JPH11513565A - Herpesvirus vector and its use - Google Patents

Herpesvirus vector and its use

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JPH11513565A
JPH11513565A JP9515631A JP51563197A JPH11513565A JP H11513565 A JPH11513565 A JP H11513565A JP 9515631 A JP9515631 A JP 9515631A JP 51563197 A JP51563197 A JP 51563197A JP H11513565 A JPH11513565 A JP H11513565A
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キース ブレナー，マルコム
ディロー，ダグマー
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St Jude Childrens Research Hospital
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Abstract

(57)【要約】 ヒト又は非ヒト動物細胞を処理して前記細胞に異種遺伝子材料を導入し、そして前記細胞の中で前記材料を発現するための方法であって、（ａ）衰弱化又は複製欠陥型であり、且つ非形質転換性突然変異ヘルペスウィルスであり、しかも異種遺伝子材料を担持する組換ヘルペスウィルスベクターを用意し、そして（ｂ）造血細胞、血液細胞に関連する悪性細胞及び悪性又は非悪性CD34＋細胞より選ばれるヒト又は非ヒト動物細胞を形質導入せしめて前記遺伝子材料を発現するためにこの細胞を前記ウィルスベクターと接触させることにより形質導入する、ことを含んで成る方法。とりわけ適用される技術は、例えば悪性細胞から腫瘍免疫原を作るための遺伝子の移入による造血細胞の改変である。   (57) [Summary] A method for treating a human or non-human animal cell to introduce heterologous genetic material into said cell, and expressing said material in said cell, comprising: (a) an attenuated or replication defective form; And providing a recombinant herpesvirus vector which is a non-transforming mutant herpesvirus and which carries heterologous genetic material; and Transducing a selected human or non-human animal cell and transducing the cell by contacting the cell with the viral vector to express the genetic material. Among the techniques applied, among others, are the modification of hematopoietic cells by the transfer of genes to make tumor immunogens from malignant cells.

Description

【発明の詳細な説明】 ヘルペスウィルスベクター及びその利用 発明の分野 本発明はウィルスベクター及びその利用のための方法、特に、例えば細胞、例 えば造血細胞系の悪性細胞を形質転換する及びかかる細胞における外来性遺伝子 材料の発現と誘導するための方法に関する。本発明は更にかかるウィルスベクタ ーを基礎とする薬理組成物、かかるウィルスベクターにより感染した細胞の製造 、かかる細胞を基礎とする薬理調製品、in vivo で外来遺伝子材料を発現させる ためのヒト及び非ヒト動物への投与のためのその利用、並びに本明細書に記載の 通りの処置及びその他の用途のための調製品の製造のための本明細書に記載の材 料の利用にも関連する。本発明に係る方法は例えば癌の免疫療法に利用できうる 。 発明の背景 組換ウィルスベクターは、いくつかの公知の因子の中でも、外来遺伝子をタン パク質として発現されうるように細胞に導入するのに有用なものである。中心要 素は形質転換する細胞の中で機能しうる適当なプロモーター配列のコントロール 下にある標的遺伝子自体である。既知の技術には非ウィルス的な方法、例えば遊 離DNA としての標的遺伝子構築体の単なる添加；標的DNA と標的細胞へのDNA の 取込みのためにデザインされた特異的なタンパク質との複合体とのインキュベー ション；並びにリポソーム又はその他の脂質を基礎とする感染因子の中に封入さ れた標的DNA とのインキュベーションが含まれる。 更なるオプションは、必須の標的遺伝子を含むように操作され、且つ標的細胞 に感染でき、それ故細胞の中に標的遺伝子を発現できる状態で運び込む組換ウィ ルスベクターの利用である。多種多様なウィルス、例えばレトロウィルス、アデ ノウィルス及びアデノ関連ウィルスがこの目的のために利用されている。 明細書EP 0,176,170号（Institut Merieux ; B Roizman）には、ゲノムのプロ モーター調節領域のコントロール下で単純ヘルペスウィルスゲノムの中に挿入さ れ、それ故外来遺伝子の発現のためのベクターを担う外来遺伝子が記載されてい る。DNA 構築体、外来遺伝子の発現のために有用な構築体を含むプラスミドベク ター、このベクターにより製造された組換ウィルス、及び関連の方法が開示され ている。 明細書EP 0,448,650号（General Hospital Corporation : A I Galler，X O B reakefield）には非有系分裂細胞に感染でき、その中で繁殖することができ、そ して神経障害の処置において利用するための、並びにかかる障害の動物及びin v itroモデルを作り上げるためのＩ型単純ヘルペスウィルス発現ベクターが記載さ れている。 組換ウィルスは遺伝子欠損症に適用される（例えば修復）遺伝子治療に特に有 用であることで知られている。 修復遺伝子治療において利用されている又は提案されている遺伝子の例えば： 例えばWO92/10564（KW Culver ら：US Secretary for Commerce & Cellco Inc） 並びにWO89/12109及びEP 0420911（I H Pastanら）に記載のヒトアデノシンデア ミナーゼ(ADA)についての遺伝子；WO91/02796(L-C Tsuiら：HSC Research & Uni versity of Michigan)、WO92/05273(F S Collins & J M Wilson ; University o f Michigan)及びWO94/12649（R J Gregory ら：Genzyme Corp.）に記載の嚢胞性 線維症が含まれる。 悪性腫瘍処置の従来技術は患者自身の腫瘍に由来する自己物質を利用する腫瘍 に対する治療用ワクチン化についての潜在能力をハイライトとする研究を含む。 この手法の背景にある一般的な理論は、腫瘍細胞が正常な健康細胞から区別され 、そしてそれ故腫瘍細胞を認識して破壊する免疫応答を狙いとするのに利用され 得る。１もしくは複数種のタンパク質又はその他の生物学的巨大分子を発現しう ることにある。 このような腫瘍標的は一定のタイプの腫瘍の中に遍在的に存在しうる。この良 い例は頸部癌であり、それにおいては腫瘍の大多数がヒトパピロマウィルスＥ６ 及びＥ７タンパク質を発現する。この場合、腫瘍標的は自己タンパク質ではなく 、それ故癌免疫治療のための固有腫瘍特異的マーカーとしてのその潜在能力は明 確である。 一定の自己タンパク質が腫瘍標的抗原としても利用できうるという証拠が増え つつある。これはそれらが正常な健康細胞ではなく、腫瘍細胞において一貫して 発現されるという所見に基づく。このような例にはMAGE科のタンパク質が含まれ る。腫瘍標的として有用なもっと多くの自己タンパク質が同定されないままであ るものと予測される。 腫瘍関連抗原及び一定の癌の免疫生物学におけるその役割は例えばP van der Bruggen ら、Current Opinion in Immunology 4(5)（1992）608-612に記載され ている。MAGEシリーズのその他のかかる抗原がT．Boon，Adv Cancer Res 58（19 92）pp 177-210において同定され、そしてその他の近縁腫瘍抗原がP．van der B ruggenら、Science 254（1991）1643-1647において同定されている；腫瘍関連ム チンはPO Livingston のCurrent Opinion in Immunology 4(5)（1992）pp 624-6 29 に記載されている；例えば MUC 1 はJ．Burchall らInt J Cancer 44（1989 ）pp 691-696 に記載されている。 いくつかの潜在的に有用な腫瘍特異的マーカーが同定及び特性決定されている が、新たな、そしておそらくはより特異的なマーカーについての探索はめんどう であり、且つ時間がかかる。 実験上の頭蓋内マウス黒色腫が神経衰弱 HSV１突然変異体1716により処置され たことが記載されており(BP Randazzo ら、Virology 211（1995）pp 94-101)、 それにおいてはこの突然変異体の複製は腫瘍細胞に制約され、そして周囲の脳組 織では起こらなかった。 サイトカインをそのまま（即ちタンパク質として）哺乳動物に投与することが 試みられているが、往々にして宿主によりあまり寛容されず、そしてしばしば悪 心、骨痛及び発熱等を含む一定の副作用が伴う。(A Mire-Sluis，TIB Tech voll ．11（1993）; MS Moore のAnn Rev Immunol 9（1991）159-91)。これらの問題 は有効な血漿濃度を保つのに往々にして必要とされる用量レベルにより一層悪化 する。 生きたウィルスベクターをサイトカン又は腫瘍抗原をコードする遺伝子を含む ように改変することが公知である。ウィルスベクターを、腫瘍免疫反応性を高め るための手段を司るように癌免疫治療において利用することが提案されている。 明細書WO86/07610号（Transgene : MP Kienyら）はヒトIL−２タンパク質をコー ドするDNA 配列全体又は一部を含んで成る組換ポックスウィルスによる哺乳動物 細胞におけるヒトIL−２の発現を開示している。明細書EP 0259212号（Transgen e SA : R Latheら）は少なくとも腫瘍特異的タンパク質の必須領域をコードする 異種DNA 配列を含む、腫瘍をコントロールするためのポックス、アデノ又はヘル ペス型のウィルスベクターを開示する。明細書WO88/00971（CSIRO，Australian National University : Ramshaw ら）は、抗原性ポリペプチドの少なくとも一部 を発現するヌクレオチド配列と、リンホカイン（インターロイキン １，２，３もしくは４、又はガンマーインターフェロン）の少なくとも一部を発 現する第二配列とを含むポックス、ヘルペス又はアデノウィルスワクチンベクタ ー、特にワクシニアを含んで成る組換ワクチンを開示する。これは抗原性ポリペ プチドに対する免疫反応を高める。明細書WO94/16716号（E Paolettiら：Viroge netics Corp.）には、例えば癌治療において利用するためのサイトカイン又は腫 瘍抗原をコードするDNA を含む衰弱組換ワクシニアウィルスが記載されている。 GMCSF 形質導入腫瘍細胞が腎癌に対する治療用ワクチンとして利用できること が提唱されている。対応の試験のためのプロトコールは、患者からの腫瘍物質を 取り出し、そしてその後適当な免疫調節遺伝子により形質導入することを包括す る。操作した細胞を患者に再導入して有利な免疫反応を刺激する。 非ヒト霊長類のウィルスであるヘルペスウィルスサイミリ(saimiri)を基礎と するベクターはヒトリンパ系細胞における遺伝子発現を導くことが記載されてい る（B Fleckenstein & R Grassmann，Gene 102(2)（1991）pp 265-9）。しかし ながら、臨床的な状況でかかるベクターを利用するのは望ましくないものと考え られている。 一定の種類の腫瘍細胞の如き細胞への免疫調節及びその他の遺伝子の導入が知 られているが、これを達成する現存の方法は本発明者により制約を有するものと 考えられ、その困難性は形質導入の定量的な低さ、複雑さ、又は利用する系の所 望されない副作用に基づく。 本発明者は今日まで、いくつかの種類の細胞、例えば造血細胞系、例えば白血 病への遺伝子の導入は困難であると、又は例えば修復遺伝子治療もしくは癌免疫 治療の目的のために効率よくそれを実施するのは困難であると考えた。 造血先祖細胞の如き細胞への遺伝子の移入のため、今日までレトロウィルスベ クターが最も広く試みられたベクターである。しかしながらこれらのベクターは 分裂していない細胞の中には組込まれず、且つ発現されないことが明らかであり 、そしてこのことは例えば遺伝子移入及び発現のための標的として造血幹細胞(H SC)又はヒト造血悪性腫瘍由来の一次細胞の如きと一緒に利用したときのその価 値を制約してしまう。この制約を解消するため、標的細胞、例えばHSC と造血増 殖因子、例えばサイトカインとの培養が、HSC を細胞サイクルへと誘導する及び このような標的細胞へのレトロウィルス媒介遺伝子移入の効率性を高める観点で 試みられているが、残念ながら培養培地の中のサイトカインは細胞の所望される 自己再生能力の損失を伴って分化を誘導することが認められている。 そこで、レトロウィルスベクターの代わりにアデノ関連ウィルスベクターの利 用が提案されているが、かかるベクターの組込み効率は低いことが認められてい る。 また、本発明者は、アデノウィルスベクターによる近年の経験に基づき、これ らが制約を有するものと考えている。即ち、それらは一定の条件下で造血細胞の 約50％に感染できうるが、にもかかわらず、遺伝子発現は往々にして数日遅れる 。一定の試験において、組換アデノウィルスベクター又はレトロウィルスベクタ ーによる急性白血病細胞への異種遺伝子の形質導入がごくわずかである又はあっ たとしても約３％の形質導入収率しか供さないことも見い出され、それ故かかる ベクターによる形質導入収率の効率には問題がある。 本発明： 本発明者は、従来技術が、更なるウィルスベクター並びにヒト及び動物細胞を 形質転換するうえでのその利用のための方法の提供の所望をいまだ残しているも のと考える。特に、有用な迅速性をもっ てヒト及び非ヒト動物細胞に対する遺伝子移入を供する材料及び方法の提供の所 望が残っている。また、有用な効率をもって遺伝子移入を供する材料及び方法の 提供を所望される。更に、有用な一連の標的細胞タイプ、例えば非分裂性細胞に 適用できる遺伝子移入のための材料及び方法の提供が所望される。 本明細書に記載の本発明の観点に従い、ヘルペスウィルスベクターによる形質 導入のための標的細胞は、造血細胞系の細胞；リンパ系又は骨髄系細胞由来の細 胞；幹細胞又はCD34＋細胞由来の細胞、例えば骨髄移植との関連で得られた又は 調製された細胞の如きを含む細胞調製品由来の細胞；又は神経外胚葉起源の細胞 、特にかかる悪性細胞、及び本明細書記載のウィルスベクターの形質導入された 細胞から選ばれうる。この用途において、本発明の例示に従う一定の方法及び手 順は驚くべきほどに高い形質導入効率を供しうることが見い出された。 一の観点において、本発明は免疫原及びワクチンとしての腫瘍細胞の利用を促 進する材料及び方法の提供を担いとする。更なる観点において、本発明は造血細 胞系の細胞の形質導入を促進し、且つそれに基づく有用な組成物及び手順を提供 することを担いとする。 本発明はまた例えば現存の腫瘍における腫瘍特異的抗原に対する免疫応答を誘 導するために利用できうる免疫原及び治療用ワクチンを作り上げるための手段の 提供を担いとする。 本発明は特に、単純ヘルペスウィルスの如きヘルペスウィルスの後期溶解遺伝 子の発現を許容しない造血細胞、例えばリンパ細胞への遺伝子移入の如きに利用 できる。 本発明の観点に従うと、異種遺伝子材料、例えば異種遺伝子を含んで成る材料 をヒト又は非ヒト動物細胞に導入するため、例えば前記遺伝子材料を前記細胞の 中で発現させるために前記細胞を処理す る方法であって、（ａ）衰弱化又は複製欠陥型であり且つ非形質転換性である突 然変異ヘルペスウィルスであり、そして異種タンパク質をコードする遺伝子の如 きの異種遺伝子材料を担持する組換ヘルペスウィルスベクターを用意し、そして （ｂ）造血細胞、血液細胞に関連する悪性細胞、及び悪性又は非悪性CD34＋細胞 より選ばれるヒト又は非ヒト動物細胞を、これらの細胞を前記ウィルスベクター と接触させて前記細胞を形質導入させることにより形質導入する段階を含んで成 る方法を提供する。下記の本発明の態様において、前記遺伝子材料を前記細胞内 で発現させる。形質導入は公知の方法でのウィルスベクターによる生きた標的細 胞の感染により行われる。 かかる方法は、例えば異種遺伝子材料をヒト又は非ヒト動物細胞に導入して前 記細胞を一層高度な免疫原性にするような前記細胞の処理であって、（ａ）衰弱 化又は複製欠陥型であり且つ非形質転換性である突然変異ヘルペスウィルスであ り、そしてサイトカイン及び免疫学的同時刺激性分子及び化学誘引物質より選ば れる異種免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を担持する組換ヘルペスウィル スベクターを用意し、そして（ｂ）血液細胞に関連する悪性細胞、造血細胞、悪 性又は非悪性CD34＋細胞より選ばれる悪性又は非悪性ヒト又は非ヒト動物細胞を これらの細胞を前記ウィルスベクターと接触させて前記細胞を形質導入させるこ とにより形質導入する段階を含んで成る処理を含んで成りうる。 ヒト又は非ヒト動物細胞の形質導入において利用するための本発明の所定の態 様に従って提供及び利用される薬理調製品は造血細胞；血液細胞に関連する悪性 細胞；及び悪性又は非悪性CD34＋細胞より選ばれることができ：衰弱化又は複製 欠陥型であり且つ非形質転換性である突然変異ヘルペスウィルスであり、そして 異種タンパク質をコードする遺伝子の如き異種遺伝子材料を担持する組換ヘルペ スウィルスベクターを含んで成りうる。 本発明の所定の態様に従って提供及び利用される薬理調製品は造血細胞；血液 細胞に関連する悪性細胞；及び悪性又は非悪性CD34＋細胞より選ばれるヒト又は 非ヒト動物細胞を含んで成り；前記細胞は衰弱化又は複製欠陥型であり、且つ非 形質転換性である突然変異ヘルペスウィルスであり、そして異種タンパク質をコ ードする遺伝子の如きを担持する組換ヘルペスウィルスベクターで感染されてい る。 更に本発明に属するのは、in vivo での外来遺伝子の発現を達成するためのヒ ト被検体又は非ヒト動物被検体である被検体を処置する方法であって、前記被検 体に本明細書記載の上記の種類の薬理組成物を投与することを含んで成る方法； 及び免疫応答を誘引するためのヒト被検体又は非ヒト動物被検体である被検体を 処置する方法であって、前記被検体に本明細書記載の上記の種類の薬理組成物を 投与することを含んで成る方法である。 本発明の観点は、例えば非形質転換性ヘルペスウィルスを基礎とし、タンパク 質、例えば免疫調節タンパク質又は遺伝子治療との関連で発現が有用であるタン パク質をコードする組換ヘルペスウィルスベクターの提供及び利用を考慮する； 更に本発明により提供されるのは細胞を一層高度に免疫原性とするためのその形 質導入におけるかかるベクターの利用である：このようにして有用に処理できる 細胞はとりわけ、例えばヒト及び非ヒト動物の悪性細胞、特に、例えば血液細胞 に関連する悪性細胞、例えば白血病細胞又は造血細胞、例えば悪性であろうとな かろうともCD34＋細胞である。即ち、処理のために適当な細胞には、例えば造血 先祖細胞、例えば健康なCD34＋細胞であって、処理細胞の中で発現するのが所望 される異種遺伝子を担持するヘルペスウィルスベクターにより形質導入されると 、高いコピー数の異種遺伝子を担持することができ、インテグラーゼを要せずに 処理細胞のゲノムと相同組換できる細胞が含まれる。 とりわけ本発明の態様の用途は、腫瘍免疫原を作成するための遺伝子の移入に よる悪性造血細胞の改変である。腫瘍免疫原として機能する改変細胞の中で有用 に作成される物質はとりわけGM-CSF及びインターロイキン２である。例えば、腫 瘍細胞によるインターロイキン２の産生は抗腫瘍応答の発生におけるＴヘルパー 機能（E R Fearonら、Cell 60（1990）pp 397 以降）を迂回することが報告され 、そしてマウスGM-CSFの場合（G Dranoff ら、Proc．Nat．Acad．Sci．USA 90（ 1993）pp 3539 以降）、GM-CSFを分泌するように操作された照射済腫瘍細胞によ るワクチン化が潜在的で特異的な持続性抗腫瘍免疫性を刺激することが報告され ている。 かくして、本発明の態様に従うと、組換ヘルペスウィルス、例えば組換HSV が （例えば白血病細胞の形質導入のためのベクターとして利用でき、これによりか かる細胞において免疫調節タンパク質又は癌免疫治療もしくは遺伝子治療に関連 するその他のタンパク質をコードする遺伝子の如き挿入遺伝子材料の発現を供さ れる。本発明の詳しい例において、 HSV１又は HSV２の組換単純ヘルペスウィル スであって、そのゲノムの一部として異種遺伝子を含むように操作されたものは 、白血病細胞に良好な効率をもって遺伝子を搬入するのに、腫瘍細胞内での異種 遺伝子の効率的な発現を誘起するのに利用でき、そして形質導入細胞は例えば細 胞性免疫原、例えば癌免疫治療のためのワクチンとして利用でき、それ故様々な 効果のうちとりわけ、ウィルスベクターで感染された細胞以外の腫瘍細胞に対す る免疫効果を媒介できる。かくして、本発明はとりわけ白血病細胞の遺伝子形質 導入のために有用な方法も提供する。 更に本発明の一定の態様に従って提供するのは、組換ヘルペスウ ィルス、例えばHSV 、例えば複製欠陥型ヘルペスウィルス、例えば HSV１又は H SV２の複製欠陥型HSV の、造血細胞系及びその他の細胞タイプの細胞を基礎とす るタイプの様々な細胞、例えば神経芽腫の形質導入のための、例えばかかる細胞 に免疫調節遺伝子、又は遺伝子治療もしくは癌免疫治療の目的のためのその他の 遺伝子の導入のための利用の方法である。 HSV を基礎とする組換ベクターの例を利用する白血病細胞への形質導入は新鮮 な腫瘍細胞を利用して効果的に達成できうることも見い出された。かくして、細 胞培養条件下で全くインキュベーションされていない、又はあまり長い時間イン キュベーションされていない（例えば約２〜４時間以内、又は一夜の如くインキ ュベーションしていない）細胞（形質導入まで）、例えば採取したばかりの腫瘍 細胞を、適当な遺伝子細胞を担持する本明細書に記載の組換ヘルペスウィルスベ クターに曝露してよい。これは腫瘍細胞により発現されない、又は実質的に発現 されない遺伝子材料、例えばGM-CSFの如き免疫調節タンパク質をコードする遺伝 子材料であってよく、これにより細胞は組換ヘルペスウィルスベクターにより感 染され、そして得られる感染細胞は例えば親細胞の由来する被検体への再導入又 はin vitroでの白血病細胞との反応のために利用されうる。 例えば、採取したばかりのヒト白血病細胞をヒトGM-CSF、又はとりわけ本明細 書記載のその他の免疫調節タンパク質のいづれかをコードする遺伝子を担持する ウィルスベクターに曝露させ、そして免疫原性細胞調製品として被検体に、例え ば下記の手順の一部又は全てを利用し、細胞の有用な形質導入度をもって再導入 できる。対して、従来、対応のレトロウィルスベクターの利用では、通常、例え ば細胞を細胞分裂へと誘導してレトロウィルス形質導入され易くするため、形質 導入する前に腫瘍細胞をin vitroで数日間培養する必 要があったことが証明されている。 これは本明細書に記載の組換ヘルペスウィルスベクターの有用な利点であり、 なぜならそれは腫瘍細胞の研究室操作についてのニーズを少なくし、より迅速で あり、より効率的な細胞形質導入率であり、そして一層有用な臨床的処置の選択 を担いうるからである。 細胞障害性Ｔ細胞は例えばin vitroで、例えば癌免疫治療の目的のため、ウィ ルス形質導入提示細胞又は標的細胞、例えば特に造血細胞系の標的細胞、CD34＋ 細胞の利用により活性化及び／又は増幅でき、ここで形質導入のために用いるウ ィルスは所望の治療に関連する抗原、例えばEBV 又はHPV によりコードされる抗 原をコードし、そして更に、必要なら、本明細書に記載の免疫調節タンパク質を コードする遺伝子を担持している。かかる用途の例は、腫瘍細胞がEBV 又はHPV 抗原を発現する移植被検体におけるドナー細胞腫瘍のケースである；ドナーＴ− リンパ球は、例えば上記したタイプの、対応の異種遺伝子、例えばHPV Ｅ６又は Ｅ７遺伝子を担持する本明細書記載のウィルスベクターによる形質導入の結果と してEBV 又はHPV 抗原を発現する標的細胞に関連して活性化及び増幅できうる。 本明細書に記載の組換ヘルペスウィルスはその他の腫瘍細胞タイプ、例えば神経 芽腫細胞を良好な効率をもって形質導入せしめることもできうる。 本発明に係るベクターとして利用される組換ヘルペスウィルスは免疫調節タン パク質、又は癌免疫治療もしくは遺伝子治療に関連するその他のタンパク質をコ ードする遺伝子を含みうる。 任意のいくつかの免疫調節タンパク質をコードする遺伝子はヒト及び非ヒト動 物において腫瘍細胞を免疫原性にするのに利用できうる。得られる免疫応答は腫 瘍増殖の予防及び処置において利用できうる。 免疫調節因子は免疫応答を高める又は抑制することができる分子である。これ にはサイトカイン（免疫系細胞の活性化、増殖及び分化を開始又は高める可溶性 糖タンパク質）、補−刺激性分子（免疫応答を刺激するのを助けるために免疫細 胞と相互作用する身体内の細胞の表層上に存在する構造）、及び免疫細胞を免疫 又は炎症活性部位、例えば抗原の存在しうる部位へと誘導するのを司る（免疫学 的）化学−誘引分子が含まれる。 本明細書において言及する「免疫調節性」又は「免疫調節」タンパク質には、 宿主細胞の、例えば突然変異ウィルスに対する、又はウィルスにとって外性的な 病原又は起源に由来する免疫原の如き抗原に対する、又は突然変異ウィルスによ り産生されるが如き腫瘍関連抗原に対する免疫反応を高めることのできる１又は 複数種のタンパク質が含まれる。免疫調節性タンパク質はそれ自体が免疫原とし て現在利用されているものではない。 本明細書に記載のウィルスにより発現可能式に担持されたヌクレオチド配列に よりコードされる免疫調節性タンパク質は、例えば組換ウィルスによるワクチン を受ける種にとって天然の配列、又は組換ウィルスにより形質導入された細胞を 受容する種にとって天然の配列を有し得る。例えばヒト免疫原又はワクチンとし て利用すべき、又はヒトに関連して利用すべき細胞調製品を形質導入するための 実体的なヒト配列の免疫調節性タンパク質を利用することが推漿される。 完全複製ウィルスにおけるかかるタンパク質の発現に関連する任意の危険性は 、ウィルスが複製欠陥突然変異体の場合、失われている。一定の態様において、 これらのタンパク質は、利用される背景における免疫原又はワクチンとしての突 然変異ウィルスの効果を高めるように選択されうる。 有用な免疫調節性タンパク質の例には、サイトカイン、例えばインターロイキ ン１〜15（IL１−IL15）、アルファー、ベーター又はガンマーインターフェロン 、腫瘍壊死因子(TNF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、マ クロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、ケモ カイン、例えば好中球活性化性タンパク質(NAP)、マクロファージ化学誘引物質 及び活性化性因子（MCAF）、RANTES、マクロファージ炎症性ペプチド MIP−１ａ 及び MIP−１ｂ、補体成分及びそのレセプター、アクセサリー分子、例えばＴ細 胞補助刺激因子のＢ７科のいづれか、例えばＢ7.1 又はＢ7.2 ，ICAM−１，２又 は３，OX40リガンド及びサイトカインレセプターが含まれる。複数の免疫調節性 タンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入した場合、それらは複数のサイ トカインを含んで成ってよく、又はサイトカインとアクセサリー分子との組合せ であってよい。数多くの更なる種類の免疫調節性タンパク質及び遺伝子が本発明 において有用でありうる。 極めて有用な免疫調節タンパク質の例にはGMCSF ；IL２，IL４；IL７；IL12； Ｂ7.1 ；アルファーTNF ；ガンマーインターフェロン；CD40L ；及びリンホタク チンである。 免疫調節タンパク質をコードする遺伝子材料は突然変異ウィルスゲノム内で、 別の相同的な及び任意的に別の機能を有するポリペプチド領域に連結された免疫 調節タンパク質との相同性及びその機能を有するポリペプチド領域を含んで成る ハイブリド又は融合タンパク質をコードする発現可能なオープンリーディングフ レームとして担持されうる。例えば、免疫調節タンパク質はヒトOX−40の結合パ ートナーとして同定されているgp34タンパク質である、それを含んで成る、又は 機能的に対応しうる（W Goodfreyら、J Exp Med 180(2)1994 pp 757-762 及びそ の中の引用文献、例えばS Miura ら、 Mol Cell Bioll 11(3)1991，pp 1313-1325を参照のこと）。突然変異ウィルスゲ ノム内でコードされうるこのバージョンのタンパク質機能は天然gp34配列自体は 対応しうるか、又はそのフラグメントに対応するか、又は例えば別のタンパク質 に融合したgp34の（Ｃ末端）細胞外（結合性）ドメインを基礎とするハイブリド 発現生成物、例えばgp34細胞外ドメイン（２型膜タンパク質）のＮ末端がイムノ グロブリン定常ドメインのＣ末端に融合したヒト IgG１の如きイムノグロブリン 重鎖の定常領域に対応しうる。 免疫調節タンパク質以外も、対応の又はその他の誘導体及びハイブリド形態で 担持及び発現されうる。かかる免疫調節タンパク質のアミノ酸配列の突然変異を 組込んでよいことも理解される。ここに含まれるのは例えば配列、機能及び抗原 性特性において対応の親配列を有するタンパク質との相同性を保つような突然変 異配列を有するタンパク質が含まれる。かかる突然変異は好ましくは例えば保存 アミノ酸変化、例えば広い意味で類似の分子特性のアミノ酸間での変化を包括す る突然変異でありうる。例えば、脂肪族群、アラニン、バリン、ロイシン及びイ ソロイシン内での交換が保存性であると考えられうる。時折り、グリシンとこれ らのいづれかとの置換も保存性と考えられうる。脂肪族群アスパラギン酸及びグ ルタミン酸内での交換も保存性と考えられうる。アミド群、アスパラギン及びグ ルタミン内での交換も保存性と考えられうる。ヒドロキシ群、セリン及びスレオ ニン内での交換も保存性と考えられうる。芳香族群、フェニルアラニン、チロシ ン及びトリプトファン内での交換も保存性と考えられうる。塩基性群、リジン、 アルギニン及びヒスチジン内での交換も保存性と考えられうる。硫黄含有群、メ チオニン及びシステイン内での交換も保存性と考えられうる。時折り、メチオニ ン及びロイシンの群内での置換も保存性と考えられうる。好適な保 存性置換群はアスパラギン酸−グルタミン酸；アスパラギン−グルタミン；バリ ン−ロイシン−イソロイシン；アラニン−バリン；フェニルアラニン−チロシン ；及びリジン−アルギニンである。別の観点において、突然変異配列は挿入及び ／又は欠失を含んで成りうる。 誘導体及びハイブリド形態の極めて有用な例には、トランスメンブランセグメ ント、細胞内配列部分、Ｎ末端又はＣ末端配列、例えば１〜５個のアミノ酸上流 の配列のいづれかの欠損した配列、並びに／又はＮ末端又はＣ末端配列、例えば １〜５個のアミノ酸上流の配列の付加された配列、又は例えば上記の更なる機能 性配列の付加された配列を有するタンパク質が含まれる。 適切には、免疫調節性タンパク質はサイトカイン、例えば顆粒球マクロファー ジコロニー刺激因子（GM-CSF）を含んで成りうる。マウスGM-CSF遺伝子は、例え ば 141個のアミノ酸のポリペプチド、即ち、グリコシル化度に依存して14ｋ〜30 ｋダルトンの分子量を有する成熟分泌糖タンパク質をコードする。GM-CSFは造血 増殖因子科の構成員であり、そしてそれは造血先視細胞においてin vitroコロニ ー形成を刺激するその能力によりはじめて決定及び同定されたものである。GM-C SFは好中球、好塩球及びマクロファージー単球機能の有能なアクベーターであり 、移動性、食作用、主要組織適合性複合体(MHC)発現を高め、そして免疫系を更 に刺激する生物活性分子のカスケードを開始させる。ヒトGM-CSFは化学治療後の 好中球減少症の処置のため及び癌治療における補助薬として臨床業界において現 在評価されている。採用する異種ヌクレオチド配列は異種遺伝子、遺伝子フラグ メント又は遺伝子の組合せを含んで成りうる。 本発明はまた修復遺伝子治療に利用でき、標的細胞の有用性又は活性を高める こともできる。例えば、正常CD34＋細胞をDNA 修復酵 素、例えばＯ６−メチルグアニンDNA メチルトランスフェラーゼ（MGMT）をコー ドする本明細書記載のウィルスベクターで形質導入して、例えばニトロソウレア による化学治療の際に（T Moritzら、Cancer Res 55(12)（1995）pp 2608-2614 ; R Maze ら、Proc Natl Acad Sci USA 93(1)1996 206-210参照）；又は放射線 損傷に対して標的細胞を保護することができる。上記の種類の修復遺伝子治療の その他の遺伝子も標的細胞に導入することもできうる。 異種DNA 、例えば更なるDNA を、その他の目的のためのウィルスベクターに、 例えば宿主ゲノムの中にウィルスベクターDNA を組み込むのに働くことができる ことで知られ、宿主細胞の有系分裂が起きたときにベクターDNA が増幅し始める ようにするインテグラーゼを発現式にコードさせる；及びその他の目的のため、 有効に導入してよい。 更に、本発明の態様に従うと、悪性芽細胞を破壊又は調節する修復又は致死遺 伝子材料を挿入する材料及び方法を提供する。これは例えば、当該ベクターによ りコードされる遺伝子材料に対応するアセンチセンス又はリボザイム配列の、本 明細書記載のヘルペスウィルスベクター法による標的細胞内での発現により行わ れうる；例えばD Marcola ら、「Antisense Approaches to Cancer Gene Therap y 」Cancer Gene Ther 2（1995）pp 47 以降参照のこと。アンチセンスポリヌク レオチドの利用のための技術は周知であり、そして有効な細胞環境において適切 な公知のプロモーターの中から選定することにより選定された標的の配列と約12 個のヌクレオチドの配列相補性の適当なヌクレオチド配列及びその他の公知の手 段を利用することにより本用途に必要な特異性に容易に適応できる。 例えば、標的遺伝子の発現を破綻するためのアンチセンスRNA の利用について の技術は明細書WO94/26908（Genetech : TG Warnerら ）に記載されている（シリアダーゼ遺伝子との関連で）。mRNA分子に特異的に結 合できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用するための技術は明細書WO94/2 9342（La Jolla Cancer Research Foundation and the Regents of the Univers ity of Michigan : R Sawadaら）にも記載されている（特に、ヒトの目由来のポ リペプチドをコードするmRNAと関連で）。標的RNA に対して相補的なアンチセン スオリゴヌクレオチドについての技術は明細書WO94/29444号（Department of He alth and Human Services : B Ensoli and R Gallo）に記載されている（塩基性 線維芽細胞増殖因子RNA に適用）。mRNAに対して実質的に相補性である配列を有 し、それ故標的核酸に対して相補性であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの、 標的の機能又は発現を阻害するために利用する技術はWO94/24864号（General Ho spital Corporation : HE Blumら）に記載されている（Ｂ型肝炎ウィルス複製の 阻害に適用）。アンチセンス技術についてはD Mercola and J S Cohen，ch．7 p p 77-89，RE Sobol and K J Scanlon(編)「Internet Book of Gene Therapy : C ancer Therapeutics 」(Appleton & Lange，Stamford，Connecticut，1995)を参 照のこと。その他の標的特異性に対する適用は応用により容易にアクセス可能で ある。 遺伝子発現を破綻するためのリボザイムを利用する技術も公知である。例えば 、標的RNA を切断又はそうでなければ標的遺伝子の発現を破綻するためのリボザ イム（又はアンチセンスオリゴヌクレオチド）を作製及び投与するための技術は 明細書WO94/13793号（Apollon : C J Pachukら）に記載されている（白血病に関 連する一定のmRNAを標的とするリボザイムに適用）。リボザイム技術については 、M Kashani-Sabet and K J Scanlon 第８章 pp 91-101 RE Sobol and K J Scan lon(編)「Internet Book of Gene Therapy : Cancer Therapeutics 」(Appleton & Lange，Stamford，Connecticut，1995)を参照のこ と。ここでもまた、その他の標的特異性への適用は応用により容易にアクセス可 能である。 致死遺伝子もベクターに挿入して形質導入細胞を破綻させることができる：例 えば、明細書WO95/14100号（Wellcome Foundation : C Richardsら）に記載の如 き投与薬剤との関連で致死的であり、CEA プロモーターのコントロール下でシト シンデアミナーゼ(CDA)をコードする遺伝子を代表する遺伝子。これは細胞の中 に導入されたとき、CDA により毒性５−フルオロウラシルへと変換される５−フ ルオロシトシンの投与との関係で致死的である。 本明細書記載の免疫調節タンパク質又はその他の遺伝子材料をコードする遺伝 子を搬送するのに利用される組換ヘルペスウィルスは好ましくは衰弱化及び／又 は複製欠陥型ヘルペスウィルスである。 