JPS58501818A - ネオサイト濃縮血液を製造する方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ネオサイト濃縮血液を製造する 方法および装置 本発明はネオサイ）　（ｎｅｏｃｙｔｅ　）　ａ縮血液を製造する方法に関する 。より詳しくは、本発明は血液ノエロサイ）　（ｇｅｒｏｃｙｔｅ　）　からネ オサイ！・濃縮血液を隔離する方法およびそれを達成する装置に関する。

発明の背景 ドナー（ｄｏｎｅｒ　）血液中の赤血球すなわちエリＡロサイ）　（ｅｒｙｔｈ ｒｏｃｙｔｅ　）は一定寿命を有する。事実ヒトの血液は約０〜１２０日の間の 令の赤血球をおよそ等割合で各有している。従って、どの所与試料中にも一定割 合の若令血液細胞すなわちいわゆるネオサイトおよび一定割合のノエロサイトと いわれる老令細胞が存在する。またヒト血液は１０Ｂ”Ｎ／ｄ４−赤血球程度の 比較的多量の鉄を含有する。さらに、その鉄含量は血液試料の平均細胞会に関係 なく比較的均一である。滑性貧血を患った、例えば生存のために反復１ＩＩＬ液 輸庄１で依存する患者も存在する。事史それら患者の系恍はドナー血液の鉄分を 完全に処理できないような迷さでドナー血液を受けその結果似者が鉄過負荷を壱 うがもしれず、またその原因から生ずる合ｍ　Ｍで死ぬかもしれない。

鉄過負荷に対する寄与は数時間生存する最老令伸主赤皿球と同ケ月も体内を循環 する最苔令のものとが同じであるので、このような患者に対する血液噛まば、老 令赤能才がドナー・Ｉｌ液から十り・庇、若令細泡、つみが前者に投与され！１ ５；寸実理学上の利匍と鉄過負荷との比率に関してより一層の効果があることが 明らかになっている。

ドナー血液中の赤血球が一定浴度分布を有することも牛た認められている。実際 １でそれ（ｄ老令赤血球はど若令のものより密・Ｗが大きいことになる。、仁の 知熾を用いて老仔細胞またｒ丁ノエ「１す・イトから若告示血球−土たは洋才１ ｒイトを限離するため（くそ７′Ｉ２らの密度によってドヲーーー試料甲の青； 血球を５）離する試みがなされてきた。例えば次の１−１ｊ行物（その写しが添 付されている）に記載された若干のそのような試み（ｄ−ドナー血液の遠し分離 を含んでいｚ）： マルフイ−（Ｍｕｒｐｈｙ、　Ｊｏｈｎ　Ｒ，）、「赤血球の分離に及ぼ１゛Ｉ Ｉ幸心の温度および方法の影響（Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕ ｒｅ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔ ｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ　）　Ｊ　、　Ｊ 、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｍｅｄ、、　Ａｕｇｕｓｔ　、　１９７３．　Ｉ）ｐ、３４−３４Ｇロラン／ユ （Ｃｏｒａｓｈ、　Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｍ、ら、［乍純ｆヒした密度勾配上の令 （でよる赤血球の分Ｊｌｌ　（５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｒｙｔｈｒｏｃ ｙｔｅｓａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ａｇｅ　ｏｎ　ａ　ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ 　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）　Ｊ　、　Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、 　Ｍｅｄ、、　Ｊｕｌｙ、　１９７４．　ｐＩ）−１４７−１５１＝ピオメリ（ Ｐｉｏｍｅｌｌｉ、　Ｓｅｒｇｉｏ　）ら、「生体内の改良」・仔による若舎亦 皿球の分離：漫性論庄（口療ｔこ対するアプローチ（５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｙｏｕｎｇｅｒ　ｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈｉｍｐｒｏｖｅｄ　５ｕｒ ｖｉｖａｌ　ｉｎ　ｖｉｖｏ：　Ａｎ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｃｈｒｏｍｉ ｃｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　ｔｈｅｒａｐ−ｙ　）ｉ　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 ＡＣａｄ、Ｓｃｉ、。

ＬＩＳＡ　７５　（１９７８）、ｐｐ、３４７４−５４７７　；およびベトーレ （Ｖｅｔｔｏｒｅ、　ＬｕＣ１ａｎＯ）ら「ヒ：の５　ｆｆｌｌＪ分離用の新糸 度勾配システム（Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｅｎｓ　：　ｔｙＧｒ　ａｄ　：　ｅｎ　ｉ　 Ｓｙ　Ｓ　ｊｅｌＴｌｆｏｒ　ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａ ｎ　Ｒｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ　）Ｊ　。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、　ａ：　２ ９１＋　第８巻（１９８口　）　、ｐｐ、２９１−２９７　。

