JPH11509411A

JPH11509411A - 樹状細胞のインビトロ増殖のための方法、三次元マトリクス中にエントラップされたその細胞を含む組成物、および免疫のための使用

Info

Publication number: JPH11509411A
Application number: JP9506009A
Authority: JP
Inventors: ビフウォースペシュワ，マドハスダン; スクーテン，ウィレムキャスパーバン
Original assignee: デンドレオンコーポレイション
Priority date: 1995-07-12
Filing date: 1996-07-12
Publication date: 1999-08-24
Also published as: WO1997003186A2; CA2226490A1; AU6457696A; EP0837926A2; AU701943B2; WO1997003186A3; US6121044A

Abstract

(57)【要約】強力な抗原提示細胞を富化された血球画分を得る方法を開示する。この方法は、単球を除去されたリンパ球画分を得る工程、無血清培地で細胞画分を、樹状細胞の形態を有する細胞への樹状細胞前駆細胞の形態学的な変化を生じさせるのに十分な期間培養する工程、この培養する工程で産生された非接着細胞を採集する工程、および採集された細胞中の樹状細胞の一部を密度遠心分離により富化する工程を含む。PAP活性を富化された細胞をコラーゲンマトリックス中に含むPAP細胞組成物をまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】樹状細胞のインビトロ増殖のための方法、三次元マトリクス中にエントラップされたその細胞を含む組成物、および免疫のための使用発明の分野本発明は強力な抗原提示(PAP)細胞に関する。そして本発明は、特に、PAP細胞を調製する方法、ただ１つの対立遺伝子に適合する同種異質遺伝子型PAP細胞を使用してＴ細胞を活性化する方法、および三次元マトリクス中にエントラップされたPAP細胞を含む組成物に関する。参考文献 Ausubel,F.M.，ら ,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley and Sons,Inc.,Media PA. Borrow,P.，ら ,J.Virol 69:1059-1070(1995). Braciale，ら ,Immunol.Rev.98:95-114 Brendel,M.D.，ら ,Cell Transpl.3:427-435(1994). Chao,S-H.，ら ,Cell Transpl.1:51-60(1992). Chchimi,J.，ら ,In:Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Im munology.Kamperdijk(ed)．New York:Plenum Press,pp.521-526(1993). Eales,L.-J.，ら ,Clin.Exp.Immunol.71:423-427(1988). Elovaara,I.，ら ,J.Exp.Med.177:1567-1573(1993). Gabrilovich,D.I.，ら ,Proceedings of the Amer.Soc.of Clin.Oncol.( 15 March,1996). Grabbe,S.，ら .,Immunol.Today 16:117-121(1995). Guery,J.-C.，ら ,J.Immunol.154:536-544(1995). Hsu,F.J.，ら ,Nature Med.2:52-58(1996). Hu,X.，ら ,Cancer Res.56:2479-2483(1996). Kabel,P.J.，ら ,Immunobiology 179:395-41(1989). 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Zweerink,H.J.，ら ,J.Immunol.150:1763-1771(1993).発明の背景文献レポートは、異なる研究者が、抗原提示細胞(APC)の単離およびインビトロ作製のために、多様で骨の折れる集約的な技術を用いることを示す。種々のタイプのAPCおよびそれらを単離しそしてインビトロ培養物においてそれらを活性化するためのプロトコルが存在するだけでなく、所定のAPCタイプ内で単離および活性化の手順に関する変形がまた存在する。このことは、特に効果的なAPCであり得る樹状細胞(DC)に関して特に正しい。 DCは、例えば、密度をベースにする多工程の単離、モノクローナル抗体パニングおよび血清補充培養を組み入れた種々の方法論を使用して、単離および精製されている(Macatoniaら、1991；MarkowiczおよびEngleman、1990；YoungおよびSt einman，1987)。しかし、報告されたすべての単離手順は、ヒツジ赤血球および/ またはウシ胎児血清のいずれかを用いる。これらは共に、精製されたDCの使用( 例えば、選択された免疫原でＴ細胞を刺激するため)を妨げ得る潜在的な免疫原性外来抗原および/または免疫原を含む。さらに、種々の先行技術の方法により精製されたDCの特徴には顕著な差異(例えば、細胞表面マーカー発現の差異)が存在するようである。これらの差異を考慮して、少なくとも３つのサブタイプのDC が存在することが提案されている(Grabbeら、1995；ThomasおよびLipsky、1994) 。各サブタイプは、その抗原提示能力に関して異なる特性および特徴を有し得る。発明の要旨本発明は、１つの局面において、ヒト血液サンプルから、(i)表面抗原HLA-DR( ヒト白血球抗原DR遺伝子)に関してポジティブであり、そして表面抗原CD3、CD4 、CD8、CD14、CD16、およびCD20に関してネガティブである表現型、ならびに(ii )ヒトリンパ球と共培養した場合、一次および二次の免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられる強力な抗原提示(PAP)細胞を得るための方法を包含する。この方法は、血液サンプルから、末梢血リンパ球および樹状前駆細胞を含む、単球を除去された画分を得る工程を包含する。この画分は、無血清培地中で、樹状前駆細胞において樹状細胞の形態を有する細胞への形態学的変化を生じるために十分な期間培養される。非接着細胞が採集され、そして採集された細胞が密度遠心分離によってPAP細胞について富化される。末梢血リンパ球および樹状前駆細胞に富む画分は、好ましくは、(i)最初に、密度遠心分離により血液サンプルに末梢血単核細胞を富化させる工程、および(i i)密度遠心分離により(i)の生成物にリンパ球および樹状前駆細胞を富化させる工程によって得られる。工程(ii)の富化工程は、好ましくは、(i)の生成物を、1 .0650±0.0010g/mLの密度および300±15mOsmの浸透圧モル濃度を有する分離媒体上に重層することによって実行される。次いで、細胞は無血清培地中で培養される。培養工程は、樹状前駆細胞が、樹状細胞への所望の形態学的変化を受けるまで、好ましくは少なくとも約24時間実行される。 PAP前駆細胞を含む細胞を培養するための例示的な無血清培地には、ダルベッコ改変最少必須培地(DMEM)：F-12(1:1)、AIM-V、マクロファージ無血清培地、栄養素補充AIM-Vまたは富化単球SFM(例えば、Gibco/BRL Life Technologies(Gaith ersburg，MD)から入手可能)が含まれる。培養に続いて、非接着細胞が採集され、そしてPAP細胞は密度遠心分離によって富化される。最終富化工程は、好ましくは、培養された細胞を、(i)1.0550±0 .0010g/mLの密度および290±10mOsmの浸透圧モル濃度、または(ii)1.0800±0.00 10g/mLの密度および540±25mOsmの浸透圧モル濃度のいずれかを有する分離媒体上に重層することによって実行される。強力な抗原提示活性は界面の細胞から得られる。この方法は、富化工程後に、PAPを富化させた画分中の細胞を、CD4、CD8、CD1 4、CD3、CD16、およびCD20からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面表現型マーカーに対する抗体を結合した固相と接触させる工程、およびこの固相に結合する、画分中の細胞を取り除く工程をさらに包含し得る。この最終工程の後、樹状細胞は細胞画分の50％以上を構成し得る。この方法は、富化させた画分中のPAP細胞を、三次元マトリクス(例えば、コラーゲン−ファイバーマトリクス)中にエントラップして、培養物中のPAP細胞の分化状態および抗原提示能力を延長された培養期間中保持する工程をさらに包含し得る。本発明はまた、選択された抗原または免疫原に特異的な活性化されたＴ細胞を調製する方法を包含する。この方法は、Ｔ細胞を、抗原または免疫原でパルスされた同種PAP細胞とともにインキュベートする工程を包含する。この方法において使用されるPAP細胞は、(i)表面抗原HLA DRに関してポジティブであり、そして表面抗原CD3、CD14、CD16、およびCD20に関してネガティブである表現型、ならびに(ii)培養物中でヒトリンパ球と共培養した場合、一次および二次の免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられ、そして上記Ｔ細胞に関して、少なくとも１つのHLAクラスＩまたはクラスII対立遺伝子に適合する。これらは、ただ１つの対立遺伝子、すべての対立遺伝子、または両者の任意の組合せに適合し得、例えば、ただ１つの対立遺伝子について不適合である。Ｔ細胞は、例えば、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、CD4⁺Ｔ細胞またはCD8⁺T細胞であり得る。関連する局面において、本発明は、既知の腫瘍特異的または病原体特異的な抗原または免疫原を有する腫瘍または病原体に対して被験体を免疫する方法を包含する。この方法は、(Ａ)同種PAP細胞を、選択された抗原または免疫原でパルスする工程、および(Ｂ)被験体のリンパ球を、パルスしたPAP細胞に曝す工程を包含する。このPAP細胞は、(i)表面抗原HLA DRに関してポジティブであり、そして表面抗原CD3、CD14、CD16、およびCD20に関してネガティブである表現型、ならびに(ii)培養物中でヒトリンパ球と共培養した場合、一次および二次の免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられ、そして上記リンパ球に関して、少なくとも１つのHLAクラスＩまたはクラスII対立遺伝子に適合する。曝露工程は、例えば、パルスしたPAP細胞を被験体に注射することによって、または細胞傷害性Ｔリンパ球を被験体から取り出すこと、パルスしたPAP細胞とそのリンパ球をエクスビボで接触させること、およびその接触させたリンパ球を上記被験体の血流に戻すことによって達成され得る。別の局面において、本発明は、コラーゲン−ファイバーマトリクスによって例示されるような三次元マトリクス中にエントラップされた上記タイプの強力な抗原提示(PAP)細胞を含む細胞組成物を包含する。関連する局面において、本発明は、被験体を、既知の腫瘍特異的、組織特異的または病原体特異的な抗原または免疫原を有する腫瘍または病原体に対してワクチン接種する方法を包含する。この方法は、被験体から、上記のタイプの強力な抗原提示(PAP)について富化させた血球画分を単離する工程、PAP細胞を三次元の生体適合性マトリクスにエントラップする工程、マトリクスにエントラップされたPAP細胞を、選択された腫瘍特異的、組織特異的または病原体特異的な抗原または免疫原内に含まれるいずれかのHLA結合ペプチドで処理する工程、および上記被験体の細胞傷害性Ｔ細胞を上記マトリクスに曝す工程を包含する。曝露工程は、細胞を含有するマトリクスを被験体に注射すること、または、細胞傷害性Ｔリンパ球を患者から取り出すこと、そのリンパ球をマトリクスとインビトロで接触させること、およびその接触させたリンパ球を上記患者の血流に戻すことを包含し得る。病原体特異的抗原の例は、ウイルス、細菌、寄生物、真菌、微生物、およびそれらの部分(例えば、特異的免疫原性タンパク質(例えば、表面タンパク質、表面および内部構造タンパク質、ならびにそれらの免疫原性タンパク質、例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)env、HIV gag、HIV nef HIV pol、HIV rev、HIV tat、 HIV rev、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ(HTLV-1)taxおよびインフルエンザマトリクスタンパク質(IMP)；特にペプチドHIV Pol 464-472 Pep(配列番号３)およびペプチドHTLV-1 Tax 11-19 Pep(配列番号１)))を含むが、これらに限定されない。腫瘍または腫瘍関連抗原(すなわち、ガン細胞によって選択的に発現される抗原)の例は、p53、ガン胎児性抗原(CEA)、HER2、MART-1、p21RASおよびそれらの部分(MART-1ペプチド(配列番号２)を含む)を含むが、これらに限定されない。新生物性の形質転換された組織においてアップレギュレートされる組織特異的抗原 (すなわち、組織または細胞タイプが形質転換される場合、特異的組織/細胞タイプ上にまたはこれらによって選択的に発現される抗原)の例は、前立腺ガンにおいてアップレギュレートされる前立腺特異的抗原(例えば、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的膜抗原、および前立腺特異的抗原)を含む。本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明を添付の図面とあわせて読むと、より十分に明らかになる。図面の簡単な説明図1Aおよび1Bは、単球を除去された末梢血単核細胞の２日間の培養後、MEP(メトリザマイド等価パーコール)中での密度遠心分離の界面から得られるPAP細胞を富化させた画分中の樹状細胞(DC)の純度を特徴付けるために使用された蛍光活性化細胞選別(FACS)プロフィールである。細胞を、フィコエリスリン(PE)チャンネル上のCD3、CD14、CD16、およびCD20、ならびにフルオレセイン−イソチオシアネート(FITC)チャンネル上のHLA-DRで染色した。DCは、HLA-DRに関してはポジティブに染色されるが、PEチャンネルで使用される細胞表現型指示薬に関してはネガティブである(図1B)。免疫グロブリンG2a(IgG2a)を、FITCおよびPEチャンネルの両方で、イソタイプコントロールとして使用した(図1A)。図2Aおよび2Bは、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ(HTLV-1)tax 11-19ペプチド(配列番号１)を用いてパルスされた自己のDCで刺激されたＴリンパ球(Ｔ細胞)の増殖キネティクスを示す。