JPS5844211B2 - 血中ケトン体の高感度簡易比色分別定量法 - Google Patents
血中ケトン体の高感度簡易比色分別定量法Info
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- JPS5844211B2 JPS5844211B2 JP10815378A JP10815378A JPS5844211B2 JP S5844211 B2 JPS5844211 B2 JP S5844211B2 JP 10815378 A JP10815378 A JP 10815378A JP 10815378 A JP10815378 A JP 10815378A JP S5844211 B2 JPS5844211 B2 JP S5844211B2
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/64—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving ketones
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は血中ケトン体、殊に血清中のD−3−ヒドロキ
シ酪酸を酵素的にアセト酢酸へ転換し、既存のアセト酢
酸とともに総ケトン体として定量し、さらには総ケトン
体量から既存のアセト酢酸量を減じてD−3−ヒドロキ
シ酪酸の定量を行なう高感度簡易比色分別定量法に係る
。
シ酪酸を酵素的にアセト酢酸へ転換し、既存のアセト酢
酸とともに総ケトン体として定量し、さらには総ケトン
体量から既存のアセト酢酸量を減じてD−3−ヒドロキ
シ酪酸の定量を行なう高感度簡易比色分別定量法に係る
。
糖尿病患者の臨床診断に際しては、血中のケトン体量を
測定することが極めて重要であり、各種測定方法が提案
され、また症状によって各種ケトン化合物含量に相違が
認められるので個々のケトン体量を測定することが極め
て意義あるものとされている。
測定することが極めて重要であり、各種測定方法が提案
され、また症状によって各種ケトン化合物含量に相違が
認められるので個々のケトン体量を測定することが極め
て意義あるものとされている。
しかしながら、現在一般に使用されている二重ロプルシ
ツド法並びに酵素法にあっては、前者は半定量法であっ
て不正確であり、後者はその操作手技が極めて煩雑であ
ると謂う欠陥を有しており、従って精度が高く且つ操作
が容易な測定法の開発が望まれていた。
ツド法並びに酵素法にあっては、前者は半定量法であっ
て不正確であり、後者はその操作手技が極めて煩雑であ
ると謂う欠陥を有しており、従って精度が高く且つ操作
が容易な測定法の開発が望まれていた。
斯かる要望に沿い、本発明者等は血清中のアセト酢酸量
を感度及び精度に優れたジアゾニウム塩とのカップリン
グ反応を利用して比色定量する方法を提案した(特願昭
53−86803号特開昭55−15004号公報)。
を感度及び精度に優れたジアゾニウム塩とのカップリン
グ反応を利用して比色定量する方法を提案した(特願昭
53−86803号特開昭55−15004号公報)。
この方法によれば、血清中のアセト酢°酸量は容易に且
つ高精度にて求めることはできるが、別のケトン体であ
るD−3−ヒドロキシ酪酸は定量不可能である。
つ高精度にて求めることはできるが、別のケトン体であ
るD−3−ヒドロキシ酪酸は定量不可能である。
斯くて本発明の主目的は血中のD−3−ヒドロキシ酪酸
を酵素的にアセト酢酸に転換し、既存のアセト酢酸とと
もに総ケトン体として定量し、さらOこは前掲特願昭5
3−86803号特開昭55−15004号公報に記載
の方法と組み合せて血中のD−3−ヒドロキシ酪酸を定
量する方法を提供することである。
を酵素的にアセト酢酸に転換し、既存のアセト酢酸とと
もに総ケトン体として定量し、さらOこは前掲特願昭5
3−86803号特開昭55−15004号公報に記載
の方法と組み合せて血中のD−3−ヒドロキシ酪酸を定
量する方法を提供することである。
本発明によれば、血清中のD−3−ヒドロキシ酪酸は酵
素的酸化によりioo%アセト酢酸に変ぜられ、このた
めには3−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素及びNAIMニコ
