JPS6248380A - Production of cephalosporin c acylase - Google Patents

Production of cephalosporin c acylase

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JPS6248380A
JPS6248380A JP60187327A JP18732785A JPS6248380A JP S6248380 A JPS6248380 A JP S6248380A JP 60187327 A JP60187327 A JP 60187327A JP 18732785 A JP18732785 A JP 18732785A JP S6248380 A JPS6248380 A JP S6248380A
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acylase
pseudomonas
enzyme
cephalosporin
acid
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Keizo Yamamoto
敬三 山本
Kenji Matsuyama
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Abstract

PURPOSE:To produce cephalosporin C acylase, having specific hydrolytic action and useful for the field of utilizing enzymes and medicines, etc., by cultivating a microorganism of the genus Pseudomonas in a culture medium. CONSTITUTION:A microorganism Pseudomonas sp. SE-83 separated from soil is inoculated into a culture medium containing an organic acid as a carbon source, peptone as a nitrogen source, phosphoric acid as an inorganic material, etc., to carry out aerobic liquid cultivation at 25-32 deg.C for 2-4 days. The resultant culture is then subjected to treatment, e.g. centrifugal separation, salting out, dialysis, etc., to give an enzyme having properties of hydrolyzing a compound expressed by formula I (R is -OCOCH3, -H or -OH) into a compound expressed by formula II and D-alpha-aminoadipic acid, about 9 optimum pH, 4-4.5 isoelectric point and an inhibitor of p-chloromercury benzoate, etc.

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、7−アミノセファロスポラン酸(以下、[7
−ACAJと略す)およびその誘導体の酵素的製造法に
利用される新規酵素の製造法に関するものである。
Detailed Description of the Invention (Industrial Field of Application) The present invention provides 7-aminocephalosporanic acid (hereinafter referred to as [7
This invention relates to a method for producing a novel enzyme that is used in the enzymatic production of -ACAJ) and its derivatives.

(従来の技術および発明が解決しようとする問題点) 発酵生産によって得られるセファロスポリンCは、7位
アミン基に結合したアシル基を除去する反応により、7
−ACAに−4され、これを出が合成され、医薬品とし
て実用に供されている。
(Prior art and problems to be solved by the invention) Cephalosporin C obtained by fermentation production is produced by a reaction that removes the acyl group bonded to the 7-position amine group.
-4 to ACA, which has been synthesized and put to practical use as a pharmaceutical.

セファロスポリンCのN−アシル基を除去する方法とし
て工業的に利用されている方法は、(1)化学的方法、
(2)中間体を経由する酵素的方法の二つに大別される
。これらの方法のうち、化学的方法は、例えば特公昭4
1−13862号あるいは特公昭45−40899号記
載の方法である。また、中間体を経由する酵素的方法は
、例えば特公昭55−12910号の方法によシセファ
ロスボリンCi7β−(5−カルボキシ−5−オキソペ
ンタンアミド)セファロスポラン酸に誘導し、ついで過
酸化水素を作用させて7β−(4−カルボキシブタンア
ミド)セファロスポラン酸(以下。
The methods used industrially to remove the N-acyl group of cephalosporin C are (1) chemical methods;
(2) Enzymatic methods via intermediates. Among these methods, chemical methods are, for example,
This method is described in No. 1-13862 or Japanese Patent Publication No. 45-40899. In addition, an enzymatic method via an intermediate may be used, for example, by the method of Japanese Patent Publication No. 12910/1983, where cicephalosvorin Ci7β-(5-carboxy-5-oxopentanamide) cephalosporanic acid is induced, and then hydrogen peroxide is used. 7β-(4-carboxybutanamide)cephalosporanic acid (hereinafter referred to as

「GL−7ACAJと略す)に誘導し、さらに微生物酵
素、例えば、アグリカルチャー・アンド・バイオロジカ
ル・ケミストリー(Agricultureand B
iological chemistry ) 45巻
、1561頁(1981年)記載の酵素を作用させて7
− ACAを製造する方法である。これらの二つの7−
 ACA裂遣製造は、いずれも多段の反応工程を必要と
する点において共通している。
GL-7ACAJ) and further microbial enzymes, such as agricultural and biological chemistry (Agricultural and Biological Chemistry).
7 by acting with the enzyme described in Iological Chemistry, Vol. 45, p. 1561 (1981).
- A method of manufacturing ACA. These two 7-
All ACA fragmentation production processes have in common that they require multiple reaction steps.

したがって、セファロスポリンCを7− ACAとD−
α−アミノアジピン酸に加水分解する酵素を利用して、
一段の反応工程でセファロスポリンCから7−ACAを
製造できれば、工業的に極めて有利であると予測されて
きた。
Therefore, cephalosporin C can be combined with 7-ACA and D-
Using an enzyme that hydrolyzes α-aminoadipic acid,
It has been predicted that it would be extremely advantageous industrially if 7-ACA could be produced from cephalosporin C in a single reaction step.

今日までに、微生物菌体またはその処理物の酵素作用を
利用して、セファロスポリンCから7−ACAを製造す
る方法としては、(1)米国特許5259594 (1
966)記載の方法、(2)特開昭52−145289
号記載の方法、(3)特開昭53−94093号記載の
方法および(4)%開開59−44592号記載の方法
の四つが知られている。
To date, methods for producing 7-ACA from cephalosporin C using the enzymatic action of microbial cells or their processed materials include (1) U.S. Patent No. 5,259,594 (1)
966) method described in (2) JP-A-52-145289
Four methods are known: (3) the method described in JP-A-53-94093, and (4) the method described in JP-A-59-44592.

このうち、米国特許3259594の方法は、アクロモ
バクタ−属(Achromobacter )、ブレビ
バクテリウム属(Brevibacterium )、
あるいはフラボバクテリウム属(Flavobacte
rium )の細菌を用いる方法であるが、プリン著「
セファロスポラン酸・アンド・ペニシリンズj (E、
H,Flynn ;Cephalosporins a
nd Pen1cillins、 AcademicP
ress、、 New York、 1972年)の3
7頁に記載されている如く、本特許は追試不能であるこ
とが知られている。また、アルタナリア属(Alter
nariaεあるいはアスペルギルス属(Asperg
illus )の真菌を用いる特開昭52−14328
9号記載の方法、シュードモナス プチダ(Pseud
omonas putida)近縁の細菌BN−188
株を用いる特開昭53−94093号記載の方法、およ
びペシロミセス属(Paecilomyces )の真
菌を用いる特開昭59−44392号記載の方法に、い
ずれも微生物の酵素作用全利用した7−ACAの製造方
法であるが、該酵素作用を触媒する酵素の実体について
は記載されていない。
Among these, the method of US Pat. No. 3,259,594 is applicable to Achromobacter genus, Brevibacterium genus
Or Flavobacterium (Flavobacterium genus)
This is a method using bacteria of Rium), as described in Prin's ``
Cephalosporanic acid and penicillins (E,
H, Flynn ; Cephalosporins a
nd Pencillins, AcademicP
ress, New York, 1972) No. 3
As stated on page 7, this patent is known to be untestable. In addition, the genus Alteraria
nariaε or Aspergillus spp.
JP 52-14328 using the fungus
The method described in No. 9, Pseudomonas putida (Pseud
omonas putida) closely related bacteria BN-188
The method described in JP-A No. 53-94093 using a strain, and the method described in JP-A-59-44392 using a fungus of the genus Paecilomyces both utilize the enzymatic action of microorganisms to produce 7-ACA. However, the substance of the enzyme that catalyzes the enzymatic action is not described.