Ｔ細胞を、続いて、HTLV-1ペプチドでパルスされた自己の単球を用いて１週間ごとに再刺激し、HTLV-1ペプチド特異的CD8⁺細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)を作製した。22.8％のCD8⁺Ｔ細胞を含む14.0×10⁶細胞の接種物を、41日間の培養後、70.7％のCD8⁺Ｔ細胞を含む145.0×10⁶細胞まで拡大した(図2 A)。同様な実験からの増殖キネティクスを図2Bに示す。図3Aおよび3Bは、標準的な４時間の⁵¹Cr遊離アッセイにおいて測定された、HT LV-1ペプチドでパルスされたDCに曝されることによって活性化された培養されたＴリンパ球による、HTLV-1ペプチドでパルスされた標的(JY)細胞およびパルスされていないコントロールのJY細胞の抗原特異的溶解を示す。図3Aは、Ｔ細胞培養の34日目に測定された溶解を示す。図3Bは、Ｔ細胞培養の41日目に測定された溶解を示す。図3Cおよび3Dは、標準的な４時間の⁵¹Cr遊離アッセイにおいて測定された、(i )パルスされていないか、(ii)HTLV-1ペプチド(配列番号１)でパルスされたか、または(ii)HTLV-1ペプチド(配列番号１)でパルスされ、次いでHLAクラスＩ抗原に対して指向される抗体(W6/32)に曝されたかのいずれかのJY(図4A)およびT2(図 4B)標的細胞に対して測定された、培養されたＴリンパ球による抗原特異的溶解を示す。図４は、HTLV-1ペプチドでパルスされたDCを用いてHTLV-1ペプチドに対して活性化されたCTLによる、HTLV-1抗原を内因性に発現する標的細胞の溶解を示す。図５は、示されたマーカーを使用して得られた、培養41日目のＴリンパ球に関するFACSプロフィール(黒塗りヒストグラム)である。それぞれの細胞表面マーカーについてのイソタイプコントロールに関する線ヒストグラムを、FACSプロフィール上に重ねて示す。図6Aおよび6Bは、CD8およびHLA-DR抗体を用いる二重染色のFACSプロフィールであり、これは、ほとんどのCD8⁺Ｔリンパ球が活性化マーカーHLA-DRを発現することを示す(図6B)。IgG1(PEチャンネル)およびIgG2a(FITCチャンネル)をイソタイプコントロールとして使用した(図6A)。図７は、標準的な４時間の⁵¹Cr遊離アッセイにおいて測定された、HIVペプチドでパルスされたDCに曝されることによって活性化された培養されたＴリンパ球による、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)逆転写酵素(RT)Pol 464-472ペプチド(配列番号３)でパルスされた標的(JY)細胞およびパルスされていないコントロールのJY 細胞の抗原特異的溶解を示す。図8A、8Bおよび8Cは、標準的な４時間の⁵¹Cr遊離アッセイにおいて測定された、コラーゲンゲル中に埋め込まれ、HTLV-1 taxペプチドでパルスされたDCに曝されることによって活性化された培養Ｔリンパ球による、HIV RT Pol 464-472ペプチド(配列番号３)でパルスされた標的(JY)細胞およびパルスされていないコントロールのJY細胞の抗原特異的溶解を示す。図9Aおよび9Bは、本発明のPAP細胞を単離する方法の２つの実施態様の概略的なまとめである。図10は、本発明の方法を使用して単離されたPAP細胞による活性化に応答するC TL拡大の１つの実施態様の概略図である。図11Aおよび11Bは、自己(図11A)およびHLAクラスＩが適合するドナーペアからの同種(図11B)のCTLについての、エフェクター対標的の比の関数としてのペプチド特異的溶解のプロットである。図12Aおよび12Bは、自己(図11A)および単一の対立遺伝子が適合するドナーペアからの同種(図11B)のCTLについての、エフェクター対標的の比の関数としてのペプチド特異的溶解のプロットである。図13A、13B、13Cおよび13Dは、CD4⁺リンパ球よりCD8⁺リンパ球の成長を好む条件下での、自己(図13Aおよび13C)および単一の対立遺伝子が適合するドナーペアからの同種異質遺伝子型(図13Bおよび13D)のCTLについての、エフェクター対標的の比の関数としてのペプチド特異的溶解のプロットである。図14は、本発明の方法に従って単離された、GM-CSF動員(mobilized)乳ガンドナー由来のPAP細胞画分のFACS分析を示す。図15は、本発明の方法に従って単離された、健常なG-CSF動員ドナー由来のPAP 細胞画分のFACS分析を示す。図16は、mAbでコートされたビーズを用いる富化の前および後でのDCの数および純度のプロットである。図17A、17Bおよび17Cは、コントロールのPAP細胞(図17A)、INFペプチドでパルスした(図17B)、およびキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)でパルスした (図17C)PAP細胞についての、エフェクター対APC(PAP細胞)の比の関数としてのＴ細胞増殖のプロットである。図18は、W6/32抗体の存在下および非存在下でのコントロール、INFペプチド、不活化インフルエンザウイルス(IIV)およびインフルエンザマトリクスタンパク質(IMP)についての平均Ｔ細胞増殖のプロットである。図19Aおよび19Bは、W6/32抗体の存在下および非存在下でのコントロール、INF ペプチド、IIVおよびIMPについての抗原のみ(図19A)または抗原でパルスされたD C(図19B)のいずれかで刺激されたＴ細胞によるJY細胞のペプチド特異的溶解のプロットである。発明の詳細な説明Ｉ．定義他に指示がなければ、下記の用語は以下の意味を有する：「樹状前駆細胞」または「DPC」は、適切な条件下で樹状細胞に成熟し得る末梢血細胞である。DPCは、代表的には、非樹状形態を有し、そして抗原提示細胞として一次免疫応答を誘発する応答能はない。「樹状細胞」または「DC」は成熟したDPCであり、これはCD3、CD4、CD8、CD14、CD 16、およびCD20の発現についてネガティブであり、HLA-DR(すなわち、クラスIIM HC)の発現についてポジティブある。樹状細胞は、代表的には、樹状細胞形態を有する。すなわち、これらは、インビトロで培養された場合、樹状突起を伸長する大きな、ベール細胞である。「強力な抗原提示(PAP)細胞」は、以下の特徴を有する樹状細胞である：(i)抗原でパルスされた後、PAP細胞は、一次免疫応答において、ナイーブCD8⁺細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)を活性化し得、そして(ii)PAP細胞は、浸透勾配の非存在下で大きな可溶性ポリペプチド抗原でロードされ得、そしてMHCクラスＩ拘束性CD8⁺C TLへの提示のためにこのような抗原をプロセシングし得る。「免疫原」とは、体液性抗体および/または細胞媒介性免疫応答を刺激または誘導し得る物質をいう。「抗原」とは、特異的免疫原により刺激された免疫応答の産物(例えば、抗体、Ｔ細胞レセプター)と反応する物質をいう。従って、抗原は、その応答を引き起こす特異的免疫原(抗原性ペプチド、タンパク質または多糖)および特異的免疫原を含むかまたは発現する存在物(例えば、ウイルス、細菌など)を含む。「病原体抗原」とは、宿主生物(例えば、ヒト)において疾患または疾患状態を誘導する能力を有する微生物に由来する抗原をいう。このような微生物の例は、ウイルス、細菌、寄生物および真菌を含む。「腫瘍抗原」とは、腫瘍関連抗原および腫瘍特異的抗原をいう。腫瘍抗原の例には、p53、ガン胎児性抗原(CEA)、HER2、MART-1およびp21RASが含まれる。「腫瘍関連抗原」とは、特定の腫瘍(例えば、リンパ腫、ガン、肉腫、およびメラノーマ)に連関する抗原をいう。例には、CA-125、CA-19-9およびCA195が含まれる。腫瘍関連抗原には、(i)正常な(形質転換されていない)細胞には存在せず、そして特定の新生物に非常に特異的な抗原、(ii)別の個体由来の関連する新生物に見出される抗原、および(iii)正常細胞および新生物細胞に見出されるが、正常細胞に比較して新生物細胞でアップレギュレートされる抗原が含まれる。腫瘍関連抗原はまた、これらが特異的組織に由来する悪性細胞上またはこれら細胞中にのみ存在する点で、「組織特異的」抗原であり得る。前立腺組織特異的抗原の例には、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的膜抗原、および前立腺特異的抗原が含まれる。「腫瘍特異的抗原」とは、腫瘍細胞に存在するが正常細胞には見出されない抗原をいう。 II．発明の概観本発明は、強力な抗原提示(PAP)細胞の単離、富化、培養ならびに免疫治療的および免疫予防的適用に関する。このPAP細胞は、ナイーブCD8⁺細胞傷害性Ｔリンパ球において一次免疫応答を誘発し得る(すなわち、ナイーブCTLを誘導して抗原特異的CTLに分化し得る)樹状細胞(DC)のクラスである。抗原特異的CD8⁺CTLは、免疫系の最も強力な抗腫瘍および抗ウイルス成分であり、そして腫瘍およびウイルス感染の根絶に関連付けられている(Grabbeら、Gueryら、Borrowら)。具体的には、エクスビボで活性化され拡大された抗原特異的CD8⁺CTLの注入は、サイトメガロウイルス(CMV)感染およびリンパ増殖性疾患において治療的な利益を有することが示されている(Mayordomoら、Rooneyら、Walterら)。 DCは、多くの組織に見出される、形態学的に類似する細胞タイプである(Stein man、1991)。３つのクラスのDCが存在すると考えられるが、それらすべてが同じ前駆細胞に由来するかどうか、また同じ機能を有するかどうかも知られていない。例えば、すべてのDCが、検出可能なCD4⁺Ｔ細胞の非存在下で、ナイーブCD8⁺CT Lを活性化し得るかどうかは知られていない。本発明は、１つの局面において、抗原でパルスされた後の、一次免疫応答において、ナイーブCD8⁺細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)を活性化し得るクラスのDC(すなわち、PAP細胞)を精製する方法を提供する。本発明に従うと、PAP細胞は、好ましくは、末梢血から、単一密度勾配物質から作製された多重密度勾配を使用して得られる。単離手順は２日で終了され得、そして無血清条件下で全体的に実行され得る。本発明以前は、DCの精製は、分離工程において多重密度勾配物質、そして/または分離/培養工程にいて血清を用いた。血清の非存在下で細胞精製を実行し得ることは、高度な利点である。なぜなら、血清は、代表的には、精製の間にPAP細胞によりロードされそしてナイーブＴ細胞に提示され得る異種抗原を含み、選択された抗原に特異的ではないＴ細胞活性化を導き得るからである。富化させた単離画分中のPAP細胞の割合は、例えば、固相抗体をベースにするネガティブ除去を使用して、混入細胞を除去することによってさらに増加し得る。さらに、本明細書中に記載される単離、富化、および培養手順は、閉(closed) デバイス/キット形態で好都合に実施され得る。富化させた画分中に存在するPAP細胞は、ヒトリンパ球とインビトロで共培養された場合、一次および二次の免疫応答をともに誘発し得、そして多くの適用において使用され得る。例えば、これらは、免疫治療組成物としての使用のための、腫瘍特異的および病原体(例えば、ウイルス)特異的抗原由来の主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩ(MHC-I)拘束性ペプチドに対する活性を有する抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)を作製するために使用され得る。本発明の別の局面は、三次元で、多孔性の、生体適合性マトリックス中でPAP 細胞を培養することによるPAP細胞の分化した機能の維持に関する。本明細書中の教示に従うと、このようなマトリクス中で細胞を培養することは、外因性サイトカインの補充の必要を減少させるかまたは排除し、そしてその細胞の分化した状態を少なくとも12日間保持するに効果的である。このような組成物は、例えば、個体を選択された抗原に対して免疫するために使用され得る。 III．PAP 細胞に富む細胞画分Ａ．調製本発明の方法に従うと、PAP細胞に富む画分は、(i)ヒト血液サンプルから、末梢血リンパ球および樹状前駆細胞を含む細胞画分、好ましくは、単球を除去された細胞画分を得ること、(ii)その細胞画分を、無血清培地中で、樹状前駆細胞に樹状細胞の形態を有する細胞への形態学的変化を生じるに十分な期間培養すること、(iii)培養によって生じた非接着細胞を採集すること、および(iv)密度遠心分離により、採集した細胞中の樹状細胞の部分を富化して、PAP細胞に富む画分を得ることによって得られ得る。例示的な方法は、以下に詳述されるように、密度遠心分離により工程(i)を達成するが、このような単球を除去された細胞画分を得るために、他のアプローチが使用され得ることが理解される。例えば、向流水簸遠心分離(Kabelら)が単球を除去するために用いられ得る。１つの一般的な実施態様において、PAP細胞に富む画分は、下記の実施例１に詳述されるように得られる。この手順は、インビトロまたはエクスビボでの培養後の、細胞タイプの密度に基づく分離と分化に誘導される細胞タイプの密度の変化との組み合わせに基づく。DPC含有サンプル、例えば、ヒト末梢血由来のサンプル(例えば、バフィーコート)は、適切な緩衝液(例えば、Ca⁺⁺/Mg⁺⁺を含まないリン酸緩衝化生理食塩水(D-PBS；Gibco/BRL Life Technologies，Grand，Island ,NY))で希釈され、密度勾配物質または分離媒体(好ましくは、約1.0770±0.0010 の密度および約310±15の浸透圧モル濃度を有する)上に重層され、そして遠心分離される。この工程のための例示的な密度勾配物質には、「PERCOLL」(Pharmacia LKB，Uppsala，Sweden)および「LYMPHOPREP」(Nycomed aboratories，Oslo，Norw ay)から作製される、シリカをベースにするFEP(フィコール等価パーコール；下記の材料および方法に記載される)が含まれる。分離は、任意の適切なチューブ、例えば、通常50mLの遠心分離チューブにおいて実施され得る。溶液界面の末梢血単核細胞(PBMC)は、この界面から細胞をピペッティングすることによって採集される。次いで、PBMCは、適切な緩衝液(例えば、D-PBS)中に再懸濁され、そして遠心分離され血小板(これは上清中に残る)を除去される。血小板を除去されたPBMCは、下記の培養工程において直接使用され得るか、または例えば、中間密度遠心分離工程によって、単球を除去するために処理され得るかのいずれかされ得る。血小板を除去されたPBMCが培養工程において直接使用され得るプロトコルは、「２勾配」プロトコルと呼ばれ、一方、血小板を除去されたPBMCが単球を除去する処理に供されるプロトコルは、「３勾配」プロトコルと呼ばれる。３勾配プロトコルにおいて、血小板を除去されたPBMCは、再び、適切な緩衝液、例えば、D-PBSに再懸濁され、密度勾配物質または分離媒体(好ましくは、約1. 0650±0.0010の密度および約300±15の浸透圧モル濃度を有する)上に重層され、そして遠心分離される。