JPH11515099A

JPH11515099A - 炎症反応の定量方法

Info

Publication number: JPH11515099A
Application number: JP9512811A
Authority: JP
Inventors: コー，グロリア・シー; ニユエン，マイ・ピー; タレント，アルセア・デイー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1995-09-19
Filing date: 1996-09-16
Publication date: 1999-12-21
Also published as: EP0855028A1; CA2231882A1; WO1997011369A1; EP0855028A4

Abstract

(57)【要約】捕捉ＥＬＩＳＡ法を用いる、温血動物の組織生検中の細胞湿潤の客観的定量方法。本方法によってまた、炎症反応に対応する組織生検の細胞湿潤を定量できる。本発明はそれ自体、炎症反応の分析及び炎症処置における免疫抑制剤の効力の分析における研究への適用と臨床への適用の両方ができる。

Description

【発明の詳細な説明】炎症反応の定量方法発明の背景炎症反応の評価は、実際の測定と採点によるか、又は炎症反応の免疫組織化学の使用による、主観的分析により行われてきた。炎症反応のタイプの中には、遅延型過敏反応（ＤＴＨ）があるが、感作抗原に曝されることにより、ＤＴＨのためにアレルギー反応と同様な発赤と腫脹が起る。皮膚ＤＴＨ反応での細胞浸潤を客観的に定量するために、新規方法が開発された。この方法には、皮膚生検を可溶化し、次に、可溶化皮膚生検中での湿潤白血球によって発現される表面抗原を定量する新規方法が含まれる。この定量化は、２種のモノクローナル抗体を用いる捕捉ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノアドソルバントアッセイ）を適用することによって可能になる。抗原を検出するために利用できる２種のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体があれば、この方法により、組織と生検における任意の細胞抗原の定量と同様に、ＤＴＨ反応の定量が可能となる。現在まで炎症反応の客観的定量方法は開発されていなかった。発明の概要本発明は、温血動物の組織生検中の細胞浸潤の定量方法であって、（ａ）組織生検を可溶化し、上清中の抗原を分離すること；及び（ｂ）炎症反応のある組織生検から分離された組織上清中に見出される、細胞浸潤によって発現される表面抗原を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用い測定すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法に関する。本方法によって、炎症反応に対応する組織生検の細胞湿潤を定量できる。本発明はそれ自体、炎症反応の分析及び炎症処置における免疫抑制剤の効力の分析における研究への適用と臨床への適用の両方ができる。発明の詳細な説明本発明は、温血動物の組織生検中の細胞浸潤の定量方法であって、（ａ）組織生検を可溶化し、組織上清を分離すること；及び（ｂ）炎症反応のある組織生検から分離された組織上清中に見出される、細胞浸潤によって発現される表面抗原を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用い測定すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法に関する。本発明の第１の実施態様は、温血動物の組織生検中の炎症反応の定量方法であって、（ａ）組織生検を可溶化し、組織上清を分離すること；及び（ｂ）炎症反応のある組織生検から分離された組織上清中に見出される、浸潤白血球によって発現される表面抗原を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用い測定すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法である。本発明の第２の実施態様は、温血動物の組織生検中の炎症反応の定量方法であって、（ａ）氷冷溶解緩衝液中で組織生検を切刻み、切刻んだ組織生検懸濁液を作出すること；（ｂ）切刻んだ組織生検懸濁液を氷上で約３０分間冷却すること；（ｃ）冷却した切刻んだ組織生検懸濁液を遠心すること；（ｄ）遠心した組織生検懸濁液からデカントで組織上清を得ること；及び（ｅ）組織上清の免疫反応を捕捉ＥＬＩＳＡ法で定量すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法である。本発明の第２の実施態様のサブ実施態様は、捕捉ＥＬＩＳＡ法が、（ａ）組織上清を第１抗体Ａｂ（Ａ）と１２〜１６時間反応させること；（ｂ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｃ）Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を、ビオチンと結合した第２抗体Ａｂ（Ｂ）と反応させること；（ｄ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｅ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清をアビジン−ペルオキシダーゼと反応させること；（ｆ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｇ）基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させること；（ｈ）アビジン−ペルオキシダーゼ−Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清の基質との反応の光学密度を測定すること；及び（ｉ）標準曲線を用いて、測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；の各工程を含むことを特徴とする上記の方法である。