JP2001523954A - 76 kDa, 32 kDa, and 50 kDa Helicobacter polypeptides and corresponding polynucleotide molecules - Google Patents

76 kDa, 32 kDa, and 50 kDa Helicobacter polypeptides and corresponding polynucleotide molecules

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヘリコバクター感染症を予防または治療するためのワクチン接種法において用いることができる、76kDa、32kDaおよび50kDaヘリコバクターポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについて開示する。本発明はまた、これらのポリペプチドを用いる診断法も開示する。   (57) [Summary] The present invention discloses 76 kDa, 32 kDa and 50 kDa Helicobacter polypeptides, and polynucleotides encoding these polypeptides, which can be used in vaccination methods to prevent or treat Helicobacter infections. The present invention also discloses diagnostic methods using these polypeptides.

Description

【発明の詳細な説明】 76kDa 、32kDa、および50kDaヘリコバクター(Helicobacter)ポリペプチド および対応するポリヌクレオチド分子 本発明は、ヒトのような哺乳動物におけるヘリコバクター(Helicobacter)感 染症を予防または治療する方法において用いることができる、ヘリコバクターポ リペプチドおよび対応するポリヌクレオチド分子に関する。 発明の背景 ヘリコバクター(Helicobacter)は、哺乳類の胃腸管でコロニーを形成する、 らせん状のグラム陰性菌属である。いくつかの種は胃にコロニーを形成し、最も 有名なものはH.ピロリ(H.pylori)、H.ヘイルマニ(H.Heilmanii)、H.フ ェリス(H.felis)、およびH.ムステラ(H.mustelae)菌である。H.ピロリ 菌はヒトへの感染に最も一般的に関連する種であるが、H.ヘイルマニ菌およびH .フェリス菌も、H.ピロリ菌よりは頻度は低いが、ヒトから単離されている。先 進国では成人集団の50%以上がヘリコバクターに感染しており、開発途上国およ びいくつかの環太平洋諸国ではほぼ100%が感染しているため、世界中で最も流 行している感染症の一つとなっている。 ヘリコバクターは、胃炎および消化性潰瘍の組織学的徴候を有するヒトの胃生 検から一般的に回収される。実際に、H.ピロリ菌は、それが引き起こす慢性胃 炎が消化性潰瘍病および胃癌を発症させる危険因子であるという点において、現 在ではヒトの重要な病原体として認識されている。したがって、ヘリコバクター 感染を予防および治療するための安全かつ有効なワクチンを開発することが非常 に望ましい。 多くのヘリコバクター抗原が、特徴付けられているか、または単離されている 。これらの中には、約30および67kDaの2つの構造的サブユニットからなるウレ アーゼ(Huら、Infect.Immun.58:992、1990;Dunnら、J.Biol.Chem.265: 9464、1990;Evansら、Microbial Pathogenesis 10:15、1991;Labigneら、J .Bact.,173:1920、1991);87kDaの空胞形成細胞毒素(VacA)(Coverら、J .Biol.Chem.267:10570、1992;Phadnisら、Infect.Immun.62:1557、1994 ;国際公開公報第93/18150号);細胞毒素に関連した128kDa免疫優性抗原(Ca gA、TagAとも呼ばれる;国際公開公報第93/18150号;米国特許第5,403,924号) ;13および58kDaの熱ショック蛋白質HspAおよびHspB(Suerbaumら、Mol.Microb iol.14:959、1994;国際公開公報第93/18150号);54kDaのカタラーゼ(Hazel lら、J.Gen.Micobiol.137:57、1991);15kDaのヒスチジンリッチ蛋白質(H pn)(Gilbertら、Infect.Immun.63:2682、1995);20kDaの膜関連リポ蛋白 質(Kostrcynskaら、J.Bact.176:5938、1994);30kDaの外膜蛋白質(Bolin ら、J.Clin.Microbiol.33:381、1995);ラクトフェリン受容体(FR 2,724,9 36);および、HopA、HopB、HopC、HopD、ならびにHopEと名付けられた、分子量 が48〜67kDaである、いくつかのポーリン(エクスナーら(Exner)、Infect.Im mun.63:1567、1995;Doigら、J.Bact.177:5447、1995)が含まれる。これ らの蛋白質のいくつかは、ワクチン抗原としての可能性があると提唱されている 。特に、ウレアーゼはワクチン候補となると思われる(国際公開公報第94/9823 号;国際公開公報第95/22987号;国際公開公報第95/3824号;ミチェッティら(M ichetti)、Gastroenterology 107:1002、1994)。それにもかかわらず、ワク チンにはいくつかの抗原が最終的に必要となる可能性があると思われる。 発明の概要 本発明は、例えばヘリコバクター(Helicobacter)感染症の予防、治療、また は診断法において用いることができる、GHPO 386、GHPO 789、GHPO 1516、GHPO 1197、GHPO 1180、GHPO 896、GHPO 711、GHPO 190、GHPO 185、GHPO 1417、およ びGHPO 1414と呼ばれる76kDaヘリコバクターポリペプチド、GHPO 1360と呼ばれ る32kDaポリペプチド、ならびにGHPO 750と呼ばれる50kDaポリペプチドのファミ リーをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。該ポリペプチドには、配列 番号:2〜22(偶数)、66および68に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが 含まれる。当業者は、下記に詳述するように、非必須アミノ酸の付加、欠失また は置換に起因しうる、これらのポリペプチドの変異体および誘導体をコードする ポリヌクレオチド分子も本発明に含まれることを理解すると思われる。 上記のポリヌクレオチド分子のほかに、本発明には、対応するポリペプチド( すなわち本発明のポリヌクレオチド分子によってコードされるポリペプチド、ま たはその断片)、およびこれらのポリペプチドに特異的に結合する単一抗原特異 的抗体が含まれる。 本発明は、多くの応用を有し、発現カセットベクターおよび本発明のポリヌク レオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を含む。従って、本発明 は、(i)組換え宿主系において本発明のポリヌクレオチド、ならびに関連する 発現カセット、ベクター、および形質転換細胞またはトランスフェクト細胞を製 造する方法;(ii)本発明のポリヌクレオチドを希釈剤または担体と併用して含 む、ポックスウイルス、ネズミチフス菌(SalHlonella typhimurium)およびビ ブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)ベクターのような生ワクチンベクター(そ のようなワクチンベクターは例えば、ヘリコバクター感染症を予防または治療す る方法において有用である)、および関連する薬学的組成物ならびに関連する治 療的および/または予防的方法;(iii)ポリヌクレオチド分子単体で、または 輸送媒体、ポリペプチド、もしくはポリペプチドの混合物、もしくは本発明の単 一抗原特異的抗体と共に製剤化されたポリヌクレオチド分子、および関連する薬 学的組成物の投与を含む、治療的および/または予防的方法;(iv)本発明のポ リヌクレオチド分子、単一抗原特異的抗体、またはポリペプチドの使用を含むこ とができる、生物試料中のヘリコバクターの有無を検出する方法;および(v) 抗体に基づくアフィニティクロマトグラフィーによって本発明のポリペプチドを 精製する方法、を提供する。 図面の簡単な説明 図1は、76kDa蛋白質ファミリーのコンセンサス配列と共に、GHPO 386(配列 番号:2)、GHPO 789(配列番号:4)、およびGHPO 1516(配列番号:6)の 椎定アミノ酸配列の配置である。 図2は、76kDa蛋白質ファミリーのコンセンサス配列と共に、GHPO 1197(配列 番号:8)、GHPO 1180(配列番号:10)、GHPO 896(配列番号:12)、GHPO 71 1(配列番号:14)、GHPO 190(配列番号:16)、GHPO 185(配列番号:18)、G HPO 1417(配列番号:20)およびGHPO 1414(配列番号:22)の椎定アミノ酸配 列の配置である。詳細な説明 GHPO 386、GHPO 789、GHPO 1516、GHPO 1197、GHPO 1180、GHPO 896、GHPO 71 1、GHPO 190、GHPO 185、GHPO 1417、およびGHPO 1414と呼ばれる新規の全長の 膜関連76kDaポリペプチド、GHPO 1360と呼ばれる32kDaポリペプチド、ならびにG HPO 750と呼ばれる50kDaポリペプチドのファミリーをコードするオープンリーデ ィングフレーム(ORF)は、H.