JPH11510708A

JPH11510708A - クローン化された植物ｐ―ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ

Info

Publication number: JPH11510708A
Application number: JP9527097A
Authority: JP
Inventors: ディーンデラペーナ; スーザンアールノーリス
Original assignee: アリゾナボードオブリージェンツオンビハーフオブユニヴァーシティオブアリゾナ
Priority date: 1996-01-29
Filing date: 1997-01-28
Publication date: 1999-09-21
Also published as: WO1997027285A1; EP0877793A1; US6087563A; BR9707200A; EP0877793A4

Abstract

(57)【要約】酵素p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼをコードする、シロイヌナズナのcDNAクローンであるpHPP1.5、配列番号１が開示される。また、シロイヌナズナのp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ発現をコードするDNA配列を含むベクターおよび微生物宿主、およびシロイヌナズナのp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ発現をコードするDNA配列を含む遺伝子構築物が、DNAコーディング配列の5'に位置するプロモーターと3'終結配列と共に開示される。プラストキノン、ビタミンＥ、およびカロチノイドの産生が改変されたトランスジェニック植物の作製方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】クローン化された植物p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ本発明は、米国農務省によって与えられた研究助成番号第93373069083号により政府の補助によってなされた。政府は本発明につき一定の権利を有する。発明の分野本発明は、p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ酵素をコードする完全長クローン化cDNAを用いることによって、植物におけるビタミンＥ、プラストキノン、およびカロチノイド合成を改変する分子的アプローチに関する。発明の背景高等植物のクロロプラストは、多くの固有の、互いに関連する生化学的経路を含んでおり、その経路は植物中で生命維持に必要な機能を発揮するだけでなく農業や栄養的観点からも重要な一群の２次代謝化合物を作り出している。そのような２次代謝物の３つとして、脂溶性のクロロプラスト合成化合物であるビタミンＥ(α-トコフェロールすなわち、α-toc)、プラストキノン(PQ)、およびカロチノイドがあり、それらは皆クロロプラスト中で多くの重要な生化学的機能を果たす。PQおよびビタミンＥはプラスチド中で共通の経路によって合成されるキノン化合物であり；カロチノイドは別個のプラスチド-局在経路によって合成されるテトラテルペノイドである。緑色組織において全プラスチドキノンプールの50％までは、しばしばプラストキノン（PQ）で説明される。PQの主要な機能は光合成電子伝達系の基本的な構成成分として、光化学系IIとチトクロームb₆f複合体との間の電子伝達体として働くことである。PQは他のあまりよく研究されていない、プラスチドにおける機能、すなわち、クロロプラストにおける他の種々の生合成反応の直接の又は中間的な電子伝達体としての働きがありそうである。ビタミンＥはクロロプラスト性キノンの第２の主要なクラスであり、プラスチド中のキノンプールの４０％までがこれで説明される。トコフェロールの本質的な栄養価値は1925年ごろに認識され、ビタミンＥ活性の原因の化合物がα-トコフェロールであることが1936年に最初に明らかにされた。α-Tocは哺乳動物においては抗酸化剤として詳細に文献記載された役割を有し、植物においてはそれほどは知られてはいないが同様な抗酸化的役割を有する。Lieblerら、Toxicology2 3:147-169，1993;Hess，Anti-oxidants in Higher Plants，CRC Press:111-134 ，1993。カロチノイドは植物、真菌類およびバクテリアで合成される、親油性色素の別の多種多様なグループである。光合成組織においてはカロチノイドは光捕集において補助色素として機能し、フリーラジカル、単原子酸素、および他の反応性種を消滅させることによる光防御において重要な役割を果たす。Siefermann-Harms ，Physiol ．Plantarum．69:561-568，1987。非光合成組織おいては高レベルのカロチノイドがしばしば蓄積し、多くの果実、野菜、花の強いオレンジ色、黄色、および赤い着色を与える(Pfander，Methods in Enzym.，213A，3-13，1992)。植物におけるカロチノイドの多くの機能に加えて、カロチノイドおよびその代謝物は動物においても重要な機能を有し、動物においてはそれらはビタミンＡ（レチノール）の主要な源として働き、その抗酸化活性のために、ある型の癌からの保護を与えるものとして同定されている。ビタミンＥの抗酸化活性もまたある型の癌に対する保護として考えられており、この点でカロチノイドと相乗的に働くであろう。Lieblerら、Toxicology 23:147-169，1993，Krinsky，J ．Nutr．119:12 3-126，1989。トコフェロールおよびプラストキノン合成 α-トコフェロールおよびプラストキノンはプラスチドに最も沢山あるキノンであり、図１に示す共通の経路により合成される。両化合物の前駆分子であるホモゲンチジン酸（HGA）は、クロロプラスト中でシキミ酸経路中間体ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（pOHPP）から、酵素ｐ-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（pOHPPジオキシゲナーゼ）によって触媒される酸化／脱炭酸反応で作られる。ホモゲンチジン酸はフィチル化／プレニル化を受け(それぞれフィチルピロリン酸およびソラニルピロリン酸、それぞれC₂₀およびC₄₅)、フィチル／プレニルトランスフェラーゼによる同時脱炭酸と共役しており、最初の真性トコフェロールおよびプラストキノン中間体、2-デメチルフィチルプラストキノールおよび2-デメチルプラストキノール-9をそれぞれ形成する。単環メチル化（single ring methylation）が2-デメチルプラストキノールに起こり、プラストキノール-9（PQH₂）を生成し、次にこれが酸化されてプラストキノン-9（PQ）となる。この酸化は可逆でクロロプラスト中のプラストキノンによる電子伝達の基礎である。 2-デメチルフィチルプラストキノールからα-トコフェロール形成への好まれる経路は、ホウレンソウで確立しているように、１）中間体2-αデメチルフィチルプラストキノールの環メチル化によりフィチルプラストキノールを生成し、２）環化してd-トコフェロールを生成し、そして最後に３）第２の環メチル化が起こりα-トコフェロールが生成される経路らしい。