JPH11511976A

JPH11511976A - 遺伝子転写を修飾する新規因子およびその使用方法

Info

Publication number: JPH11511976A
Application number: JP9510653A
Authority: JP
Inventors: エーヤング，リチャード; ジェイコレスク，アンソニー; エムトンプソン，クレイグ; エムチャオ，デイヴィッド
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Current assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date: 1995-08-31
Filing date: 1996-08-28
Publication date: 1999-10-19
Also published as: WO1997008301A1; EP0851912A1; US6214588B1; CA2227963A1; EP0851912A4

Abstract

(57)【要約】ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび１以上の調節蛋白質を含む、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素が記載されている。これらのホロ酵素は、イン・ビトロにおいて、基本転写因子が供給されると選択的に転写を開始する。該調節蛋白質は、少なくとも部分的にはＲＮＡポリメラーゼＩＩとの機能的相互作用を介して、転写開始に対して陽性的および陰性的に作用する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子転写を修飾する新規因子およびその使用方法発明の背景細胞の遺伝子発現の調節は、第一にＲＮＡポリメラーゼによる転写開始のレベルで起こる。より高等な真核生物において調製されたＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始は、プロモーターにおける基本転写因子との複合体の形成に関与する(Sawadogo，M.および Sentenac，A，Ann ．Rev．Biochem. 59:711-754(1990)) 。これらの因子の１つ、転写因子ＩＩＤ（ＴＦＩＩＤ）は、プロモーターＤＮＡに直接結合できるＴＡＴＡ−結合蛋白質（ＴＢＰ）を含む。該転写開始複合体の残りの成分は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび開始因子ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨおよびＴＦＩＩＪを含む。これらの成分はＴＦＩＩ−結合プロモーターＤＮＡと結びついて転写開始複合体を形成する。配列特異的ＤＮＡ結合蛋白質は、おそらくＴＦＩＩＢおよびＴＢＰ並びにＴＦＩＩＤを構成する付加的な因子を通じて、転写開始複合体の構築および活性を調節すると思われる。ドロソフィラ(Drosophila)およびヒト細胞からの抽出物において、ＴＢＰを含むいくつかの高分子量の複合体が同定されている(Gill，G.および Tjian．R.，C urr ．Opin．Gen．Dev. 2:236-242(1992); Sharp，P．A.，Cell 68:819-821(1992 ))。これらの複合体の１つは、少なくとも８のＴＢＰ会合因子（ＴＡＦｓ）を含むＴＦＩＩＤである(Pugh B.F.,および Tjian，R.J．Genes Dev. 5:1935-1945(1 991))。第二の複合体は、ＴＢＰおよび３のＴＡＦｓを含むＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター選択性因子、ＳＬ１である(Comai，L.ら，Cell 68:965-976(1992 )))。第三の複合体は、ＴＢＰおよび２のＴＡＦｓからなるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ因子ＴＦＩＩＩＢの成分である(Taggart，A.K.P.ら,Cell 71:1015-1028(1 992))。これらの複合体と会合したいくつかのＴＡＦｓは、配列特異的レギュレーターおよびＴＢＰの間に機能結合を供することにより転写コアクチベーターとして機能すると思われる(Dynlacht，B.D.ら，Cell 66:563-576(1991))。ＲＮＡポリメラーゼＩＩカルボキシル末端ドメイン（ＣＴＤ）は、ＴＢＰに結合可能な転写装置のもう１つの成分である( Usheva，A.ら Cell 69:871-881(199 2))。ＣＴＤは高度に保存され、かつ、明確にＲＮＡポリメラーゼＩＩの最大のサブユニットの特異的な特性を持っている(Young，R.A.，Ann ．Rev．Biochem. 6 0:689-715(1991))。該ＣＴＤは、生物により２６−５２個のＴｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒという共通のヘプタペプチド配列の繰り返しを含む。ＣＴＤのほとんどまたは全てを除去する欠失突然変異は、細胞にとって致死的である(Nonet，M.,ら，Cell 50:909-915(1987))。ＣＴＤ部分転写突然変異は、イン・ビボにおいて増殖並びに遺伝子発現の誘導の欠損を引き起こし、イン・ビトロにおいて転写開始における本質的な欠損を起こす(Liao,S．M.ら，Genes Dev．5:2431-2440(1991))。開始複合体に補充されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ分子の重要な特性は、それらのＲＮＡポリメラーゼ会合蛋白質（ＲＡＰｓ）との会合である(Conaway，J.W.ら , J ．Biol．Chem．266:17721-17724(1991))。２種の哺乳類蛋白質、ＲＡＰ３０およびＲＡＰ７４は、基本転写因子ＴＦＩＩＦの成分として同定された(Flores ，O.ら，J ．Biol．Chem．263:10812-10816(1988))。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写開始複合体の成分に関するこの知見にもかかわらず、現在までに２つの主要な疑問が提出されている。第一に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび基本開始因子がイン・ビボでもう一方とどう相互作用するのか？例えば、プロモーターＤＮＡで引き続いて起こる様式においてＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび基本因子が会合するかどうか、または、ＤＮＡとの会合に先立ってこれらの成分の大きな複合体が会合するかどうかは明確ではない。第二に、転写レギュレーターは該転写開始複合体とどう相互作用するのか？かくして、相互作用がレギュレーターとＴＦＩＩＤのサブユニットの間でだけ起こるのかどうか、該開始複合体の他の成分との付加的な相互作用が存在するかどうか我々は知らない。発明の概要本発明はＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体に関する。本発明のＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび１以上のレギュレーター成分からなる多重サブユニット複合体である。該レギュレーター成分は、真核生物のレギュレーター蛋白質、例えば、酵母および哺乳類ＳＲＢ（ＲＮＡポリメラーゼＢのサプレッサー(Suppressor of RNA polymeraseB))蛋白質、並びに酵母および哺乳類ＳＷＩおよびＳＮＦ蛋白質を含む。ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は転写の開始を可能にし、アクチベーターに応答する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素と会合した付加的成分は、１以上の基本転写因子（本明細書ではＧＴＦｓとも呼ばれる）、および転写アクチベーターに応答するために必要かつ十分な他の成分を含む。本明細書に記載されるＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は、真核細胞生物における転写の開始に鍵となる役割を果たす。ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素によるＤＮＡ転写は、アクチベーター蛋白質によって刺激され、その特性は精製されたＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび基本因子単独を用いた場合には観察されない。出願人らは、哺乳類、（例えば、酵母、真菌類、寄生種、昆虫を含む）非哺乳類およびヒト起源のそれらを含む、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体およびそれらの成分を同定し特徴付けた。１つの具体例において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性の陽性および陰性レギュレーターとして作用する、本明細書でＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、ＳＲＢ６、ＳＲＢ７、ＳＲＢ８、ＳＲＢ９、ＳＲＢ１０およびＳＲＢ１１と同定した酵母レギュレーター蛋白質が記載される。酵母ＳＲＢ蛋白質ＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、ＳＲＢ６、ＳＲＢ７、ＳＲＢ８、ＳＲＢ９、ＳＲＢ１０およびＳＲＢ１１、これらのＳＲＢ蛋白質をコードするアミノ酸、およびそれらの変異体または誘導体、並びにＳＲＢ蛋白質と反応する抗体が本発明によって包含される。該ＳＲＢ蛋白質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩカルボキシ末端ドメイン、すなわちＣＴＤと強固に会合するＳＲＢ複合体からなる。また、本明細書には、第一にヒトＳＲＢのクローン化および配列決定、並びに哺乳類のＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の精製および同定が記載される。ｈＳＢＲ７はｙＳＲＢ７と３５％一致し、ｙＳＲＢ欠失を補完し、かつ、その酵母の相対物に類似し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのカルボキシ末端ドメインと結合する。ｈＳＲＢ７は哺乳類ホロ酵素複合体の一部であり、本明細書に記載される結果はこの哺乳類ホロ酵素複合体が活性化された転写を助けることを示している。さらに本明細書には、本発明のＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素がＳＷＩおよびＳＮＦ遺伝子産物からなる包括的な遺伝子レギュレーターを含む付加的調節成分を含むことが記載される。該ＳＷＩおよびＳＮＦ遺伝子産物は本明細書では一まとめにＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と呼ばれる。該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質、またはポリペプチドは遺伝子発現の調節において鍵となる役割を果たす。ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の遺伝子発現の調節作用は染色質の再構成を含む。より特異的には、該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質はＲＮＡポリメラーゼＩＩにヌクレオソームＤＮＡを分裂するホロ酵素能力を供し、かくして、特異的プロモーターでの転写開始複合体の種々の成分の安定した結合を助長する。本発明によって包含されるＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質は、本明細書でＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体と呼ばれる、ＳＲＢ蛋白質と多重サブユニット複合体を形成する。該ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体はＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤと会合する。該ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体を含むＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質は、本発明によって包含される。また、本発明によって包含されるものは、例えば、酵母および哺乳類など真核生物のＳＲＢ蛋白質および新規なＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列の相補鎖、およびそれらの対立遺伝子バリエーション、並びにＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦＤＮＡ配列と特異的にハイブリダイズするＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦＤＮＡ配列に対して十分相補性のある核酸プローブである。さらに本発明は、ＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合する、もしくは相互作用する物質；該蛋白質をコードするＳＲＢ遺伝子およびＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子、もしくは該ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦｍＲＮＡｓによって遺伝子転写を修飾する方法に関する。かかる物質はＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成を阻害するかまたは促進するかのいずれかが可能であり、すなわち、該ホロ酵素複合体が形成されれば、転写の開始としてのホロ酵素の作用を阻害または促進する。また、ＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と結合する、もしくは相互作用する物質；ＳＲＢ遺伝子またはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子；またはＳＲＢもしくはＳＷＩ／ＳＮＦｍＲＮＡｓは、ＳＲＢまたＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質がＲＮＡポリメラーゼＩＩに、もしくは遺伝子の転写に不可欠な他の転写因子に有している影響を修飾することができる。さらには、ＳＲＢおよびＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の相同性における差異（例えば、酵母およびヒトＳＲＢ７遺伝子または蛋白質配列における差異）は、例えば、真菌類カンジダ(Candida)などの病原性真核生物を標的とし、哺乳類またはヒト宿主における遺伝子転写に影響を及ぼさずに病原体における遺伝子転写を阻害する治療成分または治療薬を設計するために利用することができる。また本発明は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を用いるイン・ビトロでの転写方法、および遺伝子転写を修飾する自然発生の、および合成による両物質の同定に対するこの方法の使用に関する。さらに本発明は、細胞においてまたは生物分泌液において、ＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ配列に対して、もしくはＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦｍＲＮＡｓ（例えば、アンチセンスヌクレオチド）とハイブリダイズする核酸プローブ、もしくはＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子産物と特異的に結合する抗体を用いてＳＲＢ遺伝子、またはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子、および遺伝子産物を検出する方法に関する。図面の簡単な説明図１Ａは、ＳＲＢ２遺伝子を含むｐＣＴ２１由来の１．９５ｋｂＢｓｔＥＩＩ −ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片の制限地図を示す（Ｂ，ＢｓｔＥＩＩ；Ｅ，ＥｃｏＲＩ；Ｎ，ＮｃｏＩ;Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓ、ＳａｃＩＩ）。ＳＲＢ２転写産物は図の上に示されている。対立遺伝子ｓｒｂ２△１の欠失を創り出すために、ＳＲＢ２の全コーディング領域は、ＨＩＳ３遺伝子を含む１．７５ｋｂＢａｍＨＩＤＮＡ断片で置換された。図１Ｂは、ＳＲＢ２遺伝子（配列番号：１）を含む１．９５ｋｂＢｓｔＥＩＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を示し、該ＳＲＢ２蛋白質の予測配列（配列番号：２）は該遺伝子の配列の下に示されている。該転写開始部位は水平の矢印によって示されている。スプライス供与体およびスプライス受容体部位は下線である。ＴＧＣＴＡＡＣＡスプライス分岐部位は線囲みの部分である。ＳＲＢ２−１突然変異は、ＰｒｏからＨｉｓまでの１４個が変化する、ＣからＡへのトランスバージョン（ｎｔ７６８）である。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、各々ＳＲＢ４（配列番号：３および４）、ＳＲＢ５（配列番号：５および６）およびＳＲＢ６蛋白質のＤＮＡ配列および予測されるアミノ酸配列（配列番号：７および８）を示す。図３Ａ−３Ｅは、ＳＲＢ２およびＳＲＢ５がイン・ビトロでの有効な転写のために不可欠であることを証明する実験結果を示す。図４Ａおよび４Ｂは、ＳＲＢ２およびＳＲＢ５が有効な開始前複合体形成のために不可欠であることを証明する実験結果を示す。図５Ａ−５Ｃは、ＳＲＢ複合体の精製法および精製の結果を示す。図６Ａ−６Ｅは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素がＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび開始因子の複合体であることを証明する実験結果を示す。図７Ａおよび７Ｂは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素による転写がＧＡＬ４ −ＶＰ１６によって刺激されることを証明する実験結果を示す。図８は、ＣＴＤトランケーション突然変異体の遺伝子外サプレッサーを要約している。図９は、ＳＲＢ７のＤＮＡ配列および予測されるアミノ酸配列（配列番号：９および１０）を示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＳＲＢ８のＤＮＡ配列および予測されるアミノ酸配列（配列番号：１１および１２）を示す。図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、ＳＲＢ９のＤＮＡ配列および予測されるアミノ酸配列（配列番号：１３および１４）を示す。図１２は、ＳＲＢ１０のＤＮＡ配列および予測されるアミノ酸配列（配列番号：１５および１６）を示す。図１３は、ＳＲＢ１１のＤＮＡ配列および予測されるアミノ酸配列（配列番号：１７および１８）を示す。図１４は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤトランケーション突然変異体の増殖表現型におけるＳＲＢ２およびＳＲＢ８対立遺伝子の影響を示す。図１５Ａおよび１５Ｂは、ＳＲＢ２およびＳＲＢ４−ＳＲＢ９がＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の成分であることを示す。図１６はＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素モデルを表す。図１７Ａは、ｈＳＲＢ７のＤＮＡ配列（配列番号：３６）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：３７）を示す。図１７Ｂは、ｈｓＳＲＢ７の予測されるアミノ酸配列とその酵母の同族体を比較している。発明の詳細な説明本発明は、部位特異的な遺伝子転写の開始が可能なＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の発見に関する。本発明において記載されるＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび１以上のレギュレーター蛋白質を含む多重サブユニット複合体である。重要には、本明細書で記載されたごとくに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は、真核生物での転写の開始において鍵となる役割を果たす。特異的には、本発明に記載される真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は高分子量（１−４Ｍｄ）で、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび１以上の調節蛋白質からなる多重サブユニット複合体である。本明細書で記載されるごとくに、該調節蛋白質はＳＲＢ蛋白質、ＳＷＩ蛋白質およびＳＮＦ蛋白質を含む。本明細書でＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、ＳＲＢ６、ＳＲＢ７、ＳＲＢ８、ＳＲＢ９、ＳＲＢ１０およびＳＲＢ１１と示されるＳＲＢ調節蛋白質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの活性の陽性レギュレーター（促進）および陰性レギュレーター（抑制）として作用する。該ＳＲＢ蛋白質はホロ酵素において複数の役割を持つ。該ＳＲＢｓはＲＮＡポリメラーゼＩＩと転写因子の間の相互作用を安定化させる調節の「接着剤」として働くことができる。またそれらは、おそらくＴＦＩＩＤにおけるＴＡＦｓに対する機能的アナログの様式でホロ酵素を供する転写アクチベーターに対してある程度の反応性を与える。さらに、該ＳＲＢｓは、例えば、ＣＴＤのリン酸化およびプロモーターのクリアランスなど、開始複合体の形成に続いて起こる結果を調節し得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび少なくとも１種のＳＲＢ蛋白質を含む真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は、遺伝子転写に関与する付加的蛋白質で補足された場合、有効な選択的転写を開始することができ、かつ転写アクチベーターに応答する。本明細書に記載される該ＳＷＩおよびＳＮＦ蛋白質は一まとめにＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と呼ばれ、典型的には、ＳＲＢ蛋白質と会合する複合体を形成する。ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質は、例えば、ＳＷＩ１、ＳＷＩ２／ＳＮＦ２、ＳＷＩ３、ＳＮＦ５、ＳＮＦ６およびＳＮＦ１１を含み得る。また、ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質は、付加的調節蛋白質またはホロ酵素に対して遺伝子転写活性を供するのに必要かつ十分な成分を含み得る。本明細書に記載される該ＳＷＩおよびＳＮＦ蛋白質は遺伝子転写活性に関与し、染色質再構成に関係している。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、少なくとも１種のＳＲＢ蛋白質および少なくとも１種のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質を含む真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は、ＡＴＰ依存ヌクレオソーム分裂活性能を持つ。遺伝子転写に関与する蛋白質は、下記に記載される３つのグループに分類され得る：１．）転写段階のある部分または全てに必要とされるが、個々のプロモーターに対して特異的ではないＲＮＡポリメラーゼのサブユニット；２．）遊離酵素の一部ではないが、それが開始複合体を形成する前、形成中、または形成した後にＲＮＡポリメラーゼに結合する転写因子（これらの因子は転写が全てのプロモーターで開始するために、または例えば終結するために転写に必要とされると思われる）；３．）標的プロモーターにおける特異的配列に結合する転写因子。（もし同一の配列が全てのプロモーターに存在するならば、これらの因子は基本転写装置の一部であろう。もしいくつかの配列が特定のプロモーターのクラスにのみ存在するならば、それらと認められる因子はそれらのプロモーターでの開始に対して特異的に必要とされる可能性がある。）また転写因子は、本明細書では開始因子とも呼ばれる。本明細書に記載されるＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素と会合する基本転写因子は、例えば、酵母においては、転写因子ｂ、ｅ並びにｇ、およびヒトを含む哺乳類においては、哺乳類転写因子ＴＦＩＩＨ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＥおよびＴＦＩＩＦを含む。ホロ酵素の基本転写因子との会合は転写プロセス中の異なる時点における細胞間で様々であり、または生物によっても様々であると考えられる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は、ヒトにおいてはＴＦＩＩＥおよびＴＡＴＡ−結合蛋白質とであるが、酵母においては転写因子ａと相互作用する（また本明細書では会合する、または補足するとも言われる）場合、遺伝子転写を開始することができる。（またＴＡＴＡ−結合蛋白質も本明細書ではＴＢＰと呼ばれ、これはプロモーターＤＮＡと選択的に結合するＴＢＰ会合因子（ＴＡＦｓ）を含むＴＦＩＩＤ多重サブユニット複合体の成分である。）驚くべきことに、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素はＧＡＬ４−ＶＰ１６アクチベーター蛋白質のごときアクチベーターに応答し、この特徴は精製された酵母ＧＴＦｓおよびポリメラーゼＩＩ単独を用いた場合は観察されない。かくして、該真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は、ＧＡＬ１１／ＳＰＴ１３のごとき転写アクチベーターに応答するために必要かつ十分な付加的成分と会合し得る。また該ホロ酵素もキナーゼ−サイクリン蛋白質対のごとき転写抑制に関係する蛋白質と会合させることができる(Liao，S．M.ら，Nature 374:193-196(1995); Kuchin，S.ら，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A. 92:4587-4590(1995))。本発明はＳＲＢ蛋白質ＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、ＳＲＢ６、ＳＲＢ７、ＳＲＢ８、ＳＲＢ９、ＳＲＢ１０およびＳＲＢ１１、該ＳＲＢアミノ酸配列、並びにそれらの変異体または誘導体を包含する。また、本発明によって包含されようとするもので、特異的なＳＲＢアミノ酸配列、並びに該アミノ酸配列に１以上の「サイレント変異」を含むＳＲＢ蛋白質に対する参照とともに本明細書で記載される蛋白質がある。アミノ酸配列におけるかかるサイレント変異は、本発明に記載する正確なＳＲＢアミノ酸配列を反映しなくてもよいが、やはり、ＳＲＢ蛋白質、すなわち転写レギュレーターとしての必須機能、または活性を変更しない。例えば、本明細書に記載するＳＲＢアミノ酸配列由来のアミノ酸配列において、遺伝子転写のレギュレーターとして機能する能力が依然として残っていれば、１以上のアミノ酸残基が異なってもよい。また、ＳＲＢ蛋白質をコードするＤＮＡおよびＲＮＡ配列、これらのＤＮＡ／ＲＮＡ配列に対する相補鎖、およびＳＲＢＤＮＡ／ＲＮＡ配列と選択的にハイブリダイズするためのＳＲＢＤＮＡ／ＲＮＡ配列に十分相補性のある核酸配列（例えば、核酸プローブ）も本発明によって包含される。本明細書で定義される十分な相補性とは、該核酸配列が本明細書に記載される正確な配列を反映していなくともよいが、ＳＢＲ蛋白質をコードする配列とハイブリダイズするために十分相補的でなければならないことを意味する。例えば、該配列が依然として正確なＳＲＢ配列とハイブリダイズするために十分な相補性を有していれば、正確なＳＲＢＤＮＡ配列中に非相補的塩基が挿入されてもよく、もしくは、配列が正確なＳＲＢ配列よりも長くても、または短くてもよい。さらに本発明は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤと会合し、遺伝子発現を調節するＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体を包含する。より特異的には、本発明によって包含されるのは、１以上のＳＡＢ蛋白質、または１以上のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質を含む多重サブユニット（例えば、複合蛋白質）複合体であり、例えば染色質再構成、またはヌクレオソーム分裂によって、遺伝子転写を開始する能力を持つ。さらに本発明は、１以上のＳＲＢ蛋白質、ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質、またはＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ／ＲＮＡと結合する、もしくは相互作用する物質によって遺伝子転写を修飾する方法に関し、かくして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、もしくは遺伝子転写に不可欠な他の転写因子におけるＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の影響を修飾する。本明細書で用いるごとき相互作用は、ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の転写後修飾の阻害または促進を含む。例えば、ＳＲＢ蛋白質を介したＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣＴＤのリン酸化の阻害、またはＳＲＢ蛋白質自身のリン酸化／活性化の阻害によって細胞の遺伝子転写を阻害する方法が本発明によって包含される。１以上のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質、もしくはこれらの調節蛋白質をコードするＤＮＡ／ＲＮＡと結合する、または相互作用する物質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の形成を阻害、もしくは助長することができ、かくして、遺伝子転写が阻害または促進される。例えば、ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズし、かつ、それらの翻訳または転写を完全に阻害する、もしくは低下させるアンチセンス、またはノンセンスヌクレオチド配列は、該ホロ酵素複合体の形成を阻害し、遺伝子転写を阻害することができる。別法として、たとえホロ酵素複合体が形成されたとしても、ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と結合する、もしくは相互作用する物質は、転写プロセスにおいて該複合体の機能を阻害または促進できる。これらの物質は、ＳＲＢ蛋白質と反応する、もしくは結合する抗体を含む。宿主における遺伝子転写を修飾することなく、真核病原体のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質との相互作用により遺伝子転写を修飾する治療成分を同定および／または設計され得ることに注目することが重要である。また本発明は、精製されたＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を用いるイン・ビトロでの転写方法、および遺伝子転写を修飾する自然発生の、および合成の両物質の同定に対するこの方法の使用に関する。また本発明は、本明細書に記載されるＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の機能的同等体であり、従って、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に対して同等である活性を有する付加的成分、または蛋白質を同定する方法も包含する。さらに本発明は、遺伝子転写を修飾する物質を同定する方法、およびＳＲＢ蛋白質の生産の不足もしくは増加、または異常なＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の生産に起因する疾病状態を治療する方法に関する。これらの方法は、ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と結合する、もしくは相互作用する物質、（自然発生のおよび生物学的に活性のある、本明細書では野生型ＳＲＢ蛋白質とも呼ばれる）ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードする遺伝子、ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦメッセンジャーＲＮＡの使用、もしくは遺伝子学的に改変されたＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の使用を含む。さらに本発明は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素において欠失したＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質を補足するための候補蛋白質の活性を評価することにより、ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性と機能的に同等な活性を有する成分を同定する方法を包含する。さらに特異的には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素におけるＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性を部分的または完全ののいずれかで阻害し；ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質活性について試験すべき候補蛋白質を提供し；該候補蛋白質をＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素と会合させ；次いで、候補蛋白質と会合したＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の活性を測定し、ここにもし該候補蛋白質が阻害されたＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に対して機能的に同等であれば、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は遺伝子転写を開始するその能力を維持していることを特徴とする、ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性と機能的に同等な活性を有する蛋白質を同定する方法を包含する。遺伝子転写を修飾する新規なＳＲＢ蛋白質の発見は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩカルボキシル末端ドメイン（ＣＴＤ）機能に関与する転写因子を同定するために設計された、遺伝子学的および生物学的選択法の組み合わせにより可能となった。全てでなくともこれらの蛋白質のほとんどは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素と強固に会合する。ＳＲＢ蛋白質のうち、転写の開始においてＣＴＤ会合因子として２つの役割を示す陽性および陰性双方のレギュレーターがある。該ＣＴＤは高度に保存され、かつ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの最大のサブユニットの明確な特異的特性を持つ。生物により、該ＣＴＤは共通ヘプタペプチド配列Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒの約５２を超える繰り返しを含む。酵母および哺乳類細胞におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩ分子のサブセットは顕著にリン酸化されたＣＴＤｓを持ち、かつ、ＣＴＤにおいてリン酸化を欠くＲＮＡポリメラーゼＩＩ分子は好ましくは開始複合体に補充される。ＣＴＤのほとんど、または全てを除去する欠失突然変異は細胞にとって致死的である。