チンアミドアデニンジヌクレオタイド)が使用されるが
、さらにはNADの再生産を行ない、酵素的転換を完全
に行なうために熱性ブドウ酸及び乳酸脱水素酵素が使用
される。
素的酸化によりioo%アセト酢酸に変ぜられ、このた
めには3−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素及びNAIMニコ
チンアミドアデニンジヌクレオタイド)が使用されるが
、さらにはNADの再生産を行ない、酵素的転換を完全
に行なうために熱性ブドウ酸及び乳酸脱水素酵素が使用
される。
D−3−ヒドロキシ酪酸が酸化されて生成したアセト酢
酸及び血清中に既存のアセト酢酸はジアゾニウム塩と反
応せしめられてアゾ化合物となされるが、本発明におい
ては斯かる反応関与体であるジアゾニウム塩としてp−
ニトロフェニルジアゾニウムフルオロポレートが使用さ
れる。
酸及び血清中に既存のアセト酢酸はジアゾニウム塩と反
応せしめられてアゾ化合物となされるが、本発明におい
ては斯かる反応関与体であるジアゾニウム塩としてp−
ニトロフェニルジアゾニウムフルオロポレートが使用さ
れる。
この目的に供し得るものとして従来知られているジアゾ
ニウム塩としては2,5−ジクロロベンゼンジアゾニウ
ムクロライドが存するが、これは液状であり且つ不安定
であるので測定当田こ新たに調製しなければならないと
謂う煩られしさがあり、しかも発色生成物が不安定であ
るので測定値がバラツクという欠点を有している。
ニウム塩としては2,5−ジクロロベンゼンジアゾニウ
ムクロライドが存するが、これは液状であり且つ不安定
であるので測定当田こ新たに調製しなければならないと
謂う煩られしさがあり、しかも発色生成物が不安定であ
るので測定値がバラツクという欠点を有している。
一方、本発明に使用される上記p−ニトロフェニルジア
ゾニウムフルオロポレートは結晶性粉末であり、冷暗所
に保存すれば数ケ月に亘って安定であり、水溶性でアセ
ト酢酸との反応性が良く、しかも発色生成物が安定であ
ると謂う利点を有している。
ゾニウムフルオロポレートは結晶性粉末であり、冷暗所
に保存すれば数ケ月に亘って安定であり、水溶性でアセ
ト酢酸との反応性が良く、しかも発色生成物が安定であ
ると謂う利点を有している。
尚、本発明方法の実施に際して生ずる諸反応を示せば下
記の通りである。
記の通りである。
次に試薬及び操作等に関連して本発明方法を更に説明す
る。
る。
試薬
(1)トリス緩衝液
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン溶液2川濃度
のものを使用。
のものを使用。
(2)無性ブドウ酸
20mM水溶液を使用。
(3)NADにコチンアミドアデニンジヌクレオタイド
) β−Nicotinamide Adenine Di
nuc+eotide(βNAD 、β−DPN) ・C2□H27N70□4P2・3H20グレード■(
KOHJIN Reagent) 20 mM濃度に調整 (4)3−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素 菌ドイツ在ベーリンガー・マンハイム社 (Bocbri nger Mannhe im Gm
bH)製のもの(グレード■) 15単位/mlに調整(0,01m使用されるので使用
量は0.15単位) (5) LDH(乳酸脱水素酵素) アメリカ合衆国在シグマ・ケミカル社(SigmaCh
emical Co−)製のもの(タイプ■)7250
単位/7rLlに調整(0,0’1−使用されるので使
用量は72.5単位であるが、更に稀釈して2単位程度
になしても使用量として充分である) (6)クエン酸緩衝液 0.23Mのクエン酸溶液と0.23Mのクエン酸ナト
リウム溶液を混合してpH4,5に調整する。
) β−Nicotinamide Adenine Di
nuc+eotide(βNAD 、β−DPN) ・C2□H27N70□4P2・3H20グレード■(
KOHJIN Reagent) 20 mM濃度に調整 (4)3−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素 菌ドイツ在ベーリンガー・マンハイム社 (Bocbri nger Mannhe im Gm