本発明の第３の実施態様は、（ａ）氷冷溶解緩衝液中でミニ豚の組織生検を切刻み、切刻んだ組織生検懸濁液を作出すること；（ｂ）切刻んだ組織生検懸濁液を氷上で約３０分間冷却すること；（ｃ）冷却した切刻んだ組織生検懸濁液を遠心すること；（ｄ）遠心した組織生検懸濁液からデカントで組織上清を得ること；及び（ｅ）組織上清の免疫反応を捕捉ＥＬＩＳＡ法で定量すること；の各工程を含むことを特徴とするミニ豚の組織生検中の炎症反応の定量方法である。本発明の第３のサブ実施態様は、捕捉ＥＬＩＳＡ法が、（ａ）組織上清を第１抗体Ａｂ（Ａ）と１２〜１６時間反応させること；（ｂ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｃ）Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を、ビオチンと結合した第２抗体Ａｂ（Ｂ）と反応させること；（ｄ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｅ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清をアビジン−ペルオキシダーゼと反応させること；（ｆ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｇ）基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させること；（ｈ）アビジン−ペルオキシダーゼ−Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清の基質との反応の光学密度を測定すること；及び（ｉ）標準曲線を用いて、測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；の各工程を含むことを特徴とする上記の方法である。本発明の第４の実施態様は、ミニ豚の組織生検でのＤＴＨ炎症反応の定量方法であって、（ａ）ミニ豚からＤＴＨ炎症反応の組織生検を採取すること；（ｂ）氷冷溶解緩衝液中で組織生検を切刻み、切刻んだ組織生検懸濁液を作出すること；（ｃ）切刻んだ組織生検懸濁液を氷上で約３０分間冷却すること；（ｄ）冷却した切刻んだ組織生検懸濁液を遠心すること；（ｅ）遠心した組織生検懸濁液からデカントで組織上清を得ること；及び（ｆ）組織上清のＤＴＨ炎症反応を捕捉ＥＬＩＳＡ法で定量すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法である。本発明の第４の実施態様のサブ実施態様は、捕捉ＥＬＩＳＡ法が、（ａ）組織上清を第１抗体Ａｂ（Ａ）と１２〜１６時間反応させること；（ｂ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｃ）Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を、ビオチンと結合した第２抗体Ａｂ（Ｂ）と反応させること；（ｄ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｅ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清をアビジン−ペルオキシダーゼと反応させること；（ｆ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｇ）基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させること；（ｈ）アビジン−ペルオキシダーゼ−Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清の基質との反応の光学密度を測定すること；及び（ｉ）標準曲線を用いて、測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；の各工程を含むことを特徴とする上記の方法である。本発明の第５の実施態様は、捕捉ＥＬＩＳＡ法が、（ａ）第１抗体Ａｂ（Ａ）で処理した９６ウエルプレートを１８〜２４時間インキュベートすること；（ｂ）第１抗体Ａｂ（Ａ）で処理した９６ウエルプレートを洗浄し、過剰の抗体Ａｂ（Ａ）を除去すること；（ｃ）リン酸緩衝液中の３％ウシ血清アルブミンでプレートをブロックすること；（ｄ）組織上清を第１抗体Ａｂ（Ａ）で被覆した９６ウエルプレートと１２〜１６時間反応させること；（ｅ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツイーンで洗浄すること；（ｆ）Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む洗浄済９６ウエルプレートを、ビオチンと結合した第２抗体Ａｂ（Ｂ）と反応させること；（ｇ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む９６ウエルプレートを、ＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｈ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む洗浄済９６ウエルプレートを、アビジン−ペルオキシダーゼと反応させること；（ｉ）アビジン−ペルオキシダーゼ処理済の、Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む９６ウエルプレートを、ＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｊ）アビジン−ペルオキシダーゼ処理済で洗浄済の、Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む９６ウエルプレートを、基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させること；（ｋ）基質−アビジン−ペルオキシダーゼ−Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清の光学密度を測定すること；及び（ｉ）標準曲線を用いて、測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；を含むことを特徴とする上記の方法である。