JPH11511163A

JPH11511163A - エイジイン化合物

Info

Publication number: JPH11511163A
Application number: JP9509187A
Authority: JP
Inventors: デニー，ウィリアム，アレクサンダー; ヘイ，マイケル，パトリック; ウィルソン，ウイリアム，ロバート
Original assignee: デニー，ウィリアム，アレクサンダー; ヘイ，マイケル，パトリック; ウィルソン，ウイリアム，ロバート
Priority date: 1995-08-18
Filing date: 1996-08-19
Publication date: 1999-09-28
Also published as: US6124310A; WO1997007118A1; CA2229269A1; NZ315411A; AU716920B2; AU6711096A; EP0853623A1; GB9517001D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、式（I）および（II）［式（I）のＸはニトロリダクターゼ又はカルボキシペプチダーゼ酵素によって切断可能な基を表す。］の化合物を提供する。該化合物の酵素による活性化により、腫瘍性疾患の治療に使用できる医薬化合物が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】エンジイン化合物本発明は、新規クラスのエンジイン化合物、これらの化合物の製造法、および腫瘍性疾患の治療におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、ＧＤＥＰＴ（遺伝子特異的酵素プロドラッグ療法）のためのプロドラッグとしての使用に適する、エンジインの新規のニトロフェニルカルバメートをベースとするプロドラッグに関する。発明の背景プロドラッグの使用は、特にそのプロドラッグが、腫瘍関連抗原に結合するモノクローナル抗体に結合可能である酵素の影響下で抗腫瘍剤に変換され得る場合には、そのようなプロドラッグと該酵素モノクローナル／抗体コンジュゲートとの組み合わせが非常に有力な臨床剤となるので、癌の治療において臨床上非常に有用な概念である。癌の治療に対するこの方法は、しばしば「抗体特異的酵素／プロドラッグ療法」（ＡＤＥＰＴ）とも言われ、WO 88/07378 に開示されている。「ウイルス特異的酵素プロドラッグ療法」（ＶＤＥＰＴ）と言うさらに別の療法が、プロドラッグを使用することによる患者の腫瘍細胞の治療法として提案されている。腫瘍細胞は、プロドラッグを活性化し得る酵素をコードする遺伝子を有するウイルスベクターの標的とされる。遺伝子は、組織特異的プロモーター又はエンハンサー配列によって転写調節することができる。プロドラッグが腫瘍細胞内で活性薬物に変換されるように、ウイルスベクターは腫瘍細胞に入り込んで酵素を発現する(Huberら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1991）88，8039）。あるいは、遺伝子をデリバリーするための非ウイルス法が使用されている。そのような方法としては、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクション、リポソーム、ＤＮＡの直接的取り込み、および受容体媒介ＤＮＡ導入が挙げられる。これらは、Morgan & French，Annu．Rev．Biochem.，1993，62:191に概説されている。「ＧＤＥＰＴ」（遺伝子特異的酵素プロドラッグ療法）は、ウイルス性および非ウイルス性の両デリバリーシステムを含むものとして使用する。ダインマイシン(Konishi，M.ら、J．Chem．Soc．1990，112，3715-3716)、エスペラマイシン(Golik，J.ら、J．Amer．Chem．Soc．1987，109，3462-3464)およびカリケアマイシン(Lee，M.D.ら、J．Amer．Chem．Soc．1987，109，3464-3466)などの天然に存在するエンジイン抗生物質は、非常に有力な細胞毒であり、腫瘍細胞培養物の増殖阻害に対するＩＣ₅₀値は低いｐＭ範囲にある。この非常に優れた効力は、それらを、プロドラッグに対する潜在的エフェクターとして魅力あるものにしている(Maier，M.E．Synlett．1995，13-26)。これらの化合物の細胞毒性効果は、電気環状反応を開始するのに十分接近したエンジイン核の共役三重結合をもたらす分子の再配列が引き金となる(Bergman，R．G.，Acc．Chem．Res．1973，6， 25-31)。各ＤＮＡ鎖上のリボース部分からプロトン（Ｃ−４’又はＣ−５’）を同時に引き抜くことができる一過性のベンゼン１，４−ジラジカルの形成により、二重鎖の切断を生じるラジカル反応のカスケードが生じる(DeVoss，J.J．ら、 J．Amer．Chem．Soc．1990，112，9669-9670)。天然の抗体は非常に複雑な分子であるが、最近の研究(Nicolaou，K.C．ら、Sc ience 1992，256，1172-1178; Nicolaou，K.C.ら、Proc．Natl．Acad．Sci USA ．1993，90，5881-5888)は、より単純でより入手し易く、細胞毒性も非常に強い一連の合成類似体を報告している。塩基触媒によるβ−放出および光分解的に生じる系など、種々の放出系が報告されている(Nicolaou，K.C．ら、J．Amer．Che m．Soc．1992，114，8890-8907: Nicolaou，K.C.ら、J．Amer．Chem．Soc．1993 ，115，7944-7953: Nicolaou，K.C.; Dai，W.-M．J．Amer．Chem．Soc．1992，1 14，8908-8921: Wender，P.A．ら、J．Org．Chem．