血液４７分の所変により↑血を公葬する通常の方法′は、血液試料を容器に入れ 、容器を容器の・軸１・て垂直な軸の周りに高速、変で回転させて容器内ａ物に ２０００Ｇ程度の遠心力をかけることである。収Ｇ　Ｊれる血液試料に加えた力 ・１げ赤血球のような厳重、最密の１１１液留分を底斗たは回転軸から遠位の容 器の１底部すなわち閉端部に集積させ、一方血漿のような低密留分を回転軸に連 続的（（より近い咎］テ中○帯脹に巣漬させる。遠已・分離により血液留分つ指 度分離を行なう典型的な装置は上記のマルフィーの論文並びに次の米国特許： ３　、０６４．　、６４７　アール（Ｅａｒｌ　）、３．９３５，１１３　エイ レス（Ａｙｒｅｓ　）、３．７５０，６４５　べ不ント（Ｂｅｎｎｅｔ　）ら、 ３．９４５，９２８　エイレス　（Ａｙｒｅｓ　）、３．８００，９４７　スミ ス（Ｓｍ１ｔｈ　）、４．１８７，８６１　ヘファーナン（Ｈｅｆｆｅｒｎａｎ ）、ろ、８８７．４６４　エイレス（Ａｙｒｅｓ　）、４．１８９，３８５　グ リンスパン（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ　）（・７斥１・ｉ＜さハでいる、 こｈらの先行文１♀（、例、゛−５−二イレス（Ａｙｒｅｓ　）の′特許（／・ ７ｉ４ｉ′、巽されるように、Ｉ÷１−・機：′こかける容器は逆止め弁にｊ　 ４）で分離された下部およ、″、ト下ｐｉ］′３の室を形成する。全面はＩ一部 室内に置かｉｑ、１！ト＾ＩＣＩ・寸高速度捷で加モされる。高いＧ力のもとて ′ｉ４′ｉ１．）（１，Ｌ　イイ＋Ｍ分は」一部室）底ＶＣ［ＩＪｌ　イ美ＩＬ 　’ｈ弁を西って下部′・：休り中へ流れてｊ少く傾向がある。そのような装ｊ ５（は全１１）１を犬」かな留分：すなわち約１．０１ｆ、’ｃｃの密度をηす る血漿を１．０７ｆ／ｃｃの平均密度を有するｌＩｌ［Ｌ液、Ｘ′４旧他から■ 効：て分離する。こればその密度差が遠心機り迷′Ｗにネ・いて全く有意である からである。甘たマルフ・イー　らによハは摺度勾配によって赤血球そのものの 多少の分離も寸だ明らかに存在する。

マルフィ−らが令（・り二よる刊胞の多少の分離が起ることを試験し、立証する ために全く複雑で時間っかがる混合、吸引手法を用いて遠心機にかけた血液の試 料を容器中のｙ〜なる帯域で抜き出したけれども、今日斗で若令細胞を貧窮′、 ｕ者に対する直接輸、・主に利用できるように鳳菌環境中で老咎のものから若怜 赤皿球を作品に隔離−または分割するｂ゛効な方法（佳存在していない。

発明の概要 従って本発明、けネオザイト贋縮罹液を得る改良１去の提１１１ミを１」的とす る。

不発明の他の目的はそれらの舎によって赤血球すなわちエリスロザイトを隔離す る方、去を提供することである。

不発・５月σつ他の目的−：ｒ　：＋；ｔ　：＋友司；１トシ一つ；ｒ訪たニテ 、＋１′隻連続体中の選し？屯においてドナー１１１Ｌ液中の示ｌ［１１球を７ ｆ割する方法を提供することである。

さらに本発明の目的ｊは下校的未熟者により速やかにかつ確実に実施できる老令 および所しい血へ舟胞を分離する方法を提供することである。

不発明のなぁ・他の目的はト紀目的を行なう装ニア７をａ供することである。

本発明の他の目的は血液・ａ＋　’Ｉ’ｒ：２の合または密度連続体における選 定点でドナー血液中の赤血球を隔離斗たは分ｓ１」する装置を提供することであ る。

本発明の他の目的は完全に泄菌の環境中でネオサイト濃縮血液を調製する装置を 提供することである。

さらに本発明の目的はこれらの血液成分をともに他４・で関係なく使用できるよ うにＸ菌条注において血液ネオサイトおよび血液ノエロサイトを隔離捷たは分配 および分割する方法および装置を提供することである。

他の目的は一部（−ｉ明らかであり甘た一部は以下に明らかになろう。

従って、本発明は、数段１４および／またはより多くの段ｌ昔の曲のぞハぞれに 関する関［系、並びに構造の特徴を具体化する装置、要素の組合せおよびすべて 以下の詳細な説明に例示されるような段階を行なうのに適応させた部オの配々１ １を含み、本発明の’ｆｉｊｆＪＡは請求の節回（／ζ示きれこの方法によれ： ばドナー全血は弁付導管によって直列に連結された第１室および第２室ケ含む密 閉容器系の一室に導入される。弁は当初ｉｌｕ液が１室内に留捷るように閉じら れている。次に容器系は、１室の導管端部を回転軸から遠位にしかつ弁を閉じた 捷ま、それにより遠心機にかけている間２室間の流体の流れを防止して高速度、 例えば２．０ＯＯＧで遠心機シてかけられる。この高速度遠心分離段Ｉ昔は１室 中の全血を密度連伏体沿いに分布した血液留分に分離し、最も密度の小さい留分 が回転軸に最も近く集まり、最密留分が回転軸に遠位の導管近傍に集積するまで 続けられる。

これに続いて遠心機サイクルの終り近くで、容器系が比較的低い速度、例えば２ ００Ｇに減速した後にだけ弁が開かれる。これにより２室の間の連絡が樹立され 、回転軸に遠位の老令高密細胞細胞が導管を通って他室内へ流れる。その流れは 遠心分離中に樹立された密度連続体の選んだ想定分割線より下の第１室から細胞 のすべてが第２室へ入る甘で続けられる。換言すれば、遠心分離により１室中に 形成された血液留分の落度連続体が連続体中の選んだ水準または部分で分割され 、選んだ密度を超える水準の下に位置する赤血球のみが他室へ流れ、低密細＠１ ｌ−１：１室中に残留する。次いで流れを止める。

