JPS58216120A - ヒトｔ交雑細胞ライン及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なしトＴ交雑細胞うイシ及びその製法に
関する。よシ詳しくは、しトＢ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ
）又はしトＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦ　）を産生じ、且
つ永代培養可能なしトＴ細胞交雑細胞（シ）７’ｔル八
イづリドーマ）及びその製法に係る。

しトの免疫系に含まれるリシへ球は、Ｔ細胞部ち胸腺由
来細胞と、Ｂ細胞部ち骨髄由来細胞とに大別される１、
上記Ｂ細胞は、抗体を分泌することが知られている。一
方、上記Ｔ細胞は、上記Ｂ細胞の抗体分泌を抑制する因
子、仲のｒ＠胞の分裂を引起す因子（イルター０イ十シ
２）等の種々の液性免液因子（リシホカイン類）を分泌
し、免疫応答の調節における中心的役割を果すものであ
る。

よって、これらＴ細胞由来の液性免疫因子、特に均質な
液性免疫因子を多量入手することによシ、免疫応答の解
明に多大の寄与がなされることになる。しかしながら、
これらＴ細胞由来の液性免疫因子をしトの体内から多量
入手することは困難でちゃ、また、しトのＴ細胞を生体
外で刺激等すると、Ｉ−によね府性会疫因子か前り出す
とムえＦ鼻もれているが、多量の、ｌ−記因子の採取は
困難であり、且つ均質な因子の取得はほとんど不可能で
あった。

そこで、細胞融合技術を応用して、じトのＴ細胞を融合
し、これら液性免疫因子を多量かつ均質な状態で取り出
そうとする試みが種々なされている。例えば、０１ａｄ
ａ　Ｍ、　ｔｔ　ａｌ　、　Ｐｒｏｔ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ　、　Ｓｔｉ　、　、　　　（）、Ｓ、Ａ、　
　７８．　７７　１７−７７２１（１９Ｂ＋）　　によ
れば、しボ＋寸シチシークアニシーホス小リボシル−ト
ラシスフェラーゼ（／／　Ｇ　Ｐ　ＲＴ　）欠損し１・
白血病性Ｔ卸１胞うイシと正常なしトＴ　ｆ４１＋胞と
の交雑細胞の中に、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ５ｔ−（
ｄ、ＩＬ−’ｌ　）を分泌するＴ交雑細胞が含まれてい
ることが記載されている。

しかしガから、Ｂ細胞の増殖又は分化を誘起する因子（
ＢＣＧＦ又はＨＣＤ　Ｆ　）及びこれら因子を分泌する
Ｔ交雑細胞に関しては、上記文献に具体的記載はなく、
特にＢ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）に関しては、これまで
その存在すら不確かであつ３− た。

本発明者は、上記ＨＧＰＲＴ欠損しト白血病性Ｔ細胞う
イシと正常しトＴ細胞との交雑細胞について種々研究を
重ねた。その結果、これら交雑細胞の中にＢＣＧＦを分
泌する交雑細胞及びＢＣＤＦを分泌する交雑細胞が含ま
れていることを発見し、しかもこれら交雑細胞は生体外
で長期安定に継代培養でき、よってこれら交雑細胞を培
養することによシ、ＢＣＧＦ又はＢＣＤＦを均質な状態
で多量生産することが可能となることを見出した。本発
明は、これら新知見に基き完成されたものである。

即ち本発明は、しトＢ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ　）もの
である。

本明細書において、しトＢ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ　）
とは、しトＢ細胞の増殖を促進する因子であり、シト８
細胞分化因子（ＨＣＤＦ）とは、しトＢ細胞を抗体産生
細胞へと分化させる因子をいう。

本発明によれば、ＢＣＧＦ及びＢＣＤＦのいずれも均質
な状態で［１つ多量に生産されるので、従来不可能であ
ったこの分野での研究、例えば、しトＴ細胞とじトＢ細
胞との相互作用の解明等に多大な恩恵を与λることに彦
る。また、ＢＣＧＦ及びＢＣＤＦけ、Ｔ細胞機能低下（
不全）に基づく免疫不全症の治療薬としても有用である
。更に、これら因子を利用すれば、生体外でしトの所望
の抗体産生細胞を大墓に得ることが可能となり、これは
例えば、ｅ　ｌ−Ｈ細胞融合法の、従来から切望されて
いた原剥として使用できる。

本発明の１１　ＣＧ　ｊ’又ＦＪ、　Ｂ　ＣＤ　！産生
能を有するしトＴ交雑細胞株は、しト白血病性Ｔ細胞株
から誘導さね九親細胞株と、ｉＦ常なじトＴ細胞とを融
合させ、）■られる交雑細胞をクローニシクして得るこ
とかできる。

上記親細胞株は、公知であり、本発明者らにより、１９
８１年７月３０日にアメリカシ・タイプ・カルチャー・
］レタクシ３：Ｊ（Ａ　Ｔ　ＣＣ）に寄託きれ、ｒＣＲ
Ｌ−８０８１Ｊとして受託されているものである。上記
親細胞株は、ヒト白血病性Ｔ細胞株より誘導されるもの
であり、ＨＧＰＲＴを欠損している点において特徴付け
られる。その細胞学的及びその他の諸性質を示せば次の
通りである。

（１）形態学的特徴： 径は正常じト末梢血Ｔ細胞の約２〜３倍であり、はぼ球
形をなす。細胞内における核の占める割合は大で、原形
質が僅かに認められる。原形質内には僅かの顆粒が認め
られる。時として偽足様の突起を出す場合がある。