ピロリゲノムにおいて同定されている。76kDaポ リペプチドのアミノ酸配列を図1および2に示す。76kDa、32kDa、および50kDa ポリペプチドは、例えばヘリコバクター感染症を予防または治療するワクチン接 種法において用いることができる。例えば、GHPO 750、GHPO 1360、GHPO 190お よびGHPO 1516は、防御抗原であることが示されている。「防御抗原」とは、陽 性対照と比較してチャレンジ後の感染レベルを低下させることができる抗原を意 味する。感染に対する完全な防御は、これも本発明に含まれるが、必要ではない 。 本発明のポリペプチド(GHPO 750を除く、下記参照)は、その成熟型(すなわ ち、クラスIIまたはクラスIII分泌経路を通じて輸送されたポリペプチドとして )として、または成熟型のN末端での開裂によって排泄/分泌の過程において除 去することができるシグナルペプチドを含む前駆体として、産生することができ る分泌型ポリペプチドである。(開裂部位は、成熟型に隣接するシグナルペプチ ドのC末端に存在する)。本発明のポリヌクレオチドの開裂部位、およびそれに より成熟したポリペプチドの最初のアミノ酸は、推定により決定された。 本発明の第一の局面に従って、ヘリコバクターGHPO 386、GHPO 789、GHPO 151 6、GHPO 1197、GHPO 1180、GHPO 896、GHPO 711、GHPO 190、GHPO 185、GHPO 14 17、GHPO 1414、GHPO 1360およびGHPO 750の前駆体および成熟型をコードする単 離されたポリヌクレオチドが提供される。 本発明の単離ポリヌクレオチドは下記の(i)または(ii)をコードする: (i)ヘリコバクターアミノ酸配列が、以下に示すアミノ酸配列からなる群よ り選択される、ヘリコバクター膜に関連したポリペプチドのヘリコバクターアミ ノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチド: アミノ酸-19〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-19位または1位 から始まって、アミノ酸689位で終了する、配列番号:2(GHPO 386); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸713位で終了する、配列番号:4(GHPO 789); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸725位で終了する、配列番号:6(GHPO 1516); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸691位で終了する、配列番号:8(GHPO 1197); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸652位で終了する、配列番号:10(GHPO 1180); アミノ酸-18〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-18位または1位 から始まって、アミノ酸673位で終了する、配列番号:12(GHPO 896); アミノ酸-21〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-21位または1位 から始まって、アミノ酸619位で終了する、配列番号:14(GHPO 711); アミノ酸-17〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-17位または1位 から始まって、アミノ酸635位で終了する、配列番号:16(GHPO 190); アミノ酸-19〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-19位または1位 から始まって、アミノ酸626位で終了する、配列番号:18(GHPO 185); アミノ酸-16〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-16位または1位 から始まって、アミノ酸467位で終了する、配列番号:20(GHPO 1417); アミノ酸-18〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-18位または1位 から始まって、アミノ酸673位で終了する、配列番号:22(GHPO 1414); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸279位で終了する、配列番号:66(GHPO 1360);および アミノ酸1位から始まって、アミノ酸399位で終了する、配列番号:68 (GHPO 750);または (ii)該ポリペプチドの誘導体。 「単離ポリヌクレオチド」という用語は、その天然に存在する環境から外され たポリヌクレオチドと定義する。例えば、生菌のゲノムにおいて、または遺伝子 バンクの一部として天然に存在するDNA分子は、単離されていないが、例えばク ローニング事象(増幅)の結果として、細菌ゲノムの残りの部分から分離されて いる同じ分子は「単離されている」。典型的に、単離されたDNA分子は、天然ゲ ノムにおいて5'末端または3'末端に隣接しているDNA領域(例えば、コード領域 )を含 まない。そのような単離ポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物の一部とな ることができ、そのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部でない ため、やはり単離されたと言える。 本発明のポリヌクレオチドは、RNAもしくはDNA(例えば、cDNA、ゲノムDNANも しくは合成DNA)、またはRNAもしくはDNAの改変または組合せを含むこどができ る。ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、一本鎖であってもよく、一本鎖の場 合では、それはコード(センス)鎖であっても、非コード(アンチセンス)鎖で あってもよい。本発明のポリペプチドをコードする配列は、配列番号:2〜22 (偶数)、66および68に示すように、(a)配列番号:1〜21(奇数)、65およ び67に示すコード配列;(b)(a)の転写に由来するリボヌクレオチド配列;または (c)遺伝子コードの重複もしくは縮重の結果として、配列番号:1〜21(奇数) 、65および67のいずれかに示す配列を有するポリヌクレオチド分子と同じポリペ プチドをコードする異なるコード配列、となることができる。本発明のポリペプ チドは、例えば、H.フェリス(H.felis)、H.ムステラ(H.mustelae)、H. ヘイルマニ(H.Heilmanni)、またはH.ピロリ(H.pylori)によって天然に分 泌または排泄されるポリペプチドであってもよい。 「ポリペプチド」または「蛋白質」とは、長さ、または翻訳後修飾(例えば、 グリコシル化、または燐酸化)の有無によらず、いかなる鎖のアミノ酸も意味す る。いずれの用語も本発明において互換的に用いられる。 「相同なアミノ酸配列」とは、ポリペプチドの特異的抗原性を破壊しない位置 に存在する1つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加のために、配列 番号:2〜22(偶数)、66および68のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列 番号:1〜21(奇数)、65および67のいずれかに示すヌクレオチド配列によりコ ードされるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を意味する。好ましくは、その ような配列は、配列番号:2〜22(偶数)、66および68のいずれかに示すアミノ 酸配列と少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、および最も好ましく は少なくとも90%同一である。 相同なアミノ酸配列は、配列番号:2〜22(偶数)、66および68のいずれか に示すアミノ酸配列と同一、または実質的に同一である配列を含む。「実質的に 同 一であるアミノ酸配列」とは、参照アミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは 少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、および最も好ましくは少なく とも99%同一であって、あったとしても、多くの保存的アミノ酸置換によって参 照配列と異なる配列を意味する。 保存的アミノ酸置換は、典型的に同じクラスのアミノ酸内での置換を含む。こ れらのクラスには、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、 およびチロシンのような非電荷極性側鎖を有するアミノ酸;リジン、アルギニン 、およびヒスチジンのような塩基性側鎖を有するアミノ酸;アスパラギン酸およ びグルタミン酸のような酸性側鎖を有するアミノ酸;ならびにグリシン、アラニ ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニ ン、トリプトファン、およびシステインのような、非極性側鎖を有するアミノ酸 が含まれる。 相同性は、配列解析ソフトウェア(例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノ ロジー・センターの遺伝子コンピューターグループの配列解析ソフトウェアパッ ケージ、1710 University Avenue,Madison,WI 53705)を用いて測定すること ができる。