この工程のための例示的な密度勾配物質は、下記のように、「PERCOLL」からまた作製される、シリカをベースにするMDP(単球除去パーコール)である。２つの溶液の界面の細胞は主に単球である。一方、ペレット中の細胞は主にリンパ球である。単球(界面)画分は、適切な培養培地、例えば、冷プールした冷ヒトAB血清(これに、等量の80％AB血清20％ジメチルスルホキシド(DM SO)を滴下する)に中に再懸濁され、そして必要になるまで凍結され得る。ペレット細胞は、末梢血リンパ球および樹状前駆細胞(DPC)を含む単球を除去された細胞画分を含む。血小板を除去されたPBMC(２勾配プロトコル)、または単球を除去された細胞画分(３勾配プロトコル)由来の末梢血リンパ球および樹状前駆細胞は採集され、洗浄され(例えば、D-PBSを用いて室温で遠心分離により)、適切な培養培地中に再懸濁され、組織培養フラスコ中に接種され、そして加湿インキュベーター中で少なくとも24時間、好ましくは約40時間培養される。接着または非接着表面のいずれかを有する組織培養フラスコが使用され得る。培養期間は、樹状前駆細胞(DP C)において樹状細胞(DC)の形態および特徴を有する細胞への形態学的変化を生じるに十分に長い。この形態学的変化は、例えば、顕微鏡写真法を使用して検出され得る。DCは、インビトロで培養された場合、代表的には、細胞表面から細胞質の突起を伸張させる、大きなサイズのベール細胞である。この形態学的変化の実際の結果(すなわち、形態学的変化が生じたことの指標)は、細胞がより低い密度になるような細胞の密度のわずかな変化である。この密度の変化の結果として、DCは、例えば、下記のような、約1.0800±0.0010の密度および約540±25の浸透圧モル濃度、あるいは約1.0550±0.0010の密度および約290±15の浸透圧モル濃度を有する密度勾配物質または分離媒体を使用する密度遠心分離後の界面から単離され得る。本発明の方法に従うと、DC単離手順、および特に先の段落に記載される培養工程において使用される培養培地は、好ましくは無血清である。本発明の支持のために実施され、そして本明細書中の実施例１および表２において詳述される実験は、単離手順および培養工程における無血清培地の使用が、最終のDC(およびPAP )を富化させた細胞画分において得られる高い純度のDCを生じることを示す。改善された純度のその後に採集されるDCを生じる無血清培地として、DMEM/F-1 2、富化させた単球SFM、AIM-Vおよび富化させたAIM-Vが挙げられる。これらのすべてが、Gibco/BRL Life Technologies (Gaithersburg，MD)から入手可能である。他の無血清培地もまた、本発明の実施において用いられ得る。例には、ハイブリドーマ無血清培地(Gibco/BRL)、タンパク質非含有ハイブリドーマ培地(Gibco/ BRL)、Iscove改変ダルベッコ培地(IMDM；Sigma)、X-VIVO培地(BioWhittaker，Wa lkersville，MD)、および4CBD培地(Sigma)が含まれる。培養期間後、非接着細胞は、例えば、培養フラスコに定着しているが強固には接着していない細胞を取り除くための培地の穏やかなピペッティングによって採集される。採集された細胞は、洗浄され、そして生理学的食塩水(例えば、D-PBS )、または適切な培養培地(例えば、上記の無血清培養培地のうちの１つ)のいずれかに再懸濁される。得られる細胞懸濁液は、密度勾配物質または分離媒体(好ましくは、約1.0800±0.0010の密度および約540±25の浸透圧モル濃度を有する) 上に重層することによって富化され、そして遠心分離される。この工程のための例示的な密度勾配物質には、「パーコール」から作製される、シリカをベースとするMEP、および約14.5％メトリザマイドまたはナイコデンズ(Nycodenz)が含まれる。 MEPは高浸透性培地である。同様な分離は、同様な分離特徴を生じるように経験的に下方に調整された密度を有する等張培地を使用して達成され得る。密度は等張培地においてより低い。なぜなら、等張培地中の細胞は、それらが高浸透圧モル濃度の培地中で水を失いそして収縮すると同じ様式では水を失わず、そして収縮しない(すなわち、より高密度にはならない)からである。 PAP細胞を富化させた画分を得るために有用な、例示的な等浸圧性密度勾配処方物または分離培地は、IOMEP(等浸透圧モルメトリザマイド等価パーコール)である。IOMEPは、1.0550±0.0010g/mLの密度、290±15mOsmの浸透圧モル濃度、および7.4±0.2のpHを有する。これは、MEPを使用して得られるのと同様なPAP細胞の単離収率および純度を生じる点で、MEPと機能的に等価である。さらに、免疫応答の発生に関して測定される、界面の細胞画分中のPAP細胞の機能は、その細胞がMEP上で単離されたのかまたはIOMEP上で単離されたのかにかかわらず同様である。従って、PAP細胞の単離は、使用する密度勾配の分離特徴に依存する。分離特徴は、次に、使用する勾配物質の物理学的属性、例えば、密度、浸透圧モル濃度およびpHに依存する。これらの特徴(上記のような)の組み合わせを有する任意の分離媒体は、PAP細胞を富化させた細胞画分を得るために有効であることが高く評価される。上記の遠心分離後の界面に存在する画分は、DCおよびPAP細胞が富化されている。この画分中のDC細胞の純度は、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)分析を使用することによって定量され得る。DC(本発明の方法によって精製されたDCを含む)は、代表的には、細胞表現型マーカーCD3(Ｔ細胞)、CD14(単球)、CD16(ナチュラルキラー(NK)細胞)およびCD20(Ｂ細胞)に関してネガティブであり、そしてH LA-DRに関するポジティブ染色(Macatoniaら、1991；MarkowiczおよびEngleman、 1990；YoungおよびSteinman、1987)によって明らかにされるようにHLAクラスII 発現に関してポジティブである。図１は、本発明の３勾配プロトコルを使用して得られるDCを富化させた画分の代表的なFACSプロフィールを示す。このプロフィールにおけるDC純度は約16.0％である。平均で、0.9±0.7×10⁶(平均±sd)個の、15.4±10.1％(平均±sd)の純度を有するDCを、１単位の血液から得た(n=60)。３勾配プロトコル後の混入細胞は、主に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球およびNK細胞(混入の大きさの順)であった。２勾配プロトコル後の混入細胞は、主に、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびNK細胞(混入の大きさの順)であった。さらなる精製が所望される場合、DCおよびPAPを富化させた画分は、さらなる精製工程に供され得る。例えば、DC上には発現されない抗原、例えば、CD3、CD1 4、CD16、および/またはCD20に対する抗体が、固体支持体に固定され、そして混入細胞を除去または「ネガティブに除去」するために使用され得る。このようなさらなる精製は、DCのさらなる富化を生じ、その結果、PAP細胞の顕著な損失なしに、DCはその画分の50％以上の細胞を構成し得る。本発明を支持するために実施されたネガティブ除去実験(例えば、実施例11；図16)は、細胞表面表現型マーカーCD4、CD8、およびCD14に対するモノクローナル抗体を結合したビーズとのMEP界面画分のインキュベーションが、細胞収率の顕著な損失を伴うことなく、さらに約３倍の精製(すなわち、３勾配プロトコルを使用して得られるPAP細胞の約50％の純度)を生じることを示した。抗体をビーズに結合させるため、およびこのような結合させたビーズをネガティブ除去に使用するためのプロトコルは、周知である(例えば、Popeら)。最終画分中のPAP細胞の富化の程度は、例えば、CTL活性化アッセイにおける限界希釈分析を使用して決定され得る。PAPを富化させた画分は抗原でパルスされ( 例えば、材料および方法におけるように)、そしてパルスされた画分の系列希釈物が作製される。次いで、この希釈物は、例えば、実施例２に詳述されるように、Ｔ細胞の拡大を刺激するために使用される。MHCに関連する抗原を発現し、そしてＴ細胞を活性化し得るPAP細胞の相対数は、Ｔ細胞の拡大を生じる最も希釈されたサンプルに基づいて推定され得る。本発明に従うと、本発明の方法により単離されるDCの一部分またはすべてを構成するPAP細胞は、そのPAP細胞が抗原でパルスされた後、CTLによって媒介される一次免疫応答の発生を生じるために有効である。最終画分中のPAP細胞の収率および純度を、単球を除去された細胞画分培養物中に導入された細胞の数(接種細胞濃度)、ならびに培地および血清組成物の関数として評価した。本発明を支持するために実施した実験の結果は、最適なPAP細胞収率および純度は、培養物が、１mLの培養培地あたり約2.0〜10.0×10⁶MDPペレット細胞を接種された場合に得られ得ることを示す。上記の血清補充培地に加えて、種々の無血清培地を、上記および実施例１(下記)のように、DC収率および純度について評価した。これらの実験の結果は、血清の添加が、PAP細胞の収率および純度の両方に対して有害な効果を有することを示唆した。分析した無血清培地のうち２つ、AIM-Vおよびマクロファージ無血清培地(マクロファージ-SFM)において、MEP界面中のPAP細胞の収率および純度は約２倍高かった。これらの結果は、PAP細胞の単離および富化の全体の手順が、無血清条件下で実施され得ることを示す。この発見は、血清が、樹状細胞のインビトロでの成熟について絶対的な要件であることを教示する以前の文献レポート (YoungおよびSteinman、1987；ThomasおよびLipsky、1994；MarkowiczおよびEng leman、1990；Mehta-Damaniら、1994)とは対照的である。上記のように、無血清精製は、血清中に存在し得る選択されていない抗原で不注意にパルスされたかまたはそれによりロードされたPAP細胞を単離するために有利である。さらに、細胞精製における規定された(無血清)培地の使用は、再現性ならびに調節および生成物開発の観点から顕著な利点を有する。 PAP細胞の収率を最適化するために、３勾配プロトコル後のMDP界面に対して失われたPAP始原体細胞の割合を定性的に評価した。PAP細胞の総収率を、最終(例えば、MEP)界面画分中の総細胞数およびその画分中のPAP細胞の純度の評価に基づいて計算した。MDP勾配上でのPBMCの分離を伴って単離されたPAP細胞の収率および純度と、MDP勾配上でのPBMCの分離を伴わずに単離されたPAP細胞の収率および純度を比較した。その結果は、約30％のPAP細胞始原体がMDP界面画分中で喪失されることを示す。従って、PAP細胞の総収率を増大させるために、本明細書中に示される結果は、２勾配プロトコルが用いられるべきであることを示す。しかし、DCの収率は、２勾配プロトコルを使用して、約30％高かったが、PAP細胞の純度はほぼ１桁減少した。PAP細胞の純度の減少の見かけの理由は、40時間の培養後、そうでなければ通常はMDP界面中に分離されていたであろう細胞のすべて( PBMCの総数の約５分の１〜３分の１である)が、MEP界面中にPAP細胞とともに同時精製されるというものである。実施例10に示されるように、ガン患者の血液から単離されるPAP細胞の収率および純度は、健常なドナー由来のPAP細胞の収率および純度と同様である。Ｂ．富化させた細胞画分の特徴付け富化させた細胞画分中のDCは、代表的には、インビトロで培養された場合、樹状形態を有する。さらに、上記のように、この細胞は、代表的には、細胞表面マーカーCD3、CD4、CD8、CD14、CD16、およびCD20に関してネガティブであり、そして例えば、HLA-DR発現により明らかにされるように、MHCクラスIIに関してポジティブである。この画分中のPAP細胞は、DCの上記の特徴、およびペプチドまたはより大きな可溶性抗原に応答して、MHCクラスＩ拘束性CTLによって媒介される一次免疫応答を刺激する能力を有する。ペプチドに対する機能的な受容能(competence)を、トリチウム化チミジン組み込みおよびペプチド特異的CTLの生成(実施例２および３ )により検出されるように設定される同種異質遺伝子型Ｔ細胞刺激における増殖応答を測定することによって評価した。 PAP細胞はまた、浸透圧の勾配の非存在下で、大きな可溶性ポリペプチド抗原をロードされ得、そしてMHCクラスＩ拘束性CD8⁺CTLに提示するためにこのような抗原をプロセシングし得る。ポリペプチドである大きな可溶性抗原は、少なくとも約20アミノ酸残基；好ましくは少なくとも約30アミノ酸残基を含む。例示的な大きな可溶性抗原には、不活化されたインフルエンザウイルスおよびインフルエンザマトリクスタンパク質(IMP)が含まれる。このような大きな可溶性抗原をロードされたPAP細胞を使用するCTLの活性化は、実施例12に記載される。ペプチドに加えて、特定のタンパク質がPAP細胞に導入され得、その結果、このタンパク質は、クラスII経路単独とは対照的に、MHCクラスＩおよびクラスII の両方の経路によりプロセシングされ得ることが明らかにされている(例えば、M ehta-Damaniらを参照)。しかし、本発明以前には、CD8⁺CTLへの抗原の提示を可能にする様式で、大きな可溶性の抗原性分子またはタンパク質(例えば、KLH)でのDCのロードは、抗原のリポソーム中への組み込み(例えば、Nairら、Reddyら、 Zhouら)またはスクロース誘導性浸透圧勾配のいずれかを使用して達成されてきた。このような浸透圧勾配は、抗原性分子が、細胞によって、この細胞による「内因性」抗原のプロセシングに使用されるタイプのベシクルに似ているベシクルに取り込まれることを引き起こし、そしてMHCクラスＩと共同して分解された(de graded)抗原の提示を生じる。浸透圧勾配アプローチの望ましくない副作用は、ロード後の生存可能なDCまたはPAP細胞の乏しい収率(代表的には＜10％)である。Ｃ．精製されたPAP細胞本発明に従うと、上記のように精製されたPAP細胞は、例示的なAPCを構成する。APCは、抗原をプロセシングし、そしてこれをMHC-ＩまたはMHC-IIのいずれかと共同してＴ細胞に提示する。伝統的な見方は、「外因的な」ペプチドが取り込まれ、プロセシングされ(すなわち、分解され)、そしてMHC-IIと共同して、クラス II拘束性(すなわち、CD4⁺)Ｔ細胞に提示される。一方、「内因性」ペプチド、例えば、ウイルスに感染した細胞から発現されるウイルス配列は、MHC-Ｉと共同して、クラスＩ拘束性(すなわち、CD8⁺)Ｔ細胞に提示される(Bracialeら、1987)。最近、外因性に加えられた抗原は、クラスＩ拘束性CTLに提示され得ることが示された(Mooreら、1988)。本明細書中に記載された特徴を有し、そして/または本発明の方法を使用して単離されたPAP細胞は、上記の任意の方法によって、またはPAP細胞の存在下で抗原を単純にインキュベートすることによってパルスされ得る。さらに、選択された抗原は、このような抗原をコードする遺伝子を含む発現ベクターで細胞をトランスフェクトすることによって、PA細胞に導入され得る。