JPH1198935A - 動物精子の凍結保存方法 - Google Patents
動物精子の凍結保存方法Info
- Publication number
- JPH1198935A JPH1198935A JP9261361A JP26136197A JPH1198935A JP H1198935 A JPH1198935 A JP H1198935A JP 9261361 A JP9261361 A JP 9261361A JP 26136197 A JP26136197 A JP 26136197A JP H1198935 A JPH1198935 A JP H1198935A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cryopreservation
- sperm
- freezing
- egg yolk
- container
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
(57)【要約】
【課題】 卵黄含有凍結保存液調製の簡易化と、高い精
子生存率と良好な活力を実現可能な凍結保存方法を提供
する。 【解決手段】 動物精子の凍結保存において、液状卵黄
に糖を添加した後乾燥して得られた糖加卵黄粉末を卵黄
含有凍結保存液の調製に用い、当該卵黄含有凍結保存液
を用いて凍結保存することを特徴とする動物精子の凍結
保存方法と、内部の冷却層厚が２〜３mm厚で内容量５〜
７mlの動物精子の凍結用容器を用い、ほぼ−100〜−130
℃の液体窒素ガス中で凍結用容器内の精子凍結保存縣濁
液を氷晶化させた後、−150℃以下の液体窒素液面上ほ
ぼ４〜10cmの位置に同容器を水平保持して冷却する動物
精子の凍結保存方法である。
子生存率と良好な活力を実現可能な凍結保存方法を提供
する。 【解決手段】 動物精子の凍結保存において、液状卵黄
に糖を添加した後乾燥して得られた糖加卵黄粉末を卵黄
含有凍結保存液の調製に用い、当該卵黄含有凍結保存液
を用いて凍結保存することを特徴とする動物精子の凍結
保存方法と、内部の冷却層厚が２〜３mm厚で内容量５〜
７mlの動物精子の凍結用容器を用い、ほぼ−100〜−130
℃の液体窒素ガス中で凍結用容器内の精子凍結保存縣濁
液を氷晶化させた後、−150℃以下の液体窒素液面上ほ
ぼ４〜10cmの位置に同容器を水平保持して冷却する動物
精子の凍結保存方法である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、液状又は凍結によ
る動物精子の凍結保存方法に関するものである。
る動物精子の凍結保存方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】動物精子の凍結保存は、次のような方法
で行われている。糖加卵黄水溶液(糖加卵黄液)或いは糖
加卵黄クエン酸緩衝液(以下糖加卵ク液と略記)で精液、
または糖加クエン酸緩衝液で(以下糖加ク液と略記)希釈
・遠心洗浄後の精子縣濁液を例えば豚精子の場合では必
要精子濃度の二分の一量に一次希釈し、15℃程度に冷却
した後、５℃前後の温度域まで冷蔵装置を有する低温庫
内で徐々に冷却する。５℃前後の温度域で同温度の３〜
10％のグリセリンを添加した同量の糖加卵黄液または糖
加卵ク液で１〜３時間をかけて徐々に倍量まで２次希釈
する。２次希釈精子縣濁液は、グリセリン平衡のため、
５℃前後の低温庫内にさらに１〜２時間静置する。グリ
セリン平衡後の２次希釈精子縣濁液(以下２次縣濁液と
略記)の凍結保存に際しては、予め凍結容器内に低温庫
内で充填する。牛精子の場合は内容量0.5mlの綿栓付き
プラスチックストロー(内径３mm)が、豚精子の場合は５
mlのストロー(内径５mm)が、それぞれ使われるのが通常
である。２次縣濁液を充填したストローは、液体窒素ガ
ス中で急速凍結され、液体窒素容器中で凍結保存され
る。その他の凍結方法として、ドライアイス上の小穴に
２次縣濁液を滴下して凍結後、プラスチック容器内に凍
結錠剤化小粒とする方法もある。
で行われている。糖加卵黄水溶液(糖加卵黄液)或いは糖
加卵黄クエン酸緩衝液(以下糖加卵ク液と略記)で精液、
または糖加クエン酸緩衝液で(以下糖加ク液と略記)希釈
・遠心洗浄後の精子縣濁液を例えば豚精子の場合では必
要精子濃度の二分の一量に一次希釈し、15℃程度に冷却
した後、５℃前後の温度域まで冷蔵装置を有する低温庫
内で徐々に冷却する。５℃前後の温度域で同温度の３〜
