JPS58501733A - ウイルス試験法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス試験法 技術分野 生物学的流体中のウィルス例えばインフルエンザウィルスを迅速に検出するだめ の簡単で有効な方法は現在のところ実用されていない。生物学的検体からウィル スを単離し同定するには一般に数日乃至数週間を要すると共に通常の操作さえも 大抵の臨床研究機関では容易に実施し得ない。感染されたウィルス要因が同定さ れる迄に、該同定は治療の即時的問題に直面する医師にとってアカデミツクな興 味以上の何物でもない傾向にあった。インフルエンザウィルス（及び構造的に関 連するウィルス）の検出のための臨床的迅速方法を使用し得るならば多くの感染 疾患における抗生物質による不必要な治療を阻止し得るであろう。更に患者が或 種のウィルス例えばインフルエ；・ｆＡ型ウィルスに犯された場合にこれはＡ型 であるとの事実を知ってさえとれば他の治療剤例えばアマフタノンを用いる治療 を指示し得たかもしれない。

背景技術 生物学的検体中のウィルスを直接検出し得る試験法の開発は現在多数者に興味を もたせている。ロタウィルス（’ｒｏｔａｖ”ｉ’ｒｕｓ　）の検出に有効であ ることが見出されたのと同様の二重抗体サンドイツチ法（ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔ ｉｂｏｄｙｓａｎｄｗｉｃｈ　）　について最も多くの研究が企図されているよ うである。この目的のために取扱いに便利な大きさのビード（玉）の上に抗ロタ ウィルス抗体を吸着させる。

次にこの抗ロタウィルス抗体ビードをロタウィルス含有容疑の排泄物検体に曝露 させる。このビードを充分に洗ってから存在するロタウィルスを“酵素が結合さ れている第二の抗ロタウィルス抗体″を用いて“サンドイッチ″する。次いで酵 素試験を行ってウィルス粒子の存在を検出する。

殆どすべての報又ハ第二抗体への　ｌ　又は酵素（アルカリホスファターゼ又は 西洋わさびのパーオキシダーゼ）の結合物を用いる二重抗体サンドインチ法（Ｄ ＡＳ）又は酵素或は標識放射性元素を結合させた第三抗体の使用を含む間接分析 法による研究にもとづく試験法を記載している。成る限られた数の例（雑文例） において標識抗原又は量を定められた抗原を用いる競争的明害（ｃｏｍｏｅｔｉ ｔｉｖｅ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　）がＤＡＳ以外の方法として示唆されている 。

本発明者らは完全形のピコルナウィルス（ｏｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）の検出用 の基質にウィルス抗原を直接吸着させることに関する雑文についても知っている 。この方・法は該系中に競争的タンパク抗原が存在していなければピコルナウィ ルスについて成功し得る。

表面抗原に関する試験によるウィルス粒子検出法におないと表面抗原か劣化して 検出すべき抗体に対して不反応性となる。

インフルエンザウィルス検出系に関する二種の雑文が文献に現われた。第−法（ Ｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８０　）　はインフルエンザウィルス存在の検 出のために螢光基質又は放射性基質を用いる少くとも２４時間の作業を含む。

操作は複雑を極めていて指示薬の螢光又は放射能の検出に特別な装置を要する。

第二法（Ｙｏｌｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８０）は完全形のウィルス粒子の中のノイラミニダーゼを吸着するためにミ クロタイター板（Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｊａｔｅ　）上の捕獲抗体（“ｃａｐ ｔｕｒｅ“ａｎｔｉｂｏｄｙ　）　を使用する。螢光基質を用いるノイラミニダ ーゼ試験法（メチル　ウンベリフェリル　ノイラミン酸）はウィルス存在を示す 。けれどもノイラミニダーゼ抗原（特にＮｌ）は、酵素が様々に異るサブタイプ （５ｕｂｔｙｐｅｓ　）　の酵素類の中のひとつであるので、その安定性が大き く変化する。この酵素の不活化；１分析を妨げる。更にこの試験法は螢光測定に 依存する点及び真実でない結果を招く非特異的反応を起させる点で制限を受ける 。