所望の抗原をコードする遺伝子でのPAP細胞のトランスフェクションは、クラスＩMHCと共同して抗原を発現させるための有効な方法である。種々の任意の公知の方法(例えば、Ausubel ら、Mulliganを参照)が、このようなトランスフェクション（エレクトロポレーション、CaPO₄沈澱、リポフェクション、裸のDNA曝露、ならびにウイルスベクター (例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクター、およびワクシニアウイルスベクターを含む)をベースにするアプローチ)に使用され得る。種々の異なる抗原が、本発明の実施に使用されるPAP細胞中にロードされ、そしてこの細胞によって提示され得る。例えば、実施例12に記載のように、PAP細胞は、小さなペプチドから大きなタンパク質〜ウイルス全体までの範囲の抗原性存在物をロードされ、そして続いてＴ細胞(CD8⁺CTLを含む)を活性化するために使用され得る。抗原の具体的な例には、感染因子(例えば、ウイルス、細菌、微生物、およびそれらの部分、例えば、特異的なタンパク質)、腫瘍またはガン細胞によって発現される肺瘍関連抗原(例えば、p53、ガン胎児性抗原(CEA)、HER2 、MART-1、およびp21RAS)、および新生物の形質転換された組織中のアップレギュレートされた組織特異的抗原(例えば、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的膜抗原、または前立腺特異的抗原)が含まれる。さらに、このような抗原は、特定の所望の活性を有する、特異的に設計されそして/または組み合わせられた形態であり得ることが理解される。例えば、複合体抗原は、２つの選択された抗原の融合体として、選択された抗原と細胞標的化分子との融合体などとして組換え的に産生され得る。特定の実施態様において、このような融合体タンパク質には、(i)免疫原性、(ii)所望のMHC経路によるプロセシング、および(iii)特定のAPCへの標的化を与える異なるドメインが含まれ得る。 III．バイオマトリクス組成物培養中の単離されたPAP細胞は、代表的には、細胞表面からの細胞質の突起ならびに一次および二次の免疫応答の発生のためにリンパ球に抗原を効果的に提示するそれらの能力を喪失する。本発明の１つの局面に従うと、PAP細胞(パルスされたかまたはパルスされていない)は、三次元マトリクス中で細胞を培養することによって、所望の(例えば、活性)状態に維持され得る。このような培養に適切であり得るマトリクスは、Langer＆Bacantiにより総説されている。それらは、細胞をエントラップするために効果的なヒドロゲル、アガロース(Brendel，M.D. ら)、およびコラーゲン(Chao，S-H.ら)のマトリクスを含み、そして細胞に増殖するための足場を提供する。このようなゲルまたはマトリクスは、好ましくは、培養に使用される条件下で安定である。マトリクスは、細胞の特定の形態、発現パターンまたは機能的特性を維持するために使用され得る。実施例７に詳述される実験は、三次元架橋コラーゲンマトリクス中での細胞の培養を記載する。単離されたMEP界面画分(PAP細胞を含む)を、Ｉ型コラーゲンモノマーの溶液と混合した。この細胞−コラーゲン懸濁物は、pHおよび温度の段階的変化後にインサイチュ重合化を誘導され、従って、コラーゲンファイバーの高度に多孔性である三次元マトリクスにPAPを効果的にエントラップする。コラーゲン中にエントラップされた細胞の形態学的観察は、12日間にわたる延長された長期間培養後、PAP細胞の分化した形態の維持を示した。12日間の培養後のコラーゲンマトリクスの消化に続いてFACS上に遊離された細胞の評価は、大部分の生存可能な細胞が、それらがDCであることの指標である表現型マーカーを表すことを示した。エントラップされたPAP細胞は、HLA-A^*0201結合ペプチドでパルスし、そして抗原特異的CD8⁺Ｔリンパ球を作製するために使用された。作製されたCTLは、標的細胞のペプチド特異的溶解を示した。これらの結果は、コラーゲンでエントラップした培養後に、分化した状態を維持する能力およびPAP細胞の抗原提示能力を示す。これらの結果は、免疫調整治療用の移植可能または体外デバイスおよび/またはシステムの設計および適用のための重要な示唆を有する。例えば、患者の自己 PAP細胞が単離されそして三次元システム中にエントラップされ得る。この細胞は、続いて、抗原またはペプチドでパルスされ、そして腫瘍またはウイルス性疾患を処置するための天然の抗原に対する移植可能なまたは体外のワクチン接種ビヒクルとして使用される。本発明の細胞/マトリクス組成物は、好ましくは、その組成物がリンパ球と接触する場合、一次または二次の免疫応答を刺激するために十分な割合のDCおよび /またはPAP細胞を含む。代表的には、エントラップされた細胞は、少なくとも10 ％のDCまたはPAP細胞、好ましくは少なくとも50％のDCまたはPAP細胞を含む。マトリクス中のPAP細胞は、選択された抗原の提示に関して改変され得る。すなわち、それらは、ペプチドまたはタンパク質で「パルス」され得るか、または選択された抗原をコードする遺伝子でトランスフェクトされ得る。抗原は、任意の抗原(この抗原に対して、免疫応答が増大されることが望まれる)、例えば、腫瘍またはウイルス抗原、１より多い抗原の組合せ(例えば、融合タンパク質)、サイトカインまたは特定の細胞タイプを標的するための配列に融合された抗原の組合せなどであり得る。 IV．有用性Ａ．PAP 細胞に富む画分 PAP細胞の単離において用いられる単一密度勾配物質から作製される多重密度勾配は、単純な閉じたデバイスまたはキットにおいて使用され得る。本発明の方法を使用して単離されるPAP細胞は、多数の適用において使用され得る。本発明の方法によって単離されたPAP細胞の１つの有用な特徴は、それらが、ナイーブＴ細胞および記憶Ｔ細胞の応答(CD8⁺Ｔ細胞媒介性の細胞傷害性応答およびCD4⁺ Ｔ細胞媒介性の増殖性応答)の誘導のために抗原を提示し得ることである。このように、PAP細胞は、普遍的に有用な抗原提示細胞であり、そして一次および二次の免疫応答の発生を含む、広範囲の免疫治療的および免疫予防的適用に用いられ得る。細胞は、例えば、直接のインビボ投与、エクスビボ体性治療、インビボ移植可能デバイスおよびエクスビボ体外デバイスに使用され得る。これらはまた、腫瘍特異性およびウイルス特異性抗原由来のペプチドエピトープの抗原性および免疫原性のスクリーニングに用いられ得る。適切な抗原で処理またはパルスされたPA P細胞は、例えば、病原性ウイルスまたはガン性腫瘍に対する強力なワクチン組成物として使用され得る。インビトロおよびエクスビボ適用のために、PAP細胞を含有する画分は、好ましくは、比較的純粋であり、そして比較的少数の単球(例えば、約５％未満の単球)を含む。このような画分は、上記の「３勾配」プロトコルを使用して簡便に得られ得る。インビボ適用について、PAP細胞を含有する画分の細胞純度は、PAP細胞の総数より重要でない。従って、インビボ使用のためのPAP画分は、上記の「２勾配」プロトコルを使用して得られ得る。単離されたPAP細胞はまた、例えば、遺伝子治療適用(例えば、細胞のトランスフェクション)に使用され、その結果、それらが、治療的適用のための所望の抗原/遺伝子産物を構成的に発現し得る。Ｂ．１つの対立遺伝子に適合する同種細胞例えば、CMV感染およびリンパ増殖性疾患(Mayordomoら、Rooneyら、Walterら) における抗原特異的CD8⁺CTLの治療的利益は、ウイルスおよび腫瘍に対するCTL応答を誘導することを目的とするワクチン接種ストラテジーを証明する。最近の臨床試験により、腫瘍抗原をロードした自己DCを使用する細胞性のワクチン接種アプローチにより、メラノーマにおける細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答(Huら)、およびＢ細胞リンパ腫患者における腫瘍退行(Hsuら)を生じるという有望な結果が得られている。しかし、特定の進行した疾患を有する患者において、DCの機能的な効力は、弱められていると考えられる(Borrowら)。このような場合において、ある個体から得られる細胞を、第２の個体の症状を処置するために使用することが有利であり得る。例えば、乳ガン患者のDCは、機能的に弱められ、そして健常な個体由来の DCと比較して、Ｔ細胞を刺激することにおいて、より低い効力を示す(Gabrilovi chら)。同様に、文献中の複数のレポートは、AIDS患者のDCがHIVウイルスに感染していること(Knightら、Macatoniaら、1990)、およびこのようなDCが強力な免疫応答を増大し得ないこと(Macatoniaら、1990、Chehimlら、Ealesら)を示す。本発明に従うと、患者のＴ細胞は、HLAクラスＩ全体(実施例８)またはただ１つのHLAクラスＩもしくはクラスII対立遺伝子(実施例９)のいずれかにマッチした同種PAP細胞を使用して活性化され得る。従って、本発明のこの局面は、以前から利用可能であったものより広い範囲の免疫治療的オプションを可能にする。例えば、AIDS患者は、健常な個体由来のHIV抗原をロードされた同種異質遺伝子型DCを用いてワクチン接種され(すなわち、インビボにおいて処置され)、AIDS患者にHIV抗原特異的CD8⁺CTLを発生させ得る。このようなCTLは、選択された特異性の、より強い抗ウイルス免疫応答を導く。処置はまた、体外的にまたはエクスビボで実施され得る。例えば、リンパ球( 例えば、CTL)は被験体から取り出され、同種異質遺伝子型の抗原でパルスされた PAPでインビトロで刺激またはプライムされ、そして拡大される。次いで、活性化されたリンパ球は被験体に注射して戻される。ここで、それらは、免疫応答の増大を生じる。Ｃ．マトリクス組成物 PAP細胞の分化した機能を、これらを、外因性サイトカインの補充をする必要のない、三次元の、多孔性の、生体適合性のマトリクス中で培養することによって維持した。本明細書(例えば、実施例７)に詳述するように、コラーゲンマトリクス中で培養されたPAP細胞は、12日以上の間、一次免疫応答を誘発する能力およびそれらの分化した状態を維持する能力、ならびに抗原提示能力を示した。これらの特徴は、細胞/マトリクス組成物を、多くの適用において有用にする。三次元マトリクス中で培養されたDCまたはPAP細胞は、数日の経過にわたる特定の状態において細胞を安定に供給することが所望される適用に使用され得る。例えば、DCまたはPAP細胞を含む三次元マトリクスは、免疫調整治療における使用のために移植可能なおよび/または体外デバイス/システムにおいて用いられ得る。患者の自己PAP細胞は単離され、そして本明細書中に記載されるような三次元マトリクスにエントラップされ得る。PAP細胞は、マトリクスにエントラップされる前またはエントラップされた後に、抗原またはペプチドでパルスされ、そしてこれを、移植可能なまたは体外ワクチン接種(例えば、リンパ球の体外活性化)のためのビヒクルとして使用されて腫瘍またはウイルス性疾患の患者を処置し得る。欠損リンパ節を有する個体の免疫治療もまた企図される。このような適用において、PAP細胞を含有するマトリクスは個体中に移植されて「人工的な」リンパ節として作用する。本明細書中で詳述される細胞/マトリクス組成物の例示的な使用は、公知の腫瘍特異的または病原体特異的抗原を有する腫瘍または病原体に対して被験体を免疫するためである。このような適用において、PAP細胞に富む血球画分は、例えば、上記のように単離され、そしてPAP細胞は、三次元生体適合性マトリクス(例えば、ヒドロゲル、コラーゲンゲルまたはアガロース)中にエントラップされる。細胞は、MHCクラスＩおよびクラスIIと共同して、抗原の提示を生じるために効果的な様式で、エントラップする前または後のいずれかで選択された抗原を用いて処理または「パルス」される。処理が、抗原を発現し得る遺伝子を含むベクターで細胞を形質転換することを伴う場合、この処理は、代表的には、エントラップする前に行われ、そしてトランスフェクトされた細胞は続いてエントラップするために選択される(標準的な方法(例えば、Ausubelら)を使用して)。あるいは、処置が、抗原性タンパク質またはペプチドに細胞を曝すことからなる場合、細胞がエントラップされた後にこの処置が行われ得る。 PAP細胞の処置に続いて、細胞は、クラスＩおよびクラスII MHCと共同して、選択された抗原を発現し、従ってリンパ球と接触される場合、免疫応答(例えば、ナイーブＴ細胞と接触される場合、一次免疫応答)を刺激するために効果的である。次いで、マトリクスにエントラップされた処理された細胞は、被験体のリンパ球と接触させられるか、またはそれらはリンパ球に曝される。この曝露は、リンパ球を刺激または活性化する効果を有し、その結果、それらは抗原特異的増殖性および細胞傷害性の免疫応答を発生し得る。曝露が体外でなされる場合、リンパ球(例えば、CTL)が被験体から取り出され、そしてマトリクス中のPAP細胞に曝される。リンパ球(これらの多くはエントラップされたPAP細胞によって活性化されている)は、被験体に注射されて戻される。被験体において、これらは免疫応答の増大を生じる。あるいは、処理されたPA P細胞を含むマトリクスは被験体に注射され得るかまたは移植され得、その結果、エントラップされたPAP細胞へのリンパ球の接触または曝露が被験体において生じ、そしてこのような接触により活性化されたリンパ球が免疫応答の増大を直接引き起こし得る。以下の実施例は本発明を例示するが、決して本発明を限定することを意図しない。材料および方法培地 AB培養培地：基礎RPMI-1640培地(Gibco Laboratories，Grand Island，NY)を2 .0mM L-グルタミン(Gibco Laboratories，Grand Island，NY)および５％のプールしたヒトAB血清(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)で補充した。密度勾配の処方物密度勾配を、約1.129±0.001g/mLの密度、約15±15mOsmの浸透圧モル濃度、および約9.0±1.0のpHを有する、シリカをベースにした密度勾配物質(分離媒体)である「PERCOLL」(PharmaciaLKB，Uppsala，Sweden)を使用して調製した。ストック等張性「PERCOLL」(SIP)密度勾配溶液を、「PERCOLL」と10×カルシウム/マグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水(D-PBS)(Gibco Laboratories，Grand Isla nd，NY)とを1:9(v/v)の比で混合することによって調製した。以下の密度勾配溶液を、SIP溶液と１×D-PBSまたは2.66×D-PBSとを混合することによって調製した。2.66×D-PBSを、10×D-PBSとエンドトキシンを含まない(LAL)水(BioWhittak er，Walkersville，MD)とを重量を基準にして0.2086±0.0010〜0.8083±0.0010 の比に混合することによって作製した。略語は以下の通りである：FEP−フィコール等価パーコール；MDP−単球除去パーコール、MEP−メトリザマイド等価パーコール、およびIOMEP−等浸透圧モルメトリザマイド等価パーコール。