JPH11509401A

JPH11509401A - Analogues of Haemophilus Hin47 with reduced protease activity

Info

Publication number: JPH11509401A
Application number: JP8505329A
Authority: JP
Inventors: エム．ルースモア、シーナ; ヤング、ヤン−ピン; チョン、ペレ; ピー．ウーメン、レイモンド; エイチ．クライン、マイケル
Original assignee: コノートラボラトリーズリミテッド
Priority date: 1995-07-21
Filing date: 1995-07-21
Publication date: 1999-08-24
Anticipated expiration: 2015-07-21
Also published as: JP4184430B2

Abstract

(57)【要約】プロテアーゼ活性が天然Ｈｉｎ４７タンパク質の１０％以下であり、その免疫原性が実質的に天然Ｈｉｎ４７タンパク質と同じである分離・精製したHaemophilus influenzae菌由来Ｈｉｎ４７タンパク質類似体。細胞に導入されて、その増殖によりＨｉｎ４７タンパク質の類似体を産生する組み換えプラスミドに供給されるＨｉｎ４７タンパク質の類似体をコードする分離・精製した核酸分子。ワクチンとして調製され、ヒトを含む宿主へのインビボ投与に使用された場合に、Ｈｉｎ４７タンパク質または宿主内でＨｉｎ４７タンパク質と特異的に反応する抗体の産生を誘起できるタンパク質を合成するHaemophilus influenzaeのようなHaemophilus菌種を含む細菌性病原菌が原因で発症する病気に対する防御作用があるＨｉｎ４７タンパク質類似体から成る免疫原性物質およびコーデングする核酸。このＨｉｎ４７タンパク質類似体およびそれをコーデングする核酸は診断分野に適用可能。 (57) [Summary] An isolated and purified Haemophilus influenzae-derived Hin47 protein analog having a protease activity of 10% or less of that of the natural Hin47 protein and having the same immunogenicity as the natural Hin47 protein. An isolated and purified nucleic acid molecule encoding an analog of Hin47 protein which is introduced into a cell and supplied to a recombinant plasmid which upon proliferation produces an analog of Hin47 protein. Haemophilus, such as Haemophilus influenzae, that synthesizes a Hin47 protein or a protein capable of inducing the production of antibodies that specifically react with the Hin47 protein in the host when prepared as a vaccine and used for in vivo administration to a host, including a human. An immunogenic substance comprising a Hin47 protein analog having a protective effect against a disease caused by a bacterial pathogen including a bacterial species, and a coding nucleic acid. This Hin47 protein analog and the nucleic acid encoding it are applicable in the diagnostic field.

Description

【発明の詳細な説明】プロテアーゼ活性低下型のHaemophilus Ｈｉｎ４７の類似体発明の分野本発明は免疫学の分野の、特に、Haemophilus属の菌種から生産される免疫原および抗原に関する。関連出願のリファレンス本出願は１９９４年８月２６日申請の米国特許出願番号０８／２９６、１４９の一部継続出願であり、これ自体は１９９４年７月２１日申請の米国特許出願番号０８／２７８、０９１の一部継続出願である。発明の背景 Haemophilus influenzae（ヘモフィルス属インフルエンザ菌）は、ヒトに、髄膜炎、喉頭蓋炎、肺炎、中耳炎などの種々の病気を発症させる微生物である。H. influenzae菌のｂ型（Ｈｉｂ）は、５才以下の小児における細菌性髄膜炎の主な原因菌である。この病気の防御抗体は微生物の夾膜多糖から誘導して生産するが、その場合、精製した燐酸ポリリボシル・リボトール（ＰＲＰ）を抗原に使って製造したワクチンが開発されている。このワクチンの免疫効果は成人では９０％であり、生後２４カ月の小児では２４％以上であるが、生後２４カ月以下の小児には免疫効果はない（Zangwill et al，1994)。（リファレンスは本申請の最後に示した参考文献リストに示してあり、そのリストの中の各参考文献はそれ自体で完結された形になっており内容が分かるので、それ以上の別の文献を必要としないようになっている。）他の多糖タンパク由来の抗原と同様に、このＰＲＰではＴ−ヘルパ細胞の増殖はなく、再免疫が二次免疫応答や記憶細胞の増加を誘発するようなことはない。ＰＲＰ多糖と蛋白質キャリアーが接合されることで、ワクチンにＴー細胞からの独立特性が付与され、実質的に、ＰＲＰ抗原に対する免疫応答力が強化されることになる。最近では、４種類のＰＲＰーキャリア・接合ワクチンが入手可能である。これらのワクチンはいずれも、Haemophilus influenzae菌のｂ型・夾膜多糖がジフテリア類毒素、破傷風類毒素、または、Neisseria meningtidis（髄膜炎菌）外層膜タンパク質と接合したものをベースにしている。これらのHaemophilus influenzae菌ｂ型接合ワクチンは細菌性髄膜炎の発症を劇的に減少させることに成功している(Schoendorf et al，1994)。 Haemophilus influenzae菌の血清型はａからｆまでの６種類があり、その夾膜多糖の種類により識別する。最近のHaemophilus菌由来接合型ワクチンは、他の侵襲型のタイプ分けが可能な菌株（ａおよびｃ型）に対し防御力がない。もっと重要なことは、これらのワクチンが、産後の敗血症、新生児の敗血症、肺炎、中耳炎の通常の原因菌であるタイプ分けが不可能な菌株（ＮＴＨｉ）に対しての防御力がないことである。中耳炎は低年齢の小児がかかる最もありふれた病気であり、すべての小児の約７０％が７才までに少なくとも一回はこの病気を経験する。この中耳炎が慢性化すると小児の聴覚障害、言語障害、知覚障害の原因となる。この中耳炎の原因の約５０％はStreptococcus pneumoni ae（肺炎連鎖球菌）による感染、約３０％がHaemophilus influenzae（ヘモフィルス属インフルエンザ菌）のタイプ分けが不可能な菌株が原因であり、残り約２０％はMoraxella(Branhamella)catarrhalis菌による感染が原因である。米国だけでも、中耳炎の治療費は年間１０億から２０億ドルに上り、抗生物質、扁桃摘出やアデノイド切除、鼓膜切開手術の費用に使われているのである。H．influen zae菌が関係する病気に対する普遍的な防御法として、特に、２才から６才までの小児、その他のハイリスク群を守る方法として、保存的で、非対応、非夾膜型のH．influenzae菌由来の免疫原の供給が待たれていたところである。H．influe nzaeのタイプ分けが不可能な菌株は高齢者や、特に、呼吸器系の感染を受け易いヒトにおける肺炎の重要な病原菌でもある。このように、H．influenzae菌由来の抗原に対する需要があり、それが供給されれば、H．influenzae菌の多くの血清型に対しての防御能のある免疫薬剤の成分として利用できることになるのである。１９９２年７月９日公開のＰＴＣ出願ＷＯ・９２／１０９３６（レファレンスとして当該申請書にも掲載）には、このH．influenzae菌から得られた分子量４７、０００の外層膜タンパク質について触れており、アドヘシンであるとして報告されており、Ｈｉｎ４７と命名され、H．influenzae菌からの単離体で、免疫学的には、このH.influenzaeはタイプ分け不可能な菌とｂ型との中間に位置するとしている。遺伝子コーディングされたＨｉｎ４７におけるアミノ酸の配列とヌクレオチドの塩基配列は、１９９２年５月２６日から３０日まで米国ニューオリンズで開催された全米微生物学会で発表されている。これらの配列については、１９９４年１月６日に公開されたＰＣＴ申請ＷＯ・９４／００１４９にも発表されており、本申請書でもレファレンスとして掲載している。このＨｉｎ４７タンパク質はHaemophilus influenzae菌株由来のタンパク質のひとつとして分類され、アドヘシンであると報告されているので、Haemophilusi nfluenzae菌が原因で発症した病気やＨｉｎ４７を産生するようなその他の細菌性病原体が原因となっている病気の診断やワクチンとして利用できるし、さらに、Ｈｉｎ４７に特異的に反応する抗体の産生を誘起できるタンパク質として利用できるのである。このＨｉｎ４７タンパク質を抗原として、抗ーＨｉｎ４７抗体を産生を誘起させるタンパク質として診断で使用する場合には、デメリットもある。つまり、これは、本申請者が予期せずして偶然に発見したことであるが、このＨｉｎ４７にはプロテアーゼ活性があり、そのために、Ｈｉｎ４７内で自己消化が起こり、その中に混入している他の抗原のタンパク質分解を起こすことである。そこで、抗原として使用できるようにするために、あるいは、ワクチンのような免疫剤や他の免疫原のキャリアーとして、あるいは、診断薬の生産用として使用できるようにするためには、このタンパク質分解活性を減少させたＨｉｎ４７タンパク質類似体を合成し供給することが望まれる（ここでは、このＨｉｎ４７タンパク質類似体を突然変異体または誘導体と呼ぶ場合もある）。発明の要約本発明の目的は、プロテアーゼ活性を低下させたHaemophilus菌由来のＨｉｎ４７タンパク質類似体を供給することである。本発明の態様の一つは、分離・精製したHaemophilus菌由来のＨｉｎ４７タンパク質類似体を供給することであり、その類似体のプロテアーゼの活性を自然界に存在する天然のＨｉｎ４７の活性の約１０％にまで低下させたものである。このＨｉｎ４７類似体は、本質的に、天然のＨｉｎ４７タンパク質と同じ免疫原性を持っていることが望ましい。本発明で供給する類似体は、天然のＨｉｎ４７を化学的、生化学的方法または遺伝子修飾を加えることで合成・生産する。本発明の実施例では、遺伝子修飾により合成させる場合に、そのプロテアーゼ活性を低下させるために、プロテアーゼ活性を起こさせている天然Ｈｉｎ４７の中の少なくとも一個のアミノ酸を除去するか、または、別のアミノ酸で置換する。さらに、このプロテアーゼ活性を低下させるための別の方法として、少なくとも１個のアミノ酸を天然のＨｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列に挿入する。除去されるか、または、置換される少なくとも一個のアミノ酸は、天然Ｈｉｎ４７の中にあるアミノ酸１９５から２０１までの中の一つが選択されるが、特に、セリンー１９７が除去されるか、別のアミノ酸であるアラニン、システイン、トレオニンで置換される。さらに、除去されるか、または、置換される少なくとも一個のアミノ酸として、Ｈｉｓー９１があり、これは除去するか、アラニン、シンン、アルギニンで置換する。除去されるか、または、置換される少なくとも一個のアミノ酸として、Ａｓｐー１２１があり、これは除去するか、アラニンで置換する。さらに、別の方法として、天然Ｈｉｎ４７分子の中の複数のアミノ酸を除去または置換させることでも生産できる。複数のアミノ酸として、Ｈｉｓー９１およびセリンー１９７があり、これらを除去するか、Ａｌａー９１およびＡｌａー１９７で置換することによって、Ｈｉｎ４７類似体タンパク質であるＨ９１Ａ／Ｓ１９７Ａを合成・生産できる。さらに、複数のアミノ酸として、Ｈｉｓー９１、Ａｓｐー１２１、Ｓｅｒー１９７があり、これらも除去するか、Ａｌａー１２１およびＡｌａー１９７で置換することによって、Ｈｉｎ４７類似体タンパク質であるＨ９１Ａ／Ｄ１２１Ａ／Ｓ１９７Ａを合成・生産できる。この発明で供給されるＨｉｎ４７類似体のうちのいくつかについて、その特性要約を表３に示した。Ｈｉｎ４７の突然変異体であるＤ１２１Ｅだけには、実質的なプロテアーゼ活性が残っていることを示している。本発明の別の態様として、分離精製した核酸分子を供給する。この核酸分子は、Haemophilus influenzaHin 47タンパク質をコーディングするHaemophilus inf luenza hin 47の突然変異遺伝子から成っており、そのプロテアーゼ活性は天然Ｈｉｎ４７タンパク質の１０％以下に低下したものになっている。この突然変異 hin47遺伝子は上記のＨｉｎ４７類似体のいずれの型のタンパク質もコードする。この突然変異遺伝子は野生型hin47遺伝子の部位特異的突然変異誘発により産生されることが望ましい。この核酸分子は、宿主の形質転換に使用される組み換えプラスミドに挿入される。ここで使用されるプラスミドはＤＳー１０１１ー１ー１であり、これは１９９４年７月２７日付けでメリーランドのロックビルにある米国微生物寄託機関に承認番号７５８４５として寄託されている。本発明は、そのような形質転換細胞に組み込まれる組み換えプラスミドも供給するものである。本発明の別の態様として、プロテアーゼ活性が天然Ｈｉｎ４７タンパク質の１０％まで低下した活性低下型のHaemophilus influenzae菌由来Ｈｉｎ４７タンパク質類似体の生産方法を提供する。その方法には、プロテアーゼ活性を起こさせている天然Ｈｉｎ４７タンパク質中の少なくとも一個のアミノ酸残基を同定すること、少なくとも一個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を除去または置換させ、さらに、突然変異体のhin47遺伝子を産生させるために、突然変異遺伝子hin47の部位特異的突然変異誘発を起こさせること、その突然変異遺伝子hin47 を細胞に取り込み、細胞に形質転換をおこさせ、それを増殖させることで、目的とするＨｉｎ類似体タンパク質を産生させる方法を含む。ここで選択される少なくとも一個のアミノ酸は、Ｈｉｎ４７類似体に関して上記で同定されたアミノ酸のうちのいずれかである。突然変異遺伝子hin47の細胞への取り込みにより細胞の形質転換が起こさせることが望ましい。形質転換細胞の中では突然変異遺伝子hin47は、Ｔ７プロモータの制御を受けるが、その形質転換細胞の増殖と、Ｔ７プロモーターによるＨｉｎ４７類似体の発現誘発は、誘発濃度に調製したラクトース培地での培養によることが望ましい。さらに、細胞の形質転換のための突然変異遺伝子hin47の細胞への取り込みは、組み換えプラスミドＤＳー１０１１ー１ー１（ここでは、これをプラスミドpT7／hin47と呼ぶ。）を使用することが望ましい。さらに、発明の態様として、本発明は分離・精製したＨｉｎ４７類似体を供給する方法を提供する。その方法にはＨｉｎ４７類似体を合成させるための上記の各手順を実施することを含む。その手順として、Ｈｉｎ４７類似体を含む顆粒画分から成る増殖させた形質転換細胞を、その上澄み液とその顆粒画分とを分離するためにその細胞を破壊すること、さらに、Ｈｉｎ４７類似体を含むる顆粒画分を溶解させ、その溶液をクロマトグラフィーを使って溶液部分を細胞砕片部分から分離して、Ｈｉｎ４７を精製すること、さらに精製したそのＨｉｎ４７類似体を分離することが含まれる。この発明で供給されるタンパク質活性低下型のＨｉｎ４７の類似体は、免疫原性組成における抗原として、別の免疫原のキャリアーとして、あるいは、診断薬の原料として有用である。同様に本発明で供給される核酸分子も、診断用プローブとして、あるいは、広く免疫分野の診断道具として有用である。発明のさらに別の態様として、本発明は、免疫効果を発揮できるだけの量のＨｉｎ４７類似体、または、Ｈｉｎ４７類似体をコードする遺伝子を含む核酸分子から成る免疫原性組成物質を供給する。この免疫原性組成物質は、ヒトを含む宿主に対するインビボ投与用のワクチンとして調製できる。このワクチンは、Ｈｉｎ４７を産生する、または、Ｈｉｎ４７に特異的に反応する宿主内抗体の産生を誘起できるタンパク質を産生するような細菌性病原体が原因で発症した病気に対しての防御手段として使える。この細菌性病原体として、Haemophilus influenz ae菌のようなHaemophilus菌種がある。本発明の免疫原性組成物質には、アジュバントのような、少なくも一個の別の免疫原性物質または免疫刺激物質から成る。さらに追加の実施例として、本発明のＨｉｎ４７類似体をコードする遺伝子から成る核酸分子は、ポックスウイルス、Salmonella（サルモネラ）、ポリオウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスまたはＢＣＧのような生存ベクターに含まれている。本発明には、ヒトを含む宿主に免疫応答を起こさせる方法も含まれる。その方法として、本発明の免疫原性組成物質を、免疫効果の期待できる量をこの宿主に接種することを含む。上述したように、このＨｉｎ４７類似体は診断領域でも使用可能である。従って、発明の追加態様として、検体中にＨｉｎ４７に特異的に反応する抗体が存在しているかどうかを検査する方法を提供する。その方法には下記の手順を含む。（ａ）検体を、実質的に天然のＨｉｎ４７タンパク質と同じ免疫原性を持つＨｉｎ４７類似体と接触させ、その結果、Ｈｉｎ４７類似体と、検体中に存在しＨｉｎ４７と特異的に反応する抗体との複合物質を産生させること、および（ｂ）この複合物質の産生を確認すること。本発明は検体中にＨｉｎ４７が存在するかどうか検出する方法を含む。その方法は下記の手順から成る。（ａ）本発明での免疫原性組成物質で被検対象を免疫感作してＨｉｎ４７タンパク質に特異的に反応する抗体を産生させること、（ｂ）被検対象をこの抗体と接触させる、その結果、被検対象に存在するＨｉｎ４７と抗体に特異的に反応するＨｉｎ４７から成る複合物質を産生させること、（ｃ）この複合物質の産生を確認すること。この発明には診断キットの供給を含む。これは検体中に、Ｈｉｎ４７に特異的に反応する抗体があるかどうかを診断するもので、下記の物質と方法を含む。（ａ）本発明で供給される天然のＨｉｎ４７タンパク質と本質的に同じ免疫原性を有するＨｉｎ４７類似体であること、（ｂ）この類似体と検体中に含まれる抗体との複合物質を産生できるように、この類似体を被検対象と接触させる方法、および、（ｃ）その複合物質の産生を確認する方法。図面の簡単な説明図１は、プラスミドであるＪＢー１０３１ー１ー１４およびＪＢー１０６８ー２ー２の制限酵素地図と塩基配列分析のための構造図である。図２は、H.influenzae菌株由来ＳＢ３３から生産したＨｉｎ４７の完全なヌクレオチド塩基配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）とアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）および、部分的ヌクレトチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）と部分的アミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）である。後者はＡＳＭ会議で発表された資料を本発明者がコピーしたものである。図３は、H.influenzae Hin47（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、E.coli（大腸菌）株のhtrA（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、Salmonella typhimurium（ネズミチフス菌）株のhtrA（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）のアミノ酸配列を比較したものである。図４は、既知のプロテアーゼを有するＨｉｎ４７のアミノ酸残基の５７から２５６までの配列（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：７から１６）である。コードは下記の通り。ＴＯＮ：ラットのトニン、ＰＫＡＡＢ：カリクレイン、ＰＴＮ：トリプシン、ＣＨＡＡ：キモトリプシン、ＥＳＴ：エラスターゼ、ＲＰ２Ａ：ラットのマスト細胞プロテアーゼ、ＳＧＴ：Streptomyces griseus （ストレプトミセス・グリセウス）トリプトシン、ＳＧＢＥ：Streptomyces gri seusプロテナーゼＡ、ＳＧＡ：Streptomyces girseusプロテナーゼＢ、ＡＬＰ： L.enzymogenes アルファー・リシン・プロテナーゼ、hin47:Ｈｉｎ４７の５７ −２５６。アスタリスク（＊）は、構造上の保存部位を示す。触媒三つ組残基はそで章マーク(≠)で示す。’ｃｏｎ’は哺乳類プロテアーゼの共通配列部位を示す。図５はプラスミドであるＤＳー１０１１ー１ー１およびＤＳー１０４８ー２の制限酵素地図で、これは、E.coli（大腸菌）から生産したＨｉｎ４７類似体であり、プラスミド・ＤＳー１０１１ー１ー１（プラスミド pT7/Hin47*）のための構成スキームである。図６は、E.coliから生産したＨｉｎ４７類似体の精製工程を示したもので、本発明の実施例の一つであり、精製品のゲル分析でもある。図７は、天然Ｈｉｎ４７と本発明のＨｉｎ４７類似体のベータ・カゼインに対するプロテアーゼ活性を示したものである。図８は、天然Ｈｉｎ４７と本発明のＨｉｎ４７類似体の温度を変化させた場合の安定性を比較したものである。図９は、天然のＨｉｎ４７と本発明のＨｉｎ４７類似体による、H.influenzae 由来組み換えタンパク質の酵素分解を示したものである。図１０は、マウスにおける、天然のＨｉｎ４７と本発明のＨｉｎ４７類似体の免疫原性を比較したものである。図１１は、H.influenzae菌株由来ＳＢ３３から生産されたＨｉｎ４７タンパク質とＳＢ１２から生産されたＨｉｎ４７タンパク質の、それぞれのアミノ酸配列の比較である。図１２は E.coliから生産されたＨｉｎ４７類似体であるＨ９１Ａの精製工程を示したものである。発明の一般的説明Ｈｉｎ４７遺伝子を持つすべてのHaemophilus菌株は、精製・分離した核酸分子（ＤＮＡ分子の形）の供給に利用されており、この分子は、本発明の典型的な実施例で示したように、Ｈｉｎ４７をコードする部分を含んだ遺伝子である。このような菌株は、臨床現場や米国微生物寄託機関のような細菌収集機関から入手可能である。このような菌として、H.influenzae菌やＨｉｎ４７・フラグメントやその類似体と特異的に反応する抗体を作り出すことのできるタンパク質を産生するその他の細菌株がある。 Haemophilus菌のうち使える菌株は次の通りである。 Haemophilus菌ｂ型株ＭｉｎｎＡ Haemophilus菌ｂ型株Ｅａｇａｎ Haemophilus菌非定型株ＳＢ３３ Haemophilaus菌非定型株ＳＢ１２ Haemophilus菌非定型株ＰＡＫ１２０８５図１には、プラスミドであるＪＢー１０３１ー１ー１４、および、ＪＢー１０６８ー２ー２の制限酵素地図を示してあるが、これらのプラスミドには、Haemop hilus菌非定型株ＳＢ３３から生産されるＨｉｎ４７蛋白質をコードする部分が挿入される。Ｈｉｎ４７遺伝子のヌクレトチド配列はすでに決定されており、図２には、Ｈｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列を示している。図３には、H.infl uenzae菌由来のＨｉｎ４７のアミノ酸配列とE.coli（大腸菌）株由来のhtrAタンパク質のセリン・プロテアーゼ・htrA、Salmonella typhimurium（ネズミチフス菌）株由来のhtrAタンパク質のアミノ酸配列を示してある。本発明者が予期せず発見したことであるが、このアミノ配列が存在することで、天然Ｈｉｎ４７では細菌性セリンプロテアーゼとして作用し、これがプロテアーゼ活性を起こしているのである。この天然Ｈｉｎ４７は、以前にはアドヒシンであると報告されていたものである。このプロテアーゼ活性があるために、天然Ｈｉｎ４７を予防接種用の免疫原、あるいは、診断用の抗原として使用しようとする場合に大きな障害となるのである。図３のアミノ酸配列の分析から、htrAタンパク質と天然Ｈｉｎ４７には、成熟タンパク質のアミノ酸残基１９５と２０１の間にＧＮＳＧＧＡＬの配列が含まれることが判明した。セリン・プロテアーゼの活性部位のコンセンサス配列はＧＤＳＧＧＰＫ（ＳＥＤＩＤＮＯ：１８）(Brenner，1988)であり、活性残基はセリンである。このように、Ｈｉｎ４７のセリンー１９７に突然変異を誘起させると、プロテアーゼ活性が低下したＨｉｎ４７類似体が合成される。これは、本発明の実施例として示してある。別の実施例ではセリンー１９７をアラニンで置換した。Ｈｉｎ４７のアミノ酸残基５７から２５６は既知のプロテアーゼであり、これは触媒三つ組残基を取り巻いている先端の相同体からは識別された活性中心残基と一列に並んでいるのである。セリンプロテアーゼには標準ナンバリング・システムが確立されており、それによれば、触媒三つ組残基はそれぞれＨｉｓー５７、Ａｓｐー１０２、Ｓｅｒー１９５と番号付けがなされる。これらがそれぞれ、残基Ｈｉｓー９１、残基Ａｓｐー１２１、Ｓｅｒー１９７に対応している。図４には、１０個の構造がすでに決定されているセリンプロテアーゼ（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：７から１６）の構造配列が示されているが、図の通り、相同残基が３次元的に同じ位置に列をなしている。Ｈｉｎ４７の疎水性コア内にある多数残基は、活性中心の廻りの残基と同様に、Ｈｉｎ４７のプロテアーゼの機能アミノ酸を識別できるような位置で合理的に列をなしているのである。天然Ｈｉｎ４７内でタンパク質のプロテアーゼ活性を起こさせているその他のアミノ酸残基としては、Ｈｉｓー９１とＡｓｐー１２１がある。実施例では、活性を低下させるために、このＨｉｓー９１をアラニン、リスニンまたはアルギニンで置換する。別の実施例では、同様に、Ａｓｐー１２１をアラニンまたはグルタミン酸で置換する。さらに、追加の実施例では、セリンー１９７をアラニン、セリン、またはトレオニンで置換する。ここでは、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７の類似体を供給する方法として、Ｈｉｎ４７のタンパク質内の特別なアミノ酸を置換することを例示しているが、本発明で示したプロテアーゼ活性の発見、Ｈｉｎ４７の発現方法、その精製方法を応用することにより、少なくとも一個のアミノ酸を除去または置換した別のＨｉｎ４７類似体、あるいは、少なくとも一個の追加アミノ酸をＨｉｎ４７タンパク質に取り込んだ別の類似体の生産も可能であることは明かである。本申請および実施例において、プロテアーゼ活性を特に低下させるためには、Ｈｉｎ４７タンパク質内の数個のアミノ酸を同時に変換することが望ましいことも示している。数個のアミノ酸としては、Ｈｉｓー９１とＳｅｒー１９７があり、これらを除去するかアラニンで置換して活性を低下させる。別の実施例では、これらの複数のアミノ酸として、Ｈｉｓー９１、Ａｓｐー１２１、Ｓｅｒー１９７があり、これらは除去するかアラニンで置換することを示している。従って、本発明では、一個または複数のアミノ酸を除去または別のアミノ酸で置換する方法、あるいは迫加のアミノ酸を導入する方法で、プロテアーゼ活性を低下させたＨｉｎ４７タンパク質類似体を供給できることを示している。上記で述べた通り、Ｈｉｎ４７には、大腸菌由来のhtrAタンパク質またはS.ty phimurium由来のhtrAタンパク質との相同性があり、これらのタンパク質は両方ともストレス応答タンパク質であり、共にセリンプロテアーゼ活性を持つ。大腸菌由来のhtrAタンパク質は、大腸菌を４３．５℃で増殖させることで産生誘導が可能である（レファレンス１３参照）。本発明では、この大腸菌由来のhtrAタンパク質は、６％のエタノール溶液内での増殖でも産生誘導が可能であることを示した。Ｈｉｎ４７も、６％のエタノール溶液内での増殖で産生の誘導可能であり、さらに、誘導される産生量は減少するが、温度を４３．５℃まで低下させて増殖させても産生誘導可能であり、そのことは以下で詳述する。このＨｉｎ４７タンパク質の発現の分析を進める中で、このタンパク質とＬｔｒＡとの間には関係があるという証拠が明確になってきた。hin47遺伝子は、タイプ分けできないH.influenzae菌株ＳＢ１２をＰＣＲ増殖することでそのクローンが得られる。図１１では、H.influenzae菌株ＳＢ１２由来のＨｉｎ４７タンパク質とH.influenzae菌株ＳＢ３３由来のＨｉｎ４７タンパク質におけるアミノ酸配列の比較をしている。この比較で分かることは、この両方のタンパク質のアミノ酸配列がほとんど同じであるということである。図５にはプラスミドであるＤＳー１０１１ー１ー１とＤＳー１０４８ー２を示してあり、これらを使用して、大腸菌内でセリンー１９７をアラニンで置換するとＨｉｎ４７類似体が発現する。図６は、Ｈｉｎ４７類似体を大腸菌の顆粒画分から精製する方法を示した流れ図である。図７は、セリンー１９７をアラニンで置換して得られたＨｉｎ４７類似体の、ベータカゼインに対するプロテアーゼ活性の低下の状態を示したもので、これにより、この類似体のプレテアーゼ活性は、天然のＨｉｎ４７タンパク質の１０％以下であることが分かる。このように、本発明の実施例では、本発明が、プロテアーゼ活性が天然のＨｉｎ４７タンパク質の１０％以下であるＨｉｎ４７類似体を供給し、このようなＨｉｎ４７類似体は、アミノ酸のセリンー１９７をアラニンで置換して生産できることを示している。図８には、本発明で供給されるＨｉｎ４７類似体の熱安定性の向上に関する分析が図示されている。本発明の実施例として、熱安定性が向上したＨｉｎ４７類似体が供給されており、そのようなＨｉｎ４７類似体はアミノ酸であるセリンー１９７をアラニンで置換して生産したものである。図９は、非Hin47のHaemophilus菌由来抗原が、Ｈｉｎ４７およびＨｉｎ４７類似体によってタンパク分解される状態を図示している。本発明の別の実施例には、このＨｉｎ４７によるタンパク質分解を起こさない別のＨｉｎ４７類似体を示し、これは、そのアミノ酸セリンー１９７がアラニンで置換されたものである。図１０と表１には、マウスにおける、修飾を加えてない天然のＨｉｎ４７と本発明にかかるプロテアーゼ活性低下型Ｈｉｎ４７類似体との免疫原性比較が図示されている。天然Ｈｉｎ４７タンパク質と本発明のＨｉｎ４７類似体Ｓ１９７Ａの免疫原性は似ている。実施例では、プロテアーゼ活性低下型で、しかも、その免疫原性が天然のＨｉｎ４７と実質的に同じであるＨｉｎ４７類似体が示されている。このＨｉｎ４７類似体では、アミノ酸であるセリンー１９７がアラニンで置換されたものである。表２と表３には、幼少ラットの菌血症モデルおよび免疫感作させたチンチラネコの中耳炎モデルにおける、プロテアーゼ活性低下型Ｈｉｎ４７類似体のＨｉｂに対する免疫防御能が示されている。このＨｉｎ４７類似体では、アミノ酸Ｈｉｓー９１が除去されるかアラニン、リシン、アルジニンで置換され、Ａｓｐー１２１が除去されるかアラニンまたはグルタミン酸で置換され、セリンー１９７がアラニン、システイン、トレオニンで置換されるか、あるいは、これらの組み合わせの置換で合成されたものである。本発明の別の態様として、Haemophilus菌、または、その他の細菌性病原菌に対する防御用のワクチンを供給する。ここで言う病原体は、Ｈｉｎ４７タンパク質、または、Ｈｉｎ４７を認識できる抗体を誘発するようなタンパク質を産生する細菌のことである。ここでのワクチンは、免疫・防御能力のあるＨｉｎ４７類似体を使ったもので、免疫原性的効果の期待できる量を使用し、または、Ｈｉｎ４７をコードする塩基配列を持つ核酸分子、および、生理的に受け入れ可能な、これらの物質のキャリアーから構成されるワクチンである。本発明で供給されるこの類似体は、Ｈｉｎ４７に関係のない抗原決定基に対する接合ワクチンを作る際には、ハプテン、多糖類、または、ペプチドのキャリア・タンパクとして使用できる。後述する申請内容からも明かなように、本発明はプラスミドおよびＨｉｎ４７類似体合成用の細菌の新規株も提供する。 Haemophilus influenzae菌由来で、しかも、天然のものに較べてそのプロテアーゼ活性の低いタンパク質Ｈｉｎ４７をコードする精製・分離ＤＮＡは、核酸プローブとして、Haemophilus菌株のインビトロまたはインビボでの同定手段として有用である。本発明により供給される遺伝子ＤＮＡ分子によりコードされたＨｉｎ４７類似体は、それを抗原に使うことで診断薬として、あるいは、抗Ｈｉｎ４７抗体を産生させる抗原として有用である。さらに、Haemophilus菌株やＨｉｎ４７と特異的に認識する抗体の産生を誘起できるタンパク質を産生するその他の細菌性病原菌が原因で発症する病気に対するワクチン生産用の抗原としても使えるし、Haemophilus菌あるいはそれに類するその他の細菌の感染症の診断に使用可能である。