JPH11510044A - タンパク質ｐ５、脳損傷用血清マーカー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 タンパク質Ｐ５は、脳又は血液−脳関門の損傷に対する血液又は血清マーカーである。本発明は脳又は血液−脳関門の損傷を検出するために、タンパク質Ｐ５のアッセイを利用することを対象としている。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質Ｐ５、脳損傷用血清マーカー 発明の背景 発明の属する分野 本発明は脳損傷、又は血液−脳関門損傷の指標として血液中、又は血清中のタ ンパク質Ｐ５を同定することに関する。本発明はまた血液中、又は血清中のタン パク質Ｐ５の存在、又は量を測定することにより、脳損傷又は血液−脳関門損傷 を診断する方法に関する。従来の技術 脳およびその周囲の液体、脊髄液は血液−脳関門（blood-brain barrier）と 呼ばれる関門により、血液区分から分離される。血液と髄液との間の輸送は、特 殊な血液−脳関門を創り出す、血漿と脳との間の基底膜の中の特殊な強い結合に よって、主に制限されると考えられる。 髄膜、又は脳の疾病において、この血液−脳関門は崩壊し、タンパク質が血液 から髄液中に漏洩し得る。その逆が真であるかどうかということ、すなわち脳又 は髄液特殊タンパク質が同様に血液中に漏洩するかどうかということは明らかで はない。もし、そうであるならば、通常、脳又は髄液の中だけに見いだされるタ ンパク質に対して、高度に特異的なモノクローナル抗体を使用することにより、 脳又は髄膜の疾病の血液検査をすることが可能である。 Harrington等（１９９３年）、およびその他の者は、髄液タンパク質の二次元 電気泳動ゲル上に豊富なタンパク質である、タンパク質Ｐ５と呼ばれる髄液タン パク質を記載している。Ｐ５は脳および髄液に対して、特異的と思われるβ−痕 跡(β-trace)タンパク質である。 Harrington等は、精製方法、Ｐ５フラグメントの配列、Ｐ５配列から誘導され た合成ペプチドに対するポリクローナル抗体の生成、および生成されたポリクロ ーナル抗体による多数の気管、および体液の研究について記載している。抗体は 特異的ではなく、抗体と反応するが異なる等電点および分子量を持つ他の８種類 のタンパク質が検出された。多数の気管および体液の研究により、Ｐ５は髄液お よび脳の中だけに見いだされることが分かった。 Ｐ５がその１つであると考えられる一群のβ−痕跡タンパク質の機能、および 詳しい構造は完全には分かっていない。。β−痕跡タンパク質が他の組織から得 られないことは高度の組織特異性を示している。このように目立った中枢神経系 タンパク質は局在化された機能を反映するものである。Ｐ５は細胞接着分子のよ うな神経生物学的細胞表面作用体に包含させることができると提案された。この タンパク質のアミノ酸配列は、中間フィラメントラミンタンパク質(Fisher等、 １９８６年)、細胞−細胞接着分子、カドヘドリン(Hatta等、１９８８年)および コンタクチン(RanschtおよびDours、１９８８年)と類似した５つの配列フラグメ ントの短い区域を持っている。従って、細胞接着、又はある種の類似した構造、 又は生物化学的機能がＰ５に対して提案された。これまでの報告は、β−痕跡タ ンパク質がプロスタグランジンＤシンセターゼと同様なペプチドであることを示 している(Zuhn等、１９９３年)。本発明者はこのタンパク質の配列を決め、Ｐ５ がプロスタグランジンＤシンセターゼと同一のものであることを確認した。 このタンパク質の存在、又は不存在も神経系の種々の疾病において研究された 。患者からの脳脊髄液中のＰ５のアッセイ（検定）結果は矛盾するか又は否定的 であった。神経系疾病の患者は一貫性がないか、又は正常なＣＦからの変化を示 さなかった(LinkおよびOlsson、１９７２年)。クロイツフェルド−ヤコブ病の或 る患者では、髄液の二次元ゲル電気泳動において或る種の異常性が見られる。し かしながら、今日までタンパク質Ｐ５は特別な状態、又は疾病の表われとして確 認されていない。