すなわち、これらの特許には、該酵素作用を触媒する酵
素の分画精製に関する記載がないため、該酵素作用が単
ムの酵素で触媒される一段反応か。
In other words, since these patents do not mention fractional purification of the enzyme that catalyzes the enzymatic action, the question is whether the enzymatic action is a one-step reaction catalyzed by a single enzyme.

ま之は複数の酵素で触媒される多段反応か明らかでない
。従来、該多段反応系が微生物細胞内に存在することは
予測されていなかったが、本発明者らは、先に該多段反
応系を保有する微生物を発見した(%願昭59−141
475号)。まf?:、、こレラの特許においては、D
−α−アミノアジピン酸の生成が明らかにされていない
ため、該酵素作用がセファロスポリンCを7−ACAと
D−α−アミノアジピン酸に加水分解する酵素によるも
のか、または未知の酵素によるものか明確でない。
It is unclear whether this is a multi-step reaction catalyzed by multiple enzymes. Conventionally, it was not predicted that this multi-stage reaction system exists in microbial cells, but the present inventors have previously discovered a microorganism that possesses this multi-stage reaction system (%Nisho 59-141).
No. 475). Maf? :,, in the Corella patent, D
-Since the production of α-aminoadipic acid has not been clarified, the enzymatic action may be due to an enzyme that hydrolyzes cephalosporin C to 7-ACA and D-α-aminoadipic acid, or an unknown enzyme. It's not clear what it is.

したがって、前記の特許において、セファロスポリンC
から7−ACA’i生成する酵素作用を利用しているこ
とは、セファロスポリンCを7− ACAとD−α−ア
ミノアジピン酸に加水分解する酵素を発見し、これを利
用していることを意味するとは限らない。
Therefore, in the said patent, cephalosporin C
Utilizing the enzymatic action of producing 7-ACA'i from cephalosporin C means that an enzyme that hydrolyzes cephalosporin C into 7-ACA and D-α-aminoadipic acid has been discovered and utilized. does not necessarily mean

ペニシリン比合物の6位あるいはセファロスポリン比合
物の7位のアミド結合を加水分解して、それぞれの母核
である6−アミノペニシラン酸化合物あるいは7−AC
A化合物を生成する酵素は、アシラーゼと総称されてお
シ、基質特異性の異なる多数のものが知られている。し
かし、セファロスポリンCを7.−ACAとD−α−ア
ミノアジピン酸に加水分解するアシラーゼ(以下、セフ
ァロスポリンCアシラーゼと呼称しb  r’p?:ア
シラーゼ」と略す)は、多くの研究者の長年の努力にも
かかわらず、その存在が明らかにはされていなかったも
のである。
By hydrolyzing the amide bond at the 6-position of the penicillin compound or the 7-position of the cephalosporin compound, the respective mother nuclei 6-aminopenicillanic acid compound or 7-AC
Enzymes that produce compound A are collectively called acylases, and many enzymes with different substrate specificities are known. However, 7. -Acylase that hydrolyzes ACA and D-α-aminoadipic acid (hereinafter referred to as cephalosporin C acylase and abbreviated as br'p?: acylase) has not been developed despite many researchers' efforts over many years. However, its existence had not been made clear.

そこで、本発明者らは、Cpeアシラーゼの製造を目的
に生産菌の探索を行ってきた。
Therefore, the present inventors have been searching for producing bacteria for the purpose of producing Cpe acylase.

(問題点を解決するための手段および作用)本発明者ら
は、先にシュードモナス エスピー(Pseudomo
nas sp、 ) S E −83(微工研菌寄第7
649号)がGL−7ACAを7−ACAとゲルタール
酸に加水分解する2種類のアシラーゼ(以下。
(Means and effects for solving the problem) The present inventors previously discovered that Pseudomonas sp.
nas sp, ) S E-83 (Microtechnical Laboratory No. 7
649) hydrolyzes GL-7ACA into 7-ACA and geltaric acid (hereinafter referred to as acylases).

「アシラーゼI型」および[アシラーゼTI型J 、!
:呼称する)を産生じていること、およびこのうちのア
シラーゼ■型がcpcアシラーゼであることを見出し、
本菌の菌体あるいは菌体処理物を利用する7〜ACAの
酵素的製造法を発明した(特願昭59−141475号
)。ついで、本菌のcpcアシラーゼ産生遺伝情報を担
うDNA断片を大腸菌にクローニングし、その塩基配列
を明らかにした(特願昭59−274108号)。
"Acylase type I" and [acylase TI type J,!
We found that the acylase type 1 of these is CPC acylase,
We have invented a method for enzymatically producing 7-ACA using the cells of this bacterium or a processed product of the bacterium (Japanese Patent Application No. 141475/1982). Subsequently, a DNA fragment carrying genetic information for CPC acylase production of this bacterium was cloned into Escherichia coli, and its nucleotide sequence was revealed (Japanese Patent Application No. 274108/1982).

さらに今回、本発明者らは、土壌から新たに分離された
細菌5E−495株がGL−7ACAfc7−ACAと
ゲルタール酸に加水分解する2種類のアシラーゼ(以下
、「アシラーゼI、]および「アシラーゼI(2)型」
と呼称する)を産生し、このうちのアシラーゼI(2)
型は、5E−83株の産生ずるcpcアシラーゼとは異
なる新規なcpcアシラーゼであることを発見した。
Furthermore, the present inventors have discovered that the newly isolated bacterial strain 5E-495 from soil contains two types of acylases (hereinafter referred to as "acylase I") and "acylase I" that hydrolyze GL-7ACAfc7-ACA and geltaric acid. (2) Type
Among these, acylase I (2)
It was discovered that this type of CPC acylase is a novel CPC acylase different from the CPC acylase produced by the 5E-83 strain.

