JPS585192A - プラズマ重合をもちいた固定化酵素の製造法 - Google Patents
プラズマ重合をもちいた固定化酵素の製造法Info
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- JPS585192A JPS585192A JP10006581A JP10006581A JPS585192A JP S585192 A JPS585192 A JP S585192A JP 10006581 A JP10006581 A JP 10006581A JP 10006581 A JP10006581 A JP 10006581A JP S585192 A JPS585192 A JP S585192A
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵゛素およびプラズマ重合活性な単量体を共存
せしめてプラズマ照射による重合体を合成し、この際に
生成する重合体を利用して酵素を包括し固定化しようと
するものである・従来、酵素の固定化忙関しては担体結
合法、架橋法、包括法等数多く知られているが、このう
ち包括法は酵素タンパク自身が固定化担体と化学的に結
合していないので数多くの酵素に適用できる利点がある
。
せしめてプラズマ照射による重合体を合成し、この際に
生成する重合体を利用して酵素を包括し固定化しようと
するものである・従来、酵素の固定化忙関しては担体結
合法、架橋法、包括法等数多く知られているが、このう
ち包括法は酵素タンパク自身が固定化担体と化学的に結
合していないので数多くの酵素に適用できる利点がある
。
放射線や高速電子線をもちいて重合をおこしたアクリル
アミドゲル中に包括した固定化酵素は工業的にも利用さ
れている好例である。これらの放射線をもちいて重合を
おこし包括する方法は、しかしながら放射線が単量体層
を透過して酵素に損傷を与え、活性を低下させてしまう
とい５欠点を有している０まだ、重合温度を非常な低温
Ｋｍ持しなげればならないし、放射線源や安全保護の観
点から施設的にも大規模な装置を備えなければならなく
、高エネルギーを要する割に効率・経済性ともに悪い。
アミドゲル中に包括した固定化酵素は工業的にも利用さ
れている好例である。これらの放射線をもちいて重合を
おこし包括する方法は、しかしながら放射線が単量体層
を透過して酵素に損傷を与え、活性を低下させてしまう
とい５欠点を有している０まだ、重合温度を非常な低温
Ｋｍ持しなげればならないし、放射線源や安全保護の観
点から施設的にも大規模な装置を備えなければならなく
、高エネルギーを要する割に効率・経済性ともに悪い。
このような情況から、放射線に代わる新しい重合法によ
る酵素固定化技術が待ち望まれていた。本発明のような
プラグ−ＶＫよって重合体をＩＩ製し、酵素を包括しよ
うとする例はまだ知られていない〇 本発明においてもちいられるプラズマは非平衡プラズマ
、特にグロー放電による低温プラズマが好ましい。この
よ５な低温プラズマは通常減圧下０、Ｏ１〜１００Ｉ１
３＋Ｈ２の圧力下にある気体に適当な電圧を加える事に
よって得られる０周波数に関しては制限はなく、例えば
１３．５６ ＭＨｚのラジオ周波数の市販プラズマ発生
装置を用いて印加する事ができる。この電極として外部
又は内部平行電極板、あるいはコイル状電極を用いる事
ができる。
る酵素固定化技術が待ち望まれていた。本発明のような
プラグ−ＶＫよって重合体をＩＩ製し、酵素を包括しよ
うとする例はまだ知られていない〇 本発明においてもちいられるプラズマは非平衡プラズマ
、特にグロー放電による低温プラズマが好ましい。この
よ５な低温プラズマは通常減圧下０、Ｏ１〜１００Ｉ１
３＋Ｈ２の圧力下にある気体に適当な電圧を加える事に
よって得られる０周波数に関しては制限はなく、例えば
１３．５６ ＭＨｚのラジオ周波数の市販プラズマ発生
装置を用いて印加する事ができる。この電極として外部
又は内部平行電極板、あるいはコイル状電極を用いる事
ができる。
酵素を包括する重合体をプラズマと接触させて調製する
ｋは、２種類の方法がある。ひとつは、グツズ１重合し
うるモノマーを気体状でプラズマ重合反応管に送りプラ