10％のグリセリンを添加した同量の糖加卵黄液または糖
加卵ク液で１〜３時間をかけて徐々に倍量まで２次希釈
する。２次希釈精子縣濁液は、グリセリン平衡のため、
５℃前後の低温庫内にさらに１〜２時間静置する。グリ
セリン平衡後の２次希釈精子縣濁液(以下２次縣濁液と
略記)の凍結保存に際しては、予め凍結容器内に低温庫
内で充填する。牛精子の場合は内容量0.5mlの綿栓付き
プラスチックストロー(内径３mm)が、豚精子の場合は５
mlのストロー(内径５mm)が、それぞれ使われるのが通常
である。２次縣濁液を充填したストローは、液体窒素ガ
ス中で急速凍結され、液体窒素容器中で凍結保存され
る。その他の凍結方法として、ドライアイス上の小穴に
２次縣濁液を滴下して凍結後、プラスチック容器内に凍
結錠剤化小粒とする方法もある。
【０００３】上記に記載する糖加卵黄液及び糖加卵ク液
の作製に用いられる卵黄は、新鮮鶏卵を卵割して卵黄と
卵白を分離した後、滅菌濾紙で完全に卵白を除去する操
作が必要で、大量の当該液を作製する場合には長時間と
労力が必要である。更に、薬品として市販されている卵
黄粉末を使用する場合は、卵黄粉末が難溶性であること
が欠点である。
の作製に用いられる卵黄は、新鮮鶏卵を卵割して卵黄と
卵白を分離した後、滅菌濾紙で完全に卵白を除去する操
作が必要で、大量の当該液を作製する場合には長時間と
労力が必要である。更に、薬品として市販されている卵
黄粉末を使用する場合は、卵黄粉末が難溶性であること
が欠点である。
【０００４】また、凍結前あるいは３８℃の温湯中に凍
結ストローを１分間浸漬した凍結融解後の精子生存率及
び活力の検査は、顕微鏡下で観察して行われ、原精液そ
のままを材料として行う場合と、糖加ク液で希釈して行
う場合がある。
結ストローを１分間浸漬した凍結融解後の精子生存率及
び活力の検査は、顕微鏡下で観察して行われ、原精液そ
のままを材料として行う場合と、糖加ク液で希釈して行
う場合がある。
【０００５】糖加卵黄液または糖加卵ク液を使用しない
方法としては、特開平5−7489号がある。当該の公開特
許公報には、(１)トレハロースを含有する血清不含凍結
用培地、(２)ゼラチンを含有する血清不含凍結用培地、
(３)トレハロースとゼラチンを含有する血清不含凍結用
培地、及び(１)，(２)，(３)の凍結保存用培地を使用し
て各種動物由来細胞株及びヒト正常人由来リンパ球を凍
結保存する方法が提供されており、発明の効果として家
畜由来の精子にも適用できると考えられると記載されて
いる。
方法としては、特開平5−7489号がある。当該の公開特
許公報には、(１)トレハロースを含有する血清不含凍結
用培地、(２)ゼラチンを含有する血清不含凍結用培地、
(３)トレハロースとゼラチンを含有する血清不含凍結用
培地、及び(１)，(２)，(３)の凍結保存用培地を使用し
て各種動物由来細胞株及びヒト正常人由来リンパ球を凍
結保存する方法が提供されており、発明の効果として家
畜由来の精子にも適用できると考えられると記載されて
いる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、動物精
子の凍結保存方法の適否は、凍結融解後の精子生存性の
良否で判定され、人工授精技術が普及している牛及び豚
においては、人工授精による受胎率が重要であり、凍結
融解後の精子生存率と活力が受胎率を左右するとされ、
単胎動物である牛では50％の生存率との活力(活発な前
進運動を示す)が、また、多胎動物の豚では１回の人工
授精に30〜50億の生存精子数が必要とされている。これ
らの理由から、精子の凍結技術においては融解後の精子
生存率と活力が重要で、より高い精子生存率と良好な活
力を実現可能な凍結保存方法を提供することにある。特
に、豚凍結精液では、従来の凍結保存液及び凍結保存方
法では凍結融解後の良好な精子生存性が得られないこと
から、農家に技術普及するまでには至っていないのが実
情である。
子の凍結保存方法の適否は、凍結融解後の精子生存性の
良否で判定され、人工授精技術が普及している牛及び豚
においては、人工授精による受胎率が重要であり、凍結
融解後の精子生存率と活力が受胎率を左右するとされ、
単胎動物である牛では50％の生存率との活力(活発な前
進運動を示す)が、また、多胎動物の豚では１回の人工
授精に30〜50億の生存精子数が必要とされている。これ
らの理由から、精子の凍結技術においては融解後の精子
生存率と活力が重要で、より高い精子生存率と良好な活
力を実現可能な凍結保存方法を提供することにある。特