類似のアミノ酸配列を、最大の相同性(すなわち同一性)が得られる ように配置する。このため、配列に人工的にギャップを導入することが必要であ るかも知れない。最適な配置が設定されれば、相同性(すなわち同一性)の程度 は、位置の総数と比較して、両配列のアミノ酸が同一である位置全てを記録する ことによって確立される。 相同なポリヌクレオチド配列は同様にして定義される。好ましくは、相同な配 列は、配列番号:1〜21(奇数)、65および67のいずれかのコード配列と少なく とも45%、より好ましくは少なくとも60%、および最も好ましくは少なくとも85 %同一である配列である。 配列番号:2〜22(偶数)、66および68に示す配列の一つと相同な配列を有す るポリペプチドには、配列番号:2〜22(偶数)、66および68に示す配列を有す るポリペプチドと抗原性が類似である、変異体または他の天然に存在しない変種 と共に、天然に存在する対立遺伝子変種が含まれる。 当技術分野で公知のように、対立遺伝子変種は、ポリペプチドの生物機能を変 化させないアミノ酸1つ以上の置換、欠失または付加を有することを特徴とする ポリペプチドの別の形である。「生物機能」とは、たとえその機能が細胞の増殖 または生存にとって必要でなくとも、天然に存在する細胞におけるポリペプチド の機能を意味する。例えば、ポーリンの生物機能は、細胞外媒体中に存在する化 合物を細胞に流入させることである。生物機能は抗原機能とは異なる。ポリペプ チドは1つ以上の生物機能を有することができる。 対立遺伝子変種は本質的に非常に一般的である。例えば、細菌種、例えばH. ピロリは通常、軽微な対立遺伝子の変化によって互いに異なる多様な株として表 される。実際に、異なる株において同じ生物機能を示すポリペプチドは、それぞ れの株において同一ではないアミノ酸配列を有することができる。そのような対 立遺伝子の変化は、ポリヌクレオチドレベルでも等しく反映されうる。 ポリペプチド抗原の対立遺伝子変種を用いることは、例えば、ヘリコバクター (Helicobacter)・ウレアーゼ抗原に関する研究によって支持される。ヘリコバ クター・ウレアーゼのアミノ酸配列は種によって広範に異なるが、なおも種間の 保護が起こるため、このことは、ウレアーゼ分子を免疫原として使用すると、ア ミノ酸の変化に対して非常に抵抗性であることを示している。単一種のH.ピロ リの異なる株においても、アミノ酸配列の変化がある。 例えば、H.ピロリおよびH.フェリスウレアーゼのUreAおよびUreBサブユニッ トのアミノ酸配列は、互いにそれぞれ26.5%および11.8%異なるが(フェローロ ら(Ferroro)、Molecular Microbiology 9(2):323〜333、1993)、H.ピロリ のウレアーゼはH.フェリス感染からマウスを保護することが示されている(ミ チェッティら(Michetti)、Gastroenterology 107:1002、1994)。さらに、ウ レアーゼの個々の構造的サブユニットであるUreAおよびUreBは異なるアミノ酸配 列を含むが、ヘリコバクター感染症に対していずれも防御抗原であることが示さ れている(ミチェッティら(Michetti)、前記)。同様に、クェンカら(Cuenca 、Gastroenterology 110:1770、1996)は、H.ムステラに感染したフェレット をH.ピロリのウレアーゼで治療的に免疫すると、H.ムステラ感染症の根治に有 効であることを示した。さらに、例えばpORV142から発現される組換え型UreA+Ur eBアポ酵素(H.ピロリ株CPM630に由来するUreAおよびUreB配列;リーら(Lee) 、J.I nfect.Dis.172:161、1995);pORV214から発現される組換え型UreA+UreBア ポ酵素(H.ピロリ株CPM630とはそれぞれ1個および2個のアミノ酸変化によっ て異なるUreAおよびUreB配列;リーら(Lee)、前記、1995);UreA-グルタチオ ン-S-トランスフェラーゼ融合蛋白質(H.ピロリ株ATCC 43504からのUreA配列; トーマスら(Thomas)、Acta Gastro-Enterologica Belgica 56:54、1993);H .ピロリ株NCTC11637から精製されたUreA+UreBホロ酵素(マルチェッティら(Ma rchetti)、Science 267:1655、1995);UreA-MBP融合蛋白質(H.ピロリ株85P からのUreA;フェローロら(Ferroro)、Infection and Immunity 62:4981、19 94);UreB-MBP融合蛋白質(H.ピロリ株85PからのUreB;フェローロら(Ferror o)、前記);UreA-MBP融合蛋白質(H.フェリス株ATCC 49179からのUreA;フェ ローロら(Ferroro)、前記);UreB-MBP融合蛋白質(H.フェリス株ATCC 49179 からのUreB;フェローロら(Ferroro)、前記)およびアミノ酸220〜569個を含 むUreBの37kDa断片(ドールダビンら(Dore-Davin)、「UreBの37kDa断片はマウ スにヘリコバクター・フェリス感染症に対する防御を与えるために十分である」 )を含む、いくつかのウレアーゼ変種が有効なワクチン抗原であることが報告さ れている。最後に、トーマスら(Thomas、前記)は、H.ピロリの粗超音波処理 物によってマウスを経口で免疫すると、H.フェリスによるその後のチャレンジ からマウスが防御されることを示した。 ポリヌクレオチド、例えば対立遺伝子変種をコードするDNA分子は、従来の方 法によって抽出したゲノム細菌DNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって 容易に得ることができる。これは、コード領域の5'および3'末端の上流および下 流である配列と対合している合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用すること を含む。適したプライマーは配列番号:1〜21(奇数)、65および67において提 供されるヌクレオチド配列情報に基づいてデザインすることができる。典型的に 、プライマーは10〜40ヌクレオチド、好ましくは15〜25ヌクレオチドを含む。ま た、有効なハイブリダイゼーションが確実に起こるように十分な比率で、例えば 総ヌクレオチド量の少なくとも40%、好ましくは50%のCおよびGヌクレオチド量 を含有する、CおよびGヌクレオチドを含むプライマーを選択することが有利とな りうる。当業者は、異なるヘリコバクター株から本発明のポリヌクレオチドを単 離 するために用いることができるプライマーを容易にデザインすることができる。 例として、シグナルペプチドを含む非プロセシングGHPO 386(配列番号:2) のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子のクロ ーニングに有用なプライマーを、配列番号:23(5'末端で対合)および配列番号 :25(3'末端で対合)に示す。シグナルペプチドを欠損する成熟GHPO 386(配列 番号:2のアミノ酸1〜689位)のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード するDNA分子のクローニングに有用なプライマーを、配列番号:24(5'末端で対 合)および配列番号:25(3'、末端で対合)に示す。GHPO 1360(配列番号:66 )のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA分子のクローニングに 有用なプライマーを、配列番号:78(5'末端で対合)および配列番号:79(3'末 端で対合)に示す。これらのプライマーの使用によって、GHPO 1360をコードす る全遺伝子の増幅が可能となる。配列番号:82(成熟蛋白質に対応するコード配 列の5'末端で対合)および配列番号:79(3'末端で対合)に示す配列を有するプ ライマーを用いて、成熟GHPO 1360をコードする遺伝子の一部を増幅することが できる。PCRを行うための実験条件は、当業者によって容易に決定することがで き、PCR実施に関する説明は実施例3および4に示す。 このように、本発明の第一の局面には、下記の(i)および(ii)が含まれる: (i)以下のプライマーのいずれかを用いたヘリコバクター、例えばH.