発明の概要 本発明者は、Ｐ５の血液中の存在、又はその量が髄膜炎、卒中（stroke）およ びその他の脳又は血液−脳関門損傷の指標であることを見いだした。本発明者は 、血液中、又は血清中のＰ５の存在を測定するアッセイ法を考案した。このアッ セイ法にはＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイ（免疫測定）、一次元および二次 元 ゲル電気泳動、および一次元および二次元ゲル電気泳動−免疫染色ブロットが包 含される。最も好ましい試験は血液、又は血清のＥＬＩＳＡのようなイムノアッ セイ、又は完全な天然（native）Ｐ５ペプチドに対するモノクローナル抗体を使 用するイムノＰＣＲ（免疫ＰＣＲ）法である。 図面の簡単な説明 図面の髄液の二次元電気泳動ゲルを示す。ペプチドＰ５のイソ型の一つの場所 が印されている。 好ましい実施の形態 実施例１：タンパク質の単離 タンパク質Ｐ５は髄液中に多量に存在する。この糖タンパク質は１８，０００ 〜２４，０００ダルトンの分子量範囲を持っている。このタンパク質はその微小 不均一性のために数個の等電点を示す。このタンパク質は、種々の方法で髄液か ら単離することができる。 ある一つの方法において、健康な志願者から得た髄液は臭化シアンを介して結 合されたプール血清タンパク質に対する抗血清を用いたセファロースカラム上を 通過させることにより、アフィニティー精製される(Pharmacia,170430-01)。カ ラムに結合しなかったＰ５富化髄液は次いで限外濾過により濃縮することができ 、濾液は二次元（２Ｄ）電気泳動ゲル上に流される。好ましいゲルは２Ｄ固定化 ｐＨ勾配ゲル（ＩＰＧ）である。Ｐ５スポットが同定され、相当する区分がゲル から切断され、ペプチドが溶離される。 別法では、アフィニティークロマトグラフィーから得たＰ５富化フラクション を第２アフィニティーカラム上に通すが、この第２カラムはタンパク質Ｐ５に対 するポリクローナル、又はモノクローナル抗体の結合されたセファロースカラム である。 タンパク質精製の当業者にとって、公知のその他の精製方法も使用できる。 ペプチドは組換え技術、又は化学合成によっても作ることができる。好ましい 実施態様において、Ｐ５はE．coliで表されるＰ５のｃＤＮＡ遺伝子を使用する 従来の遺伝子エンジニアリング技術を用いることによって生成される。ｃＤＮＡ はNagata等、１９９１年に教示されている。異型遺伝子を発現させるための種々 の系は当業者にとって周知のことである。組換えタンパク質に添加されたポリヒ スチジン尾部は組み換えＰ５を効果的に精製する手段を提供する。実施例２：タンパク質の特性化 二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によってポリビニリデン ジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Towbin等、１９７９年；Matsudaira，１９８７ 年；Eckerskorn等、１９８８年；およびEckerskorn等、１９９０年）上に分離さ れたタンパク質のブロッティングは複合生物学的サンプルからのタンパク質の同 定および特性化を可能にした。タンパク質の移送は真空、毛細管又は電場のよう ないくつかの手段を用いて行うことができる。エレクトロブロッティングは垂直 緩衝液タンク、又は半乾式ブロッティングを利用する、もっとも普及した技術で ある。両技術はTowbin、又は３−［シクロヘキサミノール］−１−プロパンスル ホン酸（ＣＡＰＳ）トランスファー緩衝液を、転移後タンパク質の特徴付けにお ける最小グリシン汚染の必要に応じて、利用することができる。これらの２つの 緩衝系を以下に述べる。 手袋は着用しなければならず、すべての濾紙はトランスファー緩衝液中で３分 間３回洗浄すべきである。タンパク質又はアミノ酸の汚染を避けるためにこれら の２工程が重要である。 １．Towbin 緩衝液系 （ａ）二次元電気泳動後にゲルを脱イオン水中に３分間浸漬する。 （ｂ）トリス（１３ｍＭ）、グリシン（１００ｍＭ）およびメタノール（１０ ％ｖ／ｖ）を含有する溶液中でゲルを３分間平衡に保つ。