本発明の第６の実施態様は、哺乳動物の炎症反応における細胞浸潤量を阻害するか又は減少させる試験化合物の薬物効力の定量方法であって、（ａ）哺乳動物からの対照組織生検を可溶化し、組織上清を分離すること；（ｂ）対照組織生検から分離した組織上清中に見出される、細胞湿潤によって発現される表面抗原の光学密度を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用いて測定すること；（ｃ）該哺乳動物を、投与量約８μｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの試験化合物で処置すること；（ｄ）試験化合物で処置後の試験組織生検を可溶化し、組織上清を分離すること；（ｅ）試験組織生検から分離された組織上清中に見出される細胞湿潤によって発現される表面抗原の光学密度を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用いて測定すること；（ｆ）標準曲線を用いて、対照組織生検と試験組織生検の測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；（ｇ）試験組織生検の細胞湿潤濃度を対照組織生検と比較すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法である。本発明は、細胞湿潤と炎症反応を減少させることにおいて、免疫抑制試験化合物、例えばイオンチャネルブロッカー（Ｋ_v１．３ブロッカー）の効力の定量に有用な方法を提供する。本発明は、試験化合物の効力の客観的定量方法を提供する。免疫抑制試験化合物の効力は、実験動物、例えばミニ豚においてＤＴＨ炎症反応を起こさせ、次に試験動物を免疫抑制化合物で処置して、次いで本発明の方法によって効力を定量することによって、評価できる。本発明の組織生検は、問題の細胞湿潤液を含み、細胞湿潤への抗体が利用できる組織サンプルを指す。細胞湿潤液は、白血球と単球を含む。本明細書の目的として、動物は動物界の一メンバーであり、哺乳動物及び鳥類が含まれる（これらに限定されない）。本発明で選択される哺乳動物は、研究目的ではミニ豚であり、臨床評価のためにはヒトである。可溶化緩衝液（溶解緩衝液）は、１０ｍＭｐＨ８．０トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、０．１５ＭＮａＣｌ、０．１５％トライトンＸ−１００、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、３０μＭイソバレリル−Ｖａｌ−ＶａｌＳｔａ−Ａｌａ−Ｓｔａ（ペプスタチンＡ）、１ｍＭ（テトラチオネート）、及び１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含むが、それらの全てはSigma Chemical Company ，St.Louis，MO（以後Sigmaという）から市販されている。組織サンプルは、冷可溶化（溶解）緩衝液中で小片に切刻むか又はポリトロンにかける(Polytron，Brinkman Instrument．Westbury，NY)。炭酸緩衝液は、炭酸ナトリウム０．７５ｇ／５００ｍＬと重炭酸ナトリウム１．４６５ｇ／５００ｍＬを含む。次に、炭酸緩衝液は、水酸化ナトリウムでｐＨ９．６に調整される。クエン酸−リン酸緩衝液は、０．１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄（１４．４２ｇ／Ｌ）と０．１Ｍクエン酸（１９．２ｇ／Ｌ）からなる。次に、クエン酸−リン酸緩衝液は、リン酸でｐＨ５．０に調整される。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の３％ウシ血清アルブミン[ＰＢＳは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及びリン酸緩衝液塩からなる(GIBCO)]。ＰＢＳ−Ｔ緩衝液といわれる、ＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーン２０（ポリオキシエチレンソウルビタンモノラウレート、Sigma）。捕捉ＥＬＩＳＡ法では、２つの異なるエピトープをもつ同一抗原に対する２つの抗体（モノクローナル又はポリクローナル）[そのうちの１つはビオチンと結合している]を使用する。抗原含有上清を第１抗体と反応させ、緩衝液で洗浄する。次に、抗体と結合した抗原を、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド(biotin,Zyme d)と結合した第２抗体と反応させ、次いで過剰の抗体を除去するために洗浄する。次に、抗体−ビオチン−抗体に結合した抗原を、アビジン−ペルオキシダーゼと架橋結合させ、過剰の抗体を除去するために洗浄する。最後に、基質を、アビジン−ペルオキシダーゼ−架橋結合−抗体−ビオチン（Ｂ）−抗体（Ａ）と結合した抗原と反応させ、発色による色のある生成物をＥＬＩＳＡ読取り器でＯ．Ｄ．で測定する。豚細胞表面抗原、例えばＣＤ２、ＣＤ１１又はＣＤ１８のＥＬＩＳＡ分析を、適切な抗体：抗ＣＤ−２、抗ＣＤ１１及び抗ＣＤ１８（それらはVMRD Inc.，Pul lman，WAから入手できる）を用いて行った。