突然変異ヘルペスウィルスは有効には任意の適当なヘルペスウィルスの突然変 異体、例えば哺乳動物ヘルペスウィルスの非形質転換性突然変異体：例えば非形 質転換性ヒトヘルペスウィルスの突然変異体、特に、例えば被覆化又は封入化突 然変異ヘルペスウィルスであってよい。本発明の態様に従ってベクターとして提 供及び使用されうるかかる突然変異体のヘルペスウィルスの例には、１型(HSV− １)又は２型(HSV−２)の単純ヘルペスウィルス、ヒト又は動物サイトメガロウィ ルス(CMV)、例えばヒトサイトメガロウィルス（HCMV）、バリセラ・ゾスター・ ウィルス(VZV)、及び／又はヒトヘルペスウィルス６及び７が含まれる。EBV は 、非形質転換性突然変異体の形態を除いてはあまり所望されず、それはその正常 な形質転換特性を理由とする。本発明の態様に従って提供するかかる突然変異体 の動物ウィルスには、シュードラビエスウィルス(PRV)、ウマ及びウシヘルペス ウィルス、例えばEHV 及びBHV 型、例えばIBRV、並 びにMarek 病ウィルス(MDV)及び近縁ウィルスが含まれる。 ヘルペスウィルス及びその多くの対応の同族体の遺伝子の命名法は様々であり 、そしてその内容が許す限り、ヘルペスウィルスについての遺伝子の言及は、そ の遺伝子の同族体を有するその他のヘルペスウィルスとの関連で、対応の同族体 についての言及を含んでいる。 本発明に係る利用に適するベクターを製造するための組換体の基礎として利用 する適当なヘルペスウィルスには明細書WO92/05263（Inglisら：Immunology Lim ited）（その開示内容は引用することで本明細書に組入れる）の中の一般的又は 特定の仕様に合う欠陥ヘルペスウィルスが含まれる。その明細書には、例えば、 ゲノムが感染性ウィルスの生産に必須な遺伝子の観点において欠陥となっている 突然変異ウィルスの免疫原又はワクチンとしての利用が記載されており、従って このウィルスは正常な宿主細胞に感染し、複製し、そしてかかる細胞の中でウィ ルス抗原遺伝子を発現することができるが、感染性ウィルスを生産することはで きない。特にWO92/05263号には、ウィルス感染能に必要とされる必須糖タンパク 質Ｈ（gH）をコードする遺伝子の欠損により不能となったHSV ウィルスが記載さ れている(A Forrester ら、J Virol 66（1992）341-348)。gHタンパク質の発現 がないと、ウィルスタンパク質のほぼ完全なレパートリーを供する非感染性ウィ ルス粒子が生産される。しかしながら、このような子孫粒子は宿主細胞に感染で きず、従って宿主内でのウィルスの拡散が防がれる。かかるウィルスは動物モデ ルにおいて有効な免疫原及びワクチンであることが示されている(Farrell ら、J Virol 68（1994）927-932 ; McLeanら、J Infect Dis，170（1994）1100-9)。 かかる突然変異ウィルスは、この突然変異ウィルスが欠陥となっ ている観点において遺伝子生成物を発現する細胞系の中で培養できうる。 文献には単純ヘルペスウィルスのタンパク質を発現する細胞系も記載されてい る：gB糖タンパク質(Cai ら、J Virol 61（1987）714-721)、gD糖タンパク質(Li gas and Johnson，J Virol 62（1988）1486)及び即時タンパク質（Immediatc Ea rly protein）ICP4(Deluca ら、J Virol 56（1985）558)。これらも対応の遺伝 子との関連で不活性化されたウィルスの複製を支持することができることが示さ れている。 完全又は実体的な配列データーがいくつかのウィルス、例えばヒトサイトメガ ロウィルスCMV（Weston and Barrell，J Mol Biol 192（1986）177-208）、バリ セラ・ゾスター・ウィルス VZV(AJ Davison and Scott，J Gen Virol 67（1986 ）759-816)及び単純ヘルペスウィルスHSV（McGeochら、J．Gen Virol 69（1988 ）1531-1574及び下記に引用する他の文献）についてのそれが公開されている。g H糖タンパク質はCMV 及びVZV において相同性を有することで知られる（Desai ら、J Gen Virol 69（1988）1147）。 かかる遺伝子の適当な例は必須ウィルス糖タンパク質、例えば（後期）必須ウ ィルス糖タンパク質、例えばgH，gL，gD及び／又はgBについての遺伝子、並びに その他の必須遺伝子である。ヒトヘルペスウィルスの必須及びその他の遺伝子は DJ McGeoch「The Genomes of the Human Herpesviruses」，Ann Rev Microbiol 43（1989）pp 235-265 ; D J McGeochらNucl Acids Res 14（1986）1727-1745 ; D J McGeochらJ mol Biol 181（1985）1-13の中のデーター及び引用文献より同 定可能である。例えばCMV 及びVZV におけるgH糖タンパク質の相同性についての 例えばDesai らJ Gen Virol 69（1988）1147に公開のデーターも参照のこと。 本発明においてウィルスベクターとして更に有用なのは例えば即時遺伝子発現 をトランス誘導できず、そしてマウスに注射したときに本質的に弱毒性であるC I Ace らJ Virol 63(5)1989 pp 2260-2269に記載の HSV−１突然変異（1814）の 如き突然変異体である。明細書WO91/02788号（CM Preston & C I Ace : Univers ity of Glasgow）には、神経宿主細胞において後期感染を樹立することができ、 且つ挿入治療遺伝子の発現を及ぼすことのできる1814に関与する有用 HSV１突然 変異体が記載されている。本発明において有用なウィルスベクターの更なる例は ヘルペス即時遺伝子、例えば ICP０， ICP４，ICP22 及びICP27 に対立遺伝子に おける突然変異を基礎とする。突然変異は、例えば引用することで本明細書に組 入れるWO96/04395（P Speck : Lynxvalc）に開示の如き組合せで利用できうる。 本発明における利用のためのウィルスベクターとして更に適当なのは突然変異体 1716の如き神経衰弱 HSV１突然変異体である(B P Randazzoら、Virology 211（1 995）pp 94-101)。 ヘルペスウィルスについては、例えばヒトサイトメガロウィルスCMV（Weston and Barrell，J Mol Biol 192（1986）177-208）及びバリセラ・ゾスター・ウィ ルス VZV(AJ Davisonら、J Gen Virol 57（1986）759-816)についての公開され たデーターを参照のこと。 以下に更に詳細する本発明の一定の例に従うと、遺伝子的に不活性化されたウ ィルス免疫原、例えばワクチンが免疫調節タンパク質をコードする遺伝子のため の有用な担体を担う。ウィルスワクチンはワクチン化宿主の細胞に感染でき、免 疫調節タンパク質の細胞内合成を供する。もし遺伝子的に不活性化したワクチン が外来抗原の搬送のためのベクターとしても働くなら、外来抗原に対する免疫反 応が高まる又は改変されうる。 このような複製欠陥ウィルスはワクチン化宿主の細胞において１ サイクルの複製しかせず、そして新たなウィルス粒子を生産できないため、免疫 調節タンパク質の生産は、感染が広がりうる複製コンピテントウィルスの状況に 反して、ワクチンのサイズに制約される。更に、生産される免疫調節タンパク質 の全体的な量は、強力な免疫応答を刺激するのに局所的には十分であるが、複製 コンピテントウィルスにより生産されるものよりは少なく、そして有害な全身応 答をあまり供しないであろう。 かかる好適な態様において、免疫調節又はその他のタンパク質をコードする遺 伝子を通常含んで成る異種ヌクレオチド配列を突然変異ウィルスのゲノムの中に 、欠失した必須の遺伝子の座において挿入し、そして最も好ましくは、異種ヌク レオチド配列は全体が欠失している遺伝子を完全に置換するものとする。このよ うにして、たとえ任意の不要な組換現象が起き、その結果野生起源から突然変異 ウィルスへの欠失遺伝子の再挿入があったとしても、挿入異種ヌクレオチド配列 はほとんど排除されているであろう。これは、異種ヌクレオチド配列のための複 製コンピテントウィルス担体ができるであろう可能性を回避するであろう。かか る組換現象は非常に稀れであるが、本態様において、その発生の有害な効果は最 少限とするであろう。 本発明に係る材料と方法は治療用ワクチンの如き細胞性免疫原により活性化さ れる免疫学的エフェクターメカニズムを誘引するのに、特に標的抗原に対して特 異的な特異的細胞障害性Ｔリンパ球(CTL)を誘引するのに利用できうる。かかるC TL は腫瘍細胞を認識及び破壊する性質による有利な効果を奏することができ、 そして様々な診断及び／又は治療方法においてex-vivo で使用することもできる 。 腫瘍細胞と正常細胞との間に抗原性相違があるとき、腫瘍特異的 抗原が免疫応答を刺激する適正な形態において有用となっていることを前提に、 それらは免疫系により認識されうる。これは腫瘍特異的マーカーの必要性を回避 する。 CTL は宿主主要組織適合性複合体(MHC)抗原との関連で抗原認識を基礎とする 。宿主細胞の細胞質内の抗原性標的よりできるペプチドは宿主MHC 分子と複合体 を形成し、そして細胞表層へと輸送され、そこでそれらはCTL の表層上のレセプ ターにより認識されうる。 本発明により提供されるベクターを利用する一の方法は、従って、１又は複数 の個体に由来する腫瘍材料からワクチンの如き細胞性免疫原を調製し、そして別 の被検体、例えば患者の処置のためにこれを免疫原又はワクチンとして投与する ことにする。しかしながら、上記の理由のために腫瘍細胞に対するCTL 応答が所 望されるなら、標的抗原は適正なMHC 分子との関連において供されるべきである 。一の個体の腫瘍から調製した免疫原又はワクチンは従って常に、異なるMHC タ イプを有する別の個体にとって適当であるわけではない。MHC 分子は個体間で異 なるため、一般に、標的抗原に対するCTL 応答を活性化するため、適正なMHC と の関連で免疫系に対応の標的抗原を供与することが必要である。従って、治療用 ワクチンの如き免疫原として利用するため、一般に選定の標的抗原を処置した被 検体又は患者自身の細胞の中に導入して適正なCTL 応答を供することが最良であ ると考えられる。 従って、腫瘍免疫原又はワクチンを患者自身の腫瘍細胞に基づかせることが特 に有用であり得、それは自己ワクチン化として知られる手順である。このような 利用の更なる主要な利点は、それに特定の腫瘍に固有でありうる抗原性標的の利 点が備わっていることにある。腫瘍増殖を基礎とする非制御型細胞サイクルコン トロールは、ある時間、新たな抗原決定基として明示される遺伝子変化の蓄積を 招きうると考えられる。尚、本発明の最後に記載した態様は自己ワクチン化手順 の問題、即ち自己腫瘍細胞の免疫原性が劣るという問題を回避又は解消しうる。 本発明の例に係る手順は、実験室的手順により被検体から取り出した腫瘍細胞 への標的遺伝子の導入、その後のそのようにして処理した細胞の処置すべき被検 体への再導入を包括しうる（ex-vivo 処置）。本発明の所定の例に従う別の手順 は患者の腫瘍細胞に標的遺伝子を直接導入することにある（in vivo 処置）。in -vivo 手順の利点は患者の腫瘍細胞の実験室的な操作を必要としないことにある 。欠点は有効な遺伝子形質導入がin vivo で達成されるものよりも困難でありう ること、又は所望の度合を達成することがより困難でありうることにある。他に 、非腫瘍細胞も当該ウィルスベクターにより有効にトランスフェクションされう る。 特定の例において、組換ヘルペスウィルスは、感受性細胞へのウィルスの侵入 に関わるウィルス粒子の表層上に存在するタンパク質である糖タンパク質Ｈ（gH ）の遺伝子において欠失を担持する単純ヘルペスウィルスの不能形態を基礎とす る。このウィルスはウィルスゲノムにおいて失われている必須機能を補完するプ ロデューサー細胞系の中でのみ複製できうる。組換補完細胞系の有用な例は、ウ ィルスベクターから欠失したものと同じHSV gH遺伝子を安定的に発現するように 操作されたものである。プロデューサー細胞系から作られたウィルスはその構造 の一部として細胞コード化gH遺伝子生成物を獲得しており、そして感染性である 。このウィルス調製品は野生型ウィルスと同じようにして正常細胞に感染できる 。一旦細胞に入ったら、このウィルスゲノムは細胞内で複製でき、そしてゲノム により担持された遺伝子はタンパク質として発現されうる。しかしながら、欠陥 ウィルスが正常細胞に感染するときの機能性gHタンパ ク質のなさは、新たな感染性ウィルス粒子の作製不良をもたらす。gH欠失ウィル スはワクチン又は遺伝子導入媒体として投与が安全と考えられる。 ベクター、例えば癌免疫治療のためのHSV ベクターは完全に不能であり、且つ 処置宿主内で拡散できないことが好ましい。しかしながら、有用なベクターは臨 床的な状況において利用するのに十分安全と認められている任意のHSV ウィルス を基礎としうる。また、かかるgH欠失HSV ゲノムに組込まれた異種遺伝子が、gH 遺伝子の除去された座に挿入され、相同組換による異種遺伝子の野生型HSV への 変換が処置個体内で同時に起こりうることの危険性を最少限にすることも好まし い。しかしながら、異種遺伝子はその代わりにウィルスゲノム内の任意の位置に 挿入してよい。 本発明の範囲における方法の更なる応用は、適当な遺伝子材料、例えば免疫調 節タンパク質をコードする遺伝子をヘルペスウィルス粒子内にパッケージングさ れたヘルペスウィルスアンプリコンの形態で搬送することにある。アンプリコン DNA は、ヘルペスウィルスゲノムの複製起点とこのDNA をウィルス粒子へとパッ ケージングすることを指令しうるDNA 配列とを含むDNA である。かかるアンプリ コンが細胞の中に対応のヘルペスウィルス（ヘルパーウィルス）と一緒に存在し ているとき、アンプリコンDNA の発現はヘルペスウィルスDNA の発現と一緒に起 こる。外来遺伝子はかかるアンプリコンの中にクローニングでき、それ故アンプ リコン及びヘルペスウィルスにより感染された細胞の中で発現する。パッケージ ングされたアンプリコンを含む粒子は表現形式が対応のヘルペスウィルスと同等 であることができ、それ故同じ宿主細胞に感染することができ、そして本明細書 では欠陥突然変異ヘルペスウィルスの中で本発明の実施における利用に適切であ ると考えられている。即ち、ウィルスパ ッケージングアンプリコンは選定のDNA を所望の細胞へと搬送するのにも利用で きうる。本発明の実施例における利用のために利用される又は容易に仕上げるこ とのできるアンプリコン及びその調製は、更なる詳細と共に、WO96/29421（Efst athiouら：Cantab Pharmaceuticals Research Ltd and Cambridge University T echnical Services Ltd.）に詳細に説明してある。 アンプリコンをパッケージングするために利用するHSV ヘルパーウィルスはそ れ自身は宿主にとって有害ではなく、それ故欠失した必須遺伝子を有する不能ウ ィルスであることが好ましい。例えば上記のgH欠失ウィルスはWO92/05263及びそ の中に引用されているその他の関連文献に記載の如き理想的なヘルパーウィルス を担う。しかしながら、その他の有用なヘルパーウィルスは、臨床的状況におい て十分に衰弱又は不能となったヘルペスウィルスを基礎とするものであってよく 、全体的に複製欠陥のものである必要はない。 ここに記載の発明は、免疫調節タンパク質の如き選定のタンパク質をコードす るDNA の如き選定の遺伝子材料を治療の目的のための腫瘍細胞へと搬送するのに 利用できうる。免疫応答の刺激の目的のために搬送できる遺伝子の範囲には、サ イトカイン、免疫刺激因子、リンホタクチン、CD40，OX40，OX40リガンド及びそ の他の本明細書に記載の遺伝子材料であって単一遺伝子もしくは多重遺伝子とし て、又は１もしくは複数の遺伝子の多重コピーとしてベクターの中に含まれうる ものが含まれる。 本発明の態様において、例えば本明細書の下記に特に記載のベクター及び標的 細胞を利用することで、正常及び悪性ヒト造血先祖細胞は60〜100 ％の範囲の効 率で容易に形質導入されうる。達成される形質導入及び遺伝子発現のレベルは、 特にこれらの標的に関し、非常に効率的であると考えられる。 本発明の態様は移入遺伝子の有用な迅速発現を供することもできる。例えば、 本明細書に詳しく記載の条件下で、移入遺伝子の発現の陽性は、ベクターに曝露 して24時間以内に、CD34＋細胞並びにAML 及びALL 芽細胞で80〜100 ％において 得られた。本発明の態様は、例えばgH欠失ヘルペスウィルスベクターにより移入 された対応の遺伝子の発現によりヒト一次白血病細胞において生産されるGM-CSF の場合、MOI(感染多重度：通常はプラーク形成単位（pfu/細胞）で計算)に比例 するレベルで、例えば0.05〜20の範囲のMOI で、少なくとも７日間にわたり移入 遺伝子の生成物を生産及び例えば放出する形質導入細胞の調製を供しうる。 従って、本発明の態様は、対応の免疫原の製造が今日まで理論的な問題を示し ていた状況において、免疫原、例えばヒト白血病免疫原の製造を可能にする。〔 たとえ、白血病芽細胞においても、例えば、一定の感受性細胞例において、レト ロウィルス又はアデノウィルスベクターにより高レベルのサイトカイン生産を得 ることが可能でありうる又は可能となりうる。本発明の態様は今までに試験した 全ての患者より、有用な高い比率の形質導入すべき白血病芽細胞の一貫した達成 を可能にすることが見い出され、それ故臨床実施における有用な利点を供する。 〕 本発明を更に、例示のみであり、限定を意味しない手順及び生成物並びに手順 及び生成物の一部の実施例の助けにより以下に更に説明する。 適当なベクターの構築体を、限定することなく、添付図面に示す：ここで、図 １〜６はそれぞれプラスミドpIMMB45，pIMMB56，pIMMB46，pIMC14 ，pIMR１及び pIMR３の構築を例示する。これらのベクターは下記に詳しく説明する； 図７及び８は本発明の特定の態様に従う、下記の通りに構築した 遺伝子的に不能なヘルペスウィルスによる細胞の形質導入の結果を示す。 下記のベクター及びその構築体の説明は単に例示にすぎない。pH欠陥ウィルス の構築及び特性並びに適当な補完細胞系は明細書WO92/05263号及びWO94/21807号 （Cantab Pharmaceuticals Research Limited : S C Inglisら）（引用すること で本明細書に組入れる）、Forrester ら1992 J．Virol．66，pp 341 以降、及び C S Mcleanら、J Infect Dis 170（1994）pp 1100 以降に示されている。更に、 遺伝子操作手順は全て「Molecular Cloning 」A Laboratory Marual，eds．Samb rook，Fritsch and Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989に記 載されている。 造血幹細胞の如き細胞へのベクターの搬送及びそれにより処置する患者への細 胞の播種は当業界公知の技術の簡単な応用により実施できる。例えば、M K Bren ner ら、Cold Spring Harbor Symposia in Quantative Biology vol LIX（1994 ）pp 691-697 もしくはその中に引用されている文献、又はM K Brenner らLance t 342（1993年11月６日）pp 1134-1137もしくはその中に引用されている文献に 記載の方法が容易に適用及び応用できる。GM-CSF を発現するgH−欠失 HSV１及びgH−欠失 HSV２の構築 gH−欠失 HSV１ウィルス及びgH−欠失 HSV２ウィルスを補完細胞系の中で増殖 させる。これらの細胞系は HSV−１ gH 遺伝子又は HSV−２ gH 遺伝子のそれぞ れを発現するように操作されている。かかる細胞系はWO94/05207及びWO94/21807 号並びにその中の引用文献の中に記載の通りに構築できる。以下の章は適当な細 胞系の構築の更なる説明を担い、そして一定のプラスミドの構築で始まる： HSV ウィルスDNA が必要なとき、それは例えば(HSV２の場合)Walboomers and Ter Schegget（1976）Virology 74，256-258 の方法 、又はその方法の適当な応用により株HG52から作ることができる。HG52株の選り 抜きのストックがInstitute of Virology，MRC Virology Unit，Church Steet， Glasgow，Scotland，UK に保存されている。その他の HSV−２株のDNA はこの領 域に非常に似ているようであり、そして例えば株Ｇ及びMSはATCC，Rockville，M aryland，USAより入手できる。プラスミドpIMC05の構築 HSV−１（HFEM）gH遺伝子及び上流の HSV−１ gDプロモーター（−392 〜＋1 1）をコードする 4.3kbの Sst−ＩフラグメントをプラスミドpgDBrgH（Forreste rら、前掲）から切り出し、そしてpUC119（Vieira & Messing，1987）の中にク ローニングしてプラスミドpUC119gHを作った。 Not１部位を部位特異的突然変異 誘発により、gH停止コドンの87bp下流にてプラスミドpUC119の中に導入した。得 られるプラスミドpIMC03 をNot１− Sst１フラグメントを作るのに利用し、それ をCMV IEプロモーターを除去するために Not１及び Nru１で予め消化しておいた 真核系発現ベクターpRc/CMV(Invitrogen Corporation)の中にライゲーションし た。得られるプラスミドpIMC05はウィルス誘導性gDプロモーターのコントロール 下にある HSV−１ gH 遺伝子及びBGH(牛成長ホルモン)ポリＡを含む。これはま たG418耐性安定細胞系の選別のためのネオマイシン耐性遺伝子も含む。gH −欠失 HSV−１補完細胞系の構築 プラスミドpIMC05をリン酸カルシウム技術(Sambrook，Fritsch & Maniatis，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)を利用してV ero(ATCC no．88020401)細胞の中にトランスフェクションした。細胞をG418の存 在下での希釈クローニングにより選別し、そしてクローン細胞系を単離した。増 幅及び凍結 後、細胞を24穴プレートに播種し、そして0.1pfu／細胞でのSC16（del）gH（For resterら、前掲）による感染によりgH陰性ウィルスの増殖を支持するその能力に ついて試験した。ウィルスプラークは感染３日後に観察され、gH遺伝子の発現を 確証した。BHK TK 細胞系の構築 これらの細胞は、gH欠失 HSV−１及びgH欠失 HSV−２補完細胞について記載し たのと同じようにしてチミジンキナーゼ陰性（TK）BHK 細胞（ECACC No．850114 23）にプラスミドpIMC005 をトランスフェクションすることにより作った。 プラスミドpIMC08の構築 HSV−２ gH 遺伝子を含むプラスミドpIMMB24 を HSV−２株25766 の隣接し合 う２個のBamHＩフラグメントより構築する。約3484塩基対のBamHＩ Ｒフラグメ ントを含むプラスミドpTW49 及び約3311塩基対のBamHＩ Ｓフラグメントを含む プラスミドpTW54 の双方をpBR322のBamHＩ部位の中にクローニングする。同等の プラスミドが HSV−２の数多くの有用な株又は臨床単離物から容易にクローニン グできる。 HSV−２遺伝子の５’末端をBamHＩ及び KpnＩを用いてpTW54 から切 り出して2620塩基対のフラグメントを作り、それをゲル精製する。 HSV−２ gH 遺伝子の３’末端をBamHＩ及び SalＩを用いてpTW49 から切り出して870 塩基対 のフラグメントを作り、それもゲル精製する。２本のフラグメントをSalHＩ及び KpnＩで消化しておいたpUC119の中にクローニングする。このプラスミドはこれ により HSV-２ gH 遺伝子全体を含む。 HSV−２（株 25766）gH遺伝子を含むプラスミドpIMC08を下記の通りにして構 築した。プラスミドpIMMB24 を NcoＩ及びBstXＩで消化し、そしてgH遺伝子の中 央部を含むフラグメントをアガロースゲルから精製した。この遺伝子の５’末端 を２本のオリゴヌクレオチ ドCE39及びCE40より再構築し、それはHindIII及び NcoＩ部位により境界形成さ れた凍結配列を形成する。 この遺伝子の３’末端は２本のオリゴヌクレオチドCE37及びCE38により再構築 し、それはBstXＩ及び NotＩ部位により境界形成された連結配列を形成する。 ２本のオリゴヌクレオチドリンカー及び精製 NcoＩ−BstXＩ gHフラグメント を三重ライゲーションでHindIII− NcoＩ消化pIMC05にクローニングし、これに より HSV−１ gH 遺伝子を HSV−２ gH 遺伝子に置き換えた。得られるプラスミ ドをpIMC08と命名する。gH 欠失 HSV-２相補性細胞系（CR２）の構築 プラスミドpIMC08はウィルス誘導性gDプロモーターの転写コントロール下にあ る HSV−２ gH 遺伝子及びBGH(牛成長ホルモン)ポリＡを含む。これは更にG418 耐性安定細胞系の選別のためのネオマイシン耐性遺伝子も含む。プラスミドpIMC 08をリン酸カルシウム技術（Sambrook，Fritsh & Maniatis．A Laboratory Manu al Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）を利用してVero(ATCC no．88 020401)細胞の中にトランスフェクションした。細胞をG418の存在下での希釈ク ローニングにより選別し、そしてクローン細胞系を単離した。増殖及び凍結後、 CR２細胞を命名したこれらの細胞を24穴プレートに播種し、そしてgH欠失 HSV− １(SC16（del）gH)により0.1pfu／細胞で感染させた。ウィルスプラークを感染 後３回目に観察し、gH遺伝子の発現を確認した。組換プラスミドの構築 ａ）pIMMB56＋ pIMMB56 はgH遺伝子の片側に HSV−２配列の隣接したlacZカセットを有するベ クターである。これは下記の通りに調製した：オリゴMB97−MB96及びオリゴMB57 −MB58により作られた２本のPCR フラグメントを、PCR オリゴヌクレオチドに含 まれる部位に適する制限酵素で消化する。MB97−MB96フラグメントをHindIII及 び HpaＩで消化する。MB57−MB58フラグメントは HpaＩ及びEcoRＩで消化する。 次いでこれらのフラグメントをHindIII及びEcoRＩで消化したベクターpUC119の 中にライゲーションする。得られるプラスミドをpIMMB45と呼ぶ（図１）。 PCR のために用いたオリゴヌクレオチドを下記に示す： 第一段階組換体の検出をし易くするため、SVプロモーターのコントロール下で Ｅ．コリベーターガラクトシダーゼ遺伝子をpIMMB45 の中に挿入する。SV40プロ モーターとベーターガラクトシダーゼ遺伝子をBamHＩ及び TthIII１を利用して プラスミドpCH110(Pharmacia)から切り出す。その先端をDNA ポリメラーゼのク レノウフラグメントを用いて補完する。このフラグメントをゲル精製する。プラ スミドpIMMB45 を HpaＩで消化し、子牛小腸アルカリホスファターゼ（CIAP）で ホスファターゼ処理して自己ライゲーションをなくし、 そしてゲル精製する。ゲル精製したフラグメントを互いにライゲーションさせて プラスミド pIMMB56＋を作る（図２参照）。 ｂ）pIMMB46 pIMMB46 は HSV−２ gH 遺伝子に隣接する配列を含み、中央に固有 HpaＩ部位 を有する。この部位にクローニングされた任意の遺伝子は HSV−２ゲノムの中に gH座において組換により挿入されうる。もしこのウィルスがTK陰性gH陰性ウィル ス（例えば、上記の pIMMB56＋プラスミドを用いて作製）なら、このプラスミド をTK遺伝子の３’末端に置き換え、TK活性を保存及びTK陽性ウィルスについての 選択を可能にする。 オリゴMB94−MB109 により及びオリゴMB57−MB108 により作った２本のPCR フ ラグメントをPCR オリゴヌクレオチドの中に含まれる部位に適する制限酵素で消 化する。MB94−MB109 フラグメントをHindIII及び HpaＩで消化する。MB57−MB1 08 フラグメントを HpaＩ及びEcoRＩで消化する。これらのフラグメントをHindI II及びEcoRＩで消化したベクターpUC119の中にライゲーションさせる。得られる プラスミドをpIMMB46 と称する（図３参照）。使用したオリゴヌクレオチドは下 記の通りである： HpaＩ MB57： ５’TCAGTTAACGCCTCTGTTCCTTTCCCTTC ３’ EcoRＩ MB108： ５’TCAGAATTCGTTCCGGGAGCAGGCGTGGA ３’ HindIII MB94： ５’TCAAAGCTTATGGCTTCTCACGCCGGCCAA ３’ HpaＩ MB109： ５’TCAGTTAACTGCACTAGTTTTAATTAATACGTATG ３’ ｃ）pIMC14 プラスミドpRc/CMV(Invitrogen Corporation)を制限酵素 NruＩ， PvuII及び BsmＩで消化し、そして1066塩基対 NruＩ− PvuIIフラグメントをアガロースゲ ルから単離した。このフラグメントを HpaＩ消化したpIMMB46 の中にクローニン グした（図４参照）。得られたものをpIMC14と命名する。 pRc/CMV フラグメントはサイトメガロウィルス主要即時プロモーター（CMV-IE プロモーター）及び牛成長ホルモン(BGH)ポリＡ付加部位を含む。このプラスミ ドpIMC14は外来遺伝子の挿入のための固有部位を有する一般の組換プラスミドで あり、これは HSV−２ gH 欠失DISCベクターの中に組換えすることができる。 ｄ）pIMR１ プラスミドpIMR１はDISC HSV−２ベクターへの、 CMV−IEプロモーターのコン トロール下でのマウスGM-CSF遺伝子の挿入のための組換ベクターである。pIMC14 を XbaＩで消化し、CIAPでホスファターゼ処理し、ゲル精製し、そして突き出し 先端をクレノウポリメラーゼで平滑にする。マウスGM-CSF遺伝子をプラスミドpG M 3.2 FF（Gough ら、EMBO Journal 4,645-653，1985ではpGM 3.2 と称されてい る）から（又は前記の通りに構築した同等のプラスミドから）、２段階手順によ り切り出す。まずpGM 3.2 FFをEcoRＩで消化し、そして1048塩基対のフラグメン トをゲル精製する。次いでこのフラグメントをHinfＩ及び StuＩで消化する。49 5 塩基対のフラグメントをゲル精製し、そしてその末端をクレノウフラグメント で修復する。次いでこのフラグメントを上記の通りに調製したpIMC14の多重クロ ーニング部位の中にクローニングする。得られるプラスミドをpIMR１と命名する （図５参照）。 pGM3.2と同等の別のプラスミドは下記の通りに構築できる。cDNAクローンのラ イブラリーをクローン化Ｔ−リンパ球系（マウスのBA LB／ｃ株由来）、例えばLB３（Kelso ら、J Immunol．132，2932，1984）から構 築する。それにおいては、GM-CSFの合成はコンカナバリンＡにより誘導される。 このライブラリーをマウスGM-CSF遺伝子に特異的な配列によるコロニーハイブリ ダイゼーションにより探索する（配列については、Gough ら、EMBO J．4,645,19 5 を参照）。この場合に有用なオリゴヌクレオチドの例は５’TGGATGACAT GCCTG TCACA TTGAATGAAG AGGTAGAAGT ３’である。１kbを超えるクローンを拾い、そし て配列決定してGM-CSFであるか検定する。これらの操作は「Molecular Cloning : A Laboratory Manual 」Sambrook，Fritsch and Maniatis，Cold Spring Harb orに記載の通りに実施できる。かかる操作はpGM 3.2 に記載の如きHinfＩ及び S tuＩで切り出すことのできる完全GM-CSF配列を含むクローンをもたらす。 ｅ）pIMR３ プラスミドpIMR１において、GM-CSF遺伝子についてのオープンリーディングフ レームには15塩基対の短いオープンリーディングフレーム(ORF)が先行する。こ れがGM-CSFの発現を妨害しうるため、プラスミドpIMR１を改変してこの小さなリ ーディングフレームを除去した。pIMR１を NotＩ及びPpuMＩで消化した。消化し たベクターを小牛小腸アルカリホスファターゼ（CIAP）でホスファターゼ処理し 、そしてゲル精製した。２つの制限酵素部位の間の配列を２本のオリゴヌクレオ チドCE55及びCE56のアニーリングにより作った短い二本鎖DNA に置き換えた： オリゴヌクレオチドを、pIMR１の消化によりできる NcoＩ及びPpuMＩ末端と適 合する突き出し末端を有するように構築する。２本のオリゴヌクレオチドをアニ ールし、リン酸化し、そして NcoＩ−Pp uMＩ消化したpIMR１にライゲーションする。得られるベクターをpIMR３と命名す る。この配列の対応の領域を下記に示す： pIMR １ pIMR ３ GM-CSFタンパク質を発現する HSV−１ DISC ウィルスを作るため、様々なプラ スミドのセットを作る： ｆ）pIMMB34 これは HSV−１ gH 遺伝子の隣接する配列を含む組換ベクターである。左側に 隣接する配列はgH遺伝子の隣りにあるTK遺伝子を不活性化する。オリゴMB97−MB 100 及びオリゴMB61−MB58により作った２本のPCR フラグメントをPCR オリゴヌ クレオチドの中に含まれる部位に適する制限酵素により消化する。MB97−MB100 フラグメントをHindIII及び HpaＩで消化する。MB61−MB58フラグメントは Hpa Ｉ及びEcoRＩで消化する。これらのフラグメントをHindIII及びEcoRＩで消化し たベクターpUC119の中にライゲーションする。得られるプラスミドをpIMMB34 と 称する。使用したオリゴヌクレオチドは下記の通りである： ｇ）pIMMB55＋ 第一段階組換体の検出をし易くするため、SVプロモーターのコントロール下で Ｅ．コリベーターガラクトシダーゼ遺伝子をpIMMB45 の中に挿入する。SV40プロ モーターとベーターガラクトシダーゼ遺伝子をBamHＩ及び TthIII１を利用して プラスミドpCH110(Pharmacia)から切り出す。その先端をDNA ポリメラーゼのク レノウフラグメントを用いて補完する。このフラグメントをゲル精製する。プラ スミドpIMMB34 を HpaＩで消化し、子牛小腸アルカリホスファターゼ（CIAP）で ホスファターゼ処理して自己ライゲーションをなくし、そしてゲル精製する。ゲ ル精製したフラグメントを互いにライゲーションさせてプラスミド pIMMB55＋を 作る。 ｈ）pIMMB63 pIMMB63 は HSV−１株 KOS（ｍ）DNA より作る。pIMMB63 は HSV−１ gH 遺伝 子に隣接する配列を含み、中央に固有 HpaＩ部位を有する。この部位にクローニ ングされた任意の遺伝子は HSV−１ゲノムの中にgH座において組換により挿入さ れうる。もしこのウィルスがTK陰性ウィルス（例えば、上記の pIMMB55＋プラス ミドを用いて作製）なら、このプラスミドをTK遺伝子の３’末端に置き換え、TK 活性を保存及びTK陽性ウィルスについての選択を可能にする。 オリゴMB96−MB63により及びオリゴMB61−MB58により作った２本のPCR フラグ メントをPCR オリゴヌクレオチドの中に含まれる部位に適する制限酵素で消化す る。MB98−MB63フラグメントをHindIII及び HpaＩで消化する。MB61−MB58フラ グメントを HpaＩ及びEcoRＩで消化する。これらのフラグメントをHindIII及びE coRＩで消化したベクターpUC119の中にライゲーションさせる。得られるプラス ミドをpIMMB63 と称する。使用したオリゴヌクレオチドは下記の通りである： ｉ）pIMX1.0 このプラスミドは外来遺伝子の挿入のための固有部位を有する一般の組換プラ スミドであり、これによりその遺伝子は HSV−１ gH 欠失DISCベクターの中に組 換えすることができる。プラスミドpRc/CMV を NruＩ及び PvuIIで消化し、そし てCMV IEプロモーター及びポリＡシグナルを含む1066bpのフラグメントをクレノ ウポリメラーゼで平滑末端にし、そしてプラスミドpIMMB63 の固有 HpaＩ部位に 挿入した。このプラスミドをpIMX1.0 と命名した。CMV IEプロモーターとポリＡ シグナルとの間に含まれる多重クローニング部位はその他の遺伝子をプラスミド の中にクローニングし、そしてその後DISC HSV-１に導入するのに理想的である 。 ｊ）pIMX3.0 プラスミドpIMX3.0 はCMV IEプロモーターのコントロール下でマウスGM-CSFを １型DISC HSVの欠失gH領域の中に挿入するための組換ベクターである。このプラ スミドは SmaＩ及び DraＩによりプラスミドpGM 3.22 FF(前掲)から切り出した マウスGM-CSFをpIMX1.0 の固有BamHＩ部位に挿入することにより構築した。この プラスミドpIMX3.0 はpIMR３の HSV−１同等品である。組換ウィルスの構築 GM-CSFを発現する組換ウィルスを２段階で作った。第一段階ではgH遺伝子、及 びTK遺伝子の一部を、Ｅ．コリlacZ遺伝子を駆動させるSV40プロモーターより成 る「lacZカセット」により置き換える。このウィルスはTKマイナス表現型を有し 、そしてまた発色原基質Ｘ−gal を含む上層のもとで増殖させたときに青色のプ ラークを供する。この組換ウィルスはこれによりgH座において外来遺伝子の挿入 のために好適に利用されうるようになる。遺伝子をTK遺伝子の欠失部と一緒に挿 入する。同時に、lacZカセットを除去する。これらのウィルスはTK陽性表現型及 びＸ−gal 下での白色に基づいて選別できうる。 ａ）SV40−lacZカセットをgHに置き換えることによる第一段階組換体の構築 組換ウィルスをプラスミド pIMMB56＋(HSV−２のため)又は pIMMB55＋(HSV− １のため)によるウィルスDNA のトランスフェクションにより構築した。ウィル スDNA をWalboomers & Ter Schegget（1976）Virology 74，256-258 に記載の通 りにしてヨウ化ナトリウム勾配上で精製する。 