JPS58501120A - 生物学的活性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的活性ペプチド 本発明は生物学的活性ペプチド、とくにヒトカルシトニン前駆体の生物学的に活 性な隣接ペプチドに関する。カルシトニンは、分子量２３．５００の比較的小さ いペプチドホルモンで、主に成長、妊娠および授乳時のカルシウム欠乏時に骨格 保護の役を担っている。カルシトニンは哺乳動物の甲状腺中、また主により原始 的なを椎動物の後鯰管体および肺臓中にあるＣ−細胞によって分泌される。この ホルモンはまたヒトを含む種種のを椎動物種の視床下部、ならびにを索動物幽霊 海鞘の原始的脳中に集中している。カルシトニンはベージェット病のような骨交 替の増加という異常な情況で治療に用いられてきた。サケのカルシトニンのよう な化学合成された非ヒトカルシトニンはそのような治療に広く用いられている。

発明の名称が「ヒトカルシトニン前駆体ポリ蛋白質構造遺伝子」である本発明者 らの同日付出願では、組換えＤＮＡ技術によるヒトカルシトニンの製造を記載し たが、その記載は本明細書に引用しである。カルシトニンのその製造法により、 複雑で費用のかかるペプチド化学を用いずに、ヒトホルモンと同じ生産物を供給 でき、しかも好都合なことには、長期間投与時の好ましくない免疫反応の問題か ら解放される。ｍ　ＲＮＡに指令される無細胞蛋白質の合成の研究により、カル シトニンが高分子量前駆体蛋白質として合成されることが証明されている。続く 組換えＤＮＡ技術の応用によりこの前駆体蛋白質の構造遺伝子のクローニングを 行った。

クローン化されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列決定により、アミノ末端およびカ ルボキシル末端に以前は知られれていなかった潜在的ペプチド配列が隣接して℃ ・る前駆体ポリ蛋白質のカルボキシル末端に面してヒトカルシトニンが存在する ことがわかった。

これらの隣接配列は有用な生物学的活性を持ち、診断に使用できるペプチドを供 給することが見出された。

従って、本発明は、ヒトカルシトニンの末端部隣接ペプチド配列、あるいはその 主要部に相当する新規ペプチドを含む。

本発明のペプチドはとくに実質的に純粋なペプチドである。

本発明の新規ペプチドであるヒトカルシトニンの隣接ペプチド配列はＣ末端では 全体に、Ｎ末端では部分的に第１図に示した配列である。第１図はヒトカルシト ニン前駆体ポリ蛋白質のヌクレオチド配列を示している。Ｎ末端配列は−３６か ら一１配列まででＣ末端配タリは＋１から＋２５までである。カルシトニンは１ から３２までである。カルシトニン配列の両側の枠部位すなわち−２，１および ＋１から＋４までは、蛋白質加水分解過程が予想される部位のアミノ酸を示し、 このアミノ酸は分泌したペプチドには多分存在しない。

とくに好適なペプチドはカルボキシル末端ペプチド配列を示すもので、ことに＋ ５から＋２５まですなわち、Ａｓｐ−Ｍｅ　ｔ−３ｅ　ｒ　−３ｅ　ｒ−Ａｓｐ −Ｌｅ、ｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｈｉ　ｓ　−Ａｒｇ−ＰｒＯ−ＨｉＳ− Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｍｅｔ　Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ　Ａｌａ−Ａｓｎのペプチド であり、以後ＰＤＮ−２１という。また特に興味深いのはアミン末端ペプチド配 列で、ことに−２７から−１４までのアミノ酸配列からなるペプチド、すなわち ｔｙｒ−ｖａｌ−ｇｌｎ　−ｍｅ　ｔ−１ｙｓ　−ａ　１ａ−ｓｅ　ｒ−ｇ　ｌ ｕ−１ｅｕ−ｇｌｕ−ｇｌｎ−ｇｌｕ−ｇｌｎ−ｇｌｕのペプチドであり、以後 ＰＹＥ−１４と（・う。