モノクローナル抗ＣＤ２（ＭＳＡ− ４）のサンプルは、Massachusetts General Hospital，Boston，MAのDr．David sachsから購入した。ヒト細胞表面抗原に対する抗体は、Becton-Dickson，San J ose，CA、Serotec Co.，Oxford，UKなどから入手できる。また、マウス細胞表面抗原に対する抗体は、Pharmingen，San Diego，CA、Becton Dickinsonなどから入手できる。ストレプトアビジンに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼは、Zymed，San Francisco，CA、Cappel Co．Melven，PAなどから入手できる。基質は、またSigma Chemical Companyから入手できる錠剤形態の基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）である。発色試薬、即ちストレプトアビジン−ペルオキシダーゼは、任意のストレプトアビジン又はアビジンに結合した指示薬システム、例えばアルカリ性ホスファターゼ、ユウロピウム、又は化学発光、及びそのそれぞれの発色基質又は指示薬（全般的に、基質という）で置換することができる。本発明の方法は、更に以下の実施例で理解することができるが、本発明を限定するものではない。実施例１工程Ａ：ユカタン豚組織生検の調製ユカタン豚皮膚生検をリン酸緩衝化生理食塩水[(PBS)Dulbecco，GIBCO]で濯ぎ、脂肪組織を除去する。次に、豚生検を、トライトンＸ−１００溶解緩衝液３ｍＬ中でポリトロンをかけるか又は切刻む。ポリトロンの針をトライトンＸ−１００溶解緩衝液１ｍＬで濯ぎ、溶解液の総用量を４ｍＬとする。氷上で２０〜３０分間インキュベートした（４℃）後、各溶解液を３本のエッペンドルフチューブに分注し、冷所で２０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。チューブからの上清を一緒にし、徹底的に混合し、３又は４セットに分注し、アッセイ時まで−７０℃に保存した。豚皮膚生検溶解液サンプルを即時に試験することもできる。豚皮膚生検溶解液サンプルはそのまま試験するか、又はトライトンＸ−１００溶解緩衝液中で溶解液サンプルの１：２〜１：４希釈になるようにトライトンＸ−１００溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤を含む）で希釈する。工程Ｂ：ＥＬＩＳＡでの標準のための豚単核細胞（ＮＭＣ）溶解液の調製フィコール−ハイパック分離（リンパ球分離培地（ＬＳＭ），Organon Teknik a Co.，Durham，NC）によるヘパリン添加豚全血から豚単核細胞を精製する。これらの細胞を冷ＰＢＳ(GIBCO)で３回洗浄する。次に細胞の数を数え、濃度２０ ×１０⁶細胞／ｍＬ、４℃で、３０分間トライトンＸ−１００溶解緩衝液で溶解する。溶解液を８００〜１０００ｒｐｍで遠心し、核を取除く。溶解液を−７０ ℃で保存する。新鮮な溶解液調製物をＤＴＨＥＬＩＳＡで試験し、現在の標準と比較する（トライトンＸ−１００溶解緩衝液中のユカタン豚溶解液の１：４希釈は５×１０⁶細胞等価物に等しく、４９０ｎｍの光学密度値約１．２００〜１．５００が得られるはずである）。捕捉ＥＬＩＳＡでの標準として使用するために、トライトンＸ− １００溶解緩衝液で、ＮＭＣ溶解液サンプルの１：４、１：８、１：１６、１：６４、１：２５６、１：１０２４希釈になるように、豚ＭＮＣ溶解液サンプルを希釈する。工程Ｃ：捕捉ＥＬＩＳＡ法を用いる、組織生検の細胞湿潤の定量方法一連の９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐ（Nunc，Denmark）プレートを、炭酸緩衝液ｐＨ９．６で希釈した抗体Ａ［a）５μｇ／ｍＬの抗豚ＣＤ２（ＰＧ１６８− Ａ）、又はｂ）０．７μｇ／ｍＬの抗豚ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＭＵＣ７６−Ａ）］で、少なくとも１８時間被覆する。プレートを常に４℃に保つか、又は−２０℃で凍結できる。次に、プレートを、ＰＢＳ緩衝液中の０．０５％ツウィーン２０（ＰＢＳ−Ｔ）で２度洗浄する［ＰＢＳ緩衝液はＣａ⁺²イオンとＭｇ⁺²イオンを含まない］。Ｃａ⁺²イオンとＭｇ⁺²イオンを含むＰＢＳ緩衝液中３％ウシ血清アルブミンで約３７℃で１時間、又は約４℃で一晩、プレートをブロックする。次に、プレートをＰＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄する。標準ＭＮＣ及び豚皮膚生検溶解液の１００μＬのアリコートをブロックしたプレートに加え、４℃で一晩インキュベートする。次に、プレートをＰＢＳ−Ｔ緩衝液で６回洗浄する。洗浄済プレートに、ビオチニル化抗体［a）１μｇ／ｍＬのビオチニル化抗豚ＣＤ２（ＭＳＡ−４）、又はb）１０μｇ／ｍＬのビオチニル化抗ヒトＣＤ１８（ＩＢ−４）。ＩＢ４は豚ＣＤ１８と交差反応する］１００μＬを加える。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。次に、プレートをＰＢＳ−Ｔ緩衝液で６回洗浄する。ブロッキング緩衝液[ＰＢＳ中３％ＢＳＡ（ブロッキング緩衝液はアジドを含まないべきである）]で希釈したストレプトアビジン／ＨＲＰ(Zymed ＃43-4323)の１００μＬアリコートを加え、３７℃で１時間インキュベートする。次に、プレートをＰＢＳ−Ｔ緩衝液で６回洗浄し、次いで、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩基質溶液の１００μＬのアリコートを加えた。ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩基質溶液は、クエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５．