これらの溶液を、以下の式に従って調製した。ここでρが密度、vが容量、wが重量、そしてxが成分(１)および(２)の混合物(ｍ)中の個々の成分の容量割合であり、その結果x₁＋x₂＝１、v₁＋v₂=v_m、およびw₁＋w₂＝w_mである。それぞれの場合における下付き文字は成分(１)、成分(２)または混合物(ｍ)のいずれかを指すことに注意すること。成分(１)は代表的にはSIPであり、そして成分(２)は、１×D-PBS(1.0064±0.0010の密度)または2.66×D-PBS(1.0169±0.0010の密度) のいずれかであった：この式をスプレッドシートプログラム(「EXCEL」、Microsoft Corp.，Redmond， WA)に入力して、各成分の重量の繰返し計算を容易にし、所望の密度を有する混合物を作製した。処方された溶液を、(i)デンシトメーター(Model #DMA-48，Anton Paar，Ashla nd，VA)においてその密度、(ii)凝固点降下浸透圧計(Model #2400，Fiske Instr uments，Norwood，MA)においてその浸透圧モル濃度、および(iii)pHメーター(Mo del #345，Corning，Corning，NY)を使用してそのpHを測定することによって特徴付けた。滅菌された、1.0M水酸化ナトリウム溶液および1.0M塩酸溶液を用いて pHを調整した。密度および浸透圧モル濃度を、受容可能な範囲の溶液特徴の密度勾配溶液を得るために、それぞれSPIまたはPBS(必要に応じて１×、2.66×または10×)を添加して値を増加させること、または滅菌水を添加して値を減少させることのいずれかにより調整した(上記表１を参照のこと)。抗原特異的Ｔリンパ球の誘発および拡大抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を、本質的にMehta-Damaniら(1994)により記載されるように誘発した。３つのHLA-A^*0201結合ペプチドを使用して抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)を誘発した。第１(配列番号１)は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１(human trophic leukemic virus 1)(HTLV-1；Elovaaraら、1993；K annagiら、1992；Zweerinkら)のTax遺伝子産物のアミノ酸11〜19に対応し、第２ (配列番号２)は、メラノーマ細胞上で発現されるMART-1抗原(Stevensら)のアミノ酸27〜35に対応し、そして第３(配列番号３)は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV) のポリメラーゼ遺伝子中の逆転写酵素のアミノ酸464〜472に対応する。すべてのペプチドは、BachemLaboratorles(Torrance，CA)により合成された。ストック溶液を、ペプチドをLAL水(BioWhittaker，Walkersville，MD)中1.0％滅菌濾過酢酸溶液に約１μg/mlの濃度で溶解することによって調製した。単離されたDCを富化させた細胞画分を、1.0mLの基礎RPMI-1640に再懸濁し、そして１〜５μg/mLのβ2-ミクログロブリン(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)および１〜５μg/mLのペプチドとともに37℃にて１〜２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、ペプチドでパルスしたDCを洗浄して過剰なペプチドを除去し、そして自己Ｔリンパ球(14.5％メトリザマイドペレット細胞)と約10:1 の比で混合し、4.0U/mLのヒト組換えIL-2(Gibco Laboratories，Grand Island， NY)を補充したAB培養培地中1.0×10⁶細胞/mLの細胞濃度を得た。培養の３日後、 IL-2濃度を20.0U/mLに増加させた。Ｔリンパ球を、週ごとのスケジュールで、10:1の比のペプチドでパルスされた自己の単球を使用して再刺激した。再刺激の間、IL-2濃度を4.0U/mLに減少させ、そして続いて各再刺激後の３日間の培養後、20.0U/mLに増加させた。CTL培養物を、代表的には、抗原特異的標的細胞溶解の評価の前に、３〜４週間拡大した。細胞媒介性細胞傷害性アッセイ細胞媒介性細胞傷害性アッセイを、標準的な４時間⁵¹Cr遊離アッセイを使用して行った。エプスタインバールウイルス(EBV)でトランスフエクトされたヒトＢ細胞株JY、および細胞表面に非占有HLAクラスＩ分子の存在を生じる機能不全の輸送関連タンパク質-1(TAP-1)変異を有する樹立されたヒトＴ細胞株T2を、細胞傷害性アッセイのための標的細胞として使用した。JYおよびT2細胞はともに、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC，Rockville，MD)から入手し得、そしてこれを、AB培養培地を使用して組織培養フラスコ中に維持した。アッセイプレートを、100μL/ウェルの最終容量でエフェクターCTLの６つの系列希釈物(1:2)を作成することにより調製した。自発遊離(バックグランドの放射活性漏出)に使用されたウェルは、エフェクターCTLを有さない、100μL/ウェルの培養培地を含んだ。最大遊離(標的細胞中へ取り込まれた最大の⁵¹Cr)の測定に使用されたウェルは、LAL水中に、50μLの培養培地および50μLの1.0％Triton X -100(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)を含んだ。標的細胞を、DCに関して上述したように、ペプチドでパルスした。ペプチドでパルスされていない標的細胞および非関連ペプチドでパルスされた標的細胞を、コントロールとして使用した。標的細胞を洗浄し、そして100μLのAB血清中に再懸濁し、そして100μLの⁵¹Cr(NEN DuPont，Wilmington，DE；ストック濃度＝1.0 mCi/mL)とともに２時間37℃にてインキュベートした。上清中の過剰な標識していない⁵¹Crを、AB培養培地中での３回の連続する遠心分離による洗浄工程(600× ｇ、５分間、室温)によって洗い流した。続いて、放射標識された細胞を、AB培養培地中に40,000細胞/mLの濃度で再懸濁した。50μLのこの懸濁物を、既知の濃度のエフェクターCTLを含む96ウェルアッセイプレートの各ウェルに添加した(2, 000細胞/ウェル)。プレートを、５％CO₂インキュベーター中で37℃にて４時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞を遠心分離し、そしてペレット化した。各ウェルからの100μLの上清を、200μLのシンチレーション液を含む、Ｔ-トレイ中の対応して標識されたウェル中に移した。Ｔ-トレイを密封し、そして上清中に遊離された⁵¹Crを、ベータプレートカウンターにおいて、１分あたりの計算されたカウント(CCPM)で測定した。アッセイを、各標的タイプについて各エフェクター：標的比で、３連の(three replicate)ウェルを測定するよう設定した。得られた測定値から、％溶解を以下のように計算した：観察された溶解がHLAクラスＩ拘束性であるかどうかを評価するために、HLAクラスＩに対するモノクローナル抗体W6/32を、ペプチドでパルスされた標的細胞に、10〜30μg/mLの濃度で添加して、標的細胞上のHLAクラスＩ部位をブロックした。フローサイトメトリー FACS分析を、「LYSISII」ソフトウェア(Becton Dickinson)を作動させるHewlett -Packard HP-9000コンピューター(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)に接続した FACScanフローサイトメーター(Becton Dickinson，San Jose，CA)で行った。分析に使用したすべてのモノクローナル抗体およびそれらのそれぞれのイソタイプコントロールを、Becton Dickinsonから購入した。簡潔に述べると、約100,000 細胞を、96ウェルプレートの各ウェル中で、50μlのウサギ血清(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)とともに、150μLの最終容量で、15〜20分間室温にてプレインキュベートして、抗体結合の非特異的部位をブロックした。次いで、10 μLの所望のFITCまたはPEタグしたモノクローナル抗体を、ウェルに添加し、そして96ウェルプレートを、暗所で、４℃にて30分間インキュベートした。次いで、プレートを遠心分離して細胞をペレット化し、そして上清を吸引して結合していない抗体を除去した。ペレット化した細胞を、５％ヒトAB血清を補充した100μLのD-PBS中に再懸濁し、固定し、そして2.0μg/mLのLDS-751(Molecula r Probes，Eugene，OR)を補充した100μLの1.0％パラホルムアルデヒド(Sigma C hemical Company，St.Louis，MO)の添加により対比染色した。LSD-751は、遠赤外スペクトルの蛍光を発し(PerCP領域−FACScanのFL3蛍光チャンネルにより検出される)、そして細胞を対比染色し、核のない細胞(染色されない)集団、核のある生存可能な細胞(弱く染色される)集団、および核のある生存不可能な細胞(非常に明るく染色される)集団の間の区別を可能にする。実施例１樹状細胞およびＴリンパ球の単離樹状細胞およびＴリンパ球を、「３勾配」プロトコルまたは「２勾配」プロトコルのいずれかを用いて精製した。他に示さない限り、以下に示す工程は、両方のプロトコルに共通である。「３勾配」および「２勾配」プロトコルの模式的な要旨を、図9Aおよび図9Bにそれぞれ示す。 HLA-A^*0201ポジティブなボランティアの健常な供与者からの血液の１単位から調製されたバフィーコートを、Stanford University Blood Center(Stanford，C A)から得た。細胞を、ロイコパック(leukopacs)から収集し、Ca⁺⁺/Mg⁺⁺を含まないリン酸緩衝化生理食塩水(D-PBS；Gibco Laboratories，Grand Island，NY)を用いて60mLに希釈し、そしてFEP溶液の２つの15mLカラムの上に、あるいは50mL 遠心分離用チューブ中のLymphoprep(Nycomed Laboratories，Oslo，Norway)上に上層した。そのチューブを、室温において1,000×gで、35分間遠心分離した。遠心分離は、ブレーキをかけずに停止させ、界面に存在する末梢血単核細胞(PBMC) を収集した。 PBMCをD-PBS中に再懸濁し、650×gで10分間１回、さらに200×gで５分間２回遠心分離して血小板を除去した。「３勾配」プロトコルにおいて、血小板が除かれたPBMCを、60mLのD-PBS中に再懸濁し、15mLのMDP（約50％「PERCOLL」）の２つのカラムの上に載せ、650×g で25分間、４℃でブレーキをかけずに遠心分離した。MDP界面（主に単球）およびMDPペレット細胞（主にリンパ球）を収集し、そして室温での遠心分離（650× gで10分間一回、そしてその後200×gで５分間２回）によりD-PBSで洗浄した。「２勾配」プロトコルにおいて、先のパラグラフに記載の「MDP」勾配遠心分離を除外し、そして血小板が除かれたPBMCを、MDPペレット画分またはMDP界面画分のいずれかを必要とする次の工程で用いた。 PAP細胞を用いて、抗原提示機能を解明する目的でペプチド特異的CTLを生成する場合、MDP界面画分（主に単球）を、プールされた冷ヒトAB血清（Irvine Scie ntific，Santa Ana，CA）中に再懸濁し、これに等容量の80％AB血清、20％ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)を滴下した。得られた細胞懸濁液をクリオバイアル(cryovial)中にアリコートし、そして液体窒素中で凍結した。単球を用いて、以下の実施例２に記載するように、拡張のためにCTLを再び刺激した。 MDPペレット画分を、100mLのAB培養培地中に再懸濁し、２つのT-75組織培養フラスコに接種し、そして加湿した５％CO₂インキュベーター中で40時間培養した。インキュベーションに続いて、非付着細胞を穏やかなピペッティングにより収集し、洗浄し、そしてAB培養培地中で２〜５×10⁶細胞/mLの濃度に再懸濁した。細胞懸濁液を、AB培養培地中の4.0mL分離培地（MEP，IOMEPまたは約14.5％Met rizamide(Sigma Chemical Company，St．Louis，MO)）の４つのカラム上に重層し、そして650×gで20分間室温でブレーキをかけずに遠心分離した。界面およびペレットの細胞を収集し、そしてAB培養培地中で、650×gで10分間１回そしてその後200×gで５分間２回の遠心分離により室温で洗浄した。両方の細胞画分の収量および生存度を、トリパンブルー排除を用いて血球計数器で計数することにより見積もった。界面画分中のDCの純度を、フローサイトメーター（FACS）での分析に続いて定量した。細胞を、細胞表現型マーカーCD3（Ｔ細胞）、CD14（単球）、CD16（NK 細胞）およびCD20（Ｂ細胞）について陰性に、そしてHLA-DR（FITCチャンネルで）およびCD3、CD14、CD16、CD20のカクテル（PEチャンネルで）での二重染色用いてHLAクラスII発現についてポジティブになるよう特徴付けした。FITCおよびP Eチャンネルの両方でのIgG2aでの二重染色を、アイソタイプのコントロールとして用いた。この表現型は、DCに特徴的である(Macatoniaら、1991；MarkowiczおよびEngleman，1990；YoungおよびSteinman，1987)。３勾配プロトコルを用いて得られるDCを富化された細胞について得られる代表的なFACSプロフィールを図１に示す。このプロフィールにおけるDC純度は、約16 .0％である。平均で、純度15.4±10.1％（平均値±標準偏差）を有する0.9±0.7 ×10⁶（平均値±標準偏差）DCを、１単位の血液（n=60）から得た。細胞の形態をまた、光学顕微鏡を用いて評価した。これらの研究は、DCを富化させた画分が、細胞表面から延びている細胞質プロセスを有する大きなサイズのベール細胞を含むことを示した。これは、DCに特徴的な特質である。上記の３勾配プロトコルをまた、DPCを含む単球欠失細胞画分の単離に適用した。ここで、画分を無血清培地で、樹状前駆細胞に、樹状細胞の特徴（例えば、形態学的特徴）を有する細胞へと、形態学的変化を生じさせるのに十分な期間培養した。４つの異なる無血清培地を試験した：DMEM/F-12(Gibco/BRL Life Techn ologies)、Enriched Macrophage SFM(Gibco/BRL Life Technologies)、AIM-V(カタログ番号12055，Gibco/BRL Life Technologies)、およびEnriched AIM-V(Gibc o/BRL Life Technologies)。