これらの発見に基づく本発明は、一般式(I)0OH (式中、 RFi−OCOCH,、−Hまたは一〇Hを
表わす。)で示される化合物を一般弐〇 (式中、Rは前記と同じ意味を有する。)で示される化
合物とD−α−アミノアジピン酸に加水分解するcpc
アシラーゼを産生ずる、土壌よシ分離されたシュードモ
ナス属に属する細菌を培養し、培養物から該酵素を採取
することを特徴としている。
Based on these discoveries, the present invention provides a compound represented by the general formula (I) 0OH (in the formula, RFi-OCOCH, -H or 10H), a compound represented by the general formula (I) 20 (in the formula, R represents the above). have the same meaning.) and cpc that hydrolyzes to D-α-aminoadipic acid
This method is characterized by culturing bacteria belonging to the genus Pseudomonas isolated from soil that produces acylase, and collecting the enzyme from the culture.

先に発見された5E−85株は、分離学的研究o結果、
シュードモナス デミニュータ種(Pseudomon
as diminuta )に近縁ではあるが、クエン
酸資化性および栄養要求性がシュードモナスデミニュー
タ僅と異なっておシ、新種であると判定されている(特
願昭59−141475号)。
The 5E-85 strain, which was discovered earlier, was found as a result of isolation studies.
Pseudomonas deminuta sp.
Although it is closely related to Pseudomonas deminuta), its ability to assimilate citric acid and auxotrophy is slightly different from that of Pseudomonas deminuta, and it has been determined that it is a new species (Japanese Patent Application No. 141,475/1986).

今回、新たに発見され1sE−495株は、山口系の土
壌よシ分離され友細菌であって、その菌学的性質は以下
のとおシである。
The newly discovered strain 1sE-495 is a friendly bacterium that was isolated from the soil of the Yamaguchi region, and its mycological properties are as follows.

5E−495株の菌学的性質 (I)  形態的性質 肉汁寒天上で培養しfcMB胞は、1.Q〜1.2×1
.9〜2.1ミクロンの桿菌であシ、他生性のペン毛で
運動する。胞子は作らず、多形性も示さない。
Mycological properties of strain 5E-495 (I) Morphological properties fcMB cells cultured on broth agar were: 1. Q~1.2×1
.. It is a bacillus with a diameter of 9 to 2.1 microns and is motile with allogenic pen hairs. It does not produce spores and shows no pleomorphism.

ダラム染色性は陰性である。Durham staining is negative.

■ 培養的性質 (1)肉汁寒天培養:菌体は黄白色を呈して増殖する。■Cultural properties (1) Meat juice agar culture: The bacterial cells appear yellowish white and grow.

拡散性色素の生産は認められない。粘調性、遊走性とも
に示さない。
No production of diffusible pigments is observed. It exhibits neither viscosity nor migration.

(2)肉汁液体培養:培地全体がかすかに濁る。菌膜の
形成は認められない。
(2) Broth liquid culture: The entire medium becomes slightly cloudy. No bacterial membrane formation was observed.

(3)ゼラチン液化穿刺培養:ゼラチンの液化は認めら
れない(25C114日間)。
(3) Gelatin liquefaction puncture culture: No liquefaction of gelatin was observed (25C114 days).

(4)リドマスミルク培養:カゼインの液化は認められ
ない。
(4) Lidomus milk culture: No liquefaction of casein was observed.

(11D  生理学的性質 (1)硝酸塩の還元:陽性 (2)脱窒反応:陰性 (31M Rテスト:陰性 +41VPテスト:陽性 (5)インドールの生成:陰性 (6)硫fヒ水素の生成:陰性 (カデンブンの加水分解:陰性 (8)クエン酸の利用:陰性 (9)無機窒素源の利用ニアンモニウム塩を唯一のN源
として利用する。
(11D Physiological properties (1) Reduction of nitrate: Positive (2) Denitrification reaction: Negative (31M R test: Negative + 41VP test: Positive (5) Production of indole: Negative (6) Production of sulfur f arsenic: Negative (Hydrolysis of kadenbun: Negative (8) Use of citric acid: Negative (9) Use of inorganic nitrogen source Niammonium salt is used as the only N source.

QO)色素の生成:色素の生成は認められない。QO) Pigment formation: No dye formation was observed.

0υオキシダーゼ:陽性 (12+カタラーゼ:陽性 03)生育の範囲:25C〜30Cで良く生育する。0υ oxidase: positive (12+ catalase: positive 03) Growth range: Grows well at 25C to 30C.

37C以上では生育しない。It will not grow above 37C.

0滲酸素に対する態度:嫌気下での増殖は認められない
Attitude towards zero oxygen: No growth is observed under anaerobic conditions.

(+5)OFテスト(ヒューレイフソン法):fijl
bパラフィンの有無に関係なく酸生成は認められない。
(+5) OF test (Hugh Leifson method): fijl
b No acid formation is observed regardless of the presence or absence of paraffin.

(16)炭素源の利用性 (1)利用する炭素源:グルタミン酸、アスパラギン酸 (11)利用しない炭素源ニゲルコース、アラビノース
、キシロース、マンノース、ガ ラクトース、イノジット、マルトース、シュークロース
、グリセリンソルビッ ト、マンニット ση栄養要求性:パントテン酸要求 αQアルギニンの分解:陰性 C1911Jジンの脱炭酸反応:陰性 (20)オルニチンの脱炭酸反応:陰性Qυエスクリン
の分解:陰性 以上の菌学的性質をバーシーズ・マニュ7k・オプ・デ
ターミネイティブ・バクテリオロジー(Bergey 
’ s Manual of Determinati
veBacteriolgy)第8版(1974年)、
マニュアル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー
(Manual of C11nical Micro
biology )第3版(1q a 0年)、 オヨ
びバーシーズ・マニュアル・オプ・システマチック・バ
クテリオロジー(Bergey’s Manual o
f Systematic Bacteriology
)(1984年〕の記載と比較し、次の結論を得た。
(16) Utilization of carbon sources (1) Carbon sources used: glutamic acid, aspartic acid (11) Carbon sources not used: nigerose, arabinose, xylose, mannose, galactose, inosit, maltose, sucrose, glycerol sorbitol, mannitol ση Auxotrophy: Pantothenic acid requirement αQ Decomposition of arginine: Negative C1911J Decarboxylation of gin: Negative (20) Decarboxylation of ornithine: Negative Qυ Degradation of esculin: Negative or higher Mycological properties Versey's Manu 7k. Op Determinative Bacteriology (Bergey
's Manual of Determinati
veBacteriology) 8th edition (1974),
Manual of Clinical Microbiology
Biology) 3rd edition (1qa 0), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology
f Systematic Bacteriology
) (1984), the following conclusions were reached.