発明の開示 本発明に従いウィルス粒子自体を単離せず又は検出することなくヴイリオ／（ウ ィルス粒子〕の主構成タンパク成分即ちＭ−タンｉＲりを検出する仕方によって ウィルスを検査する新方法を本発明において開発した。固相系の検出用抗原とし てＭ−タンパクをウィルス試験法に使用することは多くの利益をもたらす。Ｍ− タンパクはライＪｌ／　、７．例えばオルノミキソウイルスＣＯｒ　ｔｈｏｍｙ ｘｏｖｌｒｕｓｅｓ　：とれはインフルエンザウィルスを包含する〕、ノクラミ キソウイルス［ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ　；　これははしか、おたふく かぜ、パラインフルエンザ及びゾノイドミキソウイルス（ｐｓｅｕｄｏｍｙｘｏ ｖｉｒｕｓｅｓ　）を包含する〕及びラブドウィルス［ｒｈａｂｄｏｖげｕｓｅ ｓ　：　これに狂犬病、マルブルク（Ｍａｒｂｕｒｇ　）及びエボラ（Ｅｂｏｌ ａ　）ウィルスを包含する〕の主タ／バク構成分である。Ｍ−タ／ノヤクｉｆ′ ｉヴイリオンの全ウイルスタンノヤクの約３０係を構成する。更にＭ−タンパク は特異型である；即ちＡ型インフルエンザのＭ−タンノやりはＢ型インフルエン ザのＭ−タンパクから抗原的に区別され、しかも両者はＣ型インフルエンザのＭ −タンパクから抗原的に区別される。特異型抗原として、Ｍ−タン・ξりは〃外 見上永続する抗原的変化〃に支間されない（赤血球凝集素は支配される）。従っ てすべてのＡ型インフルエンザウィルスの検出に一種のみの試薬を必要とするに 過ぎない。

Ｍ−タン・ぐり使用のその他の利益はＭ−タンパクが著しく安定である事実であ る。Ｍ−タン・ぐりを煮沸した調製品は依然として抗原性を保つ。Ｍ−タンパク は酸性化クロロホルムで純化をれる：即ちメタノール抽出又はそれに続く各種洗 剤による可溶化により純化されるがそれでもその免疫原性と膜への結合性との保 持が証明されている。Ｍ−タンノｅりはヴイリオンの脂質表面膜の内側に位置し ているので生物学的検体内の偶発性のグロテアーゼから保護されている。従って Ｍ−タン・ぐり検出にモトツく本状の遂行に当り生物学的流体中に存在するかも 知れない外来性のプロテアーゼによる感受性又は反応性を損することなくＭ−タ ンパクをヴイリオン又はウィルスフラグメント（断片）から放出させてこれを直 ちに試験操作に供し得る。本発明の更に他の利益はウィルス存在について試験す るだめの検査用タンノ？り質としてのＭ−タン・ぐりの使用にあり、完全形のヴ イリオンの存在を必要としないことにある。

一般に本発明の実施に際しウィルス粒子即ちヴイリオンを処理してその中に含有 されていたＭ−タンパクラ放出させ１Ｍ−タンパクを優先的に吸着する表面上に 該放出Ｍ−タンノ母りを吸着させる。その後に該表面上のＭ−タンパクの存在を 抗−Ｍ抗体によって検出する。要約すると滴径な指示薬例えば螢光指示薬、放射 性指示薬又は酵素と結合させた抗−Ｍ抗体によってＭ−タンノξりを検出する。

けれども本発明では間接的検出法の使用が好寸しい。間接的検出法においてはＭ −タンパク吸着表面を先ずＭ抗体で処理するとこれは表面に支持されたＭ−タン パクに対して抗原的に吸着される。次にＭ抗体のＦａｂ部分に対する第二抗体（ これは指示薬と結合する）の使用によってＭ抗体を検出する。最高感度の達成の ために本発明では抗体／酵素結合物の使用が好ましい。この結合物は一般に高感 受性であるのみならず更に大部分の研究所で常用する如き分光光度計で容易に測 定し得る結果を与えることが見出された。

上記方法で各工程は急速に進むので通常の場合に全試験は数時間以内に遂行され 、普通は僅かに２　ｎｊｉＬ　のＭ−タ／・、Ｑ　り又は約５０ｙ　のウィルス 被検量で検出し得ることが本発明にふ・いて見出された。

発明を実姉するための層良の形伸 更に詳細には本発明を次のよう（でして実施するＭ−タン・々りの分散及び吸着 周知の通シ外来性タンパク質の不在下に室温乃至１０口℃の温度で３０分乃至数 時間ウィルス粒子を恒温保持することにより内部含有物質を分裂させ露出させる ことができる。Ｍ−タンパクの放出のため及び表面への最適接着のために少量の 洗剤の存在が一般に望寸れる。

