JPS58162288A - 細菌の薬剤感受性測定用セツト - Google Patents

細菌の薬剤感受性測定用セツト

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JPS58162288A
JPS58162288A JP4361882A JP4361882A JPS58162288A JP S58162288 A JPS58162288 A JP S58162288A JP 4361882 A JP4361882 A JP 4361882A JP 4361882 A JP4361882 A JP 4361882A JP S58162288 A JPS58162288 A JP S58162288A
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榎本 省二
Shuhei Futami
二見 修平
Tei Hirano
平野 禎
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 用される薬剤感受性測定用セットに関するもので、簡易
な操作で、安定且つ迅速に細菌の薬剤感受性を測定する
ことが出来、しかも廉価に製作することが出来る等の特
徴を有する薬剤感受性測定用セットを提供するものであ
る・ 従来、細菌の薬剤感受性の測定方法には、固型培地や液
体培地を使用する拡散法や稀釈法が利用されていたが、
これらの従来法においては、いずれの方法も、1g−2
’1時間という長期の培養時間が必要とされ、迅速にし
て測定結果を得ることが出来ないという致命的な欠点を
有していた。
これに対して、近年開発された液体培地を使用する薬剤
感受性測定機械を利用する方法や、酸化還元指示薬を反
応指示薬として利用した反応の色調変化を、肉眼的、ま
たは光学的に判定する方法等、簡易な操作で、且つ短時
間内の培養で、薬剤の感受性結果が得られるような方法
が最近提案されている。しかしながら、前者の液体培地
を使用する薬剤感受性測定機械を操作するものは、機械
本体がいずれも非常に高価であるばかりでなく、その操
作方法も未だ半自動化の域内にあり、結局煩雑な操作が
必要であり、また、培養時間もグー6時間という7日の
作業時間の上からは中途半端な培養時間が必要であり、
一般に普及するまでには至っていない。また、後者の酸
化還元指示薬を反応指示薬として利用する方法は、例え
ば、3−(P −Iodophenyl ) −2−(
P −n1trophenyl ) −3−pheny
l −2Htetrazolium chloride
 %P −n1trophenyl−5−phenyl
 −,2Htetrazolium chloride
 、 2 + 3 +3− triphenyl −t
etrazolium chloride 、あるいは
Ftesazurin等の酸化還元指示薬を還元して生
成したジホルマずンの色調を対照と比較して判定するも
のであるが、酸化還元指示薬と一緒に発育培養されると
、成る種の細菌の場合はその発育が阻害され、その還元
能に起因して発生するジホルマずンの色調変化が正確で
はないため、この方法による測定結果に対しては、一般
に評価が低く、大きく市場に普及するまでには至ってい
ないのが実情である。
本発明は、特許請求の範囲の構成とすることにより、前
記従来法における欠点を伴うことなく、簡易な操作で、
迅速に、且つ、正確な測定結果を得ることが出来、しか
も廉価に供給することの出来る細菌の薬剤感受性測定用
セットを提供するものである。
以下、本発明の細菌の薬剤感受性測定用セットの構成に
ついて詳述する。
本発明の細菌の薬剤感受性測定用セットは、例えば第1
図−第3図において符号1で表示されるよづなガラスま
たはプラスチック製の薬剤感受性測定用トレイと、別製
の判定用錠剤との組み合わせからなるものである。
薬剤感受性測定用トレイ1は、多数の独立した凹状部2
1,22,23 ・・・・・・2m、2nによって構成
される反応槽群を有しており、該反応槽群のうちの7つ
である凹状部21には、反応槽たる凹状部21 内に、
一定量の液体培地を塗布、乾燥せしめた乾燥培地31 
が形成されておシ、残シの反応槽群である凹状部22.