トコフェロールとプラストキノン合成における環メチル化は、双方とも環上のメチル化部位特異的な単一の酵素によって行われるが、かなり広い基質特異性を有し、キノン化合物の両方のクラスに適応する。このメチル化酵素は現在までに植物から精製されているこの経路の唯一の酵素である。d'Harlingueら、J.Biol.Chem ．26:15200，1985。α-toc /PQ経路の全ての酵素活性は、細胞分画研究によれば、pOHPPジオキシゲナーゼおよびトコフェロールシクラーゼ酵素を除いてクロロプラスト内膜へ局在している。細胞分画法の難しさ、これらのいくつかの酵素の活性の低さ、基質の安定性と入手しにくさおよびアッセイの問題がこの経路を生化学的に研究することを困難にしている。ビタミンＥおよびPQのレベル、比，および全量は異なる植物、組織、発生段階で何桁も変動する。このような変動はビタミンＥおよびPQ経路は両者とも高度に制御されており、従って、この２つの最終産物の絶対レベルと比を変えるべく操作できる可能性があることを示す。図１の経路はpOHPPジオキシゲナーゼによるホモゲンチジン酸の産生が経路を通じた全体の流れの鍵となる制御ポイントであろうことを明らかしており、その理由はHGA産生がα-toc/PQ合成おいて最初に寄与するステップだからであり、またこの反応が本質的に不可逆だからでもある。従って、pOHPPジオキシゲナーゼ活性を変えることによりHGAレベルを変えることは、植物組織における全α-toc/PQ生合成蓄積に直接の影響を与えるはずであり、以下に説明するように、PQとカロチノイド合成は関連しているので、植物組織におけるカロチノイド合成にも影響を与えるはずである。カロチノイド生合成；電子伝達体としてのキノン植物では、カロチノイドは図１の左側に示した経路によってもっぱらプラスチド中で合成され蓄積される。カロチノイド合成における最初の寄与段階は、酵素フィトエンシンターゼによるＣ₂₀炭化水素化合物ゼラニルゼラニルピロリン酸（ GGDP）の２分子の縮合であり、無色のＣ₄₀炭化水素化合物フィトエンを生ずる。酸素系光合成生物（oxygenic photosynthetic organism）（例えば、植物、藻類およびラン藻類）では、フィトエンはフィトエン不飽和化酵素によって触媒される２つの連続する不飽和化反応を受け、中間体のフィトフルエンを通してζ-カロチンを生成する。続いてζ-カロチンはζ-カロチン不飽和化酵素によって触媒される、更に２つの不飽和化反応を受け、赤い色素リコピンを生成する。リコピンは環化されてα-カロチンまたはβ-カロチンとなり、それらは両方とも種々の水酸化およびエポキシ化反応を受け植物の光合成組織で最も多いカロチノイドおよびキサントフィルである、ルテイン、β-カロチン、ビオラキサンチンおよびネオキサンチンとなる。カロチノイド経路の最初の２つの酵素（フィトエンシンターゼおよびフィトエン不飽和化酵素）をコードする遺伝子は近年多くの植物及びバクテリア供与源から単離され研究されてきた。Sandmann，Eur ．J．Biochem，223:7-24，1994。フィトエン不飽和化酵素は最もよく研究されてきたもので、その理由は商業的に重要な種々の除草剤の標的だからであり、またフィトエン不飽和化反応がカロチノイド合成において律速段階であると考えられているからでもある。分子的および生化学的研究により、２つのタイプのフィトエン不飽和化酵素が独立の進化によって発達したことが示唆された：非酸素系光合成生物(anoxygenic photosynthet ic organism)（たとえば、ロドバクター(Rhodobacter)およびエルウイニア(Erwi nia)）で見られるCrtI-型および酸素系光合成生物で見られるpds-型である。それらは一次アミノ酸配列の違いにもかかわらず、全てのフィトエン不飽和化酵素はジヌクレオチド結合領域（FADまたはNAD/NADP）を含んでおり、トウガラシ（C apsicum annum）ではFADであることが示されている。Huguenyら、Eur.J.Biochem ． 209:399-407，1992。おそらく、どちらの型のフィトエン不飽和化酵素においても、結合しているジヌクレオチドは不飽和化の際に還元され、プラスチドまたはバクテリア内に存在する未知の酸化剤によって再酸化される。一連の証拠により、高等植物のフィトエン不飽和化反応におけるキノンの役割が示唆された。単離したスイセンのクロモプラストを用いてMayerとその共同研究者は嫌気的環境では酸化された人工キノンがフィトエンの不飽和化に必要であるが、一方還元されたキノンは効果がないことを示した。Mayerら、Eur ．J．Bio chem． 191:359-363，1990。これを指示する証拠はトリケトンクラスの除草剤（例えば、スルコトリオン(Sulcotrione)）から得られた。これは、処理した組織中にフィトエンの蓄積を引き起こすが、よく研究されたピリダゾンクラスの除草剤（例えば、ノルフロラゾン（Norflorazon）(NFZ)）とは異なり、直接フィトエン不飽和化酵素に影響を与えない。そうではなく、トリケトン除草剤は、プラストキノンとトコフェロールの両者の合成に共通の酵素であるpOHPPジオキシゲナーゼを競合的に阻害し、カロチノイド不飽和化反応において１又はそれ以上のクラスのキノンが役割を果たしているかも知れないことを示唆する。Schulzら、FE BS 318:162-166，1993,Secor,Plant Physiol．106:1429-1433;Beyerら、IUPACPu re and Applied Chemistry 66:1047-1056，1994。ビタミンＥ、プラストキノンおよびカロチノイドのヒトの栄養、農業、植物細胞における生化学的プロセスに対する重要性は、よく研究され、幅広いものであるにもかかわらず、植物組織内におけるその生合成と蓄積については多くのことが明らかでないままである。これらが明らかでないために、次には、これらの重要な化合物の植物体内における合成とレベルを操作する可能性が制限される。発明の概要一つの実施態様では、生物学的に純粋なDNAサンプルを提供し、そのDNAはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの発現についてコードする配列を含んでいる。他の実施態様では、本発明は、シロイヌナズナp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの発現についてコードするために充分なほど配列番号１に相同なDNA配列を含むベクターおよび宿主微生物、および、DNAコーディング領域の 5'に位置するプロモーターおよび3'終結領域と共にシロイヌナズナのp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの発現についてコードするに充分なほど配列番号１に相同なDNA配列を含む遺伝子構築物(genetic construction)を提供する。また別の実施態様では、本発明は、プラストキノン、ビタミンＥ、およびカロチノイドの産生量が変化するに充分なほどpOHPPジオキシゲナーゼ酵素のレベルが上昇しているようなトランスジェニック植物を作り出す方法を提供する。