1993，58，5867-5869: Wende r P.A.ら、Synthesis，1994，1279-1282)。種々のクラスの細胞毒の４−ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体が、大腸菌から単離された好気性ニトロリダクターゼ酵素に対する基質となり得る能力に対して試験されている。４−ニトロベンジルオキシカルボニル基のニトロ基のニトロリダクターゼ酵素による還元の後、その基を不安定にし、細胞毒から遊離させる。当技術分野で提案されている４−ニトロベンジルオキシカルボニル化合物としては、フェニレンジアミンマスタード、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣおよびドキソルビシンの誘導体が挙げられる。これらの化合物の酵素による活性化の程度は大きく変わり、予測できない(Anlezark，G.M．ら、J．Biochem． Pharmacol．1992，44，2289-2295: Knox，R.J.ら、Cancer Metastasis Rev．199 3，12，195-212: Knox，R.J.ら、Biochem．Pharmacol．1992，44，2297-2301:Ma uger，A.B.ら、J．Med．Chem．1994，37，3452-3458)。本発明者らは、エンジインの４−ニトロベンジルカルバメート誘導体が、予期しなかったことに、ニトロリダクターゼの良好な基質であり、従って、この酵素と共にＧＤＥＰＴのためのプロドラッグとして使用できることを見いだした。発明の要旨本発明は、一態様において、一般式（Ｉ）：［式中、Ｘは式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）：［式中、Ｒ₁は、Ｈ、Ｒ、ＮＲＲ、ＣＯＮＨＲ、ＯＲ、ＮＨＣＯ₂Ｒ、ＣＯ₂Ｒ、ＳＯ₂Ｒ、ＮＯ₂又は４個までのＦ原子を表す。］で表される基であり；Ｒ₂は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ又はＯ（ＣＨ₂）_nＸ（ＣＨ₂）_mＲであり；Ｒ₃は、Ｈ、ＯＨ又はＯＲであり；ｎは１〜５であり；ｍは１〜５であり；ＸはＯ、ＮＨ、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ又はＮＨＣＯＯであり；Ｒは、必要に応じて、ヒドロキシル、メトキシ、アミノ、ジメチルアミノ又はカルボキシル酸基から選択される、同一の又は異なる１〜４個の基で置換された低級アルキル（６個までの炭素原子）、又は式（Ｉｃ）：［式中、ｎ’は１〜６であり、ＨＥＴはＯ、ＳおよびＮから選択される２個までの原子を含むヘテロ５又は６員環である。］の部分である。］で表される化合物、又は生理学的に機能するその誘導体を提供する。第二の態様において、本発明は、一般式（II）：［式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は上記で定義した通りであり、Ｒ₄はＨ、ベンジルオキシカルボニル、アリオキシカルボニル（allyoxycarbonyl）、又はＣ_1-6アルコキシカルボニル（例えば、エトキシカルボニル）又は必要に応じて、ニトロおよびＲ（Ｒは上記で定義した通りである。）から選択される、同一の又は異なる２個までの基で置換されたフェノキシカルボニル基である。］で表される化合物、又は生理学的に機能するその誘導体を提供する。式（Ｉ）および（II）の化合物は、２つの異なるエナンチオマー形で存在し得ることが認められる。そのような場合、式（Ｉ）および（II）は、どちらかのエナンチオマー形又は両方の混合物を表すと理解すべきである。本発明者らは、式（Ｉ）（Ｘは基（Ｉａ）である）および（II）の化合物が、大腸菌由来の好気性ニトロリダクターゼによって活性化される得る比較的毒性のないプロドラッグであることを見いだした。Ｘが基（Ｉｂ）である式（Ｉ）の化合物は、カルボキシペプチダーゼ酵素によって活性化することができる。別の態様において、本発明は、式（Ｉ）および（II）の化合物の抗癌薬としての使用に関する。化合物は、癌（例えば白血病）および特に固形癌（乳癌、腸癌および肺癌（小細胞肺癌を含む）など）の治療法において酸素および低酸素腫瘍細胞の選択的死滅のために使用できる。さらに別の態様において、本発明は、式（Ｉ）又は（II）の化合物を、ＡＤＥＰＴ又はＧＤＥＰＴ療法においてニトロリダクターゼ酵素（例えば、大腸菌から単離されたもの）とともに使用することに関する。本発明はまた、式（Ｉ）又は式（II）の化合物を製剤学的に許容され得る担体又は希釈剤とともに含む医薬組成物を提供する。発明の詳細な説明Ａ．式（Ｉ）の化合物の合成式（Ｉ）においてＸが基（Ｉａ）である化合物は、式Ａ：［式中、Ｐｈはフェニルであり、Ｒ²およびＲ³はＨである。］の公知(Nicolaou ，K.C．ら、J．Amer．Chem．Soc．1991，113，3106-3114)中間体を、適切な条件下で、適切に置換された４−ニトロベンジルアルコールおよびＮａＨと反応させるか、あるいは、Ａを、適切な条件下で、適切に置換された４−ニトロベンジルアルコール、１８−クラウン−６および炭酸セシウムと反応させることにより合成できる。式（Ａ）の出発物質の合成に関するさらに詳細な説明については、WO 93/2304 6も参照できる。式（Ｉ）においてＸが基（Ｉｂ）である化合物は、式（Ｉ）においてＸが水素又はフェノキシカルボニルである化合物を、適切に保護されたグルタミン酸誘導体（例えば、グルタミン酸イソシアネート）又はグルタミン酸ジ−tert−ブチルエステルと、１８−クラウン−６および炭酸セシウムの存在下で反応させることにより製造できる。適切な反応条件に関しては、WO 88/07378およびWO 91/03460 も参照できる。Ｂ．式（II）の化合物の合成これらの化合物は、添付した反応図１を参照し、下記の概要に従って製造できる。