に、豚凍結精液では、従来の凍結保存液及び凍結保存方
法では凍結融解後の良好な精子生存性が得られないこと
から、農家に技術普及するまでには至っていないのが実
情である。
【０００７】また、上記特開平5−7489号に記載されて
いる0.25モル濃度のトレハロース及び15％グリセロール
を用いた血清不含凍結用培地による凍結保存方法では、
試験の結果、牛精子及び豚精子においては凍結融解後の
精子生存率は0.01％程度に留まり、精子活力も±と極め
て弱く、動物精子の凍結保存には不適と判断される。
いる0.25モル濃度のトレハロース及び15％グリセロール
を用いた血清不含凍結用培地による凍結保存方法では、
試験の結果、牛精子及び豚精子においては凍結融解後の
精子生存率は0.01％程度に留まり、精子活力も±と極め
て弱く、動物精子の凍結保存には不適と判断される。
【０００８】更に、従来から使用されている卵黄含有凍
結保存液は、数種類の緩衝作用を有する薬品や無機物，
栄養物質としての糖や卵黄及びグリセリン，エチレング
リコール，プロパンジオール，ジメチルスルホオキサイ
ド等の耐凍剤を含む水溶液から構成されており、作製に
時間と労力を要し、特に新鮮鶏卵からの液状卵黄の分離
は煩雑な作業である。このことから本発明は、可溶性粉
末薬品と液状薬品を混合し水溶液化することにより、卵
黄含有凍結保存液の作製工程の簡易化が実現可能な技術
を提供することにある。
結保存液は、数種類の緩衝作用を有する薬品や無機物，
栄養物質としての糖や卵黄及びグリセリン，エチレング
リコール，プロパンジオール，ジメチルスルホオキサイ
ド等の耐凍剤を含む水溶液から構成されており、作製に
時間と労力を要し、特に新鮮鶏卵からの液状卵黄の分離
は煩雑な作業である。このことから本発明は、可溶性粉
末薬品と液状薬品を混合し水溶液化することにより、卵
黄含有凍結保存液の作製工程の簡易化が実現可能な技術
を提供することにある。
【０００９】以上のことから明らかなように、本発明
は、糖加卵黄液及び糖加卵ク液の作製を高能率かつ簡
易に行えるようにすること、高い精子生存率と良好な
活力を実現可能な凍結保存方法を提供することを課題と
した。
は、糖加卵黄液及び糖加卵ク液の作製を高能率かつ簡
易に行えるようにすること、高い精子生存率と良好な
活力を実現可能な凍結保存方法を提供することを課題と
した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記課題を本発明は、
(１)動物精子の凍結保存において、液状卵黄に糖を添加
した後乾燥して得られた糖加卵黄粉末を卵黄含有凍結保
存液の調製に用い、当該卵黄含有凍結保存液を用いて凍
結保存することとした。液状卵黄に糖を添加して粉末化
した糖加卵黄粉末は保存液調製時に高能率に溶解する特
徴がある。糖類の例としては、トレハロース,ラクトー
ス,マルトースなどを挙げることができる。
(１)動物精子の凍結保存において、液状卵黄に糖を添加
した後乾燥して得られた糖加卵黄粉末を卵黄含有凍結保
存液の調製に用い、当該卵黄含有凍結保存液を用いて凍
結保存することとした。液状卵黄に糖を添加して粉末化
した糖加卵黄粉末は保存液調製時に高能率に溶解する特
徴がある。糖類の例としては、トレハロース,ラクトー
ス,マルトースなどを挙げることができる。
【００１１】また、(２)内部の冷却層厚が２〜３mm厚で
内容量５〜７mlの動物精子の凍結用容器を用い、ほぼ−
100〜−130℃の液体窒素ガス中で凍結用容器内の精子凍
結保存縣濁液を氷晶化させた後、−150℃以下の液体窒
素液面上ほぼ４〜10cmの位置に同容器を水平保持して冷
却することとした。凍結用容器の内部の冷却層厚を２〜
３mm厚とすることにより、冷却ムラが無くなる。更に、
内容量を５〜７mlとしたことにより、豚のような多胎動
物の凍結精液の良好な精子生存性が得られることから、
農家に技術普及することが可能となる。凍結用容器の冷
却層厚と内容量をこのような範囲にするための方法とし
ては、形状を従来の円筒管に限定することなく、例え
ば、扁平断面管にするとか、細い円筒管を平面内で曲折
状態としたり、円筒管を矩形曲折して成形する等が考え
られる。氷晶化は−100〜−130℃、特に−120℃が最も
好ましい。−100℃以上の温度では氷晶化が困難とな
り、−130℃以下では氷晶化よりも凍結の領域となって
好ましくない。液体窒素液面上の凍結用容器の配置は４
cmよりも液体窒素に接近させると、液体窒素に触れるお