組換は下記の通りに実施する： ａ）第一段階 ５μｇのウィルスDNA，0.5μｇの線状化プラスミドDNA(制限酵素 ScaＩによる 消化により線状化)を１mlのHEBSバッファー(137mM のNaCl，５mMのKCl，0.7mMの Na2HPO4，5.5mMのグルコース、20mMのHepes，pH7.05)の中で混合することにより トランスフェクション混合物を調製する。70μｌの２ＭのCaCl2を滴下し、そし て静かに混合する。培地をCR１又はCR２細胞（gH発現性Vero細胞）の半集密５cm 皿から除去し、そして 500μｌのトランスフェクション混合物を２枚の皿それぞ れに加える。細胞を37℃で40分インキュベーションし、次いで５％の胎児牛血清 (FCS)を含む増殖培地４mlを加える。トランスフェクション混合物を加えてから ４時間後、培地を除去し、そして細胞を無血清培地で洗った。細胞を皿当り15％ のグリセロール 500μｌで２分ショックを与える。グリセロールを除去し、細胞 を無血清培地で２回洗い、そして５％のFCS を含む増殖培地を加える。 ４〜７日後、完全ウィルス細胞病理効果(CPE)が観察されたら、細胞を培地の 中にかき落し、2500rpm で５分４℃で遠心分離し、そして 120μｌのイーグル最 少必須培地（EMEM）の中に再懸濁する。これでこれは野生型及び組換ウィルスを 含む粗ウィルスストックとなる。このストックを凍結し、融解し、そして音波処 理し、次いで一定の希釈率でCR１細胞に基づいて組換体についてスクリーニング する。この培地はTKマイナスウィルスを選別するために10μｇ／mlのアシクロビ ルを含む。ウィルス希釈品の添加後、細胞に１％の低ゲル化温度のアガロースを 含む培地を載せる。約３回目にウィルスプラークの出現後、 330μｇ／mlのXgal 及び10μｇ／mlのアシクロビルを含むアガロースの第二層を加える。48時間以内 に青色のプラークを拾い、そしてCR１細胞を含む24穴皿（ウェル当り１cm2）に 移す。プラークを完全CPE にまで増殖させ、そして培地にかき落と すことにより回収する。プラーク精製の多重ラウンドをウィルスの純粋ストック が得られるまで実施する。 第一段階の組換体の構造を下記の通りに確認する。ヨウ化ナトリウム精製した ウィルスDNA を上記の通りに調製し、そしてBamHＩで消化する。この消化物をア ガロースゲル上で分離し、そしてナイロン膜に転写する。これをgH遺伝子の片側 の配列に相同性な放射能ラベルしたDNA フラグメントでプローピングする。 ｂ）第二段階 組換を第一段階組換体由来のウィルスDNA 、及びプラスミドpIMR３(HSV−２の ため)又はpIMX3.0（HSV−１のため）を用い、前記の通りに実施する。ウィルス の一次回収後、TK陽性組換ウィルスをBHK gH陽性TK−陰性細胞上での、 0.6μＭ のメトトレキセート、15μＭのチミジン、 9.5μＭのグリシン、4.75μＭのアデ ノシン及び4.75μＭのグアノシンの存在下での増殖により選別する。アラウンド のこの選別を６穴皿（ウェル当り10cm2）の中で実施する。各段階において、感 染細胞を培地の中にかき落とすことにより回収し、そして 200μｌのEMEMの中に 再懸濁する。音波処理後、その50μｌを新鮮なBHK gH−陽性TK−陰性細胞に加え 、そして選別を続ける。 最終選別後、ウィルス感染細胞を前述のように回収し、そしてgH欠失 HSV１補 完細胞に基づいてスクリーニングする。前述の通りに上層を加え、そしてプラー クをXgalの存在下で選別する。前述の通りにプラークを拾い、そして前述gH欠失 HSV１補完細胞で３回プラーク精製する。 ウィルスDNA の構造を前述の通りに分析する。GM-CSF アッセイ Cos１細胞（ECACC No．88031701）にプラスミドDNA を、DEAEデキストランを 用い、Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Michael Kriegler に記載の通りにしてトランスフェクションする。ト ランスフェクションした Cos１細胞又は感染CR２細胞由来の上清液をバイオアッ セイによりGM-CSF活性についてスクリーニングする。IL−３／GM-CSF応答性マウ ス造血細胞系C2GMをDr．E．Spooncer．Paterson Institute for Cancer Researc h，Christia Hospital，UKより入手した。細胞系C2GMを20％のウマ血清、１％の グルタミン及び10％のコンディショニング培地を有するFischer 培地の中で維持 する。コンディショニング細胞培地はマウスIL−３を培地の中に分泌するWehi ３ｂ細胞（ECACC No．B6013003）の対数増殖培地より入手する。Wehi ３ｂ細胞 をRPMI 1640 培地、10％のFCS 及び１％のグルタミンの中で維持する。 以上の説明は特に、gH陰性であり、且つGM-CSFを発現等する HSV−１及び HSV -２突然変異体の構築を可能にする。 当業者は本教示を、感染性ウィルスの製造に必須である第一遺伝子との関連に おいて欠陥であるその他の突然変異ウィルスの調製に容易に応答することができ 、これによりこのウィルスは、正常細胞に感染し、そしてこれらの細胞の中で複 製及びウィルス抗原を発現することができるが、いわゆる感染性ウィルスを産生 することはできず、しかも免疫調節性タンパク質又は本明細書に記載のその他の 遺伝子材料をコードする異種ヌクレオチド配列を発現する。 数多くのその他の突然変異ウィルスが下記のウィルス及びウィルスタイプにお ける下記の必須遺伝子の欠失又は（例えば）その他の不活性化に基づいて作るこ とができる： 単純ヘルペスウィルスにおいて、必須遺伝子、例えばgB，gD，gL， ICP４， I CP８及び／又はICP27 は、欠失しているかもしくは不活性化しているか、又は上 記の実施例に用いたgH遺伝子を代替してよい。その他のヘルペスウィルスにおい て、既知の必須遺伝子、例 えばHSV のgB，gD，gL，gH， ICP４， ICP８及び／又はICP27 遺伝子に対する任 意の既知の同族体が欠失又は不活性化のために選定できうる。サイトメガロウィ ルスは、例えばDionら、Virology 158（1987）228-230 より同定可能な感温性突 然変異を司る遺伝子を欠失させる又は活性化させることにより遺伝子的に不能す ることができる。 細胞の形質導入のためのベクターの利用： 本発明に係るいくつかの有用な例の製造に応用できる手順は下記の通りである ： gH遺伝子を欠き、そして欠失遺伝子座において選定の遺伝子の機能性コピーを 担持している組換 HSV−２ウィルスを上記の通りに培養し、そして約108pfu/ml の力価をもつストックを調製する。 白血病細胞を基礎とする形質導入手順を実施するため、血液サンプルを白血病 患者から採取し、そして細胞を密度勾配遠心分離によりそれから単離する。別の 態様において、細胞系は癌患者より生検等によって得ることができ、そして直接 又はin vitro培養を経て利用できうる。固形腫瘍を有する患者由来の細胞は腫瘍 もしくは転移物の外科的除去を経て、又は腫瘍もしくは転移物由来の生検材料か ら得られうる。腫瘍生検又は再切除材料は機械的もしくは酵素的解離により、又 はその他の周知の方法により単一細胞懸濁物を調製するのに利用できうる。 選定の遺伝子（例えばGM-CSF）を担持する組換欠陥HSV ベクターによる腫瘍細 胞又は細胞系の感染／トランスフェクションはin vitroで、単一細胞懸濁物のア リコートを24穴プレート又はフラスコの如き適当な組織培養槽の中に分注するこ とにより実施できる。適当な細胞濃度は１又は２mlの培地において 0.5〜2.0 × 106細胞／ウェルである。次いでウィルスを例えば0.01〜20、例えば0.05〜0.1 pfu/細胞、又は１以下又は約５以下のpfu/細胞の感染多重度で加えてよく、そし てその培養物を２ｈインキュベーションしてウィルスを細胞に侵入させる。過剰 なウィルスは標準的な方法で洗い出す。その細胞は免疫治療及びその他の本明細 書記載の目的のために、直接、又は例えば１〜７日間の様々な時間にわたり新鮮 培地の中で培養した後に利用できる。試験目的のため、下記の試験実験のように 、培養を１〜７日間実施する。 ウィルスベクターにより感染された細胞のサンプルをウィルスベクター内に担 持された異種遺伝子の発現について検査することができる。例えば、lacZ遺伝子 を含む組換欠陥HSV ベクターで感染された細胞は、β−ガラクトシダーゼに対し て特異的な抗体又は抗血清調製品を利用することにより、又はβ−ガラクトシダ ーゼによる切断に基づき蛍光生成物を供するガラクトシダーゼ基質（例えばフル オリポーター（TM））を利用することにより、β−ガラクトシダーゼ活性の存在 について試験することができる。蛍光生成物又は抗体は蛍光顕微鏡又はフローサ イトメトリーにより検出できうる。蛍光を示す細胞の比率（％）は遺伝子生成物 を発現する比率を示し、そして検出段階の結果から計算できる。 悪性及び正常細胞の中でのlacZの形質導入及び発現： 組換ウィルスベクターを利用する本発明に係る形質導入の有効性を試験及び例 示する適当な試験方式は下記の通りであり、そしてヘルペスウィルスベクターの その他の例に応用できる。ここに記載の試験に利用するベクターはlacZリポータ ー遺伝子を含む：一般にリポーター遺伝子の代わりに（又はその追加として）免 疫調節タンパク質もしくはその他のタンパク質をコードする遺伝子、又は本明細 書に記載のその他の遺伝子材料を有する別のベクターを本発明の実施に利用する 。 lacZ gH−欠失HSV 突然変異体を本明細書において「第一段階」突然変異ウィ ルスに関して上記した通りに構築した。免疫調節タンパク質についての遺伝子を 含むベクターの製造におけるこの第一段階は下記の試験手順に利用する適当な試 験ベクターである。他方、かかる突然変異体はWO94/21807に記載の「第一段階」 組換体に関するWO94/21807に記載の通りにして構築することもでき、その構築は その頁28行28〜頁29行28に記載されている（引用することで本明細書に組入れる ）。lacZ遺伝子は試験及びマーカー遺伝子としてここで利用する。本明細書記載 の技術を利用し、その他の有用な遺伝子をlacZの代わりに又はlacZと同様に容易 に組込むことができる。 β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子の発現を誘導する組換欠陥型HSV ウィル スベクター HSV−lacZの能力を下記の様々な腫瘍細胞タイプにおいて例示のため に研究した： Ａ：急性リンパ芽腫白血病由来の２種の細胞系（ALL）(臨床サンプルに由来し 、そして10％のFCS(Biowhittaker，Walkersville，MD)， 100IU／mlのペニシリ ン及び 100μｇ／mlのストレプトマイシン（Biowhittaker）及び２mmol／ｌのＬ −グルタミンの入ったRPMI 1640(Biowhittaker)の中で培養したSt Jude Childre n's Research Hospital，Memphis，TN で樹立されたAD及びRSヒトプレ−Ｂ−白 血病細胞系)； Ｂ：神経芽腫（NB）由来の３種の細胞系； Ｃ：ALL を有する４人の患者から単離したばかりの一次細胞； Ｄ：急性骨髄白血病(AML)を有する３人の患者由来の一次細胞； 並びに Ｅ：NBを有する２人の患者由来の一次細胞。 白血病芽細胞を末梢血液又は骨髄単核細胞のFicoll沈殿により＞80％の芽細胞 を有する患者から単離した。骨髄芽球は上記の通りに 添加の放たれたRPMIの液体培地（Biowhittaker）の中に維持してよい。リンパ芽 球は液体培地の中に維持するか、又は必要なら間質支持体として同種異系皮膚線 維芽細胞上に維持してよい。 細胞系は単離したばかりの細胞をそれぞれ１又は２mlの培地の中で５×105〜 ２×106細胞／ウェルにおいて24穴プケートの中で単一細胞懸濁物としてプレー ト培養した。組換欠陥HSV ウィルスベクター HSV−lacZを0.05〜0.1 pfu/細胞の 多重度で加え、そして37℃で２ｈインキュベーションした。過剰のウィルスを除 去し、新鮮な培地を加え、そして培養物を37℃にて様々な時間インキュベーショ ンした。有効なトランスフェクションをフローサイトメトリーにより決定し、そ して測定は感染後２日及び７日目に行った。感染細胞を染色し（xgal及び標準蛍 光体）、そしてlacZの産生についてチェックした。 以下の結果が得られた：双方のALL 細胞系について、ベクターにより搬送され たβ−ガラクトシダーゼ遺伝子についての形質導入効率は２及び７日目の双方で 100％であった。 一次ALL 細胞サンプルに関し、２つはβ−ガラクトシダーゼ発現に関して 100 ％陽性であり、そして他の２つは、２日目に80％以上の形質導入効率を示した。 （これらの細胞は間質抜きでの培養では生存せず、それ故７日目に試験できなか った。） ３種の一次AML サンプルのうちの２つが80％以上の形質導入効率を示した。そ の数日は７日目に更に上昇した。 第３のサンプルは若干低めの効率を示した（２日目に42％、そして７日目に54 ％）。 ２日目に、３つのNB細胞系はそれぞれ25％，72％及び74％の形質導入効率を示 し、一方２つの一次NB細胞サンプルは65％及び 100％の形質導入を示した。 これらの結果は従来その他の手段により形質導入するのが困難と実証されてい た細胞への異種遺伝子の形質導入についての組換欠陥HSV ベクターの高い能力を 実証する。ALL 及びAML に関し、レトロウィルス形質導入は細胞系の作製を要し 、そしてそれでさえも、遺伝子導入の効率は非常に低かった（＜５％）。ALL 及 びAML に由来する新鮮な細胞又は細胞系はアデノウィルス形質導入に対して本質 的に耐性であると考えられている。 組換欠陥HSV ベクターは新鮮なNB細胞及びNB細胞系の形質導入についての驚く べきほどに高い能力を示した。３種のNB細胞系、のうちの２つについての形質導 入効率は＞70％であり、そして新鮮な単離物についてはそれぞれ65％及び 100％ であった。 その結果を以下にまとめる： 一次骨髄細胞におけるlac の形質導入及び発現を下記の通りに実施した： 骨髄を２人の正常ドナーから得た。単核画分（Ficoll沈殿による）を抗−CD34 カラム（Cellpro，Seattle，WA）に通し、CD34＋先祖細胞集団を濃厚にした。こ れらの細胞を上記のlacZをコードする不能ヘルペスウィルスに0.05〜20（pfu/細 胞）に範囲する様々な感染度(MOI)で曝露した。２時間の曝露後、細胞を２つに 分け、そして間質支持培養物の中で又はサイトカインを有する培養物の中で下記 の通りに維持することができる。８×105／cm2の表面積を有する間質支持培養物 を15％の馬血清及び５％の胎児牛血清（FCS : Summit Biotechnology，Ft Colli ns，CO）、１×106mol/ｌのヒドロコルチゾン(Abott，Chicago，ILL)、１×104m ol/ｌのメルカプトエタノール（Sigma，St．Louis，MO）及び 400μｌ／mlのト ランスフェリン(Life Technologies)を含むFisher培地(Life Technology，Grand Island，NY)の中に樹立させた。細胞を25mlの組織培養フラスコ（Nunc，Roskil de，DK）の中で37℃で培養した。２週間毎に消費培地の半分を、間質層が完全に 樹立するまで、新鮮培地と交換した。間質細胞はフィーダー層として使用し、そ して上記のように得た形質導入CD34＋細胞を再播種した。形質導入細胞の一部を 培養する別の方法はそれらは胎児牛血清、IL３及び幹細胞因子の入った液体培地 の中で増殖させることにある。他の部分はメチルセルロースと混合し、そして組 織培養皿の中で105／mlの密度で増殖させた。 ２，７及び14日後、液体培養液由来の細胞をフローサイトメトリー（フルオリ ポーター系を利用）により分析し、一方メチルセルロースプレート由来の細胞は 個々のコロニーのｘ−gal 染色及び蛍光フローサイトメトリーにより調べた。蛍 光研究において、全ての細 胞をフルオリポーター試薬及び蛍光CD34抗体で染色した。 これらの結果はCD34＋細胞の30〜100 ％がマーカー遺伝子について陽性であっ たことを示し、陽性細胞の比率はMOI が上昇すると上昇した。14日目には、わず かな細胞及びコロニーが陽性であり（２〜50％）、導入遺伝子の発現が一部の細 胞において一過性であったことを示す。半固形（メチルセルロース）培養物中で も細胞及び個々のコロニーは陽性であったため、メチルセルロースは蛍光的に陰 性であるが、検出されるシグナルが形質導入細胞から非形質導入細胞に至るタン パク質の交換によるのではなく、任意の増殖刺激シグナルの非存在下での正常な 造血先祖細胞の非常に効率的な形質導入を示すものである。更なる試験において 、高い効率の発現が形質導入の例えば48時間後に得られることが見い出され、約 24〜48時間でピークに達成した。 lacZの形質導入及び発現についての上記の方法は、前記の通りlacZの代わりに 対応のその他の遺伝子材料を担持する他のウィルスベクターを利用することによ りその他の所望のタンパク質及び遺伝子材料に容易に応用できる。 ベクター形質転換されたヒトALL 及びその他の細胞によるGM-CSFの発現： 上記の通りに構築したサイトカイン（GM-CSF）をコードする遺伝子を担持する 不能ヘルペスウィルスベクターの例（GM-CSFをコードするgH欠陥HSV ベクター） はヒト急性リンパ球白血病(ALL)、並びにマウスリンパ芽球白血病(MLL)及びヒト 神経芽細胞系の形質導入細胞におけるコード化サイトカインの生産を誘導できる ことを示すデーターが得られた。 細胞系を標準の態様で形質導入し、そして形質導入の１，３及び７日目に、そ れらを商業的に入手できるイムノアッセイ(Endogen) によりGM-CSF分泌について試験した。図７は様々なMOI(感染多重度：細胞カウン ト数当りのウィルスpfu の比)での様々な形質導入細胞系によるGM-CSF分泌につ いての試験結果を表わすバーチャートである。３本で一組の連続バーそれぞれは 表示の条件設定下(細胞タイプ、MOI)での１，３及び７日目のそれぞれでの生産 を示す。縦軸は24時間当りの５×105細胞当りのGM-CSF生産のスケールを示す。 分泌は少なくとも７日間起ることがわかり、そしてその結果は単に早期に発現 されたタンパク質の存続によるものではないようである。それ故、低い感染多重 度（例えば約0.05〜約１，５又は10の範囲）でヒト腫瘍細胞に対して有効であり うる。比較のために用いたマウス腫瘍細胞は、ヒト細胞よりも約20倍形質導入さ れにくかった。 CD34＋一次骨髄細胞によるGM-CSFの発現 図８は正常成人起源由来のCD34＋一次骨髄細胞（造血先祖細胞）の有効な形質 導入の結果を示すFACSプロットである。 サイトカイン（GM-CSF）をコードする遺伝子を担持する不能ヘルペスウィルス ベクター（GM-CSFをコードするgH欠失HSV ベクター）を利用して骨髄細胞を形質 転換した。細胞をCD34選別により標準の態様で精製し、そしてCD34抗原について 標準の態様で染色した。同様にして、その他のCD34＋細胞、例えば悪性特性を示 すものが形質導入できる又はその後使用できる。例えば免疫原治療用ワクチンと して、親細胞が由来している患者に再導入するか、又はin vitro／ex vivo でリ ンパ球を感作又は刺激するのに利用できる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Herpesvirus vector and its use Field of the invention   The invention relates to viral vectors and methods for their use, in particular, for example, cells, e.g. For example, transforming malignant cells of the hematopoietic cell lineage and exogenous genes in such cells The present invention relates to a method for expressing and inducing a material. The present invention further provides such a virus vector. -Based pharmacological compositions, production of cells infected with such viral vectors , Such cell-based pharmacological products, to express foreign genetic material in vivo And its use for administration to humans and non-human animals, as described herein. Materials described herein for the manufacture of preparations for street treatment and other uses It also relates to the use of fees. The method according to the present invention can be used, for example, for immunotherapy of cancer. . Background of the Invention   Recombinant viral vectors can, among other known factors, transfer foreign genes. It is useful for introduction into cells so that it can be expressed as protein. Central point Control of appropriate promoter sequences that can function in transformed cells The underlying target gene itself. Known techniques include non-viral methods such as play Mere addition of target gene constructs as isolated DNA; target DNA and DNA to target cells Incubation with complexes with specific proteins designed for uptake And encapsulated in liposomes or other lipid-based infectious agents Incubation with target DNA.   A further option is to engineer to include the essential target gene and Recombinant virus that is capable of infecting and thus carrying the target gene into the cell. Use of Lus vector. A wide variety of viruses, such as retroviruses and Ade Noviruses and adeno-associated viruses have been utilized for this purpose.   Specification EP 0,176,170 (Institut Merieux; B Roizman) contains a genomic pro Inserted into the herpes simplex virus genome under control of the motor regulatory region Thus, foreign genes that carry vectors for the expression of foreign genes have been described. You. DNA constructs, plasmid vectors containing constructs useful for the expression of foreign genes The recombinant virus produced by this vector, and related methods. ing.   Specification EP 0,448,650 (General Hospital Corporation: AI Galler, XOB) reakefield) can infect non-mitotic cells, can propagate in it, And for use in treating neurological disorders, as well as animals and in v A herpes simplex virus type I expression vector has been described to create an itro model. Have been.   Recombinant viruses are particularly useful for gene therapy applied to genetic deficiencies (eg, repair). It is known for its use.   Examples of genes utilized or proposed in repair gene therapy include: For example, WO92 / 10564 (KW Culver et al .: US Secretary for Commerce & Cellco Inc) And human adenosine deas described in WO 89/12109 and EP 0420911 (I H Pastan et al.) WO91 / 02796 (L-C Tsui et al .: HSC Research & Uni) versity of Michigan), WO92 / 05273 (FS Collins & J M Wilson; University o f Michigan) and WO 94/12649 (R J Gregory et al .: Genzyme Corp. Cystic described in) Includes fibrosis.   Prior art in the treatment of malignant tumors is tumors that utilize self-materials derived from the patient's own tumor Includes studies that highlight the potential for therapeutic vaccination against The general theory behind this approach is that tumor cells are distinguished from normal healthy cells. And is therefore used to target an immune response that recognizes and destroys tumor cells obtain. Express one or more proteins or other biological macromolecules It is to be.   Such tumor targets may be ubiquitous in certain types of tumors. This good A good example is cervical cancer, in which the majority of tumors are human papillomavirus E6 And E7 protein. In this case, the tumor target is not a self protein, Therefore, its potential as a unique tumor-specific marker for cancer immunotherapy is clear It is certain.   Increasing evidence that certain self proteins can also be used as tumor targeting antigens It is getting. This is because they are not normal healthy cells but consistently in tumor cells Based on the finding that it is expressed. Such examples include proteins of the MAGE family. You. More self-proteins useful as tumor targets remain unidentified Is expected.   Tumor-associated antigens and their role in the immunobiology of certain cancers include, for example, P van der Bruggen et al., Current Opinion in Immunology 4 (5) (1992) 608-612. ing. Another such antigen of the MAGE series is T. Boon, Adv Cancer Res 58 (19 92) identified in pp 177-210, and other closely related tumor antigens. van der B ruggen et al., Science 254 (1991) 1643-1647; Chin used PO Livingston's Current Opinion in Immunology 4 (5) (1992) pp 624-6 29, for example; Burchall et al. Int J Cancer 44 (1989 ) Pp 691-696.   Several potentially useful tumor-specific markers have been identified and characterized But searching for new and possibly more specific markers is a hassle And it takes time.   Experimental intracranial mouse melanoma treated with HSV1 mutant 1716 (BP Randazzo et al., Virology 211 (1995) pp 94-101), In which replication of this mutant is restricted to tumor cells and the surrounding brain tissue It did not happen in the weaving.   It is possible to administer a cytokine as it is (ie, as a protein) to a mammal. Attempted but often poorly tolerated by the host and often There are certain side effects including heart, bone pain and fever. (A Mire-Sluis, TIB Tech voll . 11 (1993); MS Moore, Ann Rev Immunol 9 (1991) 159-91). These problems Is worse by dose levels often required to maintain effective plasma concentrations I do.   Live viral vectors containing genes encoding cytocan or tumor antigens Such modifications are known. Viral vectors enhance tumor immunoreactivity It has been proposed to use it in cancer immunotherapy to control the means for the treatment. The specification WO86 / 07610 (Transgene: MP Kieny et al.) Discloses a human IL-2 protein. Mammal with a recombinant poxvirus comprising all or part of the DNA sequence to be encoded Disclosed is the expression of human IL-2 in cells. Specification EP 0259212 (Transgen e SA: R Lathe et al.) encodes at least the essential regions of the tumor-specific protein Pox, adeno, or helium for tumor control, including heterologous DNA sequences A pess-type viral vector is disclosed. Specification WO88 / 00971 (CSIRO, Australian National University: Ramshaw et al.) At least part of an antigenic polypeptide And a lymphokine (interleukin) (1, 2, 3, or 4, or gamma interferon) Pox, herpes or adenovirus vaccine vector containing the second sequence to be expressed And, in particular, a recombinant vaccine comprising vaccinia. This is an antigenic polypeptide Boosts immune response to peptides. Specification WO94 / 16716 (E Paoletti et al .: Viroge netics Corp. ) Include, for example, cytokines or tumors for use in cancer therapy. A debilitating recombinant vaccinia virus containing DNA encoding a tumor antigen has been described.   GMCSF transduced tumor cells can be used as a therapeutic vaccine against renal cancer Has been advocated. A protocol for response testing is to identify tumor material from patients. Removal and then transduction with the appropriate immunomodulatory gene You. The engineered cells are reintroduced into the patient to stimulate a beneficial immune response.   Based on the herpesvirus saimiri, a non-human primate virus Vectors that direct gene expression in human lymphoid cells have been described. (B Fleckenstein & R Grassmann, Gene 102 (2) (1991) pp 265-9). However However, the use of such vectors in clinical situations is considered undesirable. Have been.   Immunomodulation and the introduction of other genes into cells, such as certain types of tumor cells, are known. However, existing methods of accomplishing this are subject to limitations imposed by the inventor. The difficulty may be due to the low quantitativeness of transduction, the complexity, or the system used. Based on unwanted side effects.   To date, the inventors have identified several types of cells, such as hematopoietic cell lines, such as leukemia. Gene transfer into disease is difficult, or for example, repair gene therapy or cancer immunity It was considered difficult to implement it efficiently for therapeutic purposes.   