本発明の追加実施例では、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７類似体が、被包性菌などの病原菌防御用のキメラ分子や接合ワクチン（複合糖質を含む）を合成する際のキャリア分子として使用できることを示している。例えば、本発明で供給される複合型糖質は、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）やＰＲＰのような多糖類抗原を持つ細菌が原因となる病気や感染症の防御用の免疫感作に使用できる。これらの細菌性病原菌としては、Haemophilus influenza、S treptococcus pneumonia、Escherichia coli、Neisseria meningitidis、Salmon ella typhi（チフス菌）、streptococcus mutans、Cryptococcus neoformans、K lebsiella、Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）、Pseudomonas aerugino sa（緑膿菌）がある。特殊抗原をＨｉｎ４７類似体に接合させることが可能であり、そのような接合の方法は、本発明の申請者が作製したＰＴＣ申請書・ＷＯ・９４／１２６４１にすでに記載しているが、ここではレファレンスとして掲載している。別の実施例では、このＨｉｎ４７類似体は、ガン細胞の異常多糖類に対する免疫感作をする場合や、化学療法剤または生体活性剤に接合可能な抗ガン抗体を作製する際に、キャリアとして利用できることを示している。本発明で供給されるＨｉｎ４７類似体は、H.influenzae菌由来のタンパク質であるので、これを調合した薬剤では、H.influenzae菌が原因で発症する病気の予防と診断に使える。本発明者は、このＨｉｎ４７類似体が、生きたH.influenzae 菌ｂ型株に対する防御免疫応答を引き出すことができることを発見した。従って、本発明はワクチンにも利用可能であることが明かである。さらに、本発明には、Ｈｉｎ４７類似体をコードする遺伝子のヌクレトチド配列を示している。これらのＤＮＡセグメントは、組み換えＤＮＡ技術を利用することで、ＰＲＰやリポオリゴ多糖類（ＬＯＳ）のような、H.influenzae抗原とは本質的に関連のない免疫原を供給する際にも使用できる。Ｈｉｎ４７類似体タンパク質は、E.coli、Haemophilus、Bacillus（バシラス）、Bordetella（ボルデテラ）菌、酵母、バキュロウイルス、ポックッスウイルス、ワクシニアウイルスの増殖媒体を適当な発現システムとして使用することでその産生を誘起させることが可能である。本発明は、実質的には、分離・精製された純粋なＨｉｎ４７類似体を合成する新規技術を提供するものである。本発明での実施例が、Haemophilus菌の感染症や、Ｈｉｎ４７と特異的に反応する抗体の産生を誘発できるタンパク質を産生するその他の細菌性病原菌の感染症の治療や診断、予防接種に適用できることは、本分野の技術に熟練した者には明白なことである。そのような使用法に関して下記に詳述する。１．ワクチンおよびその使用法ワクチン生産用の免疫原性誘発物質として上記のＨｉｎ４７類似体を使用できる。ワクチンは接種対象者の免疫応答を引き出し、抗Ｈｉｎ４７抗体を含む、食菌性または殺菌性の抗体を産生させるためのものである。ワクチンを投与された者が、H.Haemophilus菌や、Ｈｉｎ４７と特異的に反応する抗体の産生を誘起するタンパク質を産生するようなその他の細菌の攻撃を受けた時には、この抗体が侵入細菌に結合してそれを不活性化させる。食菌性または殺菌性の抗Ｈｉｎ４７抗体は別の機序でも防御作用を発揮する。ワクチンを含むこれらの免疫感作物質は、注射液や液体溶液として、あるいはエマルションとして調製が可能である。Ｈｉｎ４７類似体に、薬学的な意味で許容できる限度内で賦形剤を混ぜて使うことも可能である。そのような賦形剤としては、水、食塩、デキストローズ、グリセロール、エタノール、および、それらを組み合わせてものがある。この免疫原性物質やワクチンには、その効果を強化するために湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または、アジュバントのような付帯物質を添加してもよい。アジュバント効果を完全なものするために、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムを使用できるが、通常の場合には０．０５から０．１％のリン酸緩衝食塩溶液を使用する。免疫原性物質およびワクチンは、非経口で、皮下注射または、筋肉注射で投与する。本発明にかかる免疫原性物質は、投与した粘膜表面で免疫応答が起こるように調製することも可能である。この免疫原性物質は、経鼻または経口（胃内）ルートで粘膜表面への投与が可能である。坐薬や経口薬剤の方法でこれを投与することが望ましい。坐薬の場合には、そのバインダーおよびキャリアーとしてはボリアルカリン・グリコールまたはトリグリセリドが使用できる。経口薬剤として使う場合には、賦形剤を使用するが、この賦形剤としては、サッカリン、炭酸セルロース、炭酸マグネシウムを使用する。この免疫原性物質の剤形としては、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性調剤、粉末のいずれに可能であり、このＨｉｎ４７類似体の含有濃度も１から９５％まで調節できる。この免疫原性物質製剤およびワクチンは、その投与量を調節して、治療用、予防・防御用、免疫原としての使い分けが可能である。その投与量は投与対象者の個人状況により異なり、抗体の産生を誘起する個人の免疫機能の状態、必要な場合には、細胞性免疫応答の能力によって調製する。投与の際の有効成分の期待される正確な量については医者の判断に委ねられている。しかし、適切な投与量については、この分野の熟練専門家が決定する必要があり、Ｈｉｎ４７類似体の投与量としては、マイクログラムのオーダーとなるであろう。適切な初回投与量もその後の投与予定量により変動し、追加免疫抗原量も多様である。さらに、どの経路で投与するかによっても投与量は変わるし、宿主の大きさによってもその量は変動する。本発明にかかる免疫原物質製剤に含む抗原の濃度は一般的には１から９５％である。ワクチンが、一種類のみの病原菌由来の抗原を含む場合には、そのワクチンは１価ワクチンと呼ばれる。他方、数種類の病原菌由来の抗原を含むワクチンは混合ワクチンと呼ばれ、それも本発明に供給するワクチンである。混合ワクチンの場合には、種々の病原菌由来の抗原、同じ病原菌であってもその菌株が異種のものから生産した抗原あるいは種々の病原菌の組み合わされた菌からの抗原を含む。本発明のＨｉｎ４７類似体をコードする核酸分子は、直接に免疫感作に使える。例えば、この遺伝子ＤＮＡを直接に免疫感作対象に投与するか、遺伝子免疫感作の場合にはＤＮＡを直接に注射する方法もある。さらに、サルモネラ、ＢＣＧ、アデノウイルス、ボックスウイルス、ワクシニアウイルス、ボリオウイルスのような生きたベクターに遺伝子を運搬させることで免疫感作させる方法もある。異種抗原を免疫システムに運ぶのに使用する生きたベクターに関しては、O'Haga n(1992)の報告があり、遺伝子感作の目的で検体にＤＮＡを直接に挿入する方法についてはUlmerらが報告している(1993)。２．イムノアッセイ（免疫検定法）本発明のＨｉｎ４７類似体は、抗Ｈｉｎ４７抗体の産生を誘起するための免疫原として、さらに、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ：エリザ、ＲＩＡ：ラジオイムノアッセイ、その他の非酵素連結抗原結合検定または抗Haemophilus抗体、抗Ｈｉｎ４７抗体の探知技術として知られている方法を含む）における抗原としても有用である。エリザ法では、Ｈｉｎ４７類似体を、特別に選別された表面、例えば、ポリスチレン製のマイクロティタ板の壁面のようなタンパク質を付着させることのできる表面に固定する。不完全に吸収されたＨｉｎ４７類似体を除去するために洗浄をした後、検体に対して抗原抗体反応的には中立であることで知られるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液のような非特異的タンパク質をその選択表面に結合させる。こうすることで、固定表面に非特異的吸収部位をブロックできることになり、表面に抗血清の非特異的に結合する原因と背景を少なくすることができる。次に、この固定表面に、臨床的意味のある、または生物学的意味のある物質から成るサンプルを接触させ、免疫複合物質（抗原／抗体）の形成を促進させる方法で検体を試験する方法もある。この方法には、ＢＳＡ溶液、ウシ・ガンマ・グロブリン（ＢＧＧ）、リン酸緩衝食塩（ＰＢＳ）／トウイーンのような希釈剤でサンプルを希釈することも含まれる。その後、このサンプルを温度２５℃から３７ ℃で２ー４時間培養する。培養の後、サンプルが付着している表面を洗浄して非免疫複合物質を除去する。この洗浄には、ＰＢＳ／トウイーンまたはホウ酸バッファーのような溶液で洗浄することも含む。試験サンプルと結合したＨｉｎ４７類似体との間に特異的免疫複合物質を生成させた後、洗浄して、その免疫複合物質を、最初の抗体に対する特異性をもつ二番目の抗体に接触させることで、免疫複合物質の産生の時期、量を決定することができる。仮に試験サンプルがヒト由来のものであれば、二番目の抗体はヒト免疫グロビリン（一般には、ＩｇＧ）に対して特異性を持つ抗体である。検出方法として、この二番目の抗体には、適当な色素産生物質と一緒に培養した時に色を発生する酵素活性のような活性を持たせることができる。ここで発生した色の度合いをスペクトル分光光度計を使用して測定することで定量分析が可能となる。３．ハイブリッド形成プローブとして塩基配列を使用本発明の核酸分子はhin47類似体遺伝子としての塩基配列を持っており、そのために、Haemophilus菌株およぼその他のＨｉｎ４７を特異的に認識する抗体を産生することのできるタンパク質を作り出す細菌からhin47類似体遺伝子をクローニングすることも可能である。この核酸分子は、本発明のＨｉｎ４７類似体をコードする塩基配列を持つので、別のhin47遺伝子と相補的な長さの複合分子を選択的に形成させるのに使用できる。別のhin遺伝子を探索するためにプローブの選択性に幅を持たせたい場合には、ハイブリッド形成条件の設定を多様に変化させることが可能である。この選択性を高めたい場合には、複合物質を形成させる場合に、比較的に厳しい条件を採用する、例えば、塩化ナトリウムの量を低くし、かつ、高温の状態にする、具体的には、Ｎａｃｌ量を０．０２Ｍから０．１５Ｍにして、温度を５０から７０℃ のような高温条件にする。場合によっては、ハイブリッド形成条件をもっと緩やかなもの、例えば、塩化ナトリウム量を０．１５から０．９Ｍにして、温度を２０から５５℃の条件にする必要があるような場合もある。ハイブリッド複合物質を不安定化させる場合には、ホルムアルデヒドの添加量を増量してハイブリッド形成条件をもっと厳しいものにすることも可能である。このように、ハイブリッド形成条件を自由に調節でき、望む結果に合わせて広く条件選択ができるというメリットがある。臨床診断用の実施例では、本発明のhin47遺伝子をコードする核酸分子は、ハイブリッド形成の際に、ラベリング法のような適当な方法と組み合わせて使えることを示している。例えば、放射線、酵素、アビジンやビオチンのようなリガンドなどの多様なレベル指示法が知られており、これらはいずれも探知信号を発生させることができるものである。本発明の別の診断用実施例は、放射線標識に代わりに、ウレアーゼ、リン酸アルカリン、ペルオキシダーゼのような酵素標識が使用できることを示している。酵素標識の場合には、hin47遺伝子の塩基配列が含有されているサンプルの特別なハイブリッド形成を確認する際に、人間の目で見える方法として、または、分光光度計で見たような方法を提供するものとして、比色指示物質が知られている。本発明のhin47遺伝子から成る核酸分子は、溶液ハイブリッド形成を行う場合や個体相を使う実施例において、そのプローブとして有用である。個体相を使用した実施例には、浸出液、体液（例えば、血清、羊水、中耳浸出液、唾液、気管支肺胞洗浄液）または、組織のような臨床サンプルから取ったテストＤＮＡ（またはＲＮＡ）は、選択マトリックスや表面に吸収され付着することが示されている。その後、固定された一本鎖核酸は、本発明のhin47遺伝子の核酸配列から成る選択プローブで、望む条件下で、特別なハイブリッド形成を起こすことになる。この選択条件というのは、Ｇ＋Ｃの内容、目標核酸の型、核酸の起源、ハイブリッド形成プローブなどに応じて要求される特別な基準に基礎を置いた特別な環境に依存する。非特異的に結合しているプローブ分子を除去するためのハイブリッド形成の表面の洗浄に続いて起こる特別のハイブリッド形成は、標識を使用することで検出できるし、その形成量の定量でさえも可能である。４．プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７の類似体をコードする遺伝子の発現宿主との適合性のある菌株から生産された、レプリコン配列と制御配列を含んでいるベクターが、Ｈｉｎ４７類似体遺伝子の発現に使用できる（本発明では発現システムを使用する）。元来、ベクターというのは、形質転換細胞内で表現型選択をさせる標識配列部分と複製部分を細胞内に運搬するものである。例えば、大腸菌は、アンピシリンとテトラサイクリンに耐性のある遺伝子を含むプラスミドｐＢＲ３２２を使用して、細胞の形質転換が可能で、ｐＢＲ３２２は形質転換細胞の同定の簡便な手段でもある。プラスミドｐＢＲ３２２、その他の細菌性プラスミド、ファージはプロモータを含むか、含むように修飾されており、このプロモーターは、宿主が自らのタンパク質を産生する場合にも使用される。さらに、宿主との適合性があり、レプリコン配列と制御配列を含んでいるファージ・ベクターは、宿主との関係では形質転換ベクターとしても使用できる。例えば、ラムダＧＥＭー１１ファージは、組み換えファージベクターを作製する際に使用でき、この組み換えファージベクター（例えば、E.coli LE392)は、宿主の形質転換用にも使える。組み換えＤＮＡ技術で普通に使用されているプロモーターとしては、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース・プロモータ・システム（Chang et al，1979; Goedel et al，1980)、Ｔ７・プロモータ・システム（米国特許４、９５２、４９６）のような細菌性プロモーターなどがある。これらの核酸の塩基配列は詳しく解明されており、この分野の熟練技術者であれば、これらを機能的にプラスミドベクターに結合可能である。どのようなプロモータを選択するかは、どのような結果を希望しているかに依る。Ｈｉｎ４７類似体の発現に適した宿主としては、E.coli Bacillus菌株，Haemo philus Bordetella菌株，酵母、哺乳類の細胞などがあり、この類似体発現にはバキュロウイルス発現システムも使用できる。本発明では、Ｈｉｎ４７類似体の生産には組み換え法が望ましいとしている。このタンパク質の発現のために特に好ましい宿主としては、ＬＰＳを持ってない、つまり、エンドトキシンのないグラム陽性菌が挙げられる。例として、Bacill us菌株があり、これは特に、非発熱性のＨｉｎ４７類似体の作製に有用である。生物寄託Ｈｉｎ４７類似体をコードするタンパク質を含むプラスミドであるＤＳー１０１１ー１ー１（pT7/Hin47*）は、この一部継続出願に先だって、ブダペスト条約により、承認番号７５８４５として、１９９４年７月２７日に米国、メリーランド、ロックビルにある米国微生物寄託機関に寄託されている。このに寄託されたプラスミドのサンプルは、当該米国特許申請に基づく特許付与があり次第、一般に公開されることになっている。本発明およびクレームは、この寄託されているプラスミドに限定されるのでなく、それは発明の例示のひとつにすぎない。この申請の中で記載している類似体または同等の抗原をコードする遺伝子が挿入される同等または類似の如何なるプラスミドも本発明の範囲内に入るものである。実施例一般的に記述された上記の開示は本発明を説明するものである。下記に示す実施例を参照することでより完全な理解が得られる。ここで示す実施例は単に例示であって、本発明がそれらに限定されるものではない。周囲の状況で適当と判断された場合には、形態を変更したり、同等物で置き換える場合もある。特別な用語が使用される場合があるが、それは本発明を記載するために使用されたもので、限定的な意味合いを付与するものではない。この開示の中で使用されているが、明示的には記載されてない分子遺伝学、タンパク質生化学、免疫学分野の方法も、それらは関連文献で十分に説明され明白であり、本発明に関連する分野の熟練者の技術の範囲内にあるものである。実施例１この実施例は、タイプ分けできないH.influenzae菌株ＳＢ３３から作製したhi n47遺伝子のクローンを示したものである。染色体ＤＮＡをH.influenzae菌株ＳＢ３３から調製して、ＥＭＢＬ３ライブラリを作製し、hin47遺伝子の５’末端に特異的に反応する標識オリゴヌクレオチド・プローブでスクリーニングしている。ハークニス(Harkness et al，1992)) らの方法に従って、タイプ分け出来ないH.influenzae菌株ＳＢ３３をムーラーヒントン(Mueller-Hinton)寒天で、または、流体培養基で増殖させた。染色体ＤＮＡは、次のような方法で作製した。即ち、５０ml培養液から細胞をペレットで取り、ソルバール(Sorvall)型ＲＣ−３Ｂ遠心分離機を使用して、５０００rpmの回転速度で１５分から２０分間、温度４℃で遠心分離を行った。分離した細胞をＴＥ溶液１０ml中で再懸濁させた後、プロナーゼを加えて５００μｇｍｌ^-1とし、さらに１％ＳＤＳを加えた。透明な溶解産物が得られるまでサンプルを３７℃で培養した。この溶解産物を、静かに一回、トリス飽和フェノール（ｐＨ７．４）で抽出させ、さらに、もう一回、トリス飽和フェノール／クロロフォルム（１：１）で抽出し、さらにもう一度クロロフォルムで抽出した。最終の液体相を１Ｍ塩化ナトリウムを使用して２４時間、４℃で分離透析し、其の後、ＴＥで２４時間分離透析した。ＥＭＢＬ３ライブラリのＳａｕ３Ａを使用して、ＳＢ３３染色体ＤＮＡの部分消化させて調製し、其の後、ＴＮＥ（20Mmトリス／塩酸，５mM塩化ナトリウム，１mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸，pH8.0）の中で１０から３０％スクロース勾配でサイズ分別するか、または、分離用ゲル電気泳動を行った。長さが５KD以上のＤＮＡフラグメントを含む画分については、それをプールさせ沈澱させ、ＥＭＢＬ３（プロメガ）のＢａｍＨと連結させた。この連結混合物質は包装キットであるギガパックＩＩを使用して包装してE.coli ＬＥ３９２細胞の上に置いた。このライブラリは、増幅させた後、クロロフォルム存在下４℃で保存した。プラークはニトロセルロースで濾過し、³²ｐ標識のオリゴヌクレオチド・プローブ（３０２６．ＳＬ）でハイブリダイゼーションを実施した。オリゴヌクレオチドの塩基配列はＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＴＡＡＡＴＡＧＴＡＴＴＧＣＡＣＴＴＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）であり、これはＮ末端アミノ酸配列ＭＫＫＴＲＦＶＬＮＳＩＡＬＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）と対応している。ファージＤＮＡをプラークから調製し、挿入ＤＮＡをSal Iで酵素消化で切断して、Sal Iで酵素消化されたＰＵＣＢ−ＢｇＸｂのクローンを作製した。プラスミドＪＢー１０３１ー１ー１４およびＪＢー１０６８ー２ー２（図１）をさらに分析するために選択した。実施例２この実施例は、hin47遺伝子およびＮＴＨｉ株ＳＢ３３から生産したＨｉｎ４７タンパク質のキャラクタリゼーションおよび塩基配列分析を示したものである。クローンＪＢー１０３１ー１ー１４およびＪＢー１０６８ー２ー２の制限酵素地図での分析およびサザンブロット法によれは、4.7kb BamH I/BamH Iまたは2.7 kb BamH I/Pst ＩＤＮＡフラグメント上にhin47遺伝子があることになる。クローンＪＢー１０６８ー２ー２から得られた4.7kb BamH I/BamH IフラグメントはプラスミドＤＳー７５５ー１を産生するｐＵＣＢ／ＢｇＸｂにクローン化される。ＤＳー７５５ー１の3.1kb BamH IからXba IフラグメントはプラスミドＪＢー１１６５ー１ー１を産生するｐＵＣ１８にクローン化され、このｐＵＣ１８には制限部位があり、Erase-a-base(Promega)手順に利用できるようになっている（図１）。この技術によれば、挿入ＤＮＡの切断を増やすことで連続的にクローンを生産できる。この結果、生産されたクローンはプライマーを使用して急速にその塩基配列が決定されることになる。プラスミドＪＢー１１６５ー１由来のＤＮＡは、BamH IおよびSac Iで消化され、次に、Erase-a-baseキットでexoII消化される。切断されたプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分析し、代表的プラスミドを塩基配列分析のために選択する。配列決定のためのプラスミドＤＮＡを、ホルムス／クイグレー法(Holmes and Quigley，1981)による修飾法で調製した。その修飾法を簡単に述べれば、５０ｍｌ培養液から取った細胞を１０ｍｌのＳＴＥＴ（８％スクロース、５％トリトンＸー１００、５０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス／塩酸、ｐＨ８．０）中で再懸濁させ、リゾチームを添加し、その混合液を２分間沸騰させる。そのサンプルを遠心分離機ソルバルＲＣ５Ｂで、１４、０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する、其の後、その上澄み液を同量のイソプロパノールで沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、純粋のエタノールで洗浄して、風乾した。細胞ペレットを０．９ｍｌのＴＥ中で再懸濁させ、５ｍｇ・ｍｌ^-1ＲＮＡｓｅＡを２０μｌを添加した。その後、この混合物質を３７℃で１５分培養した。１．５Ｍ−ＮａＣＬ／３０％ＰＥＣを５００μｌ添加した後、その混合物質を３０分間氷上培養し、エッペンドルフ(Eppendorf)遠心分離機で１０分間遠心分離をしてＤＮＡをペレットで取り出した。この細胞ペレットを４００μｌのＴＥ中で懸濁させ、トリス飽和フェノール（ｐＨ７．４）で３回、トリス飽和フェノール／クロロフォルム（１：１）で２回、クロロフォルムで２回抽出を行った。３Ｍ・酢酸アセトンを４０μｌおよび１ｍｌのエタノールを添加してＤＮＡを沈澱させ、その後、７０％エタノールで洗浄し、蒸留水中で再懸濁をさせた。ＤＮＡサンプルの塩基配列は、ＡＢＩ・モデル３７０Ａ・ＤＮＡシークエンサー、および、ダイ・ターミネーター化学法で行った。hin47遺伝子コーディング鎖の塩基配列の決定のために、クローンの集合セットと共に、ユニバーサル逆プライマーを使用した。約２５塩基のオリゴヌクレオチド・プライマーを非コーディング鎖の塩基配列を確認する目的で使用した。ＳＢ３３・hin47遺伝子のヌクレオチド塩基配列とＨｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列を図２に示した。このＨｉｎ４７タンパク質のヌクレオチド塩基配列とＮ末端アミノ酸配列については、１９９２年５月２６日から３０日までニューオリンズで開催された米国微生物学会で発表したが、これを図２の下方に示した。ＳＢ３３・Ｈｉｎ４７タンパク質のアミノ酸末端配列と、本発明にかかるタンパク質の配列は同一であり、このクローン遺伝子がhin47としての同一性を示している。実施例３この実施例ではＨｉｎ４７タンパク質のセリンプロテアーゼ活性の発見について示している。上記の実施例で決定されたＨｉｎ４７タンパク質のアミノ酸配列を、遺伝子バンクに登録されているすべてのタンパク質と比較した。上述した通り、Ｈｉｎ４７タンパク質はＰＣＴ申請書ＷＯ９４／００１４９、ＷＯ９２／１１３６７、ＷＯ９２／１０９３６に記載されており、Haemophilusのアドヘシン分子であることが示されている。本発明における驚くべき、かつ、予期せぬ発見は、Ｈｉｎ４７タンパク質は、セリンプロテアーゼ・E.coli htrA.．S.typhimurium htrA、および、その他のプロテアーゼとの相同性（５５％）のある重要なアミノ酸を持っているということである。このようなアミノ酸配列相同性については図３と図４に示している。さらに、Ｈｉｎ４７タンパク質は、ペファブロック（Pefablock)のような、セリン・プロテアーゼ阻害剤の存在がなければ自己消化を起こすことも発見した。実施例４本実施例は、部位特異的突然変異誘発による突然変異体hin47遺伝子の産生経過を示したものである。上記で述べた通り、H.influenzae Hin47、E.coli htrA 、S.Typhimuriumはいずれもセリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼの活性中心のコンセンサス配列はＧＤＳＧＧＰＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）であり、セリンが活性残基である。htrAタンパク質はいずれもＧＮＳＧＧＡＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）の配列であり、H.influenzae Hin47には、成熟タンパク質の残基１９５と２０１の間には同一の配列がある。このように、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７類似体が産生される場合には、このセリン残基１９７が部位特異的突然変異誘発の位置として選ばれることになる。オリゴヌクレトチド・ＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）が産生され、これは１９７位置のセリン残基をアラニンに変換されたものである。hin47遺伝子をクローニングしてＭ１３ｍｐ１８とし、これにクローンＤＳー９８１ー３を産生させ、アメリカ・インビトロ・部位特異的突然変異誘発キットを用いて突然変異を誘発させた。塩基配列分析により、クローンＤＳー９９１ー８が確認され、セリンー１９７からアラニンへの突然変異が起こっていた。この突然変異体hin47遺伝子を「hin47*」と呼ぶことにした。適当なオリゴヌクレオチドを使用して、１９７位置のセリン残基はシステイン（突然変異体Ｓ１９７Ｃ）とトレオニン（突然変異体Ｓ１９７Ｔ）に変換させた。さらに、図４で示した通り、Ｈｉｎ４７のアミノ酸配列と他のプロテアーゼを比較したところ、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７類似体を産生するには、アミノ酸Ｈｉｓ−９１とＡｓｐー１２１の突然変異誘発が適当であることが判明した。上記で述べたと同様の突然変異誘発法により、これらのアミノ酸Ｈｉｓ− ９１とＡｓｐー１２１を除去するか、または、別のアミノ酸で置換させた。このようなアミノ酸の置換としては、アミン酸Ｈｉｓー９１をアラニン（突然変異体Ｈ９１Ａ）とアルギニン（突然変異体Ｄ１２１Ａ）で、アミノ酸Ａｓｐー１２１をアラニン（突然変異体Ｈ９１Ａ）とグルタミン酸（突然変異体Ｄ１２１Ｅ）で置換した。このような、突然変異誘発のオリゴヌクレオチドは下記の通り。Ｈｉｓー９１ −＞Ａｌａー９１５’ＡＴＣＡＡＴＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）Ａｓｐー１２１ −＞Ａｌａー１２１５’ＴＡＡＴＧＣＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＧＴＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）別の突然変異を誘発するために対応するオリゴヌクレトチドを使用した。多数の突然変異体が誘発され、Ｈｉｓー９１とセリンー１９７がアラニンで置換され（突然変異体Ｈ９１Ａ／Ｓ１９７Ａ）、Ｈｉｓー９１、Ａｌｐー１２１、Ｓｅｒー１９７はすべてアラニンで置換された（突然変異体Ｈ９１Ａ／Ｄ１２１Ａ／Ｓ１９７Ａ）。Hin47*原料に関する前述の実施例で述べたように、プロテアーゼ活性の減退を確認するために、これらの追加で生産した突然変異体の抽出・精製・試験を行った。多くのセリンプロテアーゼは不活性（チモーゲンのように）の状態で分泌されており、活性中心を見るのに切開が必要であった。成熟天然Ｈｉｎ４７タンパク質のＮ末端の塩基配列を分析した結果、ＫＦＦＦＧＤＲＦＡＷＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）の位置でプレタンパク質の細胞分裂が起こっていることが判明した。活性プロテアーゼ分子を産生する分子の細胞分裂を阻止するアミノ酸を修飾することにより、プロテアーゼ活性低下型のＨｉｎ４７類似体を発現させることができるのである。実施例５本実施例は、Ｓｅｒー１９７がアラニンで置換されたＨｉｎ４７類似体を発現させるのに使用する大腸菌プラスミドの構造を示したものである。プラスミドであるＤＳー９９１ー８由来の突然変異体hin47*遺伝子のｐＴー７発現ベクターのクローニングを行いプラスミドＤＳー１０１１ー１ー１を産生させた（図５）。大腸菌株ＢＬ２１／ＤＥ３を形質転換させて大腸菌株ＤＳー１０１８ー３ー１を作製するが、これによりＳｅｒー１９７がアラニンで置換されたＨｉｎ４７類似体を発現された。テトラサイクリン・セレクションを利用するために、hin47*遺伝子をクローニングしてｐＢＲ３２８とした。BglII/BamH Iフラグメントの作製のために、プラスミドＤＳー１０１１ー１ー１由来のBgl II/Cla IT7/hin47遺伝子フラグメントをクローニングすることでpEVvrfl(Young and Davis，1985)を生産するが、これは、さらにBamH Iで消化されるpUC-4K(Pharamacia)にクローン化できる。産生されたクローンＤＳー１０３４ー３を酵素EcoR Iで消化させ、T7/hin47*遺伝子フラグメントをクローニングしてpBR328とし、プラスミドＤＳー１０４８とＤＳー１０６７ー２を作製する。プラスミドＤＮＡを大腸菌株ＢＬ２１／ＤＥ３に導入すると、ＤＳー１０７１ー１ー１とＤＳー１０７１ー３ー１が生成され、これがＳｅｒー１９７がアラニンで置換されたＨｉｎ４７類似体を発現させる。実施例６この実施例では、Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の発現状態について示している。ＤＳー１０１８ー３ー１、ＤＳー１０７１ー１ー１、ＤＳー１０７１ー３ー１をＮＺＣＹＭ＋３％デキストロース＋抗生物質（２５μｇ・ｍｌ^-1のアムピシリンまたは１０μｇ・ｍｌ^-1）の混合培養基で、３７℃で振り混ぜながら１昼夜培養して増殖させた。この一昼夜培養液を１：４０に希釈し、音波処理を行った後、同じ培養基に入れ、振り混ぜながら、吸光度が約０．３になるまで培養した。Ｔ７プロモーターからの発現を誘起させるために、１０％ラクトースの１０分の１容積分を添加した。ソルバル(Sorvall)ＲＣ−３Ｂ遠心分離機を用いて、培養液を５０００ｒｐｍ回転で、１０分間、温度４℃で遠心分離した後、４時間して細胞サンプルを取り出した。実施例７この実施例ではＨｉｎ４７タンパク質の抽出、精製を示している。Ｈｉｎ４７は大腸菌において溶解性タンパク質として発現される。実施例６で調製した２５０ｍｌ培養液から取り出した細胞ペレットを、５０ｍＭトリス塩酸４０ｍｌ（ｐＨ８．０）内で再懸濁させ、音波処理で破壊した。この抽出物を２０、０００ｘｇで遠心分離した。ここで取り出した上澄み液の９５％以上が溶解性のＨｉｎ４７タンパク質であり、これは保管した。ここで発生した分画を「Ｈｉｎ４７・抽出液」と呼ぶことにした。さらに、このＨｉｎ４７・抽出液をＤＥＡＥ・モデル・セファセル・カラム(S ephacel column)を使用して精製した。４０ｍｌのＨｉｎ４７・抽出液を２０ｍｌ型ＤＥＡＥ・モデル・セファセル・カラム（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０）に注入した。Ｈｉｎ４７はこの条件下でカラムに付着した。さらに、このカラムを、１００ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８・０）、２０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１００ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で順次洗浄した。Ｈｉｎ４７を４０ｍＭ塩化ナトリウム含有の５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で希釈した。ＢＣＡタンパク質検定法で分画内のＨｉｎ４７を定量した。達成されたＨｉｎ４７の純度をＳＤＳ−ＰＡＧ分析法で測定した。Ｈｉｎ４７を含む分画を組み合わせた状態で、−２０℃で保管した。顆粒分画として生産された突然変異体の殆どを占める野生型Ｈｉｎ４７タンパク質と同程度の溶解性があるタンパク質は、突然変異体であるＨ９１Ａだけであった。