アニオン性洗剤例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）又はＮ−ラウロイルサ ルコ／ンのナトリウム塩（サルコシル；　５ａｒｋｏｓｙｌ　）　は特に好適で あることが判った。有用と思わわ、るその他のアニオン性界面活性剤には増用の 脂肪酸アルカリ金属基又（４炭素原子数約８〜１８のアリル或（はアシルギル硫 酸若しく（ハアリル又はアラルキルスルホン酸のアルカリ金属塩が含捷れる。非 イオン性及びカチオン性洗剤も又有用であると信ぜられるが最適成績の達成には これら洗剤の比較的高濃度が必要であるようである。

Ｍ（マトリクス又は膜の）タンパクはウィルス例えばオルノミキノウィルス、パ ラミギノウイルス及びラブドウィルスの表面膜の主タン・ξり構成分である。こ れらのウィルスのポｌ）　＜プチドは疎水性であって高度ｅで集合性ｆある。適 宜の濃度の化学剤例えばウレアグアニジノ塩酸塩はウィルス粒子又は断片を分裂 させてＭ−タンパクを露出させることに公知である。各種の洗剤に又ウィルスの ポリペプチド（例えばＭ−タ／′バク、又゛はＭ−タンパクを露出させたタンパ ク断片）の周囲に親水性の穀を形成することによりウィルスのポリペプチドを可 溶化させると信じられている。その他のＭ−タンパク放出のための既知方法とし て酸性化クロロホルム−メタ／　−ル又＋ｄクレアチンエーテル抽出法はウィル スの脂質表面膜を分裂させる。

Ｍ−タンパクは競合タンパク質に優先して多くの表面に対して自発的（て（自然 ［）接着する。これはその疎水性にもとづくものであると推測される。この性質 を＾ＩＪ用してＭ−タンパクが接着するように操作するに便利な適宜の試験用表 面を提供することにより本発明の試験法を実施し得る。、例えば１０，０００倍 も〕Ｉφ剰な量の競合タン・９り質分子と共存するＭ−タンパク（ｂ　ｍ！９　 ／　ｍｌの牛血清アルブミン中の０　、５　ｔｈ！７−／ｍｅのＭ−タン／ξり ）をポリスチレ／が急速Ｃ数分間以内）Ｋ吸着することを本発明において発見し た。本発明の試験法はＭ−タンパクのこの特性のＫｊ１用にもとつぐ。本発明者 らの仮説によれば上記の事実は他の多くのポリぜゾチドに比するＭ−タ／・ξり の疎水性に関連するものである。これは他の疎水性表面例えＩ″ｆｆポリアクリ レ・、ポリアミ１゛及びポリビニルの表面も又適するであろうことを示唆する。

表面は本発明の試験法の各工程において好都合ＶＣ操作され得る限りいかなる適 宜の形状であってもよく例えば筒（ｗｅｌｌ）　の中で本状を実行し得る。本発 明において６　＋１＋Ｊ径の！リスチレ／のビーズか便オＵであることか見出さ えした。これらのビーズの使用時Ｃ′ｒＣ；を法で使用されるポリスチレンにレ ットと・同温保持容器表面との間に起る競争的吸着を（ロ）避するために・同温 保持をガラス管内で行う。

Ｍ−タ／−８りの分散及び吸着に際し洗剤使用量（１Ｍ−タ／−′Ｐりの分散に は充分である量と試験表面への吸着を６月止すお量とが丁度釣合う量であらねば ならない。最適量＋ｄ洗剤の特性に％に依存することは明かである。

洗剤の最適量に又被検試料中に存在する他種タンパク質の量にも依存するらしい 。生物学的試料（・１少量ながら各種の部のタン・ξり質を通ｆａ　１′ｉ含有 する。更にウィルス試料の採取に当りウィルス杓〕−の自発的の（自然に起る） 断片化を抑制するたぬにタンパク質を添加して試料を安定化させることが四７曲 である。従って本状の実施（・で当り試峯、１に対し実％茄のタン・ξり質又は 夕／パクカ（解物をｉｉ　ｉ’＋ｌＩと共に加えるけれども但し洗剤対添加タ／ バク質の量比（１表面へのＭ−タ／・やり吸着のための最適比率Ｖζなることが 好捷しい。かよう（ですれば試料中に存在する少量の外来性タンパク質に１試験 成績を大きく変えること（・１ない。本発明で有用な添す１１用タン・々り質の 例は牛皿／７１７ルブミン（ＢＳＡ）、了うントイン含有流体、及び子牛肉浸出 液である。その他の有用と思われるものはゼラチン及び子牛胎児血清を含む。洗 剤及び添加用タン・ぐり賃下であってよい。最適条件ｕ　口、　Ｉ　ＴｎＱ／ｍ ｌのＢＳ’Ａの存在下の０　、０３’ｌｉサルコノルの使用及び０．７　ｍｑ／ 　ｍｌ！のアラントイ／含有流体の存在下のｏ、ｉ幅ザルコフルの使用を含むも のであることが見出された。