ピロリ のケノムから、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅および/またはクローニング することができる単離ポリヌクレオチド分子(例えばDNA分子): 配列番号:23に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:25に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 386); 配列番号:26に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:28に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 789); 配列番号:29に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:31に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 1516); 配列番号:32に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:34に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 1197); 配列番号:35に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:37に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドブライマー(非プロセ シングGHPO 1180); 配列番号:38に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:40に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 896); 配列番号:41に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:43に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 711); 配列番号:44に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:46に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 190); 配列番号:47に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:49に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 185); 配列番号:50に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:52に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 1417); 配列番号:53に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:55に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 1414); 配列番号:78に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:79に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 1360);または 配列番号:80に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:81に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(GHPO 750 );および (ii)以下のプライマーのいずれかを用いたヘリコバクター、例えばH.ピロリ のゲノムから、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅および/またはクローニング することができる単離ポリヌクレオチド分子(例えばDNA分子): 配列番号:24に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:25に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 386); 配列番号:27に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:28に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 789); 配列番号:30に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:31に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 1516); 配列番号:33に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:34に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 1197); 配列番号:36に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:37に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 1180); 配列番号:39に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:40に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 896); 配列番号:42に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:43に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 711); 配列番号:45に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:46に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 190); 配列番号:48に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:49に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 185); 配列番号:51に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:52に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 1417); 配列番号:54に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:55に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 1414);または 配列番号:82に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:79に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 1360)。 上記のプライマーの5'末端は、典型的に4〜6ヌクレオチドを含む制限エンド ヌクレアーゼ認識部位を含むと都合がよい。例えば、配列5'-GGATCC-3'(BamHI )または5'-CTCGAG-3'(XhoI)を用いることができる。制限部位は、増幅された DNAを消化した場合に、必要であれば、便宜上、プラスミドベクターのような適 当に消化したベクターにクローニングすることができるように、当業者によって 選択される。さらに、5'クランプ(例えばGCC)をプライマーにおいて制限エン ドヌクレアーゼ認識部位の5'に含むことができる。 天然に生じない有用な相同体は、アミノ酸配列の変化および/または欠失に対 して寛容である可能性がある抗原の領域を特定する既知の方法を用いてデザイン することができる。例えば、異なる種からの抗原の配列を比較して保存配列を特 定することができる。 本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド誘導体は、例え ば、断片、全長のポリペプチドに由来する大きい内部欠失を有するポリペプチド 、および融合蛋白質を含む。本発明のポリペプチド断片は、配列番号:2〜22( 偶数)、配列番号:66および配列番号:68の如何なる配列とも相同である配列を 有するポリペプチドから、断片が親ポリペプチドの実質的な抗原性(特異的抗原 性)を保持する程度に誘導することができる。ポリペプチド誘導体はまた、特異 的抗原性を保持しつつ、親ポリペプチドの実質的な部分を除去する大きい内部欠 失によって構築することができる。一般に、ポリペプチド誘導体は、抗原性を維 持するためには長さが少なくとも12個のアミノ酸が必要である。それらは少なく ともアミノ酸20個であれば都合よく、好ましくは少なくとも50個、より好ましく は少なくともアミノ酸75個、および最も好ましくは長さが少なくともアミノ酸10 0個の長さである。 有用なポリペプチド誘導体、例えばポリペプチド断片は、蛋白抗原において、 表面が露出した抗原領域としての可能性がある部位を特定するために、アミノ酸 配列のコンピユーターを利用した解析を用いてデザインすることができる(ヒュ フズら(Hughs)、Infect.Immun.60(9):3497、1992)。例えば、DNAスター (DNA Star)によるレーザー遺伝子プログラムを用いて、本発明のポリペプチド の親水性、抗原指標、および強度指数プロットを得ることができる。またこのプ ログラムを用いて、既知の蛋白質モチーフを有するポリペプチドの相同性に関す る情報を得ることができる。当業者は、ワクチン抗原として用いるペプチド断片 の選択の際に、そのようなプロットから得られる情報を容易に用いることができ る。例えば、抗原指数が比較的高いプロットの断片スパン領域を選択することが できる。同様に、抗原指数および強度プロットが共に比較的高い断片スパン領域 を選択することもできる。保存配列、特に親水性保存配列を含む断片もまた、選 択することができる。 大きい内部欠失を有するポリペプチド断片およびポリペプチドは、そうでなけ れば親ポリペプチドの中で遮蔽され、防御的T細胞依存的免疫応答を誘導するた めに重要である可能性があるエピトープを検出するために用いることができる。 欠失はまた、株における免疫優性超可変領域を除去することができる。 蛋白質に対する免疫応答の誘導に必要なものは全て蛋白質の小さい(例えば、 アミノ酸8〜10個)免疫原性領域であるため、蛋白性免疫原物質の断片および変 異体をワクチンとして用いることは免疫学分野では許容された方法である。これ はヘリコバクター以外の病原体に対する多くのワクチンについて行われてきた。 