ズマ化させ、よって予め反応管に存在させておいた酵素
上にその重合体を堆積させる方法である。この場合、プ
ラズマ重合しうるモノマーとしては、よく知られている
ように必ずしも２重結合は必要でなく、メタンやエタン
、メチルアルコール等数多くの有機無機化合物を選ぶ事
ができる。又、不飽和結合を有するエチレン、アセチレ
ン、各種ビニル化合物、開環重合するシクＩ：＋フルキ
ルシーキサン、環状エーテル等、数多くの単量体のうち
から選ぶこともできる。ただ、酵素′は熱や紫外光等に
敏感で容易忙失活し易いので、重合反応が速やかに進行
するよ５なモノマーを選ぶ事が肝要である。更に包括さ
れた酵素が反応をおこなう上で基質と充分１触するよう
な空間も必要なので包括する重合体は水と親和性、膨潤
性を有している事が望ましい。以上の事から例えば水溶
性ビニル七ツマ−やそれに類する単量体を包括する重合
体ないし共重合体の一成分として導入する事が好ましい
。第２の方法は、酵素のプラズマとの接触をできる丈避
ける考えから、いわゆるプラズマ開始重合法を用いる方
法である。この重合法は本発明者らの考案になるもので
液状ないし固体状の単量体存在下で短時間プラズマを発
生させて重合開始種を生成し、室温以下の温度で後重合
させて高分子量重合体を得る方法である（「化学工業Ｊ
Ａ４ 、Ｐ２Ｓ５（１９８０）、Ｕ８Ｐ。
ｋは、２種類の方法がある。ひとつは、グツズ１重合し
うるモノマーを気体状でプラズマ重合反応管に送りプラ
ズマ化させ、よって予め反応管に存在させておいた酵素
上にその重合体を堆積させる方法である。この場合、プ
ラズマ重合しうるモノマーとしては、よく知られている
ように必ずしも２重結合は必要でなく、メタンやエタン
、メチルアルコール等数多くの有機無機化合物を選ぶ事
ができる。又、不飽和結合を有するエチレン、アセチレ
ン、各種ビニル化合物、開環重合するシクＩ：＋フルキ
ルシーキサン、環状エーテル等、数多くの単量体のうち
から選ぶこともできる。ただ、酵素′は熱や紫外光等に
敏感で容易忙失活し易いので、重合反応が速やかに進行
するよ５なモノマーを選ぶ事が肝要である。更に包括さ
れた酵素が反応をおこなう上で基質と充分１触するよう
な空間も必要なので包括する重合体は水と親和性、膨潤
性を有している事が望ましい。以上の事から例えば水溶
性ビニル七ツマ−やそれに類する単量体を包括する重合
体ないし共重合体の一成分として導入する事が好ましい
。第２の方法は、酵素のプラズマとの接触をできる丈避
ける考えから、いわゆるプラズマ開始重合法を用いる方
法である。この重合法は本発明者らの考案になるもので
液状ないし固体状の単量体存在下で短時間プラズマを発
生させて重合開始種を生成し、室温以下の温度で後重合
させて高分子量重合体を得る方法である（「化学工業Ｊ
Ａ４ 、Ｐ２Ｓ５（１９８０）、Ｕ８Ｐ。
４．２１２１７１９（１９８０）参照〕。この方法を用
いるとプラズマ発生時間が数秒〜数分程度と極めて短か
い上、液相ないし固相単量体中に存在する酵素はこれら
の単量体に保護されて失希せず、しかも後重合も低温で
進行するので酵素を効率良く固定化する上で至便である
。この際、酵素、・単量体混合物をガラス板等上に塗布
し薄膜状にしておいてプラズマ開始重合を行なえば、フ
ィルム状固定化酵素が得られ酵素電極への応用が可能で
ある０プラズマ開始重合で得られる重合体は通学直鎖状
で溶媒可溶であるので、必ｇＩＫ応じ架橋剤を酵素、単
量体と共に共存して重合させ、生成した架橋網目構造の
重合体中Ｅｌｌ素を包Ｍ−ｊる工夫も必要である◎尚、
第１．第２の方法共予め重合した重合体を共存させてプ
ラグ・マ重合ないしプラズマ処理をおこし包括する事も
可能であるＯ以下に本発明の実施例を述べて詳しく説明
するＯ実施例１゜ ２０ｗＸ１００ｍのスライドグラス上にインベルターゼ
を４９Ｔｏ含有する水−グリセリン溶＊２０−滴下する
。これを同調回路付き、１３．５６ＭＨｉの発生器を備
えたプラズマ反応器（内部電極塵、電極直径１５０ｆｉ
、電極間隔６０ｍ）の一方の電極板上に水平に設置した
。
いるとプラズマ発生時間が数秒〜数分程度と極めて短か
い上、液相ないし固相単量体中に存在する酵素はこれら
の単量体に保護されて失希せず、しかも後重合も低温で