To date, retroviral vectors have been used to transfer genes into cells such as hematopoietic progenitor cells. Is the most widely attempted vector. However, these vectors It is clear that it does not integrate and is not expressed in non-dividing cells. And this means, for example, that hematopoietic stem cells (H SC) or its value when used together with primary cells from human hematopoietic malignancies Constrain the value. To overcome this limitation, target cells such as HSCs and hematopoietic Culture with growth factors, such as cytokines, induces HSCs into the cell cycle; and From the perspective of increasing the efficiency of retrovirus-mediated gene transfer into such target cells Unfortunately, cytokines in the culture medium have been It has been shown to induce differentiation with loss of self-renewal ability.   Therefore, use of adeno-associated virus vectors instead of retrovirus vectors However, it has been recognized that the integration efficiency of such vectors is low. You.   In addition, based on recent experience with adenovirus vectors, the inventor We believe they have limitations. That is, under certain conditions, they Can infect about 50%, but nevertheless gene expression is often delayed by several days . In certain tests, recombinant adenovirus or retrovirus vectors Transduction of heterologous genes into acute leukemia cells by It has also been found that it provides only about 3% transduction yield, and There is a problem with the efficiency of transduction yield with the vector. The present invention:   The present inventor has recognized that the prior art provides additional viral vectors and human and animal cells. There remains a desire to provide methods for their use in transformation. Think of it. In particular, it has useful speed To provide materials and methods for providing gene transfer to human and non-human animal cells Hope remains. Materials and methods that provide gene transfer with useful efficiency It is desired to provide. In addition, a useful set of target cell types, such as non-dividing cells It would be desirable to provide materials and methods for applicable gene transfer.   In accordance with the aspects of the invention described herein, the trait by a herpes virus vector Target cells for transduction are hematopoietic cells; lymphoid or myeloid cells. Vesicles; stem cells or cells derived from CD34 + cells, eg, obtained in the context of a bone marrow transplant or Cells from cell preparations, including prepared cells; or cells of neural ectoderm origin Transduced, especially with such malignant cells, and the viral vectors described herein. It can be selected from cells. In this application, certain methods and procedures in accordance with the exemplification of the invention will be described. It has been found that the sequence can provide a surprisingly high transduction efficiency.   In one aspect, the invention facilitates the use of tumor cells as immunogens and vaccines. It is responsible for providing the materials and methods that will advance. In a further aspect, the invention relates to hematopoietic cells. Useful compositions and procedures for promoting and transducing vesicular cells It is assumed that   The present invention also elicits an immune response against tumor-specific antigens, e.g., in existing tumors. Of immunogens and means to create therapeutic vaccines that can be used to guide Provision is assumed.   The invention is particularly directed to late lytic genetics of herpes viruses, such as herpes simplex virus. Used for gene transfer into hematopoietic cells that do not allow offspring expression, such as lymphocytes it can.   According to aspects of the present invention, a heterologous genetic material, eg, a material comprising a heterologous gene To introduce the gene material into human or non-human animal cells, for example, Treating said cells for expression in (A) an attenuated or replication defective type and a non-transformable Herpes simplex virus, such as a gene encoding a heterologous protein Providing a recombinant herpesvirus vector carrying said heterologous genetic material; and (B) hematopoietic cells, malignant cells associated with blood cells, and malignant or non-malignant CD34 + cells Human or non-human animal cells selected from these cells, And transducing the cells by contacting the cells. Provide a way to In the embodiment of the present invention described below, the genetic material is used in the cell. Is expressed. Transduction is performed using live target cells with viral vectors in a known manner. It is performed by infection of the vesicle.   Such methods include, for example, introducing heterologous genetic material into human or non-human animal cells, Treating said cells to render said cells more highly immunogenic, comprising: (a) weakening A mutant herpesvirus that is transformed or replication defective and is nontransformable. Selected from cytokines, immunological costimulatory molecules and chemoattractants Recombinant herpeswill carrying gene encoding heterologous immunomodulatory protein And (b) malignant cells associated with blood cells, hematopoietic cells, A malignant or non-malignant human or non-human animal cell selected from sexual or non-malignant CD34 + cells These cells may be contacted with the viral vector to transduce the cells. And the step of transducing.   Certain aspects of the invention for use in transducing human or non-human animal cells Pharmaceutical preparations provided and used according to the above are hematopoietic cells; malignancies associated with blood cells Cells; and can be selected from malignant or non-malignant CD34 + cells: weakened or replicated A mutant herpes virus that is defective and non-transforming, and Recombinant helper carrying heterologous genetic material, such as a gene encoding a heterologous protein It may comprise a viral vector.   Pharmaceutical preparations provided and utilized according to certain embodiments of the present invention include hematopoietic cells; A malignant cell associated with a cell; and a human or selected from malignant or non-malignant CD34 + cells. Comprising non-human animal cells; said cells are debilitated or replication defective and Mutant herpesvirus that is transformable, and Infected with a recombinant herpesvirus vector carrying a gene such as You.   Further belonging to the present invention is a human gene for achieving expression of a foreign gene in vivo. A method of treating a subject that is a subject or a non-human animal subject, wherein the subject A method comprising administering to the body a pharmaceutical composition of the type described above, as described herein; And a human or non-human animal subject to elicit an immune response. A method of treating, wherein the subject is provided with a pharmacological composition of the type described herein above. Administering to the subject.   Aspects of the invention relate to, for example, non-transforming herpesvirus Quality, such as proteins whose expression is useful in the context of immunomodulatory proteins or gene therapy Consider providing and utilizing recombinant herpesvirus vectors encoding protein; Further provided by the present invention is a form for making cells more highly immunogenic. Use of such vectors in quality transfer: can be usefully processed in this way The cells may be, for example, malignant cells of humans and non-human animals, especially blood cells, for example. Malignant cells, such as leukemia cells or hematopoietic cells, Even so, they are CD34 + cells. That is, cells suitable for processing include, for example, hematopoiesis. An ancestral cell, eg, a healthy CD34 + cell, which is desired to be expressed in the treated cells Transduced by the herpesvirus vector carrying the heterologous gene Can carry high copy number heterologous genes without the need for integrase Cells that can undergo homologous recombination with the genome of the treated cells are included.   In particular, applications of embodiments of the present invention are for gene transfer to create tumor immunogens. Modification of malignant hematopoietic cells. Useful among modified cells that function as tumor immunogens The substances made in are, inter alia, GM-CSF and interleukin 2. For example, tumor Production of interleukin 2 by tumor cells is a T helper in the development of antitumor responses Reported to bypass functions (ER Fearon et al., Cell 60 (1990) pp 397 or later) , And mouse GM-CSF (G Dranoff et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90 ( 1993) pp 3539), irradiated tumor cells engineered to secrete GM-CSF. Vaccination is reported to stimulate potential and specific persistent antitumor immunity ing.   Thus, according to an embodiment of the present invention, a recombinant herpes virus, e.g. (For example, it can be used as a vector for transduction of leukemia cells. Immunomodulatory proteins in such cells or related to cancer immunotherapy or gene therapy Provides for the expression of inserted genetic material, such as genes encoding other proteins that It is. In a specific embodiment of the invention, a recombinant herpes simplex virus of HSV1 or HSV2 That have been engineered to include heterologous genes as part of their genome To transfer genes to leukemia cells with good efficiency Can be used to induce efficient expression of the gene, and the transduced cells Vesicle immunogens, such as vaccines for cancer immunotherapy, Especially effective against tumor cells other than cells infected with viral vectors Mediate immune effects. Thus, the present invention is particularly directed to the genetic characterization of leukemia cells. It also provides useful methods for introduction.   Further provided according to certain aspects of the present invention is a recombinant herpes sp. Virus, eg, HSV, eg, a replication-defective herpes virus, eg, HSV1 or H SV2 replication defective HSV based on hematopoietic cell lines and other cell types Various types of cells, such as for transduction of neuroblastoma, for example such cells Immunomodulatory genes, or other genes for gene therapy or cancer immunotherapy purposes This is a method of use for gene transfer.   Transduction of leukemia cells using the example of HSV-based recombinant vectors is fresh It has also been found that effective tumor cells can be effectively achieved. Thus, No incubation or very long incubation under cell culture conditions Uncured (eg, within about 2-4 hours or overnight Cells (until transduction), such as a freshly harvested tumor The cells are transformed into a recombinant herpesvirus vector as described herein carrying the appropriate gene cells. May be exposed. It is not or substantially expressed by tumor cells Genetic material that encodes immunoregulatory proteins such as genetic material that is not Cells, which allow cells to be sensitized by the recombinant herpesvirus vector. The stained and resulting infected cells can be reintroduced, eg, Can be used for reaction with leukemia cells in vitro.   For example, freshly harvested human leukemia cells can be replaced with human GM-CSF, or especially Carries genes encoding any of the other immunomodulatory proteins described Exposure to viral vectors and subject to immunogenic cell preparation If some or all of the following procedures are used, reintroduce cells with a useful degree of transduction. it can. On the other hand, conventionally, the use of the corresponding retrovirus vector usually Traits to induce cell division into cells and facilitate retroviral transduction. Tumor cells must be cultured in vitro for several days before introduction. It has proved necessary.   This is a useful advantage of the recombinant herpesvirus vectors described herein, Because it reduces the need for laboratory manipulation of tumor cells, Yes, more efficient cell transduction rates, and more useful clinical treatment options It is because it can carry.   Cytotoxic T cells can be used, for example, in vitro, for example, for the purpose of cancer immunotherapy. Russ transduction presenting cells or target cells, for example target cells, especially of the hematopoietic cell lineage, CD34 + It can be activated and / or amplified by utilizing cells, and is used here for transduction. Virus is an antigen associated with the desired therapeutically relevant antigen, e.g., EBV or HPV. And optionally, if necessary, an immunomodulatory protein as described herein. It carries the encoding gene. An example of such an application is when the tumor cells are EBV or HPV Case of a donor cell tumor in a transplant subject expressing the antigen; donor T- Lymphocytes may be, for example, corresponding heterologous genes of the type described above, for example HPV E6 or Results of transduction with the viral vector described herein carrying the E7 gene and Can be activated and expanded in relation to target cells that express EBV or HPV antigens. The recombinant herpesviruses described herein may be used in other tumor cell types, such as neuronal It may also be possible to transduce blastoma cells with good efficiency.   The recombinant herpesvirus used as the vector according to the present invention is an immunomodulatory protein. Protein or other proteins associated with cancer immunotherapy or gene therapy. May be included.   Genes encoding any of several immunomodulatory proteins are expressed in human and non-human It can be used to make tumor cells immunogenic in a product. The resulting immune response is a tumor It can be used in the prevention and treatment of tumor growth.   An immunomodulator is a molecule that can enhance or suppress an immune response. this Include cytokines (soluble that initiate or enhance activation, proliferation and differentiation of immune system cells) Glycoproteins), co-stimulatory molecules (immunotherapy to help stimulate the immune response) Structure that exists on the surface of cells in the body that interacts with vesicles), and immune cells Or to direct to an inflammatory active site such as a site where an antigen may be present (immunology Target) chemo-attractant molecules.   "Immunomodulatory" or "immunomodulatory" proteins referred to herein include: Foreign to the host cell, eg, to the mutant virus, or to the virus. Against an antigen, such as an immunogen derived from a pathogen or source, or by a mutant virus Or one that can enhance an immune response to a tumor-associated antigen such as Multiple proteins are included. Immunomodulatory proteins are themselves immunogens. Is not currently used.   Nucleotide sequences carried in an expressible manner by the viruses described herein The immunomodulatory proteins encoded by them are, for example, vaccines with recombinant viruses. Cells transduced by the native sequence for the recipient species or by the recombinant virus. It may have a sequence that is native to the receiving species. For example, as a human immunogen or vaccine To transduce cell preparations to be used or used in connection with humans. The use of substantial human sequence immunomodulatory proteins is suggested.   Any risks associated with expression of such proteins in a fully replicating virus If the virus is a replication defective mutant, it is lost. In certain embodiments, These proteins are useful as immunogens or vaccines in the context of use. Naturally, it can be selected to enhance the effect of the mutant virus.   Examples of useful immunomodulatory proteins include cytokines such as interleukin 1-15 (IL1-IL15), alpha, beta or gamma interferon , Tumor necrosis factor (TNF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), Clophage colony stimulating factor (M-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), Cain, such as neutrophil activating protein (NAP), macrophage chemoattractant And activator (MCAF), RANTES, macrophage inflammatory peptide MIP-1a And MIP-1b, complement components and their receptors, accessory molecules such as T cells Any of the B7 family of vesicular costimulators, such as B7. 1 or B7. 2, ICAM-1 or 2 Include 3, OX40 ligand and cytokine receptor. Multiple immunomodulatory If you insert a nucleotide sequence that encodes a protein, Combination of cytokines and accessory molecules, which may comprise tocaine It may be. Numerous additional classes of immunomodulatory proteins and genes are disclosed in the present invention. May be useful in   Examples of very useful immunomodulatory proteins are GMCSF; IL2, IL4; IL7; IL12; B7. 1; Alpha-TNF; Gamma-interferon; CD40L; Chin.   The genetic material encoding the immunomodulatory protein is located within the mutant virus genome, Immunity linked to another homologous and optionally another functional polypeptide region Comprising a polypeptide region having homology to a regulatory protein and its function Expressible open reading frame encoding a hybrid or fusion protein It can be carried as a frame. For example, an immunomodulatory protein may bind human OX-40. -A gp34 protein that has been identified as a toner, comprising, or Functionally compatible (W Goodfrey et al., J Exp Med 180 (2) 1994 pp 757-762 and Citations, such as S Miura et al., Mol Cell Bioll 11 (3) 1991, pp 1313-1325). Mutant virus This version of the protein, which can be encoded in the nom, is a function of the native gp34 sequence itself. Can correspond, or correspond to a fragment thereof, or for example, another protein Based on the (C-terminal) extracellular (binding) domain of gp34 fused to The N-terminus of expression products, such as the gp34 extracellular domain (type 2 membrane protein) Immunoglobulins such as human IgG1 fused to the C-terminus of the globulin constant domain It may correspond to the constant region of a heavy chain.   