ダラム陰性桿菌で胞子を作らず、他生によって運動する
という形態的性質を有し、絶対好気性でグルコース発酵
能を持たないことから、本菌株はシュードモナス属に所
属すると同定できる。また、グルコース酸化陰性および
オキシダーゼ陽性の性質から、シュードモナス アルカ
リゲネス(Pseudomonas alcalige
nes )、シュードモナスシュードアルカリゲネス 
(Pseudomonaspseudoalcalig
enes )、シュードモナス テストステロニイ(P
seudomonas testosteroni )
、シュードモナス デミニュータおよびシュードモナス
 ペシキュラリス(Pseudomonas vesi
cularis)に限定される。さらに、単極毛、フラ
クトース酸化陰性、エスクリン分解陰性、硝酸塩還元陰
性であり、栄養要求性を示すことから、本菌株はシュー
ドモナス デミニュータ種に近縁であると判定できる。
This strain can be identified as belonging to the genus Pseudomonas because it is a Durham-negative bacillus, does not produce spores, is motile by allogenesis, is absolutely aerobic, and does not have the ability to ferment glucose. In addition, due to its glucose oxidation negative and oxidase positive properties, Pseudomonas alcaligenes (Pseudomonas alcaligenes)
nes ), Pseudomonas pseudoalcaligenes
(Pseudomonaspseudoalcalig
enes), Pseudomonas testosteronii (P
seudomonas testosteroni)
, Pseudomonas deminuta and Pseudomonas vesi
cularis). Furthermore, this strain can be determined to be closely related to Pseudomonas deminuta species because it has monopolar hairs, is negative for fructose oxidation, negative for esculin degradation, negative for nitrate reduction, and exhibits auxotrophy.

以上の結果から、5E−83株および5E−495株は
シュードモナス属の近縁の種に属していると結論される
。なお、5E−495株は工業技術院微生物工業技術研
究所に、シュードモナス エスピー(Pseudomo
nas sp、 ) S E −495(微工研菌寄F
ERM BP−818)として寄託されている。
From the above results, it is concluded that strains 5E-83 and 5E-495 belong to closely related species of the genus Pseudomonas. The 5E-495 strain was submitted to the Institute of Microbiology, Agency of Industrial Science and Technology as a Pseudomonas sp.
nas sp, ) S E-495 (Feikoken Bacillus F
ERM BP-818).

次に、本発明に係るシュードモナス属の細菌を用いて、
本発明のcpcアシラーゼを製造する方法について説明
する。培養は公知の方法に準じて行うことができる。培
地としては、一般微生物の栄養源として公知のものが使
用され、例えば、炭素源として種々の有機酸類、窒素源
として大豆粉、小麦胚芽、肉エキス、ペプトン、コーン
ステイープリカー、酵母エキス等を使用しうる。その他
必要に応じてマグネシウム塩、リン酸塩、カルシウム塩
などの塩類のほか、菌の生育と活性発現に必要な添加物
を適宜組合せて使用することができる。
Next, using the Pseudomonas bacterium according to the present invention,
A method for producing CPC acylase of the present invention will be explained. Cultivation can be performed according to known methods. As the culture medium, those known as nutritional sources for general microorganisms are used, such as various organic acids as a carbon source, soybean flour, wheat germ, meat extract, peptone, cornstarch liquor, yeast extract, etc. as a nitrogen source. Can be used. In addition to other salts such as magnesium salts, phosphates, and calcium salts, additives necessary for the growth and activity of the bacteria may be used in combination as necessary.

培養方法としては、好気的な液体培養法が適している。As a culture method, an aerobic liquid culture method is suitable.

培養温度は25〜32Cの範囲で選べばよく、培養時間
は培養条件によって異なるが、通常2〜4日を要する。
The culture temperature may be selected within the range of 25 to 32C, and the culture time varies depending on the culture conditions, but usually requires 2 to 4 days.

本発明のcpcアシラーゼは、得られた培養物から公知
の精製方法全適宜組合せて製造される。すなわち、cp
cアシラーゼは、通常は大部分が細胞内に存在するので
、まず、上記の培養物から遠心分離などの手段で菌体を
集め、ついで、超音波処理などの物理的処理あるいは酵
素処理を加えて細胞を破砕する。さらに、遠心分離など
の手段で固彫物を除去した後、塩析、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハ
イドaフオビツククロマトグラフイーあるいはゲル濾過
などの精製手段と透析、限外濾過、遠心分離、濃縮ある
いは凍結乾燥などの手段を適宜組合せて製造される。
The CPC acylase of the present invention is produced from the obtained culture by appropriately combining all known purification methods. That is, cp
Since most c-acylase is normally present within cells, the bacterial cells are first collected from the above-mentioned culture by centrifugation or other means, and then subjected to physical treatment such as sonication or enzymatic treatment. Crush the cells. Furthermore, after removing solid particles by means such as centrifugation, purification methods such as salting out, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, or gel filtration are performed, followed by dialysis, ultrafiltration, and centrifugation. It is manufactured by appropriately combining methods such as , concentration, and freeze-drying.

なお、5E−83株のアシラーゼ■型と5E−495株
のアシラーゼ■(2)型は、上記の精製工程において若
干異なった挙動をするため、同一物質ではなバことがわ
かる。例えば、DEAEセファデックスカラムクロマト
グラフィーにおいて、上記の二つのcpcアシラーゼが
溶離される塩濃度は異なっている。すなわち、o、1M
’!Jン酸緩衝液(pH8,0)で平衡fヒし、7’c
DEAEセファデックスA−50(ファルマシア社M)
を充填し之カラムにcpcアシラーゼを吸着させ、つい
で、食塩濃度勾配芯出法で溶出する場合、アシ2−ゼ■
型は約0.17Mの食塩濃度で溶出されるが、アシラー
ゼI(2)型は約0.12Mの食塩濃度で溶出される。
It should be noted that the acylase type 2 of the 5E-83 strain and the acylase type 2 (2) of the 5E-495 strain behave slightly differently in the above-mentioned purification process, so it can be seen that they are not the same substance. For example, in DEAE Sephadex column chromatography, the two CPC acylases are eluted at different salt concentrations. That is, o, 1M
'! Equilibrate with J acid buffer (pH 8,0) and 7'c
DEAE Sephadex A-50 (Pharmacia M)
When CPC acylase is adsorbed onto the column filled with CPC acylase and then eluted using the salt concentration gradient centering method, acylase
Acylase type I(2) is eluted at a salt concentration of about 0.12M, while acylase type I(2) is eluted at a salt concentration of about 0.17M.

本発明法によシ製造されるcpcアシラーゼの性質およ
び酵素活性測定法は、次のとおシである。
The properties and enzymatic activity of CPC acylase produced by the method of the present invention are measured as follows.