それが生じて好ましくない。
内容量５〜７mlの動物精子の凍結用容器を用い、ほぼ−
100〜−130℃の液体窒素ガス中で凍結用容器内の精子凍
結保存縣濁液を氷晶化させた後、−150℃以下の液体窒
素液面上ほぼ４〜10cmの位置に同容器を水平保持して冷
却することとした。凍結用容器の内部の冷却層厚を２〜
３mm厚とすることにより、冷却ムラが無くなる。更に、
内容量を５〜７mlとしたことにより、豚のような多胎動
物の凍結精液の良好な精子生存性が得られることから、
農家に技術普及することが可能となる。凍結用容器の冷
却層厚と内容量をこのような範囲にするための方法とし
ては、形状を従来の円筒管に限定することなく、例え
ば、扁平断面管にするとか、細い円筒管を平面内で曲折
状態としたり、円筒管を矩形曲折して成形する等が考え
られる。氷晶化は−100〜−130℃、特に−120℃が最も
好ましい。−100℃以上の温度では氷晶化が困難とな
り、−130℃以下では氷晶化よりも凍結の領域となって
好ましくない。液体窒素液面上の凍結用容器の配置は４
cmよりも液体窒素に接近させると、液体窒素に触れるお
それが生じて好ましくない。
【００１２】牛精子の凍結保存においては、原精液の精
子生存率90％以上及び＋＋＋の活力であれば、従来の凍
結保存方法による凍結融解精子において50〜60％の融解
後精子生存率及び＋＋＋〜＋＋の精子活力の再現が可能
とされているが、本発明の上記(１)(３)による卵黄含有
凍結保存液と凍結保存方法を用いれば、55〜70％の凍結
融解後の精子生存率及び＋＋＋の精子活力の再現が可能
である。特に、卵黄含有凍結保存液に添加する糖として
従来法では0.244モル濃度のラクトースを添加するが、
本発明の上記(１)の同等モル濃度のトレハロースの添加
により凍結融解後の精子生存率の５〜10％の向上が可能
となるだけでなく、精子活力においても顕著な改善を呈
することが特徴である。豚精子の凍結保存においては、
30〜50億の生存精子が１回の人工授精に必要なことか
ら、従来の凍結保存方法では５ml容量の内径５mmで長さ
27.5cmの凍結用ストローを使用し、液体窒素液面上４cm
の位置に20分間水平に保持して凍結するが、内径が太く
液体窒素ガスによる冷却ではストロー内の均質な冷却効
果が得られないことから、融解後の精子生存率は40〜50
％程度で、精子活力も＋＋〜＋＋＋と融解精子の生存性
は低い。本発明の(１)(２)による卵黄含有凍結保存液及
び凍結保存方法による豚精子の凍結保存においては、牛
精子において効果が認められた栄養物質としてのトレハ
ロース及び可溶性卵黄粉末の効果に加え、凍結保存容器
の内径を小さくすることによる均質な冷却効果が相乗的
に加わることにより、60〜70％の凍結融解後の精子生存
率及び＋＋＋の精子活力が再現可能となり、従来法に比
べ20％の精子生存率の向上と精子活力の顕著な改善効果
が得られることが特徴である。
子生存率90％以上及び＋＋＋の活力であれば、従来の凍
結保存方法による凍結融解精子において50〜60％の融解
後精子生存率及び＋＋＋〜＋＋の精子活力の再現が可能
とされているが、本発明の上記(１)(３)による卵黄含有
凍結保存液と凍結保存方法を用いれば、55〜70％の凍結
融解後の精子生存率及び＋＋＋の精子活力の再現が可能
である。特に、卵黄含有凍結保存液に添加する糖として
従来法では0.244モル濃度のラクトースを添加するが、
本発明の上記(１)の同等モル濃度のトレハロースの添加
により凍結融解後の精子生存率の５〜10％の向上が可能
となるだけでなく、精子活力においても顕著な改善を呈
することが特徴である。豚精子の凍結保存においては、
30〜50億の生存精子が１回の人工授精に必要なことか
ら、従来の凍結保存方法では５ml容量の内径５mmで長さ
27.5cmの凍結用ストローを使用し、液体窒素液面上４cm
の位置に20分間水平に保持して凍結するが、内径が太く
液体窒素ガスによる冷却ではストロー内の均質な冷却効
果が得られないことから、融解後の精子生存率は40〜50
％程度で、精子活力も＋＋〜＋＋＋と融解精子の生存性
は低い。本発明の(１)(２)による卵黄含有凍結保存液及
び凍結保存方法による豚精子の凍結保存においては、牛
精子において効果が認められた栄養物質としてのトレハ
ロース及び可溶性卵黄粉末の効果に加え、凍結保存容器
の内径を小さくすることによる均質な冷却効果が相乗的
に加わることにより、60〜70％の凍結融解後の精子生存
率及び＋＋＋の精子活力が再現可能となり、従来法に比