Other than immunomodulatory proteins, in corresponding or other derivatives and hybrid forms Can be carried and expressed. Mutating the amino acid sequence of such an immunomodulatory protein It is also understood that it may be incorporated. Included here are, for example, sequences, functions and antigens Mutations that maintain homology to the protein with the corresponding parent sequence in sexual characteristics Proteins having heterologous sequences are included. Such mutations are preferably, for example, conserved Encompasses amino acid changes, for example, between amino acids of broadly similar molecular properties Mutation. For example, aliphatic groups, alanine, valine, leucine and i Exchange within soleucine may be considered conservative. Occasionally, glycine and this Substitution with any of them may be considered conservative. Aliphatic aspartic acid and Exchange within glutamic acid may also be considered preservative. Amide group, asparagine and g Exchange within glutamine can also be considered conservative. Hydroxy group, serine and threo Exchange within the nin can also be considered preservative. Aromatic group, phenylalanine, fir Exchange within the amino acid and tryptophan may also be considered conservative. Basic group, lysine, Exchange within arginine and histidine may also be considered conservative. Sulfur-containing group, Exchange within thionin and cysteine can also be considered conservative. Occasionally, Methoni Substitution within the group of lactin and leucine may also be considered conservative. Good security The viable substitution groups are aspartic acid-glutamic acid; asparagine-glutamine; N-leucine-isoleucine; alanine-valine; phenylalanine-tyrosine And lysine-arginine. In another aspect, the mutated sequence comprises an insertion and And / or deletions.   Very useful examples of derivative and hybrid forms include transmembrane segme Sequence, intracellular sequence portion, N-terminal or C-terminal sequence, for example, 1 to 5 amino acids upstream A missing sequence, and / or an N-terminal or C-terminal sequence, such as A sequence having an added sequence of 1 to 5 amino acids upstream, or a further function as described above, for example. A protein having a sequence to which a sex sequence is added is included.   Suitably, the immunomodulatory protein is a cytokine, such as granulocyte macrophage It may comprise dicolony stimulating factor (GM-CSF). Mouse GM-CSF gene, for example For example, a polypeptide of 141 amino acids, i.e., 14 k-30, depending on the degree of glycosylation. It encodes a mature secreted glycoprotein having a molecular weight of k Daltons. GM-CSF is hematopoietic Is a member of the growth factor family, which in vitro colonies in hematopoietic sight cells. -Determined and identified for the first time by its ability to stimulate formation. GM-C SF is a potent activator of neutrophil, eosinophil and macrophage-monocyte function Enhances mobility, phagocytosis, major histocompatibility complex (MHC) expression, and improves the immune system Initiates a cascade of bioactive molecules that stimulates Human GM-CSF Present in the clinical industry for the treatment of neutropenia and as an adjunct in cancer therapy Is evaluated. The heterologous nucleotide sequence to be used is a heterologous gene, gene flag Or a combination of genes or genes.   The invention can also be used in repair gene therapy to increase the usefulness or activity of target cells You can also. For example, normal CD34 + cells Elements such as O6-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) Transduced with the viral vector described herein, e.g., nitrosoureas (T Moritz et al., Cancer Res 55 (12) (1995) pp 2608-2614). R Maze et al., Proc Natl Acad Sci USA 93 (1) 1996 206-210); or radiation Target cells can be protected against damage. Of the above types of repair gene therapy Other genes could also be introduced into the target cells.   Heterologous DNA, e.g., additional DNA, can be added to viral vectors for other purposes. Can work, for example, to integrate viral vector DNA into the host genome Vector DNA begins to amplify when host cells undergo mitosis The integrase to be encoded in the expression expression; and for other purposes, May be introduced effectively.   Further, according to aspects of the present invention, repair or killing that destroys or regulates malignant blasts Materials and methods for inserting gene material are provided. This is, for example, Of the acentisense or ribozyme sequence corresponding to the genetic material Performed by expression in target cells by the herpesvirus vector method described in the specification For example, D Marcola et al., "Antisense Approaches to Cancer Gene Therap." y "Cancer Gene Ther 2 (1995) pp 47 or later. Antisense polynuc Techniques for the use of leotide are well known and appropriate in an effective cellular environment. The target sequence selected by selecting from among known promoters and about 12 Appropriate nucleotide sequence complementarity of the nucleotides and other known The use of steps allows easy adaptation to the specificity required for this application.   For example, use of antisense RNA to disrupt target gene expression Is described in specification WO94 / 26908 (Genetech: TG Warner et al. ) (In relation to the sialidase gene). Specific binding to mRNA molecule Techniques for utilizing compatible antisense oligonucleotides are described in WO 94/2 9342 (La Jolla Cancer Research Foundation and the Regents of the Univers ity of Michigan: R Sawada et al. (especially those derived from the human eye). In the context of the mRNA encoding the repeptide). Antisense complementary to the target RNA Techniques for oligonucleotides are described in specification WO 94/29444 (Department of He alth and Human Services: B Ensoli and R Gallo) Applies to fibroblast growth factor RNA). Has a sequence that is substantially complementary to mRNA And therefore an antisense oligonucleotide that is complementary to the target nucleic acid, Techniques used to inhibit target function or expression are described in WO 94/24864 (General Ho spital Corporation: HE Blum et al.) Applied to inhibition). For antisense technology, see D Mercola and JS Cohen, ch. 7 p p 77-89, RE Sobol and K J Scanlon (eds.) “Internet Book of Gene Therapy: C ancer Therapeutics "(Appleton & Lange, Stamford, Connecticut, 1995). Teru. Applications for other target specificities are more easily accessible by application is there.   Techniques utilizing ribozymes to disrupt gene expression are also known. For example Ribozymes to cleave target RNA or otherwise disrupt target gene expression Techniques for making and administering im (or antisense oligonucleotides) It is described in the specification WO 94/13793 (Apollon: C J Pachuk et al.) (Applies to ribozymes targeting a certain set of mRNAs.) About ribozyme technology , M Kashani-Sabet and K J Scanlon Chapter 8 pp 91-101 RE Sobol and K J Scanlon lon (ed.) `` Internet Book of Gene Therapy: Cancer Therapeutics ”(Appleton & Lange, Stamford, Connecticut, 1995). When. Again, other target specificity applications are more easily accessible by application Noh.   Lethal genes can also be inserted into vectors to disrupt transduced cells: example For example, as described in the specification WO95 / 14100 (Wellcome Foundation: C Richards et al.) Is lethal in relation to the administered drug and is cytotoxic under the control of the CEA promoter. A gene representing the gene encoding syndeaminase (CDA). This is inside the cell Is converted to toxic 5-fluorouracil by CDA when introduced into Fatal in relation to the administration of luorocytosine.   Genes encoding the immunomodulatory proteins or other genetic material described herein The recombinant herpesvirus used to carry the offspring is preferably attenuated and / or Is a replication defective herpes virus.   A mutant herpesvirus is effectively a mutation of any suitable herpesvirus. Variant, eg, a non-transforming mutant of a mammalian herpes virus: eg, non-form Mutants of transvertible human herpesvirus, particularly, for example, coated or encapsulated bumps Naturally, it may be a mutant herpes virus. Provided as a vector according to an aspect of the present invention. Examples of such mutant herpesviruses that can be provided and used include type 1 (HSV- Herpes simplex virus type 1) or type 2 (HSV-2), human or animal cytomegalowi Lus (CMV) such as human cytomegalovirus (HCMV), Barricella zoster Virus (VZV), and / or human herpes viruses 6 and 7. EBV is Less desirable except in the form of non-transforming mutants, which Due to their unique transformation properties. Such mutants provided according to aspects of the invention Animal viruses include Pseudorabies virus (PRV), horse and bovine herpes Viruses such as EHV and BHV types such as IBRV, And Marek's disease virus (MDV) and closely related viruses.   The nomenclature for the genes for herpes virus and its many corresponding homologs varies. And, as far as its content allows, reference to the gene for herpes virus is In relation to other herpesviruses having homologues of the gene of the corresponding homologue Includes references to   Use as a basis for a recombinant to produce a vector suitable for use according to the invention Suitable herpesviruses described in WO 92/05263 (Inglis et al .: Immunology Lim. general) in the English (ITD) (the disclosure of which is incorporated herein by reference). Includes defective herpes viruses that meet specific specifications. In the description, for example, Genome is defective in terms of genes essential for infectious virus production The use of the mutant virus as an immunogen or vaccine has been described, and The virus infects and replicates normal host cells and has virus in such cells. Although it can express the Rus antigen gene, it cannot produce infectious virus. I can't. In particular, WO 92/05263 describes essential glycoproteins required for viral infectivity. An HSV virus that has been rendered inoperable due to the deletion of the gene encoding quality H (gH) has been described. (A Forrester et al., J Virol 66 (1992) 341-348). gH protein expression Without them, a non-infectious virus that provides a nearly complete repertoire of viral proteins Ruth particles are produced. However, such progeny particles can infect host cells. Scratches, thus preventing the spread of the virus in the host. Such viruses are animal models Have been shown to be effective immunogens and vaccines in  Virol 68 (1994) 927-932; McLean et al., J Infect Dis, 170 (1994) 1100-9).   Such a mutant virus is such that the mutant virus is defective. In some aspects, it can be cultured in a cell line that expresses the gene product.   The literature also describes cell lines that express herpes simplex virus proteins. GB glycoprotein (Cai et al., J Virol 61 (1987) 714-721), gD glycoprotein (Li gas and Johnson, J Virol 62 (1988) 1486) and immediate proteins (Immediatc Ea rly protein) ICP4 (Deluca et al., J Virol 56 (1985) 558). These are also compatible genetics Demonstrated can support replication of inactivated virus in relation to offspring Have been.   Complete or substantive sequence data is available for some viruses, such as human cytomega Lovirus CMV (Weston and Barrell, J Mol Biol 192 (1986) 177-208), Bali Serra Zoster Virus VZV (AJ Davison and Scott, J Gen Virol 67 (1986 ) 759-816) and herpes simplex virus HSV (McGeoch et al., J. Mol. Gen Virol 69 (1988 1531-1574 and other references cited below). g H glycoprotein is known to have homology in CMV and VZV (Desai Et al., J Gen Virol 69 (1988) 1147).   Suitable examples of such genes are essential viral glycoproteins, such as (late) essential A gene for a viral glycoprotein such as gH, gL, gD and / or gB, and Other essential genes. Essential and other genes of human herpes virus DJ McGeoch "The Genomes of the Human Herpesviruses", Ann Rev Microbiol 43 (1989) pp 235-265; D J McGeoch et al. Nucl Acids Res 14 (1986) 1727-1745;  D J McGeoch et al. Jmol Biol 181 (1985) 1-13 Can be determined. For example, for homology of gH glycoprotein in CMV and VZV See also, for example, data published in Desai et al. J Gen Virol 69 (1988) 1147.   Further useful as viral vectors in the present invention are, for example, immediate gene expression. Cannot be trans-induced and is inherently attenuated when injected into mice. The HSV-1 mutation (1814) described in I Ace et al. J Virol 63 (5) 1989 pp 2260-2269. Mutant. Specification WO 91/02788 (CM Preston & C I Ace: Univers ity of Glasgow) can establish late stage infection in neural host cells, And useful HSV1 suddenly involved in 1814 which can exert the expression of the inserted therapeutic gene Mutants have been described. Further examples of viral vectors useful in the present invention are Alleles to herpes immediate genes, such as ICP0, ICP4, ICP22 and ICP27 Based on mutations in Mutations are incorporated herein by reference, for example. No. WO96 / 04395 (P Speck: Lynxvalc). Further suitable as viral vectors for use in the present invention are mutants HSV1 mutant such as 1716 (BP Randazzo et al., Virology 211 (1 995) pp 94-101).   For herpes virus, for example, human cytomegalovirus CMV (Weston and Barrell, J Mol Biol 192 (1986) 177-208) and Barisella zoster wi. Published about Luz VZV (AJ Davison et al., J Gen Virol 57 (1986) 759-816) See the data.   In accordance with certain examples of the present invention, which are described in further detail below, genetically inactivated Virus immunogens, such as those for which the vaccine encodes an immunomodulatory protein Carry a useful carrier. Viral vaccines can infect vaccinated host cells and are immune Provides intracellular synthesis of epidemiological regulatory proteins. If genetically inactivated vaccine Can also act as a vector for delivery of foreign antigens, The response can be enhanced or modified.   Such a replication defective virus is present in cells of the vaccinated host in 1 Cycle replication and the inability to produce new virions The production of regulatory proteins is critical in the context of replication-competent viruses where infection can spread On the contrary, it is limited by the size of the vaccine. Furthermore, the immunomodulatory protein produced The overall amount of is locally sufficient to stimulate a strong immune response, but Less than that produced by competent viruses and harmful systemic reactions Will not provide much answer.   In such preferred embodiments, genes encoding immunomodulatory or other proteins A heterologous nucleotide sequence, usually comprising a gene, into the genome of the mutant virus Inserted at the locus of the deleted essential gene, and most preferably, a heterologous nucleic acid. The leotide sequence shall completely replace the gene which has been entirely deleted. This Thus, even if any unwanted recombination phenomena occur, resulting in mutations from wild origin Even if the deleted gene is reinserted into the virus, the inserted heterologous nucleotide sequence Would have been largely eliminated. This is a duplicate for heterologous nucleotide sequences. Would avoid the possibility of producing a competent virus carrier. Heel Recombination phenomena are very rare, but in this embodiment, the detrimental effects of their occurrence are minimal. Will be minimal.   The materials and methods of the present invention are activated by a cellular immunogen, such as a therapeutic vaccine. To elicit additional immunological effector mechanisms, especially for target antigens It can be used to attract different specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Such C TL can have a beneficial effect due to its ability to recognize and destroy tumor cells, And can be used ex-vivo in various diagnostic and / or therapeutic methods .   Tumor-specific when there is an antigenic difference between tumor cells and normal cells Given that antigens are useful in the proper form to stimulate an immune response, They can be recognized by the immune system. This avoids the need for tumor-specific markers I do.   CTL is based on antigen recognition in the context of host major histocompatibility complex (MHC) antigen . Peptides from antigenic targets in the cytoplasm of the host cell are complexed with the host MHC molecule. And are transported to the cell surface where they are receptors on the surface of the CTL. Can be recognized by the   One method of utilizing the vectors provided by the present invention is thus one or more A cellular immunogen, such as a vaccine, from tumor material derived from an individual Administer this as an immunogen or vaccine for the treatment of a subject, eg, a patient I will. However, CTL responses to tumor cells are not If desired, the target antigen should be provided in the context of the correct MHC molecule . Immunogens or vaccines prepared from tumors of one individual are therefore always different MHC targets. It is not suitable for another individual with ip. MHC molecules vary between individuals Therefore, to activate the CTL response to the target antigen, It is necessary to provide the immune system with a corresponding target antigen. Therefore, therapeutic In general, a subject treated with a selected target antigen for use as an immunogen, such as a vaccine. It is best to introduce them into the specimen or the patient's own cells to provide a proper CTL response. It is thought that.   