これらのペプチドの名称はタテモｌ−（ＴａｔｅｍｏｔＯ）およびムット（Ｍｕ ｔｔ　）の用語（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

ＳＣｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７８．６６０３−６６０７（１９８１）］に従う。

ＰＤＮ−２１は高度の生物学的活性を持っていることがわかった。すなわちＰＤ Ｎ−２１は催乳ホルモン（プロラクチン）放出に向甲状腺性ホルモン（ＴＲＨ） と同等の効果がある。さらに血漿カルシウムの低下にもカルシトニンとほぼ等し く・効果をもっている。たとえばラットにＰＤＮ−２１を静脈注射すると、［カ ルシトニン丁生物分析方法で定量したとき、血漿カルシウム濃度の低下を伴う。

免疫学的にもＰＤＮ−２１は生体内で循環すること′が水膜されるので、これは 神経ペプチドとしてまた、カルシウム調節において生理学的役割を持つヒトカル シトニン前駆体の新規なホルモン様分解産物である。

さらに、ＰＤＮ−２１をカルシトニンとともに注射すると有利な相乗効果を引き 起すらしいことがわかった。

すなわちＰＤＮ−２１とカルシトニン各々の効果の合計から予期されるよりも著 しい血漿カルシウムの低下が起る。本発明の他のペプチドは同様な神経ペプチド 活性、およびカルシウム調節活性を示しＰＤＮ−２１と同様の相乗効果を示すと 考えられる。

本発明は、本発明のペプチド例えばＰＤＮ−２１またはＰＹＢ−１４を含む組成 物、とくにペプチドと薬理学的に許容できる希釈剤、賦形剤、防腐剤などとの組 合せからなる薬理的に許容できる、すなわち注射可能な組成物をも含む。本発明 のとくに好ましい態様はペプチド、すなわちＰＤＮ−２１またはＰＹＥ−１４と カルシトニンとの組合せからなる相乗的組成物を含む。

本発明のペプチドは、いかなる適当な手法でも調製できる。それらペプチドは当 業者に公知の方法たとえば固相ペプチド合成方法を用いて部分的または完全に化 学的合成により調製できる。本発明のペプチドはまた組換えＤＮＡ技術を用いて も調製できる。

本発明のペプチドは、カルシトニンと同じ方法で直接的打撃に対して骨を保護す るため、また破骨細胞崩壊を抑制するための、治療に用いることができる。その ペプチド、例えばＰＤＮ−２１は、骨吸収が増加する骨障害、例えばベージェッ ト病あるいは骨多孔症において、単独であるいはカルシトニンと組合せて用いた 場合治療活性を持っていると思われる。そのペプチドはまた神経ペプチドとして も用いることができる。たとえば、プロラクチン放出因子として働くＰＤＮ−２ １は女性の授乳の誘導または延長に有用でありまた脳下垂体プロラクチンの放出 におけるその役割から男性の避妊薬として有用であることが証明できる。

本発明のペプチド、とくにＰＤＮ−２ｉおよびＰＹＥ−ｉ　４はまた血清カルシ トニン量の増加にともなって起る疾病の診断に関連して用いることかで芝る。た とえば、それらのペプチドはカルシトニン前駆体ある℃・はその隣接ペプチド配 列の免疫的検出および定量に用いるポリクロナールまたはモノクロナール抗体の 生産に用いることができる。従って本発明は、そのペプチドに対する抗体、例え ば、抗ＰＤＮ−２ｉ抗体および抗ＰＹＥ−１４抗体を含む。そのような抗体は甲 状腺の髄様癌のような甲状腺疾病の診断に用いることができるし、またカルシト ニン前駆体またはその隣接ペプチド配列の子宮外分泌をともなう疾病、たとえば 、肺臓の燕麦細胞癌、癌様肺瘍、消化管および肺臓の内分泌性癌および他の悪性 腫瘍の診断に用いることもできる。