2s・・・・・・2m、2nには、反応槽たる凹状部2
2,23・・・・・・2m、2n内に、前記乾燥培地3
1  を形成したときと同量の液体培地を塗布、乾燥せ
しめた乾燥培地32,33・・・・・・3m、3nと、
同一種類の抗菌性物質の溶液を、個々の濃度が相違する
ようにして塗布、乾燥せしめた抗菌性物質スポット42
 + 4a・・・・・・4m 、4nとが、これらの両
者、即ち乾燥培地32.3a・・・・・・3m、3nと
抗菌性物質スポット42 + 4s・・・・・・4m、
4nとが、交り合うことなく、区画して形成されている
前記薬剤感受性測定用トレイ1に組み合わされる別製の
判定用錠剤は、中間電子運搬体と酸化還元指示薬とを含
有するもので、普通の錠剤の製造において利用される造
粒剤や滑沢剤等と中間電子運搬体と酸化還元指示薬とを
成分とする錠剤で、通常の製錠操作で容易に得られるも
のである。この判定用錠剤を構成する中間電子運搬体と
しては、フエナジンメトサルフエイン(以下PMSと略
す)が、また、酸化還元指示薬としては、3−CP−I
odophenyl ) −2−(P −n1trop
henyl ) −5−phenyl −2Htetr
azolium cblorj、de (以下I NT
と略す)、P −njtrophenyl −5−ph
enyl −2Htetrazolj、um chlo
ride (以下NTBと略す)、コ。
3 + 5− t、rj、phenyl −tetra
zolium chl、oride (以下TTCと略
す)、Re5azurin等が使用される。
本発明の細菌の薬剤感受性測定用セットにおいて、第1
図−第3図に示される実施例における薬剤感受性測定用
トレイ1では、前記反応槽たる凹状部21,22,2a
・・・・・・2m、2nの内面に形成されている抗菌性
物質スポット42 + 43・・・・・・4m、4nは
、それぞれが同一種類の抗菌性物質で、その濃度のみが
相違する場合を示したが、本発明における薬剤感受性測
定用トレイでは、この抗菌性物質スポットは、その種類
か濃度のうちの少なくともいずれか一方が相違するよう
にして組み合わせ形成されていれば十分である。
前記構成からなる本発明の細菌の薬剤感受性測定用セッ
トにおける薬剤感受性測定用トレイの抗菌性物質スポッ
トの形成例を具体的に説明すると、同一種類の抗菌性物
質でその濃度のみを相違させて抗菌性物質スポットを形
成させたものは、該抗菌性物質の病原菌に対する感受性
を、耐性と感性とに区別するところの簡易M工C(最小
発育阻止濃度)測定用として利用されるもので、通常2
−70段階程度の任意の数からなる異別の濃度に設定さ
れたものが利用される。またこの簡易MIC測定用とし
ては、数種ないし十数種類の抗菌性物質を利用し、それ
ぞれの種類の抗菌性物質について、互に濃度が相違する
ように抗菌性物質スポットを形成することもできる。ま
た、数種から二十数類の抗菌性物質によるスポットを形
成したものは、各薬剤で設定された任意の7つの濃度で
の感受性値を耐性と感性とに区別するスクリーニング用
迅速簡易測定用トレイとして使用されるものである。
以上の構成からなる本発明の細菌の薬剤感受性測定用セ
ットの使用方法を、例えばスクリーニング用迅速簡易測
定用トレイの場合を以って説明すると以下の通りである
平板寒天培地上で分離させた数個のコロニーを取り、滅
菌した生理食塩水または滅菌蒸留水にこれを懸濁させ、
前記コロニーがグラム陽性球菌またはダラム陰性ブドウ
糖非醗酵桿菌の場合にはマツクファーランド/、0−/
、3に、グラム陰性桿菌の場合は、マツクファーランド
0.5に合わせる。
得られた懸濁液に、本発明における別製の判定用錠剤7