進行するので酵素を効率良く固定化する上で至便である
。この際、酵素、・単量体混合物をガラス板等上に塗布
し薄膜状にしておいてプラズマ開始重合を行なえば、フ
ィルム状固定化酵素が得られ酵素電極への応用が可能で
ある０プラズマ開始重合で得られる重合体は通学直鎖状
で溶媒可溶であるので、必ｇＩＫ応じ架橋剤を酵素、単
量体と共に共存して重合させ、生成した架橋網目構造の
重合体中Ｅｌｌ素を包Ｍ−ｊる工夫も必要である◎尚、
第１．第２の方法共予め重合した重合体を共存させてプ
ラグ・マ重合ないしプラズマ処理をおこし包括する事も
可能であるＯ以下に本発明の実施例を述べて詳しく説明
するＯ実施例１゜ ２０ｗＸ１００ｍのスライドグラス上にインベルターゼ
を４９Ｔｏ含有する水−グリセリン溶＊２０−滴下する
。これを同調回路付き、１３．５６ＭＨｉの発生器を備
えたプラズマ反応器（内部電極塵、電極直径１５０ｆｉ
、電極間隔６０ｍ）の一方の電極板上に水平に設置した
。
必要に応じ、電極を０℃〜−２０℃前後に冷却する事が
望ましい０反応器を０．１１１１１ＨｆＫ減圧した後４
、速やかに蒸留精製したメタクリル酸１−ヒドロキシエ
チル（ＨＥＭム）を必要によりては加熱しつつ流速５０
（ｌｄ／ＭＩＮで気体として２反応器中忙導入しプラズ
マ化させて１５分間ガラス板上Ｉｃ ＨＩＣＭム重合体
を堆積させる。得られた酵素を包括した重合体、、 ０
．２ ｆを１０９６シ■糖を含むｐＨ４，６の緩衝液ｌ
ロー中、２５℃で反応を行なわせ旋光度変化より加水分
解速度を求めた処、Ｆ５ｘ＋ｏ’Ｍ／ＭＩＮであった０ 実施例２゜ ２０ｓａＸ１００鶴のスライドグラス上に、実施ｆ１１
１と同様Ｋ １．０−のインベルターゼ溶液を滴下する
０次にＨＥＭＡの５０％水溶液２，０−をこのガラス板
上に滴下し、インベルターゼ溶液と混合する０このガラ
ス板ｔ＊施例１と同様の装置をもちい、０．１ｗＨｆの
減圧下で気体を導入せず、水及びＨＩＣＭム蒸気を利用
して、１−２０秒間プラズマを照射し、プラズマ開始重
合を行なった。プラズマ照射後減圧を保ったまま１２時
間放置し、ＨＥＭＡの後重合を逐行した。
望ましい０反応器を０．１１１１１ＨｆＫ減圧した後４
、速やかに蒸留精製したメタクリル酸１−ヒドロキシエ
チル（ＨＥＭム）を必要によりては加熱しつつ流速５０
（ｌｄ／ＭＩＮで気体として２反応器中忙導入しプラズ
マ化させて１５分間ガラス板上Ｉｃ ＨＩＣＭム重合体
を堆積させる。得られた酵素を包括した重合体、、 ０
．２ ｆを１０９６シ■糖を含むｐＨ４，６の緩衝液ｌ
ロー中、２５℃で反応を行なわせ旋光度変化より加水分
解速度を求めた処、Ｆ５ｘ＋ｏ’Ｍ／ＭＩＮであった０ 実施例２゜ ２０ｓａＸ１００鶴のスライドグラス上に、実施ｆ１１
１と同様Ｋ １．０−のインベルターゼ溶液を滴下する
０次にＨＥＭＡの５０％水溶液２，０−をこのガラス板
上に滴下し、インベルターゼ溶液と混合する０このガラ
ス板ｔ＊施例１と同様の装置をもちい、０．１ｗＨｆの
減圧下で気体を導入せず、水及びＨＩＣＭム蒸気を利用
して、１−２０秒間プラズマを照射し、プラズマ開始重
合を行なった。プラズマ照射後減圧を保ったまま１２時
間放置し、ＨＥＭＡの後重合を逐行した。
こうして得たフィルム状固定化酵素を水中でよく洗條し
て未反応単量体及びフリーのインベルターゼを除去した
後、真空乾燥し、その０，２ｆを用いて実施例１と同じ
条件でショ糖の加水分解を行なった処、今にに＋ｌｙｙ
Ｉ Ｎの速度でシ厘糖を加水分解した。又酵素の逸脱
は認められなかった・実施例３ 実施例２と同様の方法、装置を用い、１． Ｏｗｔのイ
ンベルターゼ溶液および、アクリル７ミド（ムＡＭ）Ｋ
対し、１重量％メチレ／ビスアクリル７ミドを含有する
ムムＭ２０重量％水蓉液３． Ｏ−を用いてプラズマ開
始重合を行ない、同様に後重合及び重合体処理を行なっ
て実施例２と同様にシ肩糖の加水分解を行なった処１１
．２にＩＴｈ ／Ｍ Ｉ Ｎの速度で反応した。数回に
わたるくり返し使用によってもとのよ５に調製した固定
化酵素の活性は低下する事はなかった。
て未反応単量体及びフリーのインベルターゼを除去した
後、真空乾燥し、その０，２ｆを用いて実施例１と同じ
条件でショ糖の加水分解を行なった処、今にに＋ｌｙｙ
Ｉ Ｎの速度でシ厘糖を加水分解した。又酵素の逸脱