リン酸塩で緩衝された食塩液（＋）Ｈ７、Ａ　）　又は炭酸塩緩衝液（ＤＨ約９ ．７）の中のウィルス断片又にヴイリオンを゛１ｕ温保持することによりウィル スタンパク質を分散させることが一般に好ましい。ヴオレルら［Ｖｏｌｌｅｒｅ ｔ　ａｌ、　ｉｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔ ｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ。

Ｖｏｌｕｍｅ　５３　（１９７６）　）により記載された代表的炭酸塩緩衝液ｆ ｄ１．５９！ｉ’の炭酸ナトリウム、２　、．９３　ｊ％の重炭酸ナトリウム、 ０．２ｇ−のすトリウムアット及び１０１００Ｏの蒸留水を含む。

ウィルスを含有すると思われる試料は患者から直接採取された生物学的流体例え ば咽喉洗浄物又は鼻腔洗浄物であり得るが処理前に清澄化のために１５０　Ｏｒ ｐｍで１５分間又はウィルス粒子断片を含む富化ベレットの形成のために３００ ０３　ｒｐｍで６０分間遠心分離することによる試料調製は屡々役に立つもので ある。

Ｍ−タン・ぐりの分散及び吸着を行うに場合に１１１．温保持を少くとも３０分 間継糾し温度を室温乃至１００℃に保つ。標準化の目的のたぬに本発明ではロ６ ロ３係サルコノル及びＯ，［）’１％牛血清アルブミノ使用の炭酸塩緩衝液中に 温度５６℃において゛１１温保持を１／２〜１時間継続させるように被検ウィル スを保温することが一般に好適である。

好適条件達成υてついて研究するとポリステレ／ビーズによるＭ−タン・Ｑりの 取込み速度１４３０分間〜６時間υても及ぶことが判った。吸着は著しく速かで あって通常は３０分間の終りＧて９０係り上完了してゾラトー（上昇も低下もな い〕法曹に達し、それから先の約９０〜１２０分間のうちに８１それ以」＝の反 応が起らんいようであることが見出された。

後被覆工程 分散及び吸着工程の結果として被検表面は“吸着されたＭ−タンパク″を有する が典型的に（はＰＢＳ、−１−ウィン（Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ　）液を用い てこの被検表面を数回読分な時間をかけて保温することが好せしい。該飽和によ り該表面がＭ抗体又は抗体−指示薬結合物のごときタン／Ｆり質をその後に吸着 することを阻止するようにする。

吸着されたＭ−タンノｅりの検出及び指示のために次工程で使用される抗体の吸 着は基質内で余計な変化を生じ易いので被検物のＭ−タン・ｅりの信頼し得る検 出を不明瞭とするであろう。本発明での最近の研究により子牛肉浸出液、炭酸塩 緩衝液（１：１）中での３７℃３０分間の保温は基質内変化の除去に充分である ことが桿出さり、た。

該１且温保持の後に表面を再洗浄して余分の液体を除く。

Ｍ−抗血清の反応 次ＫＰＭ検表面を抗体の非特異的接着を抑制する媒質中でＭ−抗血清に対し・酊 温保持する。他の固相免疫試験法によって一般に周知されている通りタンパク質 類及び各種の洗剤類は該抑制に資するのである。抗原／抗体反応の促進のために 媒質も又ｏＨ７付近に緩衝される。生理的ＤＨを用いることが普通である。

非特異的反応抑制のためのタンパク質として本発明でに使用する。イオン性洗剤 は抗体を変性しやすいことが知られているので洗剤は非イオン性であることか好 寸しい。示唆さ、Ｉ″Ｌ得る非イオン性洗剤のうち可能性あるものは各種アミン のエチレンオキシド縮合物、ソルビタン類及びアルコール類である。例とじてに アルキルフェノキ７エトキシエタノール、ンルビタ／エチレンオキシド縮合物及 びポリエチレンオキ７ドーポリゾロビレンオキシドブロノクポリマーが誉げられ る。