例えば、マウス乳癌ウイルス(アミノ酸11個を含むペプチド;ディオンら(Dion )、Virology 179:474〜477、1990)、セムリキ森林熱ウイルス(アミノ酸16個 を含むペプチド;スナイダースら(Snijders)、J.Gen.Virol.72:557〜565 、 1991)およびイヌパルボウイルス(それぞれがアミノ酸15個を含む2つの重なり 合うペプチド;ランケベルトら(Langeveld)、Vaccine 12(15):1473〜1480 、1994)のような、病原体の表面露出抗原に対応する短い合成ペプチドが、それ ぞれの病原体に対する有効なワクチン抗原であることが示されている。 ポリペプチド断片および大きい内部欠失を有するポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドは、定法(例えば、アウスベルら(Ausubel)、「分子生物学の 最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」、John Wiley & Sons Inc.,1994を参照のこと)、例えば逆転写PCRを含むPCR、クローニングし たDNA分子の制限酵素処理、またはクンケルらの方法(Kunkel、Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 82:448,1985;ストラタジーン社で入手可能な生物材料)によっ て構築することができる。 ポリペプチド誘導体はまた、例えば、N末端またはC末端で他のポリペプチドと 融合した本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を含む融合ポリペプチ ド(以降、ペプチドテールと呼ぶ)として産生することができる。そのような産 物は、遺伝子融合、すなわちハイブリッド遺伝子の翻訳によって容易に得ること ができる。融合ポリペプチドを発現するベクターは市販されており、この中には ペプチドテール部がマルトース結合蛋白質であるニューイングランド・バイオラ ボズ社のpMal-c2またはpMal-p2システム、ファルマシア社のグルタチオン-S-ト ランスフェラーゼシステム、またはノバゲン社から販売されているHis-Tagシス テムが含まれる。これらおよび他の発現系は、本発明のポリペプチドおよび誘導 体のさらなる精製のための簡便な手段を提供する。 本発明に含まれる融合ポリペプチドに関するもう一つの特定の実施例には、ア ジュバント活性を有するポリペプチド、例えばコレラ毒素または大腸菌易熱性毒 素のいずれかのサブユニットBと融合した本発明のポリペプチドまたはポリペプ チド誘導体が含まれる。そのような融合蛋白質の産生には、考えられるいくつか の方法を用いることができる。まず、本発明のポリペプチドは、アジュバント活 性を有するポリペプチドのN末端または好ましくはC末端と融合することができる 。第二に、本発明のポリペプチド断片は、アジュバント活性を有するポリペプチ ドのアミノ酸配列内で融合することができる。スペーサー配列もまた望ましけれ ば 含むことができる。 上記のように、本発明のポリヌクレオチドは前駆体または成熟型でヘリコバク ターポリペプチドをコードする。それらはまた、成熟して本発明のポリペプチド になることができる非相同シグナルペプチドを含むハイブリッド前駆体をコード することができる。「非相同シグナルペプチド」とは、本発明のポリペプチドの 天然の前駆体には認められないシグナルペプチドを意味する。 本発明のポリヌクレオチドは、好ましくはストリンジェントな条件下で、配列 番号:1〜21(奇数)、配列番号:65、および配列番号:67のいずれかに示す配 列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション法 は、例えばアウスベルら(Ausubel、前記);シラビーら(Silhavy、「遺伝子融 合実験(Experiments with Gene Fusions)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1980);およびデービスら(Davi s、「遺伝子操作マニュアル:応用細菌遺伝子学(A Manual for Genetic Engine ering:Advanced Baterial Genetics)」、Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss,Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1980)に記述されている。ハイブリダ イゼーション条件を最適にするために検討することができる重要なパラメータは 以下の式に反映されており、これによって2つの相補的DNAがこの温度を超える と互いに分離する温度である溶融点(Tm)の計算が容易となる(ケーシーら(Ca sey)、Nucl.Acids.Res.4:1539、1977):Tm=81.5+0.5×(%G+C)+1.6 log(陽イオン濃度)−0.6×(%ホルムアミド)。適当なストリンジェンシー条 件下では、ハイブリダイゼーション温度(Th)は、およそ20〜40℃、20〜25℃、 または好ましくは計算したTmより低い30〜40℃である。当業者は、従来の技法を 用いた予備実験において、最適な温度および塩濃度を経験的に容易に決定できる ことを理解すると思われる。例えば、ハイブリダイゼーション前のインキュベー トおよびハイブリダイゼーションの際のインキュベートのいずれについても、( i)50%ホルムアミドを含む6×CCS中で42℃で4〜16時間以内、または(ii) 6×SSC水溶液(1M NaCl、0.1Mクエン酸ナトリウム(pH7.0))中で65℃で4〜 16時間以内、というストリンジェントな条件を得ることができる。30〜600ヌク レオチドを含むポリヌクレオチドに関しては、上記式を用いて、次に(600/塩 基対で 示したポリヌクレオチドの大きさ)を差し引くことによって修正することができ る。ストリンジェントな条件はTmの5〜10℃下であるThによって定義される。 20〜30塩基より短いオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーション条件は、 上記の規則に正確には従わない。そのような場合、Tmの計算式は以下のようにな る:Tm=4×(G+C)+2(A+T)。例えば、50%G+Cの18ヌクレオチド断片で は約54℃が適切なTmがである。 RNA、DNANまたはその改変もしくは組合せを含む本発明のポリヌクレオチド分 子は、様々に応用することができる。例えば、ポリヌクレオチド分子は(i)組 換え型宿主系においてコードされたポリペプチドを産生するプロセスにおいて、 (ii)ヘリコバクター感染症の予防および/または治療のための方法および組成 物においてさらに用いられる、ポックスウイルスのようなワクチンベクターの構 築において、(iii)そのままの状態で、または輸送媒体と共に製剤化したワク チン剤として、および(iv)本発明のポリヌクレオチドを過剰発現することがで きる、またはそれを非毒性の変異型において発現することができる弱毒ヘリコバ クター株の構築において、用いることができる。 本発明の第二の局面によれば、したがって、(i)発現に必要なエレメント( 例えば、プロモーター)の調節下に置かれた本発明のポリヌクレオチド分子を含 む発現カセット;(ii)本発明の発現カセットを含む発現ベクター;(iii)本 発明の発現カセットおよび/またはベクターで形質転換またはトランスフェクト された原核細胞または真核細胞、(iv)本発明のポリヌクレオチド分子の発現を 可能にし、コードされたポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を細胞培養から 回収することを可能にする条件下で、本発明の発現カセットおよび/またはベク ターで形質転換またはトランスフェクトされた原核細胞または真核細胞を培養す ることを含む、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドま たはポリペプチド誘導体を産生するプロセスが提供される。 組換え型発現系は、原核および真核宿主から選択することができる。真核宿主 には例えば、酵母細胞(例えば、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)またはピヒア・パストリス(Pichia Pastoris))、哺乳類細胞( 例えば、COSI、NIH 3T3、またはJEG3細胞)、節足動物細胞(スポドプテラ・フ ルギ ペルダ(Spodoptera frugiperda(SF9)細胞)、および植物細胞が含まれる。好 ましくは大腸菌のような原核宿主を用いる。細菌および真核細胞は、当業者に既 知の多くの異なる入手先、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション(AT CC;ロックビル、メリーランド州)から入手できる。 発現カセットの選択は、発現されたポリペプチドに関して望ましい特徴と共に 、選択する宿主系に依る。例えば、特定の脂質型またはその他の型で本発明のポ リペプチドを産生することが有用となる可能性がある。典型的に、発現カセット には、選択した宿主系において機能的である構造的または誘導可能なプロモータ ー;リボソーム結合部位;開始コドン(ATG);必要であればシグナルペプチド 、例えばリピデーションシグナルペプチドをコードする領域;本発明のポリヌク レオチド分子;停止コドン;および選択的に3'末端領域(翻訳および/または転 写ターミネーター)を含む。シグナルペプチドコード領域は、本発明のポリヌク レオチドに隣接し、適切なリーディングフレーム内にある。