（２）染色体数： ０．１μｆ／ｍ１ＷＮ９：のコルしチシ存在下に親細胞
を３７℃下３時間培１１Ｌ、遠沈＊　０．０７５　Ｍ−
ＫＣ’１で処理し、メタノール：エタノール＝３：ｌの
固定液を用いスライドガラス上に固定後の核染色体数を
、１０００倍の油浸レシズを用いた顕微鏡観察によシ計
数１７だ結果、１００個の細胞の分裂中期において各親
、細胞の核染色体数は、下記第１表の通り６９〜８７０
間にあり、平均７８である。

第１表 （３）Ｔ細胞特異抗原発現性： 親細胞を５ＸＩＯ５個濃度に調整し、１００μｌの適当
な濃度のｔノクロナル抗体（０，ｌダ１０．５ｖｔｌｆ
）抗−１，ｔｕｌ、杭−Ｌｔｕ　２　Ａ及び抗−Ｌｅｓ
ｔ　３　Ａ・−７− 抗体の原液を、夫々ｌ’００倍、１０倍及び１０倍に希
釈して１００μｅとして用いた）と、４°Ｃ下３０分間
イシ＋ユベート後、細胞を５％胎児牛血清（ＦＣ５）を
含むＭＥＮ培地〔財団法大阪大微研〕で洗浄し、Ｆ　Ｉ
　Ｔ　Ｃ（ｆｌｕｏｒｔｓｔｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｔｙ
ａｎａｔｔ　　）−結合−ウ＋ｊ−ｆ抗マウス免疫りＯ
ｊ　リシ（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｔｄａ　　ＬＴＤ、　、　ｌ
５ｒａｅｌ　〕と反応させ、Ｔ細胞特異抗原発現性を間
接免疫螢光抗体法により測定した。尚各ｔノ９０ナル抗
体はベクトシヂイ＋ｙ　ソｙ社（Ｂｔｃｔｏｎ　　Ｄｉ
ｔ４ｉｎｓｏｙｚ　Ｃｏ、。

５ｕｎｎｙｖａｌｔ　、　Ｃａ　　：）より得た（　／
、ＥｚｐｏＭｅｄ、。

＋５３，３１０−３２３（１９８１））。２００個の細
胞について調べた結果抗−Ｌｔｕ　ｌ及び抗−Ｌｔｕ３
Ａ抗体に対し９５％以上が陽性であり、抗−Ｌｔｕ　２
　Ａ抗体に対し１％以下が陽性であった。

（４）Ｄセット形成： 抗体補体感作ヒツジ赤血球（ＥＡＣ）におけるＯ１！ッ
ト形成を、２００個の細胞につき、４００８− 倍の顕微鏡下でｉｌｌ！ｌ定した結果１％以下が陽性で
ある。

（５）　　ＢＭ胞ママ−カー現性： ＦＩＴＣ−結合マウス抗しトー免疫り０プリシ（Ｂｔｈ
ｒｉｎｇ　ｗｔｒ４ｚ　ＡＧ　、　Ｍａｒｋｕｒｙ　　
）を用いた直接免疫螢光抗体法により解析１〜九表面免
疫ジ０プリシ（Ｉ　ｙ　）＃ｉ、１％以下陽性である。

七ツク０すルー抗−Ｄ　Ｒ抗体（ｆＪｔｔｔｏｎ　−Ｄ
ｉｃｌｉｎｓｏｎ　Ｃｏ、）を用いた間接免疫螢光抗体
法により解析したしト１１　Ｌ　Ａ　−１）　Ｉｔ抗原
（１）Ｒ）は、１％以下陽性である。

またじ−シス（Ｅ戸５ｔｅｒｎ　−Ｂａｒｒ　ｖげｕｓ
　　）でトラシスフオームしたしｌ−Ｂ細胞株（ＣＥＳ
Ｓ　、ス０−シ、ケタリシタ癌研究所の七−ターラルフ
博士よシ入手）により免疫されたマウスＮ細胞と三より
　　？Ｐ３Ｕ１、（Ｅｌｋｔｒｌ）’、’１ｎｓｌｔｉ
ｎ　Ｃｏ１１ｔｙｔ　　ｏｆＭｔｄｉｃｉｎｚより人手
）との細胞融合株から得た（　Ｇ、　Ｋｏｋｌｚｒ　ａ
ｎｄ　Ｃ６Ｍ１ｌｓｌｔｉｎ　、　Ｎ’ａｔｕｒｔ　、
　２５６゜４９５・１９７５参照〕七ツク０すル抗しト
Ｂ細胞抗体を用い、間接免疫螢光抗体法により解析した
、しトＢ細胞特異抗原（Ｂ抗原）の表現性は、１％以下
が陽性である。尚上記抗体はＢ細胞乃至そのライシとは
反応するが、Ｔ＠胞乃至そのライシとは反応しない。

授より入手）と３０分間３７°Ｃで培養後、本発明の親
細胞で吸収した家兎補体（ベリタス）と、６０分間イシ
＋ユベートして細胞の生存率を調べた結果、ＨＬΔ表現
型はＡ２．　Ａｌ　ｌ、Ｂ８゜Ｂ３７．ＢｔｌＪ２２を
示す。

（７）増殖性： ８−アザクアニシＣ３−ＡＧ、ｔｏｏμＭ）、１０％胎
児牛血清（ＦＣ５）、５ＸＩＯ−５Ｍ２−メルカづトエ
タノール及び１ｍ＆タルタミシを含むＲＰＭ１１６４０
培地（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）におい
て良好に増殖する。