(I)性 質 (1)作 用 cpcアシラーゼはペニシリン アミドハイドロラーゼ
(B、C,3,5,1,11)の一つであり、化合物(
I) ’!&化合物(至)とD−α−アミノアジピン酸
に加水分解する点に特徴がある。
(I) Properties (1) Action CPC acylase is one of the penicillin amide hydrolases (B, C, 3, 5, 1, 11), and is a compound (
I)'! It is characterized in that it hydrolyzes into D-α-aminoadipic acid and D-α-aminoadipic acid.

本酵素が化合物(I)を加水分解して化合物σDとD−
α−アミノアジピン酸を生成することは、前記の方法で
精製された酵素標品について証明されている。すなわち
、化合物刊は後述の高速液体クロマトグラフィーを用い
る方法で、また、D−α−アミノアジピン酸はアミノ酸
分析計を用いて、それぞれ同定および定量が行われてい
る。なお、α−アミノアジピン酸の光学活性はL−およ
びD −アミノ酸酸化酵素を用いた実験に基づき決定さ
れている。
This enzyme hydrolyzes compound (I) to form compounds σD and D-
Production of α-aminoadipic acid has been demonstrated for enzyme preparations purified by the method described above. That is, identification and quantification of compounds are carried out using a method using high performance liquid chromatography, which will be described later, and D-α-aminoadipic acid is carried out using an amino acid analyzer. Note that the optical activity of α-aminoadipic acid has been determined based on experiments using L- and D-amino acid oxidases.

(2)基質特異性 5E−85株および5E−495株のcpcアシラーゼ
は、上記の作用に加えて、GL−7ACA。
(2) Substrate specificity The CPC acylases of the 5E-85 strain and 5E-495 strain have the above-mentioned effects as well as GL-7ACA.

7β−(5−カルボキシペンタンアミド)セファロスポ
ラン酸および7β−(3−カルボキシプロパンアミド)
セファロスポラン酸全7−ACAとジカルボン酸に加水
分解する。一方、セファロスポリンCのN−アセチル比
合物および7β−(フェニルアセトアミド)セファロス
ポラン酸は加水分解しない。なお、いずれの菌株におい
ても、該酵素のCL−7ACA加水分解活性は、セファ
ロスポリンC加水分解活性の15〜25倍の範囲にある
7β-(5-carboxypentanamide) cephalosporanic acid and 7β-(3-carboxypropanamide)
Cephalosporanic acid is hydrolyzed to total 7-ACA and dicarboxylic acid. On the other hand, the N-acetyl compound of cephalosporin C and 7β-(phenylacetamido)cephalosporanic acid are not hydrolyzed. In addition, in any strain, the CL-7ACA hydrolyzing activity of the enzyme is in the range of 15 to 25 times the cephalosporin C hydrolyzing activity.

(3)至適pH 該酵素の至適pHは、いずれも約9にある。例として、
 5E−85株のcpcアシラーゼの反応速度へのpH
の影響を、GL−7ACA全基質としてI11定した結
果を第1図に示す。使用した緩衝液は、pH5〜6はク
エン酸緩衝液、pH6〜8はリン酸緩衝液、およびpH
8〜10はグリシン緩衝液である。
(3) Optimum pH The optimal pH of the enzymes is approximately 9. As an example,
pH on reaction rate of CPC acylase of strain 5E-85
Figure 1 shows the results of determining the effect of I11 on all GL-7ACA substrates. The buffers used were citrate buffer for pH 5-6, phosphate buffer for pH 6-8, and
8-10 are glycine buffers.

(4)安定pH範囲 該酵素はジチオスレイトール存在下では、pH7〜10
の範囲でいずれも安定である。例として、5E−85株
のcpcアシラーゼをジチオスレイトール0.5mM存
在下、50Cで2時間処理後の残存活性を第2図に示し
た。使用し次緩衝液は、上記(3)で使用したものと同
様である。
(4) Stable pH range The enzyme has a pH of 7 to 10 in the presence of dithiothreitol.
All are stable within the range of . As an example, the residual activity of CPC acylase of strain 5E-85 after treatment at 50C for 2 hours in the presence of 0.5 mM dithiothreitol is shown in FIG. The buffer used was the same as that used in (3) above.

(5)阻害剤 該酵素はいずれもp−クロロマーキュリ−ベンゾエート
によシ阻害され、フェニルメチルスルホニルフルオライ
ドでは阻害されなho (6)等電点 ファルマンア社のポリバッファー2用いるクロマトフオ
ーカシング法によシ求めた該酵素の等1点は、いずれも
pH4〜4.5の範囲にちる。
(5) Inhibitor: Both of the enzymes are inhibited by p-chloromercury-benzoate, but not by phenylmethylsulfonyl fluoride. (6) Isoelectric focusing chromatofocusing method using Polybuffer 2 from Farmana. The pH values of the enzymes determined by this method all fall within the range of pH 4 to 4.5.

以上の結果から、5E−83株と5E−495株のcp
cアシラーゼは別物質ではあるが、酵素化学的性質はよ
く類似して−ることがわかる。
From the above results, the cp of the 5E-83 strain and 5E-495 strain
Although c-acylase is a different substance, it can be seen that the enzymatic chemical properties are very similar.

■酵素活性測定法 (1)セファロスポリンC加水分解活性測定法セファロ
スポリンC50mMを含む0.1Mリン酸緩衝液(+)
H8,0)1−およびジチオスレイトール2mMを含む
酵素溶液(pH8,0’)1−を混合し、37C,10
分間反応させる。67%酢酸水溶液(p H2,0) 
0.4−を加えて反応を止め、遠心分離およびメンプラ
ン濾過により固型物を除去した後、生成した7−ACA
を高速液体クロマトグラフィーで定量し、酵素活性を求
める。高速液体クロマトグラフィー条件は、次のとおり
である。
■ Enzyme activity measurement method (1) Cephalosporin C hydrolysis activity measurement method 0.1M phosphate buffer containing 50mM of cephalosporin C (+)
H8,0) 1- and an enzyme solution (pH 8,0') 1- containing 2mM dithiothreitol were mixed, and 37C,10
Let it react for a minute. 67% acetic acid aqueous solution (pH2.0)
After stopping the reaction by adding 0.4- and removing solids by centrifugation and membrane filtration, the produced 7-ACA
quantified using high performance liquid chromatography to determine enzyme activity. The high performance liquid chromatography conditions are as follows.