個を添加し、良く混合する。しかして得られた混合液を
、本発明における薬剤感受性測定用トレイの反応槽群た
る各凹状部に、各々θ、;1ml宛分注し、これを37
°0.3時間インキュベイ−ジョンした後直ちに、対照
区たる凹状部、即ち、抗菌性物質スポットの形成されて
いない凹状部による反応槽内の発色度を、その他の反応
槽内の発色度と比較して、同等の色調を呈するものを耐
性とし、色調が薄い場合、まだは培地色のみの場合を感
性として判定するものである。
以上の操作において、酸化還元指示薬によって病原菌の
発育が阻害される恐れの場合2例えば5treptoc
occus fecaelisや5taphyloco
ccus spp等の病原菌を使用する場合や、抗菌性
物質に対して耐性の場合をより鮮明な反応色で得たい場
合には、先ず、病原菌のみを懸濁させた溶液を薬剤感受
性測定用トレイの反応槽群たる各凹状部に0.2ml宛
分注し、これを37°0.3時間インキニーベイジョン
した後、判定用錠剤を滅菌蒸留水2mlに溶解させた溶
液を、各凹状部に0.1rul宛分注し、再び37°0
.13分間インキニーペイジョンするかあるいは室温に
lS分間放置した後、直ちに、得られた各反応槽内の色
調の変化を、対照区たる反応槽の色調と比較し、判定す
るようにすれば良い。
前記操作による耐性と感性との判定は、次の通りの反応
系に基いて行われるものである。
即ち、病原菌がある抗菌性物質に対して耐性の場合には
、前記インキュベイ−ジョン中に病原菌は死滅せず、対
照区である抗菌性物質スポットの形成されていない反応
槽内における病原菌と同様に、各反応槽内で発育増殖す
る。そして、この発育増殖によって、病原菌が脱水素酵
素を産出するので、この産出された脱水素酵素によって
、錠剤中に含まれ、各反応槽内に添加された酸化還元指
示薬1例えばINTが還元されてホルマずンが形成され
るので、これによって赤色の色調が呈される。これに対
して、病原菌が感性の場合には、反応槽内における抗菌
性物質の濃度で病原菌が死滅するか、あるいは発育が阻
止されるので、脱水素酵素の産出がなく、前述のような
反応が無く、反応槽内は培地色の−1まの無色になるか
、あるいは若干薄い赤色を呈するに留まる。
以上の説明及び後記実施例における本発明の細菌の薬剤
感受性測定用セットの使用方法例の説明から明らかな通
り、本発明の細菌の薬剤感受性測定用セットにおける薬
剤感受性測定用トレイの各凹状部たる反応槽内に形成さ
れている乾燥培地と抗菌性物質スポットとは、前記薬剤
感受性測定用トレイを使用して細菌の薬剤感受性の測定
を実施する際には、凹状部内に添加される中間電子運搬
体と酸化還元指示薬とを含む判定用指示薬や、細菌の懸
濁液等を通して両者がまんべんなく混合し合う位置に形
成されていることが必要であるので、普通、約3闘程度
の間隔を置いて形成されていることが好ましい。
また、薬剤感受性測定用セットにおける薬剤感受性測定
用トレイの各凹状部たる反応構内に形成される乾燥培地
と抗菌性物質スポットとは、これらが形成される際に両
者が混合してしまうと、その後の乾燥工程で、抗菌性物
質の力価が大幅に低下し、かつ、得られる薬剤感受性測
定用トレイ自体の長期保存性能が失われるので、乾燥培
地と抗菌性物質スポットとの形成に際しては、両者が混
り合わないように十分な注意をおくことが必要である。
以下本発明の細菌の薬剤感受性測定用セット及びその使
用方法を実施例に基いて説明する。
実施例/ カナマイシンを0.7M燐酸緩衝液(pH’7.g)に
溶解させ、1000tt&力価/rn1.、!;00μ
&力価/ml、2!;011g力価/ ml + / 