（８）増殖条件ニ 一般に３６〜３８°０の温度条件下及びｌ’　Ｈ７，２
〜７．３の条件下で良好に増殖する。また５％炭酸カス
及び９５％空気のイル＋１ベーター内での培養が好適で
ある。

（９）継代培養： 限界なく継代培養が可能である。

ＱＱ　ｓ結保存： 液体窒素中で宥易に艮期間弾存できる。

Ｏｎ　　８−アザジアニＮシ向Ｉ性： ８−アザタアニシ（１００μＭ）に１ｌＩｔ性があり、
しポ千寸シチシ、アミノづチリル及びチミジルを含む培
地（ＨＡＴ培地）で死線する。このことから親細胞はＨ
ＧＰＲＴ欠損株であることが判る。

＠　マイトジエシ反応性： ］、ｊカ丁パリｙ　Ａ（ＣａｎΔ）１０−１００μｆ／
　ｗ、ｌの添加及び植物性赤Ｉ６−球醗集素、フィトへ
ｔアジルアニーＪ（ＰＨＡ）の１〜１０％添加により、
分裂増殖は部分的に抑制される。ポックウイードマイト
ジエ：、ＣＰＷ’Ｍ）及び′ＪＪＯティ：ＪＡ　（Ｐｒ
。

Ａ）は、いかなる濃度において４本細胞株の分裂増殖に
影響を与えない。

之等のことを添付の第１図乃至第４図に示す。

各図は夫々２Ｘ１０”個の親細胞株を、種々の濃度のマ
イトジエシ（第１図はＣａｎ　Ａ、第２図はＰＨＡｌ、
第３図はＰＷＭ及び第４図はＰｒｔｒＡを夫々用いたも
のでおる）と共にＲＰＭＩ　　１６４０＋１０％ｐｃｓ
内で６０時間培養し、培養の最後の１２時■１に０．２
μＣ１の３Ｈ−チミジル（３１１−ＴｄＲ）を加え、培
養細胞をグラスファイパースＦリップ（ラボ　寸イエシ
ス社）に集め、Ｈ−Ｔ　ｄ　Ｒのデオ十シリボ核酸分画
への取９込みを液体シシチレーショシ力ウシターでカラ
シトした結果を、各３度繰返した平均値（Ｓ、Ｄ、　　
は１０％以下）で′ｊロットしたものであり、図中横軸
は各マイトジエシ１１− の濃度及び縦軸は取シ込まれた　Ｈ−ＴｄＲのカラシト
数（ＣｏＰｏＭ、Ｘ　１０−５）を示す。

上記諸性質を有するＨＧＰＲＴ欠損しト白血病性Ｔ細胞
株は、ｔ−、ｌ−白血病性Ｔ細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥ　Ｍ
　）　Ｃ／、　ＫＡＰＬＡＮ　、　１”、Ｃ０５ＨＯＰ
Ｅ　ａｎｄ　Ｗ、Ｄ。

ＰＥＴＥＲ５ＯＮ　、　Ｊｒ、、　Ｊ、Ｅｘｆｉ、　Ｍ
ｔｄ、ｌ　３９．１Ｑ７Ｑ　−１０７６，１９７４参照
］を起源とし、これを１０％ｐｃｓ含有ＲＰＭＩ　　１
６４０培地に８−アザシアニジ（８−ｊＧ）を添加した
培地で培養し、Ｂ、ＡＧ＃＆加菫な順次増加させていく
ことによシ取得できる。より具体的には例えばまず２μ
Ｍの８−ＡＣ；を添加した培地で１週間培養し、生存細
胞を次に１６μＭの８−．４Ｇを含む培地で１週間培養
し、その夜間様に８−ＡＧ濃度を２倍づつ増加させた培
地で順次培養し、最終的に３−ＡＧ濃度を１００μＭと
し九培地に生存する８−ＡＧ耐性細胞株を得る。かくし
て得られる親細胞株は、その後１００μＭの８−ＡＧ含
有培地で強い増殖１２− 性を示し、この培地で継代培養できる。

上記親細胞と融合させ得る正常なしトＴ細胞は特に制限
はなく、例えば、末梢血、骨髄、リシバ節、評臓、扁桃
腺等に由来する各種Ｔ細胞がいずれも使用できる。これ
らＴ細胞は公知分離手段。

例えばこの分野で慣用されている物理的方法、化学的方
法、表面膜法等によシ単離、精製される。

次いで得られたＴ細胞は、各種マイトジエシ、例えばづ
０テイｙＡ（ＰｒｏＡ）、コシヵナバリシＡ（Ｃｏｎ　
Ａ　）　、ア０抗原等で刺檄して後、上記親細胞と融合
させる。上記しトＴ細胞及び刺激Ｔ細胞の製造の詳細は
後述する実施例に示す通９でおる。

親細胞たるＨＧＰＲＴ欠損しト白血病性Ｔ細胞と上記し
トＴ細胞との融合反応は、基本的には公知の細胞融合方
法と同様であり、融合促進剤の存在下に適当な培地内で
行なわれる。融合促進剤としては例えばｔ、、Ｊイウイ
シス（ＨＶＪ）等のウィルスを用いて本よい≠１−１年
間ＩＩ！４嘘−ｈ奇Ｉ　ＩＩ　７チレシタリコール（Ｐ
ＥＧ）を用いるのが好ましい。該ＰＥＧとしては平均分
子ｍｔｏｏｏ〜６０００程度のものが打首しく、これは
培地に約３０〜６０Ｗ／Ｖ％の濃ｌｆで存在させるのが
適当である。