は認められなかった・実施例３ 実施例２と同様の方法、装置を用い、１． Ｏｗｔのイ
ンベルターゼ溶液および、アクリル７ミド（ムＡＭ）Ｋ
対し、１重量％メチレ／ビスアクリル７ミドを含有する
ムムＭ２０重量％水蓉液３． Ｏ−を用いてプラズマ開
始重合を行ない、同様に後重合及び重合体処理を行なっ
て実施例２と同様にシ肩糖の加水分解を行なった処１１
．２にＩＴｈ ／Ｍ Ｉ Ｎの速度で反応した。数回に
わたるくり返し使用によってもとのよ５に調製した固定
化酵素の活性は低下する事はなかった。
実施例４
直径１０■長さ１５０簡のアンプル中Ｋｌ！ＩＫ示すよ
うな種々の濃度のＨＩＭＡ水溶液２ｍｇ及び実施例１で
用いたのと同様のインベルターゼ溶液を各ｌ−加え、数
回凍結、脱気後封管した。これを同調回路付きプラズマ
発生器に連結した高さ１５０絽、巾ｌＯ■のｌ対の鋼製
電極板（電極板間隔１５ｇ）の間に冷却しつつ挿入し、
６０秒間プラズマをアンプル中に発生させた。プラズマ
照射したアンプルを２５℃にて２０時間後重合させ、得
られた酵素包括重合体を実施例３と同様に充分洗條した
後、その０．３Ｆを用いて実開１と同じ条件で加水分解
を行った処、表１の結果を得た。
うな種々の濃度のＨＩＭＡ水溶液２ｍｇ及び実施例１で
用いたのと同様のインベルターゼ溶液を各ｌ−加え、数
回凍結、脱気後封管した。これを同調回路付きプラズマ
発生器に連結した高さ１５０絽、巾ｌＯ■のｌ対の鋼製
電極板（電極板間隔１５ｇ）の間に冷却しつつ挿入し、
６０秒間プラズマをアンプル中に発生させた。プラズマ
照射したアンプルを２５℃にて２０時間後重合させ、得
られた酵素包括重合体を実施例３と同様に充分洗條した
後、その０．３Ｆを用いて実開１と同じ条件で加水分解
を行った処、表１の結果を得た。
このようにして得られる固定化酵素は白色で錠剤の形態
として用いる事ができた。
として用いる事ができた。
表 １
また、くり返し使用によりて酵素の逸脱は極めてわずか
であった。
であった。
実施例５
実施例４と同様のアンプル中に表２に示すような種々の
割合で含むメタクリル酸（ＭＡＡ）アクリルアミド（ム
ムＭ）の２０重量％水溶液２ｍ。
割合で含むメタクリル酸（ＭＡＡ）アクリルアミド（ム
ムＭ）の２０重量％水溶液２ｍ。
グルコースオキシダーゼ２５重量％水溶液１ｍｇ。
更に全帯量体重量に対し、ｏ、１％のメチレンビスアク
リルアミドを加え、均−ＫｆＩ！！解した後、実施９１
１４と同様に封管後プラズマ開始重合を行なったＯ得ら
れた透明ゲル状固定化酵素を実施例４と同様に洗條後、
その０．５２を用い、１０チグルコース水溶淑の酸化反
応を館外分光法をもち（１て追跡したところ表２の結果
を得たＯ 表 ２ プラズマ照射６０秒、後重合、２５℃２０時間実施例６ 巾２０闘、長さ４０ｍ、厚さ２０μの架橋ポリメタクリ
ル酸フィルム２枚の関に、実施例２と同様に１．０−の
インベルターゼ溶液をはさみ、更にこれにＨＥＭＡの１
５０％水溶液１．０−を滴下したＯこれを実施例２と同
様にプラズマ反応器中で６０秒間プラズマ照射、１０時
間後重合した後、同様の手１−で洗條して、２枚のフィ
ルムによって固定化した酵素を得た。これを ４．ｏｆ
用い、実施例２と同じ条件でショ糖の加水分解を行なっ
た処、０．２Ｍ／ＭＩＮで反応をした。
リルアミドを加え、均−ＫｆＩ！！解した後、実施９１
１４と同様に封管後プラズマ開始重合を行なったＯ得ら
れた透明ゲル状固定化酵素を実施例４と同様に洗條後、
その０．５２を用い、１０チグルコース水溶淑の酸化反
応を館外分光法をもち（１て追跡したところ表２の結果
を得たＯ 表 ２ プラズマ照射６０秒、後重合、２５℃２０時間実施例６ 巾２０闘、長さ４０ｍ、厚さ２０μの架橋ポリメタクリ
ル酸フィルム２枚の関に、実施例２と同様に１．０−の
インベルターゼ溶液をはさみ、更にこれにＨＥＭＡの１
５０％水溶液１．０−を滴下したＯこれを実施例２と同
様にプラズマ反応器中で６０秒間プラズマ照射、１０時
間後重合した後、同様の手１−で洗條して、２枚のフィ
ルムによって固定化した酵素を得た。これを ４．ｏｆ
用い、実施例２と同じ条件でショ糖の加水分解を行なっ
た処、０．２Ｍ／ＭＩＮで反応をした。
実施例７
実施例３で調整した固定化酵１１５Ｆを直径約２露の大