bH)製のもの(グレード■) 15単位/mlに調整(0,01m使用されるので使用
量は0.15単位) (5) LDH(乳酸脱水素酵素) アメリカ合衆国在シグマ・ケミカル社(SigmaCh
emical Co−)製のもの(タイプ■)7250
単位/7rLlに調整(0,0’1−使用されるので使
用量は72.5単位であるが、更に稀釈して2単位程度
になしても使用量として充分である) (6)クエン酸緩衝液 0.23Mのクエン酸溶液と0.23Mのクエン酸ナト
リウム溶液を混合してpH4,5に調整する。
(7)ジアゾニウム塩試薬
[)合成
p−N02C6H4N’iち+HNO2+HBF 4→
p −No206H4N2BF4+ 2 H20p−ニ
トロアニリン3.4.!9を42%硼弗化水素酸11T
rLl中に充分に攪拌しながら添加し、これに氷冷亜硝
酸すl−IJウム溶液(1,,7F!/3.4m1)を
滴加する。
p −No206H4N2BF4+ 2 H20p−ニ
トロアニリン3.4.!9を42%硼弗化水素酸11T
rLl中に充分に攪拌しながら添加し、これに氷冷亜硝
酸すl−IJウム溶液(1,,7F!/3.4m1)を
滴加する。
数分間攪拌し、ガラスフィルターで吸引濾過し氷冷硼弗
化水素酸3mlで1回、95%メタノールで2回、エチ
ルエーテルで数回洗浄した後0こ五酸化燐を入れた真空
デシケータ中で乾燥せしめれば黄色結晶状粉末である所
望のp−ニトロフェニルジアゾニウムフルオロポレート
5.6&(収率9、5.9%)が得られる。
化水素酸3mlで1回、95%メタノールで2回、エチ
ルエーテルで数回洗浄した後0こ五酸化燐を入れた真空
デシケータ中で乾燥せしめれば黄色結晶状粉末である所
望のp−ニトロフェニルジアゾニウムフルオロポレート
5.6&(収率9、5.9%)が得られる。
ii)使用態様
1■/諦の濃度となるように蒸留水に溶解する。
111)保存態様
粉末体は比較的安定であり、冷暗所保存により数ケ月に
亘り安定、溶液化したものは直ちに使用が原則であるが
、遮光下に水冷しておくことにより少なくとも4〜5時
間程度安定に保存しておくことができる。
亘り安定、溶液化したものは直ちに使用が原則であるが
、遮光下に水冷しておくことにより少なくとも4〜5時
間程度安定に保存しておくことができる。
(8)次亜燐酸溶成
20%溶液を使用。
測定手技
尤血清中の総ケトン体の算出方法
(1)除蛋白
試験管に血清0.2m1.を採取し、2%過塩素酸溶液
2.0mlを混和し、3000Fで15分間遠心した後
の上澄液を検体溶液として使用する0 (2)D−3−ヒドロキシ酪酸のアセト酢酸への酵素的
転換 上記検体溶液0.511Llにトリス緩衝液0.2ml
!を加え、pH8,5において3−ヒドロ、キシ酪酸脱
水素酵素0.0111LlとNAD 0.1 m1.と
無性ブドウ酸0.1 m1.!:、 LDHo、01
mとの共存下に、30℃、30分間反応卿装する。
2.0mlを混和し、3000Fで15分間遠心した後
の上澄液を検体溶液として使用する0 (2)D−3−ヒドロキシ酪酸のアセト酢酸への酵素的
転換 上記検体溶液0.511Llにトリス緩衝液0.2ml
!を加え、pH8,5において3−ヒドロ、キシ酪酸脱
水素酵素0.0111LlとNAD 0.1 m1.と
無性ブドウ酸0.1 m1.!:、 LDHo、01
mとの共存下に、30℃、30分間反応卿装する。
その後反応溶液に35%過塩素酸溶液0.1mlを添加
して強酸性にする。
して強酸性にする。
(3)発色と吸光度測定
上記2)項にて得たる溶液0.5@l中にクエン酸緩衝
液0.5 ru級びジアゾニウム塩試薬0.5−を添加
し、30℃の恒温槽内で20分間に亘り反応させる。
液0.5 ru級びジアゾニウム塩試薬0.5−を添加
し、30℃の恒温槽内で20分間に亘り反応させる。
次いで、次亜燐酸溶液0.5111を添加して残存する
ジアゾニウム塩を分解すると共に、生成していたアゾ化
合物をヒドラゾ化合物に変じた後に溶液の吸光度Aを3
90nmの波長で測定する。
ジアゾニウム塩を分解すると共に、生成していたアゾ化
合物をヒドラゾ化合物に変じた後に溶液の吸光度Aを3
90nmの波長で測定する。
(4)標準検量線の作製
検体溶液の代りに6%アルブミン溶液を用いて、D−3
−ヒドロキシ酪酸ナトリウムの0 、0.25 、0.