以下の実施例では、制限を目的とするものではないが例示として、ヒトＣ末端隣 接潜在ペプチドＰＤＮ−２１およびアミノ末端ペプチドＰＹＥ−０１４の一部を 固相法で合成し、生産物の固定および均質性の確認をアミノ酸分析、高圧電気泳 動および逆相高圧液体クロマトグラフィーで行った。これらは、下記のごとく、 生物学的活性の証拠を得、さらにヒト組織および血清中の存在を確認するために 必要な抗血清を増加するために用いた。

実施例１ 「カルシトニン」生物分析は平均体重５０１（分布域４７−５３１）の雌ウィス ター系ラット群を用いて行った。６匹のラットを対照群（グループ１）として緩 衝液のみを注射し、他のラット群（グループ２−７）に対照群の緩衝液と同容量 の種々カルシトニン、ＰＤＮ−２１およびＰＤＮ−２ｉとカルシトニンの組合せ を静脈注射した。ＰＤＮ−２１を１μｇ／ラットの割で注射した群（グループ４ ）は７匹、他のグループは各５匹であった。注射してから６０分後に全グループ のラットを殺し、各ラットの血液を大動脈から採取し、そのカルシウム量を公知 の方法で定量した。

結果を下記第１表およびグラフで第２図に示した。

第２図は注射した組成物量に対する血清カルシウム濃度の減少′を表わしたもの である。各ラットに対するカルシトニン投与量（曲線１）は公知の一般的基準で あるｍＵ　（ＭＲＣミリ単位）で示し、用いたＰＤＮ−２１の投与量（曲線２） はラット１匹当りのペプチド量をμｇで示した。これらの結果は、カルシトニン と同様、ＰＤＮ−２１の注射が血漿カルシウムを低下させることを示して℃・る 。さらにカルシトニンとＰＤＮ−２１の併用投与（曲線５）は、少なくともカル シトニンｌ　ｍＵとＰＤＮ−２１１μｇ／ラットの高用量では相乗効果を与える ようである。

２．６８　伍−２，５７８ ２，０５ｍ−２，１４０Ｐ＜０．００１　対照比１．９６　市−２，２１２Ｐ＜ ０．００１　対照比グループ４−　ＰＤＮ−２１１μｇ／ラット１．７７　伍− ２，２２７Ｐ＜０．０１　対照比１．７５　ｍ＝２．２０３　Ｐ＜０．１　（Ｎ Ｓ）対照比１．３６　伍−１，７１６Ｐ＜０．００１　対照比Ｐ　＜　０．０２ 　グループ２比 ２．１２　至＝２．２３６　Ｐ＜０．００１　対照比ＮＳ　グループ６比 実施例２ 予備実験では、血漿カルシウムに対する一ＰＤＮ−２１とヒトカルシトニン（ｂ ＣＴ　）の影響の経過が同じであった。酢酸緩衝液中のペプチドを雌のウィスタ ー系ラット〔平均重量４５ｇ、分布域４３−４８、オックスフォードシャーｅラ ボラトリイ・アニマル・コロニーズ（Ｏｙ：ｆｏｒｄｓｂｉｒｅ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｏ１ｏｎｉｅｓ　）（１９７６）社〕の尾静脈に注 射し。６０分後に血液を大動脈から採取し無作為生物分析〔マツキングイア・ア イ（ＭａｃＩｎｔｙｒｅ、１．　）　＋ガランテ・エル畳ニス（Ｇａ１ａｎｔｅ 、Ｌ、Ｓ、　）およびヒルヤード・シシ・ジエイｖｘ／ＩＡ（ｅａｓ）、クーレ フ　ｊ　ルト＋＋　１７（ｇｕｂｌｅｎｃｏｒｄｔ、Ｆ、　）およびパルチルハ イマー・エイテ（Ｂａｒｔｅｌｂｅｉｍｅｒ、Ｈ，）編、６２３−６３４（スプ リンゲル〜フェアラグ、ハイデルベルグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈ ｅｉｄｅｒｂｅｒｇ　）　＋　１９８０１にかけた。血漿カルシウムをギンドラ −・イ・エム（ＧｉｎｄＬｅｒ２ｇ０Ｍ、）およびキング・ジエイ・ディー（Ｋ ｉｎｇ、Ｊ、Ｄ、　）　［Ａｍｅｒ。

Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｐａｔｈ、　５８　、３７６−３８２　（１９７２）　）の方法 によって比色測定し、その値を原子吸光スペクトルによって確認した。結果を第 ６図に図示する。各点は６匹のラットの平均である。

○　ＰＤＮ　−２１ △　ｈＣＴ〔ＷＨＯ第１国際文献、生物分析のためのカルシトニンホルモンの調 製（ＷＨＯ１ｓｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ、ＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｐｒｅ ｐｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣａＬｃｉｔｏｎｉｎ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ｆｏｒＢｉ ｏａｓ’ｓａｙ　）　、７０　／　２３４　、ｆ・ナショナル・インステイテユ ート・フォー・バイオロジカル・スタンダーズ・アンド・コントロール（ｔｂｅ 　Ｎａｔｉｏｎａ、ｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｆｏｒ　Ｂｉｏｌａｇｉｃａｌ　５ ｔａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　）　］−ｈｃＴ＋　ＰＤＮ−２１ （’　８０　［１ｆｌｇのＰＤＮ　−２１をカルシトニンの各投与量とともに注 射した）。

変動分析により６処理グループで有意（＜０．００１）な投与量関連血漿カルシ ウム差が見られた。各点をならした曲線は目測のデータに適合した。プロビット 変換は５０％反応（ＥＤ　５　［１）を与える投与量の計算を可能にした。それ らはｈＣＴおよびＰＤＮ　−２１に対してそれぞれ０．７１　ＭＲＣミリ単位と ２４　ｎｇであった。力価は対数投与量反応が直線である投与量減上でｈｃＴに よって計算し、ｂＣＴ　十ＰＤＮ　−２１のグループで０．０１．７ミリ単位ｂ ＣＴ等量／　ｎｇ　ＰＤＮ　−２１と５．１１ミリ単位に＋ｃＴ等量／ミリ単位 ｈＣＴを得た。その６力価”は対数投与反応領域の直線部分上でカルシウム量に 与えるこれら物質の相対的効果のみを反映する。前もって行った６回の作為的実 験では本質的に同じ結果が得られた。

実施例６ 第４図は、２種濃度のＰＤＮ　−２１（２，８６Ｘ　１　［）　’Ｍと２．８６ 　ｘ　１０−６Ｍ　）およびＴ’ＲＨ（２，８６Ｘ　１０−’　Ｍと２．８６　 ｘ　１０−５Ｍ　）の１０分間パルス（横棒で示す）で潅流前、潅流中および潅 流後の下垂体前葉細胞カラムから連続的に１１ｎｌずつ採取した分画中のプロラ クチンの濃度を示す。ＴＲＨと同様にＰＤＮ　−２１は　度に比例してプロラク チン放出を刺激した。基礎的分泌以上に放出するプロラクチンの総量として見る と等量投与量（２，８６Ｘ　１０−６Ｍ　）のＰＤＮ　−２１とＴＲＨは同量の プロラクチンを放出した。’Ｉ’ＲＨ（２，８６Ｘ　１０−５Ｍ　）によって放 出されるプロラクチン量に比較“してＰＤＮ　−２１は５２．１％、ＴＲＨは５ ０．６％を放出した。ＰＤＮ　−２１の低投与量（，２，８６Ｘ　１０−７Ｍ　 ）はＴＲＨ（２−８６ｘ１０−５Ｍ　）に比較して６５．６％を放出した。