第２室へ入る血液細胞の量は他室中への流体の流れを制卸することにより制御す ることができる。従って、他室の容量を適当に選ぶことにより制御することがで きる。

明らかに、その室の容量が・トさく作られているＶ・１ど少量の細胞が１室から その室へ流れることができ、すなわち、１室内に形成された血液留分の密度連続 体中の分割線を低下をせ、１だその逆も同様である。従って他室容量を適切に選 ぶことにより分離、分割段階後に１室中に残留する赤血球の平均密度を制御する ことができる。

上記のように赤血球の亨度と令との間に直接の関係があるので、１室中に残留す るＴｔ１１唯の平均令もまた制菌することができる。例えば、他室が１室中に頭 切に存在する赤血球の２分の１を受取るように他室の容量を選ぶことができる。

前記ピオメリの論文（図ゴロ）によれば、１室中に残留する５０％赤皿球（ラビ ット血液）は５６日のその有限寿命の・・丘とんどの間循環中に生存するが、一 方他室中に分割された老令高密細胞は循環中へ再生人後１１とんど直ちにその老 化減損を開始するのでこれらの細胞の２分の１が４０日後に生存しているにすぎ ない。従って、より若令のヒト赤血球を輸注された思考は輸注の必要がより少く 、従って所与期間の間の循環系に−よる鉄の蓄漬がより少いことが明らかである 。

前記のように分別された薄液を分離、分割した後、２つの室は２室を連結する導 管を適当に／−ルし、切断することにより隔離される。従って容器系は２つの独 立の無菌室に分離され、その一つは圧液ノエロサイトをき有し、他方は選んた平 均会の即成ネオサイトを血漿とともに含有する。前者の室の内容物は実験、＠液 試験、急性血液喪失用論法などに使用でき、後者の室の内容物は負性貧血を患う 患者または若令血液Ｍ胞を必要とする患者にドナー血液として使用できる。

好ましくは上記の方法は、その他室がしぼむことができかつ当初無菌食塩洗浄溶 液で満た°された容器系中で行なわれる。高速度遠心分離段階の間【この室はし ぼみ、食塩溶液を導管を通して全面を含有する１室中へ適寸せる。洗浄溶液は集 塊となった血液細胞の分離を助け、またその室を乱すことによりその溶液を後で 加える必要が避けられる。この方法が洗浄溶液の存在のもとで行なわれるときは 洗浄溶液が頭初全血を溝入される室に尚早に入るのを防ぐため２室の間の導管中 に静止用シールを設けることが好ましい。

本発明者の装置の好ましい具体化例）まやがて詳細に記載される。この時点では 本発明者の方法および装置が赤血球を分離させ、無菌環境中にある間に高容量ベ ースで密度または全連続体沿いの実質上任意の点で分割することを可能にすると だけ述べておく。さらにその装置は製造が比較的容易かつ安価であり、また比較 的未熟者による使用が容易である。

図面の簡単な説明 本発明の性質および目的のより完全な理解のために添付図面に関連させた以下の 詳細な説明を参照すべきであり、図面中： 第１図は本発明者の方法に従ってネオサイト濃縮血液を製造する装置を示す部分 断面正面図であり、その装置は折りたたまれ、用具一式（Ｋｔｔ　）として包装 されている、 第２図は第１図の線２−２沿Ｖ、に画いた部分切取断面図であり、 第６図は使用準備のできた第１図の装置を示す部分断面正面図であり、 第４図は第３図の線４−４沿いに画いた断面図であり、第５図は第１図の装置の 操作を示す断面図であシ、第６図は装置をよシ詳細に示し、さらにその操作を示 す部分断面部分正面図であり、 第７図は第５図の装置における赤血球の分布を示すグラフ線図であり、 第８図は装置の他の具体化例を示す第６図と同様の図である。

好ましい具体イヒ例の説明 図面の第１〜３図を参照すると、装置は一般に１０で示される。使用されるまで は装置１０は折りただまれ、第１図にＰの点綴で示す密封プラスチック嚢内に無 菌、セプテイック（５ｅｐｔｉｃ　）　条件に維持されている。装置１０は基本 的には比較的大きい室を形成する第１容器１２と小室を形成する第２容器１４を 含む容器系である。

その２室の形成に種々の型の容器を使用できるけれども、装置の示した具体化例 では２容器はヒトの系統と相容性で加圧滅菌温度に耐えることができる任意の適 当なプラスチノク材料、例えばｐｖｃ共軍合体、で作った可撓性の袋または嚢で ある。袋１２は血液輸注および血液成分の分離に用いる米国特許Ａ３，０６４， ６４７号に示されるような標準血液袋とその形状および大きさが類似する１、こ れでは袋は入口管１６および袋１′２の上端の継目１、２　ａ中に組込んだ取出 可能に密封した利用Ｄ１８が取付けられている。３袋１２の下媒壁１２ｂは連結 装＠１５の頂部に７−ルされる。

袋１２は空のときには大体平らであ）、Ｖ］１に示すように折りたたむことがで きる。しかし、その袋は液体を満たしてふくらませると、第３図に示すように、 少くともその下方部分が円筒状の一般形状となる。第２図はその円形断面を有す る袋を示す。