5 、1.0 、2.0及び4.0mM溶液を調製し、
2%過塩素酸溶液で除蛋白後、上記2)及び3)項Iこ
記載の処理操作を行ない、各溶液の吸光度を390 n
mの波長で測定し、各吸光度値からOmMの場合の吸光
度値(A′ニブランク値)を減じた値をプロットして標
準検量線を作製する。
−ヒドロキシ酪酸ナトリウムの0 、0.25 、0.
5 、1.0 、2.0及び4.0mM溶液を調製し、
2%過塩素酸溶液で除蛋白後、上記2)及び3)項Iこ
記載の処理操作を行ない、各溶液の吸光度を390 n
mの波長で測定し、各吸光度値からOmMの場合の吸光
度値(A′ニブランク値)を減じた値をプロットして標
準検量線を作製する。
(5)定量計算
次式1(こ従って血清中に存在していた総ケトン体量、
すなわちD−3−ヒドロキシ酪酸とアセト酢酸の総ミリ
モル量EA(mM/ lりを算定する。
すなわちD−3−ヒドロキシ酪酸とアセト酢酸の総ミリ
モル量EA(mM/ lりを算定する。
式1 (A−A’ ) XFA=EA
〔式中FAは標準検量線の吸光度が1.0のときのD−
3−ヒドロキシ酪酸の濃度(mM/l)を意味する。
3−ヒドロキシ酪酸の濃度(mM/l)を意味する。
〕B〕血清中D−3−ヒドロキシ酪酸の算出方法(1)
検体溶液 血清を前掲「除蛋白」の項に記載の方法により除蛋白し
て検体溶液とする。
検体溶液 血清を前掲「除蛋白」の項に記載の方法により除蛋白し
て検体溶液とする。
(2)検体溶液の発色と吸光度測定
検体溶液0.5TIll中にクエン酸緩衝液0.5m/
?及びジアゾニウム塩試薬0.5mlを加えて30℃の
恒温槽内で20分間反応させる。
?及びジアゾニウム塩試薬0.5mlを加えて30℃の
恒温槽内で20分間反応させる。
次いで次亜燐酸溶液0.57711を添加して残存する
ジアゾニウム塩を分解すると共に、生成していたアゾ化
合物をヒドラゾ化合物に変じた後(こ溶液の吸光度Bを
390 nmの波長で測定する。
ジアゾニウム塩を分解すると共に、生成していたアゾ化
合物をヒドラゾ化合物に変じた後(こ溶液の吸光度Bを
390 nmの波長で測定する。
(3)標準検量線の作製
6%アルブミン溶液を用いて、リチウムアセト酢酸の0
、0.25 、0.5 、1.0 、2.0及び4.