しかしながら、ＣＴＤ部分トランケーション突然変異は、イン・ビボでは増殖および遺伝子発現に欠損を引き起こし、イン・ビトロでは複数プロモーターでの転写開始に本質的欠損を起こした。かくして、酵母における条件ＣＴＤトランケーション突然変異抑圧分析が、ＣＴＤ機能に影響を及ぼす因子を同定するために用いられてきた。ＳＲＢ２のクローン化および配列分析サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤトランケーション突然変異のサプレッサーの単離は、優性抑圧対立遺伝子、ＳＲＢ２−１の同定、並びにＳＲＢ２−１およびその野生型相対物、ＳＲＢ２を含むＤＮＡクローンの単離をもたらした(Nonet，M．L.および Young，R． A.，Genetics 123:715-724(1989))。ゲノムＤＮＡクローン内のＳＲＢ２の位置は図１Ａで示されている。図１Ｂ（配列番号：１）に示されたごとくに、ＳＲＢ２およびそれを取り巻くＤＮＡについて配列が決定された。ＳＲＢ２遺伝子はＴＢＰ結合蛋白質をコードすることが示された(Koleske，A．J.ら，Cell 69:883-8 94(1992))。予測されるＳＲＢ２蛋白質は２１０個のアミノ酸長（配列番号：２）で、２３ｋｄの分子量を有する。それはセリン、トレオニンおよびチロシン残基豊富な親水性蛋白質であり、それは酸性であり、予測ｐＫ_a５．２を有する（実施例１参照）。実施例１に記載したごとくに、ＳＲＢ２遺伝子はＣＴＤトランケーション突然変異の遺伝子外サプレッサーの分析を通じて同定された。優性の機能増大突然変異ＳＲＢ２−１は、特異的にＣＴＤトランケーション突然変異を抑圧する。ＳＲＢ２を欠く細胞およびＣＴＤの大部分を欠く細胞は、条件増殖表現型の同一セットを示し、かつ、遺伝子発現において同一の欠失を有する（図２参照）。ＳＲＢ２−１の存在は甚だしいＣＴＤトランケーションを持つ細胞にあたかもＣＴＤがより長いかのごとくに挙動させ、ＳＲＢ２の欠損はその反対の結果を持つ。ＳＲＢ２サプレッサーの対立遺伝子の特異性、ＣＴＤトランケーションを持つ細胞の同様の挙動、およびＳＲＢ２を欠く細胞は全て、ＳＲＢ２およびＣＴＤが開始中の同一のプロセスに関与していることを示している。実施例２に記載されたごとくに、ＣＴＤ機能に影響を及ぼす転写装置の付加的成分を同定するために、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia e)ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤトランケーション突然変異の遺伝子外サプレッサーが単離された。完全ヘプタペプチドリピート（ｒｐｂ１△１０４）を１１個しか持たない、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤｓを含む細胞の低温感受性表現型が開発され、８５個の独立した抑圧単離物が得られ、そのうちおよそ３分の１が優性および３分の２が劣性であった。優性の抑圧単離物はさらなる研究のために選択された。遺伝学的分析が優性突然変異の全てが４つのＳＲＢ遺伝子：ＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５およびＳＲＢ６で起こったことを明らかにした。２つの遺伝学的アッセイを行い、新たなＳＲＢ遺伝子産物とＣＴＤの間の機能的関係について支持を得た。ＳＲＢ４、ＳＲＢ５およびＳＲＢ６の抑圧対立遺伝子のＣＴＤトランケーション突然変異ｒｐｂ１△１０４と会合した表現型の全てを抑圧する能力が調べられた。これらの表現型は、低温および温度感受性増殖、イノシトール栄養要求性突然変異体、および炭素源としてのピルビン酸の利用不能を含む。ＳＲＢ４−１、ＳＲＢ５−１またはＳＲＢ６−１のいずれかを含む細胞は、ＳＲＢ２−１のごとき、これらの欠失表現型の全てを抑圧する。ＳＲＢ４−１、ＳＲＢ５−１およびＳＲＢ６−１の抑圧アクチベーターがＣＴＤ突然変異に特異的かどうかを評価するために、ＳＲＢ対立遺伝子のＲＮＡポリメラーゼＩＩ中の他の場所で突然変異と会合した条件表現型を抑圧する能力が調べられた。一般的に、ＳＲＢ４−１、ＳＲＢ５−１およびＳＲＢ６−１は、ｒｐｂ１点突然変異と会合した条件表現型および栄養要求性表現型を抑圧しない。ＳＲＢ４−１、ＳＲＢ５−１およびＳＲＢ６−１は、ｒｐｂ１−１４突然変異の低温感受性表現型を抑圧する。これはＳＲＢ２−１によって示された同一のタイプの抑圧特異性であり、このことはＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、ＳＲＢ６およびＣＴＤが転写開始における同一のプロセスに関与することを示す。ＳＲＢ４、ＳＲＢ５およびＳＲＢ６のクローン化および配列分析ＣＴＤトランケーション突然変異ｒｐｂ１△１０４を含む細胞の低温感受性表現型が優先的に抑圧されるそれらの能力の優位性を利用することによって、ＳＲＢ４−１、ＳＲＢ５−１およびＳＲＢ６−１を含むゲノムＤＮＡクローンが単離された。ゲノムＤＮＡは、優性のＳＲＢ４、ＳＲＢ５およびＳＲＢ６の抑圧対立遺伝子を含む株から単離された。ライブラリーは選択マーカーとしてＵＲＡ３遺伝子を含む酵母の動原体プラスミドにおいて構築された。これらのライブラリーは低温感受性ＣＴＤトランケーション突然変異を含む酵母細胞に形質転換され、１２℃で増殖可能なＵｒａ⁺形質転換体からゲノムクローンが単離された。ＳＲＢ４−１、ＳＲＢ５−１およびＳＲＢ６−１ゲノム挿入の断片を持つサブゲノムライブラリーを構築し、再度１２℃で増殖可能なＵｒａ⁺形質転換体について選択することにより、さらに突然変異遺伝子の位置を突き止めた。ＳＲＢ４の野生型対立遺伝子は、野生型ゲノムＤＮＡライブラリーからクローン化した。野生型ＳＲＢ５およびＳＲＢ６対立遺伝子は、イン・ビボでプラスミドギャップを修復することにより得られた。野生型ＳＲＢ４、ＳＲＢ５およびＳＲＢ６遺伝子を含むプラスミドは、ＣＴＤトランケーション突然変異の低温感受性表現型を抑圧せず、このことは各々の場合で正確な遺伝子座がクローン化されることを確信した。ＳＲＢ４、ＳＲＢ５およびＳＲＢ６は（ L．Rilesおよび M ．Olson，ワシントン大学によって提供された）酵母ゲノムのプライム・クローン・グリッド・フィルター(prime clone grid filters)を用いて物理的にマッピングされた。ＳＲＢ４は染色体Ｖの右腕、動原体からおよそ４０ｋｂにマッピングされる（λクローン５９６１および６２２４）。ＳＲＢ５は染色体ＶＩＩの右腕、ＳＰＴ６に近い動原体からおよそ３０ｋｂにマッピングされる（λクローン５１４６および４６２４）。ＳＲＢ６は染色体ＩＩの右腕、ＣＤＣ２８から離れた動原体からおよそ７５ｋｂにマッピングされる（λクローン４７９６）。ＳＲＢ４（配列番号：３）、ＳＲＢ５（配列番号：５）、およびＳＲＢ６（配列番号：７）を含むＤＮＡ断片が配列決定され、オープンリーディングフレームが一方向性欠失分析および抑圧突然変異の同定によって確立された。予測されるＳＲＢ４蛋白質は６８７個のアミノ酸長（配列番号：４）であり、７８ｋｄの分子量を有する（図２Ａ）。ＳＲＢ５は３０７個のアミノ酸長（配列番号：６）で、３４ｋｄの分子量を有すると予測される（図２Ｂ）。予測されるＳＲＢ６蛋白質は１２１個のアミノ酸長（配列番号：８）であり、１４ｋｄの分子量を有する（図２Ｃ）。配列データバンクは、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５およびＳＲＢ６が従前に同定された蛋白質と同じ重要な配列を持っていないことを明らかにした。１つの注目に値するＳＲＢ蛋白質の特性は、それらの酸性内容物である。ＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５およびＳＲＢ６の予測ｐＫ値は、５．２、５．１、４．７および４．６である。３つの遺伝子全てにおいて抑圧突然変異が、クローン化された野生型およびＳＲＢ４、ＳＲＢ５およびＳＲＢ６の抑圧対立遺伝子の全配列を比較することにより同定された。各々の場合において、変異はシングルポイントのミスセンス突然変異であった。ＳＲＢ４−１における突然変異は、グリシン３５３からシステインへ変異する。ＳＲＢ５−１突然変異は、トレオニン２２からイソロイシンへ変異し、ＳＲＢ６−１突然変異はアスパラギン８６からリシンへ変異する。ＳＲＢ遺伝子が細胞活性に必須であるかどうかを決定するために、ＳＲＢ遺伝子の全コーディング領域を欠失させてｓｒｂ４Δ２、ｓｒｂ５Δ１およびｓｒｂ６△１を作成した。ＳＲＢ４およびＳＲＢ６は必須であった。ＳＲＢ２同様ＳＲＢ５は必須ではないが、該遺伝子を欠く細胞は、緩慢な−１６増殖、低温感受性および温度感受性表現型というＣＴＤトランケーションの特性を呈する。ＳＲＢ２およびＳＲＢ５はイン・ビトロにおける有効な転写に必要とされるＳＲＢ４またはＳＲＢ６を欠く酵母細胞には活性はないが、ＳＲＢ２またはＳＲＢ５を欠く細胞は、顕著な増殖における欠損にもかかわらず活性があり、この特性がイン・ビトロでの未知の抽出物を用いるＳＲＢ２およびＳＲＢ５の転写活性の実験を容易にしている。従前の研究はＳＲＢ２が有効な基礎に必要とされ、イン・ビトロで転写開始を活性化することを明らかにした。ＳＲＢ５の役割が同様に実験され、また実施例２に記載するごとくに、有効な基礎に必要とされ、イン・ビトロで転写開始を活性化することも判明した（図３Ａ参照）。核抽出物が野生型およびｓｒｂ５△１細胞から調製され、次いで精製された組換えＳＲＢ５およびＧＡＬ４−ＶＰ１６蛋白質の存在および不在下で、それらの特異的転写物を合成する能力について試験した。野生型細胞からの抽出物は３７５および３５０ｎｔの２種の特異的転写物を産生し、ＧＡＬ４−ＶＰ１６の付加はこれらの転写物レベルを３５倍増加させた。ｓｒｂ５△１細胞からの抽出物は、ＧＡＬ４− ＶＰ１６の存在および不在下の両方の場合で、有意なレベルの特異的転写物を合成するために、付加的因子を必要とした（図３Ｂおよび３Ｃ）。ｓｒｂ５△１抽出物の補足性は精製された組換えＳＲＢ２およびＳＲＢ５の双方を要求し；ＳＲＢ５単独の添加では補足できなかった。ウエスタンブロット分析はｓｒｂ５△１細胞から調製された抽出物では、ＳＲＢ２蛋白質のレベルが徐々に低下することを明らかにした。これらの結果を確認し拡張するために、ＳＲＢ２およびＳＲＢ５を欠く細胞から調製された未知の抽出物を用いて、付加転写アッセイを行った（図３Ｄおよび３Ｅ）。ＳＲＢ蛋白質を欠く細胞からの抽出物を用いて得られた結果は、ｓｒｂ５△１細胞からの抽出物で得られた結果に一致した。これらの抽出物はプロモーター非依存性転写伸張アッセイにおいていかなる欠損も示さなかった。これらの結果はＳＲＢ２およびＳＲＢ５の双方が有効な基礎を必要とし、イン・ビトロでの転写開始を活性化することが示された。ＳＲＢ２およびＳＲＢ５を含む安定した前開始複合体の形成ＳＲＢ２およびＳＲＢ５が転写開始複合体の形成に加わるかどうかを調べるために、テンプレートコミットメントアッセイを用いた（図４Ａおよび４Ｂ）。ＳＲＢ２およびＳＲＢ５を欠く細胞から調製された抽出物をこのアッセイを行うために用いた。使用された２種の鋳型はＧ−欠損カセット長が異なる以外は同一のプロモーターを含んだ。３７５および３５０ｎｔの特異的転写物は長い鋳型から作成し、一方２７５および２５０ｎｔの転写物は短い鋳型から作成した。まず、先に記載したごとくに、ＳＲＢ２が安定した前開始複合体の有効な形成に必要とされることを確認するために実験を行った（図４Ａ）。２種の鋳型は別々に未知の抽出物およびＳＲＢ５とともにインキュベートし、次いで、制限量のＳＲＢ２蛋白質を２種の反応混合物のうち１つに添加した。６０分間プレイインキュベートした後、２つの反応物を一緒に混合した。混合後直ちにおよび１０分毎に、アリコートを採取し、ヌクレオチド三リン酸を添加してＲＮＡ合成を行わせた。複数回の転写を最小にするため、７分後に反応を停止させた。対照実験はレーン１−４に示されている。ｓｒｂ２△１、ｓｒｂ５△１抽出物をＳＲＢ２およびＳＲＢ５単独で、長い鋳型（図４Ａ、レーン１）または短い鋳型（図４Ａ、レーン２）のいずれかとともにプレインキュベートした場合、予測されたサイズの転写物が作成された。長い鋳型および短い鋳型の双方がプレインキュベート混合物に存在する場合、同レベルの長い鋳型および短い鋳型転写物が得られた（図４Ａ、レーン３）。両鋳型をＳＲＢ５単独の存在下で抽出物とともにプレインキュベートした場合、実質的には転写物は検出されなかった（図４Ａ、レーン４）。長い鋳型の混合物にＳＲＢ２を添加した場合、２つの混合物を混合した後、長い転写物が優勢となった（図４Ａ、レーン５−８）。長い鋳型との混合３０分後、短い鋳型からのシグナルに認められるほどの増加はなかった。同様に、ＳＲＢ２を短い鋳型に添加した場合、混合３０分後長い鋳型からのシグナルに認められるほどの増加はなかったものの、短い鋳型からは転写物が優先的に産生された（図４Ａ、レーン９−１２）。ＳＲＢ５が有効な前開始複合体形成に必要とされるかどうかを決定するために、同様の実験を行った（図４Ｂ）。この時、２種の鋳型は抽出物およびＳＲＢ２とともに別々にインキュベートされ、２種の反応混合物のうち１つに制限量のＳＲＢ５を添加した。残りの工程は上に記載したごとくに行った。対照区の結果（図４Ｂ、レーン１−４）は、図４Ａの結果と一致した。図４Ｂのレーン５−１２は転写物がＳＲＢ５の存在下でプレインキュベートされた鋳型から優先的に得られ、かつ、ＳＲＢ５の不在下でインキュベートされた鋳型からは３０分後でもシグナルの有意な増加がなかったことを示している。テンプレートコミットメントアッセイの結果は、安定した前開始複合体の形成のためにＳＲＢ２およびＳＲＢ５の双方が必要とされ、ＳＲＢ２およびＳＲＢ５が開始反応において化学量論的に作用することを示す。これらの結論は２つの観察に基づいている。第一に、全ての必要因子の存在下でプレインキュベートされた鋳型は、ＳＲＢ２またはＳＲＢ５のいずれかの不在下でインキュベートされた他の鋳型に比べ、混合の際に優先的に転写された。第二に、混合に引き続き、ＳＲＢ２またはＳＲＢ５のいずれかの不在下でインキュベートされた鋳型からの認められるほどのシグナルの増加はなかった。鋳型混合後３０分を超えてインキュベーションし、二次鋳型で進行すべきいかなる触媒活性にも十分な時間があったので、もしＳＲＢ２またはＳＲＢ５が開始に引き続いて作用したならば、該鋳型は同等に十分転写されたであろう。３０分後でも二次鋳型の転写における増加がほとんどなかったという観察は、ＳＲＢ２およびＳＲＢ５がプレインキュベートの間、一次鋳型と安定して会合していたことを示している。プレインキュベーション工程に過剰なＳＲＢ２を用いて図４Ａの実験を行った場合、ＳＲＢ２の不在下でプレインキュベートされた鋳型からの転写が時間とともに増加した。同様に、プレインキュベーション工程に過剰なＳＲＢ５を用いて図４Ｂの実験を行った場合、ＳＲＢ５の不在下でプレインキュベートされた鋳型からの転写が時間とともに増加した。このことはＳＲＢ２またはＳＲＢ５の不在下でプレインキュベートされた鋳型のほとんどが、依然として転写に有用であり、ＳＲＢ２およびＳＲＢ５が反応混合物中で長時間の間活性化され続けていたことを示す。これらのデータは、ＳＲＢ２およびＳＲＢ５が前開始複合体の絶対必要な成分であることを示唆している。ＳＲＢ蛋白質、ＴＢＰおよびＲＮＡポリメラーゼは１．２Ｍｄ複合体の成分であるＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５およびＳＲＢ６における突然変異のＣＴＤトランケーションを持つ細胞の増殖表現型を特異的に抑圧する能力は、これらの遺伝子がＣＴＤと同一の機能プロセスに関与していることを示している。テンプレートコミットメントアッセイはＳＲＢ２およびＳＲＢ５が転写開始複合体の成分であることを示唆している。これらの機能的研究はＳＲＢ蛋白質がお互いに物理的に相互作用するかどうかという実験につながった。機能的、エピトープ標識ＳＲＢ４、ＳＲＢ５またはＳＲＢ６蛋白質を提供する細胞が構築され、次いで、転写的に完全な核抽出物がこれらの細胞から調製された。ＳＲＢ４、ＳＲＢ５またはＳＲＢ６を免疫沈降した場合、イムノブロッティングによって明らかにされたごとくに、抽出物中のＳＲＢ２および５％−１０％のＴＢＰが沈降した。この観察は４種のＳＲＢ蛋白質およびＴＢＰが、通常のクロマトグラフィーによる野生型細胞からのＳＲＢ蛋白質の精製の試みにつながる、多重サブユニット複合体の成分であることを示唆している。野生型細胞からの全細胞抽出が一連の７つのクロマトグラフィーカラムを通じて分画され、次いで、組換えＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５およびＳＲＢ６に対して、並びに組換えＴＢＰに対して作成されたウサギポリクローナル抗体を精製中これらの蛋白質をモニターするために用いた（図５Ａ）。本質的には、全細胞抽出物におけるＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５およびＳＲＢ６の全てが７つの精製工程を通じて分画された。抽出物中にＴＢＰ部分を含む、およそ２０個の付加的ポリペプチドが４種のＳＲＢ蛋白質とともに分画された。これらの付加的ポリペプチドのサブセットは、ウエスタンブロット分析によってＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットとして同定された。ＴＢＰ、ＳＲＢ蛋白質およびＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む高分子量複合体は非常に安定であることが明らかになった。この複合体中の蛋白質は、１．１Ｍを超える塩濃度の酢酸カリウムにおいて、および４００ｍＭ酢酸カリウムを含む緩衝液中でのゲル濾過において強力なイオン交換に曝されたフラクション中で依然として強固に会合していた。例えば、図５Ｃは、ＭｏｎｏＳカラムからのＴＢＰ、ＳＲＢ蛋白質およびＲＮＡポリメラーゼＩＩ溶出プロフィールを示す。該複合体は定量的ウエスタンブロット分析によっておよそ１０、０００倍に精製されたと評価される。該複合体の構造はＭｏｎｏＳカラムに引き続くクロマトグラフィー上で変化しなかったので、該複合体は均質近くまで精製されると考えられる。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６上のゲル濾過により、これらほぼ２ダースのポリペプチドが約１．２Ｍｄの固有の分子量に一致する位置で複合体として共泳動することが明らかになった。該複合体成分と思われるポリペプチドバンドの見かけの分子量の合計は１．４Ｍｄであり、ゲル濾過によって予測されたサイズからなるＲＮＡポリメラーゼＩＩがおよそ０．５Ｍｄであると思われるので、残りの複合体は０．７−０．９Ｍｄの質量を持つ。１．２Ｍｄ複合体の成分は、イン・ビトロでＳＲＢおよびＲＮＡポリメラーゼの両活性を持つ。１．２Ｍｄ複合体はＳＲＢ２およびＳＲＢ５を欠く核抽出物を補足することができる。この分析において、該複合体における天然のＳＲＢ２およびＳＲＢ５の特異的活性は、組換えＳＲＢ２およびＳＲＢ５蛋白質のそれの１００倍であった。該複合体のＲＮＡポリメラーゼ活性は、非特異的転写アッセイにおいて同量の精製酵素を用いて得られたものに匹敵している。ＣＴＤカラムは特異的にＴＢＰ含有多重サブユニット複合体を保持するＣＴＤがＴＢＰと相互作用するという事実とともに、ＴＢＰ含有多重サブユニット複合体におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＳＲＢ蛋白質の存在は、ＳＲＢ−ＴＢＰ複合体がＣＴＤを介して物理的にＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用し得ることを示唆している。この可能性を調べるために、酵母の全細胞抽出物を組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＣＴＤ融合蛋白質またはＧＳＴ単独を含有するカラムに充填した。該カラムを広範囲にわたって洗浄し、次いで、結合蛋白質を低濃度のグアニジン塩酸塩で溶出させた。ＧＳＴ−ＣＴＤカラムに特異的に結合する蛋白質は高塩濃度（２Ｍ酢酸カリウム）を含有する緩衝液で溶出させることはできなかったので、溶出のためにグアニジン塩酸塩（０．３Ｍ）を用いた。ＧＳＴ−ＣＴＤアフィニティーカラムに特異的に結合する蛋白質は、４種のＳＲＢポリペプチド、ＴＢＰおよび少なくとも１ダースの付加的ポリペプチドを含む。これらの蛋白質の多くは、通常のクロマトグラフィーによって精製されたＴＢＰ含有多重サブユニット複合体の成分であると思われる。ＲＮＡポリメラーゼIIホロ酵素はアクチベーターに応答するイン・ビボおよびイン・ビトロでの転写開始において不可欠な役割を果たすＳＲＢ蛋白質は、高分子量の複合体中でＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび付加的な未同定のポリペプチドとともに共精製される。転写開始におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩ−含有複合体の役割をさらに調べるために、イン・ビトロにおける選択的転写に必要な付加的成分に対する調査を行った。ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素および因子ａは、実施例２に記載されたごとくに、およびSayre，M.H.ら，J ． Biol．Chem. 267:23383-23387(1992)に記載されたごとくに精製された。該複合体は類似量のＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＳＲＢ蛋白質分子を含むが、不足当量のＴＢＰしか含まないので、イン・ビトロでの転写を助けるためＴＢＰレベルが補足される必要があった。（実施例３を参照）。プロモーター−含有ＤＮＡの特異的な転写は組換えＴＢＰおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ−含有複合体に対応する酵母全細胞由来画分の添加に続いて得られた。この活性の精製は、それが、クロマトグラフィーの挙動および大きさ（６６ｋＤおよび４３ｋＤ）が因子ａ、ＴＦＩＩＥの酵母相同体に関して記載されているものと同一である、２つのポリペプチドから成ることを明らかにした。かくして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ−含有複合体は、新規な形状の酵素が、酵母ＴＢＰおよび転写因子ａを補足した場合に部位特異的な開始が可能であることを表す。精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩは選択的な転写の開始のために複数の基本転写因子の援助を要求するので、これらの結果は、高分子量ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体がその複合体に予め組み込まれたこれらの基本因子のいくつかを含み、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を産生することを示唆した。該基本転写因子のどのサブセットが高分子量複合体中でＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＳＲＢ蛋白質と会合しているかをさらに調べた。該基本転写因子は、ＴＡＴＡまたは開始モチーフのごとき一般的なプロモーター要素と結合する。これらの蛋白質因子には、限定されるものではないが、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＧおよびＴＦＩＩＨが含まれる。５つの基本因子（ａ、ｂ、ｄ、ｅ、およびｇ）は、イン・ビトロにおいて酵母ＲＮＡポリメラーゼＩＩに正確に転写を開始させるのに十分である。ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の最終精製段階からのカラム画分を再構築した転写反応の下で試験し、酵母開始因子に特異的な抗血清を用いたウエスタンブロット分析に付した（図６Ａ）。転写活性は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、およびＳＲＢ６蛋白質と共溶出した。また、該活性は４１ｋｄの酵母因子ａ（ＴＦＩＩＢ）蛋白質および７３ｋＤの酵母因子ｂのＴＦＢ１サブユニット（ＴＦＩＩＨ）と共溶出した。因子ｇ（ＴＦＩＩＦ）に対して特異的な抗血清はいまだ入手不可能であるが、該精製複合体（図６Ｂ）は、その大きさが精製因子ｇ（１０５、５５、および３０Ｋｄ）のサブユニットとして報告されたものと一致する３つのポリペプチドを含む。さらに、ＴＦＩＩＦおよびＴＦＩＩＨはヒトのＲＮＡポリメラーゼＩＩによる直鎖鋳型の転写には不可欠であり、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素が直鎖鋳型を転写し得ることが判明し、このことは該ホロ酵素がＴＦＩＩＦおよびＴＦＩＩＨと相同な活性を含むという推論を支持する。ひとまとめにして考えると、これらの結果は、精製複合体が複数のＳＲＢ蛋白質と、かつ因子ｂ、ｅ、およびｇ（ＴＦＩＩＨ、ＴＦＩＩＢ、およびＴＦＩＩＦ）と強固に会合しているＲＮＡポリメラーゼＩＩの形状を表すこと、ならびにＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素のこの形状が因子ａ（ＴＦＩＩＥ）およびＴＢＰを補足した場合に転写を正確に開始できることを示している。該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は非常に安定な複合体であり、６種のイオン交換カラムを通すクロマトグラフィーにおいても損なわれず、ゲル濾過において単一の１．２Ｍｄの複合体として移動する。単一の多重サブユニット複合体からなるホロ酵素を確認するために、免疫沈降実験を行った。４つのＳＲＢ蛋白質、因子ｅ（ＴＦＩＩＢ）、因子ｂ（ＴＦＩＩＨ）のＴＦＢ１サブユニット、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩは全て、抗−ＳＲＢ５抗体を用いてＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の精製標品から特異的に共免疫沈降することが判明した（図６Ｃ）。該複合体を他のホロ酵素成分に対する抗体で共免疫沈降させた場合に同様の結果が得られた。該ホロ酵素標品は、およそ当モル量のＳＲＢ２、ＳＲＢ５、因子ｅ（ＴＦＩＩＢ）およびＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む（図６Ｄおよび６Ｅ）。高度に精製されたホロ酵素は、有意な量のＴＢＰまたは酵母ＴＦＩＩＡのＴＯＡ１サブユニットを含まない（図６Ｄ）。いくつかのＴＢＰが多重サブユニット複合体と会合していることを従前に示したが、高度に精製されたホロ酵素は、５０分子のＲＮＡポリメラーゼＩＩ当たり１分子より少ないＴＢＰを含み、該ホロ酵素による転写が精製組換えＴＢＰの添加に絶対的に依存するという観察に一致する。該ホロ酵素の精製における各段階において、ＴＢＰの一部は該ホロ酵素とともにカラムから共溶出し、一方、該ＴＢＰの一部は遊離のＴＢＰとして溶出する。精製ホロ酵素は検出可能なＤＮＡを全く含まないので、この挙動はＤＮＡの不在下でＴＢＰのホロ酵素複合体との弱い相互作用を反映しているかもしれない。ＴＢＰはアフィニティーカラム上でＳＲＢ２、ＳＲＢ５、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤと結合することができ、ＴＢＰが該ホロ酵素のこれらの成分と物理的に相互作用していることを示唆する。また、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素が転写アクチベーターに応答する能力も調べられた。精製酵母ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび基本転写因子単独では転写アクチベーターに応答することはできない。該ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素、ＴＢＰ、および因子ａと再構築された反応中において、スーパーコイル状鋳型の転写が転写アクチベーターＧＡＬ４−ＶＰ１６によって５倍促進できた（図７Ａ）。線状化された鋳型がイン・ビトロでの転写に用いられた場合、同様の結果が得られた（図７Ｂ）。比較において、ＧＡＬ４−ＶＰ１６は同じ条件下で粗酵母核抽出物中のスーパーコイル状鋳型の転写を１０倍促進した（図７Ａ）。これらのデータは、該ホロ酵素の１以上の成分がＧＡＬ４−ＶＰ１６からの活性化シグナルに応答し得ることを示している。ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の存在は、その存在量が遊離ＲＮＡポリメラーゼＩＩより相対的に少ないために、おそらくは初期の検出から逃れた。全細胞抽出物中のＳＲＢ蛋白質のほとんどがＲＮＡポリメラーゼＩＩと複合体を形成しているが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの６％およびＴＦＩＩＢの１２％のみがホロ酵素中で発見された。該核ＲＮＡポリメラーゼは本来精製されて非特異的な転写アッセイに用いられ、該精製酵素による選択的な開始に直接必要である基本因子がその後同定された。対照的に、ホロ酵素の発見は、イン・ビボにおけるＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写に関与する因子の遺伝学的研究で始まった。その遺伝学的な実験は、イン・ビボにおけるＲＮＡポリメラーゼによる転写でのＳＲＢ蛋白質の生理学上の役割を証明した。生化学的な分析は、該ＳＲＢ蛋白質が不可欠な転写開始因子であること、および細胞中のＳＲＢ蛋白質のほとんどがホロ酵素内に含まれていることが明らかにした。酵母半数体細胞は活性プロモーターで転写を開始するに適切な量である、およそ１０００分子のホロ酵素を含むと評価される。しかしながら、該ホロ酵素によって転写される活性プロモーターの割合はまだ知られていない。いくつかのプロモーターで該ホロ酵素が優先的に利用される可能性がり、一方、遊離のＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび基本因子が他に段階的に介入している。細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩのかなりの画分が形成されつつある転写物の伸張に関与しており、少なくとも一部の酵素はＳＲＢ蛋白質と複合体を形成しないことを説明する。基本開始因子のサブセットで予め構築されたＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の存在は、転写の調節に関与する機構に包含される。アクチベーターは、少なくとも一部分は多重サブユニットＴＦＩＩＤとの相互作用を通じて機能すると思われる。該ホロ酵素は、遺伝子アクチベーターおよびプロモーターと結合したＴＦＩＩＤとの相互作用を通じて、プロモーターに効果的に補充される可能性がある。粗抽出物における活性化レベルは、精製ホロ酵素を用いて得られた活性化レベルより２倍を越えて大きい。この差異は該ホロ酵素とともに再構築された反応において、ＴＡＦｓの不在を反映しているかもしれない。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤトランケーション突然変異のサプレッサーサッカロミセス・セルビシエ(Saccharomyces cersvisiae)のＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤトランケーション突然変異体の遺伝子外サプレッサーが、ＣＴＤ機能に影響を及ぼす転写装置の付加的成分を同定するために単離された。（図８）。１１のみの完全ヘプタペプチド反復（ｒｐｂ１Δ１０４）を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤｓを含む細胞の低温感受性表現型を、そのおよそ３分の１が優性であり３分の２が劣性である８１の独立した抑圧単離物を得るために開発した。遺伝子分析は、少なくとも１０の遺伝子中の突然変異がトランケートされたＣＴＤを含む細胞の増殖欠損を抑制することを明らかにした。先に記載したごとくに、優性突然変異は、ＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、およびＳＲＢ６と呼ばれる４つの遺伝子中で発見されている。遺伝学的および分子的相補性分析を用いて、６種の付加的遺伝子：ＳＲＢ７、ＳＲＢ８、ＳＲＢ９、ＳＲＢ１０、ＳＲＢ１１およびＲＰＢ２が同定された。また、ＳＲＢ４およびＳＲＢ６の劣性抑圧対立遺伝子も同定された。この選択は飽和に近いと思われる。なぜなら、ＳＲＢ１１を除いて、各々１０種の遺伝子の１を超える非独立単離物が同定されているからである。劣性抑圧突然変異を含む遺伝子の同定およびクローン化は実施例４に提供されている。ＳＲＢ７、ＳＲＢ８、ＳＲＢ９、ＳＲＢ１０およびＳＲＢ１１は新たに同定された遺伝子であり、一方、ＲＰＢ２はＲＮＡポリメラーゼＩＩの二番目に大きなサブユニットをコードする遺伝子である。ＳＲＢ７、ＳＲＢ８、ＳＲＢ９およびＲＰＢ２の遺伝学的分析ＳＲＢ７、ＳＲＢ８、ＳＲＢ９およびＲＰＢ２の抑圧対立遺伝子（各々ｓｒｂ７−１、ｓｒｂ８−１、ｓｒｂ９−１およびｒｐｂ２−５５１）のＣＴＤトランケーション突然変異ｒｐｂ１△１０４と結びつけられた条件的表現型を抑圧する能力がさらに調べられた。これらの表現型は低温および温度感受性増殖および炭素源としてのピルビン酸の使用不能を含む。細胞の増殖表現型はＲＰＢ１ＣＴＤトランケーション突然変異およびｓｒｂ７−１、ｓｒｂ８−１、ｓｒｂ９−１またはｒｐｂ２−５５１を含む。細胞をＹＥＰＤ培地上にスポットし、１２℃、３０℃および３８℃、および唯一の炭素源としてピルビン酸を含むＳＣ培地でインキュベートした。同質遺伝子の野生型、ｓｒｂ７−１、ｓｒｂ８−１、ｓｒｂ９−１およびｒｐｂ２−５５１のバックグラウンドは、野生型ＲＰＢ１（２７リピートＣＴＤ）またはｒｐｂ１△１０４（１１リピートＣＴＤ）のいずれかを含んでいた。ｓｒｂ７−１、ｓｒｂ８−１、ｓｒｂ９−１またはｒｐｂ２−５５１対立遺伝子は、１２℃および唯一の炭素源としてピルビン酸を含む培地の下でｒｐｂ１△ １０４細胞を増殖させた。しかしながら、これらの抑圧対立遺伝子を含む細胞はＣＴＤトランケーション突然変異と結びつけられた温度感受性を抑圧しない。これらのｓｒｂおよびｒｐｂ２対立遺伝子は、試験されたＲＰＢ１において他の突然変異の条件的表現型を抑制しない。この抑圧の特異性は、ＳＲＢ７、ＳＲＢ８、ＳＲＢ９、ＲＰＢ２およびＣＴＤが転写開始における同一のプロセスに関与することを示している。ＳＲＢ７、ＳＲＢ８、ＳＲＢ９およびＲＰＢ２のクローニングおよび配列分析劣性ｓｒｂまたはｒｐｂ２対立遺伝子の抑圧表現型を打ち消す能力を開発することにより、ＳＲＢ７、ＳＲＢ８、ＳＲＢ９およびＲＰＢ２を含むゲノムＤＮＡクローンが単離された。酵母ＵＲＡ３動原体プラスミドにおいて構築された野生型ゲノムＤＮＡライブラリーは、ＣＴＤトランケーション突然変異ｒｐｂ１△１０４およびｓｒｂ７−１、ｓｒｂ８−１、ｓｒｂ９−１またはｒｐｂ２−５５１を含む酵母細胞に形質転換された。次いで、Ｕｒａ⁺形質転換体を１２℃およびピルビン酸培地の下での増殖欠損に関してスクリーニングした。所望により、ゲノム挿入断片をサブクローン化し、次いで１２℃およびピルビン酸培地で増殖可能なＵｒａ⁺形質転換体を再度スクリーニングすることにより野生型遺伝子の位置をさらに突き止めた。最小の挿入を持つクローンを配列決定した。予測されるＳＲＢ７蛋白質は、１４０個のアミノ酸長であり（配列番号：１０）、１６Ｋｄの分子量を持つ（図９）。ＳＲＢ８は１２２６個のアミノ酸長（配列番号：１２）で１４４Ｋｄの分子量を持つと予測される（図１０Ａおよび１０Ｂ）。ＳＲＢ８の部分配列分析は、それがＯＲＦＹＣＲ８１Ｗであることを明らかにした(Oliver，S．G.ら，Nature 357:38-46(1992))。予測されるＳＲＢ９蛋白質は１４２０個のアミノ酸長であり（配列番号：１１）、１６０Ｋｄの分子量を持つ（図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃ）。第四のクローンの部分配列分析は、ＲＰＢ２をＣＴＤトランケーションのサプレッサーとして同定した。配列データバンクの研究は、ＳＲＢ７、ＳＲＢ８およびＳＲＢ９が従前に同定された蛋白質と同様の有意な配列を持っていないことを明らかにした。しかしながら、ＳＲＢ９はアミノ酸１１２１ないし１１３６までの１６残基の単一のポリグルタミン伸張を含む。ＳＲＢ１０（配列番号：１５および１６）およびＳＲＢ１１（配列番号：１７および１８）に対するＤＮＡ配列および予測アミノ酸配列は、各々図１２および図１３に示されている。ＳＲＢ７およびＳＲＢ９は酵母ゲノムのプライムλ、クローングリッドフィルター（L．Rilesおよび M．Olson、ワシントン大学により提供された）を用いて物理的にマッピングされた。ＳＲＢ７は染色体ＩＶの右腕に対し、動原体からＧＣＮ２（λクローン６１１８）に向かっておよそ４５ｋｂ遠位にマッピングされる。ＳＲＢ９も染色体ＩＶの右腕に対し、動原体からＡＤＥ８（λクローン５５１３）に向かっておよそ３５ｋｂ遠位にマッピングされる。ＳＲＢ８は染色体ＩＩＩの右腕に対し、動原体よりＴＵＰ１に向かっておよそ５ｋｂ近位にマッピングされる。イン・ビボにおけるプラスミドギャップ修復によって、ｓｒｂ７−１およびｒｐｂ２−５５１突然変異体対立遺伝子が得られた。各々ＣＴＤトランケーション突然変異ｒｐｂ１△１０４およびｓｒｂ７−１またはｒｐｂ２−５５１を含む酵母細胞へ形質転換した場合、これらの突然変異体対立遺伝子を含むプラスミドは、それらの野生型の相対物とは違い、１２℃で増殖を阻害しない。