同時にＰＶＤＦ膜をメ タノール中で１分間湿潤させ、トリス（１３ｍＭ）、グリシン（１００ｍＭ）お よびメタノール（１０％ｖ／ｖ）を含有する溶液中で３分間平衡に保つ。 （ｃ）ｉ．トリス（１３ｍＭ）、グリシン（１００ｍＭ）およびメタノール（ １０％ｖ／ｖ）を含有する溶液を入れたトランスファータンク内で９０Ｖの一定 電圧で１５℃で３時間エレクトロブロッティングを行う。ブロッティンクサン ドイッチを組み立てる。又は、 ｉｉ．１０ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１１およびメタノール（２０％ｖ／ｖ陽 極側；５％ｖ／ｖ陰極側）を入れた半乾式装置内で１ｍＡ／ｃｍ²の一定電流で １５℃で３時間、又はメーカーにより示されたようにしてエレクトロブロッティ ングを行う。 ２．ＣＡＰＳ緩衝液系 （ａ）二次元電気泳動後にゲルを脱イオン水中に３分間浸漬する。 （ｂ）１０ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１１を含有する溶液中でゲルを３０分間平衡に 保つ。同時にＰＶＤＦ膜をメタノール中で１分間湿潤させ、１０ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１１およびメタノール（１０％ｖ／ｖ）を含有する溶液中でまた３０分間平 衡に保つ。 （ｃ）ｉ．１０ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１１およびメタノール（１０％ｖ／ｖ）を 含有する溶液を入れたトランスファータンク内で９０Ｖの一定電圧で１５℃で３ 時間エレクトロブロッティングを行う。ブロッティンクサンドイッチを組み立て る。又は、 ｉｉ．１０ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１１およびメタノール（２０％ｖ／ｖ陽 極側；５％ｖ／ｖ陰極側）を含有する溶液を入れた半乾式装置内で１ｍＡ／ｃｍ² の一定電流で１５℃で３時間、又はメーカーにより示されたようにしてエレク トロブロッティングを行う。 ２−Ｄ ＰＡＧＥおよびＰＶＤＦ膜上へのエレクトロブロッティングはタンパ ク質の特性化のために広く用いられた技術となっている。より大きなタンパク質 負荷、およびより良いトランスファー収率の得られる改良も、正確なタンパク質 ミクロシークエンシングおよびアミノ酸組成分析を援助している。しかしながら 、これらの技術のタンパク質への応用は相補的検出法の開発なしでは不可能であ ったと思われる。アミドブラック、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０、 コロイド金、およびポンソー(Ponceau)ＳはＰＶＤＦ膜上でタンパク質を可視化 するために普通に使用されており（下記参照）、確実なタンパク同定化学と両立 するものである(Sanchez等、１９９２年)。しかしながら、アミドブラック染色 の 利用は膜をＡＡ分析に使用するときに好ましいものである。 ＰＶＤＶ膜のためのタンパク質染色 １．アミドブラック （ａ）エレクトロトランスファー後に、アミドブラック（０．５％ｗ／ｖ）、イ ソプロパノール（２５％ｖ／ｖ）および酢酸（１０％ｖ／ｖ）を含有する溶液中 でＰＶＤＦ膜を１分間染色する。 （ｂ）振盪機上で脱イオン水中に数回浸漬することにより脱染色する。 ２．クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０ （ａ）エレクトロトランスファー後に、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５ ０（０．１％ｗ／ｖ）、メタノール（５０％ｖ／ｖ）を含有する溶液中でＰＶＤ Ｆ膜を１５分間染色する。 （ｂ）メタノール（４０％ｖ／ｖ）および酢酸（１０％ｖ／ｖ）を含有する溶液 中で脱染色する。 ３．コロイド金(Progold) （ａ）エレクトロトランスファー後に、Ｔｗｅｅｎ２０（０．５％ｖ／ｖ）を用 いたホスフェート緩衝化塩水（ＰＢＳ）中でＰＶＤＦ膜を３０分間インキュベー ションする。 （ｂ）ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．