本発明の目的は、高等植物を遺伝的に操作してプラストキノン、ビタミンＥ、およびカロチノイドの産生量を改変することである。本発明の別の目的は、pOHPPジオキシゲナーゼ酵素の発現レベルが上昇するであろうトランスジェニック植物、その結果としてトリケトンクラスの除草剤（すなわち、スルコトリオン）の耐性が増大するであろうトランスジェニック植物を提供することである。本発明の他の目的は、酵素p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（pOHPPジオキシゲナーゼ）を調製する方法を提供することであり、この酵素は新規なpOHPPジオキシゲナーゼ-阻害除草剤を同定するために用いることができる。本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい実施態様の説明および請求の範囲から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、カロチノイド、ビタミンＥ（トコフェロール）およびプラストキノンの合成経路の図解である。図２は、図１に示した経路の相互関連の図解である。図３Ａ−３Ｅは、野生型、NFG-wtおよびpdsl組織の色素分析のグラフである。図４は、可視マーカーに対するpdsl変異の物理地図である。図５Ａ−５Ｃは、MS2培地上の野生型植物、pOHPPを添加したMS2培地上のpdsl ホモ接合変異体、ホモゲンチジン酸（HGA）を添加したMS2培地上のpdslホモ接合変異体からの脂溶性色素のC18 HPLC分離の結果を示すものである。図６Ａ−６Ｂは、NFZ-wtおよびpdsl組織中のキノンのC8 HPLC分析の結果を示すものである。発明の詳細な説明上述したように、ビタミンＥとプラストキノンおよびカロチノイドは共に図１に示した経路によってプラスチド中で合成され蓄積される。本明細書には、高等植物pOHPPジオキシゲナーゼcDNAの同定、単離、特徴づけおよび機能解析、α-to c、PQおよびカロチノイド合成における役割、および植物組織におけるpOHPPジオキシゲナーゼ活性を変化させ、従って、植物組織中の１又はそれ以上の化合物、すなわちプラストキノン、ビタミンＥおよびカロチノイドの蓄積を変化させるためのこのcDNAの使用を記載する。トランスジェニック植物におけるpOHPPジオキシゲナーゼの過剰発現は、非-トランスジェニック植物に比較して、トリケトン除草剤にさらされた植物組織の酵素−対−阻害剤比を変え、その結果除草剤耐性が増大するであろう。本明細書にはまた、pOHPPジオキシゲナーゼ、新規なpOHPP ジオキシゲナーゼ-阻害除草剤を同定するのに有用な酵素であるが、その生産に使用するための遺伝子構築物を記載する。本発明者は遺伝的解析により、ビタミンＥ、プラストキノンおよびカロチノイド生合成経路は図２に示したように互いに関連しており共通の要素を共有していることを示した。シロイヌナズナの変異の研究から、本発明者はpdsl（pds=phyt oene desaturation）と命名した１つの遺伝子座を同定したが、これを破壊するとカロチノイド生合成経路の最初のカロチノイドであるフィトエンの蓄積をもたらす。驚いたことに、この変異はカロチノイド合成を破壊するもので、本来これを基礎に同定されたにもかかわらず、フィトエン不飽和化酵素をコードした遺伝子座にマップされない。このことはpdslは、フィトエン不飽和化酵素に加えてフィトエン不飽和化に必要な、従って高等植物におけるカロチノイド合成に必要な、第２の遺伝子産物を定めていることを示す。この遺伝子産物はpOHPPジオキシゲナーゼであることが分かった。プラストキノン、ビタミンＥ、およびカロチノイドという化合物の合成および蓄積を操作するための分子的機構を提供するため、本発明者は分子遺伝学的アプローチを用い、モデル植物系であるシロイヌナズナの利点を利用して、植物内におけるそれらの化合物の合成に要求される遺伝子を同定し、単離しおよび研究した。顕花植物シロイヌナズナは植物の分子生物学および分子遺伝学を研究するためのモデル系として広く使われるようになっている。シロイヌナズナは遺伝的解析について多くの利点を提供する：自家受粉することができ、非常に多くの子孫が得られる（１つの植物体から10,000までもの種子が得られる）。さらに、シロイヌナズナは世代時間が５から６週間と短く、従って適当な期間内に交雑でき子孫の解析ができる。変異のスクリーニングにより、形態形成、光合成、稔性、デンプンおよび脂質代謝、無機栄養状態その他を含む、基礎植物生物学の種々の側面に影響を与える数千の変異が同定されている。これに加えて、そのハプロイドゲノムは約１０⁸塩基対にすぎない。ここで用いて成功したアプローチの重要な特徴は、本質的な構成要素が、その単離、解析および分子的操作の前に、最初に機能的遺伝的に同定されたことである。簡単に言えば、表現型と生化学的スクリーニングを組み合わせて可能性のある変異体を同定し、遺伝的および分子的レベルで特性を明らかにし、関心のある遺伝子座を選びだし、次に対応する遺伝子をクローニングして更に調べた。このアプローチにより、本発明者は一つの遺伝子、pdslを遺伝的に同定しそのcDNAを単離した。pdslの変異はプラスチド中の３つの全てのクラスの化合物、トコフェロール、プラストキノンおよびカロチノイドの合成を止める。pdsl変異体の生化学的解析により、pdsl遺伝子はpOHPPジオキシゲナーゼ活性に影響を与えることが明らかになった。pOHPPジオキシゲナーゼは、植物におけるプラスチド性キノン経路（図１）の非常に重要な酵素であり、すなわち、プラストキノンおよびα -トコフェロールの合成に直接的に、かつ、カロチノイド合成に間接的に必要である。詳細には、推定されるpdsl変異体およびpOHPPジオキシゲナーゼ酵素の機能は図２に示した。本発明者は、生化学的相補によってpdsl変異が酵素p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（pOHPPジオキシゲナーゼ）に影響を与えることを明らかにした。なぜならば、pdsl植物はこの酵素の基質ではなくその産物（それぞれ p-ヒドロキシフェニルピルビン酸（pOHPP）とホモゲンチジン酸である）で生育することによってレスキューされるからである。pOHPPジオキシゲナーゼはビタミンＥおよびプラストキノン双方の合成において鍵となる分岐点の酵素であり重要なステップであり、いくつかの独立した生化学的証拠によりpdslはこの酵素に影響することが確かめられる（図１，５，６）。これらの結果は、プラストキノンは高等植物中のカロチノイド合成において、おそらく不飽和化反応（図２）で電子伝達体／酸化還元要素として必須の構成要素であることの初めての遺伝学的証拠を提供するものである。従って、シロイヌナズナpOHPPジオキシゲナーゼ遺伝子／cDNAはすべての高等植物において、プラストキノン、α-トコフェロールおよびカロチノイド産生を変化させるための基礎を提供する。具体的には、本明細書には、変異解析によるシロイヌナズナpOHPPジオキシゲナーゼ遺伝子の遺伝的同定、シロイヌナズナpOHPPジオキシゲナーゼcDNAの物理的単離および機能確認、その塩基配列および、他の植物種からのpOHPPジオキシゲナーゼ遺伝子およびcDNAを単離するためのその使用を記載する。