実施例８この実施例は、Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７の抽出と精製プロセスを示している。Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７は大腸菌の顆粒分画中に発現された。２５０ｍｌ培養液から取り出した細胞ペレット（実施例６で調製したもの）を４０ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で再懸濁し、音波処理（３ｘ１０分、７０％効率サイクル）で破壊した。抽出液を２０、０００ｘｇで遠心分離し、取り出した細胞ペレットを保管した。その細胞ペレットを４０ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸、０．５％トリトン・Ｘー１００、１０ｍＭ・ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で再抽出した。懸濁液を音波処理（１０分、７０％効率サイクル）を行った。抽出液を３００ｘｇで５分間遠心分離を行った。ここで取り出した上澄み液を２０、０００ｘｇで３０分間遠心分離をして、発生した細胞ペレットを保管した。その細胞ペレットを５０ｍＭトリス塩酸、０．５％トリトン・Ｘー１００、１０ｍＭ・ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で再抽出した。懸濁液を８Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）と混合した。５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を使用して、混合液内の尿素の濃度を２Ｍに調製した。Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７はこの条件で完全に溶解した。この溶液の最終量は２０ｍｌであった。この分画を「Ｈｉｎ４７類似体ー抽出液」と呼んだ。Ｈｉｎ４７類似体ー抽出液をＤＥＡＥ・モデル・セファセル・カラムで精製した。２０ｍｌのＨｉｎ４７・類似体ー抽出液を１０ｍｌ型ＤＥＡＥ・モデル・セファセル・カラム（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０）に注入した。Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体は、この条件でカラムに付着した。さらに、このカラムを５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８・０）で洗浄し、Ｈｉｎ４７類似体を３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で希釈した。この分画中にあるＨｉｎ４７類似体の量をＢＣＡタンパク質検定法で測定した。Ｈｉｎ４７類似体の純度をＳＤＳ −ＰＡＧ分析法で測定した（図６）。Ｈｉｎ４７を含む分画を組み合わせて−２０℃で保管した。実施例９この実施例では、Ｈｉｎ４７とＳｅｒー１９７をアラニンで置換して合成されたＨｉｎ４７類似体のプロテアーゼ活性を示している。Ｈｉｎ４７とＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の酵素活性を、基質としてベータ・カゼインを使用して分析した（図７）。この反応混合物には、５μｇのベータ・カゼインと、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体のいずれかを含む。反応を３７℃で２時間進行させ、その後、ＳＤＳーサンプル緩衝液を添加し、直ちに１００℃で５分間熱することで停止した。アリクオット（部分サンプル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図７で示されているように、Ｈｉｎ４７によるベーター・カゼインの消化は、２時間後には明白であり（パネルＡ、行１）、その消化の程度はＨｉｎ４７類似体を含む画分よりも強く（パネルＡ、行２）、しかも、外因性のタンパク質は関与してない（パネルＡ、行３）。これらの混合物の中のＨｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の存在は、Ｈｉｎ４７に対するモノクローナル抗体を使用したイムノブロット法により確認された（図７、パネルＣ、行１、２）。４℃および−２０℃という条件下での、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の自己消化の分析を通して、Ｈｉｎ４７およびＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体での活性を比較した。そのために、精製したＨｉｎ４７またはその類似体を４℃か−２０℃のいずれかの温度で２０日間保存した。保存後、ゼロ日目、１０日目、２０日目にアリクオットを取り出し、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の熱安定性を、Ｈｉｎ４７モノクローナル抗体を使用したイムノブロット法で分析した（図８）。４℃か−２０℃のいずれかの温度で２０日間保存した場合に、Ｈｉｎ４７よりもＨｉｎ４７類似体のほうが熱的に安定であった。Ｓｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体のプロテアーゼ活性をさらに詳しく試験するために、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の８０ーｋＤａ・H.influenzae組み換え抗原を崩壊させる能力を測定した。Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体の、他の抗原に対する酵素分解作用を測定するために混合抗原試験を行った。本試験では、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体（４７ｋＤａ）と区別するため、８０ーｋＤａ・H.influenzae組み換え抗原（ＴＢＰ１）を選択した。５種類の混合物質は下記のように調製した。８０ーｋＤａタンパク質のみ、８０ーｋＤａタンパク質＋Ｈｉｎ４７、８０ーｋＤａタンパク質＋Ｈｉｎ４７類似体、Ｈｉｎ４７のみ、Ｈｉｎ４７類似体のみ。混合物質における各タンパク質の量はいずれも５μｇであった。混合物質は４℃で４週間保存した。保存後、ゼロ日目、７日目、１４日目、２８日目ににアリクオットを取り出しＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った（図９）。１週間後に、この８０ーｋＤａタンパク質とＨｉｎ４７の両方が大きく崩壊した（２、４行）。これとは対照的に、８０ーｋＤａタンパク質とＨｉｎ４７類似体を組み合わせた混合物では、１週間後にも元のままであり、４週間後に僅かに崩壊を示しただけであった（行３）。他のＨｉｎ４７類似体のプロテアーゼ活性について、リプンシカら(Lipinska et al)が提唱した方法で、ベータ・カゼインの酵素消化反応を利用して評価を行い、その結果を表３に示した。一個の突然変異体（Ｄ１２１Ｅ）だけにセリンプロテアーゼ活性を保持していることが観察された。実施例１０この実施例は、マウスにおけるＨｉｎ４７とＨｉｎ４７類似体の免疫原性の比較を示している。図１０は、Ｈｉｎ４７とＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の免疫原性に関する比較試験結果を示してある。１群あたり５匹のBalb/cマウスで構成される群を５群用意して、１回あたり１μｇのＨｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体のいずれかを、ＡＬＰＯ₄（１投与量あたり１．５ｍｇ）の存在下で、１日目、２９日目、４３日目に１日３回皮下に注射した。注射後、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目に採血をして（これは、それぞれ、血液標本１、２、３、４として表示されている）、ＥＩＡ法により、抗Ｈｉｎ４７・抗体の力価を分析した。マウス血清における抗Ｈｉｎ４７・抗体は、パネツティ（Panezu tti et al，1993)らの方法で測定した。マイクロタイター・ウエルに１μｇのＨｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体のいずれかを、コーテングして室温で１６時間放置した。プレートはＰＢＳ内で０．１％ウシ血清アルブミンを入れブロックした。マウス血清を段階希釈してウエルに添加した後、室温で１時間培養した。ペルオキシダーゼと接合したヤギ・抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体をアフィニテー精製したＦ（ａｂ’）₂フラグメントを第二の抗体として使用した。テトラメチルベンジデン（ＴＭＢ・Ｈ₂Ｏ₂）を使用して反応を進行させ、フロー・マルテスカン(Mutiskan)・ＭＣＣ・マイクロプレート・リーダーで、波長４５０ｎｍ（基準の波長は５４０ｎｍを使用）での吸光度を測定した。抗血清の反応力価を希釈度の相関として定義したが、これは注射をしてない血清サンプルの２倍の吸光度を示した。図１０から分かるように、マウスでは、Ｈｉｎ４７とＨｉｎ４７類似体の両方とも、Ｈｉｎ４７または突然変異体がＥＩＡ法での抗原として使用できるかどうかとは関係なく、相当なＩｇＧ力価を示した。Ｈ９１ＡＨｉｎ４７類似体を使用した免疫原性研究も行った。この類似体はＳ１９７ＡＨｉｎ４７類似体と同等の免疫応答を示すことが分かった。Ｈｉｎ４７またはＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体に対する免疫応答をさらに試験するために、マウス血清での抗Ｈｉｎ４７・ＩｇＧのサブクラスを測定した。マイクロタイター・ウエルに１μｇの精製したＨｉｎ４７または類似体のいずれかをコーテングした。免疫原性比較研究のために用意したマウス血清最終サンプルをプールして、ＥＩＡ法により試験した。このＥＩＡ試験では、抗原として、ペルオキシダーゼと結合させたラット・抗マウス・ＩｇＧ、ＩｇＧ_2a、ＩｇＧ_2b、およびペルオキシダーゼと結合させたウサギ・抗マウスＩｇＧ３を使用した。交差反応を避けるために、精製した抗体サブクラスを使用して、各抱合体の希釈液を測定した。上記で述べた方法で、反応力価を測定した。表１で示したように、マウスにおいて、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体のいずれかにより誘導されたＩｇＧサブクラスは、同一であり、このことはＨｉｎ４７またはＨｉｎ４７類似体が個体抗原としてＥＩＡ法に使えるかどうかとは関係がない。マウス血清の両グループのうち、顕著なＩｇＧ応答を示したのはＩｇＧ１・イソタイプであった。従って、Ｈｉｎ４７類似体は、実質的に天然タンパク質と同じ免疫原性を示したことになる。実施例１１本実施例は、Ｈｉｎ４７またはＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の免疫防御能を示している。幼若ラットの菌血症モデルにおける、Ｈｉｎ４７・特異的抗血清の、H.influe nzae菌ｂ株由来ＭｉｎｎＡに対する防御能から、Ｈｉｎ４７またはＳｅｒー１９７をアラニンで置換したＨｉｎ４７類似体の免疫防御能を分析した。表２にはこの結果を示してある。０．１ｍｌのウサギ・抗Ｈｉｎ４７類似体・抗血清または同等の採血前血清のいずれかを、日齢６日のウイスター幼若ラット群の頚部に近い背部皮下に接種した。さらに、これらの群に、２４時間後に７００cfuの増殖させたばかりの新鮮なＨｉｂ株ＭｉｎｎＡを腹腔内投与した。２０時間後に、腹腔内投与されたラットから採血をして、チョコレート寒天プレートに移し培養した。２４時間後には細菌コロニーのカウントができた。表２に示したように、抗Ｈｉｎ４７類似体・抗血清を接種した群の９匹のうち３匹には、その血液中に菌血症は認められなかった。Ｈｉｎ４７類似体・抗血清（１１％）を接種した群の中で、採血前血清を接種したマウスに較べて、血液からの菌の回収量が高かったのは１匹だけであった。これとは対照的に、採血前血清を接種された９匹のマウス全部において菌が回収された。採血前血清を接種した９匹のうち４匹（４４％）において、血液中の細菌の数（５００ー１０００）のレベルが高かった。幼若ラットの菌血症モデルを、抗Ｈｉｎ４７・血清または抗Ｈｉｎ４７・突然変異体・抗血清の、H.influenzae・タイプｂ株感染が原因で発症した菌血症に対する防御能を評価するために使用した。この幼若ラット１０匹のうち６匹において、これらの血清は野生型Ｈｉｎ４７、Ｈ９１Ａ・Ｈｉｎ４７、Ｓ１９７Ａ・Ｈｉｎ４７類似体に対する防御能を示した。実施例１２本実施例は、ストレス負荷の条件下でのＨｉｎ４７合成の誘導を示している。 H.influenzae株Eaganをヘミン（２μｇ・ｍｌ^-1）とＮＡＤ（２μｇ・ｍｌ^-1 ）を含んだＢＨＩ液体培養基内で３７℃で、Ａ₅₉₀=0.3の条件で増殖させた。このサンプル・アリクオットを取り出して、３７℃、４２℃、４３．５℃で、または、６％エタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム、または、０．３塩化ナトリウムの存在下で増殖させた。大腸菌株ＪＭ１０９を、ＹＴ焙養基内で３７℃で、Ａ₅₉ ₀ =0.3の条件下で増殖させ、上記と同じ方法でアリクオットを取り出した。サンプルを０分、２０分、４０分、６０分、９０分後に収集して、ＯＤ法およびＳＤＳ−ＰＧＥ／ウエスタンブロット法で分析した。H.influenzae・Hin47とE.coli ・htrAを認識するモルモット抗血清を、ウエスタンブロット法分析に使った。４３．５℃で増殖させた時に、大量のE.coli・htrA・タンパク質が合成され、H.in fluenzae・Hin47・タンパク質は少量しか認められなかった。６％エタノールを含む培地で増殖させることで、E.coli・htrA・タンパク質とH.influenzae・Hin4 7・タンパク質の両方の合成が誘導された。塩の含有が多いと、このタンパク質のいずれか一方の合成が弱くなった。これらの結果は、Ｈｉｎ４７がストレス応答タンパク質であり、類似の条件で、E.coli・htrA・タンパク質の合成が誘導されることを示している。実施例１３本実施例は、Ｈ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質の精製を示している。この溶解性のＨ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質を、実施例７での野生型Ｈｉｎ４７タンパク質の場合と同じ方法に、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラムを追加した方法で精製した。ＨＡＰカラムには１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を入れ、ＤＥＡＥカラムをセットした。Ｈ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質がＨＡＰカラムに付着した。汚濁タンパク質は１７５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄して除去した。３００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出したＨ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質を−２０℃で保存した。実施例１４本実施例はチンチラネコの中耳炎モデルにおけるＨｉｎ４７およびＨｉｎ４７突然変異体の防御能を示したものである。野生型のＨｉｎ４７、Ｈ９１Ａ・Ｈｉｎ４７、Ｓ１９７Ａ・Ｈｉｎ４７による能動免疫化が引き起こす防御能の評価のために、チンチラネコの中耳炎モデルを使用した。ＡＩＰＯ４と抱合しているＨｉｎ４７（Ｈ９１Ａ）またはＨｉｎ４７突然変異体（Ｓ１９７Ａ）を、一回投与量で３０μｇ、１日目、２８日目、４２日目にチンチラネコの筋肉内に１日３回接種した。５６日目にこのチンチラネコに、５０ー１０００ＣＦＵ（コロニー形成単位）の細菌・ビルレントＮＴＨｉ株ＳＢ１２を接種した。鼓膜切開と耳鏡検査でモニターした後、接種後４日目に中耳浸出液を取り出しチョコレート寒天培地で培養した。２４時間後に細菌コロニーをカウントした。野生型のＨｉｎ４７およびＨ９１Ａ・Ｈｉｎ４７タンパク質はこの実験動物の５０％に防御能を与えるが、Ｓ１９７Ａ・Ｈｉｎ４７には防御能はない。開示内客の要約本発明は、プロテアーゼ活性を天然のＨｉｎ４７タンパク質の約１０％まで低下させた新規のH.influenzae菌由来Ｈｉｎ４７タンパク質類似体および、このＨｉｎ４７タンパク質をコーデングする分離・精製ＤＮＡを供給するものである。本発明の範囲内でのタンパク質修飾が可能である。グループ＃１：Ｈｉｎ４７の接種を受けた５匹のグループから採取してプールした免疫血清。グループ＃１：Ｈｉｎ４７突然変異体の接種を受けた５匹のグループから採取してプールした免疫血清。プレートには、Ｈｉｎ４７またはＨｉｎ４７突然変異体のいずれかをコーテングした。日齢６日の幼若ラット９匹で構成されるグループに、ウサギ抗Ｈｉｎ４７突然変異体抗血清、または、それと対応する採血前血清のいずれかを皮下注射した。２４時間後に同じラットに７００ｃｆｕ・H.influenzae菌株由来ＭｉｎｎＡを腹腔内投与した。投与から２０時間後に採血した。抗Ｈｉｎ４７＊抗体：ＣＦＡ／ＩＦＡにおける、精製したＨｉｎ４７突然変異体に対するものとして調製されたウサギ免疫血清。免疫グループにおける平均細菌回収：血液２．５μｌ当たり１００ｃｆｕ；対照グループより：血液２．５μｌ当たり２９０ｃｆｕ。 a プロテアーゼ活性は気質ベータカゼインの消化能力で測定。 b 溶解性とは溶解タンパク（−）または顆粒画分としての産出。 c 幼若ラットの菌血症の受動モデルにおける防御。 d チンチラネコの中耳炎モデルにおける防御。 e NDは未同定。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Haemophilus Hin47 analog with reduced protease activity Field of the invention The present invention relates to the field of immunology, in particular to immunogens produced from species of the genus Haemophilus. And antigens. Related Application Reference This application is filed with U.S. Patent Application Serial No. 08 / 296,149 filed August 26, 1994. Is a continuation-in-part application of U.S. patent application no. No. 08 / 278,091. Background of the Invention Haemophilus influenzae is a human medulla It is a microorganism that causes various diseases such as meningitis, epiglottitis, pneumonia, and otitis media. H. Influenzae type b (Hib) is the leading bacterial meningitis in children under 5 years of age. The causative organism. Protective antibodies against this disease are derived from the capsular polysaccharide of the microorganism. In that case, using purified polyribosyl-ribotol phosphate (PRP) as an antigen Manufactured vaccines are being developed. The vaccine has 90% immunity in adults And more than 24% in children aged 24 months, but children less than 24 months Has no immune effect (Zangwill et al, 1994). (The reference is at the end of this application In the list of references given in Each of the above references is in its own complete form and is self-explanatory. It doesn't need the other literature above. ) Antigens derived from other polysaccharide proteins As with this PRP, there was no proliferation of T-helper cells, and reimmunization resulted in a secondary immune response. It does not induce an increase in memory cells. PRP polysaccharide and protein carrier Conjugation gives the vaccine the property of being independent of T-cells and substantially , The immune response to the PRP antigen is enhanced. Recently, four types PRP-carrier conjugate vaccines are available. Any of these vaccines Also, Haemophilus influenzae bacteria type b and capsular polysaccharides are diphtheria toxins and tetanus Conjugates with toxins or Neisseria meningtidis outer membrane proteins Is based on These Haemophilus influenzae bacteria b-type conjugated vaccines Has dramatically reduced the incidence of bacterial meningitis (Schoendorf et al. al, 1994). There are six types of serotypes of Haemophilus influenzae from a to f. Identify by type of polysaccharide. Recent Haemophilus-derived conjugate vaccines are No protection against invasive strains that can be typed (types a and c). More Importantly, these vaccines are useful for postpartum sepsis, neonatal sepsis, pneumonia, A strain that cannot be classified (N Lack of protection against THi). Otitis media is most likely to affect young children Is a common disease, with about 70% of all children at least once by age seven Experience this disease. If this otitis media becomes chronic, hearing loss, language impairment, May cause paresthesia. About 50% of the causes of otitis media are Streptococcus pneumoni ae (S. pneumoniae) infection, about 30% of Haemophilus influenzae R. influenzae) due to strains that cannot be typed, with about 2 remaining 0% are due to infection by Moraxella (Branhamella) catarrhalis. United States However, treatment costs for otitis media range from $ 1 billion to $ 2 billion annually, including antibiotics and tonsillectomy. It is used to pay for prolapse, adenoidectomy, and myringotomy. H. influen As a universal defense against diseases associated with zae, especially from 2 to 6 years old Conservative, non-compliant, non-capsular methods to protect children and other high-risk populations H. The supply of immunogens from influenzae has been awaited. H. influe Non-typeable strains of nzae are susceptible to the elderly and, in particular, to respiratory infections It is also an important pathogen of pneumonia in humans. Thus, H. Influenzae origin If there is a demand for the antigen of H. Many blood of influenzae bacteria It can be used as a component of an immunological drug capable of protecting against clear type. You. 199 PTC application WO 92/10936 published on July 9, 2009 (this reference In this application, this H. molecular weight 47,00 obtained from influenzae bacteria 0 outer membrane protein and reported as adhesin And was named Hin47. Influenzae isolate, immunologically This H. influenzae is said to be located between the non-typeable bacteria and the b-type. You. Amino acid sequence and nucleotid in gene-encoded Hin47 Nucleotide sequence was opened in New Orleans, USA from May 26 to 30, 1992. Presented at the National Society of Microbiology. For these sequences, see 1994 Was also published in PCT application WO 94/00149 published on January 6, 2008. , And is also included in this application as a reference. This Hin47 protein is a protein derived from Haemophilus influenzae strain. Haemophilusi is classified as one and reported to be an adhesin. Diseases caused by nfluenzae or other bacteria that produce Hin47 It can be used as a diagnosis and vaccine for diseases caused by sexual pathogens. Used as a protein capable of inducing the production of antibodies specifically reactive with Hin47 You can. Using this Hin47 protein as an antigen, anti-Hi When the n47 antibody is used in diagnosis as a protein that induces production, There is also a lit. This means that the applicant has discovered unexpectedly and accidentally. However, Hin47 has protease activity, and Self-digestion occurs within the protein, causing proteolysis of other antigens contained therein. It is to be. Therefore, to be able to use it as an antigen, As a carrier for immunizing agents such as Kuching and other immunogens, or for the production of diagnostics This proteolytic activity must be reduced for commercial use. It is desired to synthesize and supply a Hin47 protein analog (here, The Hin47 protein analog of this is sometimes referred to as a mutant or derivative). Summary of the Invention An object of the present invention is to provide a protease derived from Haemophilus bacterium having reduced protease activity. 