mix the enzyme solution θ,/− diluted with the same buffer solution, and
After reacting at ℃/θ0 minutes, add J-N-KOH/ml to stop the enzyme reaction. Monomethylamine is oxidatively decomposed by such an enzymatic reaction, and formaldehyde, ammonia, and hydrogen peroxide are produced in the enzymatic reaction termination solution. Next, add O0j-amino-3-hydrazino-j-mercapto-/, 2. ≠-triazole (hereinafter abbreviated as AHMT) O,,5-NH
After adding /d of QI solution and reacting for lj minutes at 30°C, 0.7j-% KOy (7) 0.2 N
7m7 of KOH solution? The formaldehyde is quantitated by adding the coloring solution to a transparent cell and measuring the absorption with zsorxm.
このような測定条件で、7分間にモノメチルアンを酸化
し、/マイクロモル(μmol )のホルムアルデヒド
を生成する酵素量を/単位として、活性を表示する。Under such measurement conditions, the activity is expressed as the amount of enzyme that oxidizes monomethylane and produces /micromol (μmol) of formaldehyde in 7 minutes.
(4)至適pH
緩衝液として、0. / モ/l/ −KHaPOp
−Na:lHPOg緩両液(pHjj−4,0)、0.
t##% ルKHaPOp−NaaBp07H衝液(p
H4,0−4,3)、0.04Mヴエロナール(Ver
onal )緩衝液(pH7,3−g ! ) 、0.
/−E /l/ @ HaBO*−KCI−NaxCO
J緩衝液(pHr、OP−/ /、0 )および0.
/モA/ NaJCOJ−NaHC,Oi緩衝液(pH
J’、、t〜/ 0.4− )を使用してモノメチルア
ミン酸化酵素の各pHにおけるモノメチルアミンに対す
る酵素活性を測定した結果、至適pHは第1図に示す通
シr〜9付近であると認められた。(4) Optimal pH As a buffer solution, 0. / mo/l/ -KHaPOp
-Na: lHPOg diluted solution (pHjj-4,0), 0.
t##% LeKHaPOp-NaaBp07H buffer solution (p
H4,0-4,3), 0.04M Velonal (Ver
onal) buffer (pH 7, 3-g!), 0.
/-E /l/ @ HaBO*-KCI-NaxCO
J buffer (pHr, OP-//, 0) and 0.
/MoA/ NaJCOJ-NaHC, Oi buffer (pH
As a result of measuring the enzymatic activity of monomethylamine oxidase against monomethylamine at various pH values using the following method, the optimum pH was found to be around r~9 as shown in Figure 1. It was recognized that there is.
(5)pH安定性および熱安定性
緩衝液として、0.1M酢酸緩衝液(pHJJ、弘θ)
、Q、/ M @ KHaPO4t−NaaBaO2緩
衝液(pHJ:θ、t、o。(5) 0.1M acetate buffer (pHJJ, Hiro θ) as a pH stability and thermostability buffer
,Q,/M@KHaPO4t-NaaBaO2 buffer (pHJ: θ, t, o.
7.011019.0)、Q、 / M * Vero
nal緩衝液(put、olr、s、 5!θ) Q、
/ M NaaCOr −NaHCO3緩衝液(pH
/ 0.01/ 1.0 )を用い、pH3,3−//
において30℃で30分間それぞれ保持した後に、酵素
活性を測定した結果、第2図に示す如(pH6〜9付近
であると認められた。7.011019.0), Q, / M * Vero
nal buffer (put, olr, s, 5!θ) Q,
/M NaaCOr-NaHCO3 buffer (pH
/ 0.01/ 1.0), pH 3,3-//
After holding each sample at 30° C. for 30 minutes, the enzyme activity was measured, as shown in FIG. 2 (pH was found to be around 6 to 9).
本酵素をpH7,0で各温度で70分間処理後、7mM
のモノメチルアミン溶液を基質として、本酵素の残存活
性を測定すると第3図に示す如く、70℃以上で完全に
失活する。また、同様にpH!;、θではご3℃以上で
完全に失活する。After treating this enzyme at pH 7.0 for 70 minutes at each temperature, 7mM
When the residual activity of this enzyme is measured using a monomethylamine solution as a substrate, as shown in FIG. 3, it is completely inactivated at 70°C or higher. Also, pH! ; and θ, it is completely inactivated at 3°C or higher.