また、本明細書には、シロイヌナズナpOHPPジオキシゲナーゼcDNAおよび他の植物の関連するc DNAを使用して、組換え技術（過剰発現、コサプレッション(cosuppression)、アンチセンス、その他）により、どんな、かつ全ての植物組織、具体的には葉および果実の組織で、pOHPPジオキシゲナーゼの発現／活性を正に又は負に変化させ、α-toc、PQおよびカロチノイドの産生に正または負の影響を与えることの記載が含まれる。 pOHPPジオキシゲナーゼタンパク質レベルの上昇は植物組織で合成されるホモゲンチジン酸（HGA）の量を増加させる。HGAはα-tocおよびPQ合成（経路の最終産物）を律速する前駆分子であるので、HGA合成の増強は植物組織におけるα-to c（ビタミンＥ）およびPQのレベルを増加させる。PQの増加は、その合成にPQを必要とするカロチノイド合成を間接的に増加させる。加えて、PQの増加は、光化学系IIと光化学系Ｉの間の電子流を増加させることにより光合成効率を増加させる。なぜなら、PQはこの２つの光化学系の間の主要な電子輸送体だからである。哺乳動物ではよく研究された抗酸化剤であるα-tocの増加は、強光、高温、水ストレス、オゾンストレス、ＵＶストレス又は他の非生物的あるいは生物的ストレスによって引き起こされるような酸化的ストレスに植物が耐える能力を増大させる。pOHPPジオキシゲナーゼのレベルを上昇させるとpOHPPジオキシゲナーゼを標的とする除草剤の用量反応曲線(dose response curve)は変化するであろうし、従って、同じ種の天然の植物に比較して、トランスジェニック植物においてそのような除草剤に対する相対的な耐性を増大させるであろう。pOHPPジオキシゲナーゼの発現の抑制は反対の効果を有すると考えられる。遺伝子構築物植物中でpOHPPジオキシゲナーゼを発現させるには、pOHPPジオキシゲナーゼコーディング配列を含むDNA配列が、そのコーディング配列を植物で発現させることができる制御配列と結合されることが必要である。沢山の効率的な、構成的および発生または組織特異的な植物プロモータがいずれも当業者に知られている。転写終結配列（ポリアデニル化配列）が付加されてもよい。植物用発現ベクターすなわち、挿入したコーディング配列を植物内で発現させるために構築されたプラスミドはコーディング配列を含むキメラ植物用発現構築物を構築するため、およびその構築物を簡便に植物に導入するために技術的に広く使われている。pOHP Pジオキシゲナーゼをコードする配列には、例えば配列番号１、またはpOHPPジオキシゲナーゼ発現のコーディングに充分な様に指定された配列の改変体が含まれる。当業者によく知られた一般的に用いられる分子生物学的方法がこのDNA配列を操作するために用いられるかもしれない。我々は「遺伝子構築物」によって、タンパク質-コーディング配列とプロモーター配列（および必要なら終結配列）とを、そのプロモーター配列（および、もしあるならば終結配列）をそのタンパク質-コーディング配列に機能するように結合させた、種々の組み合わせの手段のいかなるものをも指すことを意図している。典型的には、プロモーター配列はタンパク質-コーディング配列の「上流」にあり、一方終結配列は、使用される場合は、タンパク質-コーディング配列の「下流」にあるだろう。タンパク質-コーディング配列、プロモーターおよび終結配列はプラスミドまたはウイルスベクター上で結合されて、微生物宿主に導入されてもよい。他の機能配列がこの遺伝子構築物に付加されてもよい。もうひとつは、タンパク質-コーディング配列、プロモーター配列および付加されているならば終結配列は他の必要な機能配列と結合されてベクター無しで用いられてもよい。配列番号１によって記載されるDNA配列はpOHPPジオキシゲナーゼの発現のコーディングをするのに充分である。しかしながら、上記の配列は短くすることができてなおかつ同じ性質を与えることが想像される。今のところどの具体的な欠失が成功するか不明であるが、おそらくこのタンパク質のある種の欠失はなお効果的な酵素活性を生じさせるであろう。分子生物学に習熟した者であれば、指定された配列を取り上げ、その示された配列のどの部分がpOHPPジオキシゲナーゼ発現のコーディングをするために不可欠であるかを決定するために欠失解析実験をすることは可能であろう。候補となる欠失変異のある遺伝子構築物を作り、以下で実施例に記載したような実験を行い、そのような欠失変異配列がこの酵素のコーディングができるかどうかをテストすることができるであろう。酵素活性が発現することは欠失変異が成功したことを示す。こうしたやり方で指定の配列のどの部分が酵素の発現に必須であるか決定することができるであろう。また遺伝コードが縮退していること、１以上のコドン、すなわち３つのヌクレオチドの組、が各アミノ酸をコードしていることが知られている。従って、産生されるタンパク質の配列を変えることなく、本明細書に記載のpOHPPジオキシゲナーゼに対する配列のような、タンパク質に対するDNAコーディング配列を変えることが可能である。特定の宿主ではコドン使用頻度の選択は発現レベルに影響を与えるかもしれない。そのようなコドン使用頻度の変更は本明細書でも考慮されている。さらに、本明細書に記載したシロイヌナズナpOHPP遺伝子のコーディング配列を用いて他の高等植物の相同なpOHPPジオキシゲナーゼ配列が容易に取り出せることも考えられている。オリゴヌクレオチドを以下に記載した配列から作ることができ、cDNAまたはゲノムライブラリにハイブリダイズさせることもでき、または、他の植物の相同なpOHPPジオキシゲナーゼ配列のPCR増幅のために用いることもできる。 pOHPP遺伝子が手に入れば、それがシロイヌナズナからであろうと他の植物種からであろうが、キメラの植物発現用遺伝子構築物を関心のあるどの植物種にも導入することができるようになる。そのような遺伝子構築物を、全てではないにしろ大部分の商業的に重要な植物種に導入するための適切な植物形質転換法が存在する。現在知られている方法には、アグロバクテリウム-媒介形質転換、被覆粒子遺伝子デリバリー（Biolistics）および、遺伝子導入を容易にするために電圧が用いられるエレクトロポレーションが含まれる。これらの方法の全て、および他の方法は、生ずるトランスジェニック植物のゲノム中に遺伝子構築物を挿入することができ、その挿入様式は遺伝子構築物が遺伝性の特徴となり、元のトランスジェニック植物の子孫に通常のメンデルの遺伝法則によって伝達されるものである。従って、pOHPP遺伝子を発現している遺伝子構築物が植物に導入されると、必要な何らかの遺伝的背景に移すことは植物育種プログラムの一部となり得る。 pOHPPジオキシゲナーゼを過剰発現させるために、強力なプロモーターと共に遺伝子構築物を用いてもよい。内在性のpOHPPジオキシゲナーゼの発現を抑制するために、当業者が知るように、植物組織中に存在するpOHPPジオキシゲナーゼのレベルを下げるためにアンチセンス遺伝子構築物を作成することができる。実施例カロチノイド合成を欠損している変異体、pdslの単離高等植物のクロロプラスト中のカロチノイド生合成および他の経路との統合を更に理解するため、本発明者はカロチノイド合成が遮断されているシロイヌナズナ変異体を単離することによってこの経路を調べた。カロチノイド合成の初期の段階（例えば、β-カロチンの産生前）における欠損についてホモ接合の植物は土壌で生育する場合は致死であり、そのような変異体の単離には土壌致死変異についてヘテロ接合の植物を同定するためのスクリーニング方法の設計が必要である。