;はμg力価/ml 、ろ2.3 tt j9力価/m
/! 、 3 /、23 μg力価/ ’ml 。
/ 5.63tt&力価/ml 、 7.g μ&力価
/ml、3.7pg力価/ml 、 2.0 μg力価
/ mlの70段階の濃度に調整したものを、第1図−
第3図に示したと同一の構造のトレイの各凹状部たる反
応槽内の個々に、それぞれ7種類ずつ、各0.02m1
宛、凹状部内の片隅に分注した。
さらに、感受性ブイヨン培地の実際の使用量の70倍濃
度の溶液を作製し、これをミリポアフィルタ−で濾過、
滅菌したものを、前記トレイにおける各凹状部内に、前
記分注されているカナマイシン溶液と交シ合わない様に
、各凹状部内の反対側の片隅に0.02m1宛分注し、
更に、前記カナマイシン溶液が分注されていない空の状
態にある凹状部内にも対照区として0.02m1分注し
た。
しかる後に、これを40−70°Cの加熱送風で乾燥さ
せ、MIC測定用の薬剤感受性測定用トレイを作製した
他方、pMSo、33g 、xNT3j9 、ラクトー
スgog、塩化ナトリウム/ 4.lI5.9を良く粉
砕。
混合した後、インプロピルアルコールで練シ合わせ、湿
式造粒法にて造粒後、乾燥し、次いで滑沢剤マクロゴー
ル/S00を添加、混合して打錠し、判定用錠剤を得た
尚、この錠剤製造は、その作業の全てを遮光下で行い、
捷だ、得られた錠剤は褐色びん内に保存した。
得られた錠剤7錠中の組成は下記の通りである。
7錠剤(,2/ m9 ) P M S・・・・・・・・・0.71m9.IN’f
’・・・・・・・・・・・・/、θmg+ラク]・−ス
・・/ろ、0m9+塩化ナトリウム・・・、2.g9m
?。
マクロゴール/300・・・・・/、Om&以上の通り
の構成からなる薬剤感受性測定用トレイと判定用錠剤と
の組み合わせから々る本発明の細菌の薬剤感受性測定用
セットを、次の様にして使用し、細菌の薬剤感受性の測
定を行った。
細菌の薬剤感受性測定 平板寒天培地上で分離させた数個のコロニーを取り、こ
れを滅菌生理食塩水に懸濁させ、前記コロニーがダラム
陰性桿菌の場合にはマツクファーランド0.Sに、丑だ
グラム陽性球菌及びダラム陰性ブドウ糖非醗酵桿菌の場
合には、マツクファーランド7.0−7.3に調整した
尚、各コロニーのダラム陰性とダラム陽性との区別はア
ミノペゾチダーゼテストで、又、ダラム陰性桿菌とダラ
ム陰性ブドウ糖非醗酵桿菌との区別はオキシダーゼテス
ト等によって行った。
得られた懸濁液の7種を、前記作製したMIC測定用の
薬剤感受性測定用トレイの7個に適用し、各反応槽たる
凹状部内にQ、、1ml宛分注し、これを37°C23
時間インキニーベイジョンした後、更に、前記得られた
判定用錠剤7個を滅菌蒸留水2mlに溶解させだINT
含有の判定用試薬溶液を各々の反応槽たる凹状部内に0
.1ml宛分注し、これを37°C,13分間インキニ
ーペイジョンした後、直ちに色調を対照区と比較して判
定した。
以上の操作により測定した分離菌のMIC値と、日本化
学療法学会標準法(以下化療法と略す)によるMIC値
との比較結果は第1表に示す通りである。
第  /  表 実施例ス 後記第2表における抗菌性物質の欄に表示される10種
類の抗菌性物質を溶解させ、所定の濃度に調整した抗菌
性物質溶液を、第1図−第3図に示したのと同一の構造
のトレイにおける各凹状部からなる反応槽内の個々に、
それぞれ7種類ずつ、各0−02m1宛、凹状部内の片
隅に分注した。
抗菌性物質の種類とその濃度は次の通りである。
第  コ  表 尚、前記反応槽内に分注させた抗菌性物質溶液は、滅菌
蒸留水で溶解、稀釈したものである。但し、蒸留水で溶
解できない抗菌性物質は、それぞれの抗菌性物質の化療