Therefore, it is particularly important to base the tumor immunogen or vaccine on the patient's own tumor cells. Which is a procedure known as self-vaccination. like this A further major advantage of utilization is that it utilizes antigenic targets that may be specific to a particular tumor. It has a point. Uncontrolled cell cycle control based on tumor growth Trolls accumulate, for some time, the accumulation of genetic alterations that are manifested as new epitopes. It is considered possible. The last-mentioned embodiment of the present invention is a self-vaccinating procedure. , Ie, the problem of poor immunogenicity of autologous tumor cells, can be avoided or eliminated.   The procedure according to an example of the present invention may be a tumor cell removed from a subject by a laboratory procedure. Introduction of the target gene into the cell, followed by the subject to be treated of the cells so treated It may include reintroduction into the body (ex-vivo treatment). Alternative procedure according to the given example of the invention Consists in introducing the target gene directly into the patient's tumor cells (in vivo treatment). in The advantage of the -vivo procedure is that it does not require laboratory manipulation of the patient's tumor cells . Disadvantages can be more difficult than effective gene transduction is achieved in vivo Or that it may be more difficult to achieve the desired degree. other , Non-tumor cells can also be effectively transfected with the viral vector You.   In certain instances, the recombinant herpes virus is a virus invading sensitive cells. Glycoprotein H (gHH), a protein present on the surface of virus particles associated with ) Is based on the impaired form of the herpes simplex virus carrying a deletion in the gene You. The virus complements essential functions missing in the viral genome. It can only replicate in a reducer cell line. A useful example of a recombinant complementing cell line is Stable expression of the same HSV gH gene as deleted from the virus vector It has been manipulated. Viruses made from producer cell lines have their structure Has acquired the cell-encoded gH gene product as part of and is infectious . This virus preparation can infect normal cells in the same way as a wild-type virus . Once in the cell, the viral genome can replicate in the cell and the genome Can be expressed as a protein. However, defects Functional gH protein when the virus infects normal cells Lack of quality results in poor production of new infectious virus particles. gH deletion will Is considered safe for administration as a vaccine or gene transfer vehicle.   Vectors, such as HSV vectors for cancer immunotherapy, are completely impossible and Preferably, it cannot spread within the treatment host. However, useful vectors are Any HSV virus that is recognized as safe enough to be used in floor conditions Can be based. In addition, a heterologous gene integrated into the gH-deleted HSV genome is gH-deleted. Inserted into the deleted locus of the gene, homologous recombination of the heterologous gene into wild-type HSV It is also desirable to minimize the risk of concurrent transformations within the treated individual No. However, the heterologous gene may instead be located anywhere in the viral genome. May be inserted.   A further application of the method within the scope of the present invention is the use of suitable genetic material, such as immunomodulation. A gene encoding a nodal protein is packaged in a herpesvirus particle. Transport in the form of a herpesvirus amplicon. Amplicon The DNA is the origin of replication of the herpesvirus genome and this DNA is packaged into viral particles. And a DNA sequence that can be instructed to perform caging. Such ampli Kon is present in the cell with the corresponding herpes virus (helper virus) Amplicon DNA expression occurs together with herpesvirus DNA expression This. Foreign genes can be cloned into such amplicons and therefore Expressed in cells infected by recon and herpes virus. package Particles Containing Pre-Amplicons Are Expressed Equivalent to Supported Herpesviruses And thus can infect the same host cell, and Are suitable for use in the practice of the invention among defective mutant herpesviruses. It is believed that. That is, Packaging amplicons can also be used to deliver selected DNA to desired cells. I can come. It can be used or easily finished for use in embodiments of the present invention. Amplicons and their preparation are described in further detail in WO 96/29421 (Efst athiou et al .: Cantab Pharmaceuticals Research Ltd and Cambridge University T echnical Services Ltd. ).   The HSV helper virus used to package the amplicon is It is not harmful to the host itself, and therefore has no deleted essential genes. Virus. For example, the gH deletion virus described above is WO92 / 05263 and its related Ideal helper virus as described in other relevant references cited in Carry. However, other useful helper viruses are May be based on a herpes virus that has been sufficiently debilitated or disabled. However, it need not be entirely a replication defect.   The invention described herein encodes a selected protein, such as an immunomodulatory protein. To deliver selected genetic material, such as DNA, to tumor cells for therapeutic purposes Available. The range of genes that can be delivered for the purpose of stimulating an immune response includes Itokine, immunostimulating factor, lymphotactin, CD40, OX40, OX40 ligand and its Other genetic material as described herein, comprising a single gene or multiple genes Or as multiple copies of one or more genes Things included.   In embodiments of the invention, for example, the vectors and targets specifically described herein below. Utilizing cells, normal and malignant human hematopoietic progenitor cells have an efficacy ranging from 60 to 100%. Can be easily transduced. The level of transduction and gene expression achieved is It is considered to be very efficient, especially for these targets.   Embodiments of the present invention may also provide useful rapid expression of the transferred gene. For example, Under the conditions described in detail herein, a positive expression of the transgene is exposed to the vector. Within 24 hours of CD34 + cells and 80-100% of AML and ALL blasts Obtained. Embodiments of the present invention include, for example, transfecting with a gH deleted herpesvirus vector. GM-CSF produced in human primary leukemia cells by expression of the corresponding gene In case of, proportional to MOI (multiplicity of infection: usually calculated in plaque forming units (pfu / cell)) Level, e.g. 0. Populated for at least 7 days with MOI in the range of 05-20 It may provide for the preparation of transduced cells that produce and, for example, release the product of the gene.   Thus, embodiments of the present invention show that the production of the corresponding immunogen presents a theoretical problem to date. In the present context, it allows the production of an immunogen, for example a human leukemia immunogen. [ Even in leukemic blast cells, for example, in certain sensitive cells, High levels of cytokine production with rovirus or adenovirus vectors May or may be possible. Embodiments of the invention have been tested to date Consistent achievement of a useful high ratio of leukemic blasts to be transduced from all patients To provide useful benefits in clinical practice. ]   The invention is further illustrated by procedures and products and procedures that are illustrative only and not limiting. And with the help of some examples of products.   Suitable vector constructs are shown, without limitation, in the accompanying drawings: 1 to 6 are plasmids pIMMB45, pIMMB56, pIMMB46, pIMC14, pIMR1 and The construction of pIMR3 is exemplified. These vectors are described in detail below;   7 and 8 were constructed as follows, according to certain embodiments of the present invention. Figure 3 shows the results of transduction of cells with a genetically impossible herpes virus.   The description of the vectors and their constructs below is merely exemplary. pH defective virus Construction and properties and suitable complementing cell lines are described in WO 92/05263 and WO 94/21807. (Cantab Pharmaceuticals Research Limited: SC Inglis et al.) Incorporated herein by Forrester et al. Virol. 66, pp 341 or later, and See CS Mclean et al., J Infect Dis 170 (1994) pp 1100 or later. Furthermore, All genetic manipulation procedures are described in “Molecular Cloning” A Laboratory Marual, eds. Samb rook, Fritsch and Maniatis, written in Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 It is listed.   Delivery of the vector to cells, such as hematopoietic stem cells, and delivery to the patient to be treated thereby. Seeding of the vesicles can be performed by simple application of techniques known in the art. For example, M K Bren ner et al., Cold Spring Harbor Symposia in Quantative Biology vol LIX (1994 ) Pp 691-697 or references cited therein, or MK Brenner et al. Lance. t 342 (November 6, 1993) pp 1134-1137 or references cited therein The described method can be easily applied and applied.GM-CSF Of gH-deleted HSV1 and gH-deleted HSV2 expressing   Growth of gH-deleted HSV1 virus and gH-deleted HSV2 virus in complementing cell lines Let it. These cell lines contain the HSV-1 gH gene or HSV-2 gH gene, respectively. It has been manipulated to express this. Such cell lines are described in WO94 / 05207 and WO94 / 21807. No. and the references cited therein. The following sections are Responsible for further explanation of the construction of the cell system, and begins with the construction of certain plasmids:   When HSV viral DNA is needed, it can be obtained, for example (for HSV2) by Walboomers and The method of Ter Schegget (1976) Virology 74, 256-258 Or by suitable application of the method from strain HG52. Selection of HG52 shares The stock without it is the Institute of Virology, MRC Virology Unit, Church Steet, It is stored in Glasgow, Scotland, UK. The DNA of other HSV-2 strains is And appear to be very similar to, for example, strains G and MS were from ATCC, Rockville, M. Available from aryland, USA.Construction of plasmid pIMC05   HSV-1 (HFEM) gH gene and upstream HSV-1 gD promoter (−392 to +1) The 4.3 kb Sst-I fragment encoding 1) was ligated to plasmid pgDBrgH (Forreste r et al., supra) and cut into pUC119 (Vieira & Messing, 1987). Roning produced plasmid pUC119gH. Not1 site-specific mutation Upon induction, it was introduced into plasmid pUC119 87 bp downstream of the gH stop codon. Profit The resulting plasmid pIMC03 was used to generate the Not1-Sst1 fragment, which was Was previously digested with Not1 and Nru1 to remove the CMV IE promoter Ligation into the eukaryotic expression vector pRc / CMV (Invitrogen Corporation) Was. The resulting plasmid, pIMC05, controls the virus-inducible gD promoter It contains the underlying HSV-1 gH gene and BGH (bovine growth hormone) poly A. This is And a neomycin resistance gene for selection of G418 resistant stable cell lines.gH -Construction of a deletion HSV-1 complementing cell line   Plasmid pIMC05 was converted to calcium phosphate technology (Sambrook, Fritsch & Maniatis, A  Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) ero (ATCC no. 88020401) cells. G418 cells Screened by dilution cloning in situ and clonal cell lines were isolated. Increase Width and freezing Later, cells were seeded in 24-well plates and SC16 (del) gH (0.1 pfu / cell) its ability to support the growth of gH-negative virus by infection by rester et al. Was tested. Viral plaques were observed 3 days after infection and gH gene expression was detected. Confirmed.BHK TK Construction of cell system   These cells are described as gH-deleted HSV-1 and gH-deleted HSV-2 complement cells. Thymidine kinase negative (TK) BHK cells (ECACC No. 850114) 23) was prepared by transfecting the plasmid pIMC005. Construction of plasmid pIMC08   The plasmid pIMMB24 containing the HSV-2 gH gene was ligated to the flanking HSV-2 strain 25766. The two BamHI fragments are constructed. BamHI R fragment of about 3484 base pairs Plasmid containing pTW49 and a BamHIS fragment of about 3311 base pairs. Both plasmids pTW54 are cloned into the BamHI site of pBR322. Equivalent Plasmids are readily cloned from many useful strains or clinical isolates of HSV-2. Can be The 5 'end of the HSV-2 gene was cut from pTW54 using BamHI and KpnI. To produce a 2620 base pair fragment, which is gel purified. HSV-2 gH The 3 'end of the gene was excised from pTW49 using BamHI and SalI and 870 base pairs And also gel purify it. The two fragments were SalHI and  Clone into pUC119 digested with KpnI. This plasmid is Contains the entire HSV-2 gH gene.   The plasmid pIMC08 containing the HSV-2 (strain 25766) gH gene was constructed as follows. I built it. Plasmid pIMMB24 was digested with NcoI and BstXI and the plasmid The fragment containing the center was purified from an agarose gel. 5 'end of this gene To two oligonucleotides Reconstructed from CE39 and CE40, which are bounded by HindIII and NcoI sites. To form a frozen sequence.   The 3 'end of this gene was reconstructed with two oligonucleotides CE37 and CE38 However, it forms a joining sequence bounded by BstXI and NotI sites.   Two oligonucleotide linkers and a purified NcoI-BstXI gH fragment Was cloned into HindIII-NcoI digested pIMC05 by triple ligation. The HSV-1 gH gene was replaced with the HSV-2 gH gene. Obtained plasm Name the code pIMC08.gH Construction of a deletion HSV-2 complementing cell line (CR2)   Plasmid pIMC08 is under transcriptional control of the virus-inducible gD promoter. HSV-2 gH gene and BGH (bovine growth hormone) polyA. This is G418 Also includes a neomycin resistance gene for selection of resistant stable cell lines. Plasmid pIMC 08 using calcium phosphate technology (Sambrook, French & Maniatis. A Laboratory Manu al Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) using Vero (ATCC no. 88). 020401) Transfected into cells. Cells are diluted in the presence of G418 Sorted by roning and the clonal cell line was isolated. After growth and freezing, These cells, designated CR2 cells, were seeded on 24-well plates and gH-deleted HSV- 1 (SC16 (del) gH) at 0.1 pfu / cell. Infect virus plaque After the third observation, expression of the gH gene was confirmed.Construction of recombinant plasmid a) pIMMB56 +   pIMMB56 has a lacZ cassette flanked by HSV-2 sequences on one side of the gH gene. Is a doctor. This was prepared as follows: Oligo MB97-MB96 and Oligo MB57 -Include the two PCR fragments generated by MB58 in the PCR oligonucleotide Digest with the appropriate restriction enzyme for the site to be inserted. The MB97-MB96 fragment was converted to HindIII and Digest with HpaI. The MB57-MB58 fragment is digested with HpaI and EcoRI. These fragments were then digested with HindIII and EcoRI into the vector pUC119. Ligation inside. The resulting plasmid is called pIMMB45 (FIG. 1).   The oligonucleotides used for PCR are shown below:   Under the control of the SV promoter to facilitate the detection of first stage recombinants E. FIG. The corrigator galactosidase gene is inserted into pIMMB45. SV40 Pro Motor and beta-galactosidase gene using BamHI and TthIII1 Cut out from plasmid pCH110 (Pharmacia). The tip of the DNA polymerase Complement with Lenou fragment. This fragment is gel purified. Plastic Smid pIMMB45 is digested with HpaI and calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP) Phosphatase treatment to eliminate self-ligation, Then, gel purification is performed. Ligation of gel purified fragments to each other Create plasmid pIMMB56 + (see FIG. 2). b) pIMMB46   pIMMB46 contains a sequence adjacent to the HSV-2 gH gene and has a unique HpaI site in the center. Having. Any gene cloned at this site is located in the HSV-2 genome. It can be inserted by recombination at the gH locus. If this virus is TK negative gH negative will (For example, using the pIMMB56 + plasmid described above) To the 3 'end of the TK gene to preserve TK activity and Enable selection.   Two PCR primers made with oligos MB94-MB109 and oligos MB57-MB108 Fragments with restriction enzymes suitable for the sites contained in the PCR oligonucleotide. Become The MB94-MB109 fragment is digested with HindIII and HpaI. MB57-MB1 08 Digest the fragment with HpaI and EcoRI. These fragments were converted to HindI Ligation into vector pUC119 digested with II and EcoRI. can get The plasmid is called pIMMB46 (see FIG. 3). The oligonucleotide used is below As noted:             HpaI   MB57: 5'TCAGTTAACGCCTCTGTTCCTTTCCCTTC 3 '             EcoRI   MB108: 5'TCAGAATTCGTTCCGGGAGCAGGCGTGGA 3 '             HindIII   MB94: 5'TCAAAGCTTATGGCTTCTCACGCCGGCCAA 3 '             HpaI   MB109: 5'TCAGTTAACTGCACTAGTTTTAATTAATACGTATG 3 ' c) pIMC14   Plasmid pRc / CMV (Invitrogen Corporation) was replaced with restriction enzymes NruI, PvuII and Digest with BsmI and convert the 1066 bp NruI-PvuII fragment to agarose gel. Isolated from This fragment was cloned into pIMMB46 digested with HpaI. (See FIG. 4). The result is named pIMC14.   