本発明者は、大部分の、土壌致死性の、ホモ接合の、色素-欠損シロイヌナズナ変異体はショ糖を添加したMurashigeとSkoogの基本培地（MurashigeおよびSkoog，Physiol ．Plant．15:473-497，1962）（MS2 培地）上の組織培養ではほとんど完全体に生育することを見いだした。これらの条件下では光合成およびクロロプラストの発達は本質的に不要であり、全てのエネルギーと植物に必要な栄養物は培地によって供給される。 FeldmannのT-DNAタギングされたシロイヌナズナ集団（Forsthoefelら,Aust ．J ．Plant Physiol． 19:353-366，1992）の10,000個体から、致死性の色素変異の分離の基づいて色素解析のために500以上の系統を選んだ。致死性の色素変異についてヘテロ接合の植物の種子を表面殺菌し、MS2培地で育て、分離する色素変異体を同定し、個々の植物から組織を集め、HPLC色素分析を行った。重大な色素欠損を持つ沢山の変異体系統が同定されたが、たった２つだけがカロチノイド生合成変異体であることが分かった。このグループから単離された一つの変異体系統、pdslをここで詳細に説明する。生合成経路の破壊に対する顕著な表現型は、遮断されている箇所前の中間体化合物の蓄積である。カロチノイド経路のこのような遮断は除草剤NFZ、これはフィトエン不飽和化酵素の阻害剤（図１）であり、処理した組織中にフィトエンの蓄積を引き起こすことが報告されているが、野生型の植物をこれで処理することにより化学的に模倣できる。Britton，Z ．Naturforsch 34c:979-985，1979。図3 A-3Eは野生型、NFZ-wt、およびpdsl組織の色素分析の結果を示している。図3A-3 E中の略号は、以下のとおりである：Ｎ、ネオキサンチン；Ｖ、ビオラキサンチン；Ｌ、ルテイン；Ｃｂ、クロロフィルｂ；Ｃａ、クロロフィルａ；β、β-カロチン。図３Ａは、野生型シロイヌナズナの葉に蓄積するカロチノイドのＣ₁₈逆相HPLC 分析を示したものである。これと比較して、図３Ｂは、NFZ処理した野生型（NFZ -Wt）の色素特性を示したものである。NFZ-Wt組織における33分のところの強い2 96nm吸収ピークのスペクトル分析により276、286および298nmで最大吸収が示され、それがフィトエンであることを示唆する(図３Ｄ)。図３Ｃは組織培養生育させたホモ接合pdsl変異体植物の色素分析を示したものである。図３Ｂおよび３Ｃ中の440nmの低い吸収はNFZ-Wtのように、pdsl変異体が、野生型組織で通常蓄積する全てのクロロフィルおよびカロチノイドを欠くことを示している（図３Ａと比較せよ）。しかしながら、野生型と異なり、pdsl変異体はリテンションタイム約33分のところに、296nmで強く吸収するピークを含んでいる。pds l変異体の33-分ピークのリテンションタイムおよび吸収は、NFZ-Wt組織の色素抽出物のフィトエンピークに一致する(図３Ｂ)。pdslの33-分ピークのスペクトル分析を図３Ｅに示してあるが、これはNFZ-Wt組織のフィトエンのスペクトル（図３Ｄ）および公表されているフィトエンのスペクトルと実質的に同一である。これらの結果はpdsl中で蓄積している化合物がフィトエンと化学的に同一であることを確認するものであり、pdsl変異がカロチノイド生合成を破壊することを決定的に証明するものである。カロチノイド分析カロチノイドの定量的かつ定性的分析のために、植物組織を微量遠心チューブにいれマイクロペストル（micropestle）で200μｌの80％アセトン中で粉砕した。120μｌの酢酸エチルを加えて混合物をボルテックスした。140μｌの水を加え混合物を５分間遠心した。カロチノイドを含む上層を新しいチューブに移しJoua n RC1010遠心エバポレーターで真空乾燥した。乾燥した抽出物を１μｌあたり0. 5mgの生重量の濃度で酢酸エチルに再懸濁し、直ちに解析するか又は窒素下で-80 ℃に保存した。カロチノイドは、25cmの長さのSpherisorb ODS2 5ミクロンＣ₁₈カラム（CT、N orwalkのPhase Separations Limited）を用い、アセトニトリル／水／トリエチルアミン（9:1:0.01v/v）に溶解した酢酸エチル（０〜100％）の45分勾配を用い、１分間あたり1mlの流速で、逆相HPLC解析によって分離した(GoodwinとBritton 、1988)。カロチノイドは、296nmおよび440nmの両方で検出し、既知の標準に対するリテンションタイムによって同定した。必要な場合には、個々のピークの吸収スペクトルをHewlett Packard 1040Aフォトダイオードアレイ検出器によって得、公表されているスペクトルまたは入手可能な標準品と比較した。キノン分析キノンは、BlighらのCan ．J．Biochem．Physiol．37:911-917，1959に記載された方法を改変した方法を用いて組織から抽出した。凍結植物組織を乳鉢で３容積のクロロフォルムと６容積のメタノールと共に粉砕し、試験管に移した。2相混合物が得られるまで水と追加のクロロフォルムを加えた。その後、キノンを含むクロロフォルム層を集めた。収率を上げるために、水層をクロロフォルムで逆抽出し、２つのクロロフォルム層を一緒にし、Whatman #3濾紙で濾過した。生じた濾液を連続的な窒素流下で乾燥した。乾燥したら、このペレットを１mlあたりの生重量10mgの濃度でメタノールに再懸濁し直にHPLCで解析した。キノンは、25 cmの長さのLiChrosorb RP-8、5ミクロンカラム(CA、San JoseのAlltech)で、最初の14分間はメタノール中の10％Ｈ₂Ｏ無勾配溶媒を用い、１４分のところで溶媒を100％メタノールに切り替えて残りの操作を行い逆相HPLC解析によって分離した(Lichtenthaler、Handbook of Chromatography、CRC Press、115-159、1984 に記載された方法を改変したもの)。操作中流速を１分間あたり１mlとした。ピークは、α-トコフェロールについては280nm、プラストキノンおよびユビキノンについては260nmにおける検出により、既知の標準のリテンションタイムに基づき、およびHewlett Packard 1040Aフォトダイオードアレイ検出器による吸収スペクトルにより同定した。必要な場合には、個々のクロマトグラフピークに代表される分画を集め、質量分光分析のために、Southwest Environmental HealthSc ience CenterのAnalytical Core研究所に送った。結果は、陽イオンモードで操作される大気圧化学イオン化源（atomospheric pressure chemicalionization s ource）を装備したTSQ7000質量分光器(CA、San JoseのFinnigan Corp.)を用いて得られた。装置を単位解像度（unit resolution）に設定し、サンプルを0.3ml／分のメタノール流中でイオン化源に導き入れ5kVの放電を用いてイオン化した。 pdslの遺伝的解析 pdsl変異の遺伝的性質は、pdslヘテロ接合植物の自家受粉によって生じた種子を解析することによって決定した。乾燥させる前に、Ｆ１種子を緑色（野生型またはヘテロ接合）か白色（ホモ接合）かについて記録した。