下垂体細胞カラムはスペイ）　（Ｓｐｅｉｇｂｔ　）およびフインク（Ｆｉｎｋ 　）の方法（Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒ、８９　＋　１２９−１５４（１９８１））に従 って調製した。簡単に説明すると４匹の雄つイスクー系ラット〔体重２００〜２ ５０．９；ブツ／ユｅアニマル・プリーディング・ステーション（Ｂｕｓｈ　Ａ ｎｉｍａｌ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　５ｔａｔｉｏｎ　）　：Ｘ−シンバラ（Ｅｄｉ ｎｂｕｒｇｂ　）提供〕の下垂体前葉腺の細胞をホゾキング（Ｈｏｐｋｉｎｓ　 ）およびファルクハル（Ｆａｒｑｕｈａｒ　）の方法（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ 、　５９　、２７６−３０３（１９７ろ）〕に従って分離した。得られた細胞を バイオデルｐ＝２（ＢｉｏｏｅｌＰ２）（２００−４００メツシユ、バイオ−ラ ドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｉｌｓ　）、リッチモンド （Ｒｌｃｂｍｏｎｄ　）、カリフォルニア（Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　）　、　Ｕ 、Ｓ、Ａ、〕と混合し、潅流のための単細胞カラムをロウリイ（Ｌｏｕｒｙ　） 　（Ｊ、Ｅｎｄｎｃｒ。

６２１６６−１６４（１９７４）〕およびギリースとロウリイ（Ｇ１１ｌｉｅｓ 　＆　Ｌｏｕｒｙ　）　（Ｅｎｄｏｃｒｌｎｏｌ、ｏｇｙ１０３．５２１−５２ ７（１９７Ｂ））の記載に従って調製した。カラムを６７°Ｃで水浴中に浸し、 ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　）の改良イーグル（Ｅａｇｌｅ　）培地−１％ ＢＳＡ　（ＤＭＥＭ　−ＢＳＡ　）中０．５　ｍｌ／　ｍｊ、ｎの流速で９５％ ０２：５％ＣＯ２のガス潅流を行った。３時間カラムを洗浄後、ＰＤＮ　−２１ とＴＲＨの影響な調べた。試験したホルモンの各パルスはＤＭＥＭ　−ＢＳＡの み２０分間隔で分離した。

図で示すと、　ＰＤＮ　−２１は濃度に比例してプロラクチン放出を刺激し、モ ル比ではＴＲＨとはソ同じ力価で生体外での前標識したマウスの頭蓋上からの細 胞媒介４５Ｃａ放出阻害におけるヒトカルシトニンの効果のカルシトニン製剤に 対するマウス骨の反応を研究する方法はレイノルズ魯ジエイ・ジエイ（Ｒｅｙｎ ｏｌｄｓ、Ｊ。

Ｊ、）、ミンキンＯシー（Ｍｉｎｋｉｎ、Ｃ，）およびパーソンズ・ジエー・ニ ー（Ｐａｒｓｏｎｓ、Ｊ、Ａ、　）によって詳細に記載されている（’　Ｃａ１ ｃｉｆ、Ｔｉ５ｓ、Ｒｅｓ、　４　＋　３５０−３５８（１９７０））。培地中 への４５Ｃａの細胞媒介放出は同じ親から生まれた６日令の前標識マウスの死亡 体外移植組織によって培地に放出される交換可能な４５（ａの量を生存処理体外 移植組織による放出量から引（・て計算した〔レイノルズ・ジエイ・ジエイ（Ｒ ｅｙｎｏｌｄｓ、Ｊ。

Ｊ、）、オルガン・カルチャー・イン・バイオメデイ（Ｂａ１ｌｓ、Ｍ、＆　Ｍ ｏｎｎ１ｃｂｅｎｄａ＋ｎ、Ｍ、　）　騙＋　３５５−３６６、ケンブリッジ・ ユニバーシティ・プレス（ＣａｍｂｒｌｄｇｅＵｎｌｖｅｒｓｔｔｙ　Ｐｒｅｓ ｓ）　、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｘｄｇｅ　）　。