一方可撓性の袋１４は扁平法の一般形状および袋の上面１４ａを有し、連結装置 １５の下側に７−ルされることができる。

第１および２図を参照すると、連結装置１５は上部部材１５ａおよび下部部町１ ｓ　ｂを含み、それらは互いに３ム可＝＋、ｌ　：こ連Ｆ、′、さｉ’ｔ、−Ｃ いる。部材１５ａは加圧滅菌温度に耐えることができる適当なエラストマー、例 えば天然ゴム、で成形また（１化の方法で形成された円板２２を含んでいる１、 その円板は比較的厚みのある、まだは高いリム２４を有し、リム内にリムを垂直 方向に十分に硬くまた割くする金属環帯２５が含まれている１９円筒状の従属＋ ｌ−ス２（６が円板の中心部に形成されている。そのボスもまた比較的厚みがあ るかまたは高さがあり、それもまた硬く剛い。しかし、上部の円板表面２２　’ ａは皿状にえぐられている。さらに、円板の下側）まリム２４とゴス２６の間の 環状域がえぐられ、または凹部が設けられている。

円板のこの形状はリムとボ゛スの間ｙｃ広がる比較的薄い環状薄板２８を残し、 それは垂直方向に完全に可撓性で弾性である。

中心に位置する円筒状の凹所２９は円板上部表面２２ａから下方へボス２６中へ 伸びている。円筒状のプラグ３２は凹所２９中に支えられ、そのプラグは円板上 部表面２２ａと係合する周縁フランツ３２ａを有する。袋１２の下部端壁１２ｂ はそのフランツの上部表面にシールされる。

プラグ３２は垂直穴３４が形成され、穴はその上部表面部からプラグの途中まで 伸び、袋壁１２ｂ中の開口（示されていない）と整合する。さらに穴の口は薄い 平円板状フィルター３６を配置するために３４ａで広げられている３、整合する 側部通路３８と４２はプラグ３２とボス２６にそれぞれ形成されている。一定長 さの管材４４の拡大端部４４ａは通路４２中ヘノールされて袋１２の内部との流 体連絡を樹立する。その部分の内端は通常貫通可能なシール４５により閉じられ ている。しか・し１、そのシールは青部分４４ａ中に位置する硬質先端のカニユ ーレ４６により穴をあけることができる。管材４．４．は連結装置の部材１’５ ａと１５ｂとの間の空間に収容される。たた１環の管材がメ面に示されているけ 九ども、より長い管材を両連結装置部、材間の空間中にホ゛ス２６の周・りに巻 き付けることができる。とにかく、管材の下端４１ｂは連結装置部材１，５ｂを 通過１シ１、やがて記載され、るように袋１４に連結されている。

次に第５．４および６図を参照すると、連結装置部・材１５ｂは硬質プラスチッ ク円板５２を含んでいる。袋１４の上部表面は円板５２の下側に対し密封される 。また管端４４ｂは円板５２中に形成された中心開口５４および袋１４の頂壁１ ４ａに挿入されている。管の下部端または縁４４ｃは袋壁１４ａの内部表面に設 けた環状弁部材５６に７−ルされる。従って管４４は袋１２と１４の間の直通流 体−４ｆｔを与える。

円板開口５４はボス２６の、継部２６ａを楽に受ける大きさであり、円板は第３ 図に示すようにボス上に移動可能に係合することができる。ボスの部分２６ａと 円板５２ばまた図に示すように円板５２がボス２６上に係合するとき管４４を収 容する整合溝孔５８および６２が設けられている。

次に第１図および第２図を参照すると、初めに説明したように装置１０は通常密 封プラスチック袋Ｐ内に無菌条件で保持されている。この条件で上部の袋１２は 示したように折りたたまれ、全面の収集に用いるように抗凝固剤をＪ有する。一 方下部袋１４は食塩洗浄液Ｗが満たされている。上記のように通常袋１２と１４ の内部を隔離する管４４の入口に配置した静止用／−ル４５が存在する。このノ ールは装置１０が・棚上に貯蔵されているとき袋１４中の洗浄溶液Ｗが袋１２中 へ流れるのを防止する。シール４５はまた、装置１０がやがて説明するように使 用準備されたときに袋１２中に収容された全血が袋１４中へ尚早に流れるのを防 止する。

使用の際に装置は袋Ｐから取出され、第３図に示すように袋１２が広げられ適当 な支持体からつるされ、一方ドナー全血Ｂが入口管１６を通して袋１２中へ導入 される。袋中へ導入された血液Ｂと既に存在する抗凝固剤とを合せた容積は袋１ ４中の洗浄溶液Ｗの容積を差引いた袋の有効容積量を超えるべきではない。先に 記載したように、静止用／〜ル４５のために血液は袋１２中に留寸り、袋１４中 へ流れることができない。準備ができたとき操作員がカニユーレ４６を７−ルに 押込むことによりシール４５に穴をあける。管部分４４ａはこれが可能なほど十 分に可撓性である。装置１０は次いで第６図においてＣに点線で示す円筒状遠心 機容器中に置かれる。容器Ｃの底部に剛四の取出可能なカップＣ′が楽に位置し ている。装置１０を容器Ｃ内に適当に収容すると連ｉ　１Ｊング２４の平ら々下 面２４ａが容器Ｃ′の端線上に着座する。従って容器Ｃ′は下部室１４の有効容 積を樹立する。換言すればカップの内径を同定できるけれども、後に明らかにな る理由で袋１４の有効容量を変えるためにカップの高さを変えることができる。