シグナルペプチドコ ード領域は成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子と相同または非 相同であってもよく、発現に用いられる宿主の分泌器官に対して特異的であって もよい。本発明のポリヌクレオチド分子単独で、またはシグナルペプチドと共に 、構築されるオープンリーディングフレームは、宿主系において転写および翻訳 が起こるようにプロモーターの調節下に置かれる。プロモーターおよびシグナル ペプチドコード領域は、当業者に広く知られており、利用可能で、その中には例 えば、アラビノースによって誘導可能(プロモーターaraB)で、しかも大腸菌の ようなグラム陰性菌において機能的である、ネズミチフス菌(Salmonella typhi murium)(およびその誘導体)のプロモーター(米国特許第5,028,530号;カグ ノンら(Cagnon)、Protein Engineering 4(7):843、1991);T7ポリメラー ゼを発現する多くの大腸菌株において機能的であるバクテリオファージT7 RNAポ リメラーゼ遺伝子のプロモーター(米国特許第4,952,496号);OspAリピデーシ ョンシグナルペプチド;およびRlpBリピデーションシグナルペプチド(タカセら (Takase)、J.Bact.169:5692、1987)が含まれる。 発現カセットは典型的に発現ベクターの一部で、これは選択した発現系におけ る複製能に関して選択する。発現ベクター(例えば、プラスミドまたはウイルス ベクター)は、例えば、パウェルスら(Pouwels、「クローニング・ベクターズ :実験マニュアル(Cloning Vectors:A Laboratory Manual)」、1985、補則、1 987)に記述のベクターから選択し、様々な販売元から購入することができる。 宿主細胞を発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトする方法は、当技術 分野で周知で、アウスベルら(前記)が記述したように、選択した宿主系による 。 発現されると、本発明の組換え型ポリペプチド(またはポリペプチド誘導体) は産生されて、細胞内器官に留まり、細胞外媒体または細胞周辺腔に分泌/排泄 され、または細胞膜内に取り込まれる。次に細胞抽出物または細胞培養を遠心後 の上清から、ポリペプチドを実質的に純粋な形で回収することができる。典型的 に、組換え型ポリペプチドは抗体に基づくアフィニティ精製または、小さいアフ ィニティ結合ドメインとの遺伝子融合のような、当業者に公知のその他の方法に よって精製することができる。抗体に基づくアフィニティ精製法はまた、ヘリコ バクター株から抽出した本発明のポリペプチドを精製するために利用できる。本 発明のポリペプチドを免疫アフィニティ精製するために有効な抗体は、下記の方 法を用いて得ることができる。 本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子輸送媒体としてのウイルスまたは細菌宿 主のいずれかを用いて(生ワクチンベクター)、または遊離型、例えばプラスミ ドに挿入された形で遺伝子を投与するDNAワクチン接種法において用いることが できる。本発明のポリヌクレオチドの治療または予防的効用は下記のように評価 することができる。 つまり、本発明の第3の局面において、(i)発現に必要なエレメントの調節 下に置かれる本発明のポリヌクレオチド分子を含む、ポックスウイルスのような ワクチンベクター;(ii)本発明のワクチンベクターを、希釈剤または担体と共 に含む重要な組成物;(iii)本発明のワクチンベクターの治療的または予防的 有効量を含む薬学的組成物;(iv)免疫応答、例えば、ヘリコバクターに対する 防御的または治療的免疫応答を誘発するために、本発明のワクチンベクターの免 疫学的有効量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における、ヘリコバクター に対する免疫応答を誘導する方法(例えば、ヒト;または他の動物の場合例えば ネコまたは鳥のヘリコバクター・ピロリ菌感染症を治療または予防するための家 畜病 治療の適用に用いることができる);および(v)必要とする個体に本発明のワ クチンベクターの予防または治療量を投与することを含む、ヘリコバクター(例 えば、H.ピロリ、H.フェリス、H.ムステラ、またはH.ヘイルマニ菌)感染症 の予防および/または治療法が提供される。さらに、本発明の第3の局面は、ヘ リコバクター感染症の予防および/または治療のための薬剤の調製における本発 明のワクチンベクターの使用を含む。 本発明のワクチンベクターは、ウレアーゼアポ酵素またはそのサブユニット、 断片、相同体、変異体、または誘導体のような少なくとも1つの別のヘリコバク ター抗原と共に、本発明の1つまたはいくつかのポリペプチドまたは誘導体を発 現することができる。さらに、これは、免疫応答を増強するインターロイキン-2 (IL-2)またはインターロイキン-12(IL-12)のようなサイトカインを発現する ことができる。このように、ワクチンベクターは、例えば、哺乳類細胞において 発現に必要なエレメントの調節下に置かれた、ウレアーゼサブユニットA、B、も しくはその双方をコードする別のポリヌクレオチド分子、またはサイトカインを 含むことができる。 あるいは、本発明の組成物は、そのそれぞれが本発明のポリペプチドまたは誘 導体を発現することができる、いくつかのワクチンベクターを含むことができる 。組成物はまた、ウレアーゼアポ酵素、そのサブユニット、断片、相同体、変異 体もしくは誘導体のようなさらなるヘリコバクター抗原、またはIL-2もしくはIL -12のようなサイトカインを発現することができるワクチンベクターを含むこと ができる。 哺乳類の感染症を治療または予防するワクチン接種法において、本発明のワク チンベクターは、ワクチンの分野で用いられる従来の経路、例えば粘膜(例えば 眼、鼻腔、口腔、胃、肺、脳、直腸、膣または尿管粘膜)表面に、もしくは非経 口(例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または腹腔内)経路によって投与する ことができる。好ましい経路はワクチンベクターの選択による。投与は単回投与 または間隔を開けて反復投与で行うことができる。適当な用量は、ワクチンベク ターそのものの性質、投与経路、およびワクチン接種すべき哺乳類の状態(例え ば、哺乳類の体重、年齢、および全身健康状態)のような、当業者によって理解 される様々なパラメータによる。 本発明において用いることができる生ワクチンベクターには、細菌ベクター、 例えば赤痢菌(Shigella)、サルモネラ菌(Salmonella)、ビブリオコレラ(Vi brio Cholerae)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、カルメット・ゲラン杆菌(BCG )、および連鎖球菌(Streptococcus)のような細菌ベクターや、アデノウイル スおよびポックスウイルスのようなウイルスベクターが含まれる。アデノウイル スベクターの例と、本発明のポリヌクレオチド分子を発現することができるアデ ノウイルスベクターを構築する方法は、米国特許第4,920,209号に記述されてい る。本発明において用いることができるポックスウイルスベクターには例えば、 それぞれ米国特許第4,722,848号および米国特許第5,364,773号に記述されている ワクシニアおよびカナリア痘ウイルス(例えば、ワクシニアウイルスベクターに 関する記述についてはタルタグリアら(Tartaglia)、Virology 188:217、1992 、および、カナリア痘ウイルスベクターに関する記述についてはタイラーら(Ta yler)、Vaccine 13:539、1995を参照のこと)が含まれる。本発明のポリヌク レオチドを発現することができるポックスウイルスベクターは、キーニイら(( Kieny)、Nature 312:163、1984)が記述したように、本発明のポリヌクレオチ ドが、哺乳類細胞での発現に適した条件下でウイルスゲノムの中に挿入されるよ うに、相同組換えによって得ることができる。一般に、ウイルスベクターワクチ ンの用量は、治療または予防的使用に関して約1×104〜約1×1011個であって もよく、約1×107個〜約1×1010個であれば都合よく、または約1×107個〜約 1×109プラーク形成単位/kgであることが好ましい。好ましくはウイルスベクタ ーは、例えば4週間間隔で3用量を非経口投与する。当業者は、本発明のウイル スベクターを含む組成物に化学アジュバントを加えることを避け、それによって ウイルスベクターそのものに対する免疫応答を最小限にすることが好ましいこと を認識すると思われる。 生経口ワクチンにおいて用いることができる毒性非誘発性のビブリオコレラ変 異株は、メカラノスら(Mekalanos、Nature 306:551、1983)および米国特許第 4,882,278号(機能的コレラ毒素が産生されないように、2つのctxA対立遺伝子 のそれぞれのコード配列の実質的な量が欠失している株);国際公開公報第92/1 13 54号(irgA座が変異のため不活化されている株;この変異は単一の株においてct xA変異と組み合わせることができる);および国際公開公報第94/1533号(機能 的ctxAおよびattRS1 DNA配列を欠損する欠失変異体)に記述されている。これら の株は、国際公開公報第94/19482号に記述のように、異種抗原を発現するように 遺伝子操作することができる。本発明のポリヌクレオチド分子によってコードさ れるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を発現することができるビブリオコ レラ株の有効なワクチン量は、例えば約1×105〜約1×109個、好ましくは約1 ×106個〜約1×108個の生きた細菌を、選択した投与経路にとって適当な用量で 含むことができる。