べ20％の精子生存率の向上と精子活力の顕著な改善効果
が得られることが特徴である。
【００１３】本発明の上記(１)による顕著な効果とし
て、卵黄含有凍結保存液の調製に要する時間の短縮化と
労力の軽減が挙げられる。従来の液状卵黄を使用する場
合、２リットルの卵黄含有凍結保存液調製には２時間を
要するが、本発明の上記(１)の可溶性卵黄粉末の利用に
より１時間に短縮可能である。更に、可溶性卵黄粉末の
基材に必要粉末薬品を予め添加し、冷蔵庫内に保管する
ことも可能であることから、緊急的に卵黄含有凍結保存
液を調製する場合にも便利で、卵黄含有凍結保存液の調
製において簡易化及び省力化が実現できる。
て、卵黄含有凍結保存液の調製に要する時間の短縮化と
労力の軽減が挙げられる。従来の液状卵黄を使用する場
合、２リットルの卵黄含有凍結保存液調製には２時間を
要するが、本発明の上記(１)の可溶性卵黄粉末の利用に
より１時間に短縮可能である。更に、可溶性卵黄粉末の
基材に必要粉末薬品を予め添加し、冷蔵庫内に保管する
ことも可能であることから、緊急的に卵黄含有凍結保存
液を調製する場合にも便利で、卵黄含有凍結保存液の調
製において簡易化及び省力化が実現できる。
【００１４】
実施例１ 豚精子を用い、凍結前の豚精子の処理は従来法に準じて
行った。凍結方法は、液体窒素液面上４cmに水平に保持
する従来法(一段階法)で行い、凍結容器に５mlの豚用太
型ストローを対照区容器とし、試験区容器として本発明
の(２)と同じ冷却層厚(＝内径)３mmの0.5mlの牛用細型
ストローを用いた。なお、糖加卵黄液に添加する糖とし
ては、従来法において用いられているラクトースとトレ
ハロースを使用し、グリセリンは３％濃度に調整した。
融解は、38℃の温湯中にストローを１分間浸漬して行
い、８倍量の0.154モルグルコースの糖加ク液にストロ
ー内液を希釈し、38℃に加温して経時的精子生存率を検
査した。
行った。凍結方法は、液体窒素液面上４cmに水平に保持
する従来法(一段階法)で行い、凍結容器に５mlの豚用太
型ストローを対照区容器とし、試験区容器として本発明
の(２)と同じ冷却層厚(＝内径)３mmの0.5mlの牛用細型
ストローを用いた。なお、糖加卵黄液に添加する糖とし
ては、従来法において用いられているラクトースとトレ
ハロースを使用し、グリセリンは３％濃度に調整した。
融解は、38℃の温湯中にストローを１分間浸漬して行
い、８倍量の0.154モルグルコースの糖加ク液にストロ
ー内液を希釈し、38℃に加温して経時的精子生存率を検
査した。
【００１５】その結果を、表１に示す。豚用５ml太型ス
トローの対照区容器及び牛用0.5ml細型ストローの試験
区容器の両区においていずれもラクトースよりトレハロ
ースが精子生存率で優り、有効であった。一方、容器別
では、ラクトース及びトレハロースの両区において、い
ずれも対照区容器である太型ストローより試験区容器で
ある細型ストローが優り、有効であった。以上の結果か
ら、グリセリン濃度が３％の場合は、添加糖及び凍結容
器はトレハロースと0.5ml細型ストローが最も有効であ
ると結論し得る。従って、豚用冷凍容器としては内部の
冷却層厚が２〜３mm厚で内容量５〜７mlの動物精子の凍
結用容器が好ましい。
トローの対照区容器及び牛用0.5ml細型ストローの試験
区容器の両区においていずれもラクトースよりトレハロ
ースが精子生存率で優り、有効であった。一方、容器別
では、ラクトース及びトレハロースの両区において、い
ずれも対照区容器である太型ストローより試験区容器で
ある細型ストローが優り、有効であった。以上の結果か
ら、グリセリン濃度が３％の場合は、添加糖及び凍結容
器はトレハロースと0.5ml細型ストローが最も有効であ
ると結論し得る。従って、豚用冷凍容器としては内部の
冷却層厚が２〜３mm厚で内容量５〜７mlの動物精子の凍
結用容器が好ましい。
【００１６】
【表１】
【００１７】実施例２ 豚精子を用いて、ラクトース及びトレハロースを添加糖
とし、凍結容器として0.5mlの細型ストローを用いた場
合のグリセリンの適正濃度を確認するための予備実験を
行った。実験方法は、実施例１に準じた。グリセリン濃
度は、３％及び７％とし、凍結方法は一段階法で行っ
た。その結果を、表２に示す。この結果、ラクトース及
びトレハロースの両区において、いずれもグリセリン３
％区より７％区が良好な精子生存率を示し有効であっ
た。添加糖別では、ラクトース区及びトレハロース区と
もにグリセリン７％区が良好な結果であつたが、最も優