大抵の遠心機のように、遠心機の容器Ｃは枢動上に装備され、当初垂直に方向を 向けられる。従って遠心機が運転中にあるとき容器Ｃは第５図に示す軸Ａの周シ に高速度で回転され５００Ｇを超える遠心力を生じ、その結果容器は同図に示す ように横方向に振り出される・容器Ｃおよびその内容物がこのように回転すると 遠心力が袋１２の内容物Ｂを回転軸Ａから遠くへ押し出す・連結リム２４の位置 がカップＣ′により固定されるので、連結装置部材１５ａの薄板部２８が撓み、 それによってボス２６および円板５２が第５図に示すように回転軸から離れて容 器Ｃの閉端の方へ移動する。従って円板５２が袋１４を圧搾し袋１４中の溶液Ｗ がいま開いている管４４を通って袋１２中へ注入されそこでその中の全血Ｂと混 合する。

袋１４中の洗浄溶液がすべて袋の外へ絞り出され袋が第５図に示すように完全に しぼんだ後、弁部材５６が袋１４の壁に接触して着座して管４４の下端に運動用 シールを形成する。このシールは袋１２と、１４の内部を隔離し、高速度遠心分 離段階の間装１２中の血液（または洗浄溶液）が袋１４の中へ流れるのを防止す る。

回転サイクルが続くと袋１２中の全血Ｂおよび袋１４からその袋の中へ導入され た洗浄溶液はそれらの密度に従って分離する。すなわち、洗浄溶液Ｗと血漿とか らなる密度の最も小さい成分は袋１２の最上部近傍の回転軸ＡＫ最も近い袋の帯 域中へ集積する傾向があり、その−力先血球のような最密血液留分は袋１２の底 部：て回転軸から最も遠く離れて集積する傾向がある。中間密度の留分はこれら 両極端の中間の袋の帯域に集積する。従って血液留分は分離して袋１２中に密度 連続体を形成する。

絶対的に必要ではないけれども洗浄溶液は集塊となった血液Ｍ胞の解体に役立ち 、従って細胞の密度連続体の形成を高めるので遠心分離の間に袋１２の中へ導入 される。

その溶液はまだこの手法によって分離された赤血球の貯蔵期間を伸ばすだめに加 える栄養剤を有することができる。

上記のように赤血球の密度とそれらの令との間に直接関係が存在する。この方法 によって処理するときは、従って分離された赤血球はまた袋１２中に令連続体を 形成する。すなわち、老令血液細胞すなわちノエロサイトＢｇは第５図に示すよ うに袋１２の底部に集積し、その一方若令血液細胞すなわちネオサイトＢｎ　は 回転軸Ａにより近い帯域中に位置される。血漿Ｂｐ　のような最も軽い血液留分 および洗浄溶液Ｗはすべて第５図に示すように回転軸に最も近い帯域中に配置さ れる。袋１２中の赤血球の典型的な令分布は第７図に図式的に示される。

高速度遠心分離サイクルは全血Ｂが分離して上記密度連続体を形成するまで続け られる。これが生ずるのに要する時間の長さは回転速度に依存する。事実、遠心 機の速度と回転時間の積は大体一定である。本発明者は適当な密度分離まだは分 布が遠心機を約２０００Ｇの速度で約１５分間運転するときに起ることを見出し たつその時間の後、遠心機の速度を下げて遠心力を５００Ｇ未満、好ましくは約 ２００　Ｇ、に減少させる。この低い速度で隔壁２８は第３図に示した正常な不 撓位置を回復する傾向があり、それによシ弁部材５６および開管４４が席を離れ る。しかし隔壁の復旧は袋１２中に樹立された密度連続体の最小の攪乱がある程 度である。袋１２の底部に最も近い血液留分、すなわち血液ソエロサイ）Ｂｇは その低回転速度で発生する比較的小さい遠心力の影響の下で管４４を通って袋１ ４中へい寸や自由に流れる。

管４４の口のフィルター３６は２００ミクロン程度の孔径を有するので直径７ミ クロン程度にすぎない赤血球を容易に通す。しかしそのフィルターは袋１４中へ の血液細胞の流れを滑らかにする傾向がある。また、もちろん、フィルターは管 ４４を妨害する傾向があるかもしれない袋１２を去る流体中に同伴する微粒子状 物質を遮断する。

遠心機を比較的低速度で速度を下げ続けると次第に密度の小さい血ｉ留分が袋１ ？の底部から袋１４中へ流れる。その流れは滑らかで、流量は袋１２中の分配さ れた血液成分の攪乱が最少である程度である。もちろん、袋１４中への流れはそ の袋が完全に満たされたときに止む。

従ってその袋の有効容量が袋１４へ入る高密高台赤血球と処理完了後に袋１２中 に残留する密度の小さい若者血液細胞との間の切断または分割線しく第５図）を 樹立する。袋１４中への流体流路は遠心機を止める前に袋１４中への細胞の移動 が終るように設計される。