また培地として＆Ｊ、ＭＥＭ培地、そのドルベツコ改質
培地、ＲＰＡｆｌ　　１６４０培地、その他のこの種の
細胞培養に利用される通常の各種培地を利用できる。ま
だ」〕記細胞融合用培地には所望により融合効率を高め
るための補助剤として例えばジメチルスルホ十シトｇｌ
を添加してもよい。

」二旧細胞融合に当り用いる親細胞と、しトＴ細胞との
使用量比は、特に制限はないが一般には親細胞数に対し
てし１−　Ｔ細胞数を約１〜１０倍用いることができる
。好ましい細胞融合は例えば次の如くして行なわれる。

即ちυム細胞株とじトＴ細胞との所定撤を適当な培地内
でよく混ぜ、遠沈後上清を除去１２、予め３７°Ｃに加
温したｐｇＧ溶液の適当量を加えてまぜ合せる。これに
より細胞融合反応が開始きれる。以後適当な培地を逐次
添加し、遠沈させ、上清をすてる操作を繰返すことによ
シ所望の融合細胞の出現が認められる。

所望融合細胞の分離は、上記細胞融合後の細胞を、通常
の雑種選別用培地で培養することにより行なわれる。こ
の選別用培地け、親細胞は増殖し得す、目的とする交雑
細胞のみが増殖し得る培地（しトＴ細胞は本来増殖し得
ない）であり、その代表例としては例えばしポ＋サシチ
シ、アミノづチリル及びチ三ジシを含む培地（ＨＡＴ培
地）を培地に、ア三ノプテリシ４×ＩＱ−’Ｍ、しポ＋
すｙ　チ：ｉ　１　Ｘ　１０−”　Ｍ、チ＝ジ：、ｚ　
１．６　Ｘ　１０−５Ｍ及び必要に応じてクリシシ３Ｘ
１０−’＃を添加した培地が例示できる。該ＨＡＴ培地
での細胞の培養は、通常の限界希釈法に従い目的とする
交雑細胞以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するに充分
な時間通常的数日〜数週間程行なわれる。これにより目
的とするしトＴ細胞融合細胞のみが選択的に増殖する。

かくして得られる融合細胞は、被形（核染色体数）細胞
表面の表現型、マイトジエシ反応性、リシホカイン産生
能等において、親細胞株、しトＴ細胞とは明らかに異な
る新１−い特性を具備している。この融合細胞は、ｎ＋
を記と同様の適当な培地中で増殖維持することができる
がＨＡＴ培地による選別後、じポ千すシチシ及びチ、：
ジシを含むＨＴ培地で１〜２週間培養した後、通常の培
地に移す方が好ましい。

また上記した如きしトＴ細胞交雑細胞株は、これを常法
に従い通常の培地で増殖させることにより、り０−シ化
することができ、これによ少夫々単一の融合細胞株に分
離すると七ができる。

本発明のＢＣＧＦ産生能を有するしトＴ交雑細胞うイシ
及びＢＣＤ！ＣＤ前を有するじトＴ交雑細胞５イシは、
以上の如くして得られた多数の交雑細胞りＯ−シの中か
ら発見されたものであシ、本発明者により初めてＢＣＧ
Ｆ又はＢＣＤＦの産生能を有することが見出されたもの
である。

本発明に従い確立されたＢＣＧＦ産生能を有するしトＴ
交雑細胞うイシ（即ち、り０−シム７７−Ａ、９４−Ｃ
１９８−Ｆ等）及びＢ　ＣＤ　Ｆ産生能を有するじトＴ
交雑細胞ライ：Ｊ（即ちり〇−シＡ　　９０−Ｅ等）に
つき更に詳述すれば、次の通やである。即ち、これら交
雑細胞クローンは、後述する実施例に示す通シ、ＨＧＰ
ＲＴ欠損親細胞株と刺激したしト末梢血すシバ球Ｔ細胞
との細胞融合によ）得られた交雑細胞株であり、第２表
記載の細胞学的性質を有する。各測定法は、以下の通り
である。

（１）　　Ｔ細胞特異抗原発現性： （ｇ）　Ｌｚｕ抗体 各交雑りｎ−、、を’；Ｘ１Ｏ−ａ遣計ｆ細敞手２ｔノ
９０ナル抗付である抗−Ｌｔｕ　−１、抗−Ｌｅｕ２Ａ
、抗−１，ｔｕ　３　Ａ及び抗−Ｌｔｕ　４の原液（Ｄ
ｒ。

Ｒ，Ｅりａｓｓ、ス０−シ″ケタリシタ癌研究所よシ入
手、０．Ｉ　Ｑ　／　０．５　ｍｌ　ｆ１４　Ｋ　）を
夫々、１００倍、１０倍、１０倍及び１０倍に希釈し、
１００μＪのｔツクＯｊ′ル抗拝液を調製する。上記交
雑り〇−シをとのｔマクロ　ｉ’ル抗体液と、４°Ｃで
、３０分間イシ＋］へ−１・後、細胞を５％ＦＣ５（胎
児牛血清）を含むＭＥＭ培地（阪大微υｆ）で洗浄し、
Ｆ　Ｉ　Ｔ　Ｃ（ｆｌｔｏｒｚｘｃｚｉｎ　１ｓ６１ｋ
ｉｏｃｙａｎａｔｔ）−結合−ウリｆ抗マウス免疫夕０
づりｙ　（Ｍｉ　ｌ　ｔｓ　−Ｙｔｄａ。