れた結果を示したのはトレハロース区の７％グリセリン
区であった。以上の結果から、凍結容器として0.5ml細
型ストローを用いて一段階凍結する場合の添加糖として
は実施例１と同様ラクトースよりトレハロースが有効で
あり、グリセリン濃度は５ml太型ストローで従来から用
いられていた３％よりも高濃度の７％で良好な結果を示
した。
とし、凍結容器として0.5mlの細型ストローを用いた場
合のグリセリンの適正濃度を確認するための予備実験を
行った。実験方法は、実施例１に準じた。グリセリン濃
度は、３％及び７％とし、凍結方法は一段階法で行っ
た。その結果を、表２に示す。この結果、ラクトース及
びトレハロースの両区において、いずれもグリセリン３
％区より７％区が良好な精子生存率を示し有効であっ
た。添加糖別では、ラクトース区及びトレハロース区と
もにグリセリン７％区が良好な結果であつたが、最も優
れた結果を示したのはトレハロース区の７％グリセリン
区であった。以上の結果から、凍結容器として0.5ml細
型ストローを用いて一段階凍結する場合の添加糖として
は実施例１と同様ラクトースよりトレハロースが有効で
あり、グリセリン濃度は５ml太型ストローで従来から用
いられていた３％よりも高濃度の７％で良好な結果を示
した。
【００１８】
【表２】
【００１９】実施例３ 豚精子を用いて、トレハロースを添加糖とし、かつ凍結
容器として0.5mlの細型ストローを用いた場合のグリセ
リンの適正濃度を確認する実験を行った。実験方法は、
実施例１に準じた。グリセリン濃度は、３％，５％，７
％，９％及び11％とし、凍結方法は一段階法で行った。
その結果を表３に示す。この結果、５〜９％のグリセリ
ン濃度区で65〜70％の＋＋＋活力の良好な生存率が得ら
れたが、38℃での継続培養では７％濃度区で最も良好な
精子生存性が観察された。以上のことから、0.5mlスト
ロー(内径３mm)を凍結容器として糖加卵黄液で豚精子を
凍結する場合の最適グリセリン濃度は７％と判断され
る。
容器として0.5mlの細型ストローを用いた場合のグリセ
リンの適正濃度を確認する実験を行った。実験方法は、
実施例１に準じた。グリセリン濃度は、３％，５％，７
％，９％及び11％とし、凍結方法は一段階法で行った。
その結果を表３に示す。この結果、５〜９％のグリセリ
ン濃度区で65〜70％の＋＋＋活力の良好な生存率が得ら
れたが、38℃での継続培養では７％濃度区で最も良好な
精子生存性が観察された。以上のことから、0.5mlスト
ロー(内径３mm)を凍結容器として糖加卵黄液で豚精子を
凍結する場合の最適グリセリン濃度は７％と判断され
る。
【００２０】
【表３】
【００２１】実施例４ 豚精子を用いて、トレハロースを添加糖とし、凍結容器
として0.5mlの細型ストローを用い、グリセリン濃度を
７％とした場合の凍結方法に関する実験を行った。実験
方法は、実施例２に準じた。凍結方法は従来から行われ
ている液体窒素液面上４cmに水平に保持する一段階法と
−120℃の液体窒素ガス中でストロー内を氷晶化させた
後に−150℃以下の温度で冷却する二段階凍結法(二段階
法)を比較検討した。その結果を、表４に示す。この結
果、二段階法が一段階法より５％良好な精子生存率を示
し、有効であった。
として0.5mlの細型ストローを用い、グリセリン濃度を
７％とした場合の凍結方法に関する実験を行った。実験
方法は、実施例２に準じた。凍結方法は従来から行われ
ている液体窒素液面上４cmに水平に保持する一段階法と
−120℃の液体窒素ガス中でストロー内を氷晶化させた
後に−150℃以下の温度で冷却する二段階凍結法(二段階
法)を比較検討した。その結果を、表４に示す。この結
果、二段階法が一段階法より５％良好な精子生存率を示
し、有効であった。
【００２２】
【表４】
【００２３】
【発明の効果】本発明により、卵黄含有凍結保存液の作
製工程における新鮮鶏卵からの液状卵黄の煩雑な分離作
業が不要となり、卵黄含有凍結保存液調製の簡易化が実
現できて、作製時間と労力の改善が可能となった。可溶
性卵黄粉末の基材に必要粉末薬品を予め添加し、冷蔵庫
内に保管することも可能であることから、緊急的に卵黄
含有凍結保存液を調製する場合にも便利である。また、
凍結融解後の精子生存率並びに活力において従来の凍結
方法に比べ著しい改善が実現可能となった。加えて、
牛,豚等の人工授精による受胎率の向上と、従来困難で
あった養豚農家への人工受精の普及を可能にした。
製工程における新鮮鶏卵からの液状卵黄の煩雑な分離作