このことは各々の場合において正確な遺伝子分析視座がクローン化されたことを確実にした。さらに、正確なオープンリーディングフレームの同定が、クローン化された野生型および抑圧対立遺伝子の全配列を比較することによって同定された、ｓｒｂ７ −１およびｒｐｂ２−５５１の抑圧突然変異の同定によって支持されている。各々の場合において、変異はシングルポイントのミスセンス突然変異であった。ｓｒｂ７−１における突然変異は、アラニン２１からトレオニンへ変異する。ｒｐｂ２−５５１突然変異は、アラニン１２００まらバリンへ変異する。ＳＲＢ８およびＳＲＢ９はＣＴＤ機能の陰性レギュレーターであるＳＲＢ遺伝子が細胞活性に必須であるかどうかを決定するために、各々のＳＲＢ遺伝子の全コーディング領域でなくとも、ほとんどを欠失させてｓｒｂ７△１、ｓｒｂ８Δ１およびｓｒｂ９△１を作成した。ＲＰＢ２同様ＳＲＢ７は必須である。ＳＲＢ８およびＳＲＢ９は必須ではないが、これらの遺伝子のいずれか１つを欠く細胞は、凝集を起こし、温和な低温および温度感受性表現型を呈する。意義深いことには、ＳＲＢ８およびＳＲＢ９の無効対立遺伝子は、ＣＴＤトランケーションに結びつけられた条件的表現型を部分的に抑圧する。ＳＲＢ８またはＳＲＢ９の欠失によって発現した表現型は、これらの遺伝子の抑圧突然変異対立遺伝子によって発現したそれらの表現型に非常に類似しており、このことは発明者らが正確な遺伝子をクローン化し、同定したことを示している。ＣＴＤトランケーション突然変異のスペクトルを含む細胞の増殖表現型におけるこれらの欠失対立遺伝子の効果を試験することによって、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤ機能におけるｓｒｂ８△１およびｓｒｂ９△１の影響がさらに調べられた。ＳＲＢ８を欠く酵母細胞は、１０−１２個の全ヘプタペプチドリピートを含むＣＴＤトランケーションと結びつけられた条件的表現型を部分的に抑圧した。さらに、ＳＲＢ８の欠損は、９個のヘプタリピートしか持たない細胞を生存させ；かくして、ＳＲＢ８の欠損はＣＴＤトランケーションと結びつけられた欠損を打ち消した。抑圧のこのパターンはＳＲＢ２対立遺伝子で観察されたものと逆である。優性機能増大ＳＲＢ２−１対立遺伝子は、劣性機能減少ｓｒｂ８△１対立遺伝子として、同一の抑圧表現型を提供する。対照的に、劣性機能減少ｓｒｂ２△１対立遺伝子は、ＣＴＤトランケーションと結びつけられた欠損の重篤度を増す。ＣＴＤトランケーションを含む細胞の表現型のｓｒｂ９Δ１の影響はｓｒｂ８△１のそれと同様である。それゆえ、ＳＲＢ８およびＳＲＢ９はＣＴＤ機能の陰性レギュレーターとして挙動し、一方、ＳＲＢ２はＣＴＤ機能の陽性レギュレーターとして挙動する。ＳＲＢ７、ＳＲＢ８およびＳＲＢ９はＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の成分であるＳＲＢ７、ＳＲＢ８およびＳＲＢ９もＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の成分であるかどうかが調べられた。ウサギポリクローナル抗体が組換えＳＲＢ７、ＳＲＢ８およびＳＲＢ９に対して作成された。ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の最終の精製工程からのカラム分画が、再構築された転写反応物において試験され、次いで、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＳＲＢ蛋白質に対して高血清特異性を持つウエスタンブロット分析に付した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。転写活性はＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、ＳＲＢ６、ＳＲＢ７、ＳＲＢ８並びにＳＲＢ９蛋白質とともに共溶出した。複数の因子がＣＴＤ活性に影響を及ぼす転写開始におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣＴＤの役割をよりよく定義するために、ＣＴＤトランケーション突然変異体の遺伝子外サプレッサーが単離された。この選択において、現在、１０種の遺伝子、ＳＲＢ２、ＳＲＢ４−ＳＲＢ１１およびＲＰＢ２が同定されている。これらの遺伝子における抑圧突然変異は、ＣＴＤトランケーションと関連づけられた条件的および栄養要求性表現型を抑圧するが、ＣＴＤ以外での点突然変異と関連づけられた同様の表現型は抑制しないという観察は、これらの遺伝子産物および該ＣＴＤが転写開始の同一のプロセスに関与することを主張する。この選択において、該遺伝子に対して同定されたゲノムＤＮＡがクローン化され、次いで配列決定された。これらのＳＲＢ因子は、酵母にとって野生型の速度で増殖するために、および細胞増殖のための通常の温度範囲を通じて生残するために必要とされる（表１参照）。 ^a正確なマップ位置が決定された^b 無効対立遺伝子がＣＴＤトランケーションに関連した条件的表現型を部分的に抑制する^c 1)Nonet および Young 1989，2)Koleskeら 1992，3)Thompsonら 1993，4)Koles ke および Young 1994，5)Sweetserら 1987 ＳＲＢ遺伝子はＣＴＤ機能の陽性および陰性レギュレーターをコードする。ＳＲＢ２およびＳＲＢ５における優性機能増大突然変異は、ＣＴＤトランケーション突然変異を抑圧する。さらに、ＳＲＢ２を欠く細胞は、ＣＴＤが野生型に近い長さであった場合にのみ生存できる。対照的に、ＣＴＤトランケーション突然変異を抑圧するのはＳＲＢ８またはＳＲＢ９の不在である。それゆえ、ＳＲＢ８およびＳＲＢ９蛋白質はＣＴＤ活性を抑制し、一方、ＳＲＢ２およびＳＲＢ５蛋白質はＣＴＤ活性を助長すると思われる。図１６は開始複合体へと組み立てるためのＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素モデルを示す。ホロ酵素の成分、アクチベーター蛋白質および転写因子ＴＦＩＩＤの間の複数の相互作用は、安定した開始複合体の形成に有用である。ＳＲＢｓはホロ酵素の安定性、またはホロ酵素の前開始複合体への補充におそらくはレギュレーター因子に対する応答において影響を及ぼすかもしれない。ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素はプロモーターに補充される細胞内の酵素の支配的な形態であるイン・ビボでのＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写におけるＳＲＢｓに一般的に要求性を証明するために一連の実験を行った。これらのデータはＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素がプロモーターに補充される細胞内の酵素の支配的な形態であることを示唆している。ＰＣＲに基づく突然変異誘発戦略を用いて変異誘発されたＳＲＢ４遺伝子のライブラリーを構築し、次いで、プラスミドシャッフル法を用いて劣性ｔｓ対立遺伝子、ｓｒｂ４−１３８を同定した。細胞増殖におけるｓｒｂ４−１３８突然変異の影響を調べた。突然変異型細胞は、通常３０℃の許容温度で増殖するが、３７℃の制限温度で増殖できない。増殖中のｓｒｂ４−１３８細胞培養物を制限温度へ移行すると、増殖は急速に低下し、全く増殖を停止する前に２倍になることができない。ｓｒｂ４−１３８の配列分析は、オープンリーディングフレームでの複数の点突然変異を明らかにした。ｔｓ表現型を引き起こす突然変異は同定されなかった。許容温度で野生型および突然変異型細胞を増殖させ、次いで、該培養物を制限温度へ移行することによって、ｍＲＮＡ合成におけるｓｒｂ４−１３８突然変異の影響を調べた。移行前および移行後の種々の時間で直ちにアリコートを採取し、全ＲＮＡを調製した。スロットブロット分析により、各々のサンプルについてｐｏｌｙ（Ａ）⁺ｍＲＮＡの量を決定した。等量の全ＲＮＡをブロットし、標識されたｐｏｌｙ（Ｔ）でプローブした。制限温度への移行に続いて、突然変異型細胞では劇的かつ急速なｍＲＮＡ低下があり、一方、野生型細胞は大きな影響を受けず、このことはｓｒｂ４−１３８細胞において制限温度でのＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写の全般的な欠損を示す。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写の欠損をより詳細に調べるために、特異的ｍＲＮＡｓの合成を調べた。各々のサンプルから調製した等量の全ＲＮＡを標識された過剰な相補的オリゴヌクレオチドを用いて、ＡＣＴ１、ＣＤＣ７、ＤＥＤ１、ＨＩＳ３、ＭＥＴ１９、ＲＡＤ２３、ＳＴＥ２、ＴＣＭ１およびＴＲＰ３転写物とハイブリダイズさせ、次いで、得られた産物をＳ１ヌクレアーゼで処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。これら９のメッセージは、様々な細胞プロセスに影響を与える広範な遺伝子スペクトルを示す。この試みは、新たなｍＲＮＡ合成の不在化で、安定状態のｍＲＮＡレベルを測定するので、その低下率はｍＲＮＡ機能の低下率である。これら９のメッセージの全ては、ＳＲＢ４活性の低下に応答する。一方、野生型細胞は、３７℃で全４時間の間を通じてこれらの転写物を合成し続ける。いくつかの野生型細胞由来転写物のレベルにおける一時的な低下は、温和な熱ショック応答によるものである(Nicolet,C．M.および Cra ig，E．A.，Meth ．Enzymol. 194:710(1991))。また、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによるｔＲＮＡ合成におけるｓｒｂ４−１３８突然変異の影響を調べた。ｔＲＮＡは非常に安定であるが、それらの転写物は、３分より短い半減期で急速にプロセシングされるイントロンを含む(Cormack B ．P,および Struhl，K．Cell 69:685(1992); Knapp,G.ら，Cell 14:221(1987)) 。ｔＲＮＡ転写物のトリプトファンファミリーの５’イントロン−エクソン結合に対して相補的なオリゴヌクレオチドを用いたＳ１ヌクレアーゼ分析を用いてＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性を測定した。ｓｒｂ４−１３８によるｔＲＮＡのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ合成において認められるほどの影響はない。同様に、短命なリボソームＲＮＡ前駆体を用いるＳ１ヌクレアーゼ分析を用いて、ＲＮＡポリメラーゼＩによるｒＲＮＡ合成が調べられた(Cormack B．P.,および Struhl，K．Cell 69:685(1992);Kempers-Veenstra，A．E.ら，EMBO J. 5:2 703(1986))。ｓｒｂ４−１３８突然変異体での前駆体ｒＲＮＡ転写物の合成における実質的な低下がある。ＲＮＡポリメラーゼＩ活性この低下は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの最大のサブユニットをコードしている遺伝子である、ＲＰＢ１のｔｓｒｐｂ−１対立遺伝子を含む細胞で観察されたものと同様である。(Cormack B．P.,および Struhl，K．Cell 69:685(1992); Nonet，M.ら，Mol．Cell．Biol ．7:1602(1987))。また、ｓｒｂ４−１３８およびｒｐｂ１−１細胞におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩ活性もほぼ同定された。制限温度でのＭＥＴ１９およびＲＡＤ２３転写物の合成は劇的に低下し、一方、ｔＲＮＡの合成は大きな影響を受けない。ｒｐｂ１−１およびｓｒｂ４−１３８細胞におけるｒＲＮＡ合成の停止は、遺伝子発現が影響を受ける条件下でのｒＲＮＡ合成の供給を停止する緊縮応答の結果であるかもしれない(Nonet，M.ら，Mol ．Cell．Biol．7:1602( 1987))。ｓｒｂ４−１３８細胞におけるｍＲＮＡ合成の全般的な停止は、３７℃での代謝障害、もしくはその合成がＳＲＢ４に依存する不安定なＲＮＡによってコードされている非常に不安定な蛋白質の減少という間接的な影響によるものではなさそうである。Cormack，B．P.および Struhl，K.( Cell 69:685(1992))によって、細胞サイクルへの参入を仲介するサイクリン−結合プロテインキナーゼをコードする遺伝子であるＣＤＣ２８においてｔｓ突然変異を含む系統を用いて行われたた同様の温度シフト実験では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写において認められるほどの影響はなかったことが示された。同じ研究で、これらの研究者らは、野生型細胞でサブセットのメッセージ転写に際し、細胞転写の有力な阻害剤であるシクロヘキシミドの影響を試験し、これらの転写物の合成に及ぼす影響はないことを発見した。これまでに、細胞においておよそ６％のＲＮＡポリメラーゼＩＩがホロ酵素中で、作動中のプロモーターで転写を開始するのに十分な量であったことが示されている。しかしながら、遊離ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび一般因子は他へ段階的様式で補充されたが、ホロ酵素がいくつかのプロモーターに優先的に補充されているかどうかは明らかにされなかった。今、ホロ酵素がほとんどのプロモーターで利用されるＲＮＡポリメラーゼＩＩの形態であると考えられる。この結論はＳＲＢ４がＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写において全般的な役割を果たし、かつ、細胞中の大多数のＳＲＢ４がホロ酵素でＲＮＡポリメラーゼＩＩと強固に会合しているという上記の証明に基づいている。これらの結果は転写開始の調節に関して重要な意味を持っている。ＲＮＡポリメラーゼＩＩの画分は、形成されつつある転写物の伸張に関与し、ＳＲＢ蛋白質と複合体を形成しない少なくともいくつかの酵素であるとみなされる。かくして、残りのＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび一般因子は、制限量のＳＲＢｓに匹敵する。それゆえ、ＳＲＢｓは、開始複合体の構築につながるＲＮＡポリメラーゼホロ酵素形成において鍵となる調節機能を果たし得る。哺乳類のＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体ＸＲＥＦｄｂサービスを用いて実施例６に記載するごとくに、酵母ＳＲＢ７に対して相同な３つの重複発現配列タグを同定した。酵母ＳＲＢ７のヒト相同体であるｈＳＲＢ７をクローン化し、次いで、該発現配列由来の配列情報を用いて配列を決定した。ｈＳＲＢ７は、１５．７ｋＤの推定分子量を持つ１４４個のアミノ酸蛋白質をコードしている（図１７Ａに示すごとくに配列番号：３６および３７）。その３５％が固有のものであり、５８％はその酵母の相同体と類似している。相同性研究では、酵母およびヒトＳＲＢ７が他のいずれの配列決定遺伝子より、お互いに類似していることが示されている。ｈＳＲＢ７ｃＤＮＡの６２７位（ＤＮＡ配列の開始からナンバリングする）で制限長の多形性が見られる。いくつかの個体における配列はＧＡＴＣであり、他の個体における配列はＧＡＴＴである。ＧＡＴＣは酵素Ｓａｕ３Ａに対する制限部位である。この多形性はｈＳＲＢ７遺伝子に対して遺伝子座の結合を決定するのに有用である。例えば、遺伝病がｈＳＲＢ７における突然変異によって引き起こされるかどうかを決定するために該他形性を用いることができる。酵母とヒト遺伝子の間の保存程度が高いために、ｈＳＲＢ７が酵母ＳＲＢ７欠失突然変異体を機能的に補足（例えば、それに対する機能的同等体であった）可能かどうか試験して判定された。最初の結果は、全長ｈＳＲＢ７が酵母の欠失を補足することができないことを示した。ほとんど保存されたＳＲＢ７の領域はそのＮ−末端で発見されたので、ヒト遺伝子由来のＮ−末端および酵母遺伝子由来のＣ−末端を含むキメラが機能しているということが推測された。実施例７に記載されるごとくに、キメラのパネルが構築され、それらの酵母ＳＲＢ７欠失を補足する能力について試験された。いくつかのｈＳＲＢ７−ｙＳＲＢ７キメラは、ｙＳＲＢ７欠失を十分に補足することが判明した。最大量のｈＳＲＢ７を含むキメラは、ヒト遺伝子Ｎ−末端由来の１１７個のアミノ酸および酵母遺伝子Ｃ−末端由来１２個のみを含んだ。このデータは、配列の相同性によるばかりでなく、機能試験によっても、ｈＳＲＢ７がｙＳＲＢ７のヒト相同体であるというさらなる支持を提供した。ｈＳＲＢ７がｙＳＲＢ７の正真正銘の相同体であるという遺伝学的証拠を提供するために、確証的な生物学的証拠が得られた。酵母ＳＲＢ７の特色のある生物学的特性は、それらのＣＴＤに特異的に結合する能力である。いくつかの酵母ＳＲＢｓは、ＣＴＤアフィニティークロマトグラフィーによって単離できる複合体を形成し、それゆえ、酵母ＳＲＢ７もＣＴＤに結合するではないかと考えられる。対照区およびＣＴＤアフィニティーカラムからの溶出液の分析は、この仮説を確実にした。他のＳＲＢｓ同様、ｙＳＲＢ７はＣＴＤカラムによって特異的に保持された。ｈＳＲＢ７を用いて同様の実験が行われた。まず、実施例８に記載するごとくに、ｈＳＲＢ７に対して作製した抗血清を調製および同定した。この抗血清は、それぞれヒトおよび牛ＳＲＢ７を表す、ヒーラおよび子牛胸腺抽出物における１６ｋＤのバンドを認識する。次いで、この抗血清を用いてＣＴＤ−アフィニティーおよび対照カラムからの溶出液のウエスタンブロットをプローブした。ヒーラ細胞および子牛胸腺に由来する哺乳類ＳＲＢ７はＣＴＤに特異的に結合し、このことはｈＳＲＢ７および酵母ＳＲＢ７が同一のアミノ酸配列およびイン・ビボでの機能を持つだけでなく、特異的にＣＴＤと結合する能力をも共有していることを示す。配列類似性、機能的相補性およびＣＴＤ結合の基準に基づき、ｈＳＲＢ７がｙＳＲＢ７の真のヒト相同体であるという結論は理に適ったものである。酵母において、ＳＲＢ蛋白質はＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素のホールマークである。ｙＳＲＢ７とｈＳＲＢ７の間の相同性が与えられ、ｈＳＲＢ７が哺乳類細胞において同一のホロ酵素複合体の一部であろうことが仮定される。この仮説を試験するために、ｈＳＲＢ７がＲＮＡポリメラーゼＩＩまたは他の基本転写因子と会合するかどうかが決定された。抗−ｈＳＲＢ７ペプチド抗体を用いてｈＳＲＢ７およびその会合蛋白質を沈降させ、次いで実施例９に記載されるごときに分析した。ウエスタンブロットは該抗−ｈＳＲＢ７免疫沈降物がＰｏｌＩＩおよびｈＳＲＢ７を含むことを示している。ペプチドブロック抗体を用いた対照免疫沈降は検出できるＰｏｌＩＩまたはｈＳＲＢ７を含まないので、この相互作用は特異的ある。該抗体重鎖および軽鎖からの干渉のために、他の基本因子の存在についてアッセイするためにウエスタンブロットを用いることはできなかった。別法として、イン・ビトロの転写アッセイを用いた。これらの転写アッセイは該抗−ｈＳＲＢ７免疫沈降物がＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性を含むばかりでなく、ＴＦＩＩＥおよびＴＦＩＩＨ活性も含むことを示している。これらの結果からｈＳＲＢ７が特異的にＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＴＦＩＩＥおよびＴＦＩＩＨと会合すると結論付けることは理に適っている。ＳＲＢ蛋白質の存在についてアッセイすることにより、子牛胸腺から該哺乳類ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を精製した。該精製手順の進行は、抗−ｈＳＲＢ７抗体を用いたウエスタンブロット分析によって監視された。ＳＲＢ７および会合蛋白質は子牛胸腺から６種類のイオン交換カラムにわたって精製された。哺乳類ＳＲＢ７は、該精製手段を通じて厳密にＲＮＡポリメラーゼＩＩ最大サブユニットとともに共溶出する。極めて高度に精製された画分の銀染色は、ＳＲＢ７およびＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む複合体がおよそ３０種のポリペプチドを含むことを示唆している。これらの結果を確認するために、異なる手順を用いて該ホロ酵素を精製した。哺乳類ＳＲＢ７およびＲＮＡポリメラーゼＩＩは、該精製手順を通じて再度厳密に共溶出し、同一の共溶出するポリペプチドが明白である。ＳＲＢ７が、子牛胸腺細胞から抽出されたＲＮＡポリメラーゼＩＩの少なくとも２０％と会合していると評価される。該精製手順は、ＳＲＢ７が確実にアッセイされ得る前に、粗抽出物中に存在するＲＮＡポリメラーゼＩＩのおよそ８０％を除去した。一度ＳＲＢ７が確実に検出できれば、残り２０％のＲＮＡポリメラーゼＩＩは常時ＳＲＢ７とともに共分画物で観察された。精製ホロ酵素の転写活性を、実施例１０に記載されたごとくにイン・ビトロで分析した。該反応のための鋳型は、直鎖形状の場合、緊縮的にＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＴＢＰ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＥ、およびＴＦＩＩＨを要求するアデノウイルス主要後期プロモーターを含む。ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび他の５種の基本因子の供給源としてカラム精製ホロ酵素を含む反応において、主要後期プロモーターからの特異的転写が観察された。該ホロ酵素が欠落していたが、他の５つの因子が含まれる場合、ＲＮＡポリメラーゼの要求性に一致して、ＲＮＡ産物は検出されなかった。オートラジオグラムのより長期の露出は、ＴＢＰ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＥまたはＴＦＩＩＨの欠落の結果、低いが有意なレベルの転写を生じた。これらの結果は、基本転写因子が補給された場合、該ホロ酵素はイン・ビトロで転写可能であることを証明し、微量の他の基本因子が精製ホロ酵素調製物中に存在していたことを示唆している。該酵母ホロ酵素の特性は、イン・ビトロにおける酸性活性化蛋白質による刺激に対する応答性である。アクチベーターに対する精製哺乳類ホロ酵素の応答が、アデノウイルス主要後期プロモーターか、またはＧａｌ４に対する上流結合部位を持つ同一のプロモーターのいずれかを含む２種の鋳型を用いて調べられた。もしコアクチベーターＨＭＧ−２およびＰＣ４が存在しなければ、高度に精製された転写因子およびコアＲＮＡポリメラーゼＩＩを伴うＧａｌ４−ＶＰ１６の包含物は影響を受けず、その場合には２倍の活性化が観察されるだけであった。対照的に、コアＲＮＡポリメラーゼＩＩの代わりに該ホロ酵素が含まれる場合、コアクチベーターは依然として活性化を要求したが、Ｇａｌ４−ＶＰ１６による特異的な活性化はおよそ５倍に上昇した。これまでのところ記載されているＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は全て、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＳＲＢｓを含む。しかしながら、異なる形状のホロ酵素は異なるサブユニットの基本転写因子を含む。本明細書に記載される哺乳類ホロ酵素はＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ｈＳＲＢ７を含み、それはＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＨと会合している。酵母ホロ酵素の一つの形状はＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＢｓを含み、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＦおよびＴＦＩＩＨと会合している。他の形状の酵母ホロ酵素は、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＨ、または双方を除く同一の因子を有する。観察された差違に対する１つの説明は、イン・ビボに多様な形状のホロ酵素複合体が存在するということである。該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は転写サイクル中、異なるサブユニットと会合する可能性がある。例えば、に関与する形状へ変換されるかもしれない。また、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は、異なる調節環境に応答させるために、発達および分化の間異なる形状をとる可能性がある。ホロ酵素の多様性に対する第二の説明は、精製ホロ酵素が人工的に分割されてきたより大きな物質のサブユニットを表すということである。ホロ酵素およびおそらくはメガダルトンより大きい全ての多重サブユニット複合体は、イオン強度の極端な条件および通常の蛋白質精製手順の結果である流体力学的剪断に対し、特に敏感である。イン・ビボに複数の形状のＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素が存在すると確信することは理に適っている。本明細書に記載されるごとくに、ヒトＳＲＢ遺伝子をクローン化および配列決定し、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の単離および同定が報告されてきた。これらの結果に基づいて、哺乳類ホロ酵素が、酵母ホロ酵素と同様、基本転写因子および付加的ＳＲＢ蛋白質と会合していると確信することは理に適っている。酵母ホロ酵素の成分を解明するために、本明細書に記載された方法を用いて、哺乳類ホロ酵素と会合しているこれらの特異的成分を同定することができる。例えば、Thompson，N.E.ら J Biol Chem，265:7069-77(1990)に記載されたごとくに、ｈＳＲＢ７に対する抗体を用いて、哺乳類ホロ酵素をイムノアフィニテイー精製することが可能である。次いで、精製ホロ酵素の個々のサブユニットを単離し、マイクロシークエンシングすることができる。クローン化のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、これらの配列の逆転写によって設計され得る。Ausubel，F.M.ら Current Protocols in Molecular Biology(Current Protoco ls，1994); Fields，S.および Song，O.，Nature，340:245-6(1989)に記載されたごとくに、ｈＳＲＢ７の遺伝子単離のために用いられたプライマーをトゥーハイブリッド系に用いて、該ホロ酵素の付加的成分を単離することができる。また、ｈＳＲＢをプローブとして用いて、標識されたｈＳＲＢ７蛋白質を用いて発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、該ホロ酵素中の付加的蛋白質を単離することができる(Ausubel，F.M.ら Current Protocols in Molecular Biol ogy (Current Protocols，1994))。また、ｈＳＲＢ７をアフィニティーカラムに用いて、該ホロ酵素中の付加的蛋白質を精製することができる(Thompson，C.M. ら Cell，73:1361-75(1993); Ausubel，F.M.ら Current Protocols in Molecula r Biology (Current Protocols，1994))。該ｈＳＲＢ７遺伝子配列（配列番号：３６）、またはその断片をプローブとして用いて付加的ＳＲＢ７相同体を単離することができる。例えば、Ausubel，F.M .ら Current Protocols in Molecular Biology，(Current Protocols，1994)に記載されたごとくに、標識ｈＳＲＢ７ＤＮＡを用いて適当な生物由来の組換え体ライブラリーをスクリーニングして相同遺伝子を同定することができる。生物由来のランダムなＤＮＡとｙＳＲＢ７の領域をコードするＣ−末端の間のキメラの組換えＤＮＡライブラリーを、酵母ＳＲＢ７欠失突然変異を補足するＳＲＢ７相同体に関してスクリーニングすることができる。他の生物由来のＳＲＢ７配列クローン化を可能にする、高度に保存されたＳＲＢ７アミノ酸配列が同定された。これらのアミノ酸配列はＭＸＤＲＬＴＬＱ（配列番号：３８）およびＬＩＤＳＬＰ（配列番号：３９）である。これらのアミノ酸配列の逆転写に基づく縮重したオリゴヌクレオチドを用いて他のＳＲＢ７相同体を単離することができる。さらに、再度、Ausubel，F.M.ら Current Protocol s in Molecular Biology ，(Current Protocols，1994)に記載されたごとくに、これらのペプチドに対して、またはｈＳＲＢ７もしくはその断片に対して構築された抗体を用いて相同体に関する発現ライブラリーをスクリーニングすることができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素はＳＷＩ／ＳＮＦ調節蛋白質を含むクラスＩＩ遺伝子の調節には遺伝子−特異的アクチベーターおよびコファクター、基本転写装置、およびクロマチン間の複合体相互作用が関与する。遺伝子特異的活性は、少なくとも部分的には基本転写装置の結合および組込みにより、転写の誘導および刺激につながる。クロマチン構造は、該転写装置のプロモーターへの接近を遮断することにより、遺伝子の転写の活性化に影響を与える。該ＳＷＩおよびＳＮＦ調節蛋白質は、ヌクレオソームによって仲介されるリプレッションに拮抗し、クロマチン構造を改変して該転写装置の結合を助長することによって作用する球形レギュレーターである。まず、該酵母ＳＷＩ遺伝子がＨＯ転写の陽性レギュレーターとして同定され、まず、該酵母ＳＷＩ遺伝子がＨＯ転写の陽性レギュレーターとして同定され、その後、ＳＷＩ１、ＳＷＩ２およびＳＷＩ３がイン・ビボにおいて広範なスペクトルの誘導遺伝子の活性化に必要とされることが示された。同様に、該ＳＮＦ遺伝子がＳＵＣ２およびＳＮＦ２の陽性レギュレーターとして独自に同定され、引き続いてＳＮＦ５、およびＳＮＦ６が種々のセットの誘導遺伝子の活性化に必須であることが判明した。さらなる研究はＳＷＩ２およびＳＮＦ２が、本明細書でＳＷＩ２／ＳＮＦ２と呼ばれる同一の遺伝子であることを明らかにした。遺伝学的証拠はＳＷＩおよびＳＮＦ遺伝子同様のプロセスに関与していることを示した。さらに特異的には、遺伝学的および生物学的証拠は、ヌクレオソーム分裂を介したクロマチン再構成において該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質が関与していることを示した。本明細書に記載されたごとくに、酵母ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素はＳＷＩ２／ＳＮＦ２、ＳＷＩ３、ＳＮＦ５およびＳＮＦ１１を含む。該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質はＳＲＢ複合体の成分であり、またメディエーターとしても知られ、それはＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤと強固に会合する。該ホロ酵素およびＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の双方、並びに該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質は、従来ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体に帰されてきたＡＴＰ依存性ヌクレオソーム分裂活性を有する。さらに、該ホロ酵素は、ＡＴＰ−増強様式で、ＴＢＰのヌクレオソームＤＮＡへの結合を助長する。本明細書に記載されたデータは、イン・ビボにおける該ホロ酵素の特異的プロモーターへの補充は、そのプロモーターでのヌクレオソーム構造に関わらず、ＴＢＰ結合を助長する手段を提供する。該ホロ酵素はイン・ビトロで、ＡＴＰの存在下でＴＢＰおよびＴＦＩＩＡのモノヌクレオソームへの結合を増強することができ、その結果は該ホロ酵素のポリメラーゼおよび基本転写因子成分が、ＴＢＰ結合を安定化するはずである付加的蛋白質−蛋白質および蛋白質−ＤＮＡ相互作用を提供するという証拠と両立する。モノヌクレオソームに対するホロ酵素−助長ＴＢＰ結合はＡＴＰの存在下で増強され、それはおそらくはＡＴＰ依存性ヌクレオソーム分裂活性に影響を及ぼす。該ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体はＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤと強固に会合する。カラムクロマトグラフィーによって種々のＳＲＢ蛋白質を精製する独自の試みは、同一の複数蛋白質複合体：ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の精製という結果となった。該ホロ酵素と会合しないＳＲＢ蛋白質は、非常に少量しか検出できなかった。ＳＲＢサブ複合体の部分的な精製を可能にする、２つの異なる方法が記載されている。ＣＴＤアフィニティーカラムを用いて、もしくはモノクローナル抗−ＣＴＤ抗体を用いることによりホロ酵素調製物からそれを遊離することによって、ＳＲＢ複合体が単離できた。本明細書に記載されたごとくに、ＣＴＤ−アフィニティークロマトグラフィーによって得られたＳＲＢ複合体の調製物をさらに精製した。該ＳＲＢおよびＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質は該精製の最終工程で共溶出する。また、本明細書に記載された、抗−ＣＴＤ抗体遊離によって単離されたＳＲＢ複合体は、ＳＷＩおよびＳＮＦ蛋白質を含む。さらに特異的には、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素、およびそのＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦサブ複合体は、ＳＷＩ２／ＳＮＦ２、ＳＷＩ３、ＳＮＦ５、およびＳＮＦ１１を含む。さらなる遺伝学的および生物学的データは、ＳＷＩ１およびＳＮＦ６もまた、付加的成分とともに、この複合体のサブユニットである可能性が高いことを示す。ＳＷＩ２／ＳＮＦ２およびＳＮＦ５は該ホロ酵素の化学量論的成分であり、かつ、酵母細胞は２０００−４０００分子のＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を含んでいるので、細胞当たり少なくとも２０００分子のＳＷＩ２／ＳＮＦ２およびＳＮＦ５分子が存在する。酵母細胞には５０および１５０コピーの間のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体が存在すると評価された(Cote，J.ら Science，256:53-60(1994)) 。これらの結果の１つの説明は、ほとんどのＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質がＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素中に残存し、精製されたＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の形状が、ホロ酵素への組み立てのプロセス中に存在する、少量のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質であり、もしくは択一的に、ホロ酵素から分離する可能性のあるサブ複合体を表すということである。抗−ＳＲＢおよび抗−ＳＷＩ抗体を用いて酵母の粗画分から非常に類似したホロ酵素複合体を免疫沈降が可能なことは、これらの画分中のほとんどのＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質が該ホロ酵素と会合していることを示唆している。もし該ＳＲＢおびＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の相対比率は、抗−ＳＲＢおよび抗−ＳＷＩ免疫沈降物で異なるであろう。しかしながら、抗−ＳＲＢおよび抗−ＳＷＩ抗体を用いて得られた免疫沈降物中で発見された、ＳＲＢおよびＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の類似した相対比率は、該ＳＲＢおよびＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質が粗抽出物中の同一の複合体の成分であることを示している。ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質およびそれらの機能は、真核生物において高度に保存されていると思われる。ＳＮＦ２／ＳＷＩ２の推定上の相同体は、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ｂｒａｈｍａ、ヒトｈｂｒｍおよびｈＢＲＧ１、並びにＩＮＩ１と呼ばれるＳＮＦ５の哺乳類相同体を含む。最近、酵母ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体のそれと同様、ヌクレオソーム分裂活性を持つヒトＳＷＩ／ＳＮＦ複合体が部分的に精製された(Kwon，H.