0mM溶液を調製し、2%過塩素酸溶液で除蛋白後、上
記2)項と同様の操作を行ない各溶液の吸光度を390
nmの波長で測定し、各吸光度値からOmMの場合の
吸光度値(B′ニブランク値)を減じた値をプロットし
て標準検量線を作製する。
、0.25 、0.5 、1.0 、2.0及び4.
0mM溶液を調製し、2%過塩素酸溶液で除蛋白後、上
記2)項と同様の操作を行ない各溶液の吸光度を390
nmの波長で測定し、各吸光度値からOmMの場合の
吸光度値(B′ニブランク値)を減じた値をプロットし
て標準検量線を作製する。
(4)定量計算
次式2に従って血清中に存在していたアセト酢酸の総ミ
リモル量EB(mM/l)を算定する。
リモル量EB(mM/l)を算定する。
式2 (B−B’ )XFB=EB
〔式中FBは標準検量線の吸光度が1.0のときのリチ
ウムアセト酢酸の濃度(mM/l)を意味する。
ウムアセト酢酸の濃度(mM/l)を意味する。
〕(5)D−3−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸の標
準検量線の比較 第1図及び第2図はリチウムアセト酢酸及びD−3−ヒ
ドロキシ酪酸ナトリウムよりそれぞれ出発して処理操作
を行なって得た標準検量線を示しており、これ等の図に
於いて2直線はほぼ合致することからD−3−ヒドロキ
シ酪酸からアセト酢酸への転換率はほぼ100%であり
、従って次式3に従ってD−3−ヒドロキシ酪酸量(m
WVl )を算出することができる。
準検量線の比較 第1図及び第2図はリチウムアセト酢酸及びD−3−ヒ
ドロキシ酪酸ナトリウムよりそれぞれ出発して処理操作
を行なって得た標準検量線を示しており、これ等の図に
於いて2直線はほぼ合致することからD−3−ヒドロキ
シ酪酸からアセト酢酸への転換率はほぼ100%であり
、従って次式3に従ってD−3−ヒドロキシ酪酸量(m
WVl )を算出することができる。
式3EA−EB
以下には、血清にアセト酢酸とD−3−ヒドロキシ酪酸
を混合溶解した検体の計算値と本発明方法による実測値
との比較(表1)並びにヒト血清測定例を挙げる(表2
) 3表1) 血清に添加したアセト酢酸とD−3−ヒドロキシ酪酸の
各濃度の理論値と本発明方法によって比色定量した実測
値(M、±S 、D)を比較した表であり、両者がほぼ
一致することから、本発明方法による測定精度が極めて
高いものであることが判る。
を混合溶解した検体の計算値と本発明方法による実測値
との比較(表1)並びにヒト血清測定例を挙げる(表2
) 3表1) 血清に添加したアセト酢酸とD−3−ヒドロキシ酪酸の
各濃度の理論値と本発明方法によって比色定量した実測
値(M、±S 、D)を比較した表であり、両者がほぼ
一致することから、本発明方法による測定精度が極めて
高いものであることが判る。
(表2)
本発明方法により健常人51名の血中ケトン体分別定量
を行ない、その濃度を平均値上S、D(mu/l )で
示したものと、糖尿病患者3例、境界型糖尿病患者2例
について測定した結果を示している。
を行ない、その濃度を平均値上S、D(mu/l )で
示したものと、糖尿病患者3例、境界型糖尿病患者2例
について測定した結果を示している。
異常高値を示すものは(平均+28D以上)糖尿病3例
中、アセト酢酸、D−3−ヒドロキシ酪酸、総ケトン体
とも2例にみられ、境界型糖尿病では2例ともアセト酢
酸、総ケトン体において高値を示した。
中、アセト酢酸、D−3−ヒドロキシ酪酸、総ケトン体
とも2例にみられ、境界型糖尿病では2例ともアセト酢
酸、総ケトン体において高値を示した。
第1図はリチウムアセト酢酸より出発して処理操作を行
なった場合の標準検量線(第2標準検量線)を示すグラ
フであり、第2図はD−3−ヒドロキシ酪酸ナトリウム
より出発して処理操作を行なった場合の標準検量線(第
1標準検量線)を示すグラフである。
なった場合の標準検量線(第2標準検量線)を示すグラ
フであり、第2図はD−3−ヒドロキシ酪酸ナトリウム
より出発して処理操作を行なった場合の標準検量線(第
1標準検量線)を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 a)検体血清を除蛋白し、トリス緩衝液中で3−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素と、NADにコチンアミドア