Ｌｅｄ、、　　イスラエル］と反応はせ、Ｔ細胞特異抗
原発現性を、間接免疫螢光抗体法にょシ測定した。

（ｂ）０にＴ抗体 ｔマクロすル抗体として、ＯＫ　ａＴ−５ツク０ナル抗
体（０ｒｔｋａ　Ｐｌｒａｒ＃Ｊ、Ｃｏｒｆｉ、Ｕ、Ｓ
、Ａ　　）を用い、０ＫＴ３，０ＫＴ４．０にＴ８抗体
ともそれぞれ１０倍希釈して１００μＩの液として、５
×ｌＯ５個の細胞を処理し、上記Ｌｔｕ抗体と同様の方
法で、間接螢光抗体法により測定した。

（２）　　マクロファージ抗体 しトマク０ファー！；腫瘍細胞株Ｕ９３７細胞をＢ　Ａ
　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスに免疫し、このＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ
マウスより得だ婢Ｂ細胞とミニ０−マ細胞Ｐ３Ｕ１とを
ポリエチレシタリ］−ルを用いて細胞融合させヒトマク
０フアージに対するｔツク０ナル抗体を産生ずるマウス
Ｂハイプリドーマを得た（　Ｇ。

Ｋｏｋｌｅｒ　ａｎｄ　Ｃ０Ｍ１ｌｓｔｔｉｎ　、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　、　２５６．４９５゜１９７５参照）。こ
の抗体は、Ｕ９３７や正常しトマクロファージには特異
的に結合するが、正常しトＴ　ｆｉｌｌｌ胞やＢ細胞或
はしトＴ細胞うイシやしトＢ細胞うイシとは反応しない
ものである。この抗体を用い、同様に間接螢光抗体法に
より、しトマ　　　□り０フアージ抗原（Ｍφ）を測定
した。

（３）Ｂ細胞及びマクロファージ抗原 ｔノクロナル抗しトＤＲ抗体（Ｂｅｔｔｏｎ　−Ｄｉｃ
Ｊｉｎｓｏｎ　Ｃｏ、）を１０倍希釈し、ｌｏｏμＪと
して、５×ｌＯ個の細胞と反応させ、同様に間接免疫螢
光抗体法によシしトＨＬＡ−ＤＲ抗原（ＤＲ）を測定し
九。

尚、第２表に１」、比較のため、親細胞（ＣＥＭ−ＡＧ
　）、しト組織球すシバ腫細胞株（Ｕ９３７、国立予ｉ
ｔｏ谷山博士より入手）、しト末梢血Ｔ細胞（Ｐ　ＩＩ
　Ｌ　−Ｔ　）及びしト末梢血Ｂ細胞（ＰＢＬ−Ｂ）を
用いる以外ハ、」二記（１）〜（３）と同様にして試験
した結果をも併記する。

更に、本発明のり［１−シ４７７−／ｆ、９４−Ｃ。

９　ｓ　−Ｆ＃け、後記試験例に示す如く、均質なりＣ
ＧＦを分泌するととにより特徴付けられる。

また本発明のり０−シム９０−Ｅ等は、均質なりＣＤＦ
を分泌することにより特徴付けられる。

これらのことは、第５図から明らかである。即ち、第５
図から明らかかように、これらのハイプリドーマより産
生される１１　ＣＧ　／はイルター０イ千シー２活性や
ＩＩ　ＣＯＦ活性を持たない。一方、ＢＣＤＦｙｉ、イ
シター［］イ千シー２活性やＢＣＧＦ活性を持たない。

以」二の緒特性を有する本発明の交雑細胞り〇−シは、
長期安定に継代培養することができるので、これらを培
養して増殖させることにより、多量のＢＣＧＦ又はＩＩ
　Ｃｌ）　Ｆを培養上清に溶解した形態でｌＪｉ！造す
ることができる。しかも、得られるＢＣＧＦ又はＢ　Ｃ
／）　Ｆけ、単一９０−シから得られるものであり、均
質である。

以下、本発明の詳細な説明するため、しトＴ細胞の単離
調製例、Ｔ細胞と親細胞との細胞融合及び得られた融合
細胞の選択、クローニシタ並びに得られだＢＣＧＦ又は
ＢＣＤＦ産生り０−シの試験例を掲ける。

実施例１　しトＴ細胞の単離調製 錐康々成人よシヘパリシ採血して得た血液５０ｍ１をリ
シバ球比重分離液、［フィコール−バック」（ファルマ
シア・ジセバシ株式会社）で遠心分離して、末梢血リシ
バ球５Ｘ１０’を単離した。該リシバ球からのＴ細胞の
単離は、ノイラ三ニターを処理羊赤血球（ＳＲＢＣ）で
ｏｔワットすることＫ　ｊ　ｊ）ｆＴナツタ（Ｔ、ＨＩ
ＲＭＯ、Ｔ、ＫＵＲＩＴＡＮＩ　。

Ｔ、ＫＩＳＨＩＭＯＴＯａｎｄ　Ｔ、ＹＡＭＡＭＵＲＡ
　、　／、Ｉｍｍｕｎｏｌ　、。

１１９．１２３５〜１２４１（１９７７）１゜がくして
得られた末梢血Ｔ細胞１ｘｔｏ６個／　ｖｓｌを、濃度
１０ｉｔｆ／ｍｌの”’　Ａ　（）’ＦＩＬ？シ？社Ｉ
！りテア２時間刺激して、刺激Ｔ細胞を調製した。

実施例２　親細胞−し：・１′細細胞台親細胞（ＡＴＣ
Ｃ番号　ＣＲＬ　−８０８１＋７）特性を有するもの、
以下［ｃＥＭ−ＡＧ’Ｊという）は、融合の３日前より
毎日培地（ＲＰＭＩ　１６４０十１０％ｐ　ｃ　Ｓ　＋
１００μＭ　　８−ＡＧ）を交換して、増殖が活発な４
Ａ’、Ｗに栴１持しておいた。