３−アミノ−７，８，９，１０−テトラヒドロフェナントリジン（１）と２− ニトロベンジルクロロホルメートおよびトリエチルアミンとのＤＣＭにおける反応により、カルバメート（２）が得られる。（２）とＭＣＰＢＡとのＤＣＭにおける反応により、Ｎ−オキシド（３）が得られ、これを室温で４時間、無水酢酸により処理すると、アセテート（４）が得られる。アセテート（４）のＭｅＯＨ溶液をAmberlite樹脂IRA-400と共に16時間攪拌すると、アルコール（５）が得られ、これをトリエチルアミンの存在下、ｔ−ブチルジメチルシリルトリフレート／ＤＣＭで処理すると、シリルで保護されたフェナントリジン（６）が得られる。化合物（６）は、光分解によって脱保護することにより、アニリン（７）を生じ、それをＤＣＭにおける塩化トリチルおよびトリエチルアミンでアルキル化することにより、（８）が得られる。（８）を臭化エチニルマグネシウムのＴＨＦ溶液と−78℃で反応させ、次いで、フェニルクロロホルメートと反応させると、化合物（９）が得られる。トリチル基をトリフルオロ酢酸によって脱離すると（１０）が得られ、これを４−ニトロベンジルクロロホルメートおよびトリエチルアミンで処理すると、（１１）が得られる。（１１）をＭＣＰＢＡ／ＤＣＭと反応させるとエポキシド（１２）が得られ、これをＴＢＡＦで脱保護すると、アルコール（１３）を得ることができる。（１３）をＤＣＭ中、ＰＣＣおよび４Ａ分子ふるいで酸化すると、ケトン（１４）が得られる。（１４）をＰｄ（ＰＰｈ₃ ）₄、ＣｕＩおよびｎＢｕＮＨ₂の存在下、塩化物（１５）と反応させるとエンジイン（１６）が得られ、これを硝酸銀、次いでＫＣＮで脱保護すると、（１７）が得られる。次いで、（１７）をトルエン中、ＬＤＡで処理すると、所望のエンジイン（１８）が得られる。Ｃ．ＧＤＥＰＴＣ（ｉ）−ベクター系一般に、ＧＤＥＰＴ療法で使用されるベクターは、好適なＤＮＡ又はＲＮＡベクターであればいずれでもよい。好適なウイルスベクターとしては、レトロウイルスに基づくものが挙げられる。そのようなベクターは、当技術分野では広く入手できる。Huberら（同書）は、ヘパトーム、乳房、結腸又は皮膚の細胞の形質転換に対する両種指向性レトロウイルスの使用を報告している。Culverら(Scien ce（1992）256; 1550-1552)も、ＧＤＥＰＴでのレトロウイルスベクターの使用を記載している。それらから誘導されるベクターも使用できる。他のレトロウイルスも、本発明での使用に適するベクターを作製するために使用できる。そようなレトロウイルスとしては、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。 Englehardtら(Nature Genetics（1993）4; 27-34)は、嚢胞性繊維症膜貫通調節物質（ＣＦＴＲ）の細胞へのデリバリーにおけるアデノウイルスをベースとするベクターの使用を記載しており、そのようなアデノウイルスをベースとするベクターも使用できる。アデノウイルスプロモーターおよび他の制御配列を利用するベクターは、本発明に係る系の肺の細胞へのデリバリーに使用でき、従って、肺癌の治療に有用である。モロニーマウス白血病ウイルスに基づくベクターなどの他のベクター系は公知である(Ram，Zら、Cancer Research（1993）53; 83-88; Dalton & Treisman，Ce ll（1992）68; 597-612)。これらのベクターは、β−グロビン最小プロモーターの上流にクローン化されたマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンハンサーを含む。酵素の効果的な翻訳を行うために、開始ＡＴＧまでのβ−グロビン５’未翻訳領域を補う。上記したベクターに使用できる好適なプロモーターとしては、ＭＬＶ、ＣＭＶ、ＲＳＶおよびアデノウイルスプロモーターが挙げられる。好ましいアデノウイルスプロモーターは、アデノウイルス初期遺伝子プロモーターである。強力な哺乳類プロモーターも適する。そのようなプロモーターの例としては、Mizushima およびNagataの文献((1990)，Nucl．Acids Res．18; 5322)に従って得ることができるＥＦ−１αプロモーターが挙げられる。実質的に同様の転写活性を保持するそのようなプロモーターの変形も使用できる。Ｃ（ii）−ニトロリダクターゼ好ましくは、ニトロリダクターゼ酵素は、細菌性ニトロリダクターゼなどの、哺乳類以外のニトロリダクターゼ酵素である。WO 93/08288に開示されている大腸菌ニトロリダクターゼが特に好ましい。酵素は、標準的組換えＤＮＡ技術、例えば酵素をクローン化し、その遺伝子配列を決定し、例えば部位特異的突然変異誘発による配列の切断、置換、欠失又は挿入などの方法により遺伝子配列を変えることにより、改変することができる。標準的組換えＤＮＡ技術の説明に関しては、Sambrookらの″Molecular Cloning″(1989，Cold Spring Harbor)が参照できる。行われる改変は、保護する４−ニトロベンジル基のニトロ基を還元する能力は酵素に残したままであって、酵素の他の特性、例えばその反応速度又は選択性が変化するものであればいずれでもよい。さらに、Ｎ−および／又はＣ−末端配列の小さい切断が、酵素をコードする核酸配列が種々の他のベクター配列に結合するベクターを生じるのに必要な操作の結果として生じる可能性がある。Ｃ(iii)カルボキシペプチダーゼ酵素は、好ましくは、細菌性カルボキシペプチダーゼ、特に、カルボキシペプチダーゼCPG2又はPseudomonas γ−グルタミルヒドロラーゼEC3.4.22.12(Levy CC & Goldman P J．Biol．Chem．242; p2933(1967))である。カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)は、WO 88/07378に開示されている。天然のC PG2が好ましいが、その配列に対して、アミノ酸置換、欠失又は挿入（例えば、各場合、約１、２、３、４、５、１０又は２０残基）の変異も可能である。