ら Nature，370:477-481(1994))。該ヒトＳＷＩ／ＳＮＦ複合体はｈＢＲＧ１およびＩＮＩ１蛋白質の双方を含む。酵母ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体同様、該ヒトＳＷＩ／ＳＮＦ複合体はヌクレオソームＤＮＡへのアクチベーターの結合を助長する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素中の該ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の存在は、イン・ビボで転写活性に関与した機構に対する示唆を持つ。クロマチン蛋白質と特異的ＤＮＡ部位に対するアクチベーターの間の劇的な競合は、ひとたび該ＳＷＩ／ＳＮＦ−含有ホロ酵素が該プロモーターに補充された場合、該アクチベーターの支援が決定されると考えられる。このモデルでは、該アクチベーターおよび該ホロ酵素の双方が安定した転写開始複合体形成に貢献し；該アクチベーターはその成分のサブセットに結合することにより該ホロ酵素に補充され、次いで該ホロ酵素のＳＷＩ／ＳＮＦ成分がヌクレオソームを脱安定化することによって、アクチベーター−ＤＮＡ相互作用の安定性を増強する。遺伝子転写を修飾する方法本明細書に記載されたごとくに、出願者らは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩとの相互作用を介して遺伝子転写の陽性および陰性レギュレーターとして働く、酵母およびヒトＳＲＢ蛋白質をコードする遺伝子を同定した。詳細には、出願者らはＳＲＢ２およびＳＲＢ５がＣＴＤ機能を陽性的に調節し、ＳＲＢ８およびＳＲＢ９ＲＢ２およびＳＲＢ５がＣＴＤ機能を陽性的に調節し、ＳＲＢ８およびＳＲＢ９がＣＴＤ機能を陰性的に調節することを証明した。さらに、出願者らは、該ＳＲＢ蛋白質がＳＲＢ蛋白質、ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩからなる多重サブユニット複合体の不可欠な部分であり、かつ、基本転写因子および転写活性に必要な他の成分と会合していることを示した。このＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は予め組込まれ、かつ素早くＤＮＡプロモーターへ補充され、かつ、因子ａ（ＴＦＩＩＥ）およびＴＡＴＡ−結合蛋白質を補給した場合、部位特異的な遺伝子転写が可能である。重要なことには、従来知られていた転写因子と組み合わされた精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩとは異なり、本明細書に記載されたＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は、ＧＡＬ４−ＶＰ１６のごとき転写アクチベーターに応答する。かくして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素中に含まれる調節蛋白質は、おそらくはＲＮＡポリメラーゼＩＩとの相互作用を通じて、陽性および陰性アクチベーターの双方に対する応答性を与えるシグナルプロセッサーとして働く。遺伝子転写の調節において、該ＳＲＢおよびＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質が演じる決定的な役割のために、１以上のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の修飾、または改変の結果、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の修飾、または改変が起こり、かくして、遺伝子転写を修飾、または改変する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素のこのモデルに基づいて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素による転写の開始を修飾することにより、細胞内の遺伝子転写を修飾する方法を提案することは理に適っている。ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の修飾は、多くの方法で達成され得る。１以上のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質は、他のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質との会合を阻止することができ、かくして、該ホロ酵素複合体の形成を阻止する。１以上のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質は、たとえ該ホロ酵素が形成されても、該ホロ酵素が機能しない（例えば、もはや遺伝子転写を開始する能力を持たない）ように修飾される得る。また、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素に伝達されるシグナルが改変され、転写の刺激かまたは抑圧のいずれかにつながるように、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の修飾は該ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ調節蛋白質を修飾することによっても達成できる。これは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の成分と特異的に相互作用する物質の使用によって達成することができる。本明細書に記載された方法において使用された物質は、ペプチド（天然のおよび非天然のアミノ酸よりなる）、およびペプチドアナログ（ペプチドおよび非ペブチド成分よりなる）のごとき天然の蛋白質性のものであってよく、もしくは小さな生物分子のごとき天然の非蛋白性のものであってもよい。また該物質は、遺伝子工学的に作成された、改変アミノ酸配列を持つＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質であってもよい。これらの物質は、本明細書に記載されたＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質のＤＮＡまたはアミノ酸配列、もしくは本明細書に記載されたＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と反応する抗体に基づいて、該ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と結合する、もしくは相互作用するように設計されよう。例えば、該ホロ酵素複合体中の１以上のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の相互作用を特異的に阻害する物質が同定され得、もしくは設計され得る。これらの物質は、別のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と相互作用する、少なくとも１つのＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質上の部位（例えば、該ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質上の結合部位）を模擬すると考えられ、かくして該ホロ酵素複合体の一部としての少なくとも１つのＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の会合を阻止する、または阻害する。かくして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成が阻止される。該ホロ酵素の形成を阻止することによって、転写は阻害されるであろう。別法として、これらの物質は、少なくとも１つのＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と相互作用する、もしくは結合するＲＮＡポリメラーゼＩＩ上の部位を模擬すると考えられ、再度、ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質がＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤと相互作用することを阻止する、もしくは阻害する。かくして、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体は形成されるであろうが、それは転写を開始する能力を持つ機能的ホロ酵素複合体ではないと考えられる。また、１以上のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に対して特異的なモノクロナールまたはポリクローナル抗体（例えば、本明細書に記載されたポリクローナル抗体）もＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質が遺伝子転写の開始に参加することを阻止、または阻害するために使用できる。該抗体は該ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と反応、もしくは結合すると考えられ、例えば、該ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質が他のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と会合し、次いでホロ酵素複合体を形成することを阻止する。かくして、遺伝子転写は阻害される。該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は、それが転写アクチベーターに応答可能な場合は異常であり、ゆえに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたは転写因子は単独では能力を持たない。かくして、該ＳＲＢ蛋白質は該転写複合体を一緒に保持し、該ホロ酵素上でアクチベーターに対する応答性を与える、一種の「調節接着剤」として働く。該ＳＲＢ蛋白質の存在のために、遺伝子転写はアップ−レギュレートもしくはダウン−レギュレートされ得る。かくして、該ホロ酵素複合体中の１以上のＳＲＢ蛋白質に結合する抗体を含む物質が、結果として遺伝子転写のアップ−レギュレーションもしくはダウン−レギュレーションを起こす。例えば、ＳＲＢ２およびＳＲＢ５が遺伝子転写を陽性的に調節することが示された。かくして、該ＳＲＢ２かまたはＳＲＢ５蛋白質のいずれか、もしくは双方と相互作用する物質が遺伝子転写の活性化を増加、もしくは減少させる。対照的に、遺伝子転写を陰性的に調節することが示された、ＳＲＢ８またはＳＲＢ９と相互作用する物質は、遺伝子転写を刺激することができる。別法として、調節シグナルを処理することができる突然変異体ＳＲＢ蛋白質を細胞内に導入することができ、かくして遺伝子転写が阻止される。また、あるＳＲＢ蛋白質はプロテインキナーゼドメインの特徴的なアミノ酸配列を含み、かくして、それらがキナーゼ活性を持つことが示される。これらのＳＲＢ蛋白質が、ＳＲＢ蛋白質、もしくは転写装置に関与する他の蛋白質または因子のリン酸化におけいて役割を演じることを予測することは理に適っている。かくして、１以上のＳＲＢ蛋白質のキナーゼ活性を修飾する、もしくは改変することも、例えば、別の転写因子のリン酸化を阻止することにより、遺伝子転写を修飾、もしくは改変することができる。本発明のＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素および該ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の双方はＡＴＰ−依存性ヌクレオソーム分裂活性を持つ。さらに、該ホロ酵体がＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素にクロマチン再構成活性を与えることを示している。かくして、遺伝子転写は該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質を介してアップ−レギュレートまたはダウン−レギュレートされ得る。例えば、該ホロ酵素複合体中の１以上のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合する抗体を含む物質は、結果として遺伝子転写をアップ−レギュレートまたはダウン−レギュレートする。別法として、突然変異体ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質を細胞内に導入することができる。該突然変異体蛋白質は該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質複合体の形成に、もしくは機能活性に参加して、かくして、機能的ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の形成を阻止し、かくして遺伝子転写を阻止することができる。また、該ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の転写、もしくはｍＲＮＡ配列の転写も阻害され、または低下し、結果として１以上の決定的なＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の産生を低下させ、もしくは完全に不在にすることが可能である。遺伝子転写は、１以上のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子の転写を阻害する、もしくは１以上のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を阻害する有効量の物質を細胞内に導入することによって修飾され得る。例えば、１つのＳＲＢ蛋白質をコードする遺伝子とハイブリダイズし、次いで該遺伝子の転写を阻害するであろうアンチセンスヌクレオチド配列を細胞内に導入することができる。別法として、ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するであろうアンチセンス配列を細胞内に導入することができる。本発明で記載された物質を同定し、次いでそれらの、イン・ビトロでの転写アッセイを用いて遺伝子転写を修飾する能力について試験することができる。例えば、注目するＤＮＡ（すなわち、転写されるべきＤＮＡ）を精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、該ＳＲＢおよび／またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質、転写因子ｂ、ｅ、ｇまたはａ（またはその相同体）、ＴＢＰおよび試験されるべき物質と混合し、次いでＤＮＡ転写が起こるのに十分な条件下で維持する。得られた組み合わせは試験混合物と呼ばれる。ＤＮＡ転写はｍＲＮＡの減少量を測定することにより評価される。試験される物質の存在下でＤＮＡ転写が測定され、次いで同一の条件下で行う（すなわち、対照混合物）試験物質の不在下におけるＤＮＡ転写と比較される。もしＤＮＡ転写が対照混合物におけるより、試験混合物で低い程度で起これば、該物質は、ＤＮＡ転写を阻害するごとき様式で１以上のＳＲＢ蛋白質と相互作用したことになる。もしＤＮＡ転写が対照混合物におけるより、試験混合物で高い程度で起これば、該物質は、ＤＮＡ転写を刺激するごとき様式で、１以上のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦと相互作用したことになる。また、該ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質は位置指定突然変異誘発によるごとくに遺伝学的に改変され、結果として改変された活性を持つＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質が得られる。遺伝学的に改変されたＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質は遺伝子転写に影響を与えるであろう。例えば、１以上の遺伝子分析的に改変されたＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質はリポソームを介して、すなわち細胞膜を通過することが知られている担体蛋白質と連結させて細胞に導入されてもよい。別法として、かかる蛋白質をコードするＤＮＡが例えば、標準的な実験手順を介して、該ＤＮＡ配列を含むベクターを用いて細胞内へ導入されてもよい。これらの遺伝学的に改変されたＳＲＢ蛋白質はそれらの自然発生する（すなわち、修飾されていない）ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と相互作用する能力が損なわれていると考えられ、かくして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成を阻害するか、もしくは機能的ホロ酵素の形成を阻害し、かくして、遺伝子転写を阻害する。さらに、低下した内生ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の供給を補給するために、生物学的活性を持つ野生型ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ（すなわち、遺伝子転写に参加できる）を細胞内に導入してもよい。該野生型ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質を細胞内で発現し、かくして細胞内のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質のレベルを増加させ、結果として形成されるＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の量が増加し、次いで、かくして遺伝子転写を増加させる。遺伝子転写を修飾する能力は、３つのカテゴリーのヒト疾病において有用である：１）遺伝病；２）感染起源でない後天的疾病；および３）感染起源の後天的疾病。これら３つの病状の遺伝子転写における変化は、疾病の発現における変化の一因となる。例えば、遺伝病では、決定的な遺伝子の発現レベルが、該疾病を発現しない個の一因となる。例えば、遺伝病では、決定的な遺伝子の発現レベルが、該疾病を発現しない個体の遺伝子の発現に比較して改変される。もし産生される遺伝子産物の量が十分でなければ、少なくとも１つのＳＲＢ蛋白質と相互作用する物質の細胞内への導入は、結果として、例えば、遺伝子産物の増加という結果になるであろう遺伝子転写を刺激し、かくして該個体の病状が改善される。癌のごとき感染起源ではない後天的疾病の例では、また、遺伝子転写を修飾することも該病状をを修飾する。典型的な癌は、特定の細胞タイプにおいて、転写活性の増加に付随した増殖制御の低下の結果である。この場合、１以上のＳＲＢ蛋白質と相互作用し、かくして遺伝子転写を減少させる物質が、該個体の病状を改善するであろう。癌細胞は異常に高い遺伝子転写速度を持つので、該物質は癌細胞（すなわち、急速に増殖する細胞）における遺伝子転写速度に有意に影響を与えるが、正常細胞（癌治療において抗−代謝物の使用に対するアナログ）には有意に影響を与えない。その疾病が細菌またはウイルスのごとき感染力の結果である、要求性疾病の場合は、免疫応答に関与する蛋白質をコードする遺伝子転写の増加が、結果として該個体の病状を改善する。例えば、ＨＩＶ感染において、遺伝子転写を陰性的に調節する、ＳＲＢ８またはＳＲＢ９と相互作用する物質は、リンパ球細胞への送達の標的とされ、結果として重要なリンバ球蛋白質の転写を増加させることができる。また、ワクシニアウイルスのごときいくつかのウイルス感染の場合では、宿主細胞の遺伝子転写は該ウイルスによって完全に遮断される。先に記載されたごときウイルスに感染した細胞を標的とした物質は、宿主細胞の転写装置をオンにするであろう。いくつかの細胞、すなわちアデノウイルスのための別法として、それは該宿主細胞の転写装置（先に癌に関して記載されたごとくに）を優先的にオフにするかも知れない。本明細書に記載されたごとくに、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は真核生物における遺伝子転写に決定的な役割を演じる。該ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の相同体は配列同定における差違を表し、これらの差違は宿主の遺伝子転写装置と相互作用せずに、真核細胞病原体を標的とする物質（例えば、薬剤）を設計する際に開発できる。例えば、薬剤、例えば真菌類ＳＲＢＤＮＡとハイブリダイズするアンチセンスＤＮＡ配列が同定、もしくは設計され、かくして、これが真菌類における遺伝子転写を阻害することができる。該アンチセンスヌクレオチドは真菌類ＳＲＢＤＮＡと特異的にハイブリダイズするであろうが、ヒトＳＲＢＤＮＡとはハイブリダイズせず、かくしてヒト宿主におけり遺伝子転写が損なわれる。真核生物病原体は、カンジダ(Candida)またはニューモシスティス(Pneumocystis)のごとき真菌類；プラスモディウム(Plasmodium)および住血吸虫(Schistosoma)のごとき寄生種；病原虫；および動物または農作物に影響を及ぼす昆虫を含む。遺伝子転写の修飾または改変だけが効果を見るのに必要であることに注目することは重要である。遺伝子転写の阻害または刺激は、部分的阻害または部分的刺激であってもよい。遺伝子転写の完全な阻害または完全な刺激は、必ずしも必要でない。全てに必要なことは、該物質を導入されていない細胞における遺伝子転写速度と比較して、遺伝子転写を低下させるまたは増強することである。かくして、本明細書に記載されたごとくに、遺伝子転写を修飾すための有効量の物質とは、該物質を導入されていない細胞における遺伝子転写速度と比較して、遺伝子転写を低下させるまたは増強するために必要な物質量である。物質の細胞への導入は、該細胞膜と相互作用するであろう担体蛋白質の使用；細胞表面の抗原と反応する抗体との結合；またはリポソーム中への共包含のごときいずれの常法によっても可能である。もし該物質が例えば、ペプチド、該物質をコードするＤＮＡなど天然の蛋白質性のものであれば、細胞に導入でき、次いで該物質は該細胞内で遺伝学的に発現することができる。別法として、「遺伝子ガン」、もしくは他のエレクトロポレーション法を介して、細胞、例えば表皮細胞へ該ＤＮＡを直接導入することができる。また、当業者に公知の他の細胞標的法が使用されてもよい。この発明の従って、従来の材料および手段を用いて、該物質を、医薬上許容される担体および／または他の賦形剤を含有する医薬組成物へと処方することができる。それらは適当な処方を用いて非経口、経口、吸入などのごとき従来の経路を用いて投与できる。また、当業者に公知の小分子の他の受動的または能動的輸送法も使用できる。適当な医薬上許容される担体は、限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたはデンプンのごとき炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香料油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを含む。非経口適用については、特に適しているのは注射可能な滅菌溶液、好ましくは油性または水性溶液、並びに懸濁剤、乳剤、または坐薬含む移植片である。特異的な場合において、事実上好ましい物質の有効量は、使用される特異的な物質、処方された特定の組成物、適用様式、適用の特定部位、および治療される生物によって異なる。個体に投与されるならば、所与の受容体のための投与量は、身体の大きさ、体重、齢並びに治療される病状のタイプおよび重篤度のごとき個体特性に基づいて決定されよう。また、ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の産生、もしくはそれ自身の異常性を原因とするヒトの病状を診断する方法も、本発明によって包含される。これらの方法は例えば、該細胞内もしくは生物学的サンプル中のＳＲＢ蛋白質、ＤＮＡまたはＲＮＡの同定および／または定量に基づく。生物学的サンプルは、血液、尿、糞便、組織サンプル、またはこれらの供給源から単離された細胞のごとき生物学的分泌液を含む。例えば、生物学的サンプルのＳＲＢＤＮＡを検出する方法は、公知の実験手段によってサンプルを得、次いでＤＮＡを単離し、その結果ＤＮＡプローブとハイブリダイズに使用できるＤＮＡを得ることによって達成され得る。該ＤＮＡプローブとは、それが標準的なハイブリダイゼーション条件の下で、ＳＲＢＤＮＡと選択的にハイブリダイズすることができるように、ＳＲＢＤＮＡ配列に十分相補的な核酸配列を持つ核酸プローブであると考えられる。これらの条件は当業者によって決定されたごとき高い緊縮条件であってもよい。ＳＲＢＤＮＡの検出および定量は、もし蛍光標識されたプローブが使用されるなら、蛍光検出のごとき、標準的な検出方法を用いて測定することができる。また、イムノアッセイを使用して細胞中に存在するＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮることもできる。例えば、生物学的サンプルを得、次いでＳＲＢ蛋白質への抗体の結合に適した条件下で、抗体と反応させることができる。もし該サンプルがＳＲＢ蛋白質を含めば、該抗体は該蛋白質と結合して抗体／ＳＲＢ蛋白質複合体を形成するであろう。この抗体／ＳＲＢ複合体は、当業者に公知であるごとくに、例えば検出可能なように標識され、かつこの複合体と結合すると考えられる二次抗体を用いて検出できる。本発明を以下の実施例によって例示するが、これに限定するものではない。実施例実施例１：ＳＲＢ２遺伝子およびＳＲＢ２のコードされた蛋白質分子分析ｐＣＴ２１は、ｐＵＣ１８ポリリンカーのＳａｃｌ−ＢａｍＨＩ部位に挿入されたｐＣＴ１９(Nonet,M.L,およびYoung,R.A.,Genetics 123:715-724(1989)由来の６．２ｋｂＳａｃｌ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片内にＳＲＢ２遺伝子を含む。ｐＣＴ２１のはめ合わされた欠損のセットを先に記載したごとくに作成し(Nonet， M.L.,ら、Mol ．Cell Biol．7:1602-1611(1987)、次いでＳＲＢ２および周囲のＤＮＡを二本鎖プラスミドＤＮＡｓから配列決定した。ｐＣＴ２０は、ポリリンカーのＳａｃｌ−ＢａｍＨＩ部位に挿入されたｐＣＴ１由来の６．２ｋｂＳａｃｌ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を含むｐＵＣ１８プラスミドである。ＳＲＢ２−１突然変異は、６つの２０ｂｐオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて二本鎖ｐＣＴ２０ＤＮＡを配列決定することによって推定された。ＣＴ１００＝ＡＣＴＡＣＡＡＴＣＣＧＧＧＣＴＴＡＴＣＣ（配列番号：１９）；ＣＴ１０１＝ＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＡＡＡＣＴＣＧＣＣＣ（配列番号：２０）；ＣＴ１０２＝ＧＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＴＴＡＧＣＡＣＧＧ（配列番号：２１）；ＣＴ２００＝ＣＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧ（配列番号：２２）；ＣＴ２０１＝ＴＡＧＡＣＴＴＴＣＧＧＡＣＧＴＡＣＣＧＧ（配列番号：２３）；ＣＴ２０２＝ＣＧＧＴＧＡＧＡＣＧＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧ（配列番号：２４）；全ＲＮＡは、Elderら.，Proc.Natl ．Acad．Sci．USA 80:2432-2436(1993)に記全ＲＮＡは、Elderら.，Proc.Natl ．Acad．Sci．USA 80:2432-2436(1993)に記載された方法を用いて、野生型からおよびｒｎａ２酵母細胞から単離され、ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡはこれらの調製物から精製された。ノーザン分析を、Nonet,M.ら、Cell，50:909-15(1987)に記載されたごとくに行った。ｐＣＴ２１由来の５５０ｂｐＮｃｏｌＤＮＡ断片をニック・トランスレーションして、プローブとして用いた。さらに、鎖特異的なプローブを作成し、ＳＲＢ２転写の配向の同定に用いた。オリゴヌクレオチドを配列９３２−９５２および１２０６−１２２６に対して相補的に合成し、ＳＲＢ２転写物の５’末端に置くためにポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを用いたプライマー伸張分析に用いた。ＤＮＡ構築物全てのＤＮＡ操作をSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Co ld Spring Harbor Laboratory 1989)に従って行った。位置指定突然変異誘発を、Kunkel，T.A.,ら、Meth ．Enzymol．154:367-382(1987)に記載されたごとくに行った。ＳＲＢ２の全コード領域をプライマーＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧＴＴＡＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＡＣＧＴＡＴＡＧ（配列番号：２５）を用いてｐＣＴ２９から欠失させた。このＳＲＢ２のコーディング配列がＨｐａｌ部位で置換され、ｐＣＭ２８−２を作成した。ＨＩＳ３をＨｐａｌ部位に導入するために、ｐＲＢ３２８由来の１．７５ｋｂＢａｍＨＩＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗを用いて処理することによって平滑末端化し、ｐＣＭ２８−２に連結してｐＴＫ３３（欠損対立遺伝子ｓｒｂ２Δ１：：ＨＩＳ３を含む）を作成した。１２ＣＡ５エピトープコーディング配列(Kolodziej，P.A.,ら、Mol ．Cell．Bi ol ．10:1915-1929(1990))を、プライマーＡＧＣＡＴＴＣＧＴＡＡＧＡＡＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＧＣＡＣＧＡＡＣ（配列番号：２６）を用いて、ｐＣＴ２９のＳＲＢ２蛋白質コーディング配列のカルボキシル末端に相接して導入し、ｐＴＫ２を作成した。エピトープでラベルしたＳＲＢ２は、欠失対立遺伝子ｓｒｂ２Δ１を十分に相補することが可能である。ＳＲＢ２のイントロンを、オリゴマーＴＣＣＡＣＧＡＡＴＡＴＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＴＧ（配列番号：２７）を用いて、ｐＴＫ２の遺伝子から除去し、ｐＴＫ２１を作成した。２つのプライマー、ＴＣＧＧＣＡＴＡＴＧＧＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＴＴＡＴ（配列番号：２８）およびＣＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＧＣＡＣＧＡＡ（配列番号：２９）を、バクテリア発現ベクターｐＥＴ３ａ(Studier， F.W.および Moffatt，B.A.，J ．Mol.Biol .189:113-130,(1986))のＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩ部位へ挿入するためのｐＴＫ２１のエピトープ標識ＳＲＢ２遺伝子のコーディング領域をＰＣＲを用いて増幅させ、ｐＴＫ２７を形成した。種々のＳＲＢ２対立遺伝子を含む系統の増殖表現型を分析するための同質遺伝子系統を構築するために、ｐＣＴ２５（ＳＲＢ２−１）またはｐＣＴ２７（ＳＲＢ２）由来の２．５ｋｂＸｂａｌ−Ｓａｌｌ断片をＹＣｐ４０５に挿入することによって、ｐＴＫ４４およびｐＴＫ４５を構築した。ｐＣＴ２５は、ＳＲＢ２ −１突然変異を含む以外は、ｐＣＴ２７と同一である。いくつかのプラスミドＤＮＡをイン・ビトロでの転写にための鋳型として用いた。Sha-Mei Liao(Whitehead Institute)の譲渡物であるｐＳＬ１８７は、ＧＡＬ４結合部位が除去されている以外はｐＧＡＬ４ＣＧ−(Chasman，D.I.,ら、Nat ure 339:679-684(1989))と同一である。ｐＪＪ４６０は、Michael WoontnerおよびJudith Jaehning(Wootner，M.,ら、Mol ．Cell．Biol.11:4555-4560(1991))の一種の譲渡物であった。遺伝学的分析ＳＲＢ２野生型細胞中にＣＴＤトランケーション突然変異を含む細胞の増殖表現型の分析は、従前に記載されており(Nonet，M.ら、(1987);NonetおよびYoung ，(1989))、本明細書に記載された実験を同様に行った。ｓｒｂ２Δ１のバックグラウンドで必要とされるＣＴＤ長の分析のための系統を作成するために、系統Ｚ４２６を、ｐＴＫ３３由来のｓｒｂ２Δ１：：ＨＩＳ３を含む３．３ｋｂＥｃｏＲＩ断片で形質転換した。Ｚ４２６は、ＵＲＡ３ＣＥＮプラスミドでＲＰＢ１の野生型コピーによって保護されたＲＰＢ１のゲノム欠損を有する（表２）。サザン分析によりｓｒｂ２Δ１：：ＨＩＳによって置換されたＳＲＢ２を有することが確かめられたＨｉｓ⁺コロニーをＺ４０４と呼んだ。ｓｒｂ２Δ１対立遺伝子との組み合わせにおいてＣＴＤトランケーションを含む細胞の生育力を系統Ｚ４０４(Boeke，J.,ら、Meth ．Enzymol．154:164-175(1987))を用いたプラスミドシャッフルによってアッセイした。種々のＣＴＤトランケーションを含むプラスミドが記載されている(Nonetら、(1987))。生存している系統について３８℃での温度感受性、１２℃で低温感受性を試験し、イノシトール栄養要求性突然変異体は従前に記載された(NonetおよびYoung，(1989))。ＳＲＢ２−１バックグラウンド (NonetおよびYoung，(1989))で必要とされるＣＴＤ長の分析のために、系統を従前に構築した。ＳＲＢ２対立遺伝子およびＣＴＤトランケーション対立遺伝子の組み合わせを含む系統を、３８℃、２５℃、および１２℃での増殖およびそれらのイノシトールを欠く最小培地での増殖能をアッセイした。実施例２：ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、ＳＲＢ６遺伝子およびコードされた蛋白質酵母の系統およびプラスミドを、それぞれ表３および４に挙げている。酵母培地を、ピルビン酸塩培地を除いて記載されたごとくに(Nonet，M.L.およびYoung ，R.A.,Genetics 123:715-724(1989))調製し、それは炭素源として２％のピルビン酸(Sigma)を加えた合成完全培地（ＳＣ）からなる。酵母の形質転換は、酢酸リチウム法(Schiestl，R.H.およびGietz，R.D.,Curr ．Genet.16:339-346(1989)) を用いて行った。プラスミドシャッフル法は、ＵＲＡ３プラスミドに対する選択剤として５−フルオロオロチン酸を用いて、Boeke，J.,ら、Meth ．Enzymol．154 :164-175(1987))によって記載されたごとくに行った。Ｚ５５１の低温感受性表現型の遺伝子外サプレッサーを、従前に記載されたごとくに(Nomet，M.およびYoung，R.A.,Genetics 123:715-724(1989))単離した。優性サプレッサーを、Ｚ２６に接合し、５−ＦＯＡを用いてｐＲＰ１１２の存在に対して選択し、次いでＹＥＰＤ上で１２℃にて増殖をアッセイすることによって同定した。１２℃で増殖可能な二倍体は、優性サプレッサーを含んでいた。ＬＥＵ２ＣＥＮプラスミドで種々のＲＰＢ１対立遺伝子（ｒｐｂ１−４、ｒｐｂ１−５、ｒｐｂ１−６、ｒｐｂ１−１０、ｒｐｂ１−１２、ｒｐｂ１−１３、ｒｐｂ１−１４、ｒｐｂ１−１５、およびｒｐｂ１−１８）を含む同質遺伝子野生型、ＳＲＢ４−１、ＳＲＢ５１、およびＳＲＢ６−１系統を、Ｚ２６、Ｚ５５５、Ｚ５５６、およびＺ５５７ならびにプラスミドシャッフル技術を用いて構築した。ＵＲＡ３ＣＥＮプラスミド、ｐＲＰ１−１［Ｕ］においてｒｐｂ１−１を含む同質遺伝子野生型、ＳＲＢ４−１、ＳＲＢ５−１、およびＳＲＢ６−１系統を、ｐＲＰ１−１［Ｕ］でＺ５５１、Ｚ５５２、Ｚ５５３、およびＺ５５４を形質転換することにより、続いてＳＣ−Ｕｒａ培地で増殖させてｐＣ６を欠失させることにより構築した。水中に同数の細胞を懸濁させ、等容量を４８プロング装置で寒天プレートに移植することにより、増殖アッセイを行った。ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、およびＳＲＢ６の欠失は、１段階分裂法(Rothstein，R. ，Meth ．Enzymol．194:281-301(1991)によって作成した。Ｚ５５８を所望のＤＮＡ断片で形質転換し、好ましい選択的培地上で平板培養した。１０を用いたサザン分析により、所望のＳＲＢ遺伝子の単一コピーが欠失されていることが確認された。該二倍体を胞子形成させ、四分子体（２０より大きい）をＹＥＰＤプレートで分裂させ、種々の温度での栄養要求性突然変異体および増殖の点数をつけた。