上記ＣＥＡＩ−Ａ♂のｌＸ１０７個と、上記実施例１で
得た各しｌ−Ｔ細胞の２ＸＩＯ’個とを細胞融合に利用
した。即ち上記各細胞を、予め３７°Ｃ加温保持したＦ
ｅ２を含オないＭＥＮ培地で３回洗浄し、次いで５０ｍ
１の］ニカルチューブに移しよく混合し、１０００ｒ７
＃１で１０分遠沈した。上清を除去して得られた細胞ペ
レットを軽く振とうし、その」二に３７＠Ｃに加温した
４５％ＰＥＧ−６０００（コツホライト社）の０．３ｗ
ｒｌを注いだ。３０秒間よく振とうした後、５％病酸ガ
ス及び９５％空気の脚酸ガスイシ士ユベーター内で、３
７℃下に６分間静置した。これにＦｅ２を含ま々いＭＥ
Ｎ（予め３７°Ｃに加温）を１分間に２　ｗｔｌの速度
で総計１２＋＋＋／加えた。更にＭＥ　Ｍ　２５　ｍｌ
をすばやく加えた後８００ｒ／’＃Ｊ％　１０分間遠沈
し、上清を除去した。これに２０％ｐｃｓ含有ＲＰＭＩ
　　１６４０培地（予め３７℃に加温）の５０ｖｔｌを
静かに加えて細胞濃度を２×１０５個／　ｍｌとし、こ
れをマイクロカルテＰ−づレート（９５９０社）の直径
２１の各ウェル５０個に夫々ｌ　ｍｌづつ分注した。

２４時間後上清の半分をすてＨＡＴ培地（しポ＋寸シチ
シ（シグマ社）ＩＸＩＯ−４Ａｆ　、アミノづチリル（
シグマ社）４Ｘ１０−７Ａｆ及びチ三ジシ（シグマ社）
１．６Ｘ１０　　Ｍを含むＲＰＭｌ　　１６４Ｑ＋２０
％ＦＣ５培地）１Ａｆを各ウェルに加えた。

２日毎に同様の操作を繰返し、２〜４週間週間５度６ 増殖する細胞株を次いでアミノづテリ、（Ａ）を含まな
いＨＴ培地（ＨＡＴ培地よＦ）Ａを除いたもの）に移し
、更に１週間培養後、ＨＡＴを含まないＲＰＭＩ　　１
６４０＋１０％ｐｃｓ培地（正常培地）に移し、以後常
法に従いり０−ニシタ化°した。

即ち交雑細胞を正常培地中で１個／　ｍｌとなるように
希釈しこれをファルコシマイクロづレートに０．２１１
／ウエルづつ分注し、２〜３日おきに上清な半分すて、
予め５７℃に加温した培地を加え。

上記細胞の増殖をつづけ九、１かくして交雑細胞株の単
一クローシ化を行ない、前述した特性を有するり０−シ
ム７７１．９４−Ｃ１９８−Ｆ及び９０Ｅの各しトＴ交
雑細胞株を得た。

実施例３　　ｅドア’細胞交雑細胞上清の製造上配夾施
例２で慢九各交雑細胞を、ＲＰＭ１１６４０＋ｌＯ％Ｆ
Ｃ５培地を用いてＩ　Ｘ　１０５個／　ｍｌ濃度に調整
１７．これをマイクロカルテＰプレート（リシプ０社）
の直径２１０ウエルにて２日間、３７°Ｃ下、５％択酸
ガスイシ士１ベーター内で培養した。５０００ｒ戸１１
１１１Ｏ分速沈して培養上清を採取し、これを０．４５
μ三リポア・フィルターにて滅菌濾過し、各交雑細胞の
培養上清な得た。

試験例 （１）交雑細胞上清のＢＣＧＦ活性 Ｃ活性抗Ａしト１ｆＭ−刺激しト末梢血Ｂ細胞に対する
ＢＣＧＦ活性 前記実施例１と同様にして得たしト末梢血すシバ球を、
実施例１と同様にして５ＲＢＣでＯｔ！ット化し、比重
遠心法により非Ｏｔ！ット形成細胞を分画し、更に同一
操作を行なった。次いで、非ロセット形成細胞をペトリ
ディッシュ法によシ該ディツシュに粘着する細胞を除去
し、しトＢ細胞分画を得る。

一方、常法により得た、ウサ千−抗一し１１１Ｍ血清（
Ｈｉｒａｎｏ　Ｔ、ｚｌ　ａｔ　、　／、Ｉｖｎｍｕｎ
ａｌ、　ｌ　１９　漬１２３５（１９７７）参照）をし
ト１ｇＭ−結合一七ファ０−スカラムによりアフィニテ
ィー精製し、ｔノア０−スー４Ｂじ−ズ（ファルマシア
社製）２７− に結合した不ｍ化抗体を得る。

上記で得た７？　１１胞５　Ｘ　１０”個を含み、且つ
ｌＯ％ｐｃｓを含むＲＰＭＩ　　１６４０培地（０，２
ｍ／）に、上記で得たウリｆ抗しト１ｆＭ結合ｔファ０
−スー４Ｂ及び前記実施例３で得た各培養上清を加える
。

４日間培養後、１μＣｉの　Ｈ−チ、ｌ：ジシ（以下「
　Ｈ−ＴｄＲ１という）を加え、５時間培養する。

次いでＢ細胞のゲオ十シリボ核酸分画への　Ｈ−ＴｄＲ
の取込みを液体シシ子レージ３シカウシターで測定し、
Ｂ　Ｉｌｌ胞の分裂増殖を調べた。結果を第５図（１）
−（Ａ）に示す。