カラム二マイクロボンダバツク(μmBondapac
k )Ctaカラム(ウォーターズ社製) 移動相:5%酢酸アンモニウム98容とアセトニトリル
2容の混合液 検出波長: 260 nm 121セフアロスポリンC以外の化合物(I)の加水分
解活性測定法 化合物(I)を基質として、上記(I)の方法と同様に
酵素反応を行い、生成した化合物■は、以下の方法でN
−フェニルアセチル化合物を誘導して、高速液体クロマ
トグラフィーを用いて定量する。
Column two micro bondapac (μmBondapac)
k) Cta column (manufactured by Waters) Mobile phase: A mixture of 98 volumes of 5% ammonium acetate and 2 volumes of acetonitrile Detection wavelength: 260 nm 121 Method for measuring hydrolysis activity of compounds (I) other than cephalosporin C Compound (I) As a substrate, an enzymatic reaction was performed in the same manner as in method (I) above, and the resulting compound ■ was converted to N by the following method.
- Phenylacetyl compounds are derived and quantified using high performance liquid chromatography.

すなわち、化合物0を含む一定量の水溶液に重曹を加え
アルカリ性に保つ、これに1710容のアセトンと、化
合物面の推定量の約5倍モルのフェニルアセチルクロラ
イドを添加し、室温で反応させる。30分後、%容のエ
ーテルで抽出し、過剰のフェニルアセチルクロライドを
除去する。水層をpH2に調節し、等容の酢酸エチルで
2回抽出し、酢酸エチル層を合せて減圧乾固する。残渣
を一定量のメタノールに溶解し、生成したN−フェニル
アセチル化物を高速液体クロマトグラムで分析し、標品
と比較定量する。カラムはマイクロボンダパックCI8
を用い、移動相としては0.05Mリン酸緩衝液(pH
7,0)とメタノールの混合液を適宜用いる。検出は2
60 nmで行い、生成したN−フェニルアセチル化物
の定量値、および既知濃度の化合物を用いた対照実験で
得られた回収率から生成物の量を求め、酵素活性を計算
する。
That is, baking soda is added to a certain amount of aqueous solution containing Compound 0 to keep it alkaline. To this, 1710 volumes of acetone and about 5 times the mole of phenylacetyl chloride than the estimated amount of the compound are added and reacted at room temperature. After 30 minutes, extract with % volume ether to remove excess phenylacetyl chloride. The aqueous layer is adjusted to pH 2, extracted twice with equal volumes of ethyl acetate, and the ethyl acetate layers are combined and dried under reduced pressure. The residue is dissolved in a certain amount of methanol, and the generated N-phenylacetylated product is analyzed by high performance liquid chromatography and quantified by comparison with a standard sample. Column is Microbondapak CI8
The mobile phase was 0.05M phosphate buffer (pH
7,0) and methanol is used as appropriate. Detection is 2
60 nm, and the amount of product is determined from the quantitative value of the produced N-phenylacetylated product and the recovery rate obtained in a control experiment using a compound at a known concentration, and the enzyme activity is calculated.

+31 G L −7A CAの加水分解活性測定法G
L−7ACAを基質として、前記(11の方法と同様に
酵素反応を行い、生成し7’(7−ACAは、p−ジメ
チルアミノベンズアルデヒドを用いる比色定量法で定量
する。すなわち、酵素反応液2−に67係酢酸水溶液(
p H2,0) 0.4−を加えて反応を停止させる。
+31 G L -7A CA hydrolysis activity measurement method G
Using L-7ACA as a substrate, an enzymatic reaction is carried out in the same manner as in method 11 above, and the produced 7'(7-ACA is quantified by a colorimetric method using p-dimethylaminobenzaldehyde. In other words, the enzyme reaction solution 2-67 acetic acid aqueous solution (
pH2,0) 0.4- is added to stop the reaction.

ついで、p−ジメチルアミノベンズアルデヒドのメタノ
ール溶液(5f/l)を0.4−加え攪拌する。遠心分
離により固形物を除去した後、生成する化合物の黄色を
波長400nmで定量し、あらかじめ作成した検量線か
ら7−ACA生成量を求め、さらに、酵素活性を計算す
る。酵素活性の表示は、上記の酵素反応条件下で1分間
に1マイクロモル(μmol )の7−ACAを生成す
る酵素量を1単位とする。
Then, 0.4 methanol solution (5 f/l) of p-dimethylaminobenzaldehyde was added and stirred. After removing solid matter by centrifugation, the yellow color of the produced compound is quantified at a wavelength of 400 nm, the amount of 7-ACA produced is determined from a calibration curve prepared in advance, and the enzyme activity is calculated. When expressing enzyme activity, one unit is the amount of enzyme that produces 1 micromole (μmol) of 7-ACA per minute under the enzyme reaction conditions described above.

(実施例) 次に、本発明を実施例をもって説明する。(Example) Next, the present invention will be explained using examples.

実施例1 肉エキス0.2%、酵母エキス0.2%、ペプトン0.
5%、グルタミン酸ソーダ0.5%、硫酸マグネシウム
o、o o s%の組成からなる培地(pH7,0)1
51ft501容量ジャーファーメンタ−に仕込み、1
20C,30分殺菌後、予め同培地で前培養シタシュー
ドモナス・エスピー 5E−83を2%になるように植
菌した。25Cで48時間培養後、菌体を遠心分離によ
り集め湿菌体52fを得た。本菌体に含まれる2種類の
アシラーゼ(アシラーゼ■型およびアシラーゼ■型)に
よって触媒されるGL−7ACA加水分解活性は、約0
.86単位/2−湿菌体であった。この湿菌体527を
0.1Mリン酸緩衝液(p)(8,0)200ゴに懸濁
し、5Cで超音波細胞破砕処理後、固型物を除去し酵素
液を調製した。ついで、本酵素液に5C冷却下で硫酸ア
ンモニウムを30%飽和濃度まで攪拌しながら徐々に添
加し、生成した沈でん物を除去した。上清両分に硫酸ア
ンモニウムを60係飽和濃度まで添加し、1時間攪拌後
、沈殿画分を集め、0.1Mリン酸緩衝液(pH18,
0)100−に溶かした。この酵素液を、同緩衝液に対
し5Cで−晩透析した後、あらかじめ同緩衝液で平衡化
したDEAEセファデックスA−50(ファルマシア社
H)60 a7!を充填したカラムに通すと、活性は吸
着された。活性の溶出は、溶出液としてカラム容量の5
倍量の0.1MIJン酸緩衝液(pH8,0)を使用し
、食塩濃度を最終濃度0.3Mまで直線的に上昇させる
食塩濃度勾配溶出液によった。その結果、アシラーゼ■
型は食塩濃度0.05 M付近で溶出され、cpcアシ
ラーゼ(アシラーゼ■型)は食塩濃度0.17M付近で
溶出されることがわかった。また、アシラーゼI型とc
pcアシラーゼは、はソ等量存在することがわかった。
Example 1 Meat extract 0.2%, yeast extract 0.2%, peptone 0.
5%, sodium glutamate 0.5%, magnesium sulfate o, o o s% (pH 7.0) 1
Pour into a 51ft 501 capacity jar fermenter, 1
After sterilization at 20C for 30 minutes, precultured Pseudomonas sp. 5E-83 was inoculated to 2% in the same medium. After culturing at 25C for 48 hours, the bacterial cells were collected by centrifugation to obtain wet bacterial cells 52f. The GL-7ACA hydrolysis activity catalyzed by two types of acylases (acylase ■ type and acylase ■ type) contained in this bacterial cell is approximately 0.
.. It was 86 units/2-wet bacterial cells. This wet bacterial cell 527 was suspended in 200 g of 0.1M phosphate buffer (p) (8,0), subjected to ultrasonic cell disruption treatment at 5C, and solid matter was removed to prepare an enzyme solution. Then, ammonium sulfate was gradually added to the enzyme solution under stirring at 5C to a saturation concentration of 30%, and the precipitate formed was removed. Ammonium sulfate was added to both supernatants to a saturation concentration of 60%, and after stirring for 1 hour, the precipitate fraction was collected and added to 0.1M phosphate buffer (pH 18,
0) Dissolved in 100-. This enzyme solution was dialyzed against the same buffer solution overnight at 5C, and then DEAE Sephadex A-50 (Pharmacia H) 60 a7!, which had been equilibrated with the same buffer solution in advance, was used. The activity was adsorbed when passed through a column packed with Elution of activity is performed using 5 column volumes as eluent.
Double volumes of 0.1 MIJ acid buffer (pH 8.0) were used and the saline concentration was linearly increased to a final concentration of 0.3M by saline gradient elution. As a result, acylase■
It was found that the type was eluted at a salt concentration of around 0.05M, and the CPC acylase (acylase type ■) was eluted at a salt concentration of around 0.17M. In addition, acylase type I and c
PC acylase was found to be present in approximately equal amounts.