ｓｒｂ４Δ２：：ＨＩＳ３断片を含むｐＣＴ５４のＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌ断片で形質転換し、ＳＣ−Ｈｉｓ培地上で平培養することにより、Ｚ５６５を作成した。各々の四分子体の２つ以下の胞子が生育可能で、これらはすべてヒスチジン栄養要求性突然変異体であり、ＳＲＢ４が不可欠であることを示した。ＳＲＢ４が不可欠であることを確かめるために、Ｚ５６５をｐＣＴ１５（ＵＲＡ３ＳＲＢ４）で形質転換し、四分子体を分裂させ、次いでＨｉｓ⁺Ｕｒａ⁺分離体を５− ＦＯＡプレートに線上に塗布した。それらは、５−ＦＯＡ含有培地では増殖できず、ＳＲＢ４が不可欠であることが確かめられた。ｓｒｂ５Δ１：：ＵＲＡ３− ｈｉｓＧ断片を含むｐＣＴ３７のＥｃｏＲＩ−Ｓｐｈｌ断片で形質転換し、次いでＳＣ−Ｕｒａ培地上で平板培養することにより、Ｚ５５９を作成した。ウラシルプロトトロピーに対して２：２の点数がついた分離体およびエア・ウラシルプロトトロフが、低温感受性、温度感受性、および緩慢な増殖表現型を示し、ＳＲＢ５欠失系統は条件付きで生育可能であることを示した。ｓｒｂ６Δ１：：ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ断片を含むｐＣＴ３８のＢｇｌｌｌ−ＢａｍＨｌ断片で形質転換し、ＳＣ−Ｕｒａ培地上で平板培養することにより、Ｚ５６４を作成した。各々の四分子体から２つ以下の胞子が生育可能で、これらは全てウラシル栄養要求性突然変異体であり、ＳＲＢ６が不可欠であることを示した。ＳＲＢ６が不可欠であることを確かめるために、Ｚ５６４をｐＣＴ６６（ＬＥＵ２ＳＲＢ６）で形質転換し、四分子体を分裂させ、次いでＺ５６６がＵＲＡ３遺伝子の除去を選択するために、Ｕｒａ⁺Ｌｅｕ⁺分離体を５−ＦＯＡ上で平板培養することによって作成された。Ｚ５６６をｐＣＴ４０（ＵＲＡ３ＳＲＢ６）で形質転換し、ｐＣＴ６６を欠失させるＳＣ−Ｕｒａ培地で増殖させ、次いで５−ＦＯＡプレートでの増殖に関して試験した。５−ＦＯＡ培地では増殖は観測されなかった。ＳＲＢ６が不可欠であることが確かめられた。イン・ビトロでの転写アッセイのための酵母核抽出物を作成するために、いくつかの系統が構築された。Ｚ４２５をＺ５６０に接合し、次いで四分子体を分裂させて、同一の温度感受性、低温感受性および緩慢な増殖表現型を示す、野生型Ｚ５６１、ｓｒｂ５Δ１：：ＵＲＡ３−−ｈｉｓＧ系統Ｚ５６２、およびｓｒｂ２Δ１：：ＨＩＳ３、ｓｒｂ５Δ１：ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ系統Ｚ５６３、Ｚ５６２およびおよびＺ５６３を作成する。ＤＮＡ法ＤＮＡの取り扱いは、Sambrookら、Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory 1989)に従って行った。位置指定突然変異活性は、Kunkel,T.A.,ら、Meth ．Enzymol．154:367-382(1987)に記載されたごとくに行った。ｐＣＴ５４（ｓｒｂ４Δ２）、ｐＣＴ３７（ｓｒｂ５Δ１）およびｐＣＴ３８（ｓｒｂ６Δ１）を作成するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を、全２５サイクルに対して、１．０ｍＭＭｇＣｌ₂および２００μＭｄＮＴＰを補足した緩衝液（製造業者により提供された）１００μｌ中でＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer)を用いて行った。プライマー濃度を５０ｎｇのＤＮＡで０．５μＭとし、サイクリングを９４℃（１．０分）、５０℃（１．０分）、および７２℃（２．５分）とした。ライブラリー構築およびクローン化系統Ｚ２８（野生型）、Ｚ５５２（ＳＲＢ４−１）、Ｚ５５３（ＳＲＢ５−１）、およびＺ５５４（ＳＲＢ６−１）から、酵母ゲノムＤＮＡライブラリーを調製した。ゲノムＤＮＡを部分的に単離し、Ｓａｕ３Ａで消化し、０．７％アガロースゲル上で分離し、６−１２ｋｂの断片を電気溶出によって精製し、Ｋｌｅｎｏｗを用いてその末端を部分的にｄ（ＡＧ）ＴＰでふさいだ。ＵＲＡ３動原体プラスミドｐＣＴ３をＸｈｏｌで消化し、次いでＳａｕ３Ａ消化ゲノムＤＮＡの末端と一致させるために、その末端を部分的にｄ（ＣＴ）ＴＰで塞いだ。結合に続いて、Ｈａｎａｈａｎの方法(Hanahan，D.,ら、Meth ．Enzymol．204:63-113(199 1))によって有効となったＤＨ５α細胞を形質転換した。ライブラリーは、およそ１０ｋｂの平均挿入サイズを持つおよそ１５０，０００個体の組換え体を含んだ。サブゲノムＤＮＡライブラリーは、先のゲノムＤＮＡライブラリーに関して記載されたものと同様の方法で、ｐＣＴ４（ＳＲＢ４）、ｐＣＴ１４（ＳＲＢ５ −１）、およびｐＣＴ２６（ＳＲＢ６−１）から調製された。プラスミド挿入ＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分的に消化し、次いで１．５％アガロースゲルで分離し、１−３ｋｂの断片をジーン・クリーン（ＢＩＯ１０１）によって精製し、次いでＫｌｅｎｏｗを用いてその末端を部分的にｄ（ＡＧ）ＴＰで塞いだ。断片を先の記載ごとくに調製したｐＣＴ３と連結させ、次いでＤＨ５α細胞中へ形質転換した。サブ。サブゲノムライブラリーは、２ｋｂの平均挿入サイズを持つおよそ２０，０００個体の組換え体を含んだ。ＳＲＢ４−１（ｐＣＴ８）、ＳＲＢ５−１（ｐＣＴ１４）、およびＳＲＢ６− １（ｐＣＴ２６）のゲノムクローンを、それぞれのゲノムライブラリーをＺ５５１に形質転換することによって単離し、ＳＣ−Ｕｒａ培地に平板培養し、１２℃ にプレートを置き、次いで３０℃にて回復期間として１２時間置いた。２０００の主要な形質転換体の中のおよそ１つが１２℃で増殖可能であった。形質転換した各ライブラリーにおいて、１２℃で増殖可能な１２を超えるＵｒａコロニーから、Hoffmsn，C.S.およびWinston，F.，Gene 57:267-272(1987)の方法によってゲノムクローンが単離され、Ｚ５５１の低温感受性表現型を抑圧する能力を再試験した。１１反復のＣＴＤトランケーション対立遺伝子と組み合わせた強い温度感受性の表現型を有する劣性ＳＲＢ４対立遺伝子を用いて、ＳＲＢ４（ｐＣＴ４）のゲノムクローンを野生型Ｚ２８ライブラリーから単離した。ｐＣＴ４の存在は、３８℃で、この系統に対する弱い温度感受性の表現型を回復する。ｐＣＴ１５およびｐＣＴ１６（ＳＲＢ４）、ｐＣＴ２０（ＳＲＢ５−１）、およびｐＣＴ２９（ＳＲＢ６−１）を単離するために、各々ｐＣＴ４（ＳＲＢ４），ｐＣＴ１４（ＳＲＢ５−１），およびｐＣＴ２６（ＳＲＢ６−１）由来のサブゲノムクローンを先に記載したごとくに選択した。ｐＣＴ１５とｐＣＴ１６とは、ＳＲＢ４のＤＮＡ下流の量が異なるのみである。Ｚ２２をＳａｃｌ−Ｘｈｏｌ−消化ｐＣＴ３２ＤＮＡで形質転換し、次いで染色体由来の野生型ＳＲＢ５配列でプラスミドを修復したＵｒａ⁺形質転換体からプラスミドを単離することによって、イン・ビボにおいてｐＣＴ３２からｐＣＴ３９を作成した(Rothstein．1991)。同様に、Ｂａｌｌ−Ｓｐｈｌ−消化ｐＣＴ２９ＤＮＡを用いてＳＲＢ６を単離して、ｐＣＴ４０を作成した。配列分析ｐＣＴ１５、ｐＣＴ２０、およびｐＣＴ２９由来の挿入ＤＮＡ（各々ＳＲＢ４、ＳＲＢ５−１、およびＳＲＢ６−１を含む）を各鎖で完全に配列決定した。一方向性欠失をＥｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅ系（Promega）を用いて構築し、次いでＴ３およびＴ７プロモータープライマーを用いて、ジデオキシヌクレオチドおよびＳｅｑｕｅｎａｓｅ（US Biochemical）を用いた二本鎖配列決定を製造業者が記載したごとくに行った。ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、およびＳＲＢ６中の抑圧突然変異は、全オープン・リーディング・フレームにわたったオリゴヌクレオチドプライマーを用いた配列決定によって推定された。そのＤＮＡの明確な番号付けは、翻訳の開始部位を予測することから始まる。ｐＣＴ１５（ＳＲＢ４）およびｐＣＴ４８（ＳＲＢ４−１）が配列決定され、次いで該ＳＲＢ−４突然変異はアミノ酸３５３をＧｌｙからＣｙｓに変更するＧからＴへのトランスバージョン（ヌクレオチド１０５７）として同定された。ｐＣＴ３９（ＳＲＢ５）およびｐＣＴ３２（ＳＲＢ５−１）が配列決定され、次いで該ＳＲＢ５−１突然変異は、アミノ酸２２をＴｈｒからｌｌｅへ変更するＣからＴへのトランスバージョン（ヌクレオチド６５）と同定された。ｐＣＴ４０（ＳＲＢ６）およびｐＣＴ２９（ＳＲＢ６ −１）が配列決定され、次いで該ＳＲＢ６−１突然変異は、アミノ酸８６をＡｓｎからＬｙｓに変更するＣからＧトランスバージョン（ヌクレオチド２５８）として同定された。配列比較分析をＢＬＡＳＴネットワークサービスを用いてNati onal Center for Biotechnology Informationにて行った。組換え蛋白質の精製ＳＲＢ２の精製は従前に記載されている。ＳＲＢ２を精製した場合と同様の方法で、ＳＲＢ５蛋白質をプラスミドｐＣＴ９８を運ぶバクテリア系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳから精製した。Smith，D.B.およびJohnson K.S.，Gene.67:3 1-40(1988)の方法に従って、ＳＲＢ４およびＳＲＢ６を、各々ｐＣＴ１０７およびｐＣＴ１１６を運ぶＤＨ５αからＧＳＴへの融合体として精製した。Chasman ，D.I.ら、Nature 339:679-684(1989)によって記載されたごとくに、ＧＡＬ４（１−１４７）−ＶＰ１６蛋白質をｐＪＬ２を運ぶＸＡ９０から精製した。グルタチオン−アガロース（Sigma）およびＮｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen）上でのアフィニティークロマトグラフィーによって、次いでＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Pharmacia）上でのイオン交換クロマトラフィーによって、ＣＴＤアフィニティー精製のためのＧＳＴ−融合蛋白質を、ｐＤＣ１２７またはｐＤＣ１３０を運ぶＤＨ５αから精製し、およそ９５％の純度となった。イン・ビトロでの転写イン・ビトロでのプロモーター依存性転写を、Liao，S.M.ら、Genes．Dev．5: 2431-2440(1991)によって記載されたごとくに行った。反応当たり６００ｎｇの鋳型が使用されるテンプレート・コミットメント・アッセイを除けば、イン・ビトロでのプロモーター依存性転写反応には３００ｎｇの鋳型が用いられた。１００μｇのＺ５６１蛋白質、１５０μｇのＺ５６２蛋白質、および１５０μｇのＺ５６３蛋白質を用いて光学活性を得た。ＦｕｊｉＢｉｏ−ｉｍａｇｅａｎａｌｙｚｅｒを用いて転写物を定量し、プロモーター依存性転写アッセイを(Nonet， M．ら、Cell 50:909-915(1987)に従って行った。イン・ビトロでの転写に用いる精製ＳＲＢ複合体は以下に記載するごとくに精製した。第２のＢｉｏｒｅｘ７０カラムからの溶出液を緩衝液Ａ（５０）（５０ＭＭの酢酸カリウムを含む緩衝液Ａ）中で透析し、次いでＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０フィルターユニット（Amic on）での遠心分離によって４倍に濃縮した。図３Ａは、鋳型ｐＧＡＬ４ＣＧ^-がＧ−欠損転写の発現を指示する単一のＧＡＬ４結合部位のＣＹＣ１ＴＡＴＡ要素下流を含むことを示す。図３Ｂおよび３Ｃは、組換えＳＲＢ２（２５０ｎｇ）および／またはＳＲＢ５（２５０ｎｇ）の存在下または不存在下において、ｐＧＡＬ４ＣＧ^-鋳型から特異的な転写物を合成する能力について、野生型細胞（Ｚ５６１）またはｓｒｂ５ Δ突然変異細胞（Ｚ５６２）由来の核抽出物を試験したことを示す。転写反応は、組換えＧＡＬ４−ＶＰ１６（１５０ｎｇ）の不存在下（Ｂ）または存在下（Ｃ）で行った。（Ｂ）で示されたフィルムは（Ｃ）で示されたものより５倍長く曝した。定量結果は、ｓｒｂ５Δ抽出物によって産生された特異的転写物のレベルが、付加ＳＲＢ蛋白質の不存在下で野生型抽出物によって産生されたものよりも５０倍より少ないことを示す。ｓｒｂ５Δ抽出物へのＳＲＢ２およびＳＲＢ５の双方の付加により、転写物レベルが野生型抽出物で観測されたそれの約４０％まで回復した。図３Ｄおよび３Ｅは、組換えＳＲＢ２（２５０ｎｇ）および／またはＳＲＢ５（２５０ｎｇ）の存在下または不存在下でｐＧＡＬ４ＣＧ^-鋳型からの特異的な転写物を合成する能力について、野生型細胞（Ｚ５６１）またはｓｒｂ２Δ１、ｓｒｂ５Δ１突然変異細胞（Ｚ５６３）由来の核抽出物を試験したことを示す。転写反応を、組換えＧＡＬ４−ＶＰ１６（１５０ｎｇ）の不存在下（Ｄ）または存在下（Ｅ）で行った。（Ｄ）で示されたフィルムは（Ｅ）のものより５倍長く曝した。定量結果は、ｓｒｂ２Δ、ｓｒｂ５Δ抽出物によって生成された特異的な転写物のレベルが、付加ＳＲＢ蛋白質の不存在下で野生型抽出物によって産生されたものよりも５０倍より少ないことを示す。ｓｒｂ２Δ、ｓｒｂ５Δ抽出物へのＳＲＢ２およびＳＲＢ５の双方の付加により、転写物レベルが野生型抽出物で観測されたものの約４０％まで回復した。テンプレート・コミットメント・アッセイ図４Ａおよび４Ｂで示したごとくに、十分なプレインキュベーション複合体形成が不可欠である。（Ａ）ＳＲＢ２は安定なプレインキュベーション複合体の形成に必要である。テンプレート・コミットメント・アッセイに用いられた鋳型は、各々Ｇ−欠損転写物の発現を指示する単一のＧＡＬ４結合部位のＣＹＣ１ＴＡＴＡ要素下流に含まれた。長い（Ｌ）鋳型（ｐＧＡＬ４ＣＧ）は４００ｎｔのＧ−欠損カセットに含まれ、短い（Ｓ）鋳型（ｐＣＴ１０８）は３００ｎｔのＧ −欠損カセットに含まれた。該２つの鋳型をｓｒｂ２Δ１、ｓｒｂ５Δ１細胞（Ｚ５６３）、ＳＲＢ（２５０ｎｇ）およびＧＡＬ４−ＶＰ１６（１５０ｎｇ）由来の核抽出物とともに別々にインキュベートした。制限量のＳＲＢ２蛋白質（２５ｎｇ）を、２つの反応混合物の１つに加えた。６０分のプレインキュベーションの後、２つの反応を一緒に混合し、アリコートを１０分間隔で取り出し、転写的に十分な複合体をヌクレオシド三リン酸の付加によってアッセイした。再開始を最小にするために７分後に反応を停止した。対照実験をレーン１−４に示す。ｓｒｂ２Δ１、ｓｒｂ５Δ１細胞由来の抽出物を、ＳＲＢ２、ＳＲＢ５およびＧＡＬ４−ＶＰ１６と、短種および長種鋳型を個々に（レーン１−２）または組み合わせて（レーン３）プレインキュベートした。レーン４では、双方の鋳型をＳＲＢ５およびＧＡＬ４−ＶＰ１６は存在するがＳＲＢ２は存在しない条件下でインキュベートした。プレインキュベーション反応物の混合後、アリコートを取り出して示された時点でヌクレオシド三リン酸を加えた（レーン５−１２）。（Ｂ）ＳＲＢ５は安定なプレインキュベーション複合体の形成に必要である。プレインキュベーションを制限量のＳＲＢ５（７５ｎｇ）および過剰なＳＲＢ２（２５０ｎｇ）の存在下または不存在下で行うことを除いて、（Ａ）と同様にテンプレート・コミットメント・アッセイを行った。ＳＲＢ複合体の精製精製スキームの概略を図５Ａに示す。酵母系統ＢＪ９２６(Buchman，A.R.ら、Mol ．Cell．Biol .8:5086-5099(1988))を、３０℃において１×ＹＮＢ培地（０．１５％Ｄｉｆｃｏｙｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅ、０．５％硫酸アンモニウム、２００μＭイノシトール、２％グルコース）中でＯＤ₆₀₀が４．０−４．５になるまで増殖させた。該ＳＲＢ複合体のレベルは最小培地で増殖した細胞で増加していると思われ、この観察がＳＲＢ複合体を含むＴＢＰの精製を容易にするために利用された。細胞を遠心分離によって回収し、次いで氷冷緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および１ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄した。Sayre，M.H.ら、J ．Biol．Chem．267:23376-23382(1992)に記載されているごとくに、全細胞抽出物を４８０ｇの細胞ペーストから調製した。用いられたプロテアーゼ阻害剤はここに示された：１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、２ｍＭベンズアミジン、２μＭペプスタチンＡ、０．６μＭロイペプチン、２μｇ／ｍｌキモスタチン、５μｇ／ｍｌアンチパインＨＣｌ(Sigma)であった。精製中、ＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、およびＳＲＢ６に対する抗体を用いるウエスタンブロットによって、該ＳＲＢ複合体を監視した。微修正したBlum， H.ら、Electrophoresis 8:93-99(1987)を標準として、ゲルの銀染色を行った。該ゲルを最低でも４時間固定し、次いで硝酸銀との含浸を４０分間行った。全細胞抽出物（３９０ｍｌ中に８ｇの蛋白質）を緩衝液Ａ（２０％グリセロール、２０ｍＭＨＥＰＥＳＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＥＤＴＡ、およびプロテアーゼ阻害剤）で１：５に希釈した。該抽出物を５ｃｍ×１７ｃｍＢｉｏｒｅｘ７０(Bio Rad Laboratories)カラムに流速５ｍｌ／分で充填した。カラムからさらに蛋白質が溶出しなくなるまで、該カラムを緩衝液Ａ（１００）で洗浄した。次いで、該カラムを緩衝液Ａ（３００）および緩衝液Ａ（６００）の段階洗浄で溶出させた。該ＳＲＢ複合物は、６００ｍM酢酸カリウムの工程で溶出した。Ｂｉｏｒｅｘ７０（６００）画分（１２０ｍｌ中に２５０ｍｇ）を緩衝液Ｂ（２０％グリセロール、２０ｍＭＴｒｉｓ−アセテート（ｐＨ７．９）、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、およびプロテアーゼ阻害剤）で１：６に希釈し、次いで２．５ｃｍ×８．５ｃｍジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファクリルカラム（Pharmacia）に流速４ｍｌ／分で充填した。該カラムを緩衝液Ｂ（１００）で広範囲にわたって洗浄し、次いで緩衝液Ｂ（４００）および緩衝液６（６５０）の段階洗浄で溶出させた。該ＳＲＢ複合物は、このカラムから４００ｍＭ酢酸カリウムの段階で溶出した。ＤＥＡＥ−セファクリル（４００）画分（４８ｍｌ）を、緩衝液Ｃ（２０％グリセロール、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．７）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭＤＴＴ、０．２５ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、およびプロテアーゼ阻害剤）中で透析した。該透析物をＳｏｒｖａｌｌＳＳ３４ローターで１０，０００ｒｐｍにて２０分間回転させ、上清（５０ｍｌ中に５０ｍｇの蛋白質）を１．５ｃｍ×６．５ｃｍＢｉｏ−ＧｅｌＨＴＰＨｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅに流速１ｍｌ／分で充填した。該カラムを２０ｍｌの充填緩衝液で洗浄し、緩衝液Ｃないし緩衝液Ｄ（緩衝液Ｄは、３００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．７１）を含む以外は緩衝液Ｃと同一である）の１２０ｍｌの直線勾配で溶出させた。該ＳＲＢ複合物は、６８−１１２ｍＭリン酸カリウムに相当するピークでこのカラムから溶出した。Ｂｉｏ−ＧｅｌＨＴＰ(Bio-Rad Laboratories)からの２０ｍｌの溶出液を、１００ｍＭ酢酸カリウムを含む緩衝液Ｅ（０．２５ｍＭＥＤＴＡ以外は緩衝液Ｂと同一である）に対して透析した。該透析物をＳｏｒｖａｌｌＳＳ３４ローターで１０，０００ｒｐｍにて２０分間回転させ、上清（２０ｍｌ中に１１ｍｇの蛋白質）をMono Q HR 5/5 fast protein liquid chromatography column(Pharma cia)に充填し、流速０．５ｍｌ／分で緩衝液Ｅ（１００）ないし緩衝液Ｅ（２０００）の１５ｍｌの直線勾配で溶出させた。該ＳＲＢ複合物は、０．９５Ｍ酢酸カリウムでこのカラムから溶出した。ＳＲＢ活性を含むピーク画分を緩衝液Ｆ（０．２５ｍＭＥＤＴＡ以外は緩衝液Ａと同一である）で１：６に希釈した。この試料（１０ｍｌ中に１．１ｍｇの蛋白質）をＭｏｎｏＳＨＲ．５／５ＦＰＬＣカラム（Pharmacia）に充填し、流速０．５ｍｌ／分で緩衝液Ｆ（１００）ないし緩衝液Ｆ（１０００）の１０ｍｌ勾配で溶出させた。該ＳＲＢ複合物は、４５０ｍＭ酢酸カリウムでこのカラムから溶出した。この試料（８ｍｌ中に０．６ｍｇの蛋白質）を緩衝液Ｅ（０）で１：４に希釈し、次いで１．５ｕｍ×１．５ｃｍＤＥＡＥ−セファクリルカラムに充填し、流速０．３ｍｌ／分で緩衝液Ｅ（１００）ないし緩衝液Ｅ（１０００）の２０ｍｌ勾配で溶出させた。該ＳＲＢ複合物は、４００ｍＭ酢酸カリウムでこのカラムから溶出した。（さらなるクロマトグラフィーから、この試料は約９０％の純度であることが明らかになった。）この試料（２ｍｌ中に０．５ｍｇの蛋白質）を緩衝液Ｆ（０）で１：４に希釈し、１．５ｃｍ×１ｃｍＢｉｏｒｅｘ７０カラムに充填し、緩衝液Ｆ（１００）ないし緩衝液Ｆ（１０００）の１０ｍｌ勾配で溶出させた。該ＳＲＢ複合物は、６００ｍＭ酢酸カリウムでこのカラムから溶出し、約９５％の純度であった。該ＳＲＢ複合体の全収量は０．５ｍｇであり、精製は１０，０００倍であると評価された。該ＳＲＢ複合体をＳｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲ１０／３０ＦＰＬＣカラム（Ph armacia）において緩衝液Ｆ（４００）でゲル濾過クロマトグラフィーに付した。評価された該ＳＲＢ複合体の分子の大きさは、チログロブリン（６６９ｋｄ）、アポフェリチン（４４３ｋｄ）、牛血清アルブミン（１３２ｋｄ、６６ｋｄ）およびカルボニック・アンヒドラーゼで行った検定曲線の外挿によって決定した。ＣＴＤアフィニティー精製全細胞抽出物を、１．６ｌの４％グルコースを８００ｇのレッド・スター乾燥酵母に加え、該混合物を室温にて４５分間インキュベートし、次いで８００ｍｌの破壊緩衝液（１．２Ｍ硫酸アンモニウム、０．１６ＭＫ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、４ｍＭＤＤＴ、およびプロテアーゼ阻害剤［上記の従来の精製と同様］）を加えることによって調製した。アリコート（２００ｍｌ）を液体窒素中で一滴ずつ冷凍し、Ｗａｒｉｎｇｂｌｅｎｄｅｒ中で５−１０分間混合した。５５℃で解凍した後、短時間混合することによって粘度を下げた。破壊された細胞をＳｏｒｖａｌｌＧＳＡローターで１２，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、次いで透明の上清をチーズクロスで濾過した。ＰｏｌｙｍｉｎＰの１０％溶液の２０分の１容量を加え、該抽出物を３０分間氷上でインキュベートし、次いで該溶液をＳｏｒｖａｌｌＧＳＡローターで１２，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。該上清を回収し、次いで固体の硫酸アンモニウムで７０％飽和とし、次いで４℃にて保存した。該上清のアリコートを貯蔵液から採取し、ＳｏｒｖａｌｌＧＳＡローターで１２，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。該ペレットを１．５容量の１× 転写緩衝液（Liao， S．M．，ら、Genes Dev．5：2431−2440（1991））＋プロテアーゼ阻害剤中に再懸濁し、次いでＳｏｒｖａｌｌＳＳ３４ローターで１７，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。次いで、該上清を１×転写緩衝液＋プロテアーゼ阻害剤で１：６希釈し、次いでＳｏｒｖａｌｌＧＳＡローターで１２，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。該上清を１０ｇ／１００ｍｌの細胞残渣除去剤(Whatman Labsales)とともに１５分間インキュベートした。該細胞残渣除去剤を遠心分離および濾過によって除去した。次いで、透明の上清をＢｅｃｋｍａｎ５０．２Ｔｉローターで４０，０００ｒｐｍにて１−２時間遠心分離した。ＧＳＴ融合蛋白質を、マトリックス１ｍｌ当たり５ｍｇの蛋白質濃度で製造業者の指示に従って、Pharmaciaが活性化したＣＨＳｅｐｈａｒｏｓｅに結合させた。該アフィニティー・マトリックスを６Ｍ塩酸グアニジンで洗浄し、続いて使用前に１×転写緩衝液で洗浄した。２０ｍｌの酵母全細胞抽出物を１／１０容量の１×転写緩衝液＋１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と混合し、次いでＧＳＴ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＧＳＴ−ＣＴＤＳｅｐｈａｒｏｓｅのいずれか１００ μｌに加えた。該カラムを、２０ｍｌの１×転写緩衝液＋１％ＴｒｉｔｏｎＸ −１００で洗浄し、続いて５ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含まない１×転写緩衝液で洗浄した。結合蛋白質を、種々の濃度の塩酸グアニジンを含む１×転写緩衝液で溶出させた。ウエスタンブロット分全ＴＢＰ、ＳＲＢ２、およびＳＲＢ５蛋白質に対して構築されたポリクローナルウサギ抗血清を用いて、画分のウエスタンブロッティングを行った。ＧＳＴ− ＳＲＢ４融合蛋白質、またはＧＳＴ−ＳＲＢ６融合蛋白質は標準法による。８ＷＧ１６モノクローナル抗体腹水液(Thompson，N.E.ら、J ．Biol．Chem.164:11511 -11520(1989))を用い、ＣＴＤを介して、ＲＰＢ１を検出した。ポリクローナル抗−ＴＢＰ、抗−ＳＲＢ２、抗−ＧＳＴ−ＳＲＢ４、および抗−ＳＲＢ５抗血清を１：１０００に希釈した。抗−ＧＳＴ−ＳＲＢ６抗血清を１：２００に希釈した。８ＷＧ１６モノクローナル抗体腹水液の１：１０００希釈液を用いた。全ての場合において、アルカリホスファターゼコンジュゲート二次抗体（Promega）を用いて二次的にプローブすることによって、バンドを視覚化した。図５Ｂ、左パネルは、ＳＲＢ複合体精製の各画分由来の約１μｇの蛋白質を含む肝臓染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（１５％）ゲルを示す。レーン１は全細胞抽出物；レーン２はｂｉｏｒｅｘ７０；レーン３はＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ；レーン４はヒドロキシルアパタイト；レーン５はＭｏｎｏＱ；レーン６はＭｏｎｏＳ；レーン７はＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニット、ＳＲＢ蛋白質、ＴＢＰ、および該複合体の候補的サブユニットである付加的ポリペプチドの位置は、Ｍ、マーカーと示されている。図５Ｂ、右パネルは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（１５％）ゲルに充填し、次いでＳＲＢおよびＴＢＰ蛋白質に対する抗体でプローブしたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ画分由来のＳＲＢ複合体蛋白質１μｇのウエスタンブロット分析を示す。該抗体プローブは：レーン１はポリクローナル抗−ＳＲＢ２；レーン２はポリクローナル抗−ＳＲＢ４；レーン３はポリクローナル抗−ＳＲＢ５；レーン４はポリクローナル抗−ＳＲＢ６；レーン５はポリクローナル抗−ＴＢＰである。図５Ｃは、ウエスタンブロット分析が、Experimental Proceduresに記載されたごとくに、ＭｏｎｏＳカラムから共溶出するＳＲＢ蛋白質、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＴＢＳ、ＭｏｎｏＱカラムから半精製されたＳＲＢ複合体（全蛋白質の０．８ｍｇ）をＭｏｎｏＳカラムに充填し、次いで酢酸カリウムの０．１−１．０Ｍ勾配で溶出させることを明らかにすることを示す。オンプットおよびフロースルー・マテリアル（１／２５）、並びに他のあらゆる溶出画分（１／５０）が、ＲＰＢ１、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、ＳＲＢ２、ＴＢＰ、およびＳＲＢ６の存在に対するウエスタンブロットによって分析された。該ＳＲＢ複合体は、およそ０．４Ｍの酢酸カリウムに相当するピークで溶出した。実施例３：ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素活性ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素活性のイン・ビトロでの転写活性ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を実施例２に記載したごとくに精製した。因子ａが、イン・ビトロでの転写のためのＴＢＰおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体に加えて必要とされる（Sayre， M．H．ら、J ． Biol． Chem．267：23 383−23387（1992））。ヘパリン−ＣＬ６Ｂカラムから溶出した半精製因子ａ（２ｍｌ中３００μｇの蛋白質）をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムに充填し、次いで酢酸カリウムの０．１５−１．０Ｍ勾配で溶出させた。オンプットおよびフロースルー並びに酢酸カリウム０．３２と１．０Ｍとの間でこのカラムから溶出する１つおきの画分の一部を、転写活性およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによるポリペプチドの存在について分析した。アッセイは、ｐＧＡＬ４Ｇ−鋳型（３００ｎｇ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体（１μｇ）、組換えＴＢＰ（４０ｎｇ）、並びに１μｌのＯＰ、ＦＴ、および該カラムからの１つおきの画分、並びに２．５ μｌのＯＰ、ＦＴ、および１つおきのカラム画分を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動に付した。標準的なプロトコルを用いて、ゲルを銀で染色した。該ホロ酵素、因子ａ、およびＴＢＰは、イン・ビトロでの転写用に十分である。転写反応を、ｐＧＡＬ４Ｇ−鋳型（３００ｎｇ）および標準的条件３０で行った。該ホロ酵素（１μｇ）、因子ａ（４０ｎｇ）、および組換えＴＢＰ（４０ｎｇ）を示されたごとくに反応に加えた。この出願におけるこの図および他の図は、ＵＭａｘＵＣ８０ＭａｘＶｉｓｉｏｎｄｉｇｉｔａｌｓｃａｎｎｅｒを用いてスキャンした一次データのデジタルレプリカから作成した。ホロ酵素はＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび開始因子の複合体であるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（図６Ａ）から溶出した半精製ホロ酵素を、ＭｏｎｏＳカラムに充填し、次いで酢酸カリウムの０．１−１．０Ｍ勾配で溶出させた。オンプット（ＯＰ）およびフロースルー（ＦＴ）ならびに酢酸カリウム０．１Ｍと０．９Ｍとの間で溶出する１つおきの画分を、ホロ酵素活性について分析した（上のパネル）。また、これらのサンプルは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび転写因子の存在についてもウエスタンブロットによって分析された（下のパネル）。上のパネルでは、ｐＧＡＬ４Ｇ−鋳型（３００ｎｇ）、因子ａ（４０ｎｇ）、組換えＴＢＰ（４０ｎｇ）、並びに１μｌのＯＰ、ＦＴ、およびＭｏｎｏＳカラムからの１つおきの画分を用いて、転写アッセイを行った。下のパネルでは、また１μｌの同画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いでニトロセルロースにブロットした。該ブロットを、因子ｂ（ＴＦＢ１）、因子ｅ（ＳＵＡ７）、ＳＲＢ２、ＳＲＢ４、ＳＲＢ５、およびＳＲＢ６の７３ｋＤサブユニットに特異的なポリクローナル抗体並びにＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＰＢＩ）の最大サブユニットに特異的なモノクローナル抗体でプローブした。図６Ｂは、ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素のポリペプチド組成を示す。１μｇの精製ホロ酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、銀で染色した。精製ホロ酵素のウエスタンブロットを、ＳＲＢ複合体のサブユニットを同定するために、図６Ａで用いた抗血清でのゲルの隣接レーンのサンプル実験で行った。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＳＲＢ蛋白質のサブユニット、または開始因子のサブユニットに大きさにおいて一致するホロ酵素調製における蛋白質が示されている。蛋白質の分子量の大きさの基準は、ｋＤで示されている。図６Ｃは、ホロ酵素成分のＳＲＢ５との共免疫沈降を示す。１５μｇの精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩを、グルタミン酸カリウムの代わりに酢酸カリウム、０．０１％ＮＰ４０、および０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む０．５ｍｌの転写緩衝液で希釈した。１ｍｇのアフィニティー精製抗−ＨＳＰ７０または抗−ＳＲＢ５抗体、および５ｍｇの組換えＳＲＢ２またはＳＲＢ５蛋白質を示されたごとくに加えた。免疫沈降物質を、転写因子サブユニットおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩの存在について（Ｂ）示されたごときにウエスタンブロットによって分析した。図６Ｄは、ホロ酵素成分の定量を示す。全細胞抽出物、核抽出物、および精製ホロ酵素のサンプルを、標準量の精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび組換え転写因子サブユニットとともにウエスタンブロッティングによって定量した。各ゲルは、下記を含んだ：２５μｇ酵母全細胞抽出物（レーン１）、２５μｇ酵母核抽出物（レーン２）、１μｇ精製ホロ酵素（レーン３）、および０．２μｇ精製ホロ酵素（レーン４）。また該ゲルは、レーン５−７において精製標準蛋白質を以下の量で含んだ：８、４０、および２００ｎｇＲＮＡポリメラーゼＩＩ；４、２０、および１００ｎｇ６Ｈｉｓで標識した因子ｅ（ＳＵＡ７）；３．２、１６、および８０ｎｇＳＲＢ２；４、２０、および１００ｎｇＳＲＢ５；３．２、１６、および８０ｎｇＴＯＡ１；３．２、１６、および８０ｎｇＴＢＰ。この分析に用いたエピトープで標識されたＳＲＢ２、および６Ｈｉｓで標識された因子ｅ（ＳＵＡ７）は、それらの標識されていない相対物よりわずかに低い移動性を示す。該ホロ酵素中のＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤは低リン酸化型（ＩＩＡ）である。図６Ｅは、ホロ酵素成分の概要を示す。１μｇの該ホロ酵素中の各ホロ酵素成分の量は、（Ｄ）での標準量との比較により決定した。各成分の分子量を考慮すると、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ分子当たりの各因子の化学量論が提起される。ホロ酵素による転写がＧＡＬ４−ＶＰ１６によって促進される図７Ａに示すごとくに、Ｇ−欠損カセットの転写を指示するＣＹＣＩＴＡＴＡ要素を含む鋳型（−ＧＡＬ４部位鋳型）か、またはさらにＴＡＴＡ要素のＧＡＬ４蛋白質下流のための単一の共通ＤＮＡ結合部位を含む鋳型（＋ＧＡＬ４部位鋳型）のいずれかを用いて転写反応を行った。ＧＡＬ４−ＶＰＩ６（１５０ｎｇ）を示されたごとくに反応に加えた。上のパネルでは、示されたごとくに反応をホロ酵素（１μｇ）、因子ａ（４０ｎｇ）、組換えＴＢＰ（４０ｎｇ）、および各鋳型（１００ｎｇ）を用いて行った。下のパネルでは、酵母核抽出物（１５０ μ ｇ）を用いて反応を行った。核抽出物を含む反応において、転写はＧＡＬ４−ＶＰ１６によって１０倍促進された。ホロ酵素による転写は、ＧＡＬ４−ＶＰ１６によって５倍促進された。＋ＧＡＬ４部位鋳型はｐＧＡＬ４Ｇ−である。ＧＡＬ４部位鋳型はｐＳＬ１８７である。上のパネルでの露出は、下のパネルでの露出より５倍長かった。転写のレベルをＦｕｊｉＢｉｏ−ｉｍａｇｅＡｎａｌｙｚｅｒを用いて定量した。図７Ｂに示されたごとくに、ＰｖｕＩＩ制限エンドヌクレアーゼでの消化によって直線化した、２２５ｎｇの鋳型を用いた以外は、先に記載したごとくに、ホロ酵素を用いて反応を行った。この露出は、（Ａ）におけるホロ酵素パネルよりも３倍長かった。実施例４：ＳＲＢ７、ＳＲＢ８、ＳＲＢ９、ＳＲＢ１０、ＳＲＢ１１遺伝子およびそれらがコードした蛋白質酵母系統およびプラスミドを、それぞれ表５および６に列挙した。酵母培地を、(Thompson，C.M.ら、Cell 73:1361-1375(1993)に記載されたごとくに調製した。酵母形質転換は、酢酸リチウム法(SchiestlおよびGietz，1989)を用いて行った。