１９７６参照〕。結果を下記第■表に示す。処理体外移植組織の数はかっこ中に 示し、データは４８時間の生体外移植処理後得られたものである。ｂＣＴよりも ＰＤＮ　−２１で高い投与量が必要であつ１こが、ｈｃＴとＰＤＮ　−２１に対 する投与量反応曲線が並行でないことと、４８時間培養条件下のこれらペプチド の比安定性が不明なことから１力価」比は計算しなかった。

第　■　表 記録された結果によれは、ＰＤＮ　−２１はラットの血漿カルシウム低下に高い 活性を示す（とくに第６図参照）が、最高の効果はカルシトニンのそれよりも少 い。

その結果はまた、ＰＤＮ　−２１の最高投与量を加えるとｈＣＴの力価が５倍に なることを示して℃・る。さらにカルシウムに対するＰＤＮ　−２１の効果はカ ル７トニ／の効果に付加されたものである（第６図）ので、そのペプチドは違っ た受容体に作用すると考えろｎる。その上、その作用は腎切除動物にお（・ても 明らかなので、カルシウムの欠乏というよりはむしろ、多分骨を含めて、再配分 に起因していると考えられる。これは培地中の４８時間マウス頭蓋冠移植組織か らの結果と合致して（・る（第■表）：前標識した骨からの４５（ａ　出に対す るＰＤＮ　−２１の直接の効果には明らかな証拠かある（高投与量Ｐ＝０．０２ ）。

血漿カルシウムへのこの効果が高度に特異的であることは注目丁べきことである 。ｊなわち、血漿ナトリウム、カリウム、アルブミンならび血漿リン酸には効果 が見られな（・０この発見は血漿カルシウムとリン酸の両方を低下させるカルシ トニン〔グドムンドソン・ティー・ヴイ（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ、Ｔ、Ｖ−） 　、　マツキンタイア・アイ（ＭａｃＩｎｔｙｒｅ、１．’　）およびソリマン ・エイチ・ニー４７７（１９６６）］とＰＤＮ　−２１とを明確に区別丁ム実施 例６および第４図はＰＤＮ　−２１が濃度に比例してプロラクチン放出を刺激し たことを示して℃・る。プロラクチン放出はドパミンによって阻害されるが生理 学的研究により、プロラクチン放出因子（ＰＲＦ　）が存在し、それはプロラク チンの神経系の調節に重要であることが示された〔グロスペノール・シー・イー （Ｇｒｏｓｖｅｎｏｒ、Ｃ，Ｅ、　）とメナ会エフ（Ｍｅｎａ＋Ｆ、）　’ｒＴ ＋’（Ｈはプロラクチンを放出するが、他のペプチドがプロラクチン放出機構に 関与して℃・ることは明らかである〔グロズベノール（Ｇｒｏｓｖｅｎｏｒ　） 　５　、　ｌｏｃ、ｃｉｔ、およびレイタリン・ニス（Ｒｅ１Ｃｂｌｌｎ、Ｓ、 　）　＋サバーステイン中アール（５ａｐｅｒｓｔｅｉｎ、Ｒｏ）、ゾャクソン ・アイ拳エム・ディー（Ｊａｃｋｓｏｎ、１．Ｍ、Ｄ、　）　＋ボイド・ニー・ イー・ず・サード（Ｂｏｙｄ　、　Ａ、Ｅ、＋ｍ）およびバテル・ワイ４２４（ １９７６））。そして本発明者らのデータはＰＤＮ　−２１をＰＲＦの１種と考 えるべきことを水製している。

以上から、まずヒトカルシトニン前駆体は少な（とも２つの生物学的に活性な分 解産物を持つ真のポリ蛋白質であり、ブローオビオメラノコルテンで代表される 前駆体蛋白質のグループに属することが認められる。