３：１の分離比がみられたが(146の緑色種子：48の白色種子)、これはpdslが単一の劣性の核酸変異として遺伝することを示す（Ｘ²＝0.01、ｐ＞0.90)。pdsl変異体はフィトエンの不飽和化が阻害されているので、本発明者はフィトエン不飽和化酵素の変異であろうと考えた。この酵素は、以前に第４番染色体上のagとbpの間にマップされている。Wetzelら、Plant J ．6:161-175，1994。この仮説をテストするために、 pdsl変異を可視的マーカーに対してマッピングした。pdsl変異は第１番染色体上、dislからclv2へ約７cMにマッピングされることが分かった。Franzmannら、Pla nt J ． 7:341-350，1995。これらのデータポイントは図４に要約してあり、pdsl がフィトエン不飽和化酵素遺伝子座にマッピングされないことを明確にし、従って、pdsl変異はフィトエン不飽和化酵素にないことを示す。このデータはpdsl変異の性質に関する重要な洞察を与える。ホモ接合pdsl変異体は、プラストキノンおよびトコフェロール生合成の中間体であるホモゲンチジン酸によってレスキューすることができる初めの方に述べたように、フィトエン不飽和化におけるキノンおよびpOHPPジオキシゲナーゼの役割を示唆する以前の研究を受けて、本発明者はpdsl変異体におけるキノン生合成経路を研究することにした。プラストキノン／トコフェロール合成の初期段階を、この経路の２つの中間体化合物であるp-ヒドロキシフェニルピルビン酸（pHOPP）とホモゲンチジン酸（HGA）（図１および２を参照せよ）の存在下において生育させることにより機能的に解析した。アルビノpdslホモ接合植物を最初にMS2培地上で発芽させ、次に100μMのpOHPPまたはHGAのいずれかを添加したMS2培地に移した。pdsl植物はpOHPPを含む培地に移してもアルビノのままであったが、pdsl植物をHGAを含む培地に移したときは緑化が起こった。図５Ａ〜５Ｃはpdsl変異体のホモゲンチジン酸による相補の結果を示す。各グラフは10mgの生重量の組織から抽出した色素を表す。図５Ａ〜５Ｃ中で用いた略号は、図３Ａ〜３Ｅと同様である。pOHPPおよびHGAで生育したpdsl植物から抽出したカロチノイドの440nmの検出によるHPLC分析はそれぞれ図５ＢおよびＣに示した。pOHPP上で生育したpdsl変異体の色素特性は図３Ｂに示したMS2培地上で生育したpdsl植物の特性と同様である。pdsl＋HGA組織と野生型組織の色素特性を比較すると(図５Ａおよび５Ｃ)、HGA存在下での生育は、アルビノのホモ接合pdsl植物に対して野生型カロチノイドの特性を質的に回復させることが示される。これらの結果は、pdsl変異は酵素pOHPPジオキシゲナーゼに影響を与えることを示す。なぜなら、pdsl変異体はこの酵素の基質、すなわちpOHPP 上での生育では変わらず、むしろ、この酵素の産物、HGA上での生育によって野生型色素産生に質的に回復するからである(図１および２を参照せよ)。pdslがHG Aと相補することはこの経路の中間体または最終産物（プラストキノンおよび／またはトコフェロール、図１および図２を参照せよ）は植物においてフィトエン不飽和化に必須の構成成分であることも示し、FEBSのSchultzらの所見を確認するものである。そこではpOHPPジオキシゲナーゼの阻害剤はフィトエンの蓄積をもたらすことが示されている。 HPLC分析により、pdslはプラストキノン／トコフェロール生合成経路における変異であって、またカロチノイド合成にも影響を与える変異であることが明確に示される pdsl変異体の生化学的相補性に加えて、プラストキノン／トコフェロール経路をpdsl組織においてＣ₈HPLCを用いて直接に分析し、全脂質抽出物を分離してキノンの３つの別々のクラスを同定した：ユビキノン、プラストキノン、およびα -トコフェロール（ビタミンＥ）である(図５および６)。ユビキノンおよびプラストキノンは、それぞれミトコンドリアおよびクロロプラストで類似の電子伝達機能を果たすが、別々の細胞内区画中の異なる経路によって合成され(Goodwinら、Introduction to Plant Biochemistry、Oxford，Pergamon Press,1983)、このことによりユビキノンはこうした分析において理想的な内部対照となる。図６は NFZ-Wt組織およびpdsl組織の脂溶性抽出物のＣ８ HPLC分析を示す。NFZ-Wt組織（図６Ａ）において、ピーク３および４はリテンションタイム(２６分および２７分)、光学スペクトル、および質量スペクトル（結果は示していない）に基づき、それぞれユビキノンおよびプラストキノンと同定された。NFZ-Wt組織はリテンションタイム13.5分のピーク（１）を含み、このピークは標準品のリテンションタイムに基づきα-トコフェロールであると同定された。しかしながら、光学分光分析および質量分光分析によりピーク１は２つの主要成分からなっていることが明らかになった：α-トコフェロール（１ａ）と未同定の化合物（１ｂ）である。α-トコフェロールの質量は、質量431のプロトン化した分子の存在によって示されるように430であると決定されたが、未同定の化合物の分子質量は、質量413のプロトン化分子の存在によって示されるように4 12であり(データは示していない)、ピーク１中の２つの化合物の存在が明確に示された。このキノン分析により、除草剤NFZは、フィトエン不飽和化酵素を特異的に阻害するものだが、ホモゲンチジン酸塩由来のキノン合成に影響を与えないことが明らかになった。pdsl組織（図６Ｂ）はユビキノン（ピーク３）を含むがプラストキノン（ピーク４）を欠いている。さらに、pdslは13.5分のところにピークを含んでいるが、光学分光分析および質量光学分析のデータはこのピークは α-トコフェロール（１ａ）を欠き化合物１ｂのみからなることを示す(データは示していない)。従って、ホモ接合のpdsl植物はユビキノンを蓄積するが、プラストキノンとα-トコフェロールの両方を欠いている。このことはHGAによる変異のレスキューによって示唆されるようにpdsl変異体はpOHPPジオキシゲナーゼ（図１および２を参照せよ）に影響を与えることと矛盾せず、pdsl変異がpOHPPジオキシゲナーゼを破壊するという新たな証拠を提供するものである。不完全長の、推定されるシロイヌナズナpOHPPジオキシゲナーゼcDNAの単離 pOHPPジオキシゲナーゼ活性の阻害剤はカロチノイド合成を破壊しフィトエンの蓄積をもたらすことを示したSchultzらの所見はpdsl変異体の性質に関する重要な洞察を与えるが、そのことは次に本発明者にpdsl遺伝子座に対するcDNAの単離に関する重要な洞察を与えた。動物ではpOHPPジオキシゲナーゼの活性を阻害する遺伝的欠損はＩ型チロシン血症を起こし、これは尿中に高レベルのpOHPPが存在することを特徴とする、芳香族アミノ酸代謝の致命的な遺伝病である。この疾病の性質をさらに理解するために、pOHPPジオキシゲナーゼcDNAがいくつかの哺乳動物およびバクテリア供与源からクローニングされている (Ruetschiら、Eur ．J．Biochem．205:459-466,1992に要約されている)。種々の哺乳動物間のpOHPPジオキシゲナーゼ酵素のアミノ酸の同一性は＞80％である。これに対して、バクテリアのホモローグとの同一性は非常に低く、28％より低い。