きさＩＣ粉砕し、これを直径ｌＯ■のカラムにつめ、ｐ
Ｈ４，６の緩衝滴液で充分洗浄膨潤させたＯ次に、シ■
糖２％含有するｐＨ４，６，０緩衝溶液１０〇−を１ｓ
ｇＡＩＮの流速でカラム上部から流下させた〇カラムを
透過した溶液を旋光度法によって分析した処、７２着の
７５１が加水分解している事がわがりた。
きさＩＣ粉砕し、これを直径ｌＯ■のカラムにつめ、ｐ
Ｈ４，６の緩衝滴液で充分洗浄膨潤させたＯ次に、シ■
糖２％含有するｐＨ４，６，０緩衝溶液１０〇−を１ｓ
ｇＡＩＮの流速でカラム上部から流下させた〇カラムを
透過した溶液を旋光度法によって分析した処、７２着の
７５１が加水分解している事がわがりた。
特許出願人 長 １）義 仁
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 α） −素とプラズマ重合しうる単量体が共存している
状態でこれら２者をプラズマと接触せしめ、よりて酵素
の固定化をはかる事を特徴とする固定化酵素の製造方法
。 （２）酵素およびこれを包括する単量体が液状又は固体
状１１にあってプラズマと接触せしめて重合をおこし、
よりて酵素の固定化を行なう事を特徴とする特許請求範
囲第１項記載の製造方法。 （３）酵素およびこれを包括する単量体をプラズマと接
触させた後、適当な温度で放置して後重合させる事を特
徴とする特許請求範囲第２項記載の製造方法。 ＋４７ プラズマを減圧下、１０〜５００ワツトの印
加電力で液状ないし固体状の酵素と気体ないし液体また
は固体状のプラズマ重合し５る化合物、更に予め重合し
た重合体存在下にプラズマを発生せしめて酵素の固定化
をはかる事を特徴とする特許請求範囲第１項、第２項、
第３項記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10006581A JPS585192A (ja) | 1981-06-28 | 1981-06-28 | プラズマ重合をもちいた固定化酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10006581A JPS585192A (ja) | 1981-06-28 | 1981-06-28 | プラズマ重合をもちいた固定化酵素の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS585192A true JPS585192A (ja) | 1983-01-12 |
Family
ID=14264059
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10006581A Pending JPS585192A (ja) | 1981-06-28 | 1981-06-28 | プラズマ重合をもちいた固定化酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS585192A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS606193A (ja) * | 1983-06-24 | 1985-01-12 | Nok Corp | 固定化微生物膜の製造法 |
| JPH0391481A (ja) * | 1989-08-18 | 1991-04-17 | Natl Sci Council | プラズマ表面処理法による固定化グルコース酸化酵素膜の製造法 |
-
1981
- 1981-06-28 JP JP10006581A patent/JPS585192A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS606193A (ja) * | 1983-06-24 | 1985-01-12 | Nok Corp | 固定化微生物膜の製造法 |
| JPH0391481A (ja) * | 1989-08-18 | 1991-04-17 | Natl Sci Council | プラズマ表面処理法による固定化グルコース酸化酵素膜の製造法 |
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