本発明においては０．１〜１　ｍｙ　／　ｍｅのＢＳＡ又にアラントイン含有流 体を添加したＰＢＳ−トウイン混合液の使用が好適である。

使用に便利な動物種に列しＭ−タンパクを注射することによる常法によって抗血 清を生成させ適宜の恒温保持期間の後に抗−Ｍ血清を回収する。使用に便利な種 としてウサギがよいことが見出された。１５０希釈でウサギ抗血清を使用すると 最高感度が得られる；但し希釈度ｉ−１：１：５０〜１：２０口０の１囲に変化 し得る。各種の・同温保持条件の下で本発明方法を試みると室温下Ｖｒｃ５分間 保温すればＭ−タンパクによる抗体吸着は約６０係完了であることが判明した。

３７℃で反応させても効果を高めることはない。使用のＭ−タンパクについて１ 時間の終りまでに実質的飽和が起るように思われる。

酵素−抗体結合物との反応 Ｍ抗血清で処理された被検表面を再び数回洗って余分の流体を除き指示薬−抗体 結合物と共に恒温保持する。

既述の通り本発明では酵素−抗体結合物の使用が好贅しい。アルカリホスファタ ーゼとヤギの抗−ウサギＦａｂ抗体との結合物は市販されていて本発明での諸実 験にも成功裡に使用された。この市販の結合物を製造会社の使用法説明書の仕方 に従い適宜の保温用媒質中に希釈する。

媒質は常用技法（既述の通り）に従って非特異的接着を抑制するものとして選択 される。製造会社による指示の力価にもとっきＭ抗体の約０．５ミクロダラムと 反応するに充分な量を用いる。一般にこのことに抗体／酵素結合物が約１２５０ 〜１：２００口の希釈度において使用されることを意味する。結合物用として本 発明で使用さＩ’した保γ品用媒質（・１０．５４牛血清了ルブＳン含有のρｆ ３　Ｓ　−１−ウイ、／液である。

基質試験 酵素−抗体結合物で処理された被検表面を取出して再洗し、酵素中の基質と反応 させる。１基質の選択はイ１ちろん結合物中に使用さ２ｔシる指示薬（酵素）（ で依存する。了ルカリボスーノアターゼの場合（・こ推奨される７Ｉ！−質の代 表的（・つもの（」４−ニトロフェニルホスフェートｋ　Ａ’ｌ　（５ｍＱ　） であってこれを５　ｍｅの１０傑７ｙエタノールアミン緩衝液に浴かす。ヴ、ｄ −１−ルら（前掲文献）の記載のようにして９７　ｍｌの７′エタノールアミン 、８０Ｏｍｌの水、０．２９（ハナトリウムア７゛ド、ｐＨ９，８ｆ／ｒ達セＬ 　、＋１−）　ル（’Ｄ　ＶＣ光９な量の１千Ａ塩酸、及び浴液を１０１００Ｄ となす（で光ｆ’ｊな蒸留水を用いてノエタンールアミン緩Ｉｉｉ液を調製する 。

適宜の時間をかけて１１（温保持を行い得る。本発明で使用した特別な糸（Ａ　 Ｑ　Ｑ　ｎｍ　での訪み）の場合の丸字落度（弓、ｌ１温保持時間と直線的に比 例することが見出された。

本分−明の試験法のために３７℃でろ口外間の保温時間が便利であることが判っ た。

ｊψ−タンノやりに対する抗血清の調製Ｍ−タン・ξりの純化は確立化された方 法ＣＭａｈｙ　ａｎｄＢａｒｒｙ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　５ｔｒａｎｄ 　ｖ：ｒｕｓｅｓ、　Ｃｈａｐ、　９　（ｐｐ。

１５３−Ｉ　Ａ　３　）　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓｌ　Ｌｏｎｄｏｎ 、　ｌ９７５’ｌ（Ｋ従いウィルス粒子の分裂の後にＢｉ、ｏ　Ｇｅｌ　Ａ　− ５ｍ又は５ｅｏｈ−ａｒｏ、ｓｅＣ−Ｌ　−６：Ｂ中のｓＤｓケ゛ルク０７トグ ラフイにより行われる。免疫源としての１′ψ用のためのＭ−り／・モクの純化 は又高圧液体クロマトグラフィによりステリノクエタスクルノヨンコラム（５ｔ ｅｒｉｃ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｏｌｕｍｎｓ）上で緩衝液含有のＴｒｉｓ　− ＨＣｔ−ＳＤＳ中でのクロマトグラフィ（・でより付われ；：］。