好ましい投与経路には全ての粘膜経路が含まれるが、最も好 ましくはこれらのベクターは鼻腔内または経口に投与される。 異種抗原の組換え発現のために遺伝子操作された弱毒化ネズミチフス(Salmon ella typhimurium)株およびその経口ワクチンとしての使用は、ナカヤマら(Na kayama、Bio/Technology 6:693、1988)および国際公開公報第92/11361号に記 述されている。これらのベクターの好ましい投与経路には全ての粘膜経路が含ま れる。最も好ましくは、ベクターは鼻腔内または経口投与する。 ワクチンベクターとして有効なその他の細菌ベクターは、ハイら(High、EMBO 11:1991、1992)およびシゼモアら(Sizemore、Science 270:299、1995;フレ クスナー赤痢菌(Shigella flexneri));メダグリニら(Medaglini、Proc.Na tl.Acad.Sci.USA 92:6868、1995;ストレプトコッカス・ゴルドニ(Strepto coccus gordonii));フリン(Flynn、Cell.Mol.Biol.40(補則I):31、11 94)、および国際公開公報第:88/6626号、90/0594号、91/13157号、92/1796号 、92/21376号(カルメット・ゲラン杆菌(Bacille Calmette Guerin))によっ て記述されている。細菌ベクターでは、本発明のポリヌクレオチドは細菌ゲノム の中に挿入することができ、または例えばプラスミド内に組み込まれるなどの遊 離の状態で留まることができる。 細菌ベクターワクチンを含む組成物にもアジュバントを加えることができる。 用いることができる多くのアジュバントは当業者に既知である。例えば、好まし いアジュバントは、下記に示すリストから選択することができる。 本発明の第4の局面において、(i)希釈剤または担体と共に本発明のポリヌ ク レオチドを含む重要な組成物;(ii)本発明のポリヌクレオチドの治療的または 予防的有効量を含む薬学的組成物;(iii)免疫応答、例えば、ヘリコバクター に対する防御的免疫応答を誘発するために、本発明のポリヌクレオチドの免疫学 的有効量を哺乳類に投与することによって、哺乳類においてヘリコバクターに対 する免疫応答を誘導する方法;および(iv)そのような治療を必要とする個体に 本発明のポリヌクレオチドの予防的または治療的有効量を投与することによって 、ヘリコバクター(例えば、H.ピロリ、H.フェリス、H.ムステラ、またはH. ヘイルマニ菌)感染症を予防および/または治療する方法もまた提供される。さ らに、本発明の第4の局面は、ヘリコバクター感染症の予防および/または治療 のための薬剤の調製に本発明のポリヌクレオチドを用いることを含む。本発明の 第4の局面は好ましくは、哺乳類細胞、例えば、哺乳類の細胞において複製する ことができず、哺乳類のゲノムに実質的に組み入れられないプラスミドにおいて 、発現条件下に置かれたポリヌクレオチド分子を用いることを含む。 本発明のポリヌクレオチド(例えば、DNAまたはRNA分子)は、ワクチンとして 哺乳類に投与するように投与することができる。本発明のDNA分子を用いる場合 、それは、哺乳類細胞において複製することができず、哺乳類のゲノムに組み入 れられないプラスミドの形となり得る。典型的に、DNA分子は哺乳類細胞での発 現に適したプロモーターの調節下に置かれる。プロモーターは、至る所で、また は組織特異的に機能することができる。非組織特異的プロモーターの例には、初 期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(米国特許第4,168,062号)および ラウス肉腫ウイルスプロモーター(ノートンら(Norton)、Molec.Cell.Biol .5:281、1985)が含まれる。デスミンプロモーター(リら(Li)、Gene 78:2 43、1989;リら(Li)、J.Biol.Chem.266:6562、1991;リら(Li)、J.Bio l.Chem.268:10403、1993)は組織特異的で筋細胞において発現を誘発する。 より一般的に、有用なプロモーターおよびベクターは、例えば国際公開公報第94 /21797号、およびハーティッカら(Hartikka、Human Gene Therapy 7:1205、1 996)によって記述されている。 DNA/RNAワクチン接種に関しては、本発明のポリヌクレオチドは本発明のポリ ペプチドの前駆体または成熟型をコードすることができる。これが前駆体型をコ ー ドする場合、前駆体配列は同種または異種となりうる。後者の場合、組織型プラ スミノーゲン活性化因子(tpA)のリーダー配列のような真核細胞リーダー配列 を用いることができる。 本発明の組成物は、1つまたはいくつかの本発明のポリヌクレオチドを含むこ とができる。これはまた、ウレアーゼサブユニットA、Bまたは両者のような、も う一つのヘリコバクター抗原をコードする少なくとも1つのさらなるポリヌクレ オチド、またはその断片、誘導体、変異体、もしくは類似体を含むことができる 。インターロイキン-2(IL-2)またはインターロイキン-12(IL-12)のような、 サイトカインをコードするポリヌクレオチドもまた、免疫応答を増強するように 組成物に加えることができる。これらの付加的ポリヌクレオチドは、発現のため の適切な調節下に置かれる。本発明のDNA分子および/または付加のDNA分子を同 じ組成物に含めれば、同じプラスミドにおいて都合よく輸送される。 本発明の治療的ポリヌクレオチドの調製には、定法を用いることができる。例 えば、ポリヌクレオチドは、陰イオンリポソーム、陽イオンリポソーム、微粒子 、例えば金微粒子、沈降剤、例えばリン酸カルシウム、またはその他のトランス フェクション促進剤のような輸送媒体を含まないそのままの形で用いることがで きる。この場合、ポリペプチドは、担体の有無によらず、滅菌生理食塩液、また は滅菌緩衝生理食塩液のような生理学的に許容される溶液中で、簡易に希釈する ことができる。担体が存在する場合は、担体は好ましくは等張、低張、または弱 い低張であり、例えば20%蔗糖を含有する蔗糖溶液によって得られるように、イ オン強度が比較的低い。 または、ポリヌクレオチドは細胞取り込みを補助する薬剤に関連させることが できる。それはすなわち、(i)ブピバカインのような細胞透過性を変化させる 化学物質を加えたもの(例えば、国際公開公報第94/16737号参照)、(ii)リポ ソームへの封入体、または(iii)陽イオン脂質またはシリカ、金もしくはタン グステン微粒子に関連させたものとなり得る。 陰イオンおよび中性リポソームは、当技術分野で周知で(例えば、リポソーム の作成法に関する詳しい記述については「リポソーム:実用的アプローチ(Lipo somes:A Practical Approach)、RPC New Ed,IRL Press、1990を参照のこと) 、ポリヌクレオチドを含む広い範囲の産物を輸送するために有用である。 陽イオン脂質はまた、遺伝子輸送に用いることができる。そのような脂質は例 えば、DOTMA(N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-塩化トリメチルア ンモニウム)としても知られるリポフェクション(登録商標)、DOTAP(1,2-ビ ス(オレイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン)、DDAB(臭化ジメチ ルジオクタデシルアンモニウム)、DOGS(ジオクタデシルアミドログリシルスペ ルミン)、およびコレステロール誘導体が含まれる。これらの陽イオン脂質に関 する説明は、欧州特許第187,702号、国際公開公報第90/11092号、米国特許第5,2 83,185号、国際公開公報第91/15501号、国際公開公報第95/26356号、および米国 特許第5,527,928号に見ることができる。遺伝子輸送のための陽イオン脂質は、D OPE(ジオレイル・フォスファチジルエタノールアミン;国際公開広報第90/1109 2号)のような中性脂質に結合させて用いることが好ましい。陽イオンリポソー ムを含む製剤には、その他のトランスフェクション促進化合物を加えることがで きる。それらの多くは例えば、国際公開公報第93/18759号、国際公開公報第93/1 9768号、国際公開公報第94/25608号、および国際公開公報第95/2397号に記述さ れている。それらの中には、例えば核膜を通じてのDNA輸送を促進するために有 効なスペルミン誘導体(例えば、国際公開公報第93/18759号参照)およびGALA、 グラミシジンS、および陽イオン胆汁酸塩のような膜透過性化合物が含まれる( 例えば国際公開公報第93/19768号を参照のこと)。 金またはタングステン微粒子もまた、国際公開公報第91/359号、第93/17706号 およびタンら(Tang、Nature 356:152、1992)の記述のように、遺伝子輸送に 用いることができる。この場合、米国特許第4,945,050号、米国特許第5,015,580 号、および国際公開公報94/24263号に記述のように、微粒子コーティングポリヌ クレオチドを針なし注射器(「遺伝子銃」)を用いて皮内または上皮内経路で注 射することができる(「遺伝子銃」)。 ワクチン受容者に用いられるDNA量は、例えばDNA構築物において用いられるプ ロモーターの強度、発現した遺伝子産物の免疫原性、投与される哺乳動物の状態 (例えば、哺乳類の体重、年齢、および全身健康状態)、投与様式、ならびに製 剤のタイプに依存する。一般に、約1μg〜約1mgの治療的または予防的有効量 、 好ましくは約10μg〜約800μg、およびより好ましくは約25μg〜約250μgをヒト 成人に投与することができる。投与は1回投与または間隔を開けて反復投与によ って行うことができる。 