従って、袋１４の有効容量を変えることにより袋１４中へ流れる老令血液細胞Ｂ ｇ　と分割段階後に袋１２中に残留する若令細胞Ｂｎ　とを区分する分割線りを 移動することができる。従ってこの方法によって袋１２中に残留する赤血球の平 均密度、従って平均台を実際に制御することができる。換言すれば、袋１４の容 量が増すと遠心分離段階後により多くの流体が袋、１２から袋１４へ移される。

従って効果的に袋１４へ移される血液留分を袋１２中に残留する留分から区分す る第５図に示す分割線りが袋に沿って上方へ、例えば第５ダに点線Ｌ１　、とじ て示す線へ実質上移動する。従って、その袋の容量が増すと袋１２中に残留する 赤血球の平均密度および令が小さくなる。逆に袋１４の有効容量が減少すると効 果的に分割線りは袋１２の下端の方へ下に、例えば点線Ｌ２　へ移動し、その結 果分割後袋１２中に残留する赤血球はよシ大きい平均密度および令を有する。

従って、袋１４の容量を適切に選ぶことにより、例えば当初袋１２中に含まれた 赤血球の２分の１が袋１４に入るように分割線りを位置させることができる。こ の場合、第７図かられかるように、９０日の期待平均寿命を有するネオサイトの 約８４係が妾１２中に残留し、一方６０日の平均寿命を有するノエロサイトの僅 か１６％が残留する。従って、袋１２中に残留する細胞の平均寿命は８０日（０ ，８４Ｘ９０＋０．１６Ｘ３０）である。

これは約６０［］である未分別か血球の平均寿命と対比される。、一方、袋１４ の有効容量を赤血球の底部４分の３が袋１４に入るように選ぶならば、袋１２中 にネオサイトの約６０％が残留し、ノエロザイトの約８係が存在するにすぎない 。これらのネオサイトが全く最若令の細胞を含むのでそれらの平均寿命は約９８ 日である。従って、このより濃縮された、しかしより少量の血液は約９ｏ日（（ ０，６０Ｘ９８＋　０　、０８Ｘ３０）　÷　０．６８）　の平均寿命を有する 。

袋１４の有効容量を減少することを望むならば、装置１０を、より低い容積限定 カップＣ′を装備した容器Ｃ中に置くことができる。当初、連結リム２４はカッ プσの縁に坐らないかもしれない。しかし、高速度遠心分離１階が開始されると すぐにリムは、袋１４がしぼみ洗浄溶液Ｗが上記のように袋１２へ送り込まれる とともにその縁に向って押出される。高速度の遠心機サイクルの終りに、隔壁２ ８が第６図に示した正常な応力を加えない状態に同腹すると袋１４内に入る流体 の量が、袋の実際の容量より小さいカップＣ′の有効内容積によって決定される 。換言すれば、カップＣ′のより低い高さのだめに袋１４は一部しぼんだま捷で 、袋に入ることができる流体の量は実際の袋容量より小さい。従ってカップの高 さを変えることにより袋１４に入る血液細胞の平均台、従って袋１２中に残留す る。細胞の平均台をそのときの特定要件に適するように調整することができる。

不凭明者の手法によれば、全ＪＵＬが高速度遠心分離の間に密２または全連続体 に従って分離されることに留意することが重要である。しか１７、そのように分 離された血液留分が高速度遠心分離段階の完了後にのみ分割前しに沿って分割さ れる。換言すれば、分割は、袋１２由に樹立された密度連続体を乱すことなく血 液留分を袋１４中へ移すのを容易にするのに丁１変十分な５０口Ｇ以下の低いＧ 力の存在下に生ずる。すなわち、弁部材５６が開管４４に坐っていないときに適 切な背圧がダ荘し、袋１４中への流体の流れが袋１２中に樹立された沿度勾配を こわすほど速くないように分割中の低い回転速度が選ばれる。−刃数回転段階の 期間は、回転が全く停止する前に袋１４の有効容量を４だすのに十分な時間を血 液→唯に与えるように選７ゴれる。

皿底ノエロサイトと血液ネオサイトとは相互に僅かに１．０６と１．ｏ９ｙ／− たけ密度が異なる。しかし、この分離せたに分配手法および装置を用いると、こ れらの１細胞を袋１２中で分離し、缶度範囲沿いの１１−任意の点にあるよＣに 選ぶことかできる区分ＭＬで２つの袋１２と１４中へ分割することができる。

次に第６図を参照すると、１ＴＩｌ液留分が前記のように分離はれ、分割された 後、装置１０を遠し機の容器Ｃから取出し円板５２をポス２６からはずし、それ により同図に示すように２つの連結装置部材１５ａと１．５　ｂを分離する。次 いで袋１２と１４の内部を隔離するためにシールＳを管沿いの間をあけた′今装 置で管４４：こ層成する。最後に２ン−ルＳの間の６（＜　ｐで管をｔυ（υｉ しそれにより２つの袋およびそれらの内容物ケ、す離する・。袋１２中の密度の 小さい着合１１１１液第１υ５２すなゎぢイ・万サイトＢｎ　は、次に秩過刺投 与を避けるためそのような若令血液細胞を必要とする１妙〆＋：秤皿の上塔のよ うな患箭に注入するのに使用することができる。一方、袋１４中に含１れる高瀦 高令の１ｉｉｌ液叶吻は、ｋ：検、試験に、または任意令の１ｌｌＬ液を部時必 要とする舒４、例え（，４串攻仮害者、に注入するため（で使用できる１、 望むなら（ゲ種々の曲の江装置を、高−速度遠心分離の間に生ずる血液留分分離 段、１昔の間の袋１２と１４の内部を１隔離するため、およびその段階の後に生 ずる■液留分の分割せたは隔離の間この２室間の連絡を衝立するため：て利用す ることができる。例えば、通常は閉鎖した電気作動弁を管４４中に介甘せること かできる。遠心機サイクルの終りに容器Ｃが低速明で回転しているときその弁を 、選んだ分割線しより下の血液留分に対応する流体量を袋１２の底部から袋１４ 中へ移すことが可能な十分な時間開くことができる。