第3図にDEAEセファデックスカラムクロマトグラフ
ィーの溶出パターンを示す。ついで、cpcアシラーゼ
画分を集めたところ、18単位のG L −7ACA加
水分解活性が回収された。この画分を、再度同一条件で
DEAEセファデックスカラムクロマトグラフィーにか
け、精製酵素標品を得た。この標品中の蛋白量は45■
であり、酵素活性はGL−7ACA加水分解活性で示せ
ば約9単位、また、セファロスポリンC加水分解活性で
示せば約0.5単位であった。なお、蛋白量はロー’J
 −(Lowry )法により、牛血清アルブミンを標
準と゛して測定した。
FIG. 3 shows the elution pattern of DEAE Sephadex column chromatography. The cpc acylase fraction was then collected, and 18 units of GL-7ACA hydrolysis activity was recovered. This fraction was again subjected to DEAE Sephadex column chromatography under the same conditions to obtain a purified enzyme preparation. The amount of protein in this specimen is 45■
The enzymatic activity was approximately 9 units in terms of GL-7ACA hydrolysis activity, and approximately 0.5 units in terms of cephalosporin C hydrolysis activity. In addition, the protein amount is Rho'J
- (Lowry) method using bovine serum albumin as a standard.

実施例2 実施例1と同様の方法でシュードモナス エスピー5E
−495を培養し、菌体を遠心分離により集めたところ
、湿菌体50?を得た。本菌体に含まれる2種類のアシ
ラーゼ(アシラーゼ■型およびアシラーゼI(2)型)
によって触媒されるGL−7ACA加水分解活性は、約
0.52単位/2−湿菌体であった。この湿菌体50ノ
を、実施例1と同様な方法で超音波処理、硫安分画およ
びDEAセファデックスカラムクロマトグラフィー精製
に供した。その結果、アシラーゼ■型は食塩濃度0.0
5M付近で溶出され、cpcアシラーゼ(アシラーゼ■
(21型)は食塩濃度0.12M付近で溶出されること
がわかった。また、アシラーゼ■型とcpcアシラーゼ
は、はy等量存在することがわかった。第4図にDEA
Eセファデックスカラムクロマトグラフィーの塵出パタ
ーンを示す。
Example 2 Pseudomonas sp. 5E was grown in the same manner as in Example 1.
-495 was cultured and the bacterial cells were collected by centrifugation, and it was found that 50? I got it. Two types of acylases contained in this bacterial cell (acylase type ■ and acylase I (2) type)
The GL-7ACA hydrolysis activity catalyzed by the following was approximately 0.52 units/2 wet bacterial cells. Fifty pieces of the wet bacterial cells were subjected to ultrasonication, ammonium sulfate fractionation, and DEA-Sephadex column chromatography purification in the same manner as in Example 1. As a result, acylase type ■ has a salt concentration of 0.0.
It was eluted at around 5M, and CPC acylase (acylase ■
(Type 21) was found to be eluted at a salt concentration of around 0.12M. Furthermore, it was found that acylase type II and CPC acylase were present in y-equal amounts. Figure 4 shows the DEA
The dust pattern of E-Sephadex column chromatography is shown.

ついで、cpCアシラーゼ画分を集めたところ、10単
位のGL−7A CA加水分解活性が回収された。この
画分を、再度同一条件でDEAEセファデックスカラム
クロマトグラフィーにかけ、精製酵素標品を得た。得ら
れた標品中の蛋白量は40ffl?であり、酵素量はG
L−7A CA加水分解活性で示せば約4.8単位であ
り、また、セファロスポリンC加水分解活性で示せば約
0.24単位であった。
The cpC acylase fraction was then collected, and 10 units of GL-7A CA hydrolysis activity was recovered. This fraction was again subjected to DEAE Sephadex column chromatography under the same conditions to obtain a purified enzyme preparation. The amount of protein in the obtained sample is 40 ffl? and the amount of enzyme is G
The L-7A CA hydrolysis activity was about 4.8 units, and the cephalosporin C hydrolysis activity was about 0.24 units.

(発明の効果) 本発明者らは、化合物(I)を化合物面とD−α−アミ
ノアジピン酸て加水分解する酵素(cpcアシラーゼ)
を産生ずる微生物を探索し、シュードモナス エスピー
5E−85およびシュードモナス エスピー5E−49
5を発見した。これらの発見に基づき、実施例に示す如
く、化合物■の酵素的製造に用いられるcpcアシラー
ゼの製造方法が確立された。
(Effect of the invention) The present inventors have discovered an enzyme (cpc acylase) that hydrolyzes compound (I) between the compound surface and D-α-aminoadipic acid.
We searched for microorganisms that produce Pseudomonas sp. 5E-85 and Pseudomonas sp. 5E-49.
I found 5. Based on these discoveries, a method for producing CPC acylase, which is used in the enzymatic production of Compound (1), was established as shown in the Examples.