５％ｖ／ｖ）中で５分間３回および脱イオ ン水中で１分間洗浄する。 （ｃ）Ｐｒｏｇｏｌｄ（商標名）又はＡｕｒｏｄｙｅ（商標名）のようなコロイ ド金を含有する溶液１００ｍｌ中で膜を室温で１晩染色する。 ４．ポンソーＳ （ａ）エレクトロトランスファー後に、ポンソー（０．２％ｗ／ｖ）、ＴＣＡ（ ３０％ｖ／ｖ）を含有する溶液中でＰＶＤＦ膜を染色する。 （ｂ）脱イオン水中に数回浸漬することにより脱染色する。乾燥および走査 染色したＰＶＤＦ膜を厚さ３ｍｍのガラス板上で３７℃で１０分間乾燥する。 次いでこの膜をレーザーデンシトメーター上で走査し、Ｍｅｌａｎｉｅ ＩＩの ような像分析ソフトウエアによって分析する。エドマン分解同定法 Ｎ−末端タンパク質配列を生成する自動化エドマン分解は、ＰＶＤＦ結合膜の 普通の同定方法である（Matsudaira、１９８７年）。シーケンシングは通常１５ サイクルで行われ、得られた配列をタンパク質データベースのものと対応させる ことにより同定が行われる。内部タンパク質シーケンシングも可能であるが、こ れはより労働集約型の操作である。 本発明者は上記の方法によりＰ５タンパク質の配列を決め、Ｐ５がプロスタグ ランジンＤシンセターゼと同一のものであることを確認した。実施例３：抗体の調製 次に、実施例１で得たタンパク質を用いて、タンパク質Ｐ５に対して高い特異 性のあるモノクローナル抗体を調製する（Ｐ５ペプチドのフラグメントも免疫原 として使用できる）。フラグメントを使用するときには、免疫応答を増大させる ためにフラグメントを免疫源に接合することが必要である。 モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌａｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年） の技術のような当業者に周知の技術によって調製することができる。好ましい実 施態様においてモノクローナル抗体はマウスモデル中で産生される。初代培養は 常法により、すなわち市販の細胞ソーターを使用するか、又は希釈を制限するこ とによりクローン化される。 こうして得たクローンを次に試験して、該クローンの産生した抗体がタンパク 質Ｐ５と反応するが、他の髄液又は血液タンパク質とは反応しないことを調べる 。得られた細胞株（セルライン）も試験して、生産された抗体がタンパク質の同 じエピトープに結合するかどうか、また異なるエピトープに結合するかどうかを 調べる。選択的エピトープを結合する特異的モノクローナルをスクリーンしてＰ ５脳特異的グリコシル化又は転写後修飾を同定する。実施例４：イムノアッセイ 実施例３で発生したハイブリドーマ細胞株から得たモノクローナル抗体をイム ノアッセイに使用して血液又は血清中のタンパク質Ｐ５の存在又はその量を測定 する。 公知のすべてのイムノアッセイがこの方法に使用するのに適している。これら のアッセイは競合アッセイ、サンドイッチアッセイであり、その標識はラジオイ ムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光又は化学発光イムノアッセイの ような公知の標識群から、又は更に感度を高めるためのイムノ−ＰＣＲ法から選 択される。イムノ−ＰＣＲはＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ等（１９９５年）に教示さ れている。本発明の特に好ましい態様はＥＬＩＳＡである。このようなアッセイ において、患者の体液、好ましくは血液、又は血清を試験してＰ５タンパク質の 存在、又はその量を測定する。髄液以外の体液、例えば血清又は血漿中のＰ５タ ンパクの存在は、患者がある種の脳又は血液−脳関門の損傷、例えば発作に罹っ ていることの指標と考えられる。 いくつかの例において、体液試料を一次元又は二次元ゲル電気泳動にかけ、次 に標準タンパク質染色を行うか、又は本発明の抗体の一つで免疫染色を行うのが 好ましい。ペプチドは公知のＰ５ペプチドとその移動度を比較することによって 同定される。 ＣＳＦからのＰ５の一部を血液、又は血清試料に添加し、２Ｄ電気泳動ゲル上 に流して参照ゲルを作成すると、このゲルは血液および血清タンパク質と比較し たＰ５の位置を示す。 