他の型の機織的弁装置が第８図に一般に８２で示されている。弁装置８２におい て、球形弁部材８４は通塔弾性隔壁８８（・でよりフィル−ター３６の下のｙｆ 坐８６トに着１・１≦し７てぜＩ′：持される。球８４の着ｆ王が通榊袋１２と １４とを隔離する静［１−用ノールを樹立する。この隔壁８８には直径が球８４ の直径より鏝−〉］・てい甲７シ・：別口９２が形成されているので、球・５は その川口の、川；１に適合できない。隔・妾８８の下に（・１小円板９６が１〃 置し、円板の直下には他の弁座１０２が配備される。ｌｊ］仮とゴス２６の底と の間で作用するつる巻きばｒ１０４が日板を上方へ付勢しているので円ｇｊ、は 弁座から幾分間隔を置いている。弁坐３２の下の空間は袋１４に通じる管４４と 連絡１７ている。

通な、球８４は弁・坐８６に接触して前座している。しかし、弁装置８２を組入 れた装置１ｏを高速度で回転すると球８４は弁座８６から席を離れ、遠心力（で より隔壁開口９２を通って押出きれる。それ（（より球は円板９６を束縛し、円 板を押し下げるので円板！Ｌ：ｉへ線で示したように升、坐１０２上に着Ｊヌし そ７′Ｌにより管４４中への流体の流れを閉基する。換言すれば、高速度におけ る遣口・分離の間ば弁装置８２が装備されているが、しがしなお閉じた１甘であ る。遠心機サイクルの終りに回転速度を比較的低い値、例えば５００Ｇ以下に減 少させると円板９６に作用する円泊・カはばね１０４の復元カポ角に落ちるので 、円板は連続線で示した＊、ｌ？１１０２がら席を離れ、それにより２つの袋の 間の流体連絡が筒立され、上記のように袋１２の底部の血液留分が貸１４中へ流 れてこれを満たすことができる。従って第８図の弁装置８：ｌｌＪ’ｉ靜屯用／ −ルと連ｇＩＪ用／−ルの両方として機ｊ巨し、」−記α理中適当なときに自動 的に開閉する。

もちろん、この手法に従って血液留分を分離、分割できる他の匹敵する弁構造を もくろむことができる。

捷だ、本発明者は血液ネオサイトのノエロサイトからの分離、隔離についてこの 装置および方法を説明したけれども、同様の方法および装置を、密度によって赤 血球捷たは他の物質を分離するために使用することができる。

例えば、同じ手法を遺伝子増埴用途に適用して遺伝子を密度連続体に分離し、− その連続体中の選んだ分割線の上またけ下の遺伝子のみを収集することができる 。

従って、上記の方法および装置を用いることにより、非常に正確にかつ完全に無 菌環境で異なる密度および令を有する血液細胞を鏝離し、隔離し、二収巣できる ことが上記から認められるであろう。

分割ば゛密度または全連続体中の実質上任意の選んだ点で行なうことができ、そ の分割点は方法および装置そのものに依存し、操作員の１則のｆ４Ｊ断に依存し ない。従って、血液細胞の分離、分割および収集は比較的未熟者により比較的短 時間に行なうことができる。それ故、この手法は、特に若令血液細胞すなわちネ オサイトからなるドナー血液の連続供給の必要がある病院や診療所において広範 な適用が見出されるであろう。

従って、上記の、中でも前述の説明から明らかになった目的が有効に達成され、 そして上記手法および上記構造に発明の範囲を逸脱しないで変更をなすことがで きるので、上記記載に含まれ、または添付図面に示されるすべての内容が例示と 解釈され限定趣旨でないと意図されていることが一３カられよう。