（ｎ）ｐｉｔΔ−誘発Ｈコロニーから得たＢ細胞に対す
るｌノＣＧ　Ｆ活性 １５％ＦＣ５，５Ｘ１０−５Ａｆ　　２−メルカづトＩ
タノール及び’／１１５００　Ｐ　ＨＡ−ｐ　　（フイ
トヘマグルアチニシーＰ、ディフコ社１ｉｔ）を含有す
るマツコイ５Ａ培地（）０−ラボラトリーズ社製＞２＋
ｗｌに２８− 上記ＣＡ）と同様にして得たしトＢ細胞２　Ｘ　１０６
個及び該Ｂ細胞を採取した人と同一人の末梢血Ｔ細胞に
２０００ラドのＸ線を照射して得たＴ細胞２×１σ個を
加え、３日間培養後、細胞を上記培地で洗浄する。

一方、下記成分を含み且つ寒天０．３％及び０．５％を
含む軟寒天培地を調製する。

０８５％マツ］イ５Ａ培地 ｏ１５ｔ）６ＦＣ５ ０２ｍＭ　　Ｌ−タルタ三シ （）０−ラボラトリ−社製） ０１６μｆ／ｍｅ　　Ｌ−アスパラｆシ（タカラコーサ
シ■製） ０８μｆ／鱈ｔ　１．−ｐリシ （タカラコーサシ■製） ｏ１ｍ＆　　％）ジウムじルベート （フローラボラトリー社製） （）０−ラボラトリ−社製） （）０−ラボラトリ−社ａｌｌ） ０５ＸＩＯ”−’Ｍ　２−メルカづトエタノール０１０
０単位／ｍｅベニシリシ ０１００μｆ　／　＊ｔスづしづトマイシシこの軟寒天
培地中で、上記細胞を”／１　ｓｏｏ　Ｐ　ＨＡ−Ｐの
存在下に、二層法［Ｍｕｒａｙｕｃｋｉ　、　４　ｚｌ
ａｔ　／、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉ　２５．５６４（１９８
０）　］により、３７゛Ｃにて、７Ｈ間培養し、コロニ
ー形成細胞を採取する。得られた細胞は、ＦＩＴＣ−結
合−ウ９′千−抗−シト免疫りＯプリ＞　（Ｂｔｈｒｉ
ｎｙｆｔｒＡｔ　ＡＧ　、　Ｍａｒｂｕｒｙ　　）によ
る、直接免疫螢光法で、９２％が陽性を示【７九。また
この細胞の３．５％が５ＲＢＣとＯ１！ット形成を示し
た。

とのコロニー形成細胞２×１０５個を、抗−Ｌｇｕｌ抗
体産生バイブリド−７（Ｄｒ、Ｒ９Ｅｔｔａｎｓ　：　
　ス０−シケタリシジ癌研究所、　Ｎ、Ｙよシ入手）の
培養」二層１００μＩ及び袖体（４倍希釈の新生児ウリ
ｆ血清）で、細胞障害反応により処理して、混在するＴ
細胞を除去した。

かくして得たり０−シ化Ｂ細胞ｌＸＩＯ３憫を、前記実
施例３で得た各培養上溝０．２ｍｌと共に３日間培養後
、０．５μＣＩの３Ｈ−ＴｄＲを加え、６時間培養して
、　Ｈ−ＴｄＲの取シ込みを測定した。

結果を第５図（１）−（Ｂ）に示す。

（２）　ＢＣＤＦ活性 （Ａ）ＢＣＤＦｃｒ）存在下テｌ　ｙ　Ｇ産’１４ｍ胞
ＣＰＦＣ）へと分化し得る細胞であるＣＥＳＳ（ＥＢウ
ィルシストラシスフオームし九Ｂ細胞株、ス〇−シ・ケ
タリシク癌研究所Ｄｒ、Ｐ、Ｒａ１戸りよ）入手）ＩＸ
ＩＯを、前配突施例３で得た各培養上清０．２１１！と
共に４８時間培養後、リバース・づラーク・アッセイ法
によｐｌｆＧ産生細胞（ＰＦＣ）の数を測定する。

即ち、４６〜４８゛ｃで溶解させたアガロースに、″ｊ
ｏティシＡ−結合５ＲＢＣを加え、更に」二組培養後の
ＣＥＳＳ浮遊液、抗しト１　ｙＧ抗体（Ｂｇｋｒｉｎｙ
　Ｗｔｒａｇ　ＡＧ　、　Ｍａｒｂｕｒｇ　　）補体（
七ルｔット血消、５倍希釈）を加え、ペトリデイッシ１
上に広け、３７℃で４時間保温する。次いで溶血真数（
ｐ　ｐ’　ｃ数に相当）を測定し。

ＰＦＣｔｙ）増加数（ΔＰ　ＦＣ／ｎ１ｌｔｕｒｔ　）
を下式にて算出する。

結果を第５図（２）−（Ｊ）に示す。

ＣＢ）前記（１）−（Ａ）と同様にして得たしトＢ細胞
１０個を、０．００２５％　スタフィロコッカス　オー
１．、　ｒ）　ス−３−ｒ）　シＩ　（Ｃａｌｂｉｏｔ
ｋｔｍ　−ＢｚｋｒｉｎｑＣ″ｏｖｅｒ、　、　Ｌａ　
Ｊｏｌｌｙ　、　Ｃａ、）を含むＲＰＭ１１６４０＋ｌ
０９６ＦＣ５培地１　ｍｌ中で３日間培養して上記Ｂ細
胞を刺激し１次いでこの刺激細胞を上記培地で洗浄する
。