次いで、細胞を、上記のようにMEPを用いてさらに精製し、そしてDCの純度および収量について上記のように評価した。これらの実験の結果を、以下に表２に示す。結果は、無血清培地（純度）で培養した画分に存在するDCのパーセントが、血清を含むコントロール（RPMI+５％ABS）で培養された画分の純度よりも有意に大きいことを実証する。本発明の補助において行われたさらなる実験の結果は、50 pg/mL GM-CSF(Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor)の添加が、 DCの純度または収量を増加させないことを示した。２勾配対３勾配プロトコルを用いて得られたPAP画分間の主要な差異は、単球の混入度であった。単球は、３勾配プロトコルを用いて得られたPAP細胞を富化させた画分中で細胞の約５％未満を構成したのに対し、これらは、２勾配プロトコルを用いて得られた細胞の半分以上を構成した。従って、インビトロまたはイクスビボで免疫応答の刺激における使用のために単離された調製物（ここで、単球の混入をできるだけ減少させることが好ましい）は、代表的には３勾配プロトコルを用いて調製されたのに対し、インビボまたはインサイチュでの適用のために単離された調製物は、２勾配プロトコルを用いて都合良く調製され得る。実施例２ペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の生成単離された細胞を、HLAクラスＩ結合ペプチドを用いて、これらがインビトロでナイーブＴ細胞を活性化する能力を保持することを実証することにより、DCであるとさらに確認した。DCおよびＴリンパ球画分を、末梢血単核細胞の密度勾配分離（３勾配プロトコル）に続いて得た。DCを富化させた画分をHLA-A^*0201結合 HTLV-1ペプチド（配列番号１）でパルス(pulse)し、そして自己Ｔリンパ球と共に培養しペプチド特異的CTLを生成した。 DCを富化させた画分は、8.6×10⁶個の細胞を含み、そしてリンパ球を富化させた画分は、139.0×10⁶個の細胞を含んだ。FACS分析は、DCを富化させた画分中に 8.0％のDC純度を示し、0.69×10⁶個のDCを生じた。この場合、2.0×10⁶個の界面細胞（160,000 DC）を、1.0μg/mLのβ２ミクログロブリンおよび5.0μg/mLのHT LV-1ペプチド（配列番号１）と共に、37℃で２時間インキュベートした。残りの DCを用いて、他のHLA-A^*0201結合ペプチドを用いてCTLを生成した。リンパ球画分は、FACSで染色および分析した場合、以下の表現型分布を有した：70.8％ CD3⁺、49.3％ CD4⁺、および22.8％ CD8⁺。この画分（14.0×10⁶個の細胞；3.2×10⁶個のCD8⁺細胞）をHTLV-1ペプチドでパルスされたDCを富化された細胞と混合し、DCのCD8⁺Ｔリンパ球に対する比が１：20になった。培養を、4.0U/m LのIL-2を補充したAB培養培地において0.8×10⁶細胞/mLの接種濃度で開始した。 CTLを、HTLV-1ペプチドでパルスされた自己単球およびIL-2サイクリングで、材料および方法において記載したように、全41日間、７日毎に再刺激することによって拡張し、70.7％のCD8⁺Ｔ細胞を含む145.0×10⁶個の細胞を生じた。この拡張プロトコルの模式概略図を、図10に示す。図2Aは、HTLV-1ペプチドでパルスされた自己樹状細胞で刺激されたCTLの増殖キネティックスを示す。細胞数は初めは、おそらくバイスタンダー細胞の死が原因で、初めの約10〜12日間の培養の間、減少する。14日目に、第２の再刺激の間、細胞の数は、おそらくペプチド特異的Ｔリンパ球のより高い頻度で播種された細胞の数とほとんど同じであった。その後、抗原特異的再刺激により選択された CTLは、40日培養以上拡張し得る。14日目から41日目までのペプチド特異的CTLの比増殖速度は、0.006 hr^-1と計算され、播種されたCD8⁺細胞の数に基づいた4.9 日の倍加時間および45倍の拡張となった。図2Bは、同様な実験の結果を示し、HTLV-1 tax 11-19ペプチド（配列番号１）を用いたHTLV-1血清陰性の個体の250ml末梢血液から生成された、CTL R54株の拡張のキネティックスを示す。細胞は、３週間の培養の後に120×10⁶個以上の細胞にまで拡張し、そしてCD4⁺およびCD8⁺Ｔリンパ球を主に含んだ。実施例３活性化された細胞傷害性Ｔリンパ球による HTLV-1 ペプチドでパルスされたJY細胞の溶解実施例２に記載の培養由来のCTLを、HTLV-1ペプチドでパルスされたJT標的細胞を溶解する能力について、標準的な４時間⁵¹Cr遊離細胞障害アッセイ（材料および方法）において、34日目および41日目に試験した。図3Aおよび3Bに示す結果は、ペプチドでパルスされた標的細胞の容量応答曲線依存性抗原特異的溶解を示す。34日目（図3A）に、最も高いエフェクター：標的比である142:1において、測定されたHTLV-1ペプチドでパルスされたJY細胞の溶解は、63.5±3.5％（平均値±標準偏差）で、パルスされなかったJY細胞のバックグラウンド溶解は29.1± 2.9％（平均値±標準偏差）と計算された。41日目（図3B）に、最も高いエフェクター：標的比である100:1（第34日目の値より低い）において、82.3±1.9％（平均値±標準偏差）および31.8±7.5％（平均値±標準偏差）の溶解を、HTLV-1 ペプチドでパルスされた細胞およびパルスされなかったJY標的細胞についてそれぞれ観察された。これらの結果は、生成されたCTLによって提示された抗原特異的細胞傷害性が、40日の拡張期間にわたり維持されることを示す。図3Cおよび3Dに図示されるように、ペプチドでパルスされた標的細胞の観察された抗原特異的溶解（図3CのJY細胞および図3DのT2細胞）は、W6/32（HLAクラス I分子に対して指向されたモノクローナル抗体）の存在下でパルスされなかった標的細胞を用いて得られた溶解と類似のレベルまで阻害された。さらに、抗原特異的細胞溶解が、OKT-8（Ｔリンパ球表面のCD8分子に対して指向された抗体）の添加により阻害されるのに対し、抗HLAクラスII抗体が抗原特異的溶解に対して何ら影響を及ぼさないことが観察された。これらの結果は、抗原特異的溶解が、主にHLAクラスIで拘束され、そしてCD8⁺Ｔリンパ球によって媒介されることを示す。上記の実験を、13 HLA-A2ポジティブ、HTLV-1血清陰性の個体の末梢性血液から生成されたHTLV-1 tax 11-19ペプチド特異的CTL株を用いて行った。抗原特異的CTLを、13個のサンプルのうちの11個から生成した。ペプチドでパルスされたDCを用いてHTLV-1ペプチドに対して生成されたCTLを、内因的にHTLV-1抗原を発現する標的細胞を溶解する能力について試験した。標的細胞は、２つの細胞株（MJ細胞(ATCCから入手したＴ細胞株)、および20473細胞（Merck SharpおよびDohme Research Laboratories(Rahway，NJ)から入手した、Ｂ細胞株））由来であった。MJ細胞は、HTLV-1によって感染され、そして培養物中にHTLV-1抗原を合成する（A2.1^- tax⁺Ｔ細胞）HLA-A^*0201陰性（A2.1^-）Ｔ細胞である。MJ細胞のサンプルを、一過性のワクシニアベクターを用いてHLA-A^* 0201でトランスフェクトし、そのトランスフェクトした細胞をHLA-A^*0201ポジティブ（A2.1⁺tax⁺Ｔ細胞）にした。20473細胞は、HTLV-1のTaxタンパク質をハイグロマイシン選択遺伝子（A2.1⁺tax⁺Ｂ細胞）と共に含むプラスミドの挿入によって得られたHLA-A^*0201ポジティブのトランスフェクトされたＢ細胞株である。 JY細胞は、A2.1⁺tax^-Ｂ細胞コントロールとして用いた。図４に図示されるように、HTLV-1特異的CTLは、HLA-A^*0201トランスフェクトされたMJ細胞および20473細胞の両方を認識し、そして溶解する。20:1のエフェクター：標識比において、トランスフェクトされていないMJ細胞およびトランスフェクトされたMJ細胞の溶解は、それぞれ、9.72％および39.43％であった；そして20473細胞の溶解は、JY細胞での6.64％のバックグラウンド上で55.74％であった。従って、HTLV-1ペプチドは、抗原特異的、HLA-A^*0201に拘束された様式で認識される。これらのデータは、生成されたCTLがペプチドでパルス/コートされた標的細胞のみならず、抗原を内因的に発現するか、またはウイルスに感染した（ペプチドでパルスされた細胞よりもインビボ状況により類似する）細胞も溶解することを実証する。実施例４活性化されたＴリンパ球の表現型分析実施例２および実施例３に記載されるCTLの細胞表現型分析を、培養の第34日目および第41日目について、FACSを用いて行った。図５に示す結果は、細胞の大部分がCD4⁺またはCD8⁺Ｔリンパ球のいずれかであり、検出可能な数のNK細胞、Ｂ細胞、または単球細胞は存在しなかったことを示す。単球（CD14）、NK細胞（CD 16）、またはＢ細胞（CD20）の細胞表面マーカーに対応する集団は、検出されなかった。さらに、67.9％の細胞もまた、活性化マーカーHLA-DRを発現し、このことはＴリンパ球の有意な画分が活性化され、おそらく増殖していることを示した。各細胞表面マーカーのアイソタイプコントロールの株のヒストグラムを、FACS プロフィール（黒塗りのヒストグラム）の上に重ねて示す。図6Aおよび図6Bに示すように、41日目にHLA-DRおよびCD8での二重染色は、細胞の62.2％が両方ともHLA-DR⁺およびCD8⁺であり、13.8％の細胞がHLA-DR^-しかし CD8⁺、そして4.6％の細胞がHLA-DR⁺およびCD8^-であることを示した。これは、HL A-DR発現で判断された結果、活性化された細胞の大部分が、細胞表面上でCD8分子を発現したことを示し、このことによって拡張プロトコルが抗原特異的活性化 CD8⁺Tリンパ球の選択的拡張を導くことが確証された。培養物中のCD4⁺、CD8⁺、およびHLA-DR⁺細胞の相対的な割合を、以下表３に要約する。細胞表現型分布を、培養の開始（２日目）、中間時点（34日目）、および培養の最後（41日目）に続いて、Ｔリンパ球培養物のFACS染色に続いて得た。結果は、培養が長くなるにつれ、CD8⁺Ｔリンパ球の画分の増加、およびCD4⁺Ｔリンパ球画分の減少を示す。34日目および41日目の両方において、培養物は主にCD4⁺および CD8⁺Ｔリンパ球で構成される。培養の最後でのCD8⁺Ｔリンパ球の大部分は、活性化マーカーHLA-DRを発現した。これらのデータは、これらの培養物中のCD8⁺Ｔ細胞を選択的に拡張し、強力なペプチド特異的溶解能力を有するCTLを生成する能力を示す。実施例５活性化された細胞傷害性Ｔリンパ球による HIV R Pol 464-472 ペプチドでパルスされたJY細胞の溶解材料および方法に記載するように、HIV RT Pol 464-472ペプチド（配列番号３）でパルスされたPAP細胞を用いて、CD8⁺Ｔリンパ球（CTL）を１：10の比で活性化した。培養を、4.0U/mLのIL-2を補充されたAB培養培地中で0.5×10⁶細胞/mLという接種濃度で開始した。CTLを、上述のように全21日間の、７日毎のHIV Pol 4 64-472ペプチドでパルスされた自己単球での再刺激、およびIL-2サイクリングにより拡張し、12.8×10⁶個の細胞を得た。上述のCTLを、HIV Pol 464-472ペプチドでパルスされたJY標的細胞を溶解する能力について、４時間にわたる⁵¹Cr遊離細胞傷害性アッセイにおいて、28日目に試験した（材料および方法）。図７に示す結果は、ペプチドでパルスされた標的細胞の容量応答曲線依存性抗原特異的溶解を示す。最も高いエフェクター：標識比10:1において、HIV Pol 464-472ペプチドでパルスされたJY細胞の測定された溶解は、57.9±6.9％（平均値±標準偏差）であり、パルスされていないJY細胞でのバックグラウンドの溶解は、26.9±5.6％（平均値±標準偏差）と計算された。これらの結果は、上記の実施例３で達した結論を支持し、そして抗原特異的細胞傷害性が異なるペプチドに対して生成され得ることを実証する。実施例６活性化された細胞傷害性Ｔリンパ球による MART-1 ペプチドでパルスされたJY細胞の溶解 PAP細胞をMART-1ペプチド（配列番号２）でパルスし、上記のようにCTLを活性化し拡張するために用いた。活性化されたCTLを、MART-1ペプチドでパルスされたJY標的細胞、パルスされていないJY細胞、K562細胞、Malme-3細胞（MART-1抗原を発現するA2陰性メラノーマ細胞株）、SK-MEL-28細胞（MART-1抗原を発現しないA2ポジティブ株）、およびSK-MEL-5細胞（MART-1抗原を発現するA2ポジティブ株）を溶解する能力について評価した。結果は、MART-1ペプチドでパルスされたPAPにより活性化されたCTLが、MART-1 ペプチドでパルスされたJY細胞、ならびにポジティブのコントロールSK-MEL-5細胞を、陰性コントロール細胞よりも有意に高いレベルで溶解するのに効果的であることを示す。さらに、結果は、CTLがMART-1抗原を内因的に発現する細胞を溶解し得ることを実証する。実施例７樹状細胞の三次元培養パルスまたは刺激された樹状細胞を、CTLを活性化する能力を損失することなく、三次元架橋されたコラーゲンマトリックス中に12日間まで維持した。このコラーゲンマトリックスを、４℃、pH7.2（1.0 NaOHで調整）において、３容量の「VITROGEN-100」（0.012Ｎ HCl溶液中に2.9mg/mL １型コラーゲン；Collagen C orp.，Palo ALto，CA）と１容量の４倍濃縮したAB培養培地とを混合することにより調製した。培養物中の樹状細胞を、短時間の遠心分離によりペレット化し、コラーゲン懸濁液中に分散した。次いで、得られた細胞-コラーゲン混合物を、最終のゲルの厚さが約１mmになるまでマルチウェルプレートへ流し込んだ。細胞/コラーゲン混合物を、37℃のインキュベーターへ移し、コラーゲンのゲル化を開始した。ゲル化は、代表的には15〜20分以内に起こり、コラーゲン繊維の高度に多孔性の３次元ネットワーク内に細胞を包括した。ゲル化が完了した後、培地を各ウェル内のゲル化したプラグの上に添加し、そしてその培養物を、５％CO₂インキュベーター中で37℃でインキュベートした。一連の実験において、コラーゲンゲルに包括されたPAP細胞を、HTLV-1ペプチドでパルスし、そして本質的に上記のように自己のＴリンパ球を刺激するために用いた。試薬（「パルスする」ペプチドおよびＴ細胞を含む）を、PAP細胞を含むコラーゲンプラグを浸す培地に添加した。21日の培養（上記のように、自己のペプチドでパルスされた単球、およびIL-2フィードスケジュールでの毎週の再刺激を用いた）の後、活性化されたCTLを、コラゲナーゼで消化することによってコラーゲンゲルから放出した。放出された細胞を、上記の標準的な細胞障害性アッセイにおいて用いた。