呼だ以下の請うくの範囲は記載でれた不発明の包括的および特定の特徴のすべて を額含する意図であることを理解すべきである。

ＦＩＧ、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １Ａ、第１室中に全面試料を収集する、Ｂ、第１室とその内容物を遠心機にかけ て第１室中に含まれる血液中の赤血球が、最密細胞が回転軸に対して遠位である 糸度連続体沿いに分離するまで５００Ｇを超える遠心力を発生ジせる、およびＣ ０旨速度遠心分雌段階の終った後、分離した細胞を、前記回転軸から分割線を超 える赤血球量を第２室へ移動させることにより密度連続体中の選んだ線で分割す る、 諸段階を含むネオサイト濃縮血液を製造する方法。 ２、　前記分割段階後に第１室と第２室とを隔離する付加段階を含む、請求の範 囲第１項記載の方法。 ６　前記＄１室および第２室を前記回転軸の周りに回転し、前記赤血球量が第２ 室へ移動し終る寸で前記分割段階の間、室に遠心力を生せしめる付加段階を含む 、請求の範囲第１項・ンて記載の方法。 ４　前記第１室中で全皿と混合するために高速度遠心分離段：青の完了の前に第 １室中へ水性洗浄溶液を導入する付加段階を含む、請求の範囲第１項に記載の方 法。 ５Ａ、第１室中へ流体細胞の試料を導入する、Ｂ、第１室中の流体細胞が吸糸の 細胞を回転軸に対し遠位にした密度４続体に分配されるまで＠配第１室を高速度 で回転する、および Ｃ１高速度回転段階の終った後、前記分割線の回転軸から遠位の′１ｇ１１部の 一＋ｌ＋］泡量を第２￥（こ移動させることにより分自己された一泡を隔離する 、 諸段階を宮む、選べ、た屑度範囲の流体−ａ泡を収集する方法。 ６　前記分割段１昔後に第１室と第２室とを隔離する付加段階を含む、請求の範 （州第５項に言ピ載の方法。 ７　前記分割段階の間、前記＠胞量が第２室に移動し終る捷で比較的低速度で前 記回転軸の周りに前記第１室および第２室を回転する付加段階を含む、請求の範 囲第５項に記載の方法。 ８Ａ、高速度回転段階が第１室に５０：ＯＧを超える比較的大きい遠心力を生ず る、１だ Ｂ、低速度回転段階が第１室２よび第２室に５００Ｇ未満である比較的小さい遠 心力を生ずる、請求の範１囲第７項に記載の方法。 ９Ａ、大きい遠心力が約２．ロロＯＧであり、−！たＢ、小さい遠心力が約２０ ０Ｇである、請求の範囲第８項に記載の方法。 １０Ａ、第１室を形成する装置、 ８、第２室を形成する装置、 Ｃ１上記２室の内部を連結する導管、 Ｄ、　夜体を第１室へ導入する装置、前記の室を形成する装置は第１室中の前記 液体の成分が第１室中に密度連続体沿いに分配されるように前記導管から遠位の 軸の周りに高速度で回転されるように配列される、および Ｅ、前記密度連続体が第１室中に形成された後、前記Ｅ度連続体中の選んだ分割 線の１側の第１室の内容物を前記第２室に移動させるように選んだ時間の間前記 導管を開く装置、 を含むネオサイト濃縮血液の製造装置。 １１、前記第１室および第２室を形成する装置が可撓性袋を含む、請求の範囲第 １０項に記載の装置。 １２　さらに前記の室を形成する装置間の前記導管中にフィルターを含む、請求 の範囲第１０項に記載の装置。 １６　さらに前記第２室を形成する装置中に含まれる水性洗浄溶液を含む、請求 の範囲第１０項に記載の装置。 １４、前記移動装置が、前記の室を形成する装置を高速度で回転した後まで前記 の室の間の液体の流れを防止する弁装置を含む、請求の範囲第１０項に記載の装 置。 １５Ａ、前記導管を通る流体の流れを防止するシール、および Ｂ、　前記の室を形成する装置を回転する前に前記シールを１透す：ＳＳ買置 をさらに含む、請求の範囲第１４項に記載する装置。 １６、前記の弁装置が、前記第２室中の前記導管の室への入口における弁部材を 含み、前記の弁部材は、前記の室を形成する装置が回転されたときに回転の間前 記室間の液体の流れを防止するように第２室を形成する装置の壁に接触して着座 するように配置されている、請求の範囲第１４項に＝ａ載の装置。 １７　弁装置が、 Ａ、前記導管内の第１弁座、 Ｂ、前記第１弁座から間１隔を置いた前記導管中の第２弁坐、 ａ　前記弁座間に配置された弁部材、 ａ　前記第１弁座の方向へ前記弁部材を保持する装置、Ｅ、前記の室を形成する 装置が回転したときに前記回転の間前記室の間の液の流れを閉塞するよＡに前記 弁部材を前記第１弁坐から離し前記部材を前記第２弁座上に着座させる装置、お よび Ｆ、　前記の室を形成する装置が回転した後導管を通して前記第１室から前記第 ２室へ液体の流れを可能にするための第２弁座から弁部材を離す装置、を含む、 請求の範囲第１４項に記載の装置。 １８Ａ、第１可撓性袋、 Ｂ、第１袋よりも小容量を有する第２の可撓性袋、ｃ、２つの袋の内部を連結す る導管、 Ｄ、第１の袋の中へ液体を導入するための装置、Ｅ、前記袋の間の液体の流れを 防止する前記導管中のシール、および Ｆ、　前記袋相互を移動可能に機械的に連結するための第１の袋の導管端におけ る装置、 を含む異なる密度の細胞を分離する装置。 １９　連結装置が、前記袋の一つに取付けられたオス連結部１第２よび前記その 他方に取付けらｎたメス連結部材を含む、請求の範囲第１８項に記載の装置。 ２０、さらに前記袋の間の導管中にフィルターを含む、請求の範囲第１９項に記 載の装置。 ２１、前記連結部材の一つが Ａ、比較的硬質の外環、 Ｂ、　前記袋の一つに取付けられた比較的硬質の中心部材、および Ｃ０中心部材が環に関して軸方向に移動することができるように前記環と中心部 材とを連結する可撓性、弾性の隔壁、 を含む、請求の範囲第１９項に記載の装置っ２２、他の連結部材が前記袋の他方 に取付けられた比較的硬質の円板を含む、請求の範囲第２１項て記載の装置。