47 to provide a protein analog. One aspect of the present invention is a method for separating and purifying Hin47 tannin from Haemophilus bacteria. To provide a proteinaceous analog, and to increase the protease activity of the analog in nature. The activity is reduced to about 10% of the activity of natural Hin47 present in E. coli. This Is essentially the same immunogenicity as the native Hin47 protein To It is desirable to have. The analog provided in the present invention converts natural Hin47 It is synthesized and produced by chemical or biochemical methods or by adding genetic modifications. In an embodiment of the present invention, when synthesized by genetic modification, In order to reduce the activity, natural Hin47 causing protease activity Remove or replace at least one amino acid in it . In addition, another method for reducing this protease activity is to use at least Also inserts one amino acid into the amino acid sequence of the native Hin47 protein. Remove At least one amino acid that is removed or substituted is the natural Hin47 One of the amino acids 195 to 201 in is selected. Phosphorus-197 is removed or other amino acids, alanine, cysteine, Replaced with onine. In addition, at least one is removed or replaced. Amino acids include His-91, which can be removed or alanine, Arginine. At least one removed or replaced Asp-121 is Asp-121, which is removed or replaced with alanine. I do. Further, as another method, a plurality of amino acids in the natural Hin47 molecule can be removed. It can also be produced by removing or replacing. His-91 as a plurality of amino acids and There are serine-197, which can be removed or Ala-91 and Ala-19 By substituting with H7, the Hin47 analog protein H91A / S1 97A can be synthesized and produced. Further, as a plurality of amino acids, His-91, A There are sp-121 and Ser-197, which are also removed or Ala-121 and Ser-197. And Ala-197 replace the Hin47 analog protein. H91A / D121A / S197A can be synthesized and produced. Supplied by this invention A summary of some of the Hin47 analogs is given in Table 3. Only D121E, a mutant of Hin47, has substantial protease activity Indicates that remains. In another embodiment of the present invention, a separated and purified nucleic acid molecule is provided. This nucleic acid molecule , Haemophilus influenza influenzaHin47 protein encoding Haemophilus inf It consists of a mutant gene of luenza hin 47, and its protease activity is natural. It is less than 10% of the Hin47 protein. This mutation The hin47 gene encodes any type of protein of the above-described Hin47 analog . This mutated gene was produced by site-directed mutagenesis of the wild-type hin47 gene. It is desirable to be born. This nucleic acid molecule is used to transform the host Inserted into the plasmid. This The plasmid used here is DS-101-11-1, which was used in 1994. Approved by the US Microbial Depositary in Rockville, Maryland on July 27 No. 75845. The present invention relates to such transformed cells. It also supplies the inserted recombinant plasmid. In another aspect of the invention, the protease activity is one of the native Hin47 proteins. Activity-reduced Hin47 protein from Haemophilus influenzae reduced to 0% Provided are methods for producing dendritic analogs. The method involves generating protease activity. Identifying at least one amino acid residue in the native Hin47 protein That the nucleotide sequence encoding at least one amino acid has been removed or replaced. In order to produce a mutant hin47 gene, Inducing site-directed mutagenesis of the offspring hin47, the mutant gene hin47 Incorporation into cells, transformation of cells, and growth And a method for producing a Hin analog protein. The few selected here At least one amino acid is the amino acid identified above for the Hin47 analog Is one of Incorporation of the mutant gene hin47 into cells causes cell transformation It is desirable. Transformation In the vesicle, the mutant gene hin47 is controlled by the T7 promoter, Growth of transformed cells and induction of expression of Hin47 analog by T7 promoter It is desirable to culture in a lactose medium adjusted to the induced concentration. In addition, Incorporation of the mutant gene hin47 into cells for cell transformation Rasmid DS-101-1-1 (this is called plasmid pT7 / hin47 Huh. ) Is preferred. Further, as an aspect of the invention, the present invention provides a separated and purified Hin47 analog. Provide a way to The method includes the steps described above for synthesizing a Hin47 analog. Including performing each procedure. The procedure involves a granule containing the Hin47 analog. The separated transformed cells are separated into the supernatant and the granule fraction. The granule fraction containing the Hin47 analog And dissolve the solution using chromatography to remove the cell debris And purifying Hin47, further purifying its Hin47 analog Is included. The analog of the protein-lowering form of Hin47 provided in the present invention is an immunogen. As an antigen in a sexual composition, as a carrier for another immunogen, or as a diagnostic agent Useful as a raw material for A nucleus also provided by the present invention Acid molecules are also useful as diagnostic probes or as diagnostic tools in the field of immunology. It is for. In yet another aspect of the invention, the invention provides an amount of H sufficient to exert an immune effect. Nucleic acid molecules comprising genes encoding in47 analogs or Hin47 analogs Providing an immunogenic composition comprising: This immunogenic composition is It can be prepared as a vaccine for in vivo administration to the main. This vaccine is Hi n47 or the production of in-host antibodies specifically reactive with Hin47. Diseases caused by bacterial pathogens that produce inducible proteins You can use it as a defense. Haemophilus influenz as this bacterial pathogen There are Haemophilus species such as ae. The immunogenic composition of the present invention includes Consists of at least one other immunogenic or immunostimulant substance, such as bunt . As a further additional example, the gene encoding the Hin47 analog of the present invention may be The nucleic acid molecules comprise poxviruses, Salmonella, and polio Survival vectors such as Rus, Adenovirus, Vaccinia virus or BCG Included in. The invention also includes a method of raising an immune response in a host, including a human. That one As a method, the immunogenic composition of the present invention is administered to this host in an amount which is expected to produce an immunological effect. Including inoculation. As mentioned above, this Hin47 analog can also be used in the diagnostic area. Follow As an additional embodiment of the invention, an antibody specifically reacting with Hin47 is present in the sample. Provide a way to check if you are. The method includes the following steps. (A) Specimens were converted to Hi with substantially the same immunogenicity as native Hin47 protein contact with the n47 analog, so that the Hin47 analog and the Hi present in the sample are present. producing a complex with an antibody that specifically reacts with n47; and (B) confirming the production of this complex. The present invention includes a method for detecting whether Hin47 is present in a sample. That one The method consists of the following steps. (A) immunizing a test subject with the immunogenic composition of the present invention to obtain Hin47 protein; Producing antibodies that specifically react with the protein, (B) bringing a test subject into contact with this antibody, so that Hin present in the test subject is present; Producing a complex consisting of 47 and Hin47 that specifically reacts with the antibody; (C) confirming the production of this complex. The invention includes the provision of a diagnostic kit. This is specific to Hin47 in the sample It diagnoses whether there is an antibody that reacts specifically and includes the following substances and methods. (A) essentially the same immunogenicity as the native Hin47 protein provided in the present invention Being a Hin47 analog having (B) To produce a complex of this analog and the antibody contained in the sample, Contacting an analog of the subject with the subject, and (C) A method for confirming the production of the complex substance. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows plasmids JB-1031-1-14 and JB-1068- FIG. 2 is a diagram of a restriction enzyme map of 2-2 and a structure for nucleotide sequence analysis. FIG. 2 shows the complete nucleus of Hin47 produced from SB33 derived from H. influenzae strain. Reotide base sequence (SEQ ID NO: 1) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) NO: 2) and partial nucleotide sequences (SEQ ID NO: 3) and portions The amino acid sequence (SEQ ID NO: 4). The latter was announced at the ASM conference This is a copy of the document obtained by the inventor. FIG. 3 shows H. influenzae Hin47 (SEQ ID NO: 2) and E. coli (E. coli). Strains htrA (SEQ ID NO: 5), Salmonella typhimurium (S. typhimurium) Comparison of the amino acid sequences of strains htrA (SEQ ID NO: 6) . FIG. 4 shows Hin47 with a known protease. Sequence from amino acid residue 57 to 256 (SEQ ID NOS: 7 to 16) It is. The code is as follows. TON: rat tonin, PKAAB: kallikre In, PTN: trypsin, CHAA: chymotrypsin, EST: elastase RP2A: rat mast cell protease, SGT: Streptomyces griseus (Streptomyces griseus) Trypticin, SGBE: Streptomyces gri seus proteinase A, SGA: Streptomyces girseus proteinase B, ALP: L.enzymogenes alpha lysine proteinase, hin47: 57 of Hin47 -256. An asterisk (*) indicates a conserved site on the structure. The catalytic triad is It is indicated by a sleeve mark (≠). 'Con' indicates the consensus sequence site of the mammalian protease You. FIG. 5 shows the plasmids DS-101-11-1 and DS-1048-2. In the restriction map, this is a Hin47 analog produced from E. coli. For the plasmid DS-101-11-1 (plasmid pT7 / Hin47 *) It is a configuration scheme. FIG. 6 shows a purification process of a Hin47 analog produced from E. coli. This is one of the embodiments of the invention, and is also a gel analysis of a purified product. FIG. 7 shows the relationship between native Hin47 and beta casein, a Hin47 analog of the present invention. Showing protease activity It was done. FIG. 8 shows the case where the temperature of natural Hin47 and the Hin47 analog of the present invention were changed. Is a comparison of the stability. FIG. 9 shows H. influenzae by natural Hin47 and a Hin47 analog of the present invention. 1 shows the enzymatic degradation of a recombinant protein of interest. FIG. 10 shows the relationship between native Hin47 and a Hin47 analog of the present invention in mice. It is a comparison of immunogenicity. FIG. 11 shows Hin47 protein produced from SB33 derived from H. influenzae strain. Quality and amino acid sequence of each of Hin47 proteins produced from SB12 It is a comparison. FIG. 12 shows the purification process of H91A, a Hin47 analog produced from E. coli. It is shown. General description of the invention All Haemophilus strains having the Hin47 gene are purified and isolated In the form of DNA molecules (in the form of DNA molecules), which are typical of the present invention. As shown in Examples, the gene includes a portion encoding Hin47. This Strains can be obtained from clinical sites or from bacterial collection agencies such as the U.S. Microbial Depositary. It is possible. As such a fungus, H. influenzae bacteria and Hi to produce antibodies that specifically react with the n47 fragment and its analogs There are other bacterial strains that produce the protein. Haemophilus strains that can be used are as follows. Haemophilus b type strain MinnA Haemophilus type b strain Eagan Haemophilus atypical strain SB33 Haemophilaus atypical strain SB12 Haemophilus atypical strain PAK12085 FIG. 1 shows plasmids JB-1031-1-14 and JB-10. The restriction map of 68-2-2 is shown, and these plasmids contain Haemop. The part encoding the Hin47 protein produced from the atypical strain SB33 of H. hilus is Inserted. The nucleotide sequence of the Hin47 gene has already been determined. 2 shows the amino acid sequence of the Hin47 protein. FIG. infl Amino acid sequence of Hin47 from uenzae and E. coli. htrA tan from E. coli strain Parkin serine protease htrA, Salmonella typhimurium (S. typhimurium) 3 shows the amino acid sequence of the htrA protein derived from the Bacillus strain. Unexpectedly by the inventor It was discovered that the presence of this amino acid sequence Acts as a bacterial serine protease, which causes protease activity. To It is. This natural Hin47 was previously reported to be an adhesin Things. Due to this protease activity, natural Hin47 is used for vaccination. A major obstacle when trying to use it as an immunogen or as a diagnostic antigen It becomes. From the analysis of the amino acid sequence in FIG. 3, the htrA protein and natural Hin4 7 contains the GNSGGAL between amino acid residues 195 and 201 of the mature protein. The sequence was found to be included. Consensus of the active site of serine protease The sequence is GDSGGPK (SED ID NO: 18) (Brenner, 1988). , The active residue is serine. Thus, it suddenly changed to Serine-197 of Hin47. Induction of a mutation results in synthesis of a Hin47 analog with reduced protease activity . This is shown as an embodiment of the present invention. In another embodiment, serine-197 is Replaced with alanine. Amino acid residues 57 to 256 of Hin47 are known proteins. Aase, distinguished from the leading homolog surrounding the catalytic triad It is aligned with the active center residue. Standard for serine proteases A numbering system has been established, according to which the catalytic triad residues are They are numbered His-57, Asp-102, and Ser-195, respectively. These are at residues His-91, Asp-121 and Ser-197, respectively. Correspondence doing. FIG. 4 shows a serine protease whose ten structures have already been determined. (SEQ ID NOS: 7 to 16) are shown in FIG. The same residues are arranged in the same position in three dimensions. Within the hydrophobic core of Hin47 Many residues are similar to the residues around the active center, as well as the Hin47 protease machinery. They are rationally arranged at positions where functional amino acids can be identified. Natural H Other amino acids causing protein protease activity in in47 Residues include His-91 and Asp-121. In the examples, the activity is reduced This His-91 with alanine, lisnin or arginine I do. In another embodiment, Asp-121 is also alanine or glutamic acid. Replace with Further, in additional embodiments, serine-197 is alanine, serine, Or, it is substituted with threonine. Here, Hin47 of protease activity reduced type was used. As a method of supplying an analog of, a special amino acid in the protein of Hin47 is used. Although the substitution is exemplified, the discovery of the protease activity shown in the present invention, Hi By applying the expression method of n47 and its purification method, at least one Another Hin47 analog from which no acid has been removed or substituted, or at least one It is possible to produce other analogs that incorporate additional amino acids into the Hin47 protein. To It is clear that. In this application and examples, protease activity was particularly reduced To do so, several amino acids in the Hin47 protein must be converted simultaneously. Is also desirable. Some amino acids include His-91 and Se r-197, which is removed or replaced with alanine to reduce activity. In another embodiment, the plurality of amino acids are His-91, Asp-12 