次に生体外プロラクチン放出へのＰＤＮ　−２１の力価は、それが生体内ＰＲＦ の１種と考えるべきであり、従って神経ペプチドとしての治療的役割を持ちうろ ことを示している。三番目に、健康時のカルシウム調節に深（かかわっているこ とに加えて、ＰＤＮ　−２１は治療的潜在能力を持っている。か（のごとく、カ ルシウムへの固有の活性はカルシトニン活性の強化と共に、ＰＤＮ　−２１が、 現在ヒトカルシトニンをより抜きの処方とするベージェット病の治療に役立つこ とを示しており〔マツキンタイア・アイ（ＭａｃＩｎｔｙｒｅ、１．）　、　エ バンス・アイ・エム・ニー（Ｅｖａｎｓ、１９Ｍ、Ａ、　）　、ホビッッ・エイ テ・エイチ・ジー（Ｈｏｂｉｔｚ、Ｈ，Ｈ，Ｇ−）　、ジョブリン・ジー・エフ （Ｊｏｐｌｉｎ、（）、Ｆ、）およびステーブンンンＯジエー・シー（５ｔｅｖ ｅｎｓｏｎ、Ｊ、Ｃ１）　、　Ａｒｔｈ、Ｐｂｅｕｍ。

２３．１１３９−１１４７（１９８０））、さらに、女性の閉経期後の骨格崩壊 の主原因となる閉経期後の骨多孔病の予防および治療に単独でまたカルシトニン および他の化合物と組合せて用いることができることを示して℃・る。カルシト ニンと同様、ＰＤＮ　−２１はまた骨の悪性沈着に起因する血漿カルシウム増加 の治療に役立つ。これの最も一般的な原因は骨格中の二次沈着を伴う胸部の癌で ある。

本発明者らはこれまで、ヒトカルシトニンポリ蛋白質ｍＲＮＡ中にコードされた ペプチドＰＤＮ　−２１の生物学的活性および治療潜在力の例を述べた。本発明 者らは、公知の方法を用いて、カルシトニンポリ蛋白質中のカルシトニンに隣接 する他のペプチド配列が診断的潜在能力をもつポリクロナールまたはモノクロナ ール抗体生産のだめの有用な抗原を形成するペプチドであるかどうかを同定する 方法の例を示す。適当なペプチド抗原の基準には２要素がある。第１にペプチド が親蛋白質内で、抗体結合に有利な領域内にあること、第２にこのペプチドが簡 単、迅速に放射能標識でき、ラジオイムノアッセイが容易に行えることである。

ここで、ペプチドＰＹＥ　−１４がこれらの両基準から判断して適当であり、従 って抗原として用いた場合、ＰＹＥ’　−’　１４ペプチドを含めて、カルシト ニンのアミノ末端隣接ペプチド配列の検出に有用なポリクロナールあるいはモノ クロナール抗体を生じるであろうということがわかる。

か（のごとく、本発明者ら−は分子の外側に存在すると思われろヒトカルシトニ ンのアミノ末端隣接ペプチド配列の領域を２種の別々の方法で決定した。第一の 方法〔チョウ・ビー・ワイ（Ｃｈｏｕ、Ｐ、Ｙ、　）とファスマ４５−１４８’ 　］は二次構造領域を予言する（第５図参照）。これは−２０（Ｇｌｕ　）から −１４（Ｇｌｕ　）までのアミノ酸と共役するα−フエリックスの領域があるこ とを示しており（第１図参照）、従って抗原性であることが証明される分子表面 上の一部位を提供することができるであろう。第二の方法〔ホップ・ティー・３ ８２４−３８２８１は最大の極在親氷点を見出すためにアミノ酸配列分析により 蛋白質抗原決定基の位置を決める方法を提供する。この技術の応用によりアミン 末端隣接ペプチド抗原も親水性の領域（第６図”星印”参照）が上記と同じペプ チド（−２０（Ｇｌｕ）から−１４（Ｇｌｕ　）まで〕に該当することがわかっ た。