Ｔリンパ球のみ（図8B）、またはPAP細胞のみ（DCと示した）（図8A）のコラーゲン包括培養をコントロールとして用いた。HTLV-1でパルスされた包括されたPAP細胞（DCと示した）によって生成されたCTLは、HTLV-1ペプチドでパルスされた標的細胞（JY）の強力なペプチド特異的溶解およびパルスされていないJY細胞の低いバックグラウンド溶解（図8C）を示した。コントロール培養物（図8Aおよび8B ）は、検出可能なバックグラウンド死滅を越えて認識可能な抗原特異的溶解を示さなかった。実施例８ HLA クラスI適合した同種異質遺伝子型のペプチドをロードされた全PAP細胞を用いた主要なペプチド特異的CTL応答の誘発 PAP細胞およびＴリンパ球画分を、HLA-A^*0201ポジティブの、HLAクラスIに適合した健常なドナーの対（ドナーＡおよびドナーＢ）のPBMCから、上記の３勾配密度精製プロトコルを用いて得た。レスポンダー（ドナーＡ）細胞および刺激者（ドナーＢ）細胞のHLAクラスI表現型分布は、それぞれ、A2、Ｘ、B7、B27、およびA1、A2、B7、B27であった。14.5％メトリザミド界面画分は、刺激者について5.8％の純度で0.52×10⁶個のPAP細胞を、そしてレスポンダーについて3.3％の純度で0.93×10⁶個のPAP細胞を生じた。両方のPAP細胞画分をHTLV-1ペプチドと共に上記のようにインキュベートし、C TL培養を開始するために用いた。レスポンダー（ドナーＡ）Ｔリンパ球（6.25× 10⁶個の細胞）を、ペプチドでパルスされたレスポンダー（ドナーＡ）および刺激者（ドナーＢ）PAP細胞と10：１の比で混合し、自己（コントロール）および同種異質遺伝子型のCTL培養をそれぞれ開始した。表現型分析は、レスポンダー（ドナーＡ）Ｔリンパ球集団は、73.3％ CD4⁺および11.1％ CD8⁺Ｔリンパ球からなることを示した。両方のＴリンパ球培養物を、HTLV-1ペプチドでパルスされたレスポンダー（ドナーＡ）単球で一週間おきに２度再刺激した。得られた培養物は、同種異質遺伝子型CTLについて8.4×10⁶個の細胞、および自己（コントロール）CTLについて8.8×10⁶個の細胞を含んだ。これらのCTLを、培養20日目にペプチド特異的溶解について試験した。結果を、図11Aおよび図11B に示す。自己（コントロール）CTL（図11A）は、HTLV-1ペプチドでコートされた標的（JY）細胞の容量応答性ペプチド特異的溶解を示した。約31％のペプチド特異的溶解（黒塗りのバー）を、検出不可能なバックグラウンド溶解上でエフェクター-標的比160：１で観察した。これは、培養中の低い頻度のペプチド特異的CT Lを示唆する。これは、CTLがナイーブ抗原に対して生成されたことを考慮に入れれば期待されないことではない。しかし、図11Bに示すように、同種異質遺伝子型ペプチドでパルスされたPAP細胞を用いて生成されたCTLは、エフェクター-標的比160：１で約35％のバックグラウンド溶解（白抜きのバー）を示し、そしてエフェクター-標的比20：１で約1 5％の溶解を生じる容量応答性を示した。このバックグラウンド溶解（白抜きのバー）は、標的細胞上に存在するアロ抗原に対して指向されるようである。しかし、ペプチドでパルスされたJY細胞を標的として用いた時には、エフェクター- 標的比160：１での60％溶解が、エフェクター-標的比20：1での30％に低下し、バックグラウンド溶解を越えるペプチド特異的溶解（黒塗りのバー）が観察された。これらの結果は、同種異質遺伝子型PAP細胞が一次免疫応答をインビトロで刺激し得ることを示す。同種異質遺伝子型および自己（コントロール）CTLの細胞の表現型の分析を、以下の表４に示す。両方のCTL株は、主にCD4⁺Ｔリンパ球からなった。これは、おそらく開始時のレスポンダーのＴリンパ球集団中の高いCD4⁺Ｔリンパ球含有率（CD8⁺/CD4比＝0. 15）の反映である。自己（コントロール）CTL株（CD8⁺/CD4⁺比＝0.21）において、3.1％のCD4⁺および41.5％のCD8⁺Ｔリンパ球が、活性化マーカーHLA-DRを発現した。対照的に、同種異質遺伝子型のCTL株（CD8⁺/CD4⁺比＝0.29）において、56 .1％のCD4⁺および83.3％のCD8⁺Ｔリンパ球が、活性化マーカーHLA-DRを発現した。同種異質遺伝子型CTL株中のCD4⁺およびCD8⁺Ｔリンパ球の両方の活性化された（HLA-DR発現の）集団のより大きな画分の存在は、高いバックグラウンド溶解を生じた同種異質遺伝子型PAP細胞によって誘導される同種抗原特異的応答に起因するようである。しかし、同種異質遺伝子型CTL株および自己（コントロール）C TL株の両方において、CD8⁺Ｔリンパ球のCD4⁺Ｔリンパ球に対する比は、0.15から 0.29および0.21にそれぞれ増加した。これは、本明細書中で記載される拡張プロトコルが、CD4⁺Ｔリンパ球よりもCD8⁺Ｔリンパ球の拡張に対して都合良い条件を導くことを示す。実施例９単一のHLAクラスＩ対立遺伝子に適合する同種異質遺伝子型ペプチドでロードされたPAP細胞を用いた主要なペプチド特異的CTL応答の誘発スタンフォード大学血液センター（Stanford，CA）でボランティアの（未知の HLA遺伝子型の）健常なドナーから調製されたバフィーコートを、HLA-A^*0201分子について特異的なFITC結合抗体（BB7.2、ATCCから購入したハイブリドーマHB- 82から生成した）を用いてFACSで分類した。HLA-A^*0201対立遺伝子を共有するバフィーコートを、単一のHLAクラスＩ対立遺伝子に適合した実験においてレスポンダーおよび刺激者として用いた。単一の対立遺伝子に適合した同種異質遺伝子型PAP細胞を用いて、上記の実施例８に記載のようにペプチド特異的CTLを生成した。代表的な実験として18日目に行った細胞傷害性アッセイからの結果を、図12Aおよび図12Bに示す。図11Aおよび11Bに示すように、白抜きのバーはバックグラウンド溶解を示し、そして黒塗りのバーはペプチド特異的溶解を示す。ペプチド特異的溶解は同種異質遺伝子型生成CTLでのバックグラウンドを越えては検出されなかった（図12B）のに対し、自己（コントロール）CTL（図12A）は強力なペプチド特異的溶解を生じたことが理解され得る。これらの結果は、複数の実験において再生された。さらに、生成されたCTL産物の表現型分析は、同種異質遺伝子型CTLの場合、高比率のCD4⁺およびCD8⁺Ｔリンパ球が活性化された（活性化マーカーHLA-DRの発現により判断した）ことを示した。例えば、図12Aおよび図12Bに示す実験の場合、自己（コントロール）CTLにおいては、1.0％のCD4⁺および4.2％のCD8⁺が活性化されたのに対し、同種異質遺伝子型CTLにおいては、49.2％のCD4⁺および42.7％のCD8⁺Ｔリンパ球がHLA-DR⁺であった。上記の結果は、同種異質遺伝子型PAP細胞が、主要なペプチド特異的免疫応答をインビトロで誘発し得るが、同種抗原に対する応答は、ペプチド特異的応答の検出をマスクし得ることを示唆する。さらに、この効果は、Ｔ細胞とPAP細胞の間の完全なHLAクラスI適合よりもむしろ、たった１つのHLAクラスI対立遺伝子が適合する場合に、より劇的であり得るようである。上記のプロトコルを２通りに改変し、これらの問題を提起する。第一に、細胞を培養中により長く維持し、そしてペプチドでパルスされた自己単球での５回の毎週の再刺激をした；そして第二に、培養条件を改変して、各再刺激後に３日間、 rIL-2の濃度を20U/mLから400〜1000U/mLの間に増加することにより、CD4⁺リンパ球よりもCD8⁺Tリンパ球の増殖のための選択的増殖の利点を提供した。２つの代表的な実験（R38およびR40）の結果を本明細書中に記載する。実験R3 8における14.5％のメトリザミド界面画分は、1.3×10⁶個の細胞を43.3％のPAP細胞純度で含んだ（0.563×10⁶個のPAP細胞を得た）のに対し、R40の画分は、11.3 10⁶個の細胞を6.4％のPAP細胞純度で含んだ（0.723×10⁶個のPAP細胞を得た）。Ｔリンパ球サブセットは、R38について64.1％のCD4⁺Ｔリンパ球および21.5％のC D8⁺Ｔリンパ球、そしてR40について41.9％のCD4⁺Ｔリンパ球および43.5％のCD8⁺ Ｔリンパ球からなった。４つのCTL培養を、レスポンダーおよび刺激者の両方として、R38およびR40 PA P細胞およびＴリンパ球を用いて開始した。R38自己（コントロール）：R38 PAP 細胞をR38Ｔリンパ球と共に；R38同種異質遺伝子型：R40 PAP細胞をR38Ｔリンパ球と共に；R40自己：R40PAP細胞をR40Ｔリンパ球と共に；そしてR40同種異質遺伝子型：R38 PAP細胞をR40Ｔリンパ球と共に。培養13日目の表現型分析は、CD4⁺ とCD8⁺Ｔリンパ球との間で以下のような分布を示した：R38自己（コントロール）について82.6％ CD4⁺Ｔリンパ球および9.7％ CD8⁺Ｔリンパ球；R38同種異質遺伝子型について72.9％ CD4⁺Ｔリンパ球および14.6％ CD8⁺Ｔリンパ球；R40自己（コントロール）について56.3％ CD4⁺Ｔリンパ球および9.3％ CD8⁺Ｔリンパ球；R40同種異質遺伝子型について78.0％ CD4⁺Ｔリンパ球および15.1％ CD8⁺Ｔリンパ球。細胞傷害性アッセイは、13日目に行われた。ここで、検出可能なペプチド特異的溶解は、どの４つのCTL株についても観察されなかった。14日目の２回目の再刺激およびそれ以降の再刺激に続いて、再刺激の３日後のIL-2濃度は、40 0〜1000U/mLに増加した。 CTL株は、以下の拡張した細胞数を含んだ：R38自己（コントロール）CTLについて85.4×10⁶個の細胞、R38同種異質遺伝子型CTLについて96.4×10⁶個の細胞、 R40自己（コントロール）CTLについて131.8×10⁶個の細胞、そしてR40同種異質遺伝子型CTLについて116.1×10⁶個の細胞。34日目に測定されたペプチド特異的溶解を、図13Aおよび図13B（R38）；および図13Cおよび図13D（R40）に示す。図から、全てのCTL株について10％未満のバックグラウンド溶解と共に、全ての４つのCTL株が強力なペプチド特異的溶解（エフェクター-標的比50:１において40％溶解より大きい）を示したことが理解され得る（バーは、図11A、11B、12A、および12Bに関して上記と同様）。以下の表５に示す同種異質遺伝子型CTLおよび自己（コントロール）CTLの細胞表現型の分析は、CD4⁺Ｔリンパ球とCD8⁺Ｔリンパ球との間で以下の分布を示した：R38自己（コントロール）について71.1％ CD4⁺ Ｔリンパ球および14.8％ CD8⁺Ｔリンパ球；R38同種異質遺伝子型について60.6％ CD4⁺Ｔリンパ球および37.1％ CD8⁺Ｔリンパ球；R40自己（コントロール）について66.0％ CD4⁺Ｔリンパ球および31.0％ CD8⁺Ｔリンパ球；R40同種異質遺伝子型について85.7％ CD4⁺Ｔリンパ球および10.8％ CD8⁺Ｔリンパ球。上記の結果は、培養条件の操作が、たった１つの対立遺伝子がPAP細胞とＴリンパ球との間で適合する場合でさえも、応答の同種抗原特異的成分の抑制およびペプチド特異的CD8⁺CTL応答の選択的拡張を可能にすることを示す。実施例１０動員された健常なドナーおよびガン患者の末梢血液由来の PAP 細胞に富化された細胞画分の単離血液サンプルを、正常な健常ボランティアドナーの全身性の顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）の動員および乳ガン患者の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の動員に続いて得た。PAP細胞画分を、実施例１に記載のように３勾配プロトコルを用いて単離し、そしてFACS分析用に、Ｔ(CD3⁺)、単球(CD14⁺ )、NK様(CD16⁺)、およびＢ-（CD20⁺）細胞系統に対して特異的な細胞表面マーカーに対するPE結合モノクローナル抗体（mAb）、そしてHLAクラスIIのDR対立遺伝子（PAP細胞の活性化マーカー）に対するFITC結合mAbを用いて染色した。FACSプロフィールを、健常なドナーおよび乳ガンのドナーそれぞれについて、図14および図15に示す。乳ガンドナー由来のPAP細胞を富化された画分（MEP、IOEPまたは約14.5％メトリザミドの界面）は、4.1％および5.8％の樹状細胞で8.0×10⁶個および6.0×10⁶ 個の細胞を含み、それらはそれぞれ非接着性および接着性培養（図14）から0.33 ×10⁶個および0.35×10⁶個の樹状細胞を生じ、合計で0.68×10⁶個の樹状細胞を１単位（約500mL）の全血から生じた。健常なG-CSF動員ドナーからのPAP細胞を富化された画分は、8.2％の樹状細胞で8.7×10⁶個の細胞を含み、１単位の全血から0.72×10⁶個の樹状細胞を生じる（図15）。正常な（非動員の）健常なボランティアのドナーから得たPAP細胞を富化された画分中の樹状細胞の平均の純度は、15.4±10.1％（平均値±標準偏差）であり、１単位の全血から0.9±0.7×10⁶ （平均値±標準偏差）個の樹状細胞を生じる。これらの結果は、動員された健常なドナーおよび動員されたガン患者から得られた樹状細胞の純度および数が、健常な動員されていないドナーから得たものと類似であることを示す。実施例１１混入している系統ポジティブ細胞のネガティブ除去を用いる PAP 細胞画分からの樹状細胞の富化 PAP細胞を富化させた画分を、正常で健常なボランティアドナーの末梢血液から、実施例１に記載の３勾配プロトコルを用いて得た。MEP界面は、4.9×10⁶個の細胞を含んだ。このうち、16.3％（0.80×10⁶個）は樹状細胞であった。界面の細胞を、さらに３つの部分に分割し、そしてＴ細胞（CD4⁺またはCD8⁺）または単球（CD14）のいずれかの細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体（mAb ）でコートしたビーズと共にインキュベートした。得られた細胞およびビーズの懸濁液をFEP密度勾配の上に重層し、そして遠心分離した。mAbでコートされたビーズに結合した細胞はペレットとして沈降し、そしてそれらを捨てた。未結合の細胞を収集し、計数し、そしてFACSで樹状細胞の含有量について分析した。分析は、この細胞画分が実質的に樹状細胞について富化されたことを示した。合計約1.68×10⁶個の細胞が回収され、約49.5％（0.83×10⁶個）が樹状細胞であった。結果を図16にプロットした。この富化工程の前および後のDCの全数が、本質的に一定のままであったことに注目されたい。これはこのような固体支持体ベースの方法が、樹状細胞の調製物を、樹状細胞の実質的な損失を招くこと無しに顕著に富化するために用いられ得ることを示す。実施例１２腫瘍またはウイルス特異的抗原でのPAP細胞画分のローディングは、主要な抗原特異的増殖性および細胞傷害性の免疫応答の誘発をもたらす PAP細胞を富化させた画分を、正常で健常なボランティアのドナーからの末梢血液から、実施例１に記載の３勾配プロトコルを用いて得た。MEP（またはIOMEP または14.5％メトリザミド）分離のペレットの細胞画分を、未変化（全Ｔ細胞）のＴリンパ球またはCD4でコートされた磁気ビーズでのCD4⁺細胞の除去後のＴリンパ球（CD8⁺Ｔ細胞について富化された）のいずれかの供給源として用いた。