【図面の簡単な説明】 第1図はcpcアシラーゼの至適pHを示すグラフ、第
2図はcpcアシラーゼのpH安定曲線、第3図はシュ
ードモナス エスピー 5E−asのcpcアシラーゼ
のDEAEセファデックスカラムクロマトグラフィーに
おける溶出パターンを示すグラフ、第4図はシュードモ
ナス エスピー5E−495のcpcアシラーゼのDE
AEセファデックスカラムクロマトグラフィーにおける
溶出パターンを示すグラフである。 第1図 第2図 蛋白Cm9/ml> (Δ−−−−Δ)食塩濃度(M)
  (−−−−) 蛋白閂たl)(Δ−−−Δ) 食塩j1度(M)  (−−−−) 手 続 補 正 !+方式) %式% 1 事件の表示 特願昭60−187327号 2 発明の名称 セファロスポリンCアシラーゼの製造法3 補正をする
者 事件との関係・特許出願人 (003) 旭化成工業株式会社 4代理人 東京都港区虎ノ門−丁目2番29号虎ノ門産業ビル51
者(6823)    弁理士  清  水     
 猛°゛・5 補正命令の日付 昭和60年11月26日 6 補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄 発明の詳細な説明の欄 7 補正の内容 明細書の記e1.ヲ次のとおり補正する。 Hl  特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 (21第8頁11行の一般式(I)を下記のとおり補正
する。 「 」 (31第8頁下から2行の一般式(II)を下記のとお
り補正する。 [ 特許請求の範囲            別 紙+11
 一般式(I) 0OH (式中、Rは一0COCHい−Hまたは−OHを表わす
。)で示される化合物を一般式(II) 0OH (式中、Rは一0COCHい−Hまたは一〇Hを表わす
。)で示される化合物とD−α−アミノアジピン酸に加
水分解するセファロスポリンCアシラーゼを産生ずるシ
ュードモナス属(Pseudomonas )の細菌を
培養し、培養物から該酵素を採取することを特徴とする
発酵法によるセファロスポリンCアシラーゼの製造法。 (21シュードモナス属の細菌がシュードモナスエスピ
ー(Pseudomonas sp、 ) S E −
83(倣工研菌寄第7649号、FERM BP−81
7)である特許請求の範囲第1項記載の方法。 (31シュードモナス属の細菌がシュードモナスエスピ
ー(Pseudomonas sp、) S E −4
95(微工研菌寄FERM  BP−818)である特
許請求の範囲第1項記載の方法。
[Brief explanation of the drawings] Figure 1 is a graph showing the optimum pH of CPC acylase, Figure 2 is a pH stability curve of CPC acylase, and Figure 3 is a DEAE Sephadex column chromatography of CPC acylase from Pseudomonas sp. 5E-as. A graph showing the elution pattern in the graph, Figure 4 shows the DE of CPC acylase of Pseudomonas sp.
It is a graph showing an elution pattern in AE Sephadex column chromatography. Figure 1 Figure 2 Protein Cm9/ml> (Δ---Δ) Salt concentration (M)
(-----) Protein bar) (Δ---Δ) Salt j1 degree (M) (-----) Procedure correction! + method) % formula % 1 Indication of the case Japanese Patent Application No. 187327/1982 2 Name of the invention Method for producing cephalosporin C acylase 3 Person making the amendment Relationship with the case/Patent applicant (003) Asahi Kasei Corporation 4 Agent: 51 Toranomon Industrial Building, 2-29 Toranomon-chome, Minato-ku, Tokyo
(6823) Patent attorney Shimizu
5. Date of amendment order November 26, 1985 6 Claims column of the specification to be amended Detailed description of the invention column 7 Contents of the amendment Description e1. Correct as follows. Hl The claims are amended as shown in the attached sheet. (21 General formula (I) on page 8, line 11 is amended as follows. " 31 General formula (II) on page 8, line 11 from the bottom is amended as follows. paper +11
A compound represented by the general formula (I) 0OH (in the formula, R represents 10COCH-H or -OH) is a compound represented by the general formula (II) 0OH (in the formula, R represents 10COCH-H or -OH). A bacterium of the genus Pseudomonas that produces cephalosporin C acylase, which hydrolyzes the compound represented by the following formula into D-α-aminoadipic acid, is cultured, and the enzyme is collected from the culture. A method for producing cephalosporin C acylase by a fermentation method. (21 Bacteria of the genus Pseudomonas are Pseudomonas sp.) SE -
83 (Imitation Technical Research Institute No. 7649, FERM BP-81
7) The method according to claim 1. (31 Bacteria of the genus Pseudomonas are Pseudomonas sp.) SE-4
95 (FERM BP-818).

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] (1)一般式( I ) ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) (式中、Rは−OCOCH_3、−Hまたは−OHを表
わす。)で示される化合物を一般式(II) ▲数式、化学式、表等があります▼(II) (式中、Rは−OCOCH_3、−Hまたは−OHを表
わす。)で示される化合物とD−α−アミノアジピン酸
に加水分解するセフアロスポリンCアシラーゼを産生す
るシユードモナス属(Pseudomonas)の細菌
を培養し、培養物から該酵素を採取することを特徴とす
る発酵法によるセフアロスポリンCアシラーゼの製造法
(1) General formula (I) ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼(I) (In the formula, R represents -OCOCH_3, -H or -OH.) General formula (II) ▲ There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼ (II) (In the formula, R represents -OCOCH_3, -H or -OH.) A compound represented by the formula and cephalosporin C acylase which hydrolyzes it to D-α-aminoadipic acid. A method for producing cephalosporin C acylase by a fermentation method, which comprises culturing the producing bacteria of the genus Pseudomonas and collecting the enzyme from the culture.
(2)シユードモナス属の細菌がシユードモナスエスピ
ー(Pseudomonas sp.)SE−83(微
工研菌寄第7649号、FERM BP−817)であ
る特許請求の範囲第1項記載の方法。
(2) The method according to claim 1, wherein the bacterium of the genus Pseudomonas is Pseudomonas sp. SE-83 (FERM BP-817, FERM BP-817).
(3)シユードモナス属の細菌がシユードモナスエスピ
ー(Pseudomonas sp.)SE−495(
微工研菌寄FERM BP−818)である特許請求の
範囲第1項記載の方法。
(3) Bacteria of the genus Pseudomonas is Pseudomonas sp. SE-495 (
FERM BP-818) The method according to claim 1.
JP60187327A 1985-08-28 1985-08-28 Production of cephalosporin c acylase Granted JPS6248380A (en)

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