(6)作用適温の範囲
0、1モルKHコPOダーNaJBダ02緩衝液により
反応系のpHを70に設定し、各温度における酵素活性
を調べ、また、0.7M・Ve、rOnal緩衝液によ
り反応系のpHをりθに設定し、各温度における酵素活
性を調べたところ、第≠図に示す如く、最適作用温度は
pH7のと、き、≠ON1θ℃付近、pH9のとき30
−≠θ℃付近であると認められた。(6) Range of suitable temperature for action The pH of the reaction system was set to 70 with 0 and 1 mol KH Coder, PO, NaJB, and 02 buffers, and the enzyme activity at each temperature was examined. The pH of the reaction system was set at θ and the enzyme activity at each temperature was investigated. As shown in the figure, the optimum temperature for action was at pH 7;
It was recognized that the temperature was around -≠θ℃.
以上の理化学的性質を有する本酵素はモノメチルアミン
の定量法に好適に用いることができる。This enzyme having the above-mentioned physicochemical properties can be suitably used for the quantitative determination of monomethylamine.
なお、モノメチルアミンを定量することは、皮革工業、
有機化合物合成工業の製造管理分析の立場から重要であ
るばかシでなく、食品の安全性を初知する上で、また生
体内の異常を診断する意味で極めて重要なことである。Note that quantifying monomethylamine is carried out by the leather industry,
This is not just a stupid thing that is important from the standpoint of manufacturing control analysis in the organic compound synthesis industry, but it is extremely important for understanding food safety for the first time and for diagnosing abnormalities in living organisms.
また本酵素は、メチルグアニジンの定量法にも好適に用
いることができる。The present enzyme can also be suitably used in a method for quantifying methylguanidine.
すなわち、本酵素はモノメチルアミンに対する基質特異
性がきわめて高いため、メチルグアニジンを定量すべき
試料に、メチルグアニジン分解酵素を作用させζ該作用
により生成するモノメチルアミンに本酵素を作用させ、
発生するホルムアルデヒド量を定量するか、あるいは過
酸化水素を定量することによって、メチルグアニジンの
特異的゛な定量が可能である。That is, since this enzyme has extremely high substrate specificity for monomethylamine, a methylguanidine-degrading enzyme is applied to a sample in which methylguanidine is to be determined, and this enzyme is allowed to act on the monomethylamine produced by this action.
Methylguanidine can be specifically quantified by quantifying the amount of formaldehyde generated or by quantifying hydrogen peroxide.
次に、モノメチルアミン酸化酵素の製造法について具体
的に述べる。Next, a method for producing monomethylamine oxidase will be specifically described.
本発明酵素の製造方法において使用される微生物は、バ
チルス属に属し、モノメチルアミン酸化酵素生産能を有
するものであればどのような菌類でも良く、自然界から
新に分離された菌株、既存の培養菌株、およびこれらの
菌株を通常の微生物突然変異誘発法、たとえば紫外線、
X線、γ線照射々どの物理的処理、ニトロソグアニジン
などの薬剤による化学的処理による方法によって得られ
るモノメチルアミン酸化酵素高生産性突然変異株のいず
れを用いても良い。The microorganism used in the method for producing the enzyme of the present invention may be any fungus that belongs to the genus Bacillus and has the ability to produce monomethylamine oxidase, including newly isolated strains from nature and existing cultured strains. , and these strains were subjected to conventional microbial mutagenesis methods, such as ultraviolet light,
Any mutant strain with high production of monomethylamine oxidase obtained by physical treatment such as X-ray or γ-ray irradiation, or chemical treatment with a drug such as nitrosoguanidine may be used.
そして本発明者らが千葉県野田市の畑の土壌より分離し
たバチルス舎エスピーBacillus sp、 @N
−10/は特に、モノメチルアミン酸化酵素生産能が高
院微生物工業技術研究所に微工研者寄第j9号a、)形
態
■細胞の大きさおよび形:t!〜2×3〜1ミクロンの
短桿菌。Bacillus sp, @N, which the present inventors isolated from the soil of a field in Noda City, Chiba Prefecture.
-10/ is especially capable of producing monomethylamine oxidase. ~2 x 3-1 micron short rods.