とにかく、変異は、酵素が、実質的に天然の酵素と同じ速度でプロドラッグを活性薬物に変換する能力を保持するような変異である。ここで、「実質的に同じ速度」とは、望ましくは、１以内の大きさであり、好ましくは約50倍小さい大きさ（例えば２倍小さい大きさ）から２、５又は１０倍大きい大きさである。特異的変化の他に、酵素は、酵素の活性が上記したように実質的に無変化である限り、切断、置換、欠失又は挿入によって変えることができる。例えば、Ｎ− および／又はＣ−末端配列における小さい切断は、その酵素をコードする核酸配列が好適なプロモーターに結合するベクターを生じるのに必要な操作の結果として生じ得る。Ｄ．ＡＤＥＰＴＡＤＥＰＴ系で使用する場合、腫瘍特異的マーカーに対して特異的な抗体は、上記したように改変され得るニトロリダクターゼ又はカルボキシペプチダーゼ酵素に結合させる。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルである。本発明の目的に対して、「抗体」という用語は、特に断らない限り、腫瘍標的抗原に対する結合活性を保持する抗体全体の断片を含む。そのような断片としては、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）₂断片、ならびに一本鎖抗体が挙げられる。さらに、抗体およびその断片は、例えばEP-A-239400に記載されているように、ヒト化抗体であってもよい。抗体は、通常のハイブリドーマ技術によって、又は、改変抗体もしくは断片の場合には、組換えＤＮＡ技術、例えばプロモーターに機能を発揮するように結合した改変抗体又は断片をコードするＤＮＡ構築物の好適な宿主ベクターでの発現によって、産生させることができる。好適な宿主細胞としては、細菌（例えば、大腸菌）、酵母、昆虫および哺乳類が挙げられる。抗体がそのような組換え技術によって産生される場合、酵素は、その酵素をコードする核酸配列（所望により、上記したように改変されたもの）を、抗体又はその断片をコードする構築物の配列の３’又は５’端に結合させることにより産生され得る。Ｅ．生理学的機能性誘導体プロドラッグの生理学的機能性誘導体としては、塩、アミドおよびエステルが挙げられる。エステルとしては、エステル基のカルボニル以外の部分が、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ_1-6アルキル（メチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル又はｔ−ブチル）；又はＣ_3-6環状アルキル（例えば、シクロヘキシル）から選択されるカルボン酸エステルが挙げられる。塩としては、生理学的に許容され得る塩基性の塩、例えばアルカリ金属（例えば、ナトリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、アンモニウムおよびＮＲ₄ _″（Ｒ”はＣ_1-4アルキルである）塩などの適切な塩基から誘導されるものが挙げられる。他の塩としては、塩酸塩および酢酸塩などの酸付加塩が挙げられる。アミドとしては、無置換ならびにモノ −およびジ−置換誘導体が挙げられる。そのような誘導体は、薬剤分野でそれ自体が公知の技術によって製造され得る。Ｆ．発明の適用本発明の化合物は、ヒト又は動物の治療法に使用できる。そのような治療としては、腫瘍性疾患の患者における腫瘍細胞の増殖の治療法が挙げられ、該方法は、ＡＤＥＰＴ又はＧＤＥＰＴ療法系の一部として、本発明の治療用化合物を必要とする患者に投与することを含む。腫瘍性疾患としては、白血病ならびに乳、腸および肺腫瘍（小細胞肺癌を含む）などの固形腫瘍が挙げられる。理解されるように、腫瘍の治療に関する場合、治療は、患者に対する腫瘍の影響を緩和するために医師が取るいかなる処置をも含む。すなわち、腫瘍の完全緩解が望ましい目標であるが、効果的な治療は、腫瘍の部分的緩解を達成することができるとともに、転移を含む腫瘍の増殖速度を低下させ得るいかなる処置をも含む。そのような処置は、生命の質の延長および／又は向上ならびに症状の緩和に有効である。Ｆ（ｉ）：ＡＤＥＰＴ療法ＡＤＥＰＴに対する抗体／酵素コンジュゲートは、同時に投与できるが、臨床上は、プロドラッグの例えば72時間前まで、又は１週間も前に、酵素／薬剤コンジュゲートを投与して、酵素／薬剤コンジュゲートが腫瘍標的領域に局在化する機会を付与するのが好ましいことが判明している。このように操作することにより、プロドラッグを投与する場合、プロドラッグの細胞毒性薬剤への変換は、酵素／薬剤コンジュゲートが局在化する領域、すなわち、標的腫瘍領域に限られる傾向にあり、式（II）の化合物の早すぎる放出が最小にされる。ＡＤＥＰＴにおいて、酵素／薬剤コンジュゲートの局在化の程度（自由に循環している活性コンジュゲートに対する局在化の割合で表す）は、WO 89/10140に記載のクリアランスおよび／又は不活性化系を使用してさらに高めることができる。これは、通常はコンジュゲートの投与後でプロドラッグの投与前に、酵素を不活性化し、および／又は血液からのコンジュゲートのクリアランスを促進するように、コンジュゲートのそのような部分に結合し得る成分（「第二成分」）の投与を含む。そのような成分としては、酵素を不活性化し得る系の酵素成分に対する抗体が挙げられる。第二成分が、血管部分から離れるのを防止するために、第二成分を、デキストラン、リポソーム、アルブミン、マクログロブリン又は血液型群Ｏの赤血球などのマクロ分子に結合させてもよい。さらに、又は、その代わりとして、第二成分は、十分な数の共有結合したガラクトース残基又はラクトースもしくはマンノースなどの他の糖の残基を含み得る。その結果、第二成分は血漿中ではコンジュゲートを結合することができるが、肝臓中では、ガラクトース又は他の糖に対する受容体によって血漿からコンジュゲートとともに除去され得る。