1, Ser-197, indicating that these were removed or replaced with alanine. ing. Accordingly, the present invention provides for the removal of one or more amino acids or the removal of another amino acid. A method of substituting amino acids or introducing an imminent amino acid This shows that a Hin47 protein analog with reduced activity can be supplied. As described above, Hin47 contains htrA protein derived from E. coli or S. ty There is homology with the htrA protein from phimurium, and these proteins are both Both are stress responsive proteins and both have serine protease activity. colon The htrA protein derived from the bacterium was obtained from Escherichia coli 43. Induction of production by growing at 5 ° C It is possible (see reference 13). In the present invention, the htrA tan Protein shows that production can be induced by growth in a 6% ethanol solution. did. Hin47 also grows in 6% ethanol solution And the amount of induced production is reduced, but the temperature is reduced to 43 . Production can be induced even when grown at 5 ° C, which is described in detail below. I do. As we proceeded with the analysis of the expression of this Hin47 protein, Evidence for a relationship with LtrA has become clear. The hin47 gene H., cannot be classified. Influenzae strain SB12 is amplified by PCR. You get a loan. In FIG. 11, H. Hin47ta from influenzae strain SB12 Protein and H. Amino acids in Hin47 protein from influenzae strain SB33 Noic acid sequences are compared. This comparison shows that both proteins That is, the amino acid sequences are almost the same. FIG. 5 shows plasmids DS-101-11-1 and DS-1048-2. And use them to replace serine-197 with alanine in E. coli. And a Hin47 analog are expressed. FIG. 6 is a flow chart showing a method for purifying a Hin47 analog from a granule fraction of E. coli. FIG. FIG. 7 shows the Hin47 analog obtained by replacing serine-197 with alanine, This shows the state of decreased protease activity against beta casein, Thus, the protease activity of this analog is 10% that of the native Hin47 protein. It can be seen that: Thus, in an embodiment of the present invention, the present invention relates to the case where the protease activity is natural Hin Supply a Hin47 analog that is less than 10% of the H.47 protein; The n47 analog can be produced by replacing the amino acid serine-197 with alanine. Are shown. FIG. 8 shows the improvement in the thermal stability of the Hin47 analog supplied in the present invention. The analysis is illustrated. As examples of the present invention, Hin47s having improved thermal stability Analogs have been supplied, and such Hin47 analogs include the amino acids serine- It was produced by replacing 197 with alanine. FIG. 9 shows that antigens derived from non-Hin47 Haemophilus bacteria were Hin47 and Hin47s. Figure 2 illustrates the state of proteolysis by analogs. In another embodiment of the present invention, Shows another Hin47 analog that does not cause proteolysis by Hin47. This is the amino acid serine-197 substituted with alanine. FIG. 10 and Table 1 show the unmodified native Hin47 and the book in mice. Illustrates immunogenicity comparison with Hin47 analog with reduced protease activity according to the invention Have been. Natural Hin47 protein and Hin47 analog S197A of the present invention Are similar in immunogenicity. In the examples, the protease activity is reduced, and H whose immunogenicity is substantially the same as native Hin47 The in47 analog is shown. In this Hin47 analog, the amino acid Phosphorus-197 was substituted with alanine. Tables 2 and 3 show the bacteremia model in young rats and the immunized chinchillane. Hib analog of Hin47 analog with reduced protease activity in otitis media model Have been shown to be immune protective. In this Hin47 analog, the amino acid Hi s-91 is removed or replaced with alanine, lysine, arginine and Asp-1 21 is removed or replaced with alanine or glutamic acid and serine-197 is Substituted with alanine, cysteine, threonine, or a combination thereof It was synthesized by the following substitution. In another embodiment of the invention, Haemophilus or other bacterial pathogens Supply vaccines to protect against. The pathogen here is the Hin47 protein Produce proteins that elicit antibodies that are capable of recognizing Hin47 or Hin47 Bacteria. The vaccine here is Hin47s with immunity and protection Use analogues, use expected amounts of immunogenic effects, or use Hin A nucleic acid molecule having a nucleotide sequence encoding 47, and a physiologically acceptable It is a vaccine composed of carriers of these substances. Supplied by the present invention This analog is related to Hin47 When making conjugate vaccines for unidentified determinants, haptens, polysaccharides, Can be used as a carrier protein for peptides. As will be clear from the application content described later, the present invention relates to plasmids and Hin47. New strains of bacteria for analog synthesis are also provided. It is derived from Haemophilus influenzae and its protea Purified / isolated DNA encoding the protein Hin47 having a low activity of As a lobe, as a means of identifying Haemophilus strains in vitro or in vivo. And useful. H encoded by the genetic DNA molecule provided by the present invention The in47 analog can be used as a diagnostic agent by using it as an antigen or as an anti-Hin It is useful as an antigen for producing the 47 antibody. In addition, Haemophilus strains and Hi Others that produce proteins capable of inducing the production of antibodies that specifically recognize n47 As an antigen for vaccine production against diseases caused by bacterial pathogens Used to diagnose Haemophilus or other similar bacterial infections. Is available. In a further embodiment of the invention, a reduced protease activity form of the Hin47 analog is provided. Combination of chimeric molecules and conjugate vaccines (including complex carbohydrates) for the protection of pathogenic bacteria such as Shows that it can be used as a carrier molecule when forming ing. For example, the complex type saccharide supplied in the present invention includes lipooligosaccharide (LOS) and Immunity to protect against diseases and infections caused by bacteria with polysaccharide antigens such as PRP Can be used for sensitization. These bacterial pathogens include Haemophilus influenza, S treptococcus pneumonia, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmon ella typhi (S. typhi), streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, K lebsiella, Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), Pseudomonas aerugino There is sa (Pseudomonas aeruginosa). It is possible to conjugate a special antigen to a Hin47 analog Such a joining method is described in the PTC application WO 94/12641, but here is a reference ing. In another embodiment, the Hin47 analog is immune to abnormal polysaccharides in cancer cells. For anti-epidemic sensitization or production of anticancer antibodies that can be conjugated to chemotherapeutic or bioactive agents It shows that it can be used as a carrier when it is manufactured. The Hin47 analog provided in the present invention is H. Influenzae-derived protein So, in the drug that formulated this, H. Prediction of diseases caused by influenzae bacteria Can be used for prevention and diagnosis. The present inventor has reported that this Hin47 analog can be used in live H. influenzae Protective immunity against B-type strain I found that I could elicit a response. Therefore, the present invention is also useful for vaccines. It is clear that it can be used. In addition, the present invention includes a Hin47 analog. 1 shows the nucleotide sequence of the gene to be read. These DNA segments are: By utilizing recombinant DNA technology, PRP and lipo-oligopolysaccharide (LOS) Like, H. Also used to supply immunogens that are essentially unrelated to influenzae antigens it can. The Hin47 analog protein is E. coli. coli, Haemophilus, Bacillus (ba Shirasu, Bordetella, yeast, baculovirus, pox Use the virus or vaccinia virus propagation medium as a suitable expression system This can induce its production. The present invention is essentially a separation / It provides a novel technique for synthesizing purified, pure Hin47 analogs. Examples of the present invention show that Haemophilus infection and specific reaction with Hin47 Infection with other bacterial pathogens that produce proteins capable of inducing the production of antibodies It can be applied to the treatment, diagnosis, and vaccination of illness. It is obvious. Such uses are described in detail below. 1. Vaccines and their uses The above-described Hin47 analog can be used as an immunogenicity inducer for vaccine production . The vaccine is Elicit an immune response and produce phagocytic or bactericidal antibodies, including anti-Hin47 antibodies It is for living. If the vaccine recipient is H. Haemophilus bacteria, To produce a protein that induces the production of antibodies specifically reactive with Hin47 When attacked by any other bacteria, this antibody binds to and invades invading bacteria. Activate. Phagocytic or bactericidal anti-Hin47 antibody protects against other mechanisms Demonstrate. These immunizing agents, including vaccines, can be used as injectable or liquid solutions, or It can be prepared as an emulsion. Pharmaceutical sense for Hin47 analog It is also possible to mix excipients within acceptable limits. With such excipients Water, salt, dextrose, glycerol, ethanol, and There are things that combine. This immunogenic substance or vaccine enhances its effect Ancillary substances such as wetting agents, emulsifiers, pH buffers, or adjuvants Quality may be added. Aluminum hydroxide for perfect adjuvant effect Or aluminum phosphate can be used, but in the normal case it should be 0. 05? 0. Use a 1% phosphate buffered saline solution. Immunogenic substances and vaccines It is administered parenterally by subcutaneous or intramuscular injection. Immunogenic substance according to the present invention Are prepared so that an immune response occurs at the administered mucosal surface It is also possible. This immunogenic substance is delivered to the mucous membrane via the nasal or oral (intragastric) route. Surface administration is possible. It is desirable to administer this in the form of suppositories and oral drugs New In the case of suppositories, the binder and carrier are polyalkali Glycol or triglyceride can be used. When used as an oral drug Uses excipients, such as saccharin, cellulose carbonate, Use magnesium carbonate. The dosage form of this immunogenic substance may be a solution, a suspension, , Tablets, pills, capsules, sustained-release preparations, and powders. The concentration of the 47 analog can also be adjusted from 1 to 95%. This immunogenic preparation and And vaccines can be adjusted in dosage to provide therapeutic, prophylactic / protective, Can be used properly. The dose varies depending on the individual situation of the recipient. The state of an individual's immune function that triggers the body's production and, if necessary, the cellular immune response Prepare by capacity. The exact amount of active ingredient expected at the time of administration is It is left to the judgment of the person. However, for appropriate dosages, It is necessary for the expert to determine, and the dosage of the Hin47 analog may be microg It will be in ram order. The appropriate initial dose also depends on the subsequent dose It varies and the amount of booster antigen varies. In addition, depending on which route Also throw The dose varies, and the amount varies depending on the size of the host. The concentration of the antigen contained in the immunogenic preparation according to the present invention is generally 1 to 95%. is there. If the vaccine contains antigens from only one pathogen, the vaccine Are called monovalent vaccines. On the other hand, vaccines containing antigens from several types of pathogenic bacteria Is called a combination vaccine, which is also a vaccine supplied to the present invention. Mixed Wakuchi In the case of the same pathogen, antigens derived from various pathogens Antigens produced from or a combination of various pathogens Including. Nucleic acid molecules encoding the Hin47 analogs of the invention can be used directly for immunization . For example, this gene DNA is directly administered to the subject to be immunized, or In the case of cropping, there is a method of directly injecting DNA. Furthermore, Salmonella, BCG , Adenovirus, box virus, vaccinia virus, boliovirus There is also a method for immunization by transferring a gene to such a living vector. For live vectors used to carry heterologous antigens to the immune system, see O'Haga n (1992), a method to insert DNA directly into a sample for the purpose of gene sensitization Reported by Ulmer et al. (1993). 2. Immunoassay (immunoassay) The Hin47 analogs of the present invention may be used to immunize to induce the production of anti-Hin47 antibodies. As a source, furthermore, an immunoassay (ELISA: Eliza, RIA: radioimmune) Assay, other non-enzyme linked antigen binding assays or anti-Haemophilus antibodies, anti-H (including methods known as detection techniques for in47 antibodies) Useful. In the Elisa method, the Hin47 analog is converted to a specially selected surface, such as Attach proteins like the walls of a polystyrene microtiter plate To a surface that can be used. Removes incompletely absorbed Hin47 analog Is known to be neutral to antigen-antibody reaction to the specimen after washing. Non-specific proteins such as bovine serum albumin (BSA) solution Bond to the surface. This allows non-specific absorption sites to be blocked on the immobilization surface. To reduce the cause and background of non-specific binding of antiserum to the surface Can be. Next, this immobilized surface should be a material with clinical or biological significance. Contact with a sample consisting of multiple components to promote the formation of immune complex (antigen / antibody) There is also a method of testing a sample by a method. This method includes BSA solution, bovine gamma g With a diluent such as Roblin (BGG), phosphate buffered saline (PBS) / Tween Sa This includes diluting the sample. Thereafter, the sample was heated from 25 ° C. Incubate at 2 ° C for 2-4 hours. After incubation, wash the surface on which the sample is Remove immune complex. This wash may include PBS / Tween or boric acid This includes washing with a fur-like solution. Hin47 combined with test sample After producing a specific immune complex between the analog and the analog, the immune complex is washed. Quality by contacting a second antibody with specificity for the first antibody. The timing and amount of production of the complex can be determined. If the test sample is human If so, the second antibody is to human immunoglobulin (generally IgG) It is an antibody with specificity for it. As a detection method, this second antibody It has an activity such as an enzyme activity that produces color when cultured with various chromogenic substances. Can be made. The degree of color generated here is measured using a spectrum spectrophotometer. Quantitative analysis becomes possible by measuring. 