■細胞の多形性の有無i無し。■Presence or absence of cell pleomorphism.
■運動性の有無:周鞭毛を有し、運動性有り。■Motility: Has periflagella and is motile.
■胞子の有無:有シ。■Presence or absence of spores: Yes.
性 ■グラム染色′4#:陽性。sex ■Gram staining '4#: Positive.
b)各培地における生育状態
■肉汁寒天平板培養
30℃、≠?時間の培養で、直径0.j〜/mmの円形
コロニー。表面は平滑で黄色を呈し光沢がある。b) Growth status in each medium ■ Juicy agar plate culture at 30°C, ≠? Incubation for hours, diameter 0. Round colonies of j~/mm. The surface is smooth, yellow and shiny.
■肉汁寒天斜面培養
30℃、≠r時間の培養で、糸状で、生育は弱い。表面
は平滑で黄色を呈し、光沢がある。■Juice agar slant culture When cultured at 30°C for ≠r hours, it is filamentous and the growth is weak. The surface is smooth, yellow, and shiny.
■肉汁液体培養 30℃、≠r時間の静置培養でわずかに濁シを生ずる。■ Meat juice liquid culture Slight turbidity occurs when statically cultured at 30°C for ≠r hours.
■肉汁ゼラチン穿刺培養
、20℃、≠2日間の静置培養でゆつくシとゼラチンを
液化。■ Meat juice gelatin puncture culture, 20℃, static culture for ≠ 2 days to liquefy the meat juice and gelatin.
■リドマスミルク培養 30℃、/≠日日間静置培養で変化なし。■ Lidomus milk culture No change after static culture at 30°C for ≠ days.
C)生理的性質 ■硝酸塩の還元:弱いながら還元。C) Physiological properties ■Reduction of nitrate: Although weak, reduction occurs.
■脱窒反応:陽性、ガスの生成なし。■Denitrification reaction: Positive, no gas produced.
■MRテスト:陰性。■MR test: Negative.
■vpテスト:陰性。■VP test: Negative.
■インドールの生成:生成しない。■Indole generation: Not generated.
■硫化水素の生成:生成しない。■Generation of hydrogen sulfide: Not generated.
C9テンブンの加水分解−弱いながら分解する。Hydrolysis of C9 Tenbun - Decomposes weakly.
■クエン酸の利用:利用する。■Use of citric acid: Use it.
■無機窒素源:利用しない。■Inorganic nitrogen source: Not used.
(9)色素の生成:生成しない。(9) Formation of pigment: Not formed.
■ウレアーゼ:陽性。■Urease: Positive.
■オキシダーゼジ陰性。■ Oxidase di negative.
0カタラーゼ:陽性。0 catalase: positive.
0生育の範囲: 温度:/!〜≠≠℃。0 growth range: temperature:/! ~≠≠℃.
pH: J’〜L?、夕。pH: J'~L? ,evening.
[相]酸素に対する態度:好気性。[Phase] Attitude towards oxygen: Aerobic.
@l O−Fテスト(Hugh ’Leifson法)
:陰性。@l O-F test (Hugh'Leifson method)
:negative.
O炭素源の利用:フラクトースより酸の生成。Utilization of O carbon source: Production of acid from fructose.
[相]メタノールの資化性を有する。[Phase] Has the ability to assimilate methanol.
以上の生理化学的性質をバージエズ・マニュアル・オブ
・デイターミネイティブ・バクテリオロジー、第を版に
よって分類すれば、本菌は芽胞子を形成すること、桿菌
であること、好気性菌であること、カタラーゼ生産能を
有すること、およびダラム陽性菌であることからノ(チ
ルス属に属する菌であると判定した。そして、さらに本
菌を既知バチルス属に属する菌と比較すると、細胞の大
きさが非常に大きい(/、オー。2μ×3〜jμ)こと
カラバチルス・セレウス、同アンスランス、同チューリ
ンジエンシス、同メガテリウムに近似しているが、これ
らの菌と比較すると、本菌はグルコースから酸を生成し
ないこと、メタノール資化性を有することが相違するの
で、バチルス属に属する新種であると認定した。Classifying the above physiochemical properties according to the edition of Burgess Manual of Determinative Bacteriology, this bacterium forms spores, is a bacillus, and is an aerobic bacterium. It was determined that this bacterium belongs to the genus Bacillus because it has the ability to produce catalase and is a Durham-positive bacterium.Furthermore, when this bacterium is compared with known bacteria belonging to the genus Bacillus, the cell size is extremely large. It is similar to Carabacillus cereus, Carabacillus anthrans, Carabacillus thuringiensis, and Carabacillus megaterium, but compared to these bacteria, this bacterium produces acid from glucose. It was recognized as a new species belonging to the genus Bacillus because of the differences in that it does not produce methanol and has the ability to assimilate methanol.