哺乳動物およびバクテリアの配列を発現配列タグ（Expressed Sequence Tag s）(ESTs)コンピューターDNAデータベースを検査するために用いて(Newmanら、P lant Physiol ． 106:1241-1255，1994)、不完全長シロイヌナズナESTを一つ同定し、これをプローブとして用いた。この不完全長シロイヌナズナプローブは配列番号１の1072塩基対から1500塩基対に相当する。このcDNAはタンパク質コーディング領域のＣ末端部分の99アミノ酸のみを含んでいる。この推定されるシロイヌナズナpOHPPジオキシゲナーゼcDNAから導かれるタンパク質配列は哺乳動物およびバクテリアのpOHPPオキシゲナーゼの両方に同様のホモロジー（〜50％同一）を示す。面白いことに、この部分的なシロイヌナズナの配列はヒトまたはバクテリアの酵素には見られない15のアミノ酸の挿入も含んでいる。最後に、哺乳動物およびバクテリアの６つのpOHPPジオキシゲナーゼ配列を整列させると、高度に保存された３つの領域が同定され、最も高いのはpOHPPジオキシゲナーゼのカルボキシ端付近の16アミノ酸領域であり、すべての種にわたって62.5％の同一性を示した。Ruetschiら、Eur ．J．Biochem.205:45 9-466，1992。この領域は不完全長シロイヌナズナ配列にも存在する。一連の証拠により、上述した不完全長シロイヌナズナcDNAはpOHPPジオキシゲナーゼ、おそらくはpdsl遺伝子座をコードしていることが示唆される。完全長シロイヌナズナpOHPPジオキシゲナーゼcDNAの単離と特性解析不完全長シロイヌナズナcDNAプローブを用いて、完全長cDNAに対する核酸ハイブリダイゼーションによって、シロイヌナズナcDNAライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイズする多数のcDNAを単離し、最も長いものの一つ、1520bp のインサートを含むpHPP1.5を完全にシーケンシングした；このインサートは配列番号１として示した。pHPP1.5は446アミノ酸のタンパク質（配列番号２として示した）をコードしており、哺乳動物およびバクテリアのpOHPPジオキシゲナーゼよりも僅かにサイズが大きい。pHPP1.5はアミノ酸レベルで種々の哺乳動物およびバクテリアのpOHPPジオキシゲナーゼと34〜40％の同一性を示す。４種のバクテリアpOHPPジオキシゲナーゼおよび１つの哺乳動物(ブタ)pOHPPジオキシゲナーゼ、これらの大きさは346〜404アミノ酸の範囲だが、Denoyaらは、これらを比較して５種の全てのpOHPPジオキシゲナーゼ間で保存されている69のアミノ酸を同定した。Denoyaら、J ．Bacteriol．176:5312-5319.，1994。pHPP1. 5コーディング領域はこれらの69の保存されたアミノ酸のうち52を含んでいる。 pHPP1.5が活性なpOHPPジオキシゲナーゼタンパク質をコードし、pdsl変異を相補することの証明 pHPP1.5がpdsl遺伝子座にコードされる遺伝子産物であり機能のあるpOHPPジオキシゲナーゼタンパク質をコードすることを決定的に証明すべく、pdslとの分子相補性実験のためにpHPP1.5 cDNAを植物形質転換ベクターにクローニングした。完全長の野生型pOHPPジオキシゲナーゼcDNAを、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（CaMV）プロモータによって動かされ、かつ必要な全ての終結カセットと選択マーカー（Kan^r）を含む植物形質転換ベクターにサブクローニングするであろう。CaMvプロモーターは強い構成的プロモーターである。この単一の構築物および（対照として）pHPP1.5インサートのないベクターを、土壌生育植物体全体を用いた真空浸潤形質転換(vacuum infiltration transformation)に用い、かつ、pdsl変異についてヘテロ接合の植物の形質転換にも用いるであろう。Bouchez ら、CR Acad．Sci．Paris，Sciences de la vie 316，1993。標準的な方法では、20〜30の土壌生育植物を独立に形質転換して別々に解析するであろう。この例ではpdsl変異を含むホモ接合の植物は致死であろうが、pdsl 変異を含むヘテロ接合の植物はその長角果（silique）においてpdsl変異について２：１に分離するであろう。発明者は対照として並行する形質転換においては同様な数の野生型植物を用いるであろう。pdslを分離する植物集団を形質転換した後、これらの植物は種子をもつので、発明者は、３：１の比で緑色：白色胚を含むであろう長角果を調べることによりpdsl変異についてヘテロ接合の植物を後から容易に同定することができる。別々に形質転換したヘテロ接合pdsl植物体から集めた種子はカナマイシン上で発芽させて、抵抗性の芽生えを土壌に移すであろう。pdsl表現型（アルビノおよびフィトエン蓄積）に関するこれらの一次形質転換体の種子（Ｔ２種子）およびＴ３種子およびT-DNAにコードされたカナマイシン抵抗性マーカー（野生型pOHPP ジオキシゲナーゼcDNA）の分離解析はpdsl変異とpOHPPジオキシゲナーゼcDNAとの相補性を決定的に証明するであろう。pHPP1.5がpdsl遺伝子座にコードされていることの追加の証拠を提供すると、Listerら、Plant J ．4:745-750,1993に記載されているように、pHPP1.5cDNAは組換え近交系を用いてpdsl遺伝子座に関連してマッピングされている。pHPP1.5cDNAはpdsl変異を含む第１番染色体領域にマッピングされた(図４)。最後に、pHPP1.5cDNAを大腸菌（E.coli）中で過剰発現させタンパク質の活性を測定するであろう。 pOHPP発現の改変上述した遺伝的かつ生化学的研究から、たった一つのpOHPPジオキシゲナーゼ遺伝子産物がクロロプラスト性キノン合成に関与しており、pdsl変異がこの遺伝子を定めており、pHPP1.5cDNAはpdsl遺伝子座にコードされる産物であり、この機能が破壊されると植物組織中のビタミンＥ産生およびプラストキノン及びカロチノイド合成が完全に失われることが明らかである。従って、pHPP1.5を用いた分子的技法によって植物中のpOHPPジオキシゲナーゼ発現を改変することで、トコフェロール、プラストキノンの産生に直接に、およびカロチノイドの産生に間接に（図１および２を参照せよ）正または負の影響を与えることができる。特に、pOHPPジオキシゲナーゼ酵素の過剰発現は、トランスジェニック植物の組織におけるこれらの１又はそれ以上の化合物レベルの上昇をもたらすであろう。もうひとつは、アンチセンス技術を用いて、酵素活性レベルを低下させて植物中でのこれらの化合物のレベルを低下させることが可能である。更に、pOHPPジオキシゲナーゼの過剰発現により、トランスジェニック植物はこの酵素を標的とする高レベルの除草剤に抵抗できるようになり、正常植物に比較して農業経済上重要な除草剤耐性が提供されであろう。２つの異なる植物系統、シロイヌナズナとトマトを植物組織における改変した pOHPPジオキシゲナーゼの効果を示すために用いる。pOHPPジオキシゲナーゼの構成的過剰発現を両方の植物系統で、CaMV３５ＳプロモーターとHPP1.5cDNAを用いて行うであろう。