3. Use base sequence as hybridization probe The nucleic acid molecule of the present invention has a base sequence as a hin47 analog gene, Therefore, antibodies that specifically recognize Haemophilus strains and other Hin47 Cloning the hin47 analog gene from bacteria that produce a protein that can be produced Training is also possible. Since this nucleic acid molecule has a base sequence encoding the Hin47 analog of the present invention, Can be used to selectively form complex lengths complementary to another hin47 gene Wear. If you want to give the probe selectivity to search for another hin gene The setting of the hybridization conditions can be varied in various ways. This choice If it is desired to improve the properties, adopt relatively strict conditions when forming the composite material. Use, for example, lowering the amount of sodium chloride and keeping it at a high temperature, Specifically, the amount of NaCl is set to 0.1. 02M to 0. 15M, temperature from 50 to 70 ° C High temperature conditions such as In some cases, the hybridization conditions may be more relaxed. The amount of kana, for example, sodium chloride is set to 0. 15 to 0. 9M and temperature 2 In some cases, it is necessary to set the temperature at 0 to 55 ° C. Hybrid composite materials To destabilize the hybrid, increase the amount of formaldehyde It is also possible to make the forming conditions more stringent. Thus, the hybrid It is possible to freely adjust the conditions for forming the pattern and to select a wide range of conditions according to the desired result There are benefits. In an embodiment for clinical diagnosis, the nucleic acid molecule encoding the hin47 gene of the present invention comprises Can be used in combination with a suitable method such as labeling when forming an hybrid This Are shown. For example, radiation, enzymes, ligands such as avidin and biotin A variety of level indicating methods are known, such as generating a detection signal. That can be done. Another diagnostic embodiment of the invention replaces radiolabels. In addition, enzyme labels such as urease, alkaline phosphate, and peroxidase are used. Indicates that it can be used. In the case of enzyme labeling, the base sequence of the hin47 gene is included. Human eyes to identify the specific hybridization of the sample As an alternative, or to provide a method as seen on a spectrophotometer, Colorimetric indicators are known. The nucleic acid molecule comprising the hin47 gene of the present invention can be used for solution hybridization. It is useful as a probe in an embodiment using a solid phase. Use the fauna Examples include exudates, bodily fluids (eg, serum, amniotic fluid, middle ear exudates, saliva, trachea Alveolar lavage fluid or test DNA from clinical samples such as tissue (or Or RNA) has been shown to be absorbed and adhered to selection matrices and surfaces. You. Thereafter, the immobilized single-stranded nucleic acid is composed of the nucleic acid sequence of the hin47 gene of the present invention. Selective probes will cause specific hybridization under desired conditions . The selection conditions include G + C content, target nucleic acid type, nucleic acid origin, and hybridization. For special standards required according to lid forming probe, etc. Depends on the special environment on which it is based. Remove non-specifically bound probe molecules Special hybrids that follow washing of the hybridization surface to remove Formation can be detected using a label and even quantifying its formation. is there. 4. Expression of a gene encoding an analog of Hin47 with reduced protease activity Contains replicon and control sequences produced from a host-compatible strain Can be used for the expression of the Hin47 analog gene (the present invention Use the current system). Originally, vectors are phenotypes in transformed cells It carries the marker sequence portion and the replicating portion for selection into cells. For example, E. coli is a plasmid containing genes that are resistant to ampicillin and tetracycline. PBR322 can be used to transform cells, and pBR322 is transformed. It is also a convenient means of cell identification. Plasmid pBR322, other bacterial plasmids Rasmids and phages contain or have been modified to contain a promoter. Lomotors are also used when the host produces its own protein. In addition, files that are compatible with the host and contain replicon and regulatory sequences The vector can also be used as a transformation vector in relation to the host. An example For example, lambda GEM-11 phage can be used to produce a recombinant phage vector. This recombinant phage vector (for example, E. coli LE392) is the host It can also be used for transformation. Beta promoters commonly used in recombinant DNA technology include Cutamase (penicillinase), lactose promoter system (Chang et al, 1979; Goedel et al, 1980), T7 promoter system (U.S. Pat. 952, 496). Bases of these nucleic acids The sequence is well elucidated, and those skilled in the Can be ligated to a plasmid vector. Which promoter you choose depends on what you want to achieve . Suitable hosts for expression of the Hin47 analog include E. coli. coli Bacillus strain, Haemo There are philus Bordetella strains, yeast, mammalian cells, etc. Baculovirus expression systems can also be used. The present invention states that recombinant methods are desirable for the production of Hin47 analogs. Particularly preferred hosts for expression of this protein lack LPS That is, Gram-positive bacteria without endotoxin can be mentioned. For example, Bacill US strains, which are especially Useful for making non-pyrogenic Hin47 analogs. Biological deposit DS-10, a plasmid containing the protein encoding the Hin47 analog Prior to this continuation-in-part application, 11-1-1 (pT7 / Hin47 *) On July 27, 1994 in Maryland, U.S.A. as approval number 75845. It has been deposited with the US Microbial Depositary in Rockville. Deposited in this Plasmid samples will be publicly available upon grant of a patent based on the U.S. patent application. It is to be released to the public. The present invention and claims are in this deposit Without being limited to plasmids, it is only one example of the invention. this Insertion of a gene encoding an analog or equivalent antigen described in the application Any equivalent or similar plasmids fall within the scope of the present invention. Example The above disclosure, which has been described generally, illustrates the present invention. The fruit shown below A more complete understanding can be obtained by reference to the examples. The examples shown here are merely illustrative However, the present invention is not limited to them. Appropriate in the surrounding situation In such a case, the form may be changed or replaced with an equivalent. Special use Words may be used, which describe the invention It is not used in a limited sense. Molecular genetics used in this disclosure but not explicitly described Methods in the fields of protein biochemistry and immunology are also well described and evident in the relevant literature. And are within the skill of those skilled in the arts related to the present invention. Example 1 This example demonstrates the use of hi generated from a non-typeable H. influenzae strain SB33. This shows a clone of the n47 gene. Chromosomal DNA was prepared from H. influenzae strain SB33, and the EMBL3 library was prepared. And a labeled oligonucleotide specifically reacting with the 5 'end of the hin47 gene. Screening with a probe. Harkness et al., 1992) According to these methods, H. influenzae strain SB33, which cannot be typed, is Grow on Mueller-Hinton agar or in broth. Chromosome DN A was prepared by the following method. That is, pellet cells from a 50 ml culture. Using a Sorvall RC-3B centrifuge at 5000 rpm. Centrifugation was performed at a rotation speed of 15 to 20 minutes at a temperature of 4 ° C. The separated cells are After resuspension in 10 ml of E solution, 0 μgml^-1And 1% SDS was further added. Until a clear lysate is obtained Samples were incubated at 37 ° C. Gently lyse the lysate once with Tris-saturated pheno And then extracted once more with Tris-saturated phenol / c Extracted with loroform (1: 1) and once more with chloroform. The final liquid phase was separated and dialyzed using 1 M sodium chloride for 24 hours at 4 ° C. After that, the solution was separated and dialyzed against TE for 24 hours. Using Sau3A of the EMBL3 library, a portion of SB33 chromosomal DNA Prepared by digestion, then TNE (20 mM Tris / HCl, 5 mM sodium chloride, 10 to 30% sucrose in 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0) Size separation by gradient or preparative gel electrophoresis was performed. Length is 5KD or less For the fraction containing the above DNA fragment, it was pooled and precipitated, Ligation was performed with BamH of MBL3 (Promega). This linked mixture is in a packaging kit And packaged on E. coli LE392 cells using Gigapack II . After amplification, this library was stored at 4 ° C. in the presence of chloroform. Step Lark is filtered through nitrocellulose,³²p-labeled oligonucleotide probe (3026.SL) for hybridization. Oligonucleotide of The base sequence is ATGAAAAAAACACGTTTTGTATTAAATATAGTA TTGCACTTGG (SEQ ID NO: 3), which is an N-terminal amino acid Corresponding to the acid sequence MKKTRFVLNSIALG (SEQ ID NO: 19) I have. Phage DNA is prepared from plaques and the inserted DNA is digested with SalI Cleavage was performed to generate a clone of PUCB-BgXb digested with SalI. Plasmids JB-103-11-1 and JB-1068-2-2 (FIG. 1) Selected for further analysis. Example 2 This example demonstrates the Hin4 gene and Hin4 produced from NTHi strain SB33. 7 shows the characterization and base sequence analysis of 7 proteins . Restriction enzymes of clones JB-103-11-1 and JB-1068-2-2 According to map analysis and Southern blotting, 4.7 kb BamH I / BamH I or 2.7 kb The hin47 gene will be on the kb BamH I / Pst I DNA fragment. Black The 4.7 kb BamHI / BamHI fragment obtained from JB-1068-2-2 was Cloned into pUCB / BgXb producing plasmid DS-755-1 . The 3.1 kb BamHI to XbaI fragment of DS-755-1 was converted to plasmid JB- Cloned into pUC18 producing 1165-1-1 This pUC18 has a restriction site, which is used for the Erase-a-base (Promega) procedure. (Figure 1). According to this technique, the cutting of the inserted DNA is increased. This allows continuous production of clones. As a result, the clones produced The base sequence will be rapidly determined using an immer. DNA from plasmid JB-1165-1 was digested with BamHI and SacI. Then, exoII digestion is performed with the Erase-a-base kit. Agar Analyze by Rose gel electrophoresis and select representative plasmids for sequence analysis You. Plasmid DNA for sequencing was prepared using the Holmes / Quigley method (Holmes and Quigley, 1981). To briefly describe the modification method, 50 m 1 ml of cells taken from the culture solution in 10 ml of STET (8% sucrose, 5% Triton X-100, 50 mM EDTA, 50 mM Tris / HCl, pH 8.0) Re-suspend, add lysozyme and boil the mixture for 2 minutes. That sun The pull is centrifuged in a centrifuge Solval RC5B at 14,000 rpm for 20 minutes. After that, the supernatant was precipitated with the same amount of isopropanol, and 70% ethanol was added. Washed with ethanol, washed with pure ethanol and air-dried. Add cell pellet to 0. Resuspend in 9 ml of TE, 5 mg^-1RNAs 20 μl of eA was added. Thereafter, the mixed substance was cultured at 37 ° C. for 15 minutes. After adding 500 μl of 1.5 M NaCl / 30% PEC, the mixed substance was added to 3 μl. Incubate on ice for 0 min and centrifuge for 10 min in an Eppendorf centrifuge And the DNA was pelleted out. Place the cell pellet in 400 μl TE And trisaturated with Tris-saturated phenol (pH 7.4) three times. 2 extractions with chloroform / chloroform (1: 1) and twice with chloroform. 3 DNA was precipitated by adding 40 μl of M · acetone acetone and 1 ml of ethanol. And then washed with 70% ethanol and resuspended in distilled water. The base sequence of the DNA sample is ABI model 370A DNA sequencer And die terminator chemistry. hin47 gene coding A universal reverse probe along with a set of clones is used to determine the base sequence of the strand. Limer was used. Non-code oligonucleotide primers of about 25 bases It was used for the purpose of confirming the base sequence of the ring. Nuku of SB33 / hin47 gene FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the reotide and the amino acid sequence of the Hin47 protein. this About the nucleotide base sequence and N-terminal amino acid sequence of Hin47 protein United States Microorganisms held in New Orleans May 26-30, 1992 Society This was shown in the lower part of FIG. Of SB33 / Hin47 protein The amino acid terminal sequence and the sequence of the protein of the present invention are identical, Region gene shows the identity as hin47. Example 3 This example describes the discovery of the serine protease activity of the Hin47 protein. Is shown. The amino acid sequence of the Hin47 protein determined in the above example was Compared to all proteins registered in the link. As described above, Hin4 7 proteins are listed in PCT Application WO94 / 00149, WO92 / 11367, WO92 / 10936 and is an adhesin molecule of Haemophilus It has been shown. A surprising and unexpected finding in the present invention is that of Hin 47 protein is a serine protease E. coli htrA. S.typhimurium htrA, And important amino acids with homology (55%) to other proteases That is. FIG. 3 and FIG. It is shown in FIG. In addition, the Hin47 protein is used in cell lines, such as Pefablock. It has also been discovered that autolysis occurs in the absence of protease inhibitors. Example 4 This example demonstrates the production of mutant hin47 gene by site-directed mutagenesis. It is an indication of the excess. As mentioned above, H. influenzae Hin47, E. coli htrA , S. Typhimurium are all serine proteases. Serine protease The consensus sequence of the active center is GDSGGPK (SEQ ID NO: 18). Yes, serine is the active residue. All htrA proteins are GNSGGAL (S SEQ ID NO: 17), and H. influenzae Hin47 contains the mature protein There is an identical sequence between residues 195 and 201. Thus, protease activity If a reduced sex Hin47 analog is produced, this serine residue 