０２５ｍＬ中のｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩２０ｍｇ（２錠）、二重蒸留Ｈ₂Ｏ２５ｍＬ及び３０％Ｈ₂Ｏ₂ １８μＬからなる。基質溶液は十分に混合し、光を避けて保存すべきである。色は５〜１０分で発色するはずである。次に、２ＮＨ₂ＳＯ₄ １００μＬを添加して、反応を止める。次に、ＥＬＩＳＡ光学密度読取り器（Molecular Device，Palo Alto，CA）を用いて、プレートの各々を４９０ｎｍで読む。４変数曲線適合プログラムを用い、１：４、１：８、１：１６、１：６４、１：２５６、及び１：１０２４希釈のＭＮＣ溶解液サンプルの光学密度を測定して、Ｘ軸を細胞数／ｍＬ、Ｙ軸を光学密度（Ｏ．Ｄ．）にして標準曲線をプロットする。豚皮膚生検溶解液を含むプレートの光学密度を測定し、細胞数／ｍＬをこの標準曲線から読む。ＣＤ２のための標準曲線ＣＤ１８のための標準曲線実施例２遅延型過敏（ＤＴＨ）炎症反応の豚組織生検を用い、上記の方法で、細胞湿潤を測定する。実施例３生検の細胞湿潤の一般的定量方法同一抗原の異なるエピトープを検出するために２つの抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）が利用できるならば、炎症反応におけるのと異なる、生検での細胞成分又は細胞構成物を定量するために、同様の方法を使用できる。もう一つの基準は、定量を行うことができるように、細胞成分の標準曲線を作製できるということである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１０月６日【補正内容】請求の範囲１．温血動物の組織生検中の細胞浸潤の定量方法であって、（ａ）組織生検を可溶化し、組織上清を分離すること；及び（ｂ）炎症反応のある組織生検から分離された組織上清中に見出される、細胞浸潤によって発現される表面抗原を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用い測定することによって、組織上清の細胞湿潤の程度を定量すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。２．温血動物の組織生検中の炎症反応の定量方法であって、（ａ）組織生検を可溶化し、組織上清を分離すること；及び（ｂ）炎症反応のある組織生検から分離された組織上清中に見出される、浸潤白血球によって発現される表面抗原を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用い測定することによって、組織上清の炎症反応を定量すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。３．温血動物の組織生検中の炎症反応の定量方法であって、（ａ）氷冷溶解緩衝液中で組織生検を切刻み、切刻んだ組織生検懸濁液を作出すること；（ｂ）切刻んだ組織生検懸濁液を氷上で約３０分間冷却すること；（ｃ）冷却した切刻んだ組織生検懸濁液を遠心すること；（ｄ）遠心した組織生検懸濁液からデカントで組織上清を得ること；及び（ｅ）炎症反応のある組織生検から分離された組織上清中に見出される、浸潤細胞によって発現される表面抗原を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用い測定することによって、組織上清の炎症反応を定量すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。４．（ａ）氷冷溶解緩衝液中でミニ豚の組織生検を切刻み、切刻んだ組織生検懸濁液を作出すること；（ｂ）切刻んだ組織生検懸濁液を氷上で約３０分間冷却すること；（ｃ）冷却した切刻んだ組織生検懸濁液を遠心すること；（ｄ）遠心した組織生検懸濁液からデカントで組織上清を得ること；及び（ｅ）炎症反応のある組織生検から分離された組織上清中に見出される、浸潤細胞によって発現される表面抗原を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用い測定することによって、組織の炎症反応を定量すること；の各工程を含むことを特徴とする請求項３に記載のミニ豚の組織生検中の炎症反応の定量方法。５．ミニ豚のＤＴＨ炎症反応の定量方法であって、（ａ）ミニ豚からＤＴＨ炎症反応の組織生検を採取すること；（ｂ）氷冷溶解緩衝液中で組織生検を切刻み、切刻んだ組織生検懸濁液を作出すること；（ｃ）切刻んだ組織生検懸濁液を氷上で約３０分間冷却すること；（ｄ）冷却した切刻んだ組織生検懸濁液を遠心すること；（ｅ）遠心した組織生検懸濁液からデカントで組織上清を得ること；及び（ｆ）炎症反応のある組織生検から分離された組織上清中に見出される、浸潤細胞によって発現される表面抗原を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用い測定することによって、組織上清のＤＴＨ炎症反応を定量すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。６．捕捉ＥＬＩＳＡ法が、（ａ）上清を第１抗体Ａｂ（Ａ）と１２〜１６時間反応させること；（ｂ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｃ）Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を、ビオチンと結合した第２抗体Ａｂ（Ｂ）と反応させること；（ｄ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｅ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清をアビジン−ペルオキシダーゼと反応させること；（ｆ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｇ）基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させること；（ｈ）アビジン−ペルオキシダーゼ−Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清の基質との反応の光学密度を測定すること；及び（ｉ）標準曲線を用いて、測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；の各工程を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。