業が不要となり、卵黄含有凍結保存液調製の簡易化が実
現できて、作製時間と労力の改善が可能となった。可溶
性卵黄粉末の基材に必要粉末薬品を予め添加し、冷蔵庫
内に保管することも可能であることから、緊急的に卵黄
含有凍結保存液を調製する場合にも便利である。また、
凍結融解後の精子生存率並びに活力において従来の凍結
方法に比べ著しい改善が実現可能となった。加えて、
牛,豚等の人工授精による受胎率の向上と、従来困難で
あった養豚農家への人工受精の普及を可能にした。
Claims (2)
- 【請求項１】 動物精子の凍結保存において、液状卵黄
に糖を添加した後乾燥して得られた糖加卵黄粉末を卵黄
含有凍結保存液の調製に用い、当該卵黄含有凍結保存液
を用いて凍結保存することを特徴とする動物精子の凍結
保存方法。 - 【請求項２】 内部の冷却層厚が２〜３mm厚で内容量５
〜７mlの動物精子の凍結用容器を用い、−100〜−130℃
の液体窒素ガス中で凍結用容器内の精子凍結保存縣濁液
を氷晶化させた後、−150℃以下の液体窒素液面上ほぼ
４〜10cmの位置に同容器を水平保持して冷却する動物精
子の凍結保存方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9261361A JPH1198935A (ja) | 1997-09-26 | 1997-09-26 | 動物精子の凍結保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9261361A JPH1198935A (ja) | 1997-09-26 | 1997-09-26 | 動物精子の凍結保存方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1198935A true JPH1198935A (ja) | 1999-04-13 |
Family
ID=17360783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9261361A Pending JPH1198935A (ja) | 1997-09-26 | 1997-09-26 | 動物精子の凍結保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1198935A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030014891A (ko) * | 2001-08-13 | 2003-02-20 | (주)베티즌 | 개 정액 냉각용 및 동결용 조성물, 이를 이용한 개 정액냉각 및 동결 방법 그리고 냉각 및 동결된 정액을 이용한개 인공수정 방법 |
| KR100433280B1 (ko) * | 2000-09-22 | 2004-05-31 | 대한민국 | 돼지정자 동결용 희석액 및 돼지정자 동결정액 제조방법 |
| JP2014128219A (ja) * | 2012-12-28 | 2014-07-10 | Hiroshima Univ | 精子保存液、精子保存方法及び人工授精方法 |
| CN109122548A (zh) * | 2017-06-19 | 2019-01-04 | 湘潭市金辉养殖专业合作社 | 一种牛的养殖方法 |
-
1997
- 1997-09-26 JP JP9261361A patent/JPH1198935A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100433280B1 (ko) * | 2000-09-22 | 2004-05-31 | 대한민국 | 돼지정자 동결용 희석액 및 돼지정자 동결정액 제조방법 |
| KR20030014891A (ko) * | 2001-08-13 | 2003-02-20 | (주)베티즌 | 개 정액 냉각용 및 동결용 조성물, 이를 이용한 개 정액냉각 및 동결 방법 그리고 냉각 및 동결된 정액을 이용한개 인공수정 방법 |
| JP2014128219A (ja) * | 2012-12-28 | 2014-07-10 | Hiroshima Univ | 精子保存液、精子保存方法及び人工授精方法 |