次に、本菌の培養方法および条件について述べる0
モノメチルアミン酸化酵素生産のための微生物の培養方
法および条件には本発明の目的を特に阻害しない限シに
おいて制約されない。すなわち、バチルス属に属するモ
ノメチルアミン酸化酵素生産菌め生育およびモノメチル
アミン酸化酵素の生産が可能な環境を与える培養方法お
よび培養条件が採用され得る。Next, the method and conditions for culturing the present microorganism will be described. The method and conditions for culturing the microorganism for producing monomethylamine oxidase are not restricted as long as they do not particularly impede the purpose of the present invention. That is, a culture method and culture conditions that provide an environment in which monomethylamine oxidase-producing bacteria belonging to the genus Bacillus can grow and produce monomethylamine oxidase can be adopted.
なおバチルス・エスピー・N−/θ/の野生株を用いた
場合、モノメチルアミン酸化酵素の生産は、固体培養よ
りも液体培養法において有利に行なわれることが判明し
ている。しかしながら本菌に菌株改良技術を施せば、固
体培養に適した菌株の造成も可能である。It has been found that when a wild strain of Bacillus sp. N-/θ/ is used, production of monomethylamine oxidase is more advantageous in a liquid culture method than in a solid culture method. However, if strain improvement techniques are applied to this bacterium, it is possible to create a strain suitable for solid culture.
るが、モノメチルアミン塩酸塩をO0θ/〜2チ添加す
ると、モノメチルアミン酸化酵素の生産量が飛躍的に増
大する。上記炭素源としてはグルコース、グリセリン、
マルトニス、可溶性澱粉、エタノール等が挙げられ、窒
素源としては各種アミノ酸、ペプトン、大豆粉、各種蛋
白加水分解物、コーンステイープリカー、肉エキス、酵
母エキス、硝酸す) IJウム等が挙げられ、また微量
成分としては各種のナトリウム塩、カリウム塩、マンガ
ン塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、鉄塩、
リン酸塩、硫酸塩等が挙げられる。However, when monomethylamine hydrochloride is added at O0θ/~2 times, the production amount of monomethylamine oxidase increases dramatically. The above carbon sources include glucose, glycerin,
Examples of nitrogen sources include various amino acids, peptone, soybean flour, various protein hydrolysates, cornstarch liquor, meat extract, yeast extract, nitrate, etc. In addition, trace components include various sodium salts, potassium salts, manganese salts, magnesium salts, calcium salts, zinc salts, iron salts,
Examples include phosphates and sulfates.
培地の具体例としては、例えばグルコース/1、酵母エ
キス2チ、リン酸−カリウム0.7’16、硫酸マグネ
シウム0. / % 、硫酸第一鉄O0θ/%、塩化マ
ンガンO1θ/%を含む培地(pH7,2) (以下A
培地と略記する)、モノメチルアミン塩酸塩0. /チ
、クルコース/チ、酵母エキス/%、リン酸−カリ0.
/ * 、硫酸マグネシウムO1θtS、硫酸第一鉄
O0θ/%、塩化マンガン0.0/%を含む培地(以下
B培地と略記する)、代用肉汁検地(肉エキス/%、ポ
リペプトンフチ、塩化ナトリウム0.jチ)、麦芽汁培
地(麦芽汁2チ、グルコース2チ、ペプトン0./%)
、サフロー培地(マルトース<zチ、ペプトン/%)、
YpSs培地(可溶性澱粉/、 、5−チ、酵母エキス
02t%、リン酸二カリウム0./9b、硫酸マグネシ
ウム・7水塩o、osts)が挙げられるが、これらの
培地を用いた好気的条件下における培養によシモノメチ
ルアミン酸化酵素を生産することが出来る。いずれの培
地を用いる場合であっても、培養は十分な酸素供給下に
行なうのが好ましく、この目的のための振盪培養法、通
気攪拌用
培養法が採孝される。Specific examples of the medium include glucose/1, yeast extract 2 t, potassium phosphate 0.7'16, magnesium sulfate 0. /%, ferrous sulfate O0θ/%, manganese chloride O1θ/% (pH 7,2) (hereinafter referred to as A
(abbreviated as medium), monomethylamine hydrochloride 0. /C, Cucrose/C, Yeast extract/%, Phosphoric acid-potassium 0.