The pRc / CMV fragment is the major immediate promoter of the cytomegalovirus (CMV-IE Promoter and bovine growth hormone (BGH) polyA addition site. This plasm PIMC14 is a common recombinant plasmid with unique sites for insertion of foreign genes Yes, it can be recombined into an HSV-2 gH deleted DISC vector. d) pIMR1   Plasmid pIMR1 is used to connect the CMV-IE promoter to the DISC HSV-2 vector. It is a recombinant vector for insertion of mouse GM-CSF gene under troll. pIMC14 Was digested with XbaI, phosphatase treated with CIAP, gel purified and extruded. Blunt the tip with Klenow polymerase. Mouse GM-CSF gene was transferred to plasmid pG M 3.2 FF (Gough et al., Referred to as pGM 3.2 in EMBO Journal 4,645-653, 1985) ) (Or from an equivalent plasmid constructed as described above) Cut out. First, pGM 3.2 FF was digested with EcoRI, and a 1048 base pair fragment was digested. Gel purify the gel. This fragment is then digested with HinfI and StuI. 49 Gel purify the 5 bp fragment and terminate the Klenow fragment To repair. This fragment was then used to multiplex the pIMC14 prepared as described above. Cloned into the cloning site. The resulting plasmid is named pIMR1 (See FIG. 5).   Another plasmid equivalent to pGM3.2 can be constructed as follows. cDNA clone The library was cloned from a T-lymphocyte lineage (BA LB / c strain), for example, LB3 (Kelso et al., J Immunol. 132, 2932, 1984). Build. Therein, the synthesis of GM-CSF is induced by concanavalin A. This library is used for colony hybridization using a sequence specific to the mouse GM-CSF gene. Search by dization (for sequences, see Gough et al., EMBO J. 4,645,19). 5). An example of an oligonucleotide useful in this case is 5'TGGATGACAT GCCTG TCACA TTGAATGAAG AGGTAGAAGT 3 '. Pick a clone over 1kb and To determine if it is GM-CSF. These operations are described in “Molecular Cloning : A Laboratory Manual "Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harb It can be performed as described in or. Such operations are performed by HinfI and S as described in pGM 3.2. This results in a clone containing the complete GM-CSF sequence that can be excised with tuI. e) pIMR3   In plasmid pIMR1, the open reading frame for the GM-CSF gene The frame is preceded by a short 15 bp open reading frame (ORF). This Since this can interfere with the expression of GM-CSF, the plasmid pIMR1 is modified to Loading frame was removed. pIMR1 was digested with NotI and PpuMI. Digest Vector treated with calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP) And gel purified. The sequence between the two restriction sites is replaced by two oligonucleotides Replaced with a short double-stranded DNA made by annealing CE55 and CE56:   Oligonucleotides were matched with NcoI and PpuMI ends generated by digestion of pIMR1. Constructed to have protruding ends that meet. Animate two oligonucleotides And phosphorylation and NcoI-Pp Ligation to uMI digested pIMR1. The resulting vector is named pIMR3 You. The corresponding regions of this sequence are shown below:   pIMR 1   pIMR 3   To generate HSV-1 DISC virus expressing GM-CSF protein, various Make a set of sumids: f) pIMMB34   This is a recombinant vector containing the flanking sequences of the HSV-1 gH gene. On the left The flanking sequence inactivates the TK gene next to the gH gene. Oligo MB97-MB 100 and the two PCR fragments generated by oligos MB61-MB58 Digest with a restriction enzyme appropriate for the site contained in the nucleotide. MB97-MB100 The fragment is digested with HindIII and HpaI. MB61-MB58 fragment is Hpa Digest with I and EcoRI. These fragments were digested with HindIII and EcoRI. Ligation into the vector pUC119. The resulting plasmid is called pIMMB34. Name. The oligonucleotides used are as follows: g) pIMMB55 +   Under the control of the SV promoter to facilitate the detection of first stage recombinants E. FIG. The corrigator galactosidase gene is inserted into pIMMB45. SV40 Pro Motor and beta-galactosidase gene using BamHI and TthIII1 Cut out from plasmid pCH110 (Pharmacia). The tip of the DNA polymerase Complement with Lenou fragment. This fragment is gel purified. Plastic Digest pIMMB34 with HpaI and calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP) Phosphatase treatment eliminates self-ligation and gel purification. Get The purified fragments are ligated together and the plasmid pIMMB55 + create. h) pIMMB63   pIMMB63 is made from HSV-1 strain KOS (m) DNA. pIMMB63 is HSV-1 gH gene It contains sequences flanking its offspring and has a unique HpaI site in the center. Clonis on this part Any of the cloned genes was recombinantly inserted into the HSV-1 genome at the gH locus. Can be. If this virus is a TK-negative virus (eg, pIMMB55 + This plasmid is replaced with the 3 'end of the TK gene, Preserves activity and allows selection for TK positive virus.   Two PCR flags generated by oligos MB96-MB63 and oligos MB61-MB58 Digest with the appropriate restriction enzymes for the sites contained in the PCR oligonucleotide. You. The MB98-MB63 fragment is digested with HindIII and HpaI. MB61-MB58 hula Digest with HpaI and EcoRI. These fragments were used for HindIII and E Ligation into coRI digested vector pUC119. Plus you get The mid is called pIMMB63. The oligonucleotides used are as follows: i) pIMX1.0   This plasmid is a common recombinant plasmid with unique sites for insertion of foreign genes. This gene is inserted into the HSV-1 gH deleted DISC vector. Can be replaced. Plasmid pRc / CMV was digested with NruI and PvuII and A 1066 bp fragment containing the CMV IE promoter and polyA signal Blunt ends with polymerase and place at the unique HpaI site of plasmid pIMMB63. Inserted. This plasmid was named pIMX1.0. CMV IE promoter and poly A Multiple cloning sites included between the signal and other genes Ideal for cloning into and subsequently introducing into DISC HSV-1 . j) pIMX3.0   Plasmid pIMX3.0 contains the mouse GM-CSF under the control of the CMV IE promoter. It is a recombinant vector for insertion into the deleted gH region of type 1 DISC HSV. This plastic Smid was excised from plasmid pGM 3.22 FF (supra) with SmaI and DraI. It was constructed by inserting mouse GM-CSF into the unique BamHI site of pIMX1.0. this Plasmid pIMX3.0 is the HSV-1 equivalent of pIMR3.Construction of recombinant virus   A recombinant virus expressing GM-CSF was made in two steps. In the first stage, the gH gene and And a part of the TK gene, Consists of the SV40 promoter driving the E. coli lacZ gene LacZ cassette. This virus has a TK minus phenotype And also when grown under an upper layer containing the chromogenic substrate X-gal Serve Lark. This recombinant virus allows for the insertion of foreign genes at the gH locus. It can be suitably used for. Insert gene along with deletion of TK gene Enter. At the same time, remove the lacZ cassette. These viruses have a TK positive phenotype and And white under X-gal. a) Construction of the first-stage recombinant by replacing the SV40-lacZ cassette with gH   The recombinant virus was transferred to plasmid pIMMB56 + (for HSV-2) or pIMMB55 + (for HSV- 1) by transfection of viral DNA. Will DNA as described in Walboomers & Ter Schegget (1976) Virology 74, 256-258. And purify on a sodium iodide gradient.   Recombination is performed as follows: a) First stage   5 μg viral DNA, 0.5 μg linearized plasmid DNA (by restriction enzyme ScaI) 1 ml of HEBS buffer (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM NaTwoHPOFour, 5.5 mM glucose, 20 mM Hepes, pH 7.05) by mixing Prepare transfection mixture. 70 μl of 2M CaClTwoAnd then And mix gently. The medium is 5 cm semi-confluent of CR1 or CR2 cells (gH-expressing Vero cells) Remove from dish and add 500 μl of transfection mixture to each of two dishes Add to this. The cells are incubated at 37 ° C. for 40 minutes, then 5% fetal bovine serum Add 4 ml of growth medium containing (FCS). After adding the transfection mixture After 4 hours, the medium was removed and the cells were washed with serum-free medium. 15% cells per dish Shock with 500 μl of glycerol for 2 minutes. Remove glycerol and remove cells Are washed twice with serum-free medium and growth medium containing 5% FCS is added.   After 4-7 days, when complete viral cytopathic effect (CPE) is observed, cells are removed from the medium. Scrape in, centrifuge at 2500 rpm for 5 minutes at 4 ° C, and remove Resuspend in small essential medium (EMEM). This allows wild-type and recombinant viruses And crude virus stock. This stock is frozen, thawed and sonicated. And screen for recombinants based on CR1 cells at a constant dilution I do. This medium contains 10 μg / ml acyclovir for screening TK minus virus. Including After addition of the virus dilution, cells are agarose with 1% low gelling temperature. Place medium containing. After the appearance of the viral plaque about the third time, 330 μg / ml of Xgal And a second layer of agarose containing 10 μg / ml acyclovir. Within 48 hours Pick up blue plaques and place in a 24-well dish containing CR1 cells (1 cm per well)Two) Move. Grow plaque to complete CPE and scrape into media To recover. Multiple rounds of plaque purification with pure stock of virus Until the following is obtained.   The structure of the first stage recombinant is confirmed as follows. Sodium iodide purified Viral DNA is prepared as described above and digested with BamHI. This digest Separate on a galose gel and transfer to a nylon membrane. This is one side of the gH gene Probe with a radiolabeled DNA fragment homologous to the sequence. b) Second stage   Recombination was performed with viral DNA from the first-stage recombinant, and plasmid pIMR3 (of HSV-2). And pIMX3.0 (for HSV-1) and performed as described above. virus After the primary recovery of TK-positive recombinant virus, BHK gH-positive TK- Methotrexate, 15 μM thymidine, 9.5 μM glycine, 4.75 μM Select by growth in the presence of nosin and 4.75 μM guanosine. Around 6-hole dish (10cm per well)Two). At each stage, Harvest stained cells by scraping into media and place in 200 μl EMEM Resuspend. After sonication, add 50 μl to fresh BHK gH-positive TK-negative cells. , And continue sorting.   After final selection, virus-infected cells were harvested as described above and gH-deleted HSV1 complementation. Screen based on complete cells. Add top layer as above, and pull Screens in the presence of Xgal. Pick up plaques as before, and delete the gH  Plaque purify 3 times with HSV1 complementing cells.   The structure of the viral DNA is analyzed as described above.GM-CSF Assay   Plasmid DNA and Cos1 cells (ECACC No. 88317001) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Transfect as described in the Manual, Michael Kriegler. G The supernatant from the transfected Cos1 cells or infected CR2 cells is Screen for GM-CSF activity by Say. IL-3 / GM-CSF responsive mouse Hematopoietic cell line C2GM E. Spooncer. Paterson Institute for Cancer Researc h, obtained from Christia Hospital, UK. Cell line C2GM with 20% horse serum, 1% Maintained in Fischer medium with glutamine and 10% conditioning medium I do. The conditioned cell medium is Wehi, which secretes mouse IL-3 into the medium. Obtained from logarithmic growth medium of 3b cells (ECACC No. B6013003). Wehi 3b cells Are maintained in RPMI 1640 medium, 10% FCS and 1% glutamine.   The above explanation is particularly for HSV-1 and HSV which are gH-negative and express GM-CSF. -2 allows the construction of mutants.   One skilled in the art will use the present teachings in the context of the first gene, which is essential for the production of infectious viruses. Can easily respond to the preparation of other mutant viruses that are defective in This causes the virus to infect normal cells and replicate in these cells. Can produce and express viral antigens, but produce so-called infectious viruses And cannot modulate the immunomodulatory proteins or other proteins described herein. Express a heterologous nucleotide sequence encoding the genetic material.   Numerous other mutated viruses are available for the following viruses and virus types: Based on deletion or (for example) other inactivation of the following essential genes: You can:   In herpes simplex virus, essential genes such as gB, gD, gL, ICP4, I CP8 and / or ICP27 may be deleted or inactivated, or The gH gene used in the above example may be substituted. Other herpesvirus smells Known essential genes, eg For example, the role of HSV for gB, gD, gL, gH, ICP4, ICP8 and / or ICP27 genes. Any known homologue may be selected for deletion or inactivation. Cytomegalowie Lus, for example, Dion et al., Virology158(1987) Thermosensitive bumps identifiable from 228-230 Genetically disabled by deleting or activating the gene responsible for mutation Can be Use of vectors for cell transduction:   Procedures applicable to the manufacture of some useful examples according to the present invention are as follows: :   lacks the gH gene and provides a functional copy of the selected gene at the deleted locus The carrying recombinant HSV-2 virus was cultured as described above and8pfu / ml Prepare a stock with a titer of   To perform a leukemia cell-based transduction procedure, Harvested from the patient, and cells are isolated therefrom by density gradient centrifugation. another In embodiments, the cell line can be obtained from a cancer patient, such as by biopsy, and Alternatively, it can be used via in vitro culture. Cells from patients with solid tumors are tumors Or via surgical removal of metastases, or from a biopsy from a tumor or metastasis Can be obtained from Tumor biopsy or resection material can be obtained by mechanical or enzymatic dissociation, or Can be used to prepare single cell suspensions by other well-known methods.   Tumor cells with a recombinant defective HSV vector carrying a selected gene (eg, GM-CSF) Infection / transfection of cells or cell lines can be performed in vitro using a single cell suspension. Dispense the recoat into a suitable tissue culture vessel such as a 24-well plate or flask. And can be implemented. A suitable cell concentration is 0.5-2.0 × in 1 or 2 ml of medium. Ten6Cells / well. The virus is then e.g. 0.01-20, e.g. 0.05-0.1 pfu / cell, or at a multiplicity of infection of 1 or less or about 5 or less, and The culture is then incubated for 2 h to allow the virus to enter the cells. excess Viruses are washed out by standard methods. The cells are used in immunotherapy and other Fresh for various purposes, for example, directly or for a period of time, e.g. It can be used after culturing in a medium. For testing purposes, as in the test experiment below Culture is performed for 1-7 days.   A sample of cells infected by the viral vector is carried in the viral vector. The expression of the carried heterologous gene can be tested. For example, the lacZ gene Cells infected with a recombinant defective HSV vector containing β-galactosidase By utilizing an antibody or an antiserum preparation specific for β-galactosida Galactosidase substrates that provide a fluorescent product upon cleavage by The presence of β-galactosidase activity by using Oriporter (TM) Can be tested for Fluorescent products or antibodies can be obtained by fluorescence microscopy or It can be detected by itometry. The percentage of cells that show fluorescence is the gene product And can be calculated from the results of the detection step. Transduction and expression of lacZ in malignant and normal cells:   Testing and Examples of Transduction Efficacy According to the Invention Utilizing Recombinant Viral Vectors The appropriate test format shown is as follows, and the herpes virus vector It can be applied to other examples. The vector used for the test described here is the lacZ reporter -Genes: generally in place of (or in addition to) the reporter gene A gene encoding an epidemiological regulatory protein or other protein, or the present specification Use Other Vectors Having Other Genetic Materials as Described in the Present Disclosure .   The lacZ gH-deleted HSV mutant is referred to herein as the "first-stage" Constructed as described above for Luss. Genes for immunomodulatory proteins This first step in the production of a vector containing Test vector. On the other hand, such a mutant is a "first step" described in WO 94/21807. It can also be constructed as described in WO 94/21807 for recombinants, Page 28, line 28 to page 29, line 28 (incorporated herein by reference) ). The lacZ gene is used here as a test and marker gene. Described in this specification Technology to replace other useful genes with lacZ or as easily as lacZ Can be incorporated into   Recombinant deficient HSV will induce expression of β-galactosidase marker gene The ability of the vector HSV-lacZ to be demonstrated in various tumor cell types described below Studied in:   A: Two cell lines (ALL) derived from acute lymphoblastoma leukemia (derived from clinical samples And 10% FCS (Biowhittaker, Walkersville, MD), 100 IU / ml penicillium And 100 μg / ml streptomycin (Biowhittaker) and 2 mmol / l L St Jude Childre cultured in RPMI 1640 with Glutamine (Biowhittaker) AD and RS human pre-B-white established at n's Research Hospital, Memphis, TN Blood cell line);   B: three cell lines derived from neuroblastoma (NB);   C: primary cells just isolated from 4 patients with ALL;   D: primary cells from three patients with acute myeloid leukemia (AML); And   E: Primary cells from two patients with NB.   