| CN109122548A (zh) * | 2017-06-19 | 2019-01-04 | 湘潭市金辉养殖专业合作社 | 一种牛的养殖方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Watson | Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawing function | |
| Hafez | Preservation and cryopreservation of gametes and embryos | |
| Voelkel et al. | Use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females | |
| Vishwanath et al. | Storage of bovine semen in liquid and frozen state | |
| Raju et al. | Vitrification of human 8-cell embryos, a modified protocol for better pregnancy rates | |
| Chen et al. | Effect of sucrose, trehalose, hypotaurine, taurine, and blood serum on survival of frozen bull sperm | |
| Farstad | Semen cryopreservation in dogs and foxes | |
| US4980277A (en) | Cryoprotectant solution and method | |
| US3791384A (en) | Artificial insemination of sows | |
| Graham et al. | Current status of semen preservation in the ram, boar and stallion | |
| Ali et al. | Successful vitrification of day-6 sheep embryos | |
| EP1476013B1 (en) | Methods and device for freezing and thawing biological samples | |
| JP2000189155A (ja) | 哺乳動物胚または卵子の保存方法並びに凍結胚または卵子の融解希釈方法 | |
| Chen et al. | Survival of bull spermatozoa seeded and frozen at different rates in egg yolk-tris and whole milk extenders | |
| JP3672201B2 (ja) | 哺乳動物胚移植用ストロー及びその製造法 | |
| KR102226182B1 (ko) | 난황추출물과 유단백추출물을 포함하는 정자의 동결보존용 조성물 | |
| US4965186A (en) | Method for low-temperature preservation of spermatozoa | |
| JPH1198935A (ja) | 動物精子の凍結保存方法 | |
| JPH10248860A (ja) | ストロー内希釈型の哺乳動物胚ガラス化保存 ストロー | |
| US5504002A (en) | Cryopreserving bovine embryos with a composition comprising 4% ethylen E glycol, 4% propanediol, and bovine albumin having a lipid content of 2.5 ug or more | |
| VanDemark et al. | Preservation of bull semen at sub-zero temperatures | |
| Tibary et al. | Challenges in the development of artificial insemination in the dromedary camel | |
| Kuzan et al. | Cryopreservation of mammalian embryos | |
| Dupesh et al. | Human Sperm Freezing: Mini Update | |
| JP3872863B2 (ja) | 哺乳動物胚保存用ストロー |