/*, medium containing magnesium sulfate O1θtS, ferrous sulfate O0θ/%, manganese chloride 0.0/% (hereinafter abbreviated as B medium), meat juice substitute test sample (meat extract/%, polypeptone border, sodium chloride 0.0/%). j), wort medium (wort 2 t, glucose 2 t, peptone 0./%)
, Safro medium (maltose < z, peptone/%),
Examples include YpSs medium (soluble starch/, 5-thi, yeast extract 02t%, dipotassium phosphate 0./9b, magnesium sulfate heptahydrate o, osts), but aerobic Cymonomethylamine oxidase can be produced by culturing under these conditions. Regardless of which medium is used, culturing is preferably carried out under sufficient oxygen supply, and shaking culture methods and aerated agitation culture methods are applicable for this purpose.
培養条件は通常温度20〜33℃、pH6〜?で培養期
間が70時間〜1週間である。Culture conditions are usually temperature 20-33℃, pH 6~? The culture period is 70 hours to 1 week.
固体培養法においては、市販のフスマに対重量比ご0〜
20%散水して調製したいわゆるフスマ培地、あるいは
これらに本菌が資化可能な炭素源窒素源、微量成分を適
宜に添加した培地、これらを適宜な配合、大きさ、形状
に造粒成型した培地などを固体培地として用いる。In the solid culture method, the weight ratio of commercially available wheat bran is 0 to 0.
A so-called bran medium prepared by sprinkling 20% water, or a medium to which a carbon source, a nitrogen source, and trace components that can be assimilated by the bacteria were appropriately added, and these were granulated into an appropriate composition, size, and shape. A medium or the like is used as a solid medium.
培養条件は、通常温度はコθ〜315℃、pH4〜♂で
培養日数が/〜IO日間である。The culture conditions are usually a temperature of θ to 315°C, a pH of 4 to ♂, and a culture period of 1 to 10 days.
上記のようにして、モノメチルアミン酸化酵素生産菌の
培養によりモノメチルアミン酸化酵素を生産することが
出来る。As described above, monomethylamine oxidase can be produced by culturing monomethylamine oxidase-producing bacteria.
該培養物からモノメチルアミン酸化酵素を採取するには
、直接、液体培養ろ液あるいは固体培養物の水抽出液か
らモノメチルアミン酸化酵素を採取してもよいが、本酵
素は菌体外に分泌されにくいので、培養物から菌体を集
め、適当な緩衝液に懸濁後、超音波処理、トリトンス−
IOθなどの界・面活性剤処理、機械的磨砕あるいはリ
ゾチームなどの溶菌酵素によって菌体を砕壊し、菌体内
のモノメチルアミン酸化酵素を効率良く採取するととが
できる。To collect monomethylamine oxidase from the culture, monomethylamine oxidase may be collected directly from the liquid culture filtrate or the aqueous extract of the solid culture, but this enzyme is not secreted outside the bacterial cells. The cells are collected from the culture, suspended in an appropriate buffer, and then subjected to ultrasonic treatment and Triton sterilization.
Monomethylamine oxidase within the bacterial cells can be efficiently collected by disrupting the bacterial cells by treatment with a surfactant such as IOθ, mechanical grinding, or a lytic enzyme such as lysozyme.