第二成分は、プロドラッグの投与前および投与中に、局在化したコンジュゲートを不活性化し得る腫瘍の血管外空間に、識別できる程度に混入しないように投与し、使用設計するべきである。ＡＤＥＰＴ系では、プロドラッグおよびコンジュゲートの投与量は、最終的には医師の自由であるが、医師によって、患者の年齢、体重および状態などの因子が考慮されるであろう。プロドラッグおよびコンジュゲートの好適な投与量は、 Bagshaweら、Antibody，Immunoconjugates，and Radiopharmaceuticals(1991)， 4，915-922に示されている。コンジュゲートの好適な投与量は、500〜200,000酵素単位/m²例えば、20,000酵素単位/m²）であり、プロドラッグの好適な投与量は、患者一日あたり、約0.1〜200mg/kg、好ましくは約10〜100mg/kgである。所望の治療部位でコンジュゲートの最大濃度を確保するために、通常は、２成分の投与を少なくとも４時間あけて行うのが望ましい。正確な処方(regime)は、標的とする腫瘍の性質およびプロドラッグの性質などの種々の因子の影響を受けるが、通常は、48時間以内に、所望の治療部位に十分な濃度のコンジュゲートが存在する。ニトロリダクターゼとともに使用する場合のＡＤＥＰＴ系も、好ましくは、酵素に対する適切な共因子を含む。好適な共因子としては、ニコチン酸又はニコチンアミドのリボシド又はリボチドが挙げられる。抗体／酵素コンジュゲートは、ＡＤＥＰＴ療法で通常使用される適切な経路で投与することができる。これには、下記のＦ（iv）に記載のものと同様の方法および組成物における抗体の非経口投与が含まれる。Ｆ（ii）：ＧＤＥＰＴ療法治療でベクターを使用する場合、ベクターは、通常は、例えばRamら（同書）に記載されているように、ウイルス粒子にパッケージされ、その粒子は腫瘍部位にデリバリーされる。ウイルス粒子は、腫瘍に対する標的度を高めるために、抗体、その断片（一本鎖を含む）又は腫瘍特異的リガンドを含むように改変され得る。あるいは、ベクターは、リポソームにパッケージすることもできる。リポソームは、特定の腫瘍の標的とされ得る。これは、腫瘍特異的抗体をリポソームに結合することにより達成できる。ウイルス粒子も、リポソームに導入することができる。当該粒子は、医師の思いどおりに任意の適切な手段によって腫瘍に運搬され得る。好ましくは、ウイルス粒子は、腫瘍細胞に選択的に感染することができる。「選択的に感染する」とは、ウイルス粒子が主に腫瘍細胞に感染し、かつ治療を受ける病気の性質を示すとしても、感染した非腫瘍細胞の割合が、プロドラッグの投与による非腫瘍細胞に対する障害が許容できるほどに低くなるような割合であることを意味する。好適な一つの投与法は、滅菌溶液における粒子の注入による。ウイルス、例えばパッケージ用細胞系から単離したウイルスを、局所灌流又は直接腫瘍内投与により、あるいは、体腔への直接注入（腔内投与）、例えば腹膜内注入により投与することもできる。ＧＤＥＰＴに対する正確な用量の処方は、もちろん、個々の患者に対して個々の医師が決定することが必要であり、これは、プロドラッグの正確な性質およびプロドラッグから放出され得る細胞毒性薬物によって制御されるが、いくつかの一般的指針は示すことができる。この種の化学療法は、一般に、改変ウイルスの非経口投与を含み、静脈内投与が最も実用的であることが多くの場合で分かっている。ＧＤＥＰＴ系では、デリバリーされるウイルス又は他のベクターの量は、上記したＡＤＥＰＴ系と同様の細胞内濃度の酵素を提供する量である。典型的には、ベクターが患者に投与され、次いで、トランスフェクション又は感染（ウイルスベクターの場合）を受けた細胞によるベクターの取り込みが、例えば標的とされた組織の生検サンプルの回収および分析によってモニターされる。これは、試行用量範囲を患者に投与し、標的細胞又は腫瘍の感染又はトランスフェクションの程度を測定することを含む臨床的試行によって決定できる。必要なプロドラッグの量は、ＡＤＥＰＴ系の場合と同様か、それより多い。ＧＤＥＰＴ系の使用では、プロドラッグは、通常、酵素をコードするベクターの投与後に投与される。プロドラッグの適切な投与量は、患者一日あたり、約0. 1〜200mg/kg、好ましくは約10〜100mg/kgである。Ｆ（iv）：薬物又はプロドラッグの投与本発明の化合物は単独での投与が可能であるが、それらは医薬組成物として提供するのが好ましい。当該組成物は、化合物を１種以上の許容され得るその担体および所望により他の治療成分とともに含む。担体は、組成物の他の成分と適合し、その受け手、例えばリポソームに対して有害でないという意味で「許容され得る」ものでなければならない。好適なリポソームとしては、例えば、正に帯電した脂質（Ｎ〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）を含むもの、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むもの、および３β〔Ｎ−（ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル〕コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）を含むものが挙げられる。非経口投与又は筋肉内投与に適する組成物としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質および組成物と意図する患者の血液とを等張性にする溶質を含み得る水性および非水性滅菌注射溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤、ならびにリポソーム又は化合物の標的を血液成分もしくは１種以上の器官とするように設計された他の微粒子系を含み得る水性および非水性滅菌懸濁物が挙げられる。組成物は、１回投与又は多数回投与用の容器、例えば密閉アンプルおよびバイアルに入れて提供することができ、使用直前に注射用の滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。