Ｍ−抗体の調製（−ｉ免疫学的応答を起させる（て充分な￥のＭ−タンパクを便 宜のゼ１物種（例え（弓゛ヤギ、つづギ又（ｉニワトＩＪ　）　ｉ・てついで用 いる包状で達成される。典型的Ｋ（４使用動物に対し２回文（・ｉ３回、成る間 隔をおいて接種して抗−Ｍ力価が所望の程度（て上昇したとさに血清を採取する 。

洗剤中乙・こ中、離された如きＭ−タンパクからの数種の免疫学的応答は接種Ｖ こよって得られるけれども凝集したＭ−タ／・９りの使用により調製された少く とも＋　１００００の抗−Ｍ力価を有する高度免疫血清の使用が好適であ２〕。

ＳＤＳの除去によりＭ−タンパクは凝集して美しい乳白尤をもつ懸濁物を生成す る。ＳＤＳの除去はＰＭ−ＩＱ膜を具えた濾過器（Ａｍ１ｃｏｎ　ｍｏｄｅｌ　 ５６　）を用いる連続式超濾過によって可能である（　Ｂｕｃｈｅｒ　ｅ、ｔ　 ａｌ、、　Ｊ。

Ｖげ○ｌｏｇＶ３６　：　２ｏｐ−５８６−５９０，、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　。

１．９３０　）。又ＳＤＳのＭ−タンパク製品か、らの除去はＭ−タンパクの濃 化製品（０，１〜１０ｍｇ、、’ゴ）の４℃（でおける大量の蒸留水（で対する 徹底的な透＠にょっても可能である。ＳＤＳは冷時に沈殿するので載量のＳＤＳ の・再溶解のたぬに［］常の事として２該試料の穏和な加熱が必要である。フロ イノＩ・（ＦｒｅｕｎΔ）の助剤（アノユバント）中のＩ　Ｑ　ｕｇ　の凝集Ｍ −タンパク（既述のようにして調製）を用い皮下注射によりウサギを免疫処理す る。

同時に追加の１０１１ｇのＭ−タンパクを静脈注射する。

（Ｍ−タンパク投与前に対照の採血を行う。）Ａ２日後ｔこ該動物を１０ｒｔｐ 　の凝集したＭ−タン・モク調製物（）ロイントアノユバント不含有）の使用下 に処理する。７日後に試験用の採血を行う。この血清について、吸着物としてＭ −タンパクの使用下に、下記のようにしてミクロ力価試験（Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅ ｒ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ　）により検査する。力価が充分に高値（’Ｉｏ ｏ口ｏ以上）であるならば動物を放血させこの血清を試験目的に満足であると考 える。力価がｉｏｏｏｏｇ下であるならば更に追加的に１０μｍ　の再注射分を 投与して７日−後に前記のよう（Ｃ血清の力価を測る。

抗−Ｍ抗血清の力価測定 純化Ｍ−タンパク（、ＳＤＳケ゛ルクロマトグラフイ（・でよるもの）について ロウソイ法（Ｌｏｗｒｙ　ｍｅｔｈｏｄ　）　ｌ・でよりタンパク濃度をθり定 する。このＭ−タンノやりからＳＯ５は除去されていない。

Ｍ−タン・ぐり溶液を希釈して０．２〜０．４μ９／ｄ即ち２０〜’　Ｏｎ５’ ／　１００　ｔｌｉとした。この希釈されたＭ−タンパク（１００ａｌ／ｗｅ１ １）をミクロ力価デレー１・（Ｍｉｃｒｏｅｌｉｓａ　）上の筒（ｗｅｌｔｓ　 ）　Ｋ添加して終夜４℃において吸着を行わせる。その翌日にプレートをρ４Ｂ 　Ｓ−トウイノ液でろ回洗う。１５０〜ｉ：ｉＴ：１１１希−釈から出発して０ ．５係アシ、／　Ｉ−イノ流体含有のＰＢＳ−トウイン液中のプレート」二で２ 倍・希釈を行う。