細胞のこれらの２つのレスポンダー集団（全Ｔ細胞およびCD8⁺Ｔ細胞）を、増殖性および細胞傷害性の応答誘発のためのその後のアッセイに用いた。 PAP細胞で富化された画分を、37℃での１時間のインキュベーションにより抗原でパルスした。用いられた抗原は、ナイーブ抗原（スカシガイのヘモシアニン；KLH）または記憶抗原（インフルエンザマトリックスタンパク質；IMP）のいずれかである。ナイーブ抗原は、以前に免疫系により遭遇されていない抗原であるのに対し、記憶抗原は免疫系の細胞が、その抗原に感染または接種により予め曝されている抗原である。IMP（INFペプチド）からのHLA-A2拘束ペプチドをコントロールとして用いた。なぜなら、本発明の支持で行われた他の実験が、ペプチドでパルスしたPAP細胞画分が、ペプチド特異的CD8⁺細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL ）応答を生成し得ることを実証したからである。例示的な実験において、PAPを富化された細胞をFACSで表現型に分類し、13.84 ％の樹状細胞を含むことを見出した（系統マーカーCD3、CD14、CD16、CD20について陰性、そして活性化マーカーHLAクラスIIDR対立遺伝子の発現についてポジティブであることが判断された；実施例１を参照のこと）。これらの細胞を抗原、KLH、またはINFペプチドのいずれも無しでロードし、レスポンダー細胞（全Ｔ細胞またはCD8⁺Ｔ細胞）と、レスポンダーＴ細胞に対する種々の抗原提示細胞の比（２倍連続希釈で１：２から１：128まで）で混合した。得られた培養物を96 ウェルの培養プレート中で、200μLの５％ヒトAB血清を補充された培地中でウェル当たり10⁵個のレスポンダーＴ細胞濃度で播種し、37℃で５％CO₂の大気インキュベーター中で５日間インキュベートした。５日目に、96ウェルの培養プレート中の各ウェルを、0.5μCi/ウェルのトリチウム化チミジン（³H-TdR）でパルスした。プレートを６日目に収集し、そして取り込まれた³H-TdRの量をβプレートシンチレーションカウンターで測定した。図17A、17B、および17Cに図示される結果は、レスポンダー細胞（全Ｔ細胞およびCD8⁺Ｔ細胞の両方）が抗原でロードされたPAP細胞を富化させた画分での刺激に応答して増殖し得ることを示す。レスポンダー細胞増殖を、記憶抗原およびナイーブ抗原の両方に対して検出した。これらの抗原はそれら自体ではＴ細胞増殖性応答を刺激せず、従って、抗原提示細胞の表面に提示される必要があることに注意されたい。これらの結果はさらに、PAP細胞を富化させた画分が強力な免疫刺激性能力を有する細胞を含むことを確認する。さらに、この用量依存性、抗原特異的増殖を、全Ｔ細胞（CD4⁺およびCD8⁺Ｔ細胞）およびCD8⁺Ｔ細胞（CD4⁺を除去された全Ｔ細胞）の両方について検出した。これは、抗原でロードされたPA P細胞を用いる誘発で発生された免疫応答が、HLAクラスIおよびHLAクラスII経路の両方を介して媒介されたことを示す。可溶性抗原（全タンパク質）に応答するＴ細胞増殖は、主にHLAクラスII媒介であると一般的に考えられているが、本明細書中で示される結果は、抗原がPAP細胞を富化させた画分中の抗原提示細胞によって提示される場合には、CD4除去Ｔ細胞（主にCD8⁺Ｔ細胞）でさえも、可溶性タンパク質抗原に応答して増殖し得ることを示す。これらの観察は、上記の実験と類似であるが、さらなるコントロール（これにより、HLAクラスＩ特異的モノクローナル抗体であるW6/32でのブロッキングの存在下で増殖応答が測定される）を含む実験の結果により支持された。CD4を除去されたＴ細胞（CD8⁺Ｔ細胞）をレスポンダー細胞として用い、インフルエンザマトリックスタンパク質（IMP）を抗原として用い、そしてIMPでロードされたPAP 細胞を、刺激者対レスポンダーの比を０、１：２、１：８、および１：32で、刺激者として用いた。図18に示す結果は、CD8⁺Ｔ細胞について得られた増殖性応答がW6/32の存在下でブロッキングされ得ることを示す。これは、抗原でロードされたPAP細胞を用いる可溶性抗原に対して発生した免疫応答が、HLAクラスIおよびHLAクラスII経路の両方を介して媒介されるという観察を確認する。抗原でロードされたPAP細胞により誘発される免疫応答は、CD4⁺Ｔ細胞およびC D8⁺Ｔ細胞の増殖によって検出されるように、CD4ヘルパー応答およびCD8細胞傷害性応答の発生に帰するべきである。CD4応答を発生するために可溶性抗原を用いる技量は、文献中に十分に記載されている。実験を、CD8増殖性応答が抗原特異的CD8⁺CTLの確立に帰するかどうかを評価するために設計した。上記のように得られたPAP細胞画分を、INFペプチド、不活性化されたインフルエンザウイルスからなるインフルエンザワクチン、またはインフルエンザマトリックスタンパク質（IMP）のいずれかでロードした。いかなる抗原でもロードされていないPAP細胞を、コントロールとして用いた。抗原でロードされたPAP細胞を自己Ｔリンパ球と共に混合し、実施例２に記載のようにCTL培養を開始するために用いた。抗原でロードされたPAP細胞での刺激の１週間後に、フィトヘマグルチニン（PHA）およびインターロイキン（IL-2）を用いて、培養物を非特異的に１週間拡張した。得られた細胞を、材料および方法および実施例３に記載のように、標準的な４時間クロミウム遊離細胞傷害性アッセイにおいて試験した。JY 細胞、HLA-A^*0201対立遺伝子を発現するＢ細胞株を、標的細胞として用いた。抗原特異的溶解を、パルスされていないJY細胞のバックグラウンド死滅に対するIN FペプチドでパルスしたJY細胞の死滅として測定した。さらに、W6/32でのブロッキングを用いて、細胞障害性が、CD8⁺Ｔ細胞に起因し得ること、およびエフェクター細胞と標的細胞との間のHLAクラスI相互作用によって媒介されることを確認した。図19Aおよび図19Bに示す結果は、INFペプチド、不活性化インフルエンザウイルス、およびインフルエンザマトリックスタンパク質（IMP）でロードされたPAP細胞で刺激されたT細胞株による強力なINFペプチド特異的溶解を示す。さらに、結果は、抗原特異的溶解が、HLAクラスI分子に対するモノクローナル抗体 W6/32によってブロックされたことを示す。これは、この溶解がCD8⁺CTLによって媒介され、そしてHLAクラスIで拘束されることを確認した。これらをまとめて、図17A-C、18、19A、および19Bに示す結果は、HLAクラスI およびHLAクラスIIで媒介される増殖性、細胞傷害性Ｔ細胞応答の両方が、抗原でロードされたPAP細胞を用いて、記憶およびナイーブ抗原に対してインビトロで生じ得ることを実証する。本発明は特定の方法および実施態様に関して記載されているが、種々の改変および変化が本発明から逸脱せずになされ得ることが理解される。

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト血液サンプルから強力な抗原提示(PAP)細胞を得るための方法であって、該強力な抗原提示細胞が、 (i)表面抗原HLA DRに関してポジティブであり、そして表面抗原CD3、CD14、CD16 、およびCD20に関してネガティブである表現型、および (ii)培養物中でヒトリンパ球と共培養される場合、一次および二次の免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられ、該方法が、該血液サンプルから末梢血リンパ球および樹状前駆細胞を含む細胞画分を得る工程；該細胞画分を、樹状前駆細胞において樹状細胞の形態を有する細胞への形態学的変化を生じるために十分な期間無血清培地中で培養する工程；該培養工程によって生じた非接着細胞を採集する工程；および PAP細胞に富む画分を得るために、該採集された細胞中の樹状細胞部分を、密度遠心分離により富化する工程、を包含する、方法。２．前記血液サンプルから得られる、末梢血リンパ球および樹状前駆細胞を含む前記細胞画分が、単球を除去された細胞画分であり、そして前記培養工程がサイトカインの添加なしに行われる、請求項１に記載の方法。３．前記得る工程が、 (i)まず、前記血液サンプルに、密度遠心分離によって末梢血単核細胞を富化させる工程、および (ii)(i)の生成物に、密度遠心分離によってリンパ球および樹状前駆細胞を富化させる工程、を包含する、請求項１または２に記載の方法。４．前記富化工程(ii)が、前記(i)の生成物を、1.0650±0.0010g/mLの密度および300±15mOsmの浸透圧モル濃度を有する分離媒体上に重層することによって行われる、請求項１または２に記載の方法。５．前記培養工程が、AIM-Vまたはマクロファージ無血清培地中で少なくとも2 4時間行われる、請求項１から４までのいずれかに記載の方法。６．前記富化工程が、前記採集された非接着細胞を、1.0800±0.0010の密度および540±25mOsmの浸透圧モル濃度を有する分離媒体上に重層することによって行われる、請求項１または２に記載の方法。７．前記富化工程が、前記採集された非接着細胞を、1.0550±0.0010の密度および290±15mOsmの浸透圧モル濃度を有する分離媒体上に重層することによって行われる、請求項１または２に記載の方法。８．前記富化工程に続いて、前記PAPを富化させた画分中の細胞を、CD3、CD4 、CD8、CD14、CD16、およびCD20からなる群から選択される少なくとも１つの細胞表面表現型マーカーに対する抗体を結合された固相支持体と接触させる工程、および該固相に結合する該画分中の細胞を取り除く工程をさらに包含する、請求項１または２に記載の方法。９．前記固相支持体が、CD3、CD14、CD16、およびCD20に対する抗体を結合されている、請求項８に記載の方法。１０．前記固相支持体に結合している細胞を取り除いた後に残る細胞が、50％を超える樹状細胞である、請求項９に記載の方法。１１．培養物中の前記PAP細胞の分化状態および抗原提示能力を、延長された培養期間の間、保持することにおいて使用するための請求項１０に記載の方法であって、前記PAPを富化させた画分由来の細胞を三次元マトリクス中にエントラップする工程をさらに包含する、方法。１２．前記三次元マトリクスが架橋したコラーゲンマトリクスである、請求項１１に記載の方法。１３．強力な抗原提示(PAP)細胞を含む細胞組成物であって、該強力な抗原提示細胞が、ヒト血液サンプルから、単球を除去された、末梢血リンパ球および樹状前駆細胞を含む細胞画分を得る工程、該細胞画分を樹状前駆細胞において樹状細胞の特徴を有する細胞への形態学的変化を生じるために十分な期間無血清培地中で培養する工程、該培養工程によって生じた非接着細胞を採集する工程、および PAP細胞に富む画分を得るために、該採集された細胞中の樹状細胞部分を、密度遠心分離により富化する工程、により調製され、そして (i)表面抗原HLA DRに関してポジティブであり、そして表面抗原CD3、CD14、CD16 、およびCD20に関してネガティブである表現型、および (ii)三次元マトリクス中にエントラップされた、培養物中でヒトリンパ球と共培養される場合、一次および二次の免疫応答を誘発する能力、によって特徴づけられる、組成物。１４．前記三次元マトリクスが架橋されたコラーゲンマトリクスである、請求項１３に記載の組成物。１５．前記培養工程がサイトカインの添加なしに行われる、請求項１３または１４に記載の組成物。１６．前記エントラップされた細胞が、少なくとも10％のPAP細胞を含む、請求項１３から１５のいずれかに記載の組成物。１７．前記エントラップされた細胞が、少なくとも50％のPAP細胞を含む、請求項１３から１５のいずれかに記載の組成物。１８．前記マトリクス中のPAP細胞が、選択された抗原の提示について改変されている、請求項１３から１７のいずれかに記載の組成物。１９．前記選択された抗原が、病原体抗原または腫瘍抗原を含む、請求項１８に記載の組成物。２０．前記選択された抗原が、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的膜抗原、および前立腺特異的抗原からなる群から選択される前立腺組織特異的腫瘍抗原である、請求項１９に記載の組成物。２１．前記選択された抗原が、p53、ガン胎児性抗原(CEA)、HER2、MART-1およびp21RASからなる群から選択される腫瘍抗原である、請求項１９に記載の組成物。２２．前記選択された抗原が、ペプチドMART-1 27-35 Pep(配列番号２)である、請求項２１に記載の組成物。２３．前記選択された抗原が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)pol、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ(HTLV-1)taxおよびインフルエンザマトリクスタンパク質(IMP)からなる群から選択されるウイルス性病原体抗原である、請求項１９に記載の組成物。２４．前記選択された抗原が、ペプチドHIV Pol 464-472 Pep(配列番号３)またはペプチドHTLV-1 Tax 11-19 Pep(配列番号１)である、請求項２３に記載の組成物。２５．既知の腫瘍特異的または病原体特異的な抗原を有する腫瘍または病原体に対して被験体を免疫する方法であって、該被験体から、 (i)表面抗原HLA DRに関してポジティブであり、そして表面抗原CD3、CD14、CD16 、およびCD20に関してネガティブである表現型、ならびに (ii)培養物中でヒトリンパ球と共培養される場合、一次および二次の免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられる強力な抗原提示(PAP)細胞について富化させた血球画分を単離する工程、該PAP細胞を三次元の生体適合性マトリクス中にエントラップする工程、該エントラップする工程の前または後に、該マトリクスにエントラップされる PAP細胞を、前記選択される抗原でパルスする工程、および該被験体のリンパ球を該マトリクスに曝す工程、を包含する、方法。２６．前記単離する工程が、ヒト血液サンプルから、末梢血リンパ球および樹状前駆細胞を含む細胞画分を得る工程、該細胞画分を、無血清培地中で、樹状前駆細胞において樹状細胞の特徴を有する細胞への形態学的変化を生じるに十分な期間培養する工程；該培養工程によって生じた非接着細胞を採集する工程；および PAP細胞に富む画分を得るために、該採集された細胞中の樹状細胞部分を、密度遠心分離により富化する工程、を包含する、請求項２５に記載の方法。２７．前記血液サンプルから得られた、末梢血リンパ球および樹状前駆細胞を含む前記細胞画分が、単球を除去された細胞画分である、請求項２６に記載の方法。２８．前記培養工程が、サイトカインの添加なしに行われる、請求項２６または２７に記載の方法。２９．前記曝露工程が、前記マトリクスを前記被験体に注射する工程を包含する、請求項２６から２８のいずれかに記載の方法。３０．前記曝露工程が、前記被験体から細胞傷害性Ｔリンパ球を取り出す工程、該リンパ球を前記マトリクスとエクスビボで接触させる工程、および該接触させたリンパ球を該被験体の血流に戻す工程を包含する、請求項２６から２８のいずれかに記載の方法。