注射溶液および懸濁物は、上記に記載されている種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から即座に調製することができる。理解されるように、上記で特に挙げた成分の他に、組成物は、関与する組成物の種類に関する当技術分野での通常の他の薬物を含み得る。可能な組成物のうち、発熱物質を含まない滅菌水性および非水性溶液が好ましい。投与は、継続的に、例えば毎日、一週間おき、もしくは一カ月おきに、又は患者の特定の要求に応じて行うことができる。好ましい投与法は、経口投与および注射、典型的には非経口又は筋肉内注射若しくは腫瘍内注射である。正確な投与量は、もちろん、個々の患者に対して個々の医師が決定することが必要であり、これは、化合物の正確な性質によって制御されるが、いくつかの一般的指針を示すことができる。典型的な投与量の範囲は、一般的には上記で記載した範囲であり、一回又は多数回に分けて投与できる。他の投与量は、医師の裁量で、患者の状態および他の因子に従って使用できる。下記実施例により本発明を説明する。実施例１式Ａ’：の公知(Nicolaou，K.C.; Smith，A.L.; Wendeborn，S.V.; Hwang，C.-K．J．Ame r．Chem．Soc．1991，113，3106-3114)エンジイン（0.188mg、0.47ミリモル）のＴＨＦ（2ml）溶液を、４−ニトロベンジルアルコール（22.0mg 、1.43ミリモル）およびＮａＨ（50%懸濁液、69mg、1.43ミリモル）のＴＨＦの攪拌溶液に、Ｎ２下、０℃で添加した。その溶液を０℃で１０分間攪拌し、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（5ml）を添加した。混合物をＥｔＯＡｃ（3ｘ20ml）で抽出し、有機画分を一緒にしてブライン（30ml）で洗浄し、脱水乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）して、溶媒を減圧除去した。残渣をクロマトグラフィーにかけ、40%ジエチルエーテル／石油エーテルで溶離すると、（６Ｒ，６ａＲ，１０Ｒ，１０ａＳ，１４Ｚ）−（±）−（４−ニトロフェニル）メチル７，８，９，１０−テトラヒドロ−６ａ，１０ａ− エポキシ−６，１０−〔３〕−ヘキセン〔１，５〕ジイノフェナントリジン−５（６Ｈ）−カルボキシレート（67mg、31%）が得られた。融点（ゴム）：59〜63 ℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：2955，2933，2863，1709，1524，1495，1389，1271cm-１：１ＨＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）ｄ8.21(d，J=8.8 Hz，2H，H3″')，7.69(dd ，J=7.9，1.3 Hz，1H，H1)，7.58(d，J=8.5 Hz，2H，H2″')，7.38(dd，J=8.1， 1.2 Hz，1H，H4)，7.31(ddd，J=8.1，7.4，1.4 Hz，1H，H3)，7.22(ddd，J=7.7 ，7.5，1.3 Hz，1H，H2)，5.97(dd，J=9.9，1.6 Hz，1H，H4')，5.84（dd，J=9. 9，1.7 Hz，1H，H3')，5.47(d，J=1.5 Hz，1H，H6)，5.35(d，J=13.8 Hz，1H，H 1″)，5.30(d，J=13.8 Hz，1H，H1″)，3.99(s 1H，H10)，2.29-2.34(m，1H，H7 )，2.07-2.12(m,1H，H7)，1.67-1.85(m，3H，H8，2H9)，1.54-1.58（m，1H，H8 ）；１３ＣＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）ｄ151.0(OCO)，147.0(C4″')，143.7(C1″')，135.0(C4a)，12 8.2(Cla)，128.0(C2″')，127.9(C3)，127.3(C1)，125.9(C4)，125.6(C4')，124 .9(C2)，123.4(C3″')，122.0(C3')，102.2(C6')，93.9(C1')，90.9(C5'),88.7( C2')，69.7(C6a)，66.2(C1″)，60.4(C10a)，49.0(C6)，28.4(C10)，22.7(C7)， 22.0(C9)，15.1（C8）;ＭＳ（ＤＥＩ）452（60%，Ｍ＋）:316(30)，272(60)，24 4(70)，216(100)，136（95）;ＨＲＭＳ（ＤＥＩ）計算値（Ｃ２７H２０Ｎ２０Ｏ５として）（Ｍ＋）:452.1372，実験値:452.1375。１ＨＮＭＲおよび１３ＣＮＭＲの帰属は、ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣおよびＨＭＱＣ実験に基づいて決定した。また、回収したものは、出発物質とした（12%）。あるいは、上記化合物は、１８−クラウン−６（0.41g、0.25ミリモル）および４−ニトロベンジルアルコール（78mg、0.51ミリモル）を炭酸セシウム（0.41 g、1.27ミリモル）のアセトニトリル（15ml）の攪拌溶液に添加し、これを20℃ でさらに10分間攪拌することにより調製できる。化合物Ａ’（100mg、0.25ミリモル）を添加し、混合物を20℃で24時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。Ｅｔ₂Ｏ／石油エーテル（４：６）で溶離すると、所望の４−ニトロベンジル化合物（72mg，68%）が得られた。実施例２実施例１で合成した化合物を、好気性条件下、96−ウェルプレートで18時間、ＵＶ４細胞とともにインキュベートさせることにより、大腸菌からの好気性ニトロリダクターゼにより活性化した。