プラスミドシャッフル法は、ＵＲＡ３プラスミドに対する選択剤として５−フルオロオレチン酸（５−ＦＯＡ）を用いて、Boeke，J.ら、Meth ．E nzymol ．154:164-175(1987)に記載されたごとくに行った。Hoffman,C.S.ら、Win ston, F.Gene 57:267-272(1987)に記載されたごとくに、プラスミドを酵母から回収した。増殖アッセイは、同様数の細胞を水に懸濁させ、次いで４８プロング装置を用いて等容量を寒天プレートに移植することによって行った。いくつかの系統のフロキュレーションを減じるために、細胞を最初に１００ｍＭＥＧＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ７．５で洗浄した。Ｚ５５１の低温感受性表現型の遺伝子外サプレッサーを、従前に記載したごとくに単離した。Ｚ２６に接合し、５−ＦＯＡを用いてｐＲＰ１１２の存在に対して選択し、次いでＹＥＰＤ上で１２℃にて増殖をアッセイすることによって、優性および劣性のサプレッサーを同定した。１２℃で増殖可能な二倍体は、優性サプレッサーを含んでいた。１２℃で増殖できない二倍体は、劣性サプレッサーを含んでいた。およそ半分の優性サプレッサーおよび半分の劣性サプレッサーの相反する接合型の酵母系統は、ガラクトース誘導プロモーターの制御の下、プラスミドに位置するＨＯ遺伝子の発現により切り替えられる接合型のの誘導によって生じる。優性的な抑圧突然変異のランダム胞子分析を、２つの独立した単離物が同一遺伝子中に突然変異を含むかどうかを決定するために用いた。各々ＣＴＤトランケーション突然変異ｒｐｂ１Δ１０４および独立して単離されたＳＲＢ突然変異を含む半数体を互いに接合させて二倍体を形成した。これらの二倍体をプレート上で胞子形成させ、次いで少量の胞子を削り取って、０．５ｍｌ３０ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび１００ｎｇ／ｍｌＺｙｍｏｌａｓｅ１００Ｔ（ＩＣＮ）中で３０℃にて一晩振とうした。０．５ｍｌの１．５％ＮＰ−４０および０．４ｇのガラスビーズを加え、次いで該混合物を氷上で１５分間維持した。次いで、該懸濁液を３分間攪拌し、５分間氷上で維持し、２分間攪拌し、次いで該ガラスビーズを室温にて１０分間静置した。該懸濁液を取り出し、２分間回転させ、次いで該ペレットを一度水で洗浄し、次いで水に再懸濁させ、次いで一部をＹＥＰＤ上で平板培養した。およそ５０の半数体後代を、１２℃でそれらの増殖能についてアッセイした。もし１２℃で全ての半数体が増殖できたならば、次いで２つのＳＲＢ単離物が同一の遺伝子に突然変異を含むと仮定された。劣性対立遺伝子の遺伝的相補性は、二倍体を形成するための、それぞれＣＴＤトランケーション突然変異ｒｐｂ１Δ１０４および独立して単離されたｓｒｂ突然変異を含む互いの半数体が接合すること、および１２℃でのそれら二倍体の増殖能を評価することによるアッセイを評価することに関与していた。１２℃で増殖可能な二倍体は、同一の遺伝子中にｓｒｂ突然変異を含むと仮定された。それぞれの相補性グループの遺伝子クローンを、相補性グループのそれぞれのメンバーの同一性を確認し、および付加的メンバーを同定するために用いた。野生型に相当するＳＲＢ対立遺伝子で形質転換した場合、ＣＴＤトランケーション突然変異ｒｐｂ１Δ１０４を含む細胞および劣性ｓｒｂ対立遺伝子は、１２℃およびピルビン酸塩培地で増殖できなかった。ＳＲＢ７、ＳＲＢ８およびＳＲＢ９の欠失を１段階破壊法によって作成した。Ｚ５５８を所望のＤＮＡ画分で形質転換し、次いでＳＣ−Ｕｒａ培地上で平板培養した。所望のＳＲＢ遺伝子の単一のコピーが欠失していることを確かめるために、サザン分析を用いた。ＹＥＰＤプレート上で二倍体を胞子形成させ、次いで四分子体を分割し（＞２０）、次いで種々の温度での栄養要求性突然変異および増殖について記録した。Ｚ５７５は、ｐＣＨ４６由来のｓｒｂ７Δ１：：ＵＲＡ３ｈｉｓＧ断片を用いた形質転換によって作成された。それぞれの四分子体由来の２以下の胞子が増殖可能であり、それらの胞子は、ＳＲＢ７が不可欠であることを示すウラシル栄養要求性突然変異体であった。Ｚ５７６はｐＳＬ３１５由来のｓｒｂ８Δ１：：ＵＲＡ３ｈｉｓＧ断片での形質転換によって作成され、Ｚ５７７はｐＣＨ６６由来のｓｒｂ９Δ１：：ＵＲＡ３ｈｉｓＧ断片での形質転換によって作成された。各々の場合において、分離物はウラシルプロトトロピーについて２：２を記録し、全ウラシルプロトトロフは穏やかな低温感受性、温度感受性、および緩慢な増殖表現型を示し、このことはＳＲＢ８およびＳＲＢ９欠失系統が条件的に増殖可能なことを示す。また、ｓｒｂ８ＡΔ１およびｓｒｂ９Δ１系統は、ＳＲＢ８およびＳＲＢ９の抑圧単離物であるかのごとくフロキュレントである。ＳＲＢ８およびＳＲＢ９の特徴付けられていない欠失を含む系統を、５ −ＦＯＡでの増殖により、ＵＲＡ３遺伝子の除去を選択することによって作成された(Alani，E.ら、Genetics 116:541-545(1987))。ＳＲＢ２およびＳＲＢ８対立遺伝子の、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤトランケーション突然変異体の増殖表現型に対する影響を、以下のごとくに試験した。ＳＲＢ２またはＳＲＢ８対立遺伝子およびＣＴＤトランケーション対立遺伝子の組み合わせを含む系統を、ＹＥＰＤ培地上で１２℃、３０℃、および３８℃で、かつ、唯一の炭素源としてピルビン酸塩を含むＳＣ培地上で増殖に関してアッセイした。ＣＴＤトランケーションの程度を水平軸上でそれぞれの突然変異体に対して示し、それぞれＣＴＤトランケーション対立遺伝子を有するプラスミドを表した（すなわち、ｐＮ５１）。野生型、ｓｒｂ２Δ１、ＳＲＢ２−１、またはｓｒｂ８Δ１のバックグラウンドでそれぞれのＣＴＤトランケーション突然変異体によって示された表現型を左に示す。増殖できない系統（Ｎ）を破線で示し、高温（３８℃）および低温（１２℃）に非常に敏感であり、かつピルビン酸塩上では増殖できない条件付きの系統（Ｃ）を薄い実線で示し、試験した全条件下でほとんど野生型の増殖特性を示す（Ｖ）系統を太い実線で示した。増殖可能／条件的のｓｒｂ８Δ１系統（Ｖ／Ｃ）は、高温には感受性であるが低温下およびピルビン酸塩培地上では増殖できず、実線で示される。全ての条件で全てのＣＴＤトランケーション対立遺伝子を試験したわけではないが、それぞれのバックグラウンドにおいて表現型の境界を十分に確立した。ＤＮＡ法 Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor L aboratory 1989)に従って、ＤＮＡ操作を行った。Kunkel，T.A.ら、Meth ．Enzym ol .154:367-382(1987)に記載されたごとくに、位置指定突然変異誘発を行った。ｐＣＨ４５（ｓｒｂ７Δ１）、ｐＳＬ３１５（ｓｒｂ８Δ１）、およびｐＳＬ３０７（ｐＥＴ−３ａ中のＳＲＢ８）を作成するためのＰＣＲ増幅は、全２５サイクルで２００μＭｄＮＴＰを補足した１００λの緩衝液（製造業者により提供された）中で、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer)を用いて行った。プライマー濃度は５０ｎｇのＤＮＡを用いて０．５μＭであり、サイクリングは９４℃（１．０分）、５０℃（１．０分）および７２℃（２．５分）であった。クローン化および配列分析ＳＲＢ７（ｐＣＨ２）、ＳＲＢ８（ｐＳＬ３０１）、ＳＲＢ９（ｐＣＨ４７）、およびＲＰＢ２（ｐＳＬ４０１）のゲノムクローンを、各々Ｚ５６７、Ｚ５６８、Ｚ５６９、およびＺ５７０の形質転換および相補性によって単離した。ｐＣＨ３６はイン・ビボでｐＣＨ７から、Ｚ５６７を直鎖ｐＣＨ７欠損ＳＲＢ７コーディングＤＮＡで形質転換し、次いで染色体由来の突然変異体ｓｒｂ７−１配列でプラスミドを修復したＵｒａ⁺形質転換体からプラスミドを単離することによって作成された。同様に、ｒｐｂ２−５５１（ｐＳＬ４１１）は、ｐＲＰ２１２を用いてＺ５７０から単離した。ＳＲＢ７およびＳＲＢ９は、各々ｐＣＨ７およびｐＣＨ４７由来のゲノムＤＮＡを用いて、それぞれの鎖上で完全に配列決された。一方向性欠失をＥｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅｓｙｓｔｅｍ(Promega)を用いて構築し、次いでジデオキシヌクレオチドおよびＳｅｑｕｅｎａｓｅ(US Biochemi cal)を用いた二本鎖配列決定は、Ｔ３およびＴ７プロモータープライマーを用いて製造業者本が記載したごとくに行った。内部オリゴヌクレオチドプライマーを用いた配列決定によって、配列ギャップを埋めた。全オープン・リーディング・フレームにわたったオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定することにより、ＳＲＢ７およびＲＰＢ２における抑圧突然変異を推定した。配列比較分析は、ＢＬＡＳＴネットワーク・サービスを用いるthe National Center for Bio technology Informationにて行った。ＳＲＢ７遺伝子を含むｐＣＨ７由来の２．０ｋｂＤＮＡ断片の制限地図が決定された。ＳＲＢ７の全コーディング領域を、サルモネラ(Salmonella)ｈｉｓＧＤＮＡの直列反復によってフランクされたＵＲＡ３およびカナマイシン遺伝子を含む５．５ｋｂＤＮＡ断片で置換して、欠失対立遺伝子ｓｒｂ７Δ１：：ＵＲＡ３ｈｉｓＧを作成した。予測されたＳＲＢ７蛋白質の１４０ａａ配列が図９に示されている。該ＤＮＡの明確な番号付けは、予測された翻訳の開始部位で始まる。ｓｒｂ７−１突然変異はａａ２１をＡｌａからＴｈｒへ変更したＧからＡへのトランスバージョン（ｎｔ６１）である。また、ＳＲＢ８遺伝子を含むｐＳＬ３１１由来の６．０ｋｂＤＮＡ断片の制限地図も決定された。そのゲノムＤＮＡに比較して、逆位が存在するＳＲＢ８の上流およそ５００ｂｐを用いて、２ｋｂより大きな配列を含む染色体ＩＩＩの領域を配列決定した。ＳＲＢ８の全コーディング領域をサルモネラ(Salmonella)ｈｉｓＧＤＮＡの直列反復によってフランクされたＵＲＡ３およびカナマイシン遺伝子を含む５．５ｋｂＤＮＡ断片で置換して、欠失対立遺伝子ｓｒｂ８Δ１：：ＵＲＡ３ｈｉｓＧを作成した。その予測されたアミノ酸を持つＤＮＡ配列ＳＲＢ８が図１０Ａおよび１０Ｂに示めされている。ＳＲＢ９遺伝子を含むｐＣＨ４７由来の７．３ｋｂＤＮＡ断片の制限地図もまた決定された。ＳＲＢ９のほとんどのコーディング領域をサルモネラ(Salmone lla)ｈｉｓＧＤＮＡの直列反復によってフランクされたＵＲＡ３およびカナマイシン遺伝子を含む５．５ｋｂＤＮＡ断片で置換して、欠失対立遺伝子ｓｒｂ９Δ１：：ＵＲＡ３ｈｉｓＧを作成した。図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、ＳＲＢ９遺伝子を含む７．３ｋｂＤＮＡ断片の配列を示す。予測されるＳＲＢ９蛋白質の１４２０ａａ配列を該遺伝子の下に示す。該ＤＮＡ配列並びにＳＲＢ１０およびＳＲＢ１１に対して、該ＤＮＡ配列およびそれらの予測されるアミノ酸配列を各々図１２および１３に示す。組換え蛋白質の精製ウサギにおいてポリクローナル抗体を作成するために組換え蛋白質を精製した。ＳＲＢ２が精製されたのと同様の方法で、ＳＲＢ７およびＳＲＢ８の一部（アミノ酸８６８から１２２６）を、それぞれプラスミドｐＣＨ３４およびｐＳＬ３０７を運ぶバクテリア系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ(Studier および Moff att，1986)から精製した。Smith，D.B.およびJohnson K.S.，Gene.67:31-40(198 8)の方法に従って、ｐＣＨ６４を運ぶＤＨ５αからグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼへ融合体として、ＳＲＢ９の一部（アミノ酸４５から５０１）を精製した。イン・ビトロでの転写およびウエスタンブロット分析ホロ酵素活性に対するイン・ビトロでの転写アッセイを、先に記載したごとくに行った。ウエスタンブロッティングを標準法により行った。ＲＰＢ１をＣＴＤを介して８ＷＧ１６モノクローナル抗体腹水液(Promega)を用いて検出した。ポリクローナルウサギ抗−ＳＲＢ２、抗−ＧＳＴ−ＳＲＢ４、抗−ＳＲＢ５、抗−ＧＳＴ−ＳＲＢ６、抗−ＳＲＢ７、抗−ＳＲＢ８（ａａ８６８から１２２６）、および抗−ＧＳＴ−ＳＲＢ９（ａａ４５から５０１）抗血清を用いてＳＲＢｓを検出した。全ての場合において、アルカリホスファターゼ共役二次抗体(Promega )で二次的にプローブすることにより、バンドを視覚化した。図１５Ａおよび１５Ｂは、ＳＲＢ２およびＳＲＢ４−ＳＲＢ９がＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の成分であることを示す。（Ａ）実施例３で記載されたごとくにＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから溶出した半精製ホロ酵素を、ＭｏｎｏＳカラムに充填し、酢酸カリウムの０．１−１．０Ｍ勾配で溶出させた。オンプット（ＯＰ）およびフロースルー（ＦＴ）および酢酸カリウム０．１Ｍと０．９Ｍとの間に溶出した１つおきの画分を、ホロ酵素活性について分析した（上のパネル）。これらのサンプルをまた、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＳＲＢ蛋白質の存在についてウエスタンブロットにより分析した。この図は、ＵＭＡＸＵＣ８４０ＭａｘＶｉｓｉｏｎデジタル・スキャナーを用いてスキャンした一次データのデジタルレプリカから作成した。（Ｂ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素のポリペプチド組成。１ｍｇの精製ホロ酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、銀で染色した。ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＲＢ蛋白質のサブユニットに大きさにおいて対応するホロ酵素調製物における蛋白質が示されている。蛋白質分子量の大きさの標準は、ｋｄで示される。実施例５：イン・ビボにおけるＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の基本要求ＰＣＲ突然変異誘発を、D.W．Leung，E．Chen，D.V．Goeddel,Tecnique．1:11 (1989)に記載されたごとくに行った。プラスミドｐＣＴ１２７（ＳＲＢ４ＬＥＵ２ＣＥＮ）はＳＲＢ４ＡＴＧに特異的なＮｄｅｌ部位、およびＳＲＢ４停止コドンに続いて特異的なＸｂａｌ部位を含み、両者は位置指定突然変異誘発(T.A ．Kunkel，J.D．Roberts，R.A.Zakour，Meth ．Enzymol.154:367(1987))によって作成された。ＯＲＦをフランクするオリゴヌクレオチドを有するｐＣＴ１２７由来のＳＲＢ４のＰＣＲを、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、および０．４ｍＭＭｎ²⁺ を含む緩衝液中で行った。反応物をプールし、ＤＮＡをＮｄｅＩ−ＸｂａＩで消化し、ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ｐＣＴ１２７ベクター断片に連結し、次いでＤＨ５ αに形質転換した。約３０，０００の形質転換体が得られた。プラスミドシャッフル法を、ＵＲＡ３プラスミドに対する選択剤として５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を用いて、J．Boeke，J．Truehart，B．Natsou lis，G.R．Fink，Meth ．Enzymol．154:164(1987)に記載されたごとくに行った。酵母の遺伝子操作を従前に記載されたごとくに行った。ＬＥＵ２および突然変異誘発されたＳＲＢ４遺伝子を含むＤＮＡ分子を、ＳＲＢ４の染色体コピーに関しては削除されたが、該遺伝子の野生型コピーをコードするＵＲＡ３動原体プラスミドを運ぶ酵母系統（ＣＴＹ１８２）に形質転換した。およそ２０％の形質転換体が５−ＦＯＡの存在下では増殖できず、ＬＥＵ２プラスミド−発生ＳＲＢ４遺伝子中では致死的な突然変異を示した。およそ０．５％の形質転換体が３７℃では増殖できなかったが、３０℃にて５−ＦＯＡプレート上では増殖可能であり、これはＬＥＵ２プラスミド−発生ＳＲＢ４遺伝子におけるｔｓ対立遺伝子を示す。これらの形質転換体由来のＬＥＵ２プラスミドを回復させ、ｔｓ表現型を確かめるためにＣＴＹ１８２に再導入した。プラスミドｐＣＴ１８１は、ｓｒｂ４− １３８突然変異体対立遺伝子を含む。細胞由来の全ＲＮＡを、熱酸性フェノール抽出(F.M．Ausubelら、編、Current Protocols in Molecular Biology (John WileyおよびSons,New York,(1993))を用いて単離した。ＲＮＡを２６０ｎｍでの吸光度によって定量し、次いで該ＲＮＡの完全性をアガロースゲル中のＲＮＡの臭化エチジウム染色によって確かめた。５−３０ｕｇのＲＮＡおよびＤＥＤ１、ＨＩＳ３、ＴＲＰ３、ｒＲＮＡおよび従前に記載したごときｔＲＮＡ^wオリゴヌクレオチドプローブ(CormackおよびStr uhl)を用いて、Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイを行った。他のオリゴヌクレオチドプローブについての配列は下記の通りである：ＡＣＴ１（ＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＣＧＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＣＧＴＡＧＡＡＧＧＣＡＴＴＣＣＡ）（配列番号：３０）、ＣＤＣ７（ＧＧＧＧＣＴＡＣＴＣＴＣＧＡＡＧＡＴＣＣＣＧＴＣＡＴＴＡＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＴＧＣＣＴ）（配列番号：３１）、ＭＥＴ１９（ＧＣＣＴＴＡＣＣＧＧＣＡＣＧＣＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＴＣＧＧＴＡＣＴＧＧＧＧＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＡ）（配列番号：３３）、ＳＴＥ２（ＧＴＣＧＡＣＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＴＴＧＴＡＡＣＴＴＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＣＧＧＡＴＧＡＣＡ）（配列番号：３４）、およびＴＣＭ１（ＧＧＡＧＴＧＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＴＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＴＴＣＡＣＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧＡＧＣＴ）（配列番号：３５）。オリゴヌクレオチドは５’３’方向に書き込まれており、かつ、該ＲＮＡと相補性のない３’末端に６残基を含み、適切なＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドおよび未消化プローブによるバンド間の差異を許容する。実施例６：ｈＳＲＢ７のクローン化および配列化ＸＲＥＦを用いて、ｙＳＲＢ７に類似した発現配列標識に関してｄｂＥＳＴをスクリーニングした(Boguski，M.S.ら、Jr．Science,265:1993-1994(1994))。重複配列（遺伝子バンク受入番号Ｈ０８０４８、Ｒ１９４７３、およびＦ１３２２７）を潜在的なｙＳＲＢ７相同体をコードするとして同定した。該標識から誘導された配列を用いて、ｈＳＲＢ７遺伝子を増幅するためのプライマーを設計した。ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs)を、製造業者の指示に従って用いて、１ＹＥＳに構築したヒト抹消血液リンパ球ｃＤＮＡライブラリー由来のｈＳＲＢ７プローブを増幅した(Elledge，S.J.ら、Proc ．Natl．Acad．Sci ．USA ，88:1731-1735(1991))。該プローブを用いて、標準法によって同一のライブラリーからｈＳＲＢ７の十分な長さのクローンを単離した(Ausubel，F.M.，Cu rrent Protocols in Molecular Biology (Current protocols，1994))。ｈＳＲＢ７のＤＮＡ配列をＳｅｑｕｅｎａｓｅ(US Biochemical)を用いて製造業者の指示に従って決定した。開始ＡＴＧをｙＳＲＢ７との相同性に基づいて決定した。ｙＳＲＢ７およびｈＳＲＢ７は、３５％同一で５８％類似である。ｙＳＲＢ７およびｈＳＲＢ７は、他のいかなる配列決定遺伝子より互いがより類似している。ｙＳＲＢ７およびｈＳＲＢ７を、プログラムＢＥＳＴＦＩＴ(Genetics Comput er 。ｙＳＲＢ７およびｈＳＲＢ７を、プログラムＢＥＳＴＦＩＴ(Genetics Comput er Group,Inc.)を用いて配列させた。１．０のギャップ重および０．１の長さ重を用いた。検索子としてｈＳＲＢ７配列を用いて、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎの非重複蛋白質データベースのＢＬＡＳＴ調査は、最小合計６．４×１０^-6(Altschul，S.F .ら，J．Mol．Biol.，215:402-410(1990))の確率でｙＳＲＢ７を回収した。他の重要な重複は報告されていなかった。ｙＳＲＢ７でのＢＬＡＳＴ調査は、ｙＳＲＢ７自身以外の重要な重複を全く回収できなかった。実施例７：ｙＳＲＢ７−ｈＳＲＢｙキメラを用いたｙＳＲＢ７欠損の相補化製造業者の指示に従って、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolab s)を用いてＰＣＲによりｙＳＲＢ７の適当な領域を増幅した。ｙＳＲＢ７の適当なセグメントに対する相同体の１８ｂｐ領域が各断片の増幅に用いられる３’プライマーに付加されている以外は、ｈＳＲＢ７の適切な領域を同様に増幅した。該ＰＣＲ断片をゲル精製し、混合し、次いでｈＳＲＢ７のＮ末端およびｙＳＲＢ７のＣ末端へハイブリダイズするプライマーで再び増幅させた。適当なＰＣＲ断片をゲル精製し、再度増幅させ、次いで酵母発現ベクターＤＢ２０ＬＢｇ１２（ L．Guarenteの譲渡）のＢｇｌＩＩ部位へクローン化した。該キメラはＬｉ０Ａｃ形質転換および５−フルオロオロチン酸によって、十分な長さのｙＳＲＢ７（残基１−１４０）；ｈＳＲＢ７（１−２０）−ｙＳＲＢ７（２１−１４０）；ｈＳＲＢ７（１−７７）−ｙＳＲＢ７（８２−１４０）；ｈＳＲＢ７（１−１１７）−ｙＳＲＢ７（１２９−１４０）；および全長のｈＳＲＢ７（１−１４４）である。キメラを発現するプラスミドは、系統ＥＧＹ１１２（ＭＡＴａｕｒａ３ −５２、ｈｉｓ３Ｄ２００、ｌｅｕ２−３、１１２、ＳＲＢ７Ｄ１（ｐＣＨ７：ＳＲＢ７ＵＲＡ３ＣＥＮ）中へシャッフルされた(Boeke，J.D.ら，Methods Enzymol，154:164-175(1987);Schiestl，R.H.およびGietz，R.D.，Curr．Genet ，16:339-346(1989))。これらの独立したクローンが各々のキメラに対して試験され、次いで各々のキメラについて少なくとも１つのクローンの配列がＤＮＡ配列決定によって確認された。実施例８；ＣＴＤへ結合するｈＳＲＢ野生型Ｓ２８８Ｃ株から精製されたＳＲＢｓを含むＢｉｏＲｅｘ７０画分を当容量の緩衝液Ａ（２０ｍＭＫ−ＨＥＰＥＳｐＨ７．６、１ｍＭＥＤＴＡ、２０％グリセロール、１ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭベンジルアミジン、０．５ｕＭペプスタチン、０．１５ｕＭロイペプチン、および１ｕｇ／ｍｌキモスタチン）＋２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と混合し、次いで予備清澄化カラムに適用した。予備清澄化された抽出物をＧＳＴまたはＧＳＴ−ＣＴＤカラムに適用した(Hengartner，C.J.ら,Genes and Development，9:897-910(199 5);Thompson，C.M.ら，Cell，73:1361-1375(1993))。カラムを緩衝液Ａ＋３００ｍＭＫＯＡｃ＋１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および緩衝液Ａ＋３００ｍＭＫＯＡｃ＋４Ｍ尿素で順次に洗浄した。溶出液をＴＣＡで沈殿させ、次いで、４− ２０％の勾配ゲル(BioRad)上でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。Hengartner，C.J.ら,Genes and Development，9:897-910(1995)に記載されたごとくに、ウエスタンブロッティングを行った。実施例９；ｈＳＲＢ７のＲＮＡポリメラーゼＩＩとの会合製造者の指示に従い、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs) を用いたＰＣＲにより、ｈＳＲＢ７の６５ないし９２のアミノ酸を増幅し、次いで、ＰＣＲ産物をｐＧＥＸ−４Ｔ−３(Pharmacia Biotech)のＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位に挿入することにより、ｐＥＧ１２１を構築した。得られたＧＳＴ −ｈＳＲＢ７Ｃ−末端断片融合体を記載されたごとくに[Smith,1988#1936]精製し、製造者の指示に従い、ＲＩＢＩアジュバント(RIBI ImmunoChem Research, Inc.)で雌ニュージーランドシロウサギを免疫感作するために用いた。ヒーラおよびＣＯＳ細胞抽出物において、ｈＳＲＢ７に対して構築された抗体は１６ｋＤの相対移動度を持つ蛋白質を認識する。この相対移動度はｈＳＲＢ７の推定分子量１５．７ｋＤからなる。該抗体が特異的にｈＳＲＢ７を認識するというさらなる証拠は、ｈＳＲＢ７発現構築体で一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞を用いた実験から来る。ｈＳＲＢ７に対して構築された抗体でプローブした場合、これらの細胞からの抽出物のウエスタンブロットは、そのシグナルが対照細胞からの抽出物におけるより２０倍高い１６ｋＤバンドを含む。発明者らはこれらの実験から、該抗−ｈＳＲＢ７抗体がウエスタンブロット中のｈＳＲＢ７を特異的に認識すると結論付けた。子牛胸腺抽出物において、ヒトＳＲＢ７に対して向けられる抗体は、共泳動する１６ｋＤバンドを認識する。哺乳類転写因子の中での高い程度の保存のため、この１６ｋＤ蛋白質がウシＳＲＢ７を表すと確信することは道理に適っている。ヒーラ全細胞抽出物(Manley，J.L.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77:3855 -3859(1980)を先のごとくにＣＴＤカラムに適用した。該ブロットを該Ｃ−末端断片に対して構築した抗血清の１：２５０希釈でプローブした。冷凍子牛胸腺（１ｋｇ）のアリコートをナイロンバッグ(The North Face)中に入れ、ハンマーで粉砕した。該冷凍片に２１の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＯＡｃｐＨ７．８、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＥＧＴＡ、５％グリセロール、０．２ｍＭＤＴＴおよび緩衝液Ａと同様のプロテアーゼ阻害剤を添加した。該子牛胸腺のアリコートを各々Ｗａｒｉｎｇｂｌｅｎｄｅｒで２分間混合した。混合した子牛胸腺をプールし、アリコートをさらに２分間混合した。混合した胸腺を、ＳｏｒｖａｌｌＲＣ３Ｂ遠心機で、５，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて３０分間回転させた。該上清をミラクロス(CalBiochem)を通してデカントし、再度遠心分離し、次いでミラクロスを通してデカントした。２９．１ｇの硫酸アンモニウム／上清１００ｍｌの添加後、該懸濁物を４℃にて１５分間撹拌し、次いでＲＣ３Ｂで６，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて３０分間遠心分離した。該上清をデカントし、次いで該ペレットを伝導度が緩衝液Ｄ＋３００ｍＭ硫酸アンモニウムと同等になるように、緩衝液Ｄ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＯＡｃｐＨ７．８、０．１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロール）中に再懸濁させた。抽出物リットル当たり５．５ｍｌの１０％ポリエチレンイミンを添加し、次いで該抽出物を４℃にて１０分間撹拌した。該抽出物をＳｏｒｖａｌｌＧＳ３ローターで８，０００ＲＰＭにて３０分間遠心分離した。該上清をデカントし、次いで、伝導度が緩衝液Ｄ＋１５０ｍＭ硫酸アンモニウムと同等になるように、緩衝液Ｄを添加した。２００ｍｌのにて１時間撹拌した。該樹脂をブフナー漏斗で回収し、次いで直径５ｃｍのカラムに充填した。結合した蛋白質を緩衝液Ｄ＋４００ｍＭ硫酸アンモニウムで溶出させた。該ＤＥＡＥ溶出液を液体窒素中で瞬間冷凍し、−７０℃にて保存した。該ＤＥＡＥ溶出液をＣＴＤカラムに適用し、次いでヒーラ抽出物と同様に分析した。全ての一次データをスキャンし、次いで記載されたごとくに電子工学的に処理した(Koleske，A.J.および Young，R.A.，Nature，368:466-469(1994))。ウエスタンブロットを記載されたごとくにスキャンした(Donovan，R.S.ら，Biotechniq ues，17:660-661)。マップシステムを用いて、ｈＳＲＢ７のアミノ酸３９−５８に対するアミノ酸に相当するペプチドを合成し、ポリクローナル抗血清を調製するために用いた(R esearch Genetics)。１容量の１ＭＮａ−ＢｏｒａｔｅｐＨ８．５を用いて溶出液を中和した以外は製造者の指示に従い、該ｈＳＲＢ７ペプチドを用いてアフィニティー精製抗−ｈＳＲＢ７抗体を調製した。該溶出液をCentriprep 30 ul trafiltration unit(Amicon)で濃縮した。冷凍子牛胸腺（１ｋｇ）のアリコートをナイロンバッグ(The North Face)中に入れ、ハンマーで粉砕した。該冷凍片に２１の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＳＯ₄ ｐＨ７．６、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＥＧＴＡ、５％グリセロール、０．１ｍＭＤＴＴおよび緩衝液Ａと同様のプロテアーゼ阻害剤を添加した。該子牛胸腺のアリコートを各々Ｗａｒｉｎｇｂｌｅｎｄｅｒで２分間混合した。混合した子牛胸腺をプールし、次いでアリコートをさらに２分間混合した。混合した胸腺を、ＳｏｒｖａｌｌＲＣ３Ｂ遠心機で、５，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて３０分間回転させた。該上清をミラクロス(CalBiochem)を通してデカントし、再度遠心分離し、次いで再びミラクロスを通してデカントした。硫酸アンモニウムを３０％飽和まで添加した。４℃にて撹拌１５分後、該懸濁物ＳｏｒｖａｌｌＲＣ３Ｂ遠心機で、５，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１時間遠心分離した。該上清をデカントし、次いで該ペレットを伝導度が緩衝液Ｂ＋７５ｍＭ硫酸アンモニウムと同等になるように、緩衝液Ｂ（２０ｍＭＫ−ＨＥＰＥＳｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．１ｍＭＤＴＴ、上記のごときプロテアＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．１ｍＭＤＴＴ、上記のごときプロテアーゼ阻害剤）中に再懸濁させた。該懸濁物をＳｏｒｖａｌｌＲＣ３Ｂで５，０００ｒ．ｐ．ｍにて１０分間遠心分離した。該上清をデカントし、次いで、製造者の指示に従い、予め循環させた５００ｇの湿潤ホスホセルロースＰ１１(Whatm an)でインキュベートし、次いで緩衝液Ｂ＋７５ｍＭ硫酸アンモニウムで平衡化した。該スラリーを１時間撹拌し、ブフナー漏斗で濾過し、緩衝液Ｂ＋７５ｍＭ硫酸アンモニウムで洗浄し、次いで直径５ｃｍのカラムに充填した。結合した蛋白質を緩衝液Ｂ＋２５０ｍＭ硫酸アンモニウムで溶出させ、液体窒素中で冷凍し、次いで使用まで−７０℃にて保存した。１００ｕｌのホスホセルロース画分を２００ｕｌ緩衝液Ｂ＋０．１％ＮＰ−４と混合し、次いで５ｕｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(Pharmacia)とともに１時間インキュベートした。該画分をマイクロ遠心機で５分間遠心分離した。該上清を５ｕｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅおよび１．５ｕｇのアフィニティー精製抗−ＳＲＢ７ペプチド抗体とともに２時間インキュベートした。該免疫複合体をマイクロ遠心機で短時間の回転によりペレットとし、次いで０．５ｍｌの６０ｍＭＫＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．９、５ｍＭＭｇＣｌ₂、２．５ｍＭＭｎＣｌ₂で４回洗浄した。２０ｕｇのｈＳＲＢ７ペプチドを抗原−結合部位を遮断するために使用した以外は同様の方法にて、対照免疫沈降を行った。先に記載されたごとくに、ウエスタンブロッティングを行い、次いでｈＳＲＢ７のＣ−末端に対して向けられる抗体でプローブした。対照免疫沈降では、全てのアッセイにｐｏｌＩＩを添加した。免疫沈降物中にはｐｏｌＩＩが存在することが知られているので、抗−ｈＳＲＢ７対照免疫沈降においては、外生ｐｏｌＩＩが欠落していた。ホスホセルロース画分を上記のごとくに調製した。該溶出液２５０ｍＭを液体窒素中で瞬間冷凍し、次いで−７０℃にて保存した。該抽出物を解凍し、次いで、伝導度が緩衝液Ｂ＋１５０ｍＭ硫酸アンモニウムのそれと同等になるように、緩衝液Ｂを添加した。次いで、該抽出物をＲＣ３Ｂ遠心機(Sorvall)で５，０００ｒ．ｐ．ｍにて１０分間回転させた。該上清をデカントし、次いで、３ｍｌ／分の流速にて、ヘパリン−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂの８０ｍｌカラムに適用した。該カラムを緩衝液Ｂ＋２００ｍＭ硫酸アンモニウムで洗浄し、次いで緩衝液Ｂ＋５００ｍＭ硫酸アンモニウムで溶出させた。溶出した蛋白質をプールし、次いで硫酸アンモニウムを６０％飽和まで添加した。４℃にて３０分間撹拌した後、該懸濁物をＳＳ−３４３ローター(Sorvall)で１０，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１０分間遠心分離した。該上清をデカントし、次いで該ペレットを使用まで −７０℃にて保存した。該ペレットを１．５ｍｌの緩衝液Ｂに再懸濁させ、次いで１１の緩衝液Ｂ＋１００ｍＭ硫酸アンモニウムに対して４時間透析した。透析されたサンプルをマイクロ遠心機で１０分間遠心分離し、次いで０．５ｍｌ／分の流速にて、セファクリルＳ−４００１６／６０カラム(Pharmacia)へ装填した。１．５ｍｌ画分を回収した。該カラムを同様の条件下で流すゲル濾過標準(B ioRad)で校正した。ＴＦＩＩＨｐ８９、ＴＦＩＩＥｐ５６およびｐ３４（J ．Kim，B．Shykind,および P．Sharpの譲渡）に対して、並びにＭＯ１５（T．Ma kelaおよび R．Weinbergの譲渡）に対して構築された抗体をウエスタンブロッティングのために用いた。実施例１０：哺乳類ホロ酵素の精製および同定Ｐ１１上における子牛胸腺のクロマトグラフィーは、免疫沈降のために記載された通りであった。２５０ｍＭ溶出液に硫酸アンモニウムを３５％飽和に達するまで添加した。４℃にて１５分間撹拌した後、該懸濁物をＳＳ−３４ローター(S orvall)で１７，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１０分間回転させた。該上清をデカントし、次いで該ペレットを−７０℃にて保存した。該ペレットを、伝導度が緩衝液Ｂ＋１５０ｍＭ硫酸アンモニウムのそれと同等になるように、緩衝液Ｂに再懸濁させた。再懸濁させたペレットをＳＳ−３４ローター(Sorvall)で８，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１０分間遠心分離した。該上清をデカントし、次いでヘパリン −ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂの４０ｍｌカラムに装填した。１／２５容量の１ＭＴｒｉｓ−ＳＯ₄ ｐＨ７．６をフローへ添加した。次いで該画分をＳＳ −３４ローター(Sorvall)で８，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１０分間遠心分離し、次いで５ｍｌＨｉＴｒａｐＱカートリッジ(Pharmacia)へ適用した。