７．捕捉ＥＬＩＳＡ法が、（ａ）上清を第１抗体Ａｂ（Ａ）と１２〜１６時間反応させること；（ｂ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｃ）Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を、ビオチンと結合した第２抗体Ａｂ（Ｂ）と反応させること；（ｄ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｅ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清をアビジン−ペルオキシダーゼと反応させること；（ｆ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｇ）基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させること；（ｈ）アビジン−ペルオキシダーゼ−Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清の基質との反応の光学密度を測定すること；（ｉ）標準曲線を用いて、測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；の各工程を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。８．捕捉ＥＬＩＳＡ法が、（ａ）組織上清を第１抗体Ａｂ（Ａ）と１２〜１６時間反応させること；（ｂ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｃ）Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を、ビオチンと結合した第２抗体Ａｂ（Ｂ）と反応させること；（ｄ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｅ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清をアビジン−ペルオキシダーゼと反応させること；（ｆ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｇ）基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させること；（ｈ）アビジン−ペルオキシダーゼ−Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清の基質との反応の光学密度を測定すること；（ｉ）標準曲線を用いて、測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；の各工程を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。９．捕捉ＥＬＩＳＡ法が、（ａ）第１抗体Ａｂ（Ａ）で処理した９６ウエルプレートを１８〜２４時間インキュベートすること；（ｂ）第１抗体Ａｂ（Ａ）で処理した９６ウエルプレートを洗浄し、過剰の抗体Ａｂ（Ａ）を除去すること；（ｃ）リン酸緩衝液中の３％ウシ血清アルブミンでプレートをブロックすること；（ｄ）組織上清を第１抗体Ａｂ（Ａ）で被覆した９６ウエルプレートと１２〜１６時間反応させること；（ｅ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツイーンで洗浄すること；（ｆ）Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む洗浄済９６ウエルプレートを、ビオチンと結合した第２抗体Ａｂ（Ｂ）と反応させること；（ｇ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む９６ウエルプレートを、ＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｈ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む洗浄済９６ウエルプレートを、アビジン−ペルオキシダーゼと反応させること；（ｉ）アビジン−ペルオキシダーゼ処理済の、Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む９６ウエルプレートを、ＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｊ）アビジン−ペルオキシダーゼ処理済の、Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む９６ウエルプレートを、基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させること；（ｋ）基質−アビジン−ペルオキシダーゼ−Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清の光学密度を測定すること；及び（ｉ）標準曲線を用いて、測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．