種々の植物組織におけるトコフェロール、プラストキノンおよびカロチノイドのレベルと特性への、発現量が変化したことの影響は以下に説明するように測定するであろう。トマトでは、組織特異的pOHPPジオキシゲナーゼ（pHPP1.5）の過剰発現は、トマト果実の発達期に特異的に発現し成熟期には発現しない、トマトβサブユニット遺伝子に由来する果実特異的プロモーターによって行うであろう。このことは、トコフェロール、プラストキノン、およびカロチノイドのレベルを他の植物組織におけるそれらの産生に影響を与えることなく、栄養的目的のために果実の発達期および成熟期に特異的に改変する可能性を定めるものであろう。これらの実験を組み合わせて、pOHPPジオキシゲナーゼがクロロプラスト性ホモゲンチジン酸由来キノン合成の律速段階であるかどうか、およびクロロプラスト性ホモゲンチジン酸由来キノン（トコフェロールおよびプラストキノン）およびその合成にキノンを要求する化合物（カロチノイド、その他）をpOHPPジオキシゲナーゼ活性を増大させることにより、操作できる可能性が決定されるであろう。複数の独立な形質転換体を各々の構築および使用する植物種に対して作るであろう。各々の系統中の各キメラ遺伝子の組込みと遺伝子コピー数は、サザン解析、ノーザンブロット解析により決定されるpOHPP mRNAレベル、Schulzら、FEBS31 8:162-166，1993に記載されたようにして決定されるpOHPPジオキシゲナーゼ活性、および解析される、関心のある個々のクロロプラスト構成成分（トコフェロール、プラストキノンおよびカロチノイド）への影響によって確認するであろう。構成的に発現する構築物を含む緑色組織では、この解析は形質転換体を土壌に置いた後、比較的早く行うことができる。果実特異的構築系統の解析は果実が実ってくるのにより長い時間が必要であろう。トコフェロール、プラストキノンおよびカロチノイドの分析は、Norrisら(1995、印刷中)に記載されるようにHPLC、光学および質量スペクトルの組み合わせによるであろう。トコフェロールレベルの分析はHPLCおよび必要な場合は選択したイオンモードのＧＣ：質量分光器によって行う。MS解析において、トコフェロールの絶対レベルを、抽出の開始時に添加した既知の「重い炭素(heavy carbon)」トコフェロール標準品の同位体希釈によって定量するであろう。組織の生重量に基づく測定も行うことができる。プラストキノンレベルをNorrisら(1995、印刷中)に記載されたようにＣ８ HPLC および光学スペクトルによって定量化するであろう。全カロチノイドレベルを分光測光法的に決定し、個々のカロチンレベルをＣ18 HPLCで定量化し、光学スペクトルは標準に対して数値化する。これらの実験の過程で、われわれは子孫において１個の遺伝子座として分離する単一の挿入をもつ、強く発現している系統を同定するであろう。これは、この遺伝子の遺伝と後代における表現型の解析を容易にするであろう。 in vitro 除草剤解析のためのpOHPPの過剰発現 pOHPPジオキシゲナーゼを大腸菌または他の原核生物または真核生物のタンパク質産生系で過剰発現させ大量に精製し、新規な除草剤化合物（pOHPP阻害剤）を同定し、詳細な動態解析を通して、そこに現れる化学作用を最適化するための酵素アッセイに用いるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ノーリススーザンアールアメリカ合衆国アリゾナ州 85705 ツーソンイーストリンバーロストロード 555 アパートメント＃2012

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的に純粋なDNAサンプルであって、植物p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの発現についてコードするDNA配列を含むDNA。２．請求項１に記載のDNA配列を含むベクター。３．請求項２に記載のベクターにより形質転換された微生物宿主。４．p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼがシロイヌナズナ由来である、請求項１に記載のDNA。５．請求項１に記載のDNAを含むDNA構築物で形質転換されたトランスジェニックトマト植物体。６．請求項１に記載のDNAを含むDNA構築物で形質転換されたトランスジェニックシロイヌナズナ植物体。７．DNAが配列番号１の配列である、請求項１に記載の生物学的に純粋なDNA。８．植物遺伝子発現DNA構築物であって、ａ．植物p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの発現についてコードするDNA配列とｂ．前記DNAコーディング配列の5'に位置する、植物細胞において有効なプロモーターと、ｃ．植物細胞で有効な3'終結配列を含む構築物。９．DNA構築物であって、ａ．トマト植物体中で、下流のコーディング配列を発現させることのできるプロモーターと、ｂ．植物起源のp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの発現についてコードするDNA配列と、ｃ．3'終結配列を含み、トマト植物体に形質転換されたときにp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ遺伝子を発現させることができる構築物。１０．請求項９に記載の構築物を含むバクテリア。１１．請求項９に記載の構築物を含むトマト植物細胞。１２．請求項９に記載の構築物を含むシロイヌナズナ植物細胞。１３．5'から3'方向に、トマト中で有効なプロモーター、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼをコードするDNAコーディング領域、および転写終結配列を含む外来遺伝子構築物をゲノム中に含むトランスジェニックトマト植物体であって、前記遺伝子構築物がトマト植物中in vivoで有効にp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの発現を刺激する、トランスジェニックトマト植物体。１４．請求項１３に記載のトマト植物体の種子。１５．請求項１３に記載のトマト植物体の果実。１６．p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼをコードするDNAコーディング領域が配列番号１に記載した配列である、請求項１１に記載のトランスジェニックトマト植物体。１７．植物中におけるビタミンＥおよびプラストキノンの産生を抑制する方法であって、ａ．植物起源のp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼをコードするDNA配列を単離するステップと、ｂ．5'から3'方向に、植物細胞で有効なプロモーター、コーディング配列、および転写終結配列を含む遺伝子構築物であって、コーディング領域が前記DNA配列に由来するものであり、ステップ（ａ）のDNA配列がp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの発現が抑制されるように変えられている、遺伝子構築物を作製するステップと、ｃ．前記遺伝子構築物で植物細胞を形質転換し、それによって前記植物細胞が産生するビタミンＥおよびプラストキノンのレベルが低下するステップを含む方法。