結合した蛋白質を緩衝液Ｃ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＳＯ₄ ｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．１ｍＭＤＴＴ、緩衝液Ａについてと同様のプロテアーゼ阻害剤）＋７５ｍＭ硫酸アンモニウムないし緩衝液Ｃ＋１０００ｍＭ硫酸アンモニウムの２４ｍｌ勾配で溶出させた。ＳＲＢ７を含む画分をプールし、次いで使用まで−７０℃にて保存した。伝導度が緩衝液Ｂ＋７５ｍＭ硫酸アンモニウムのそれと同等になるように、プールした画分に緩衝液Ｂを添加した。プールした画分をＳＳ−３４ローター(Sorvall)で８，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１０分間遠心分離した。該上清をデカントし、次いで５ｍｌヘパリン−ＨｉＴｒａｐカートリッジ(Pharmacia)に装填した。結合した蛋白質を緩衝液Ｂ＋７５ｍＭ硫酸アンモニウムないし緩衝液Ｂ＋１０００ｍＭ硫酸アンモニウムの３０ｍｌ勾配で溶出させた。ＳＲＢ７を含む画分をプールし、次いで使用まで−７０℃にて保存した。伝導度が緩衝液Ｃ＋７５ｍＭ硫酸アンモニウムのそれと同等になるように、プールした画分の３分の１に緩衝液Ｃを添加した。プールした画分をＳＳ−３４ローター(Sorvall)で８，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１０分間遠心分離した。該上清をデカントし、次いでＭｏｎｏＱＨＲ５／５カラム(Pharmacia)に装填した。結合した蛋白質を緩衝液Ｃ＋７５ｍＭ硫酸アンモニウムないし緩衝液Ｃ＋１０００ｍＭ硫酸アンモニウムの２０ｍｌ勾配で溶出させた。ＳＲＢ７を含む画分をプールし、液体窒素中で瞬間冷凍し、次いで使用まで−７０℃にて保存した。プールした画分を１１の緩衝液Ｂ＋２５ｍＭ硫酸アンモニウムの対して２時間透析した。伝導度が緩衝液Ｂ＋２５ｍＭ硫酸アンモニウムのそれと同等になるように、緩衝液Ｂを添加した。プールした画分を０．２ｕｍフィルターを通して濾過し、次いでＭｏｎｏＳ、ＰＣ１．６／５(Pharmacia)に装填した。結合した蛋白質は緩衝液Ｂ＋２５ｍＭ硫酸アンモニウムないし緩衝液Ｂ＋１０００ｍＭ硫酸アンモニウムの２ｍｌ勾配を用い１００ｕｌ画分中に溶出した。二次精製手順では、ヘパリンＨｉＴｒａｐカラムからのプールした試料の３分の１に４容量の緩衝液Ｃを添加した。プールした画分をＳＳ−３４ローター(Sor vall)で８，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１０分間遠心分離した。該上清をデカントし、次いで、０．５ｍｌ／分の流速で、７．５×７５ｍｍＤＥＡＥ５ＰＷカラム(Toso-Haas)に装填した。結合した蛋白質を緩衝液Ｃ＋７５ｍＭ硫酸アンモニウムないし緩衝液Ｂ＋７５０ｍＭ硫酸アンモニウムの３０ｍｌ勾配で溶出させた。ＳＲＢ７を含む画分をプールし、液体窒素中で瞬間冷凍し、次いで使用まで−７０℃にて保存した。プールした画分を解凍し、次いで１１の緩衝液Ｃに対して２時間透析した。透析された試料を０．２ｕｍフィルターを通して濾過し、次いで０．１ｍｌ／分の流速で、ＭｏｎｏＱ、ＰＣ１．６／５(Pharmacia)に装填した。結合した蛋白質を緩衝液Ｃ＋７５ｍＭ硫酸アンモニウムないし緩衝液Ｃ＋１０００ｍＭ硫酸アンモニウムの２ｍｌ勾配を用いて１００ｕｌ画分に溶出した。銀染色およびウエスタンブロッティングを行った。記載されたごとくに、転写反応を行った(Makela，T.P.ら，Proc ．Natl．Sci． U.S.A. ,92:5174-5178(1995)。ホロ酵素はＭｏｎｏＳカラムからのピーク画分に存在した。用いられた全ての基本因子に対する蛋白質調製物には、クロス−コンタミネーションがないことが示された。イン・ビトロの転写アッセイを用いてカラム精製ホロ酵素（ＭｏｎｏＳ）の特異的転写を助ける能力について、および基本転写因子の存在について試験した。鋳型は、直鎖トポロジーを持つアデノウイルス主要後期プロモーターであった。産物は示された全ての因子を含む、および単一の異なる因子の欠落を持つ反応から得られた。基本因子が補給された場合、精製ホロ酵素は基本転写を助けた。コアＲＮＡポリメラーゼＩＩまたは精製ホロ酵素が、コアクチベーターＨＭＧ −２またはＰＣ４の存在、もしくは不在下で、Ｇａｌ４−ＶＰ１６に対するそれらの応答について試験された。該上流転写物はアデノウイルス主要後期プロモーターおよび３Ｇａｌ４結合部位を含む鋳型から誘導される。該下流転写物はアデノウイルス主要後期プロモーターを含むがＧａｌ４結合部位を含まない対照鋳型から誘導される。コアクチベーターの存在下で、該ホロ酵素は５倍レベルの活性化を助ける、一方、コアＲＮＡポリメラーゼＩＩは２倍レベルの活性化を示す・実施例１１：抗−ＳＲＢおよび抗−ＳＷＩ抗体のホロ酵素共沈降物全ての免疫沈降は記載されたごとくに行った(Hengartner，C.J.ら Genes and Development ，9:897-910(1995))。便宜には、５０μｌのＤＥＡＥ（４００）画分を修飾転写緩衝液（ＭＴＢ）（５０ｍＭＨＥＰＥＳＫＯＨｐＨ７．３、１Ｔ、１０％グリセロール、０．０１％ＮＰ−４０、１ｍＭＰＭＳＦ、２ｍＭベンジルアミジン、２μＭペプスタチンＡ、０．６μＭロイペプチン、および２μ ｇ／ｍｌキモスタチン）マイナス、酢酸カリウムで１：４希釈した。Aμｇオボアルブミン、４μｇＨＡ−ＧＳＴ、および２μｇＢＳＡを抗体の添加に先立って各々の反応物に添加した。０．４μｇのアフィニティー精製α-ＳＲＢＳ、〜０．１５μｇのアフィニティー精製α−ＳＷＩ３、または１．５μｇのアフィニティー精製α−ＴＧＦβを各々の反応物に添加し、次いで４℃にて２時間インキュベートさせた。１５μｌのヤギ抗−ウサギ抗体を共有結合的に磁気ビーズ (Dynal)に結合させ、次いで添加し、４℃にて１時間攪拌しながらインキュベートした。ビーズを磁石で沈降させ、次いで２００μｄＭＴＢ緩衝液で３回洗浄した。該最終洗液にはＮＰ−４０は含まれていなかった。２０μｌのサンプル緩衝液中で煮沸することにより、蛋白質を磁気ビーズから溶出させた。全てのウエスタンブロットを記載されたごとくに行った(Koleske，A.J．および Young，R.A.，Nature，368:466-9(1994))。蛋白質は下記の抗体を用いて検出した：ＳＲＢ２、４、５、６(Thompson，C.M.ら Cell，73:1361-1375(1993))、ＳＲＢ８、９(Hengartner，C.J.ら Genes and Development，9:897-910(1995)) 、ＳＲＢ１０、１１(Liao，S.M.ら Nature，374:193-196(1995))、ＳＷＩ２／ＳＮＦ２、ＳＮＦ５(B．Laurentの譲渡)、ＳＷＩ３(C．Petersonの譲渡)、ＳＮＦ１１(I．Treichおよび M．Carlsonの譲渡)、ＴＦＩＩＥαおよびＴＦＩＩＥβ。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作製は当業者に公知であり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の付加的成分に対する抗体を適宜に作製することができる。定量的ウエスタンブロットをKoleske A.J.および Young R.A.，Nature，3 68:466-469(1994)に記載されたごとくに行った。組換え標準はＳＲＢ５ Thomps on，C.M．および Young，R.A.，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A.,(1995)、ＧＳＴ−ＳＮＦ２／ＳＷＩ２_1256-1703およびＧＳＴ−ＳＮＦ５_1-193(B．Laurent の譲渡)であった。ＧＳＴ蛋白質は記載されたごとくに精製した(Smith，D.B．および Johnson，K.S.，Gene，67:31-40(1988))。組換え蛋白質の濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いた比色アッセイ(BioRad)を用いて測定した。ＳＲＢ調節蛋白質は専ら細胞抽出物中のＲＮＡポリメラーゼＩＩの他の成分とＳＲＢ調節蛋白質は専ら細胞抽出物中のＲＮＡポリメラーゼＩＩの他の成分と強固に会合していることが判明した。もしＳＷＩおよびＳＮＦ蛋白質がＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素のサブユニットであれば、次いでＳＲＢ５に対する抗体が粗抽出物から該ホロ酵素およびＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の双方を沈降させるはずである。結果としてこのことが事実であることが証明された。ＳＷＩ２／ＳＮＦ２、ＳＷＩ３およびＳＮＦ５蛋白質は、ＳＲＢ５免疫沈降を通じて得られたホロ酵素とともに共沈降する。粗抽出物から免疫沈降したＳＷＩおよびＳＮＦ蛋白質画分は、ＳＲＢ蛋白質のそれと同一であると思われる。該粗ライゼートに導入された対照蛋白質は、共沈降せず、このことは免疫沈降物が該ホロ酵素に特異的せあったことを示している。ＳＷＩ３に対する抗体を用いて該免疫沈降実験を行った場合、実質的に同一の結果が得られた。用いられた抗体がＳＲＢ５に対して向けられようと、ＳＷＩ３に対して向けられようと、同様の能力を持つＳＷＩ／ＳＮＦおよびＳＲＢ蛋白質が該粗抽出物から免疫沈降した。ＴＧＦβに対する抗体を用いた対照実験は、ＳＷＩ／ＳＮＦまたはＳＲＢ蛋白質を沈降できなかった。これらの結果は、ＳＲＢおよびＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質がお互いに強固に会合して、ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体を形成していることを示す。実施例１２：精製ホロ酵素はＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質を含む KoleskeおよびYoung,1994に記載されたごとくに、ホロ酵素を精製し、次いで転写アッセイを行った。Hengartner，C.J.ら Genes and Development，9:897-91 0(1995)に記載されたごとくに、メディエーターを精製した。選択されたＳＷＩおよびＳＮＦ蛋白質に対する抗体を用いて、該ホロ酵素の最終の最終の精製工程において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素と共溶出するかどうかを調べた。該データはＳＮＦ２／ＳＷＩ２、ＳＮＦ５、ＳＷＩ３およびＳＮＦＩＩ蛋白質が該ホロ酵素の他の既知成分とともに、かつ、転写活性とともに共溶出することを示している。該ホロ酵素は化学量論量のＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＲＢ蛋白質、および基本転写因子を含む。該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質が該ホロ酵素の化学量論量の成分であるかどうか確認するために、標準として種々の量の組換え蛋白質を用いたウエスタンブロット分析によって、ＳＮＦ２およびＳＮＦ５量が評価された。これらのデータは、該精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素がおよそ等モル量のＳＮＦ２，ＳＮＦ５およびＳＲＢ５を含むことを示し、後者は標準であり、従前に他のホロ酵素複合体と比較された。酵母細胞は２０００ないし４０００分子の間のＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を含むので、細胞当たり少なくともこの数のＳＷＩ２／ＳＮＦ２およびＳＮＦ５分子が存在すると思われる。実施例１３：ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質はＣＴＤ−結合ＳＲＢ複合体の成分であるＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体精製 Thompson，C.M.ら Cell，73:1367-1375(1993)に記載されたごとくにレッド・スター酵母から全細胞抽出物を調製した。１．２Ｌの硫酸アンモニウムペレットをＲＣ３Ｂ遠心機(Sorvall)で５，０００ＲＰＭにて３０分間遠心分離した。該ペレットを９００ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭＫ−ＨｅｐｅｓｐＨ７．６、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、２０％グリセロール、およびプロテアーゼ阻害剤(Thompson，C.M.ら Cell，73:1367-1375(1993))中に再懸濁させた。該懸濁物を再度ＲＣ３Ｂ遠心機(Sorvall)で５，０００ＲＰＭにて３０分間遠心分離した。該上清を２００ｇ（乾燥）のＢｉｏＲｅｘ７０と混合し、次いで２０分間攪拌した。該上清を直径５ｃｍのカラムに充填し、次いで１．５ｌの緩衝液Ａ＋１００ｍＭＫＯＡｃで洗浄した。結合した蛋白質を緩衝液Ａ＋６００ｍＭＫＯＡｃで溶出した。蛋白質を含む画分をプールし、液体窒素中で冷凍し、次いで使用まで−７０℃にて保存した。２のＢｉｏＲｅｘカラムからの溶出液（３２０ｍｌ、１．０ｇ蛋白質）を解凍し、次いでプールした。３２０ｍｌの緩衝液Ａ＋２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し・次いで該混合物をＧＳＡローター(Sorvall )で１２，０００ＲＰＭにて３０分間遠心分離した。該上清を、Thompson，C.M. ら Cell，73:1367-1375(1993)に記載されたごとくに、２００ｍｌ／時の流速で１５ｍｌＣＴＤアフィニティーカラムに装填した。該カラムを１００ｍｌの緩衝液Ａ＋３００ｍＭＫＯＡｃ＋１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ｍｌの緩衝液Ａ＋３００ｍＭＫＯＡｃで洗浄した。結合した蛋白質を２５ｍｌ／時の流速にて緩衝液Ａ＋３００ｍＭＫＯＡｃ＋１Ｍ尿素で溶出させた。蛋白質を含む画分をプールし、液体窒素中で冷凍し、次いで−７０℃にて保存した。該ＣＴＤカラムを緩衝液Ａ＋３００ｍＭＫＯＡｃ＋１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で平衡化し、次いで再度フローを装填した。該カラムを洗浄し、次いで上記の通りに溶出した。蛋白質を含む画分（１．８ｍｇ）をプールし、液体窒素中で冷凍し、次いで−７０℃にて保存した。該ＣＴＤ溶出液をプールし、１．５容量の緩衝液Ａ＋０．０１％ＮＰ−４０で希釈し、次いでＳＳ−３４ローター(Sorvall)で１７，０００ＲＰＭにて１０分間遠心分離した。該上清を０．３ｍｌ／分の流速でＭｏｎｏＳＨＲ５／５(Pharmacia)に装填した。該カラムを３ｍｌの緩衝液Ａ＋１２０ｍＭＫＯＡｃ＋０．０１％１ＮＰ−４０で洗浄した。結合した蛋白質を緩衝液Ａ＋０．０１％ＮＰ−４０１２０ｍＭないし１０００ｍＭＫＯＡｃの２０ｍｌ勾配で溶出させた。画分を液体窒素中で冷凍し、次いで使用まで−７０℃にて保存した。ウエスタンブロッティングによりアッセイされたごとくに、ＳＲＢ４およびＳＲＢ５を含む画分をプールし、次いで２容量の緩衝液Ｂ（２０ｍＭＴｒｉｓＯＡｃｐＨ７．６＋２０％グリセロール＋１ｍＭＤＴＴ＋０．０１％ＮＰ−４０＋プロテアーゼ阻害剤）で希釈した。該混合物をマイクロ遠心機で５分間遠心分離した。該上清を０．３ｍｌ／分の流速で、ＭｏｎｏＱＨＲＲ５／５カラム(Pharmacia)に装填した。該カラムを１ｍｌの緩衝液Ｂ＋２００ｍＭＫＯＡｃで洗浄した。結合した蛋白質を緩衝液Ｂ、２００ｍＭないし２０００ｍＭＫＯＡｃの４０ｍｌ勾配で溶出させた。ＳＲＢ複合体の収量はおよそ１００μｇであった。各々の画分１μｌを銀染色によって分析した。各々の画分７．５μｌ−１０μｌをウエスタンブロッティングによって分析した。遺伝学的証拠は、該ＳＲＢ調節蛋白質およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＣ−末端ドメイン（ＣＴＤ）が転写開始に関連した機能を持ち、かつ、これらが転写レギュレーターに対する応答に関与することを示している。また、該ＳＷＩおよびＳＮＦ蛋白質も広範な種々の遺伝子の活性化に関与し、かつ、ＳＷＩおよびＳＮＦ遺伝子における突然変異はＳＲＢ遺伝子における突然変異で観察されるものと同様の表現型を呈するので、ＳＷＩおよびＳＮＦ蛋白質がＳＲＢ複合体と会合しているかどうかが調べられた。該ＳＲＢ蛋白質複合体は、後者が該ＣＴＤ対するモノクローナル抗体で処理された場合、該ＳＲＢ蛋白質複合体は該ホロ酵素から遊離させることができ、この調製物はメディエーターと呼ばれて来た(Kim，Y.J. ら Cell，77:599-608(1994))。メディエーター複合体はKimらに従って調製された。このメディエーター複合体は従前に記載されたコアクチベーターを持つことが確認され、さらに、該メディエーターが全てのＳＲＢ蛋白質を含むことが証明された(Hengartner，C.J.ら Genes and Development，9:897-910(1995))。このメディエーター調製物をウエスタンブロットによってＳＮＦ２／ＳＷＩ２、ＳＮＦ５およびＳＷＩ３蛋白質の存在に関してアッセイする場合、３種のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質全てが発見された。また該ＳＲＢ複合体も、組換えＣＴＤカラムを用いて、粗抽出物から単離された(Thompson，C.M.ら Cell，73:1361-1374(1993))。ＳＲＢ複合体は組換えＧＳＴ−ＣＴＤカラム、続いてｍｏｎｏＳおよびｍｏｎｏＱカラムでのクロマトグラフィーを用いて大量に精製された。該ＳＲＢ、ＳＷＩ、およびＳＮＦ蛋白質はＧＳＴ−ＣＴＤカラムに結合するが、対照ＧＳＴカラムには結合せず、このことはそれらが該ＣＴＤに特異的に結合することを示している。銀染色およびウエスタンブロット分析はＳＲＢ蛋白質およびアッセイされた３種のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の各々を含む複合蛋白質複合体が該ｍｏｎｏＱカラムから共泳動することを確証する。この複合体中にはおよそ２５個のペプチドが存在し、いくつかは従前に同定されたＳＲＢ、ＳＷＩおよびＳＮＦ蛋白質と大きさにおいて一致する。該ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体を含むウエスタンブロットをＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＴＢＰ、ＴＦＩＩＢまたはＴＦＩＩＨのＴＦＢ１サブユニットに対する抗体でプローブした場合、シグナルは得られなかった。これらの結果は、該ＳＲＢ複合体が実際には、ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体であり、さらには該ＳＷＩおよびＳＮＦ蛋白質が、少なくとも部分的にそれらのＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤとの会合を通じて該ホロ酵素と相互作用することを示している。実施例１４：ホロ酵素およびＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体中のヌクレオソーム分裂活性 Imbalzano，A.M.ら Nature，370:481-485(1994)に記載されたごとくに、ＰＨＭＬＴまたはＰＨＭＬＴ（＋３）制限断片が循環的に同調化されたモノヌクレオソーム粒子に組み込まれ、グリセロール勾配遠心分離によって精製され、次いで分析された。この研究および従前の研究において用いられたヌクレオソーム濃度および反応条件にて、ヌクレオソームは、ミクロコッカスヌクレアーゼに対する耐性を基礎として安定であること、ＤＮＡｓｅＩ消化における１０ｂｐの反復の出現、および天然のポリアクリルアミドゲル電気泳動における移動度の低下の表示に対して同定された。ヌクレオソーム解離による遊離ＤＮＡの出現は、これらいずれの実験でも観察されなかった。ホロ酵素画分は実施例１１で用いられたものと同様であった。各々の画分０．３μｌを４ｍＭＡＴＰの存在下でアッセイした。ホロ酵素の滴定のために、各々示されたごとき４ｍＭＡＴＰを用いて、および用いずに、０μｌ、０．０１５μｌ、０．０５μｌ、０．１５μｌ、０．５μｌの画分６０を用いた。ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ−画分は先に用いたものと同様であった。４ｍＭＡＴＰの存在下で各々の画分１．７μｌをアッセイした。適定のため各々４ｍＭＡＴＰを用いて、および用いずに、０μｌ、０．０７μｌ、０．２μｌ、０．７μｌおよび２．０μｌの画分２４を用いた。 Imbalzano，A.N.ら Nature，370:481-485(1994)に記載されたごとくに、ＰＨＭＬＴ（＋３）制限断片を含むヌクレオソームに対するｙＴＢＰおよびｙＴＨＩＩＡの結合を行った。全ての反応物は４ｍＭＡＴＰを含んだ。ホロ酵素の存在または不在下で、３０℃にて３０分間のインキュベートに続いて、ｙＴＦＩＩＡの存在下でｙＴＢＰの添加量を増した。ＴＢＰ濃度は０、０．０４マイクロモル、０．４マイクロモルおよび４マイクロモルであった。また、１．５マイクロモルのｙＴＦＩＩＡも全ての反応物に添加した。反応物はホロ酵素単独で、４ｍＭＡＴＰの存在下で、もしくは４ｍＭＡＴＰγＳの存在下で処理され、次いで１．５マイクロモルｙＴＦＩＩＡの存在下で、４マイクロモルｙＴＢＰを添加した。ヘパリンピークがＭｏｎｏＳＨＲ５／５ＦＰＬＣカラム(Pharmacia) でさらに精製された以外は記載されたごとくに、組換えｙＴＢＰを精製した(Hoe y，T.ら Cell，61:1179-1186(1990))。組換えｙＴＦＩＩＡは記載されたごとくに精製された(Ranish，A.A.ら Science，255:1127-1129(1992))。ＳＷＩ１、ＳＷＩ２、ＳＷＩ３、ＳＮＦ５、ＳＮＦ６、およびＳＮＦ１１遺伝子産物がヌクレオソーム構造を改変する能力を持つ大多重サブユニット複合体として単離され得るという従前の証拠は、精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素および該ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体がヌクレオソーム構造を改変できるかどうかを発明者らに調べさせた。モノヌクレオソーム粒子は、精製ヒストン８量体および２コピーの人工フェーシング配列を含むＤＮＡ断片から再構築される(Shrad er，T.E．および Crothers，D.M.，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，86,7418-2 2(1989))。ＤＮＡｓｅＩを用いたモノヌクレオソームの消化は、循環的に同調化されたヌクレオソームに典型的な１０ｂｐ切断ラダーを示した。該ホロ酵素の精製工程における最終のクロマトグラフィー工程の画分をモノヌクレオソームと混合し、次いで、ＤＮＡｓｅＩ切断に対する該ヌクレオソームの接近性における変化により視覚化できる、ヌクレオソーム構造を改変する能力に関してアッセイした。その結果は、ヌクレオソーム分裂活性がＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素とともに共溶出されたことを示している。ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ精製における最終工程からの画分を用いた同様の実験で、該ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体のヌクレオソーム構造を改変する能力が分析された。その結果はヌクレオソーム分裂活性がＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体とともに共溶出したことを示している。該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素およびＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体のさらなる分析は、該ヌクレオソーム分裂活性がＡＴＰに依存していることを示した。さらに、精製コアＲＮＡポリメラーゼＩＩはヌクレオソーム改変能はないことが示された。これらのデータは該ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体が該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素にクロマチン再構成活性を与えていることを示している。実施例１５：精製ホロ酵素およびＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体はプラスミドクロマチンを分割するスーパーコイリング・レダクション・アッセイ記載されたごとくに、プラスミドクロマチンを組込みし、次いで精製した(Kwo n，H.ら Nature，370:477-481(1994))。全量１２．５μｌの反応物は、クロマチン（２ｎｇＤＮＡ）、１ＵトポイソメラーゼＩ(Promega)、２．５μｌ〜３０％グリセロール勾配緩衝液、７μｌ緩衝液Ａマイナス、ＫＣｌ、７ｍＭＭｇＣｌ₂、５０−１００ｍＭＫＯＡｃ（最終）、そこで示された４ｍＭＡＴＰ、および２μｌホロ酵素ｍｏｎｏＳ画分または１μｌＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体ｍｏｎｏＱ画分を含んだ。３０℃にて９０分間後、６μｌの停止緩衝液（３％ＳＤＳ、１００ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．０、２５％グリセロール、２ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）の添加により反応を停止させた。反応物を３７℃にて９０分間インキュベートし、次いで２％アガロースグル（５０ｍＭＴｒｉｓ−リン酸ｐＨ７．３、１ｍＭＥＤＴＡ）上で４０Ｖにて４０時間分離した。ゲルを乾燥させ、次いでフィルムに露出させた。該ホロ酵素およびＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体のヌクレオソーム分裂力をさらに特徴付けるために、スーパーコイリング・レダクション・アッセイを行った。このアッセイでは、グリセロール勾配遠心分離により実質的に精製されたクロマチンがリラックス閉環プラスミドに組込まれる。各々構築されたヌクレオソームは、該プラスミドに対しておよそ１つの陰性超コイルを挿入し、ヒストンの除去後これをアガロースゲル電気泳動により分離することができる。ヌクレオソーム−組込みプラスミドへ蛋白質が添加されない場合、それは高度にスーパーコイルを形成する。該複合体精製の最終カラムからの画分が、添加されたトポイソメラーゼＩの存在下で、それらのヌクレオソーム構造を分割し、次いでそれによりスーパーコイル形成を低下させる能力に関して試験された。この活性は、ホロ酵素転写活性とともに、ＳＲＢおよびＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質とともに、かつ、ヌクレオソーム−コア分割活性とともに共溶出する。該スーパーコイル形成−低下活性は、ヒトＳＷＩ／ＳＮＦ複合体に関して示されたごとくに、ＡＴＰに依存する (Kwon，H.ら Nature，370:477-481(1994))。ＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の最終カラムからの画分を用いた実験を繰り返すことにより、この複合体もまたＡＴＰ−依存性超コイル形成−低下活性を持つことが示された。実施例１６：ホロ酵素はヌクレオソームへのＴＢＰの結合を助長するこれまでの研究は、酵母およびヒトＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の双方が、関連因子結合部位を含むヌクレオソームＤＮＡへ結合する転写因子を助長し得ることを示した。本明細書に記載されたホロ酵素は、それがＴＢＳ結合部位を含むモノヌクレオソームへのＴＢＰの結合を増加させ得るかどうかについて試験された。４× １０^-6ＭのＴＢＰ濃度にて、ホロ酵素およびＡＴＰの存在を伴う、ＴＢＰおよびＴＦＩＩＡは該モノヌクレオソームに結合したが、一方、ホロ酵素の不在下ではＴＢＰ／ＴＦＩＩＡ結合は観察されなかった。このホロ酵素−助長ＴＢＰ結合は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび基本転写因子の存在下で起こる付加的蛋白質−蛋白質および蛋白質−ＤＮＡ相互作用の効果を安定化させることによって、ＳＷＩ／ＳＮＦのＡＴＰ依存性ヌクレオソーム分割によって、もしくは双方の効果の組み合わせによって引き起こされると考えられる。この論文を提出するために、助長されるＴＢＰ結合がＡＴＰに依存しているかどうかが試験され、ＡＴＰが抑制される場合、もしくはＡＴＰの代わりにＡＴＰγＳが用いられる場合、ＴＡＴＡ領域の部分的保護が観察された。しかしながら、ＴＡＴＡボックスにわたるＤＮＡｓｅＩ切断からの保護、５’方向におけるフットプリントの拡張、および３’方向のにおける過敏感反応バンドの出現を増加させることによって示されるごとくに、ＡＴＰの添加は該ＴＢＰ結合を増強する。かくして、該ホロ酵素は、ＡＴＰの不在下でモノヌクレオソームへのＴＢＰおよびＴＦＩＩＡの結合を部分的に安定化させることができる。しかしながら、おそらくは、それがＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質のＡＴＰ−依存性ヌクレオソーム分割活性を含んでいるために、ホロ酵素−助長ＴＢＰ結合の十分な効果はＡＴＰを要求する。同等物慣例の実験を用いて、当業者は、本明細書に記載された発明の具体例に対する多くの同等物を認識または確認することができよう。かかる同等物は下記の請求の範囲によって包含されることを意図する。

【手続補正書】【提出日】１９９８年３月２３日【補正内容】特許請求の範囲１．ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび１以上の調節蛋白質を含むことを特徴とする精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。２．該調節蛋白質が１以上のＳＲＢ蛋白質を含む請求項１記載の精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。３．ａ）少なくとも１のＳＲＢ蛋白質およびＲＮＡポリメラーゼＩＩを含み；ｂ）ＳＲＢおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性を有し；かつｃ）転写アクチベーターに応答することを特徴とする精製多重サブユニットＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。４．該ホロ酵素が９のＳＲＢ蛋白質転写因子ｂ、ｅ、およびｇ、またはそれらの相同体およびＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む調節蛋白質からなり、該ホロ酵素がおよそ１−４Ｍｄの分子量を有する請求項３記載の精製多重サブユニットＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。５．該ホロ酵素がｈＳＲＢ７、転写因子ＴＦＩＩＥおよびＴＦＩＩＨ、またはそれらの相同体を含む調節蛋白質からなり、該ホロ酵素がおよそ１−４Ｍｄの分子量を有する請求項３記載の精製多重サブユニットＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。６．該調節蛋白質が１以上のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質を含む請求項１記載の精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。７．該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質がＳＲＢ蛋白質および他の調節成分の複合体からなる請求項６記載の精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。８．該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質がＳＷＩ１、ＳＷＩ２／ＳＮＦ２、ＳＷＩ３、ＳＮＦ５、ＳＮＦ６およびＳＮＦ１１からなる群より選択されるＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質を含む請求項６記載の精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。９．ａ）少なくとも１のＳＲＢ蛋白質、少なくとも１のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質およびＲＮＡポリメラーゼＩＩからなり；ｂ）ＳＲＢ、ＳＷＩ／ＳＮＦおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性を有し；かつｃ）転写アクチベーターに応答することを特徴とする精製多重ユニットＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。１０．該ホロ酵素が９のＳＲＢ蛋白質、転写因子ｂ、ｅおよびｇ、またはそれらの相同体、１以上のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質およびＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む調節蛋白質からなり、かつおよそ１−４Ｍｄの分子量を有する請求項９記載の精製多重ユニットＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。１１．そのＤＮＡがａ）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号１８、または配列番号：３７のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、転写調節因子をコードするＤＮＡ；ｂ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、および配列番号：３６；ｃ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、または配列番号：３６の相補鎖；ｄ）高い緊縮条件下で、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、または配列番号：３６へハイブリダイズするＤＮＡ；およびｅ）緊縮条件下で、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、または配列番号：３６の相補鎖へハイブリダイズするＤＮＡからなる群より選択されることを特徴とする転写調節因子をコードする単離ＤＮＡ。１２．そのＤＮＡがａ）配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、または配列番号：３７のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、転写調節因子をコードするＤＮＡ；ｂ）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、および配列番号：３６；ｃ）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、および配列番号：３６の相補鎖；ｄ）高い緊縮条件下で、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、および配列番号：３６へハイブリダイズするＤＮＡ；およびｅ）緊縮条件下で、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、および配列番号：３６の相補鎖へハイブリダイズするＤＮＡからなる群より選択されることを特徴とする転写調節因子をコードする単離ＤＮＡ。１３．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８および配列番号：３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする転写調節因子を伴う抗体反応性。１４．ＳＲＢ蛋白質と結合する抗体、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合する抗体からなる群より選択される抗体を細胞内に導入し、ここに該抗体がＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合し、それによりＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。１５．ＳＲＢ蛋白質と結合する抗体、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合する抗体からなる群より選択される抗体を細胞内に導入し、ここに該抗体がＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合し、それにより機能的ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。