法に従って薬剤原末(抗菌性物質)を溶解した後、滅菌
蒸留水で稀釈、調整した。
さらに、感受性ブイヨン培地の実際の使用量の70倍濃
度の溶液を作製し、これをミリポアフィルタ−で濾過、
滅菌したものを、前述のトレイにおける各凹状部内に、
前記分注されている各抗性物質溶液と交シ合わない様に
、各凹状部内の反対側の片隅に0.02 ml宛分注し
、更に、前記各抗性物質溶液が分注されていない空の状
態にある凹状部内にも対照区として0−02 m1分注
した。
しかる後に、これを減圧乾燥させ、スクリーニング用迅
速簡易測定用の薬剤感受性測定用トレイを作製した。
得られた薬剤感受性測定用トレイと、前述の実施例/で
得られた判定用錠剤と同一の構成からなるINT含有の
判定用錠剤との組み合わせから々る本発明の細菌の薬剤
感受性測定用セットを、次の様に使用し、細菌の薬剤感
受性の測定を行った。
細菌の薬剤感受性測定 平板寒天培地上で分離させた数個のコロニーを取り、ダ
ラム陰性菌と推定される分離菌のみに、これを滅菌生理
食塩水に懸濁させ、それがダラム陰性桿菌と推定される
ものはマツクファーランド0.5に、まだ、ダラム陰性
ブドウ糖非醗酵桿菌と推定されるものは、マツクファー
ランド7.0−7.5に調整した。
得られた懸濁液を使用して、以下、実施例/における懸
濁液と薬剤感受性測定用トレイとの操作と同様に操作し
、前記分離菌の判定結果を得た。
得られた判定結果を、化療法によるMIC値と併せ第3
表に示す。
実施例3 セファロシンを、前記実施例コにおけるセファロシン溶
液の作製と同様に操作して溶解させ、700μg力価/
m1.200ttfl力価/ml、ll100p力価/
ml!、g00ttE/力価/ mlのq段階の濃度に
調整したものを、第1図−第3図に示したと同一の構造
のトレイの各凹状部たる反応槽内の個々に”、それぞれ
7種類ずつ、各0.02m1宛、凹状部内の片隅に分注
した。
さらに、感受性ブイヨン培地の実際の使用量の10倍濃
度の溶液を作製し、これをミリポアフィルタ−で濾過、
滅菌したものを、前記トレイにおける各凹状部内に、前
記分注されているセファロシン溶液と交り合わない様に
、各凹状部内の反対側の片隅に0.02 ml宛分注し
、更に、前記セファロシン溶液が分注されていない空の
状態にある凹状部内にも対照区として0.02m1分注
した。
しかる後に、これをbo−qo℃の加熱送風で乾燥させ
、MIC測定用の薬剤感受性測定用トレイを作製した。
得られた薬剤感受性測定用トレイと、前述の実施例/で
得られた判定用錠剤と同一の構成からなるINT含有の
判定用錠剤との組み合わせからなる本発明の細菌の薬剤
感受性測定用セットを、次の様に使用し、細菌の薬剤感
受性の測定を行った。
細菌の薬剤感受性測定 平板寒天培地上で分離させた数個のコロニーを取り、ダ
ラム陰性菌と推定される分離菌は、これを滅菌生理食塩
水に懸濁させ、ダラム陰性桿菌と推定されるものはマツ
クファーランド0.5に、また、グラム陽性球菌と推定
されるものは、マツクファーランド/、0−/、5に調
整した。
得られた各懸濁液、1.Qmlに、前記INT含有の判
定用錠剤/錠宛を添加し、十分に混合した混合液の7種
を、前記作製したMIC測定用の薬剤感受性測定用トレ
イの7個に適用し、各反応槽たる凹状部内にQ、、、1
m、l宛分注した。しかる後に、これを37°C23時
間インキュベイ−ジョンし、直ちに各凹状部内の色調を
対照区の色調と比較して判定した。
以上の操作により測定した分離菌のMIC値と、化療法
によるMIC値との比較結果は第9表に示す通りである
第  q  表 本発明の細菌の薬剤感受性測定用セットは、斜上の通り