この刺激細胞２　Ｘ　１０５個を用いる以外は前記（２
）−（Ａ）と同様にして、ＰＦＣの増加数を測定する。

結果を第５図（２）−（Ｚ？）に示す。

（３）Ｔ細胞増殖因子ＣＩＬ−２＞活性ＩＬ−’ｌ依存
性しト細胞障害性Ｔ細胞を使用して、各培養上溝のＩＬ
−’ｌ活性を測定した（　０ｋａｄａ　、　Ａｆ、ｒｅ
ａｌ　、　Ｆｒｏｇ　、　Ｎａｔｌ、Ａｔａｄ、Ｓｃｉ
。

ＵＳＡ　　７８，７７１７−７７２１（１９８１））。

即ち、ＩＬ−２依存性ヒト細胞障害性Ｔ＠胞３×１０３
個を前記実施例３で得た各培養上溝の存在下に２４時間
培ＩＩ後、０．５μＣｉの　Ｈ−ＴｄＲを加え、６時間
培養後　Ｈ−ＴｄＨの取り込み量をカラシトしＩＬ−２
活性を測定した。結果を第５図（３）に示す。

上記試験例（１）〜（３）の各結果は、同一の試験な２
を、試験例（２）においては、ΔＰ　Ｆ　Ｃ／Ｃ１ｌ　
１ｕｒｅ　（個×１０２）を夫々示す。尚、対照として
、培養上清を添加しない群（Ｃ）、実施例３と同様にし
て得たＣ　Ｅ　Ａｔ　−Ａ　ＧＲ又１：ｉ　２４−　Ａ
　（０ｌａｄａ　、　Ｍ、　ｔｔ　ａｔ。

Ｐｖｏｃ、Ｎａｔｌ、ΔＣａｄ６．Ｓｃｉ、　（ＩＳＡ
　　７３　、７７１７−７７２１（１９８１）１の培譬
上清添加群及びＰＨΔ刺激Ｔ細胞因子（ＰＩＩＡ−５ｕ
ｐ）添加群を夫々併記する。尚、Ｐ　ＩＩ　Ａ　−Ｓｕ
　７　は、前記実施例１と同様にして得たｔ′：、ｔ−
１”細胞をＰＨ’　（”／１０００　）の存在下４８時
間培を後の培養、ヒ清をもファデックスＧ−１００（フ
ァルマシア社）にてゲル沖過し、分子量１５０００〜２
００００の両分を集めたものを使用した。し１・１゛細
胞１０６個よシ得られたＰＨＡ−５ｕ／を１中位として
示す。

第５図より、７７−Ａ、９４−Ｃ５９８−Ｆの各培養上
清のＢ　ＣＧ　Ｐ“活１イ１ミ及び９０−Ｅの培養上清
のＢＣＤＦ活性が明らかであり、それらはＩＬ−２活性
とは異るものであることが判る。

（４）前記試験例（１，）　−ＣＢ）と同様にして７７
−Ａ及び９４−Ｃ培養上清のＢＣＧＦ活性の相乗作用を
試験した。結果を第６図に示す。

図中、横軸は各培養上清の希釈倍率を、縦軸は　Ｈ，、
−ＴｄＲの取り込み（ｃＪ、ｍＸｌ０３）　を示す。図
中の各マークは夫々以下の通シである。

△ｉ　ＣＥ＃ＡＧの非希釈培養上清添加群ロｊＰＨΔ−
５ｕｐｒｏ単位添加群 ０；７７−Ａ培養上清添加群 ムｉ　９４−Ｃ培養上清添加群 １１２倍希釈の９４−Ｃ培養上清に各希釈倍率７７−Ａ
培養を混合して添加した群 結果は、同一試験を３度繰り返した平均士Ｓ、Ｄ、テ示
ス。該１１！Ｄ、７７−　ｉ及ヒｑ４−ｃ各培養上清の
ＢＣＧＦ活性相剰作用が判る。

即ち、ＢＣＧＦｔ７ｃは少くとも２種が存在し、互いの
相乗効果によシ、Ｂ細胞を顕著に増殖させる。この結果
は、非トラシスフォー乙のしトＢ細胞株の長期培養り０
−シ化に有力な武器を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１〜４図ケ」、ＩＡ細胞株のマイト＼ジエシ反応性を
示すグラフである。 第５図は、本発明交雑細胞のＢＣＧＦ活性（１）、ＢＣ
ＤＦ活性（２）及びＩＬ−２活性（３）を示すグラフで
ある。 第６図は、本発明交雑細胞り０−シＡ　７　？　−’の
培養−ヒ清と９４−Ｃの培養上清とを混合した場合のＩ
Ｉ　ＣＧ　Ｆ活性の相乗作用を示すグラフである。 （以　上） 第１図　　　　第３図 第６図 ＃−狭缶牽

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　しトＢ細胞増殖因子又はじトＢ＠胞分化因子の産生
   能を有することを特徴とするしトＴ交雑細胞うイシ〇 ■　ＨＧＰＲＴ欠損しト白血病性Ｔ細胞と正常しトＴ細
   胞とを融合させ、得られる交雑細胞を選択培地で選択的
   に増殖させ、これをり０−シ化し、Ｂ細胞増殖因子又は
   Ｂ細胞分化因子の産生能を有する交雑細胞ライクを得る
   ことを特徴とするＢ細胞増殖因子又はＢ細胞分化因子の
   産生能を有するしトＴ交雑細胞うイシの製造法。