１６．ＳＲＢ蛋白質と結合する抗体、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合する抗体からなる群より選択される抗体を細胞内に導入し、ここに該抗体がＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合し、それによりＳＲＢ蛋白質の調節シグナルを処理する能力を修飾することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。１７．少なくとも１のＳＲＢ蛋白質、または、少なくとも１のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合する物質の有効量を細胞内に導入し、それによりＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。１８．少なくとも１のＳＲＢ蛋白質、または、少なくとも１のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合する物質の有効量を細胞内に導入し、それにより機能的ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。１９．該ＳＲＢ蛋白質がキナーゼ活性を有し、かつ該物質が該ＳＲＢ蛋白質に結合し、それにより該ＳＲＢ蛋白質のキナーゼ活性を修飾する請求項１８記載の方法。２０．該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質がクロマチン再構成活性を有し、かつ該物質が該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合し、それにより該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質のクロマチン再構成活性を修飾する請求項１８記載の方法。２１．ＲＮＡポリメラーゼＩＩのカルボキシル末端ドメインに結合する物質の有効量を細胞内に導入し、それによりＲＮＡポリメラーゼＩＩのＳＲＢ蛋白質、またはＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質複合体と相互作用する能力を修飾することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。２２．少なくとも１のＳＲＢ蛋白質に結合する物質の有効量を細胞内に導入し、それにより該ＳＲＢ蛋白質の調節シグナルを処理する能力を修飾することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。２３．該物質がＳＲＢ８またはＳＲＢ９に結合し、それにより遺伝子転写を増加させる請求項２２記載の方法。２４．該物質がＳＲＢ２またはＳＲＢ５に結合し、それにより遺伝子転写を減少させる請求項２２記載の方法。２５．１以上のＳＲＢ遺伝子またはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子の転写を阻害する物質の有効量を細胞内に導入することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。２６．ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質転写後修飾を阻害または誘導することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。２７．１以上のＳＲＢ遺伝子産物またはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を阻害する物質の有効量を細胞内に導入することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。２８．ＳＲＢ蛋白質に、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合することにより、もしくは、該ＳＲＢ蛋白質またはＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体が結合するＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の１つの成分上の部位に結合することによって、ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性を阻害するペプチドをコードするＤＮＡを細胞内に導入し、それによりＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。２９．細胞内で発現されるペプチドをコードするＤＮＡを細胞内に導入し、ここに該ペプチドは、ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合することにより、もしくは該ＳＲＢ蛋白質、またはＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体が結合するＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の１つの成分上の部位に結合することによって、ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性を阻害するものであり、それにより機能的ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。３０．細胞内で発現されるペプチドをコードするＤＮＡを細胞内に導入し、ここに該ペプチドは、ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合することにより、もしくは該ＳＲＢ蛋白質、またはＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体が結合するＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の１つの成分上の部位に結合することによって、ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性を阻害するものであり、それによりＳＲＢ蛋白質の調節シグナルを処理する能力を修飾する、もしくはそれによりＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質複合体のクロマチン構造を改造する能力を修正することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。３１．細胞内で発現されるペプチドをコードするＤＮＡを細胞内に導入し、ここに該ペプチドは、ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードし、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を形成することができるものであり、それによりＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成を増加させることを特徴とする細胞における遺伝子転写を増加させる方法。３２．細胞内で発現される突然変異ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡを細胞内に導入し、ここに該突然変異ＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質はＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を形成できず、それによりＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。３３．細胞内で発現される、生物学的に不活性な突然変異ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡを細胞内に導入し、ここに該生物学的に不活性な突然変異ＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質はＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を形成できず、それにより機能的ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。３４．調節シグナルを処理する能力を欠く、突然変異ＳＲＢ蛋白質をコードするＤＮＡを細胞内に導入することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。３５．クロマチン構造を再構成する能力を欠く、突然変異ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡを細胞内に導入することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。３６．ＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡプローブ。３７．配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７および配列番号：３６からなる群より選択されるＤＮＡにハイブリダイズする請求項３６記載のＤＮＡプローブ。３８．ａ）サンプル中に存在する核酸を相補的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションに有用であるようにし、それによりハイブリダイズ可能な核酸を産生し；ｂ）工程（ａ）で産生された核酸を、相補的ヌクレオチド配列のハイブリダイズが起こるのに適した条件下で、ＳＲＢ蛋白質をコードする核酸配列の全て、もしくは一部を補足する核酸配列である、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと接触させ；次いでｃ）サンプル中の、該プローブを伴う核酸のハイブリダイゼーションの存在が、ＳＲＢ核酸を表す、該プローブを用いて核酸のハイブリダイゼーションを検出する工程を有することを特徴とする、生物学的サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを含むＳＲＢ核酸を検出する方法。３９．該プローブが検出可能なように標識されている請求項３８記載の方法。４０．ａ）該細胞または分泌液をＳＲＢ蛋白質に結合する抗体と反応させ、それにより抗体／ＳＲＢ蛋白質複合体を形成し、次いでｂ）該複合体の検出がＳＲＢ蛋白質の存在を表す、該抗体／ＳＲＢを検出するまたは定量する行程を有することを特徴とする、細胞または生物学的サンプル中のＳＲＢ蛋白質の存在を検出する、または定量するためのイムノアッセイ。４１．該抗体が検出可能なように標識されている請求項４０記載のイムノアッセイ。４２．有効量のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子産物を含む、ＳＲＢ遺伝子、またはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子の改変または欠失が原因となる疾病を治療するための薬剤。４３．有効量のＳＲＢ遺伝子産物、またはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子産物を疾病細胞に加え、細胞内の遺伝子転写を修飾する請求項４２記載の薬剤。４４．ａ）転写されるべきＤＮＡ、転写因子ａまたはその相同体、およびＴＡＴＡ−結合蛋白質を提供し；ｂ）工程ａ）のＤＮＡ、転写因子および結合蛋白質を精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素と混合し；次いでｃ）該ＤＮＡの転写に十分な条件下で、工程ｂ）の該混合物を維持する工程を有することを特徴とする、イン・ビトロでのＤＮＡ配列の転写法。４５．ａ）（ｉ）転写されるべきＤＮＡ；（ｉｉ）転写因子ａ、またはその相同体；（ｉｉｉ）ＴＡＴＡ−結合蛋白質；（ｉｖ）その遺伝子転写を修飾する能力について評価されるべき物質；および（ｖ）精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を一緒にし、それにより試験混合物を作製し；ｂ）該ＤＮＡの転写に十分な条件下で、工程ｂ）の試験混合物を維持し；次いでｃ）該試験混合物中でＤＮＡ転写が起こる程度を測定し、次いで、その結果を該物質の不在下でＤＮＡ転写が起こる程度と比較する工程を有することを特徴とする、遺伝子転写を修飾する物質を同定する方法。４６．１以上のＳＲＢ蛋白質および１以上のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質、遺伝子転写を調節できる能力を有する該複合体を含むことを特徴とする精製複合蛋白質複合体。４７．該活性がクロマチン再構成活性である請求項４６記載の複合体。４８．候補蛋白質の欠失したＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性を補足する能力を評価することを特徴とするＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性と機能的に同等な活性を有する蛋白質を同定する方法。４９．ａ）該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素中のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性を部分的に、もしくは完全に阻害し；ｂ）該候補蛋白質を該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素と会合させ；次いでｃ）該候補蛋白質と会合したＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の活性を測定し、ここに、もし該候補蛋白質が阻害されたＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と機能的に同等ならば、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は遺伝子転写を開始する工程を有することを特徴とする該ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性と機能的に同等な活性を持つ蛋白質を同定する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号５９０，３９９ (32)優先日 1996年１月26日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者コレスク，アンソニージェイアメリカ合衆国マサチューセッツ 02184 ブレイントゥリーワシントンストリート＃213 550 (72)発明者トンプソン，クレイグエムアメリカ合衆国コネティカット 06411 ニューヘイヴンホイットニーアヴェニュ＃１ 421 (72)発明者チャオ，デイヴィッドエムアメリカ合衆国マサチューセッツ 02138 ケンブリッジガーデンコート６アパートメント３

Claims

【特許請求の範囲】１．ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび１以上の調節蛋白質を含むことを特徴とする精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。２．該調節蛋白質が１以上のＳＲＢ蛋白質を含む請求項１記載の精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。３．ａ）少なくとも１のＳＲＢ蛋白質およびＲＮＡポリメラーゼＩＩを含み；ｂ）ＳＲＢおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性を有し；かつｃ）転写アクチベーターに応答することを特徴とする精製多重サブユニットＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。４．該ホロ酵素が９のＳＲＢ蛋白質転写因子ｂ、ｅ、およびｇ、またはそれらの相同体およびＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む調節蛋白質からなり、該ホロ酵素がおよそ１−４Ｍｄの分子量を有する請求項３記載の精製多重サブユニットＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。５．該ホロ酵素がｈＳＲＢ７、転写因子ＴＦＩＩＥおよびＴＦＩＩＨ、またはそれらの相同体を含む調節蛋白質からなり、該ホロ酵素がおよそ１−４Ｍｄの分子量を有する請求項３記載の精製多重サブユニットＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。６．該調節蛋白質が１以上のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質を含む請求項１記載の精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。７．該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質がＳＲＢ蛋白質および他の調節成分の複合体からなる請求項６記載の精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。８．該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質がＳＷＩ１、ＳＷＩ２／ＳＮＦ２、ＳＷＩ３、ＳＮＦ５、ＳＮＦ６およびＳＮＦ１１からなる群より選択されるＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質を含む請求項６記載の精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。９．ａ）少なくとも１のＳＲＢ蛋白質、少なくとも１のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質およびＲＮＡポリメラーゼＩＩからなり；ｂ）ＳＲＢ、ＳＷＩ／ＳＮＦおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性を有し；かつｃ）転写アクチベーターに応答することを特徴とする精製多重ユニットＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。１０．該ホロ酵素が９のＳＲＢ蛋白質、転写因子ｂ、ｅおよびｇ、またはそれらの相同体、１以上のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質およびＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む調節蛋白質からなり、かつおよそ１−４Ｍｄの分子量を有する請求項９記載の精製多重ユニットＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素。１１．そのＤＮＡがａ）配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号１８、または配列番号：３７のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、転写調節因子をコードするＤＮＡ；ｂ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、および配列番号：３６；ｃ）配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、または配列番号：３６の相補鎖；ｄ）高い緊縮条件下で、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、または配列番号：３６へハイブリダイズするＤＮＡ；およびｅ）緊縮条件下で、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、または配列番号：３６の相補鎖へハイブリダイズするＤＮＡからなる群より選択されることを特徴とする転写調節因子をコードする単離ＤＮＡ。１２．そのＤＮＡがａ）配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、または配列番号：３７のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、転写調節因子をコードするＤＮＡ；ｂ）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、および配列番号：３６；ｃ）配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、および配列番号：３６の相補鎖；ｄ）高い緊縮条件下で、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、および配列番号：３６へハイブリダイズするＤＮＡ；およびｅ）緊縮条件下で、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、および配列番号：３６の相補鎖へハイブリダイズするＤＮＡからなる群より選択されることを特徴とする転写調節因子をコードする単離ＤＮＡ。１３．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８および配列番号：３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする転写調節因子を伴う抗体反応性。１４．ＳＲＢ蛋白質と結合する抗体、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合する抗体からなる群より選択される抗体を細胞内に導入し、ここに該抗体がＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合し、それによりＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。１５．ＳＲＢ蛋白質と結合する抗体、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合する抗体からなる群より選択される抗体を細胞内に導入し、ここに該抗体がＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合し、それにより機能的ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。１６．ＳＲＢ蛋白質と結合する抗体、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合する抗体からなる群より選択される抗体を細胞内に導入し、ここに該抗体がＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合し、それによりＳＲＢ蛋白質の調節シグナルを処理する能力を修飾することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。１７．少なくとも１のＳＲＢ蛋白質、または、少なくとも１のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合する物質の有効量を細胞内に導入し、それによりＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。１８．少なくとも１のＳＲＢ蛋白質、または、少なくとも１のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合する物質の有効量を細胞内に導入し、それにより機能的ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素複合体の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。１９．該ＳＲＢ蛋白質がキナーゼ活性を有し、かつ該物質が該ＳＲＢ蛋白質に結合し、それにより該ＳＲＢ蛋白質のキナーゼ活性を修飾する請求項１８記載の方法。２０．該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質がクロマチン再構成活性を有し、かつ該物質が該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合し、それにより該ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質のクロマチン再構成活性を修飾する請求項１８記載の方法。２１．ＲＮＡポリメラーゼＩＩのカルボキシル末端ドメインに結合する物質の有効量を細胞内に導入し、それによりＲＮＡポリメラーゼＩＩのＳＲＢ蛋白質、またはＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質複合体と相互作用する能力を修飾することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。２２．少なくとも１のＳＲＢ蛋白質に結合する物質の有効量を細胞内に導入し、それにより該ＳＲＢ蛋白質の調節シグナルを処理する能力を修飾することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。２３．該物質がＳＲＢ８またはＳＲＢ９に結合し、それにより遺伝子転写を増加させる請求項２２記載の方法。２４．該物質がＳＲＢ２またはＳＲＢ５に結合し、それにより遺伝子転写を減少させる請求項２２記載の方法。２５．１以上のＳＲＢ遺伝子またはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子の転写を阻害する物質の有効量を細胞内に導入することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。２６．ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質転写後修飾を阻害または誘導することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。２７．１以上のＳＲＢ遺伝子産物またはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を阻害する物質の有効量を細胞内に導入することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。２８．ＳＲＢ蛋白質に、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合することにより、もしくは、該ＳＲＢ蛋白質またはＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体が結合するＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の１つの成分上の部位に結合することによって、ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性を阻害するペプチドをコードするＤＮＡを細胞内に導入し、それによりＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。２９．細胞内で発現されるペプチドをコードするＤＮＡを細胞内に導入し、ここに該ペプチドは、ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合することにより、もしくは該ＳＲＢ蛋白質、またはＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体が結合するＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の１つの成分上の部位に結合することによって、ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性を阻害するものであり、それにより機能的ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。３０．細胞内で発現されるペプチドをコードするＤＮＡを細胞内に導入し、ここに該ペプチドは、ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質に結合することにより、もしくは該ＳＲＢ蛋白質、またはＳＲＢ／ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体が結合するＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の１つの成分上の部位に結合することによって、ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性を阻害するものであり、それによりＳＲＢ蛋白質の調節シグナルを処理する能力を修飾する、もしくはそれによりＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質複合体のクロマチン構造を改造する能力を修正することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。３１．細胞内で発現されるペプチドをコードするＤＮＡを細胞内に導入し、ここに該ペプチドは、ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードし、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を形成することができるものであり、それによりＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成を増加させることを特徴とする細胞における遺伝子転写を増加させる方法。３２．細胞内で発現される突然変異ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡを細胞内に導入し、ここに該突然変異ＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質はＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を形成できず、それによりＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。３３．細胞内で発現される、生物学的に不活性な突然変異ＳＲＢ蛋白質、またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡを細胞内に導入し、ここに該生物学的に不活性な突然変異ＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質はＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を形成できず、それにより機能的ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の形成を阻止することを特徴とする細胞における遺伝子転写を阻害する方法。３４．調節シグナルを処理する能力を欠く、突然変異ＳＲＢ蛋白質をコードするＤＮＡを細胞内に導入することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。３５．クロマチン構造を再構成する能力を欠く、突然変異ＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡを細胞内に導入することを特徴とする細胞における遺伝子転写を修飾する方法。３６．ＳＲＢ蛋白質またはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡプローブ。３７．配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７および配列番号：３６からなる群より選択されるＤＮＡにハイブリダイズする請求項３３８．ａ）サンプル中に存在する核酸を相補的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションに有用であるようにし、それによりハイブリダイズ可能な核酸を産生し；ｂ）工程（ａ）で産生された核酸を、相補的ヌクレオチド配列のハイブリダイズが起こるのに適した条件下で、ＳＲＢ蛋白質をコードする核酸配列の全て、もしくは一部を補足する核酸配列である、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと接触させ；次いでｃ）サンプル中の、該プローブを伴う核酸のハイブリダイゼーションの存在が、ＳＲＢ核酸を表す、該プローブを用いて核酸のハイブリダイゼーションを検出する工程を有することを特徴とする、生物学的サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを含むＳＲＢ核酸を検出する方法。３９．該プローブが検出可能なように標識されている請求項３８記載の方法。４０．ａ）該細胞または分泌液をＳＲＢ蛋白質に結合する抗体と反応させ、それにより抗体／ＳＲＢ蛋白質複合体を形成し、次いでｂ）該複合体の検出がＳＲＢ蛋白質の存在を表す、該抗体／ＳＲＢを検出するまたは定量する行程を有することを特徴とする、細胞または生物学的サンプル中のＳＲＢ蛋白質の存在を検出する、または定量するためのイムノアッセイ。４１．該抗体が検出可能なように標識されている請求項４０記載のイムノアッセイ。４２．有効量のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子産物を疾病細胞に加えることを特徴とするＳＲＢ遺伝子、またはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子の改変または欠失が原因となる疾病の治療法。４３．有効量のＳＲＢ遺伝子産物、またはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子産物を、遺伝子４３．有効量のＳＲＢ遺伝子産物、またはＳＷＩ／ＳＮＦ遺伝子産物を、遺伝子転移法によって、疾病細胞に加える請求項４２記載の方法。４４．ａ）転写されるべきＤＮＡ、転写因子ａまたはその相同体、およびＴＡＴＡ−結合蛋白質を提供し；ｂ）工程ａ）のＤＮＡ、転写因子および結合蛋白質を精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素と混合し；次いでｃ）該ＤＮＡの転写に十分な条件下で、工程ｂ）の該混合物を維持する工程を有することを特徴とする、イン・ビトロでのＤＮＡ配列の転写法。４５．ａ）（ｉ）転写されるべきＤＮＡ；（ｉｉ）転写因子ａ、またはその相同体；（ｉｉｉ）ＴＡＴＡ−結合蛋白質；（ｉｖ）その遺伝子転写を修飾する能力について評価されるべき物質；および（ｖ）精製ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を一緒にし、それにより試験混合物を作製し；ｂ）該ＤＮＡの転写に十分な条件下で、工程ｂ）の試験混合物を維持し；次いでｃ）該試験混合物中でＤＮＡ転写が起こる程度を測定し、次いで、その結果を該物質の不在下でＤＮＡ転写が起こる程度と比較する工程を有することを特徴とする、遺伝子転写を修飾する物質を同定する方法。４６．１以上のＳＲＢ蛋白質および１以上のＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質、遺伝子転写を調節できる能力を有する該複合体を含むことを特徴とする精製複合蛋白質複合体。４７．該活性がクロマチン再構成活性である請求項４６記載の複合体。４８．候補蛋白質の欠失したＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性を補足する能力を評価することを特徴とするＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性と機能的に同等な活性を有する蛋白質を同定する方法。４９．ａ）該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素中のＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性を部分的に、もしくは完全に阻害し；ｂ）該候補蛋白質を該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素と会合させ；次いでｃ）該候補蛋白質と会合したＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の活性を測定し、ここに、もし該候補蛋白質が阻害されたＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質と機能的に同等ならば、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素は遺伝子転写を開始する工程を有することを特徴とする該ＳＲＢまたはＳＷＩ／ＳＮＦ蛋白質の活性と機能的に同等な活性を持つ蛋白質を同定する方法。