抗原−抗体反応は４℃で終夜゛進行する。その−翌、８ｖｃプレートをｐｓｓ− トウイノ液で５回洗う。ＰＩＢ、、Ｓ−ｉウィン含有の０．５％ＢＳＡ中で希釈 されアルカリホスファターゼを結合され予備渭］定濃度範囲（１：　：２５　口 〜１２００口）を有するヤギの抗ウサギＦａｂを一添加して終夜４℃に恒温保持 する。その翌日にプレートをＰ　ＢＳ−１−ウィン液で３回洗う。１０妬ノ工タ ンールアミンＭｉ液中１　ｍｑ　／　ｍｌのパラニｉ・ロフェニルホスフェート を含有する溶液の１００μｔ　を添加する。室温下の俯・所で３０分間゛亘温保 持する。測定器［Ｍｉ　ｃｒｏ　Ｅｌ　ｉｓａ　Ｒｅａｄｅ：ｒ（Ｄｙｎａｔｅ ｃｈ　）　：］　中で吸収値を読みとる。希釈度の逆数の計算により力価を測定 すると光学密度単位０．３の値を与える。

本発明はウィルス中のＭ−タンパクの検査法として特記されたけれども技法の適 宜の変改によりＭ−タンパクυて対する抗体の試験法として同様にオリ用される ことは明かである。該変改においてＭ−タン・ぐりの調製は上記の通りであって 即ち例えば抗−Ｍｆｍ清の力価測定繰作にでおける通りである。次にＭ−タンパ クの予備測定された量を用いて被検表面を飽和させ、かように飽和された被検表 面をＭ−抗血清含有の可能性ある血清の各種希釈物Ｉで対して１１１．温保持す る。次に血清中に含有されているＭ−抗体の力価を、例えば既述のエリザ法（Ｅ ＬＩＳＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｒｏｃｅｄｕｒｅ　）　Ｋより、測定する。こ の変改された方法を例えば被検患者血清についてＭ−抗体の検査に使用するなら ば酵素結合された酵素免疫グロブリンは人のＭ−抗体のＦａｂ部分に対する抗体 であることは明白サルコシル（０，０３％）及び牛血清アルブミン（０、０１４ ）を溶解させた０　、　３ｍ／の炭酸塩緩衝液を含有するガラス管の中でインフ ルエンザウィルス含有試料を恒温保持した。特別に仕上げた直径６ＩＩＡのポリ スチレンビード（単数）を該恒温保持用媒質中に置いた。

・１亘温保持（５６℃）１時間の後にビードを取出してリン酸塩で緩衝された食 塩−トウイン溶液で３回洗った。

次に洗浄後のビードを子牛肉滲出液゛炭酸塩緩衝液（１：１）中で３０分間３７ ℃に恒温保持した。既述の通り恒１Ｂ保持は任意であるけれどもＩリスチレンビ ード上の未反Ｗ、個所を飽和させることによって基質の変化を除くので゛同温保 持は望寸しい工程である。

子牛肉滲出液中の・同温保持の後にビードを再び３回洗浄してから新規のガラス 管内に置き１．５０の割合に希釈された０、５％７ラントイン流体含有のＰ　Ｂ 　Ｓ−トウイン液中の希釈されたウサギ抗−ｒｖ３１ｎ？％ｒと共に１時間恒温 保持した。次にこの１ｕ温保持工程後にビードを再び洗ってアルカリホスファタ ーゼと結合させたウサギのＦａｂに対するヤギ抗体と共に３７℃で更に１時間恒 温保持した。結合物を０．５１８ｓＡ含有のＰＢＳ−トウイン液中に希釈させた 。

酵素−抗体結合物と共に恒温保持した後にビードを取出し、再度０．３−のρＢ Ｓ−トウイン液で６回洗ってから新規のガラス管中に置き１０係ノエタノールア ミン緩衝溶液中の４−ニトロフェニルホヌフエートト共に・同温保持した。３０ 分間３７℃の保温の後ＫＯ０５−の１モル水酸化ナトリウム液の添加により反応 を停止させた。

次に溶液のＡ　Ｑ　Ｑ　ｒＢｌｌでの吸収値を読みとった。

例　２ 鶏胚のアラントイン含有流体からインフルエンザウィルスを採取した。余計な砕 片の除去のために１５００ｒｐｍの低速遠沈で試料を清澄化させた。上澄液を更 に３００００　ｒｏｍで３０分間遠沈して得られた啄レットを炭酸塩緩衝液中の ０．０３４サルコンル液の０．３−中に再分散させた。１個のポリスチレンビー ドを添加してから試料を５６℃ｌ／ｍ３Ｄ分間加熱した。