197 is partially It will be chosen as the site for site-directed mutagenesis. Oligonucleotide / CGCTCCACCAGCATTACGCGCGG (SE QIDNO: 20) is produced, which converts the serine residue at position 197 to alanine. It has been replaced. The hin47 gene was cloned into M13mp18, Produced clone DS-981-3, and used in the US, in vitro, and site-specific. Mutagenesis was induced using a mutagenesis kit. By nucleotide sequence analysis, DS-991-8 was identified, and a mutation from serine-197 to alanine was found. Was happening. This mutant hin47 gene was called "hin47 *". Suitable Use proper oligonucleotide Thus, the serine residue at position 197 is cysteine (mutant S197C) and threo Converted to nin (mutant S197T). Furthermore, as shown in FIG. 4, the amino acid sequence of Hin47 and another protease As a comparison, to produce a protease-reduced Hin47 analog, Mutagenesis of amino acids His-91 and Asp-121 proved to be appropriate did. By the same mutagenesis method as described above, these amino acids His- 91 and Asp-121 were removed or replaced with another amino acid. this Amino acid His-91 may be substituted with alanine (mutant H91A) and arginine (mutant D121A) with the amino acids Asp-121 With alanine (mutant H91A) and glutamic acid (mutant D121E) Replaced. Such mutagenized oligonucleotides are as follows: His-91-> Ala-91 5'ATCAATAACAGCATTATT ATTGGT 3 '(SEQ ID NO: 21) Asp-121-> Ala-121 5'TAATGCAATTGCTGAT AGTTC3 '(SEQ ID NO: 22) The corresponding oligonucleotide to induce another mutation Retotide was used. Numerous mutants were induced, His-91 and Serine-1 97 was replaced with alanine (mutant H91A / S197A) and His-91 , Alp-121 and Ser-197 were all substituted with alanine (mutant H91A / D121A / S197A). In the previous example regarding Hin47 * raw material, As such, these additions were produced to confirm the decline in protease activity. Mutants were extracted, purified, and tested. Many serine proteases are secreted in an inactive (like zymogen) state And required an incision to see the active center. Mature natural Hin47 protein As a result of analyzing the N-terminal nucleotide sequence of the protein, KFFFG DRFAWQ (SEQ I It turns out that cell division of preprotein occurs at the position of D NO: 23). did. Amino acids that block cell division of molecules that produce active protease molecules By decorating, it is possible to express Hin47 analog with reduced protease activity. You can do it. Example 5 This example demonstrates the expression of a Hin47 analog in which Ser-197 has been replaced with alanine. 1 shows the structure of an Escherichia coli plasmid used for the above. Mutation from plasmid DS-991-8 Cloning of the pT-7 expression vector for the hin47 * gene 101-1-1 was produced (FIG. 5). Transform E. coli strain BL21 / DE3 To produce Escherichia coli strain DS-1018-3-1 by Ser-19. A Hin47 analog with 7 replaced by alanine was expressed. Cloning the hin47 * gene to use tetracycline selection To obtain pBR328. For the production of BglII / BamHI fragments, Bgl II / Cla IT7 / hin47 gene fragment derived from Sumid DS-101-1-1 Cloning produces pEVvrfl (Young and Davis, 1985). Can be further cloned into pUC-4K (Pharamacia) that is digested with BamHI. Produced The clone DS-1034-3 was digested with EcoRI and the T7 / hin47 * gene The fragment was cloned into pBR328 and plasmids DS-1048 and DS-108 were cloned. 1067-2 is produced. Introduction of plasmid DNA into E. coli strain BL21 / DE3 Then, DS-1071-1-1 and DS-1071-3-1 are generated, and this is Expresses a Hin47 analog in which Ser-197 has been replaced with alanine. Example 6 In this example, the generation of a Hin47 analog in which Ser-197 was replaced with alanine was described. This shows the current state. DS-1018-3-1, DS-1071-1-1, DS-1071-1-1 With NZCYM + 3% dextrose + antibiotic (25 μg · ml^-1Ampiciri Or 10μg ・ ml^-1) In a mixed culture medium at 37 ° C, cultivate all day and night while shaking. Nourished and grown. After diluting this day / night culture solution 1:40 and sonicating The cells were placed in the same culture medium, and cultured with shaking until the absorbance reached about 0.3. To induce expression from the T7 promoter, 10 minutes of 10% lactose One volume was added. Culture using a Sorvall RC-3B centrifuge The solution was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes at a temperature of 4 ° C., and then for 4 hours. A cell sample was removed. Example 7 This example shows extraction and purification of Hin47 protein. Hin47 Is expressed as a soluble protein in E. coli. 25 prepared in Example 6 The cell pellet removed from the 0 ml culture solution was added to 40 ml of 50 mM Tris-HCl (p. H8.0) and disrupted by sonication. 20,000x this extract Centrifuged at g. 95% or more of the supernatant liquid taken out is soluble Hin4 7 proteins, which were stored. The fraction generated here is referred to as “Hin47 We decided to call it "fluid." Further, this Hin47 extract was subjected to DEAE model Sephacel column (S ephacel column). 20 ml of 40 ml Hin47 extract l-type DEAE model Sephacel column (50 mM Tris-HCl, pH 8.0) ). Hin47 adhered to the column under these conditions. Furthermore, this color 100 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM sodium chloride Then, the plate was sequentially washed with 100 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing the system. Hi n47 was diluted with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 40 mM sodium chloride. I shouted. Hin47 in the fractions was quantified by BCA protein assay. Achieved The purity of Hin47 was measured by SDS-PAG analysis. Fractions containing Hin47 In the combined state, it was stored at -20 ° C. Wild-type Hin47 protein that accounts for most of the mutants produced as a granular fraction The only protein that is as soluble as protein is H91A, a mutant. Was. Example 8 This example demonstrates the extraction and purification of Hin47 in which Ser-197 was replaced with alanine. Shows the process. Hin47 in which Ser-197 was substituted with alanine was expressed in the granule fraction of E. coli. Was done. 250ml culture solution Of the cell pellet (prepared in Example 6) taken from Resuspend in Tris-HCl (pH 8.0) and sonicate (3 × 10 min, 70% efficiency size) Kuru) destroyed. The extract was centrifuged at 20,000 xg, and the cell The let was saved. The cell pellet is mixed with 40 ml of 50 mM Tris-HCl, 0.5 % Triton X-100, 10 mM EDTA (pH 8.0). Hanging The suspension was sonicated (10 min, 70% efficiency cycle). 300xg extract For 5 minutes. The supernatant liquid taken out here is 20,000 xg at 3 The resulting cell pellet was stored by centrifugation for 0 minutes. The cell pellet 50 mM Tris-HCl, 0.5% Triton X-100, 10 mM EDTA (p H8.0). The suspension was washed with 50 mM Tris-HCl (pH 8) containing 8 M urea. . 0). Using 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), The concentration of urea was adjusted to 2M. Hin47 in which Ser-197 is substituted with alanine Completely dissolved under these conditions. The final volume of this solution was 20 ml. This fraction Was called "Hin47 analog-extract". Hin47 analogue-DEA Purified on an E. model Sephacel column. 20ml of Hin47 analog The extract was subjected to a 10 ml DEAE model Sephacel column (50 mM Tris salt). acid, pH 8.0). Similar to Hin47 in which Ser-197 is replaced with alanine The body adhered to the column under these conditions. Further, this column is treated with 50 mM Tris-HCl. (PH 8.0), and the Hin47 analog was washed with 5 mM containing 30 mM sodium chloride. It was diluted with 0 mM Tris-HCl (pH 8.0). Similar to Hin47 in this fraction Body mass was measured by the BCA protein assay. Purity of Hin47 analog by SDS -Measured by PAG analysis (FIG. 6). Combining fractions containing Hin47 -2 Stored at 0 ° C. Example 9 In this example, synthesis was performed by substituting Hin47 and Ser-197 with alanine. 9 shows the protease activity of the Hin47 analog. Enzyme activity of Hin47 analog in which Hin47 and Ser-197 are substituted with alanine Sex was analyzed using beta casein as a substrate (FIG. 7). This reaction mixture Products include 5 μg beta casein and Hin47 or a Hin47 analog. Including The reaction was allowed to proceed at 37 ° C. for 2 hours, after which SDS—sample buffer The solution was added and stopped immediately by heating at 100 ° C. for 5 minutes. Aliquot (part Minute sample) was analyzed by SDS-PAGE. As shown in FIG. Digestion of beta casein by n47 after 2 hours (Panel A, row 1) and its degree of digestion includes the Hin47 analog Stronger than the fractions (panel A, row 2) and without exogenous proteins involved (Panel A, row 3). Hin47 or Hin47-like in these mixtures The presence of the body was determined by immunoblot using a monoclonal antibody against Hin47. (FIG. 7, panel C, rows 1, 2). Hin47 or Hin47 analog under conditions of 4 ° C and -20 ° C Through analysis of autolysis, Hin47 and Ser-197 were replaced with alanine. The activity with the Hin47 analog was compared. Therefore, purified Hin47 or Stored the analog at either 4 ° C. or −20 ° C. for 20 days. After saving, Aliquots are removed on day zero, day 10, and day 20, Hin47 or H The thermal stability of the in47 analog was determined by immunoassay using the Hin47 monoclonal antibody. Analyzed by blotting (FIG. 8). Keep at 4 ° C or -20 ° C for 20 days When present, the Hin47 analog was more thermally stable than Hin47 . The protease activity of the Hin47 analog in which Ser-197 was replaced with alanine was determined. For further testing, the 80-kD of Hin47 or Hin47 analog a. The ability to disrupt H. influenzae recombinant antigen was measured. Hin47 or Another of the Hin47 analogs A mixed antigen test was performed to determine the enzymatic degradation effect on the antigen. In this test , Hin47 or a Hin47 analog (47 kDa), 80-k Da.H. influenzae recombinant antigen (TBP1) was selected. Five kinds of mixed substances It was prepared as follows. 80-kDa protein only, 80-kDa protein + Hin47, 80-kDa protein + Hin47 analog, Hin47 only , Hin47 analog only. The amount of each protein in the mixed substance is 5 μg Met. The mixture was stored at 4 ° C. for 4 weeks. Zero days, 7 days, 14 days after storage Aliquots were taken out on days 28 and 28 and subjected to SDS-PAGE analysis (FIG. 9). One week later, both the 80-kDa protein and Hin47 were greatly disrupted. Broke (lines 2 and 4). In contrast, the 80-kDa protein and Hin47 The mixture of analogs remains intact after one week and slightly after four weeks. It only showed crab decay (line 3). For the protease activity of other Hin47 analogs, see Lipinska et al. et al), using the enzyme digestion reaction of beta-casein. Table 3 shows the results. Serine to only one mutant (D121E) It was observed that it retains Rotase activity. Example 10 This example demonstrates the immunogenicity ratio of Hin47 and Hin47 analogs in mice. Shows a comparison. FIG. 10 is similar to Hin47 in which Hin47 and Ser-197 were substituted with alanine. The results of comparative tests on the immunogenicity of the body are shown. 5 Balb / c mice per group 5 groups were prepared, and 1 μg of Hin47 or Hin Any of the 47 analogs can be_Four(1.5 mg per dose) On day 1, day 29 and day 43, they were injected subcutaneously three times a day. 14 days after the injection, Blood was collected on days 28, 42, and 56 (this was blood sample 1, 2, 3 and 4), the strength of the anti-Hin47 antibody by the EIA method. The titer was analyzed. Anti-Hin47 antibody in mouse serum was tested with Paneti (Panezu tti et al, 1993). 1 μg of H in microtiter wells Either in47 or Hin47 analogs are coated for 16 hours at room temperature I left it. Plates were blocked with 0.1% bovine serum albumin in PBS. Was. Mouse serum was serially diluted and added to the wells, and then cultured at room temperature for 1 hour. Pe Goat anti-mouse IgG (Fc-specific) antibody conjugated with TA purified F (ab ')_TwoThe fragment was used as a second antibody. Tetra Methyl Benzydene (TMB ・ H_TwoO_Two) To allow the reaction to proceed With a wavelength of 450nm (Mutiskan, MCC, microplate reader) The absorbance at 540 nm was used. Dilute the antiserum reaction titer Of the uninjected serum sample. Indicated. As can be seen from FIG. 10, in the mouse, Hin47 and the Hin47 analog Both, Hin47 or mutant can be used as antigen in EIA method Irrespective of whether or not they showed considerable IgG titers. Immunogenicity studies using H91AHin47 analogs were also performed. This analog is S It was found to show an immune response equivalent to the 197A Hin47 analog. Hin47 or a Hin47 analog in which Ser-197 was replaced with alanine. To further test the immune response that occurs, anti-Hin47 IgG The subclass was measured. 1 μg of purified Hin4 in microtiter wells Either 7 or the analog was coated. Prepared for comparative immunogenicity studies The final mouse serum samples were pooled and tested by the EIA method. This EIA In the test, rats, anti-mouse and Ig conjugated with peroxidase were used as antigens. G, IgG_2a, IgG_2bRabbit and anti-mouse conjugated with peroxidase IgG3 was used. Intersection To avoid reactions, use the purified antibody subclass and dilute each conjugate dilution. It was measured. The reaction titer was determined by the method described above. As shown in Table 1, Induced in E. coli by either Hin47 or a Hin47 analog The IgG subclasses are identical, which is Hin47 or Hin47-like It has nothing to do with whether the body can be used as an individual antigen in the EIA method. Mouse serum Of the groups, the IgG1 isotype showed a pronounced IgG response . Thus, the Hin47 analog exhibits substantially the same immunogenicity as the native protein. It will be. Example 11 In this example, Hin4 in which Hin47 or Ser-197 was substituted with alanine was used. 7 shows the immunoprotective ability of 7 analogs. H.influe of Hin47-specific antiserum in a bacteremia model of young rats From the ability to protect against MinnA derived from nzae strain b, Hin47 or Ser-19 was used. The immunoprotective ability of the Hin47 analog in which 7 was substituted with alanine was analyzed. Table 2 The result is shown. 0.1 ml rabbit, anti-Hin47 analog, antiserum or One of the same pre-bleed serum was applied to the neck of 6-day-old Wistar juvenile rats. It was inoculated subcutaneously on the back. In addition, these groups had a growth of 700 cfu after 24 hours. Sa Freshly grown fresh Hib strain MinnA was administered intraperitoneally. 