哺乳動物の炎症反応における細胞浸潤量を阻害するか又は減少させる試験化合物の薬物効力の定量方法であって、（ａ）哺乳動物からの対照組織生検を可溶化し、組織上清を分離すること；（ｂ）対照組織生検から分離した組織上清中に見出される、細胞湿潤によって発現される表面抗原の光学密度を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用いて測定すること；（ｃ）該哺乳動物を、投与量約８μｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの試験化合物で処置すること；（ｄ）試験化合物で処置後の試験組織生検を可溶化し、組織上清を分離すること；（ｅ）試験組織生検から分離された組織上清中に見出される細胞湿潤によって発現される表面抗原の光学密度を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用いて測定することによって、組織上清の炎症反応を定量すること；（ｆ）標準曲線を用いて、対照組織生検と試験組織生検の測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；（ｇ）試験組織生検の細胞湿潤濃度を対照組織生検と比較すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ニユエン，マイ・ピーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者タレント，アルセア・デイーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．温血動物の組織生検中の細胞浸潤の定量方法であって、（ａ）組織生検を可溶化し、組織上清を分離すること；及び（ｂ）炎症反応のある組織生検から分離された組織上清中に見出される、細胞浸潤によって発現される表面抗原を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用い測定すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。２．温血動物の組織生検中の炎症反応の定量方法であって、（ａ）組織生検を可溶化し、組織上清を分離すること；及び（ｂ）炎症反応のある組織生検から分離された組織上清中に見出される、浸潤白血球によって発現される表面抗原を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用い測定すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。３．温血動物の組織生検中の炎症反応の定量方法であって、（ａ）氷冷溶解緩衝液中で組織生検を切刻み、切刻んだ組織生検懸濁液を作出すること；（ｂ）切刻んだ組織生検懸濁液を氷上で約３０分間冷却すること；（ｃ）冷却した切刻んだ組織生検懸濁液を遠心すること；（ｄ）遠心した組織生検懸濁液からデカントで組織上清を得ること；及び（ｅ）組織上清の免疫反応を捕捉ＥＬＩＳＡ法で定量すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。４．（ａ）氷冷溶解緩衝液中でミニ豚の組織生検を切刻み、切刻んだ組織生検懸濁液を作出すること；（ｂ）切刻んだ組織生検懸濁液を氷上で約３０分間冷却すること；（ｃ）冷却した切刻んだ組織生検懸濁液を遠心すること；（ｄ）遠心した組織生検懸濁液からデカントで組織上清を得ること；及び（ｅ）組織上清の免疫反応を捕捉ＥＬＩＳＡ法で定量すること；の各工程を含むことを特徴とする請求項３に記載のミニ豚の組織生検中の炎症反応の定量方法。５．ミニ豚のＤＴＨ炎症反応の定量方法であって、（ａ）ミニ豚からＤＴＨ炎症反応の組織生検を採取すること；（ｂ）氷冷溶解緩衝液中で組織生検を切刻み、切刻んだ組織生検懸濁液を作出すること；（ｃ）切刻んだ組織生検懸濁液を氷上で約３０分間冷却すること；（ｄ）冷却した切刻んだ組織生検懸濁液を遠心すること；（ｅ）遠心した組織生検懸濁液からデカントで組織上清を得ること；及び（ｆ）組織上清のＤＴＨ炎症反応を捕捉ＥＬＩＳＡ法で定量すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。６．捕捉ＥＬＩＳＡ法が、（ａ）上清を第１抗体Ａｂ（Ａ）と１２〜１６時間反応させること；（ｂ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｃ）Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を、ビオチンと結合した第２抗体Ａｂ（Ｂ）と反応させること；（ｄ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｅ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清をアビジン−ペルオキシダーゼと反応させること；（ｆ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｇ）基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させること；（ｈ）アビジン−ペルオキシダーゼ−Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清の基質との反応の光学密度を測定すること；及び（ｉ）標準曲線を用いて、測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；の各工程を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。７．