しかしながら、他の公知の小ペプチドはＧｌｕとＧｉｎに富んでおり、さらにこ れらのアミノ酸は容易に放射能標識できないので、またその付加アミノ酸は抗原 として使用するときＰＹＥ　−１４に付加的特異性を与え、アミン末端チロシン が１２５工でのヨード化部位を与えるので本実例では上記のごとくＰＹＥ−１４ （−２７から−１４まで、第１図参照）の合成を選んだ。

ＰＹＥ　−１４はカルシトニン前駆体ポリペプチド中のペプチドの実例で、ヨー ド化が可能なチロシン残基を含んで（・る。チロシン残基は例えばＰＤＮ　−２ １には存在しな（・ので、そのペプチドは抗原としては用いることができるが、 ラジオイムノアッセイに用いるためには第２のペプチドを構成しなければならな い。そのようなペプチドはペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末 端にチロシン残基が付加されたものである。

カルシトニンポリ蛋白質の分解産物（例えばＰ、ＤＮ　−２１）あるいは隣接領 域中の高い抗原性が予想されるペプチドに対する抗体は甲状腺疾病ならびにカル シトニンポリ蛋白質の全体的または部分的子宮外合成および分泌を伴なう疾病の 診断に非常に役立つことが証明されるであろう。

浄書）′内容に変更なし） とン／杓１７眞〕Ｖ７勺イ／１１敲　７（ＭＲＣミリ潜呵女） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、６ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ２、発明の名称 孝」勿柚ｈ〉老へ・贈フ゛今ト ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ５、補正命令の日付 昭和５８年　４　月　１２日 ６、補正により増加する発明の数 国際調査報告 Ｉｍｖｎ−ｔ、−ｎ１Ａ□ｈｔ−＋、ｏ−＋ｉｏ、ｐＣＴ／ＧＢ　８２１００２ ０８　２第１頁の続き ■８２１０２９７

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　ヒトカルシトニン前駆体配列中に含まれるアミノ酸配列を含む、ヒトカル シトニン以外のポリペプチド。 ５２、ヒトカルシトニン前駆体のカルボキシル末端またはアミン末端隣接ペゾチ ド配列またはその主要部である、請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ６、　アミノ酸配列 −ａｓｐ−ｍｅｔ７．ｓｅｒ−ｓｅｒ−ａｓｐ−１ｅｕ−ｇｌｕ−ａｒｇ−ａｓ ｐ−ｈｉｓ−ａ　ｒｇ−ｐ　ｒｏ　−ｈ　ｉ　ｓ　−ｖａ　ｌ　−ｓ　ｅｒ−ｍ ｅｔ−ｐｒ　ｏ−ｇｉｎ−ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎを含む、請求の範囲第１項記 載のポリペプチド。 ４、　アミノ酸配列 −ｔｙｒ−ｖａｌ−ｇｌｎ−ｍｅｔ−１７ｓ−ａｌａ−ｓｅｒ−ｇｌｕ−１ｅｕ −ｇｌｕ−ｇｌｎ−ｇｌｕ−ｇｉｎ−ｇｌｕ を含む、請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ５、請求の範囲第１項から第４項のいずれか１項に記載のポリペプチドと薬理的 に許容される担体とからなる組成物。 ６、注射可能な組成物である、請求の範囲第５項記載の組成物。 Ｚ　さらに少な（とも１つの生物学的活性化合物を含む請求の範囲第５項または 第６項記載の組成物。 ８、生物学的活性化合物がカルシトニンであることを特徴とする請求の範囲第７ 項記載の組成物。 ９　請求の範囲第１項から第４項のいずれか１項に記載のポリペプチドに対する 抗体。 １０、モノクロナール抗体である、請求の範囲第９項に記載の抗体。 １１、抗−ＰＤＮ　−２１（抗体） １２、抗−ＰＹＥ　−１４（抗体） １６、アミンあるいはカルボキシル末端に付加したチロシン残基なもつ請求の範 囲第１項から第４項のいずれか１項に記載のポリペプチド。 １４、チロシン付加ＰＤＮ　−２１。 １５、チロシン付加ＰＹＥ　−１４゜