得られた粗酵素液からは、公知の方法、例えば硫酸アン
モニウム、硫酸ナトリウム、食塩などの塩類を用いる塩
析法、アセトン類、エタノール類などを用いる有機溶媒
沈澱法、トヨバールTSK −jよ(東洋曹達)、セフ
ァデックス、G 、200 、セファローズ乙゛B(ス
ウェーデン国ファルマシア製)、バイオゲルP30θ(
米国バイオラッド環)などを用いるゲル濾過法、オメガ
−アミノヘキシル・アガロース(マイルズ・ラボラトリ
製)を用いる親和クロマトグラフィー法、ハイドロオキ
シアバタイド(米国、バイオラッド環)を用いる吸着ク
ロマトグラフィ法、ジエチル拳アミノエチルセファデッ
クス(スウェーデン国、ファルマシア製)、ジエチルア
ミンエチルセルロース、トリエチルアミノセルロース(
米国、バイオラッド環)などのイオン交換体を用いるカ
ラムクロマトグラフィー法、アンホライン(スウェーデ
ン国、千ルケービー製)などを用いる等電点分画法、ア
ゼテート膜、澱粉、アクリルアマイドゲルなどを用いる
電気泳動法、透析法、各種膜による分画法その他等電点
沈澱法などの個々の手段またはこれらの適当な組合せを
適宜利用することによって本酵素を精製し、電気泳動的
に単一なモノメチルアミン酸化酵素の精製標品を得るこ
とができる。The obtained crude enzyme solution is extracted using known methods such as salting out using salts such as ammonium sulfate, sodium sulfate, and common salt, organic solvent precipitation using acetones and ethanol, and Toyobar TSK-j (Toyo Soda). ), Sephadex, G, 200, Sepharose B (manufactured by Pharmacia, Sweden), Biogel P30θ (
Gel filtration method using omega-aminohexyl agarose (manufactured by Miles Laboratory), adsorption chromatography method using hydroxyabatide (Bio-Rad Ring, USA), diethyl fist Aminoethyl Sephadex (manufactured by Pharmacia, Sweden), diethylamine ethylcellulose, triethylaminocellulose (
Column chromatography using an ion exchanger such as Bio-Rad Ring (USA), isoelectric focusing using Ampholine (manufactured by 1000K, Sweden), electrophoresis using azetate membrane, starch, acrylamide gel, etc. The enzyme is purified by using individual methods such as dialysis, dialysis, fractionation using various membranes, isoelectric focusing precipitation, or an appropriate combination of these methods, and is electrophoretically purified by single monomethylamine oxidation. A purified sample of the enzyme can be obtained.
実施例1
バチルス・エスピー・N−10/ (微工研条寄第j9
号、FERM BP 3−9 )の保存スラントに滅
菌生理食塩水を加えて、懸濁し、種菌液(/θ′個/
me )を調製した。Example 1 Bacillus sp. N-10/
Add sterile physiological saline to the storage slant of No., FERM BP 3-9), suspend it, and prepare the seed culture solution (/θ' cells/
me) was prepared.
前述のA培地/θ罰を大型試験管に入れ、720℃、3
0分加圧滅菌した後に前記種菌液0.3 ml!を無菌
的に接種し、30℃で2≠時間振盪培養を行った。この
ようにして得られた培養液を遠心分離して湿潤菌体を集
菌し、次、いでこの菌体を0.1モルリン酸緩衝液(’
pH70)2−に懸濁したのち、超音波破壊機で氷冷し
つつj分間細胞を破壊した。Place the above A medium/θ punishment in a large test tube and incubate at 720°C for 3
After autoclaving for 0 minutes, 0.3 ml of the above seed culture solution! was aseptically inoculated and cultured with shaking at 30°C for 2≠ hours. The culture solution thus obtained was centrifuged to collect wet bacterial cells, and then the bacterial cells were collected in 0.1 molar phosphate buffer ('
After suspending at pH 70)2-, the cells were disrupted for j minutes using an ultrasonic disruptor while cooling on ice.
次いで、これを遠心分離して上清を採取し粗酵素液/、
−c5’ ml (酵素活性0.29単位/ me )
を得た。Next, this was centrifuged, the supernatant was collected, and the crude enzyme solution/,
-c5' ml (enzyme activity 0.29 units/me)
I got it.