20 hours later, abdominal cavity Blood was collected from rats administered internally, transferred to chocolate agar plates and cultured . After 24 hours, bacterial colonies could be counted. As shown in Table 2, anti-H Three of nine animals in the group inoculated with the in47 analog / antiserum had bacteremia in their blood. No symptoms were noted. In the group inoculated with Hin47 analog / antiserum (11%) The amount of bacteria recovered from the blood was higher than in mice inoculated with pre-bleed serum. Was only one. In contrast, nine mice inoculated with pre-bleed serum Bacteria were recovered in all. 4 out of 9 animals (44%) inoculated with pre-bleed serum , The level of the number of bacteria in the blood (500-1000) was high. Bacteremia model of immature rats was tested using anti-Hin47 serum or anti-Hin47 Against bacteremia caused by H. influenzae / type b strain infection of mutant / antiserum It was used to evaluate the protective abilities. 6 out of 10 juvenile rats These sera were used for wild-type Hin47, H91A / Hin47, S197A / H Demonstrated protective ability against in47 analogs. Example 12 This example shows the induction of Hin47 synthesis under stressed conditions. H. influenzae strain Eagan was replaced with hemin (2 μg^-1) And NAD (2μg ・ ml^-1 A) at 37 ° C. in a BHI broth containing₅₉₀= 0.3. This Remove the sample aliquots at 37 ° C, 42 ° C, 43.5 ° C, and Is 6% ethanol, 0.2 M sodium chloride, or 0.3 sodium chloride Grown in the presence of E. coli strain JM109 was grown at 37 ° C. in YT₅₉ ₀ = 0.3, and aliquots were removed in the same manner as above. Sun Pulls were collected at 0, 20, 40, 60, 90 minutes and the OD method and SD Analysis was performed by S-PGE / Western blotting. H.influenzae / Hin47 and E.coli Guinea pig antiserum that recognizes htrA was used for Western blot analysis. 4 When grown at 3.5 ° C., a large amount of E. coli / htrA / protein is synthesized and H.in Only small amounts of fluenzae / Hin47 / protein were found. 6% ethanol E. coli / htrA / protein and H. influenzae / Hin4 7. Synthesis of both proteins was induced. If the salt content is high, this protein The synthesis of either one became weaker. These results indicate that Hin47 responds to stress. It is a protein that induces E. coli / htrA / protein synthesis under similar conditions. Is shown. Example 13 This example shows the purification of H91A.Hin47 protein. This soluble H91A • Hin47 protein was replaced with wild-type Hin in Example 7. A hydroxyapatite (HAP) column was used in the same way as for the 47 protein. Purified by the additional method. The HAP column contains 10 mM sodium phosphate buffer ( pH 8.0) and a DEAE column was set. H91A / Hin47 Tan The protein adhered to the HAP column. 175 mM sodium phosphate The column was washed off with buffer buffer. 300 mM sodium phosphate buffer (p H91A / Hin47 protein eluted at (H8.0) was stored at -20 ° C. Example 14 This example demonstrates Hin47 and Hin47 in the otitis media model of the chinchilla cat. This shows the protective ability of the mutant. By wild-type Hin47, H91A-Hin47, S197A-Hin47 In order to evaluate the protective ability caused by active immunization, a model of otitis media in a chinchilla cat used. Hin47 (H91A) or Hin47 mutation conjugated to AIPO4 The body (S197A) was administered in a single dose of 30 μg on days 1, 28 and 42. The cat was inoculated intramuscularly three times a day. On the 56th day, this chinchilla cat -1000 CFU (colony forming unit) of bacteria, virulent NTHi strain SB12 Was inoculated. Middle ear exudate 4 days after inoculation after monitoring by eardrum and otoscopy Was taken out and cultured on a chocolate agar medium. 24 hours after bacterial colonies I did it. Wild-type Hin47 and H91A / Hin47 proteins Protects 50% of test animals, but S197A / Hin47 does not. . Summary of internal customers disclosed The present invention reduces protease activity to about 10% of the native Hin47 protein. A new Hin47 protein analog derived from H. influenzae, It supplies a separated and purified DNA encoding the in47 protein. Protein modifications are possible within the scope of the present invention. Group # 1: Collected and pooled from a group of 5 animals receiving Hin47 inoculation. Immune serum. Group # 1: Collected from a group of 5 animals inoculated with the Hin47 mutant Pooled immune sera. Plates were coated with either Hin47 or the Hin47 mutant. did. Rabbit anti-Hin47 suddenly changed to a group consisting of 9 young rats 6 days old. Either the variant antiserum or the corresponding pre-bleed serum was injected subcutaneously. 2 Four hours later, the same rat was intraperitoneally injected with MinnA derived from 700 cfu H. influenzae strain. Was administered internally. Blood was collected 20 hours after administration. Anti-Hin47 * antibody: purified Hin47 mutant in CFA / IFA Rabbit immune serum prepared as against. Mean bacterial recovery in immunized group: 100 cfu / 2.5 μl blood; control From group: 290 cfu per 2.5 μl of blood. a Protease activity is measured by the digestive ability of temperament beta casein. b Solubility refers to production as a soluble protein (-) or as a granule fraction. c Protection in a passive model of bacteremia in young rats. d Protection in chinchilla cat otitis media model. e ND not identified.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｆ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:21） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヤング、ヤン−ピンカナダ国エム２アール３エヌ７オンタリオ州ウイロウダールアパート. 1709 トーレスダールアヴェニュー 120 (72)発明者チョン、ペレカナダ国エル４シー０ビー６オンタリオ州リッチモンドヒルエストリルストリート 32 (72)発明者ウーメン、レイモンドピー. カナダ国エル０ジー１ティー０オンタリオ州スコームベーグアール．アール．ナンバー１ (72)発明者クライン、マイケルエイチ. カナダ国エム２ピー１ビー９オンタリオ州ウイロウダールムンロブールヴァード 16──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification symbol FI C12P 21/02 C12P 21/02 C G01N 33/53 G01N 33/53 D 33/569 33/569 F // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:21) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR , IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP ( KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK , TJ, TT, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Young, Jan-Ping Canada M2 R3 N7 Ontario Willowdal Apartment. 1709 Torresdal Avenue 120 (72) El 4Sea 0B6 Canada Richmond Hill Estoril Street, Ontario 32 (72) Inventor, Raymond P. Canada El 0G 1tee 0 Ontario Scombebeg Earl. R. Number 1 (72) Inventor Klein, Michael H. M2P1B9 Canada Willowdal Munro Boulevard 16 Ontario

Claims

[Claims] 1. Reduced protease activity to about 10% of native Hin47 protein An isolated and purified Hin47 protein analog derived from Haemophilus influenzae. 2. Claim 1 wherein the immunogenicity is substantially the same as the native Hin47 protein Analog. 3. Amino acids of natural Hin47 protein causing protease activity Remove at least one, replace with another amino acid, or By inserting at least one of them into the natural Hin47 protein, An analogue of claim 1 having reduced activity. 4. At least one amino acid that is removed or replaced is a native Hin An analogy of claim 3 selected from 195 to 201 of 47 protein amino acids body. 5. An analog of claim 4 wherein the at least one amino acid is serine-197 body. 6. Serine-197 substituted with alanine, cysteine, or threonine. An analogue of Lame 5. 7. Histidine, wherein the at least one amino acid is a natural Hin47 protein An analog of claim 3 which is -91 or Asp-121. 8. Hitsugin-91 is alanine, lysine, or An analogue of claim 7 substituted with arginine. 9. An analogue of claim 7 wherein Asp-121 is replaced by alanine. 10. An analogue of claim 4 wherein multiple amino acids are removed and substituted. 11. Several amino acids include His-91 and Ser-197, which are An analogue of claim 10 which is removed or replaced by alanine. 12. Several amino acids include His-91, Asp-121 and Ser-197 Wherein the analogs of claim 10 are removed or replaced by alanine . 13. Reduces protease activity to about 10% of native Hin47 protein The isolated and purified Hin47 protein analog derived from Haemophilus influenzae Isolation and purification consisting of the encoding mutant Haemophilus influenzae hin47 gene Nucleic acid molecule. 14． The immunogenicity of the encoded analog is substantially similar to the native Hin47 protein. 13. The nucleic acid molecule of claim 13 which is identical. 15. Wild-type hin47 encoding an amino acid causing protease activity At least one codon in the gene has been removed or replaced, At least one codon must be in the wild to synthesize the mutant hin47 gene. Inserted into the type hin46 gene The nucleic acid molecule of claim 13. 16. At least one of the removed or replaced codons is a native Hin47 protein. Claims encoding at least one of amino acids 195 to 201 of protein 15 nucleic acids. 17． Claim 1 wherein at least one of the above codons encodes serine-197 6. The nucleic acid of 6. 18. The codon encoding serine-197 is alanine, cysteine or threo The nucleic acid molecule of claim 17 replaced by a codon encoding nin. 19. At least one of the above codons is a His-protein of the native Hin47 protein. The nucleic acid molecule of claim 15 which encodes 91 or Asp-121. 20. The codon encoding His-91 is alanine, lysine or arginine. The nucleic acid molecule of claim 19, wherein the nucleic acid molecule is replaced with an encoding codon. 21. Codon coding for Asp-121 replaced by codon coding for alanine Claim 19. The nucleic acid molecule of Claim 19, wherein 22. Mutant gene for site-directed mutagenesis of wild-type hin47 gene 14. The nucleic acid molecule of claim 13 further synthesized. 23. The nucleic acid molecule of claim 10 wherein multiple codons are removed or replaced. 24. These multiple codons encode His-91 and Ser-197, and Claim 23 wherein the codon coding for lanin is removed or replaced Nucleic acids. 25. These multiple codons are His-91, Asp-12 and Ser-197. And is removed or replaced by a codon encoding alanine The nucleic acid of claim 23. 26. A plasmid vector into which the nucleic acid molecule of claim 13 is inserted, Recombinant plasmid used for primary transformation. 27. Plasmid (DS-101-1-1 (pT7 / Hin47 *)) Of claim 26 deposited with the Depositary Agency (ATCC) as grant number 75845. Recombinant plasmid. 28. A transformed cell comprising the recombinant plasmid of claim 26. 29. Reduces protease activity to about 10% of native Hin47 protein Of the isolated and purified Hin47 protein analog from Haemophilus influenzae A method comprising a synthetic method comprising: At least one Hin47 protein causing protease activity Identifying amino acid residues, By removing or substituting the nucleotide sequence encoding the above amino acid, To synthesize the mutant hin47 gene, site-directed mutagenesis of the hin47 gene was performed. To wake up Introducing a mutant hin47 gene to produce transformed cells, The transformed cells can be grown to produce Hin47 protein analogs. When. 30. At least one of the above amino acids is from 95 of the native Hin47 protein 201. The method of claim 29 selected from 201. 31. Claim 30 wherein at least one of the above amino acids is serine-197 Method. 32. Serine-197 replaced with alanine, cysteine, or threonine The method of claim 30. 33. At least one of the above amino acids is a natural Hin47 protein sheep 29. The method of claim 29 which is As-121 or Asp-121. 34. Claims in which hitsudine is replaced by alanine, lysine, or arginine 33 methods. 35. The method of claim 33 wherein Asp-121 is replaced with alanine. 36. 30. The method of claim 29 wherein a plurality of amino acids are removed or substituted. 37. Several amino acids are His-91 and Ser-197, which are excluded. 36. The method of claim 36 which is removed or replaced with alanine. 38. Multiple amino acids are His-91, Asp-121 and Ser-197 The method of claim 36 wherein these are removed or replaced with alanine. 39. Introduction of the mutant hin47 gene produces transformed cells, The mutant hin47 gene is under the control of the T7 promoter, and Cell proliferation and expression of a Hin analog by the T7 promoter described above The method of claim 29 performed by roasting in a roasting ground adjusted to an induced concentration. 40. The introduction of the mutant hin47 gene has been approved by the United States Microbial Depositary, approval number 758. Recombinant plasmid DS-101-1-1 (pT7 / Hin47) deposited at No. 45 40. The method of claim 39, wherein the method is performed by transforming the cell using 41. An immunologically effective amount of a Hin analog of claim 2 or a nucleic acid of claim 14 An immunogenic composition comprising: 42. Hin47 protein or specifically inhibits Hin47 protein in the host. Bacterial pathogens producing proteins capable of inducing the production of corresponding antibodies Vaccines for in vivo administration to a host to protect against the causative disease Clay prepared as An immunogenic composition of M41. 43. The immunogenic composition of claim 42 wherein the bacterial pathogen is Haemophilus sp. . 44. Immunization of claim 43 wherein the Haemophilus species is Haemophilus influenzae Original composition material. 45. Claim 42 comprising at least one other immunogenic or immunostimulant Immunogenic composition. 46. Administering an immunologically effective amount of claim 41 immunogenic composition into the host Eliciting an immune response. 47. Reacts specifically with Hin47 protein in the specimen, consisting of the following procedure Methods for quantifying antibodies: (A) Reacts specifically with Hin47 protein in Hin analogs and specimens In order to synthesize a complex consisting of any of the above antibodies, the sample was Contacting with a Hin47 analog; (B) identifying the synthesis of the complex. 48. Identify the presence of Hin47 protein in the sample, comprising the following steps Method: (A) To produce antibodies that specifically react with the Hin47 protein, Immunizing a subject by administering an immunogenic composition of Lame 41. (B) any Hin47 proteins and proteins present in the specimen To produce a complex consisting of antibodies that react specifically with Contacting, and (C) identifying the production of the complex. 49. In a sample that specifically reacts with the Hin47 protein consisting of: Diagnostic kit to identify antibodies: (A) a Hin47 analog of the claim, (B) producing a complex consisting of the analog and the antibody described above in the sample; A device for contacting the analogue with the analyte, and (C) an apparatus for identifying the production of this complex. 50. Haemophilus.influenzae-derived Hi isolated and purified by the following method Means for providing n47 protein analogs: For transforming and producing transformed cells having the granule fraction containing the Hin47 analog Implementing the method of claim 29, Disrupt the transformed cells grown to produce the supernatant and the granule fraction. When, Dissolving the granular fraction to produce a solution containing the Hin47 analog , A solution of the Hin47 analog using cell chromatography without cell debris Purification, and Separating the purified Hin47 analog. 51. Following the method of claim 39, claim 23 The method of claim 50 practicing the method. 52. An analog of claim 1 conjugated to a polypeptide, protein, or polysaccharide Chimeric molecule.