化合物２のＩＣ₅₀は18.1μMであったが、同様の条件下で、精製した大腸菌ニトロリダクターゼ酵素(1μg/ml)およびＮＡＤＨ（1mM、共因子として）とともにでインキュベートすると、0.19μMのＩＣ₅₀を示した。これは、酵素による115倍の活性化を示し、この酵素と共にＧＤＥＰＴに対するプロドラッグとしてのその化合物の潜在的有用性を示している。これに対して、式Ａ’の化合物も、式Ｂ：の公知(A.L．Smithら、米国特許第5,276,159;Chem．Abstracts 1994，121，2804 70v)の密接に関連した化合物も、酵素による活性化を示さなかった。実施例３化合物４の合成（反応図２）化合物（１）〔K.C．Nicolaou，P．Maligres，T．Suzuki，S.V．Wendeborn，W .-M．DaiおよびR.K．Chandha，J．Am．Chem．Soc.，1992，114，8890-8907の方法により合成〕（0.57g，1.15ミリモル）、ＴＢＤＭＳＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＳＯ₂ＰｈＭｅ（1.53g，4.62ミリモル）、Ｃｓ₂ＣＯ₃（5.64g，17.3ミリモル）および１８ −クラウン−６（1.53g、5.77ミリモル）のアセトニトリル（100ml）における混合物を20℃で16時間攪拌した。混合物をセライトにより濾過し、溶媒を減圧除去した。残渣をジエチルエーテル（150ml）に懸濁し、セライトにより濾過して、ジエチルエーテル（2x20ml）で洗浄し、有機抽出物を一緒にして減圧蒸発させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、10〜20%勾配のＥｔＯＡｃ／石油エーテルで溶離すると、化合物（２）が泡状物質として得られた（354mg，54% ）。ＩＲν_max（薄膜）2951，2930，2857，2857，1723，1505，1377，1273，120 0cm^-1;¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）ｄ7.32-7.36(m，3H，Ｈ_arom)，7.14-7.21(m，4H ，Ｈ_arom)，6.86(dd，J=8.8，2.7 Hz，1H，Ｈ_arom)，5.78（dd，J=9.8，1.3 Hz ，1H，CH=C)，5.67(dd，J=9.8，1.4 Hz，1H，CH=C)，5.48(s，1H，NCH)，4.04-4 .07(m，2H，CH₂O)，3.95-3.98(m，2H，CH₂O)，3.73(brs，1H，CH)，2.38-2.44(m ，2H，CH₂)，2.19-2.27(m，1H，CH₂)，0.90(s，9H，SiC(CH₃)₃)，0.10(s，6H，S i(CH₃)₂)；¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）ｄ156.2，154.6，151.0，135.5，129.2，12 8.6，127.3，125.5，124.9，121.9，121.5，113.9，113.7，101.5，94.0，91.3 ，88.8，69.9， 69.5，61.9，60.9，50.0，29.5,25.8，23.2，22.2，18.3，15.6，-5.4；ＤＥＩＭＳm/z567（Ｍ⁺，50%）510(100)，266(20)，372(30)；ＨＲＤＥＩＭＳ計算値（Ｃ₃₄Ｈ₃₇ＮＯ₅Ｓｉとして）（Ｍ⁺）:567.2441、実験値:567.2440 （２）（317mg、0.55モル）のアセトニトリル（5ml）溶液を、４−ニトロベンジルアルコール（253mg、1.65ミリモル）、Ｃｓ₂ＣＯ₃（1.07g，3.30ミリモル）および１８−クラウン−６（145mg、0.55ミリモル）のアセトニトリル（20ml）における懸濁物に添加し、混合物を20℃で16時間攪拌した。混合物をセライトにより濾過し、エーテル（50ml）で洗浄し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、30〜50%勾配のジエチルエーテル／石油エーテルで溶離すると、（３）が油状物として得られた。39mg（11%）；ＩＲν_max（薄膜）2949，2930，2857，1707，1607，1522，1505，1346，1271，1100cm^-1。（３）（39mg，62ミリモル）のＴＨＦ（2ml）溶液をＴＢＡＦ（1MのＴＨＦ溶液、70ml、70ミリモル）で処理し、20℃で30分間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、50〜80%の勾配のジエチルエーテル／石油エーテルで溶離すると、（４）（17mg、54%）が得られた。ＩＲν_m _ax （薄膜）3440、2951、2926、2855、1707、1521、1503、1346、1273cm^-1;¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）ｄ8.19(d，J=7.6 Hz，2H，Ｈ_arom)，7.42(brs，2H，Ｈ_arom) ，6.86(dd，J=8.8，2.6 Hz，1H，Ｈ_arom），5.79(dd，J=9.9，1.6 Hz，1H，CH=) ，5.76(dd，J=9.9，1.6 Hz，1H，CH=)，5.41(brs，1H，NCH)，5.29(s，2H，CH₂O )，4.10(brt，J=4.4 Hz，2H，CH₂O)，3.97(brt，J=4.4 Hz，2H，CHＨ₂O)，3.71( brs，1H，CH)，2.35-2.41(m，1H，CH₂)，2.15-2.24(m，1H，CH₂)，2.15-2.24(m ，1H，CH₂)，1.88-2.04(m，3H，CH₂，OH)，1.66-1.82(m，1H，CH₂)，1.57-1.62( m，1H，CH₂);¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）ｄ156.0，154.8，147.6，143.4，135.7， 130.8，130.0，127.6，125.0，123.8，121.9，113.8，113.7，101.5，93.9，91. 