Leukemia blasts> 80% blasts by Ficoll precipitation of peripheral blood or bone marrow mononuclear cells Was isolated from patients with Myeloblasts as above The spiked RPMI may be maintained in a liquid medium (Biowhittaker). Lymph bud Spheres should be maintained in liquid media or, if necessary, allogeneic skin lines as interstitial supports May be maintained on fibroblasts.   The cell line consists of freshly isolated cells in 5 × 10 5 cells each in 1 or 2 ml of medium.Five~ 2 × 106Play as single cell suspension in 24-well plate at cells / well And cultured. Recombination deficient HSV virus vector HSV-lacZ at 0.05-0.1 pfu / cell Added at a multiplicity and incubated at 37 ° C. for 2 h. Remove excess virus Remove, add fresh medium and incubate the cultures at 37 ° C for various times. I did. Effective transfection is determined by flow cytometry and Measurements were taken 2 and 7 days after infection. Stain infected cells (xgal and standard firefly) Light), and lacZ production.   The following results were obtained: for both ALL cell lines, The transduction efficiency for the β-galactosidase gene was  100%.   For primary ALL cell samples, two for 100 β-galactosidase expression. % Positive, and the other two showed transduction efficiencies of over 80% on day 2. (These cells do not survive culture without stroma and cannot be tested on day 7 Was. )   Two of the three primary AML samples showed transduction efficiencies of over 80%. So Days rose further on the seventh day.   The third sample showed slightly lower efficiency (42% on day 2 and 54% on day 7). %).   On day two, three NB cell lines show transduction efficiencies of 25%, 72% and 74%, respectively. Whereas two primary NB cell samples showed 65% and 100% transduction.   These results have previously proven to be difficult to transduce by other means. Ability of recombinant defective HSV vectors for transduction of heterologous genes into living cells Demonstrate. For ALL and AML, retroviral transduction requires the generation of a cell line. And even so, the efficiency of gene transfer was very low (<5%). ALL and Fresh cells or cell lines derived from AML and AML are essential for adenovirus transduction It is considered to be chemically resistant.   Recombination deficient HSV vectors are surprising for transduction of fresh NB cells and NB cell lines He showed a reasonably high ability. Transduction for two of the three NB cell lines Input efficiency is> 70% and 65% and 100% respectively for fresh isolates Met.   The results are summarized below:   Transduction and expression of lac in primary bone marrow cells was performed as follows:   Bone marrow was obtained from two normal donors. Mononuclear fraction (by Ficoll precipitation) was anti-CD34 The CD34 + progenitor cell population was enriched through a column (Cellpro, Seattle, WA). This These cells were exposed to the impaired herpes virus encoding lacZ at 0.05-20 (pfu / cell). Follicles) at various degrees of infection (MOI). After 2 hours exposure, divide cells into two And in a stromal support culture or in a culture with cytokines: Can be maintained as street. 8 × 10Five/cmTwo-Supported cultures with a specific surface area With 15% horse serum and 5% fetal calf serum (FCS: Summit Biotechnology, Ft Colli ns, CO), 1 × 106mol / l hydrocortisone (Abott, Chicago, ILL), 1 × 10Fourm ol / l mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, Mo.) and 400 μl / ml Fisher's medium containing transferrin (Life Technologies) (Life Technology, Grand  Island, NY). Transfer cells to 25 ml tissue culture flasks (Nunc, Roskil de, DK) at 37 ° C. Every two weeks, half of the spent medium and the interstitial layer The medium was replaced with fresh medium until establishment. Stromal cells are used as a feeder layer, The transduced CD34 + cells obtained as above were then replated. Some of the transduced cells Another method of culturing is a liquid medium containing fetal calf serum, IL3 and stem cell factor. It is to grow in. The other part is mixed with methylcellulose and 10 in the woven culture dishFiveG / ml.   After 2, 7 and 14 days, cells from the liquid culture were analyzed by flow cytometry (fluorimetry). Using a porter system), while cells from the methylcellulose plate Individual colonies were examined by x-gal staining and fluorescence flow cytometry. firefly In optical research, all details The cells were stained with a fluoriporter reagent and a fluorescent CD34 antibody.   These results indicate that 30 to 100% of CD34 + cells are positive for the marker gene. The percentage of positive cells increased with increasing MOI. On the 14th day, Kana cells and colonies are positive (2-50%) and transgene expression is Indicates that it was transient in the vesicle. In semi-solid (methylcellulose) culture Cells and individual colonies were also positive, so methylcellulose was , But the signal detected is from a transduced cell to a non-transduced cell. Normal, in the absence of any growth stimulating signals, rather than by protein exchange FIG. 4 shows very efficient transduction of hematopoietic progenitor cells. In further testing It has been found that high efficiency expression is obtained, for example, 48 hours after transduction, Peak reached in 24-48 hours.   The method described above for transduction and expression of lacZ replaces lacZ as described above. By utilizing other viral vectors carrying other corresponding genetic material Can be easily applied to other desired proteins and genetic materials. Expression of GM-CSF by vector-transformed human ALL and other cells:   Carries the gene encoding the cytokine (GM-CSF) constructed as described above Impossible herpesvirus vector example (gH defective HSV vector encoding GM-CSF) Is human acute lymphocytic leukemia (ALL), mouse lymphoblastic leukemia (MLL) and human Can induce the production of encoded cytokines in transduced cells of the neuroblastoma line Was obtained.   The cell line is transduced in a standard manner, and on days 1, 3 and 7 of transduction, These are commercially available immunoassays (Endogen) Tested for GM-CSF secretion. Figure 7 shows various MOIs (multiplicity of infection: cell count GM-CSF secretion by various transduced cell lines 6 is a bar chart showing test results of the first embodiment. Each set of three continuous bars is Production on days 1, 3 and 7 respectively under the indicated conditions (cell type, MOI) Is shown. The vertical axis is 5 × 10 per 24 hoursFive4 shows the scale of GM-CSF production per cell.   Secretion was found to occur for at least 7 days, and the result was simply early onset It does not appear to be due to the persistence of the rendered protein. Therefore, low infection multiplicity Degree (e.g., in the range of about 0.05 to about 1,5 or 10) is effective against human tumor cells sell. The mouse tumor cells used for comparison were approximately 20-fold more transduced than human cells. It was difficult. Expression of GM-CSF by CD34 + primary bone marrow cells   Figure 8 shows the effective traits of CD34 + primary bone marrow cells (hematopoietic progenitor cells) derived from normal adult origin It is a FACS plot showing the result of introduction.   Impossible herpes virus carrying a gene encoding a cytokine (GM-CSF) Transform bone marrow cells using a vector (gH-deleted HSV vector encoding GM-CSF) Converted. The cells are purified in a standard manner by CD34 sorting and for CD34 antigen Stained in standard manner. Similarly, other CD34 + cells, e.g. Anything can be transduced or used subsequently. For example, a vaccine for immunogen therapy And then reintroduce it into the patient from which the parent cells were derived, or It can be used to sensitize or stimulate the embals.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 バースネル，マイケル エドワード グリ フィス イギリス国，ケンブリッジ シービー１ ４エヌワイ，ネザホール ウェイ 46 (72)発明者 ブレナー，マルコム キース アメリカ合衆国，テネシー 38103，メン フィス，リバーパーク ドライブ 814 (72)発明者 ディロー，ダグマー アメリカ合衆国，テネシー 38103，メン フィス，ハーバー クラブ サークル ＃301 148 (72)発明者 イングリス，スティーブン チャールズ イギリス国，ケンブリッジ シービー１ ６エルエックス，リントン，ルガーブ ガ ーデンズ，２────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ , BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, G E, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, P L, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK , TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN (72) Inventors Barsnell, Michael Edward Gris             Fiss             Cambridge Seabee 1 UK             4 NW, Nezah Way 46 (72) Inventor Brenner, Malcolm Keith             United States, Tennessee 38103, Men             Fiss, River Park Drive 814 (72) Inventor Diroh, Dagmar             United States, Tennessee 38103, Men             Fiss, Harbor Club Circle             # 301 148 (72) Inventors Inglis, Stephen Charles             Cambridge Seabee 1 UK             6 LX, Lynton, Lugarbuga             Dendens, 2

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．造血細胞、血液細胞に関連する悪性細胞及び悪性又は非悪性CD34＋細胞か ら選ばれるヒト又は非ヒト動物細胞を形質導入するための調製品の製造における 、衰弱化又は複製欠陥型であり、且つ非形質転換性突然変異ヘルペスウィルスで あり、しかも異種遺伝子材料を担持する組換ヘルペスウィルスベクターの利用。 ２．前記異種遺伝子材料が腫瘍治療、免疫治療又は遺伝子治療において有用な 免疫調節タンパク質又はその他の遺伝子生成物をコードする遺伝子を含んで成る 、請求項１記載の利用。 ３．前記ヒト又は非ヒト動物細胞が、（形質導入前において）細胞培養条件下 で全くインキュベーションされていない細胞、約２時間より長くインキュベーシ ョンされていない細胞、約４時間より長くインキュベーションされていない細胞 、及び一夜ほど長くインキュベーションされていない細胞、例えばサンプリング したばかりの細胞から選ばれる、請求項１又は２記載の利用。 ４．前記で得られる形質導入細胞を、（ａ）親細胞が由来する対象体への前記 細胞の再導入、及び（ｂ）in vitroでの前記細胞と白血球との反応、より選ばれ る更なる段階にかける、請求項１，２又は３記載の利用。 ５．前記ヒト又は非ヒト動物細胞をex-vivo で処理し、ここで前記形質導入が 42％以上の効率で実施される、請求項１〜４のいづれか１項記載の利用。 ６．前記ヒト又は非ヒト動物細胞をex-vivo で処理し、ここで前記形質導入が 65％以上の効率で実施される、請求項５記載の利用。 ７．前記ヒト又は非ヒト動物細胞をex-vivo で処理し、ここで前記形質導入が 80％以上の効率で実施される、請求項６記載の利用。 ８．前記ヒト又は非ヒト動物細胞をex-vivo で処理し、そして前記形質導入段 階（ｂ）を0.05〜20の感染多重度(MOI)で実施する、請求項１〜７のいづれか１ 項記載の利用。 ９．前記複製欠陥突然変異ウィルスが、そのゲノムが感染性ウィルスの生産に 必須の遺伝子に関して欠陥となっており、従って前記遺伝子が欠失しており、そ してこのウィルスが正常宿主細胞に感染でき、そしてかかる細胞の中でのウィル ス遺伝子の複製及び発現に委ねられるが、感染性ウィルスを産生することのでき ない突然変異ウィルスである、請求項１〜８のいづれか１項記載の利用。 10．感染性ウィルスの産生に必須である前記遺伝子が欠失しており、そして異 種タンパク質をコードする前記遺伝子が前記突然変異ウィルスのゲノムの前記欠 失した必須遺伝子の座において挿入されている、請求項９の利用。 11．前記ウィルスベクターがHSV の突然変異体である、請求項１〜10のいづれ か１項記載の利用。 12．ヒト又は非ヒト動物起源の造血細胞、血液細胞に関連する悪性細胞及び悪 性又は非悪性CD34＋細胞から選ばれるヒト又は非ヒト動物細胞に異種遺伝子を導 入してその細胞をより高度に免疫原性とするための、前記細胞の形質導入のため の調製品の製造における、衰弱化又は複製欠陥型であり、且つ非形質転換性突然 変異ウィルスベクターであり、しかもサイトカイン並びに免疫学的補助刺激分子 及び化学誘引物質から選ばれる免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を含んで 成る異種遺伝子材料を担持する組換ヘルペスウィルスベクターの、請求項１〜11 のいづれか１項記載の利用。 13．前記ウィルスベクターが、サイトカイン、免疫学的補助刺激分子及び免疫 学的化学誘引物質より選ばれる異種免疫調節タンパク質をコードする遺伝子をコ ードする、請求項１〜12のいづれか１項 記載の利用。 14．前記細胞を形質導入するのに用いるウィルスベクターがGMCSF， IL２，IL 12，CD40L ，Ｂ7.1 及びリンホタクチンより選ばれるサイトカインをコードする ベクターである、請求項13記載の利用。 15．請求項１〜14のいづれか１項記載の方法により形質導入された細胞の、細 胞障害性Ｔ細胞をこの形質導入細胞に曝露することによりかかるＴ細胞を活性化 及び／又は増殖させるための、利用。 16．前記形質導入細胞が悪性細胞及び／又はCD34＋細胞である、請求項15記載 の利用。 17．造血細胞、血液細胞に関連する悪性細胞及び悪性又は非悪性CD34＋細胞か ら選ばれるヒト又は非ヒト動物細胞を形質導入するのに利用するための薬理組成 物であって、衰弱化又は複製欠陥型であり、且つ非形質転換性突然変異ヘルペス ウィルスであり、しかも異種遺伝子材料、例えば異種タンパク質をコードする遺 伝子を担持する組換ヘルペスウィルスベクターを含んで成る、組成物。 18．造血細胞、血液細胞に関連する悪性細胞及び悪性又は非悪性CD34＋細胞か ら選ばれるヒト又は非ヒト動物細胞を含んで成る薬理組成物であって、前記細胞 が衰弱化又は複製欠陥型であり、且つ非形質転換性突然変異ヘルペスウィルスで あり、しかも異種遺伝子材料、例えば異種タンパク質をコードする遺伝子を担持 する組換ヘルペスウィルスベクターにより感染されている、組成物。 19．in vivo での外来遺伝子の発現を達成するための、ヒト又は非ヒト動物被 検体である被検体を処置するのに利用するための医薬品の製造における請求項17 又は18記載の組成物の利用。 20．免疫応答を誘導するための、ヒト又は非ヒト動物被検体である被検体を処 置するのに利用するための医薬品の製造における請求項18記載の組成物の利用。[Claims]   1. Hematopoietic cells, malignant cells associated with blood cells and malignant or non-malignant CD34 + cells In the preparation of a preparation for transducing human or non-human animal cells selected from Attenuated or replication-defective, and non-transforming mutant herpes virus Utilization of a recombinant herpesvirus vector that carries a heterologous genetic material.   2. The heterologous genetic material is useful in tumor therapy, immunotherapy or gene therapy Comprising genes encoding immunomodulatory proteins or other gene products The use according to claim 1.   3. Wherein said human or non-human animal cells are cultured under cell culture conditions (before transduction). Not incubated at all, incubation for more than about 2 hours Unincubated cells, cells that have not been incubated for more than about 4 hours And cells that have not been incubated as long as overnight, eg, sampling 3. Use according to claim 1 or 2, which is selected from fresh cells.   4. Transforming the transduced cells obtained above into (a) the subject from which the parent cells are derived; Cell reintroduction, and (b) the reaction of said cells with leukocytes in vitro. 4. Use according to claim 1, 2 or 3 in a further further step.   5. Treating said human or non-human animal cells ex-vivo, wherein said transduction is 5. Use according to any one of the preceding claims, which is performed with an efficiency of 42% or more.   6. Treating said human or non-human animal cells ex-vivo, wherein said transduction is 6. Use according to claim 5, which is performed with an efficiency of 65% or more.   7. Treating said human or non-human animal cells ex-vivo, wherein said transduction is 7. Use according to claim 6, performed at an efficiency of 80% or more.   8. Treating said human or non-human animal cells ex-vivo and said transducing step 8. The method according to claim 1, wherein the floor (b) is performed at a multiplicity of infection (MOI) of 0.05 to 20. Use described in section.   9. The replication-defective mutant virus has its genome involved in the production of infectious virus. It is defective with respect to an essential gene, and thus the gene is deleted and This virus can infect normal host cells, and will Gene replication and expression, but not capable of producing infectious virus. 9. Use according to any one of the preceding claims, wherein the mutant virus is not a mutant virus.   Ten. The gene, which is essential for the production of infectious virus, is deleted and The gene encoding the seed protein is in the deletion of the genome of the mutant virus; 10. Use according to claim 9, wherein it has been inserted at the locus of the missing essential gene.   11． 11. The method according to claim 1, wherein the viral vector is a mutant of HSV. Or use according to item 1.   12． Hematopoietic cells of human or non-human animal origin, malignant cells associated with blood cells and evil Introduce a heterologous gene into human or non-human animal cells selected from sexual or non-malignant CD34 + cells To transduce said cells in order to make said cells more immunogenic. In the production of preparations of fragile or replication defective and non-transformable Mutant viral vector and cytokines and immunological costimulatory molecules And a gene encoding an immunomodulatory protein selected from chemoattractants A recombinant herpesvirus vector carrying said heterologous genetic material comprising: Use according to any one of the above items.   13. The viral vector may comprise a cytokine, an immunological costimulatory molecule, and an immune system. Gene encoding a heterologous immunomodulatory protein selected from biological chemoattractants Any one of claims 1 to 12 Use of the description.   14. The viral vector used to transduce said cells is GMCSF, IL2, IL 12, encodes a cytokine selected from CD40L, B7.1 and lymphotactin 14. Use according to claim 13, which is a vector.   15． A method for transducing cells transduced by the method according to any one of claims 1 to 14. Activating cytotoxic T cells by exposing the T cells to the transduced cells And / or to propagate.   16． 16. The transduced cell is a malignant cell and / or a CD34 + cell. Use of   17． Hematopoietic cells, malignant cells associated with blood cells and malignant or non-malignant CD34 + cells Pharmaceutical compositions for use in transducing human or non-human animal cells selected from , A weakened or replication-defective form, and a non-transforming mutant herpes A virus that encodes heterologous genetic material, such as a heterologous protein A composition comprising a recombinant herpesvirus vector carrying a gene.   18． Hematopoietic cells, malignant cells associated with blood cells and malignant or non-malignant CD34 + cells A pharmaceutical composition comprising human or non-human animal cells selected from the group consisting of: Is an attenuated or replication defective form and is a non-transforming mutant herpes virus Yes, and carry heterologous genetic material, such as a gene encoding a heterologous protein The composition is infected by a recombinant herpesvirus vector.   19. a human or non-human animal coat to achieve expression of a foreign gene in vivo. 18. The method of claim 17, wherein the medicament is for use in treating a subject. Or a use of the composition according to 18.   20. Treating a subject, which is a human or non-human animal subject, to induce an immune response 19. Use of the composition of claim 18 in the manufacture of a medicament for use in placing.
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