実施例2
3を容攪拌式小型培養装置(いf)じゃ社製)の培養槽
に前述のB培地(pH72に調製)21を入れ、/、2
0℃、30分加圧滅菌し、実施例/で調製した種菌液2
θrnlを無菌的に接噸し、30℃で≠r時間通気攪拌
深部培養を行っ′こ。Example 2 The above-mentioned B medium (adjusted to pH 72) 21 was placed in the culture tank of an agitated small culture device (If) (manufactured by Ja Co., Ltd.), and /, 2
Inoculum solution 2 prepared in Example 2 by autoclaving at 0°C for 30 minutes
θrnl was inoculated aseptically, and submerged culture with aeration and stirring was performed at 30°C for ≠r hours.
このようにして得られた培養;11分、、=i心分離し
て湿潤菌体を集菌し、次いでこの61・g4:291r
’) !J )ンX−100(和光紬薬製)溶液”
00 rrreに懸濁し、30℃で1時間放置して溶菌
7、遠心分離して上清液を採取し、粗酵素液を得こ。The culture thus obtained; 11 minutes, =i heart separation to collect wet bacterial cells, and then this 61.g4:291r
')! J)NX-100 (Wako Tsumugi Pharmaceutical Co., Ltd.) solution”
00 rrre, leave to stand at 30°C for 1 hour for bacteriolysis (7), centrifuge and collect supernatant to obtain crude enzyme solution.
との粗酵素液に硫酸アンモニウムをO1!飽和濃度まで
加えると、沈澱が析出する。この沈澱区分を集めo、o
iモルリン酸緩衝液(p’H7,θ)溶解し、同一緩衝
液で透析脱塩した。次いで透析内液を限外濾過システム
(無化成社製ミニモジュール、M−3)を用いて70倍
に濃縮し、これを005モルのKCIを含む0.01モ
ルリン酸緩衝液で平衡化したトヨパールTSK−3!;
B(東洋曹達製)を充填したカラムに通過し、高速ゲル
濾過クロマトグラフィーを行った。次いで前操作の活性
区分を集め、これをO,OSモルのKCIを含む0.0
1モルリン酸緩衝液で透析し、同一緩衝液で平衡化した
オメガ−アミノヘキシル・アガロース(マイルズ・ラボ
ラ) IJイズ製)カラムに吸着させたのち同一緩衝液
で不純蛋白を充分に溶出除去し、次いでKC1濃度を0
.2Mにあげた0、01モルリン酸緩衝液でアフィニテ
ィークロマトグラフィーを行った。Add ammonium sulfate to the crude enzyme solution with O1! When added to saturation concentration, a precipitate separates out. Collect this precipitate section o, o
The mixture was dissolved in iM phosphate buffer (p'H7, θ) and desalted by dialysis with the same buffer. Next, the dialyzed fluid was concentrated 70 times using an ultrafiltration system (Mikasei Mini Module, M-3), and this was equilibrated with a 0.01M phosphate buffer containing 0.05M KCI. TSK-3! ;
The mixture was passed through a column packed with B (manufactured by Toyo Soda) and subjected to high-speed gel filtration chromatography. The active fraction from the previous operation was then collected and added to a 0.0
Dialyzed against 1 molar phosphate buffer, adsorbed on an omega-aminohexyl agarose (Miles Laboratories, IJ's) column equilibrated with the same buffer, and impure proteins were sufficiently eluted and removed with the same buffer. Then, the KC1 concentration was reduced to 0.
.. Affinity chromatography was performed with 0.01 molar phosphate buffer raised to 2M.
このようにして得られた活性区分を蒸溜水を用いて透析
し、凍結乾燥し、てモノメチルアミン酸化酵素の精製酵
素標品7■(酵素活性/?年単位1ng)を得だ。The active fraction thus obtained was dialyzed against distilled water and freeze-dried to obtain purified enzyme preparation 7 of monomethylamine oxidase (enzyme activity/?year unit: 1 ng).
第1図は、本発明のモノメチルアミン酸化酵素の至適p
Hを、第2図はpH安定性を、第3図は熱安定性を、そ
して第≠図は作用適温の範囲を、それぞれ示す曲線であ
る。
特許出願人 キッコーマン株式会社
第)図
ビH
課之図
QO,Ir/−−ぐロブー−ノL” a#yt@
Q、Ir’l・NaxCOs−NaHCO25l)y喪
’ OpH7,0
拳−−rHq刀
o−oP)17.。
参−Φ IH’1.0FIG. 1 shows the optimal p of monomethylamine oxidase of the present invention.