本発明による髄膜疾病の血液検査は、脳、血液−脳関門又は髄膜の疾病に有用 な最初の血液検査であるという点で驚くべきものである。本発明で用いるＥＬＩ ＳＡのようなアッセイ、又は凝集試験は迅速に行われ、脳、血液−脳関門又は髄 膜の損傷にかかっていると思われる患者の看護に多くの必要なデータを提供する ことができる。 参考文献 以下の刊行物を参考文献としてここに取り込む。 Eckerskorn,C.，Jungblut，P.，Mewes，W.，Klose，J．およびLottspeich，F. (1998).電気泳動、9.830-838． Eckerskorn，C.およびLottspeich，F.(1990),電気泳動、11,554-561． Fisher 等、Proc．Natl．Acad．Sci．83:6450-6454(1986) Harrington 等、応用および理論電気泳動、3：229−234（1993）。 Hatta等、J.Cell Biol．106:873-881(1988) Hendrickson等、核酸研究、23(3):552-529(1995) KohlerおよびMilstein，Nature 256:495-497(1975) Link & Olsson，Acta．Neurol.，Scand 43:7-136,(1972) Matsudaira，P．(1987)．J.Biol．Chem.，262，10035-10038 Nagata等、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.,88:4020-4024(1991) Ranscht および Dours，J ．Cell Biol．107:1561-1573,(1988) Sanchez，J.-C.，Ravier，F.，Pasquali，C.，Frutiger，S.，Paquet，N.，Bj ellqvist，B.，Hochstrasser，D.F．および Hughes，F.J.(1992)．電気泳動 13, 715-717 Towbin，H.，Staehelin，T．および Gordon，J．(1979)．Proc．Natl．Acad． Sci．USA，76，4350-4354． Zahn 等 Journal of Neurochemistry，61(2):451-456,(1993)

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 27/447 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 33/53 33/577 Ｂ 33/573 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｈ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．脳又は血液−脳関門の損傷を、血液又は血清試料から診断することにおける タンパク質Ｐ５又はその抗体の使用。 ２．ａ）脳又は血液−脳関門に損傷を受けていると思われる患者の血液又は血清 のアッセイを行い、 ｂ）Ｐ５の存在又はその量を測定し、 ｃ）Ｐ５の存在又はその量を脳又は血液−関門に対する損傷の発生と関連づけ ることを含む脳又は血液−脳関門に対する損傷の検出方法。 ３．イムノアッセイである第２項に記載の方法。 ４．イムノアッセイがＥＬＩＳＡである第３項に記載の方法。 ５．イムノアッセイが凝集アッセイである第３項に記載の方法。 ６．アッセイが、血液又は血清試料の一次元又は二次元ゲル電気泳動を行い、そ れによってＰ５を分離し、Ｐ５をそれの抗体を用いてイムノブロッティングし、 このイムノブロットを検出することを含む第３項に記載の方法。 ７．イムノアッセイがイムノポリメラーゼ連鎖反応アッセイである第３項に記載 の方法。 ８．特異的にＰ５と結合し、髄液又は血液のその他のタンパク質と交差反応しな いモノクローナル抗体。 ９．特異的にＰ５と結合し、髄液又は血液のその他のタンパク質と交差反応しな いモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株。