ビードを取出してＰＢＳ−トウイン液中′で３回洗浄してから子牛肉浸出液°炭 酸塩緩衝液（１：１）を用い３０分間３７℃で処理した。ビードを取出し再びＰ ＢＳ−トウイン液で３回洗ってから新しい管へ移し入れた。

ウサギのＭ−抗血清を１：２００希釈となるように添加しビードを１時間室温下 に・は温保持した。再びビードを取出してＰＢＳ−トウイン液で６回洗い新管へ 移し入れた。アルカリホスファターゼ（希釈度１：２５０　）と結合させたヤギ の抗−ウサギＦａｂ抗体を添加し１時間３７℃に恒温保持した。

この保温媒質からビードを取出しρＢ５−１ウィン液で３回洗って新管へ移し入 れ、この管の中で３７℃に３００分間ホスファターゼ素試験を行った。

例　３ 例２の一般的操作に従いインフルエンザウィルス含有アラントイン流体０．１５ −に対し０．０６ｑｂサルコシルの０．１５−を添加（サルコシルの最終濃度は ０．０３係である）することによシウイルスを直接アラントイン流体中で検査す ることができる。この場合には遠沈工程（２回共）は省略されている。ポリスチ レン被レット（単数）を添加して３０分間５６℃に恒温保持した。

から例２記載の繰作の残りの工程を行った。

例　Ａ 更に他の変改法として子牛肉浸出液中のウィルスを０．０６１サルコンル含有の 炭酸塩緩衝液を用いて１゜１に希釈した（最終濃度は０．０３係）。この混合物 の０．３ｍｌを１個の径６朋のポリスチレンビードと共に恒温保持用ガラス容器 内に置き３０分間５６℃で１１ｉ温保持した。ビードを取出しＰＢＳ−トウイン 液で３回洗ってからウサギＭ−抗血清と共に希釈度１：２００において１時間室 温下に恒温保持した。例２記１１ｉ１４の残りの工程を行ってこの試験を完了し た。この変改法に丸・いては例２記載の遠沈工程も後被覆工程も共に省略された 。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．　ヴイリオン内にＭ−タンパクを有するウィルスの検出方法において、下記 の諸工程即ち： （ａ）　Ｍ−タンがり又は〃露出されたＭ−タン・ぐりを有するウィルス断片〃 を優先的に吸着する試験表面とＩウィルス粒子を分裂させＭ−タンパクを放出さ せるか又（′ｉ露出Ｍ−タンパク含有断片を放出させるのに有効な１１ｊ温保持 用媒質〃との存在下にウィルス含有容疑試料を恒温保持し、それによって該Ｍ− タンパク又は該ウィルス断片を試験表面上に吸着させ；（ｂ）　Ｍ−タンパクを 吸着して有する該試験表面と／Ｔ被検ウィルスのＭ−タンがりに特異的であるＭ 抗体ＩとをＭ抗体の非特異的接着を抑制する恒温保持用媒質中で恒温保持し；そ して （Ｃ）　その後にｌ試験表面に対しＭ−タン・ξりによって免疫学的゛に吸着さ れたＭ抗体〃の吸着程度を検出する上記の諸工程を包含することを特徴とする上 記の方法０． ２．１Ｍ抗体のＦａｂ部分により免疫学的に吸尤される第二抗体Ｉを用いてＭ抗 体吸着後の試験表面を処理すること、但し第二抗体（ｄ、指示薬と結合したもの であること、該処理の後に該指示薬を検査することによりｌ試験表面−ＬのＭ− タン・９りを介して免疫学的に吸着されたｔａ　４／１．体ｌを検出することを 特徴とする請求の範囲第、２項に記載の力θ、。 ろ、　指示薬が酵素であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。 ４　工程（ａ）でＭ−タン・タンを吸着した試験表面を１Ｍ抗体と不反応性であ るタン・ぐり又はタン・やり分解物ｌと共に工程（ｂ）の遂行前に処理すること 、但し該タン・Ｐり又はタン・ぐり分解物は試験表面上の未反応タン・Ｐり吸着 個所（複数）を飽オロさせるに有効なものであることを特徴とする請求の範囲第 １．２又はろ項に記載の方法。 ５　ウィルス粒子のＭ−タン・ぐりに対し免疫学的に特異であるＦａｂ部分を有 する抗体。 ６　集合して免疫原性を増加したＭ−タンパクから製造されたＭ−タン・ぐりに 対する高度免疫抗血清であって少くともｉ　：１ｏｏｏｏの力価を有する該高度 免疫抗血清。