Figure 2 shows the pH stability, Figure 3 shows the thermal stability, and Figure ≠ shows the range of suitable temperature for action. Patent Applicant: Kikkoman Corporation No.) Figure B H Section Figure QO, Ir/--Grobu-no L"a#yt@
Q, Ir'l・NaxCOs-NaHCO25l) y mourning' OpH7,0 fist--rHq sword o-oP) 17. . Reference-Φ IH'1.0
Claims (3)
化酵素。 a)作 用: モノメチルアミンのアミノ基を水と酸素の存在下に酸化
的に脱アミノしてホルムアルデヒド、アンモニアおよび
過酸化水素を生成する作用を有する。 b)基質特異性: モノメチルアミンに対する基質特異性が最も高く、次い
でエチルアミン、n−プロピルアミンの順に作用し、ベ
ンジルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エ
チレンジアミンおよびチラミンには作用しない。 C)モノメチルアミンに対するh値がz、2×lθ−′
M(pH9,0)である。 d)至適pHおよび安定pH範囲 至適pH:/〜9 安定pH範囲:乙〜9 e)作用適温の範囲: pH7のとき≠θ〜!θ℃、pH9のとき30〜≠θ℃
の範囲が作用適温である。 f)温度による失活の条件: pH7,70℃以上の温度で70分処理、またはpH9
,63℃以上の温度で70分処理した場合、 ゛それぞ
れ失活する。(1) Monomethylamine oxidase having the following physical and chemical properties. a) Action: It has the action of oxidatively deaminating the amino group of monomethylamine in the presence of water and oxygen to produce formaldehyde, ammonia and hydrogen peroxide. b) Substrate specificity: The substrate specificity is highest for monomethylamine, followed by ethylamine and n-propylamine, and does not affect benzylamine, dimethylamine, trimethylamine, ethylenediamine and tyramine. C) h value for monomethylamine is z, 2×lθ−′
M (pH 9,0). d) Optimal pH and stable pH range Optimum pH: / ~ 9 Stable pH range: O ~ 9 e) Range of suitable temperature for action: When pH 7 ≠ θ ~! θ℃, pH 9: 30~≠θ℃
The range of is the optimum temperature for action. f) Conditions for inactivation by temperature: pH 7, treatment at a temperature of 70°C or higher for 70 minutes, or pH 9
, When treated for 70 minutes at a temperature of 63°C or higher, each of the following is inactivated.
細菌よシ得られたものである特許請求の範囲第1項記載
のモノメチルアミン酸化酵素。(2) The monomethylamine oxidase according to claim 1, wherein the monomethylamine oxidase is obtained from a bacterium belonging to the genus Bacillus.
能を有する菌株を培地に培養し、該培養物からモノメチ
ルアミン酸化酵素を採取することを特徴とするモノメチ
ルアミン酸化酵素の製造法。(3) A method for producing monomethylamine oxidase, which comprises culturing a strain belonging to the genus Bacillus and having the ability to produce monomethylamine oxidase in a medium, and collecting monomethylamine oxidase from the culture.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16791081A JPS6033473B2 (en) | 1981-10-22 | 1981-10-22 | Monomethylamine oxidase and its production method |
US06/435,316 US4503147A (en) | 1981-10-22 | 1982-10-19 | Monomethylamine-oxidizing enzyme |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16791081A JPS6033473B2 (en) | 1981-10-22 | 1981-10-22 | Monomethylamine oxidase and its production method |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5871886A true JPS5871886A (en) | 1983-04-28 |
JPS6033473B2 JPS6033473B2 (en) | 1985-08-02 |
Family
ID=15858311
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16791081A Expired JPS6033473B2 (en) | 1981-10-22 | 1981-10-22 | Monomethylamine oxidase and its production method |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6033473B2 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007148787A (en) * | 2005-11-28 | 2007-06-14 | Fuji Electric Retail Systems Co Ltd | Automatic cup-type beverage vending machine |
-
1981
- 1981-10-22 JP JP16791081A patent/JPS6033473B2/en not_active Expired
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007148787A (en) * | 2005-11-28 | 2007-06-14 | Fuji Electric Retail Systems Co Ltd | Automatic cup-type beverage vending machine |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6033473B2 (en) | 1985-08-02 |
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