5，88.9，70.1，69.5，66.5，61.4，61.0，50.0，29.5，23.2，22.5，15.6。反応図１反応図１の試薬Ａ２−ニトロベンジルクロロホルメート／Ｅｔ₃Ｎ／ＣＨ₂Ｃｌ₂ ＢＭＣＰＢＡ／ＣＨ₂Ｃl₂ ＣＡｃ₂Ｏ／25℃ Ｄ Amberlite樹脂ＩＲＡ−144／ＭｅＯＨＥＴＢＤＭＳ−Ｔｆ／２，６−ルチジンＦＵＶ光／ＣＨ₂Ｃｌ₂／25℃ ＧＴｒＣｌ／Ｅｔ₃Ｎ／ＴＨＦＨエチニルＭｇＢｒ、次いでＰｈＯＣＯＣｌ／ＴＨＦ／−78℃ ＩＴＦＡ／ＭｅＯＨ／25℃ Ｊ４−ニトロベンジルクロロホルメート／Ｅｔ₃Ｎ／ＣＨ₂Ｃｌ₂ ＫＭＣＰＢＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂ ＬＴＢＡＦ／ＴＨＦＭＰＣＣ／４Å分子ふるいＮＣｌ−Ｃ＝Ｃ−ＴＭＳ，Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄、ＣｕＩ、ｎＢｕＮＨ₂／ＣＨ₂Ｃｌ₂ ＯＡｇＮＯ₃／ＴＨＦ／ＥｔＯＨ／Ｈ₂Ｏ，ＫＣＮＰＬＤＡ／トルエン反応図２ｉ:TBDMS(CH₂)₂OSO₂PhMe/18-クラウン-6/Cs₂CO₃/MeCN/16時間/20℃ ii:4-NO₂PhCH₂OH/18-クラウン-6/Cs₂CO₃/16時間/20℃ iii:TBAF/THF/30分/20℃

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｚ 15/48 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人ヘイ，マイケル，パトリックニュージーランド国 1003 オークランド，グラフトン，パークロード，キャンサーリサーチラボラトリー，ファクルティーオブメディシンアンドヘルスサイエンス，ユニバーシティーオブオークランド (71)出願人ウィルソン，ウイリアム，ロバートニュージーランド国 1003 オークランド，グラフトン，パークロード，デパートメントオブパソロジー，ファクルティーオブメディシンアンドヘルスサイエンス，ユニバーシティーオブオークランド (72)発明者デニー，ウィリアム，アレクサンダーニュージーランド国 1003 オークランド，グラフトン，パークロード，キャンサーリサーチラボラトリー，ファクルティーオブメディシンアンドヘルスサイエンス，ユニバーシティーオブオークランド (72)発明者ヘイ，マイケル，パトリックニュージーランド国 1003 オークランド，グラフトン，パークロード，キャンサーリサーチラボラトリー，ファクルティーオブメディシンアンドヘルスサイエンス，ユニバーシティーオブオークランド (72)発明者ウィルソン，ウイリアム，ロバートニュージーランド国 1003 オークランド，グラフトン，パークロード，デパートメントオブパソロジー，ファクルティーオブメディシンアンドヘルスサイエンス，ユニバーシティーオブオークランド

Claims

【特許請求の範囲】１．式（Ｉ）：［式中、Ｘは式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）：［式中、Ｒ₁は、Ｈ、Ｒ、ＮＲＲ、ＣＯＮＨＲ、ＯＲ、ＮＨＣＯ₂Ｒ、ＣＯ₂Ｒ、ＳＯ₂Ｒ、ＮＯ₂又は４個までのＦ原子を表す。］で表される基であり；Ｒ₂は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ又はＯ（ＣＨ₂）_nＸ（ＣＨ₂）_mＲであり；Ｒ₃は、Ｈ、ＯＨ又はＯＲであり；ｎは１〜５であり；ｍは１〜５であり；ＸはＯ、ＮＨ、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ又はＮＨＣＯＯであり；Ｒは、必要に応じて、ヒドロキシル、メトキシ、アミノ、ジメチルアミノもしくはカルボキシル酸基から選択される、同一の又は異なる１〜４個の基で置換された低級アルキル（６個までの炭素原子）、又は式（Ｉｃ）：［式中、ｎ’は１〜６であり、ＨＥＴはＯ、ＳおよびＮから選択される２個までの原子を含むヘテロ５又は６員環である。］の部分である。］で表される化合物、又は生理学的に機能するその誘導体。２．一般式（II）：［式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は請求項１で定義した通りであり、Ｒ₄はＨ、ベンジルオキシカルボニル、アリオキシカルボニル(allyoxycarbonyl)、又はＣ_1-6アルコキシカルボニル、又は必要に応じて、ニトロおよびＲ（Ｒは上記で定義した通りである。）から選択される、同一の又は異なる２個までの基で置換されたフェノキシカルボニル基である。］で表される化合物、又は生理学的に機能するその誘導体。３．（ｉ）カルボキシペプチダーゼ又はニトロリダクターゼ酵素をコードし、腫瘍細胞においてそれらを発現し得るベクター；および（ii）該酵素によって活性化され得る請求項１又は２に記載の化合物を含む腫瘍性疾患を治療するための二成分系。４．（ｉ）カルボキシペプチダーゼ又はニトロリダクターゼ酵素に結合する腫瘍特異的抗体；および（ii）該酵素によって活性化され得る請求項１又は２に記載の化合物を含む腫瘍性疾患を治療するための二成分系。５．請求項１又は２に記載の化合物を製剤学的に許容され得る担体又は希釈剤とともに含む組成物。６．ヒト又は動物の体の治療法において使用するための請求項１もしくは２に記載の化合物、請求項３もしくは４に記載の系、又は請求項５に記載の組成物。７．請求項１もしくは２に記載の化合物、請求項３もしくは４に記載の系、又は請求項５に記載の組成物の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、腫瘍性疾患の治療法。