デニンジヌクレオダイド)を加え反応装置し、D−3−
ヒドロキシ酪酸をアセト酢酸Oこ転換し、この際アセト
酢酸への酵素的転換を完全に行うために焦点ブドウ酸及
び乳酸脱水素酵素を加えNADの再生産を行って反応を
促進させ、次いでこの反応液にクエン酸緩衝液を加えp
−ニトロフェニルジアゾニウムフルオロポレートと反応
させてアゾ化合物を生成せしめ、次亜燐酸溶液を添加し
て残存ジアゾニウム塩を分解するとともに、上記アゾ化
合物をヒドラゾ化合物に変じた後、390nmの波長に
おけるこの溶液の吸光度Aを測定する工程と、 b)検体血清を除蛋白後、a)で述べた酵素的変換操作
を省き、直接クエン酸緩衝液中で、p−ニトロフェニル
ジアゾニウムフルオロボレートと反応せしめてa)と同
様の操作を行い、390nmの波長に耘けるこの溶液の
吸光度Bを測定すする工程と、 a96%アルブミン溶液を用い、D−3−ヒドロキシ酪
酸ナトリウムの0 、0.25 、0.5 。 1.0 、2.0及び4.0 mM温溶液調製−除蛋白
後、上記a)工程記載の処理を行なって、各溶液の吸光
度を390nmの波長で測定し、各吸光度値からOmM
の場合の吸光度値(A′: ブランク値)を減じた値
をプロットして第1標準検量線を作製する工程と、 b96%アルブミン溶液を用い、リチウムアセト酢酸の
0 、0.25 、0.5 、1.0 、2.0及び4
、0 mM温溶液調製し、除蛋白後、上記b)工程記載
の処理を行なって、各溶液の吸光度を390 nmの波
長で測定し、各吸光度値からOmMの場合の吸光度値(
B′ニブランク値)ヲ減じた値をプロットして第2標準
検量線を作製する工程を具備しており、 式1 (A−A’)XFA 〔式中FAは第1標準検量線の吸光度が1.0のときの
D−3−ヒドロキシ酪酸の濃度 mM/L)を意味する〕 で得た値、すなわち血中総ケトン体濃度より、式2
(B−B’)XFB 〔式中FBは第2標準検量線の吸光度が1.0のときの
リチウムアセト酢酸の濃度(mM/l)を意味する〕 で得た値、すなわち血中アセト酢酸濃度を減することに
より、D−3−ヒドロキシ酪酸を算定することを特徴と
する血中ケトン体の高感度簡易比色分別定量法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10815378A JPS5844211B2 (ja) | 1978-09-05 | 1978-09-05 | 血中ケトン体の高感度簡易比色分別定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10815378A JPS5844211B2 (ja) | 1978-09-05 | 1978-09-05 | 血中ケトン体の高感度簡易比色分別定量法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5535232A JPS5535232A (en) | 1980-03-12 |
JPS5844211B2 true JPS5844211B2 (ja) | 1983-10-01 |
Family
ID=14477283
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10815378A Expired JPS5844211B2 (ja) | 1978-09-05 | 1978-09-05 | 血中ケトン体の高感度簡易比色分別定量法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5844211B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6091998A (ja) * | 1983-10-27 | 1985-05-23 | Yukio Shigeta | 体液及び尿中のd―3―ヒドロキシ酪酸の測定法並びにそのための測定試薬 |
-
1978
- 1978-09-05 JP JP10815378A patent/JPS5844211B2/ja not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5535232A (en) | 1980-03-12 |
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