捕捉ＥＬＩＳＡ法が、（ａ）上清を第１抗体Ａｂ（Ａ）と１２〜１６時間反応させること；（ｂ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｃ）Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を、ビオチンと結合した第２抗体Ａｂ（Ｂ）と反応させること；（ｄ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｅ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清をアビジン−ペルオキシダーゼと反応させること；（ｆ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｇ）基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させること；（ｈ）アビジン−ペルオキシダーゼ−Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清の基質との反応の光学密度を測定すること；（ｉ）標準曲線を用いて、測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；の各工程を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。８．捕捉ＥＬＩＳＡ法が、（ａ）組織上清を第１抗体Ａｂ（Ａ）と１２〜１６時間反応させること；（ｂ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｃ）Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を、ビオチンと結合した第２抗体Ａｂ（Ｂ）と反応させること；（ｄ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｅ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清をアビジン−ペルオキシダーゼと反応させること；（ｆ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｇ）基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させること；（ｈ）アビジン−ペルオキシダーゼ−Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清の基質との反応の光学密度を測定すること；（ｉ）標準曲線を用いて、測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；の各工程を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。９．捕捉ＥＬＩＳＡ法が、（ａ）第１抗体Ａｂ（Ａ）で処理した９６ウエルプレートを１８〜２４時間インキュベートすること；（ｂ）第１抗体Ａｂ（Ａ）で処理した９６ウエルプレートを洗浄し、過剰の抗体Ａｂ（Ａ）を除去すること；（ｃ）リン酸緩衝液中の３％ウシ血清アルブミンでプレートをブロックすること；（ｄ）組織上清を第１抗体Ａｂ（Ａ）で被覆した９６ウエルプレートと１２〜１６時間反応させること；（ｅ）反応混合物をＰＢＳ溶液中の０．０５％ツイーンで洗浄すること；（ｆ）Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む洗浄済９６ウエルプレートを、ビオチンと結合した第２抗体Ａｂ（Ｂ）と反応させること；（ｇ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む９６ウエルプレートを、ＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｈ）Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む洗浄済９６ウエルプレートを、アビジン−ペルオキシダーゼと反応させること；（ｉ）アビジン−ペルオキシダーゼ処理済の、Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む９６ウエルプレートを、ＰＢＳ溶液中の０．０５％ツウィーンで洗浄すること；（ｊ）アビジン−ペルオキシダーゼ処理済の、Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清を含む９６ウエルプレートを、基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と反応させること；（ｋ）基質−アビジン−ペルオキシダーゼ−Ａｂ（Ｂ）−Ａｂ（Ａ）に結合した組織上清の光学密度を測定すること；及び（ｉ）標準曲線を用いて、測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．哺乳動物の炎症反応における細胞浸潤量を阻害するか又は減少させる試験化合物の薬物効力の定量方法であって、（ａ）哺乳動物からの対照組織生検を可溶化し、組織上清を分離すること；（ｂ）対照組織生検から分離した組織上清中に見出される、細胞湿潤によって発現される表面抗原の光学密度を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用いて測定すること；（ｃ）該哺乳動物を、投与量約８μｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの試験化合物で処置すること；（ｄ）試験化合物で処置後の試験組織生検を可溶化し、組織上清を分離すること；（ｅ）試験組織生検から分離された組織上清中に見出される、細胞湿潤によって発現される表面抗原の光学密度を、捕捉ＥＬＩＳＡ法を用いて測定すること；（ｆ）標準曲線を用いて、対照組織生検と試験組織生検の測定した光学密度から細胞濃度を計算すること；（ｇ）試験組織生検の細胞湿潤濃度を対照組織生検と比較すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。