の構成から成るものであり、一定量の乾燥培地と抗菌性
物質とが予め形成されている薬剤感受性測定用トレイに
しであるので、細菌の薬剤感受性の測定操作が簡易で、
迅速に行い得るという作用、効果を有する。
また、薬剤感受性測定用トレイにおける反応槽たる凹状
部内には、抗菌性物質と乾燥培地が区画して形成されて
いるので、保存安定性が良好であるという作用、効果、
も有する。
更に、本発明の細菌の薬剤感受性測定用セットでは、指
示薬たる酸化還元指示薬を、培地となる乾燥培地とは別
に構成したので、予め培地中に指示薬が混在されている
ものと比較して、保存安定性と試薬安定性とが極めて良
好であるし、また、インキューベート後にこの指示薬成
分を添加する操作を行うことが出来るので、指示薬に阻
害を受ける性質を有する細菌の薬剤感受性測定を行うこ
とも出来るという作用、効果も奏する。
また、本発明の細菌の薬剤感受性測定用セットでは、指
示薬たる酸化還元指示薬を中間電子運搬体と共に使用す
るようにしているので、短時間の培養時間で測定結果が
得られるという作用、効果を有する。
さらに、本発明の細菌の薬剤感受性測定用セットでは、
薬剤感受性測定用トレイにおける凹状部内に形成されて
いる抗菌性物質スポットを、ある種の抗菌剤の倍々稀釈
したものを、/−数種類の抗菌剤について形成させるこ
とにより、MIC測定用として、また、種々の抗菌剤の
それぞれについての一定濃度のもので形成させることに
より、スクリーニング用として構成することが出来るの
で、目的に応じた用途を有するものを、容易に得ること
が出来るという作用、効果も有する。
【図面の簡単な説明】
第1図−第3図は本発明の細菌の薬剤感受性測定用セッ
トにおける薬剤感受性測定用トレイの/実施例を示すも
のであり、第1図は正面図、第2図は第1図の■−■線
位置において破断して示した斜面図、第3図は第1図の
■−■線断面図である。 特許出願人 栄研化学株式会社 代理人市川理吉 新  井  清  子

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)  多数の独立した凹状部からなる反応槽群を有
    する薬剤感受性測定用トレイと、中間電子運搬体と酸化
    還元指示薬とを含有する判定用錠剤との組み合わせから
    なる細菌の薬剤感受性測定用セットにおいて、前記薬剤
    感受性測定用トレイにおける反応槽群のうちの1つには
    、該反応槽内に、一定量の液体培地を塗布、乾燥せしめ
    た乾燥培地のみが形成されておシ、残シの反応槽群には
    、該反応槽内の個々に、前記と同量の液体培地を塗布、
    乾燥せしめた乾燥培地と、少なくとも種類と濃度とのう
    ちのいずれか/方が互に相違する抗菌性物質スポットと
    が、これらの両者が区画されて形成されていることを特
    徴とする細菌の薬剤感受性測定用セット。
  2. (2)  抗菌性物質スポットが、濃度の相違する同一
    種類の抗菌性物質スポットである特許請求の範囲第1項
    記載の細菌の薬剤感受性測定用セット。
  3. (3)抗菌性物質スポットが、複数種の互に異なる種類
    の抗菌性物質による抗菌性物質スポットである特許請求
    の範囲第1項記載の細菌の薬剤感受性測定用セット。
  4. (4)  抗菌性物質スポットが、“複数種の抗菌性物
    質で、それぞれの種類において濃度の相違する抗菌性物
    質スポットである特許請求の範囲第1項記載の細菌の薬
    剤感受性測定用セット。
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