投与経路はワクチン分野において用いられる従来の如何なる経路であってもよ い。一般的ガイダンスとして、本発明のポリヌクレオチドは粘膜表面、例えば、 眼、鼻腔、肺、口腔、脳、直腸、膣または尿管表面粘膜を通じて、または非経口 経路、例えば静脈内、皮下、腹腔内、皮内、表皮内、または筋肉内経路によって 投与することができる。投与経路の選択は、例えば、選択する製剤による。ブピ バカインに関連して製剤化されたポリヌクレオチドは、筋肉に投与すると有効で ある。中性または陰イオンリポソームまたはDOTMAのような陽イオン脂質を用い る場合、製剤は静脈内、鼻腔内(例えば、エアロゾル化)、筋肉内、皮内、およ び皮下経路によって都合よく注射することができる。そのままの形でのポリヌク レオチドは、筋肉内、皮内または皮下経路によって有効に投与することができる 。絶対的に必要ではないが、そのような組成物はまた、アジュバントを含むこと ができる。アジュバント作用を示すために同時投与を必要としない全身アジュバ ントが好ましい。 本出願において提供される配列情報により、診断法において用いることができ る特殊なヌクレオチドプローブおよびプライマーのデザインが可能となる。従っ て、本発明の第5の局面において、配列番号:1〜21(奇数)、配列番号:65、 および配列番号:67、またはそれらの相補配列のいずれかにおいて示される配列 において認められる、または遺伝子コードの縮重性によってそれらの配列に由来 するヌクレオチドプローブまたはプライマーが提供される。 本出願において用いられる「プローブ」という用語は、先に定義したように、 ストリンジェントな条件下で配列番号:1〜21(奇数)、配列番号:65、および 配列番号:67に示す配列のいずれかと相同である配列を有するポリヌクレオチド 分子、または配列番号:1〜21(奇数)、配列番号:65、および配列番号:67の いずれかの配列の相補的もしくはアンチセンス配列とハイブリダイズする、DNA (好ましくは1本鎖)またはRNA分子(またはその改変もしくは併用)を指す。 一般に、プローブは、配列番号:1〜21(奇数)、配列番号:65、および配列番 号: 67のいずれかに示される全長の配列より有意に短い。例えば、それらは約5〜約 100ヌクレオチドを含むことができ、好ましくは約10〜約80ヌクレオチドを含む ことができる。特に、プローブは配列番号:1〜21(奇数)、配列番号:65、お よび配列番号:67のいずれかに示す配列の一部、または該配列に相補的な配列と 少なくとも75%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは95%相同である配 列を有する。 プローブは、イノシン、メチル-5-デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジ メチルアミノ-5-デオキシウリジン、またはジアミノ-2,6-プリンのような修飾塩 基を含むことができる。糖または燐酸残基も同様に、修飾または置換することが できる。例えば、デオキシリボース残基はポリアミド(ニールセンら(Nielsen )、Science 254:1497、1991)によって置換することができ、燐酸残基は二燐 酸、アルキル、ホスホン酸アリール、およびホスホロチオ酸エステルのようなエ ステル基によって置換することができる。さらに、リボヌクレオチド上の2'-水 酸基は、例えばアルキル基を付加することによって修飾することができる。 本発明のプローブは診断検査または捕獲もしくは検出プローブとして用いるこ とができる。そのような捕獲プローブは固相支持体上に、直接または間接的に共 有結合または受動的吸収によって固定することができる。検出プローブは、検出 可能な標識、例えば放射性同位体;ペルオキシダーゼおよびアルカリフォスファ ターゼのようなのような酵素;発色性、蛍光性または発光性の基質を加水分解す ることができる酵素;発色、蛍光または発光性の化合物;ヌクレオチド塩基類似 体;およびビオチンから選択される標識によって標識することができる。 本発明のプローブは、ドットブロット法(マニアティスら(Maniatis)、「分 子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual) 」、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor、ニューヨー ク、1982)、サザンブロット法(サザン(Southern)、J.Mol.Biol.98:503 、1975)、ノーザンブロット法(RNAを標的として用いることを除いてはサザン ブロットと同じ)またはサンドイッチ法(ダンら(Dunn)、Cell 12:23、1977 )のような従来のハイブリダイゼーション法において用いることができる。当技 術分野で既知のように、後者の技法は、少なくとも部分的に互いに異なるヌクレ オチド 配列を有する特異的捕獲プローブおよび特異的検出プローブを用いることを含む 。 本発明において用いられるプライマーは約10〜40ヌクレオチドを含み、増幅プ ロセス(例えば、PCR)、伸長プロセス、または逆転写法においてDNAの酵素的重 合化を開始するために用いられる。PCRを含む診断法において、プライマーは標 識することができる。 このため、本発明はまた、(i)生物材料中に存在するヘリコバクターを検出お よび/または同定するための、本発明のプローブを含む試薬;(ii)(a)試料を生 物材料から回収するかまたはこれに由来する、(b)DNAまたはRNAを材料から抽出 し変性させる、ならびに(C)ストリンジェントな条件のもとで、試料を、本発明 のプローブ、例えば捕獲プローブ、検出用プローブ、または両方に暴露し、ハイ ブリダイゼーションを検出することを含む、生物材料中に存在するヘリコバクタ ーを検出および/または同定するための方法;(iii)(a)試料を生物材料から回収 するかまたはこれに由来する、(b)DNAをそれらから抽出する、(c)抽出したDNAを 、少なくとも一種、または好ましくは二種の本発明のプライマーと接触させ、ポ リメラーゼ連鎖反応により増幅する、ならびに(d)増幅されたDNA分子を産生する ことを含む、生物材料中に存在するヘリコバクターを検出および/または同定す るための方法をも含んでいる。 上述したように、本発明のポリヌクレオチドを発現させて産生されるポリペプ チドは、ワクチン抗原として用いることができる。従って、本発明の第六の局面 は、本発明のポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を有する実質的な精製 ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体に関するものである。 「実質的に精製されたポリペプチド」とは、天然に生じる環境から分離された ポリペプチドおよび/または合成時の環境中に存在する他の多くのポリペプチド の混入のないポリペプチドとして定義される。本発明のポリペプチドは、ヘリコ バクター菌株のような天然の供給源から精製することができるか、または組換え 法を用いて産生することができる。 本発明のポリヌクレオチドがコードするものと相同なポリペプチドまたはポリ ペプチド誘導体は、特異的な抗原性を持つため、配列番号:2〜22(偶数番号) 、 配列番号:66、および配列番号:68のいずれかに示したアミノ酸配列を有するポ リペプチドに対して作成した抗血清を用いた交差反応性試験により、スクリーニ ングすることができる。簡単にいえば、例えば、MBP、GSTもしくはヒスチジン・ タグのシステムによる発現産物、または抗原性を有すると予想される合成ペプチ ドのような精製した対照用ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドに対して、単 一抗原特異的な高力価の抗血消を作成することができる。特異的な抗原性を有す るかどうかをスクリーニングするための相同なポリペプチドまたは誘導体は、そ れ自体または融合ポリペプチドとして、作成することができる。後者の場合、し かも融合ポリペプチドに対する抗血清も作成する場合には、二つの異なる融合シ ステムを用いる。特異的な抗原性は、以下に述べるようにウエスタンブロット( Towbinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350、1979)、ドットブロットおよ びELISA法を含む数多くの方法を用いて、検出することができる。 ウエスタンブロットによるアッセイでは、スクリーニングする産物は精製材料 または大腸菌の全抽出物であるが、これを例えばラムリ(Laemmli)の記述(Nat ure 227:680、1970)にあるように、SDS-PAGEでフラクションに分画する。試料 をニトロセルロース膜のようなフィルターにトランスファーした後、約50倍から 約5000倍、好ましくは約100倍から約500倍の範囲で希釈した単一抗原特異的な高 力価の抗血清と反応させる。産生物に対応するバンドがその範囲のいずれかの希 釈で反応性を示せば、特異的な抗原性が検出されたことになる。 ELISAによるアッセイでは、スクリーニングする産生物は、コート用の抗原の 形で用いることができる。精製材料が好ましいが、細胞の全抽出物でも用いるこ とができる。簡単にいえば、約10μg蛋白質/mlの材料の約100μlを、96穴のELIS Aプレートのウェルに分注する。プレートを37℃で約2時間処理した後、4℃で一 晩処理する。プレートを、0.05%のTween 20を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)(P BS/Tween緩衝液)で洗浄し、非特異的な抗体の結合を防ぐために、ウェルを1% のウシ血消アルブミン(BSA)を含む250μlのPBSで満たす。37℃で1時間処理し た後、プレートをPBS/Tween緩衝液で洗浄する。抗血清を、0.5%のBSAを含むPBS /Tween緩衝液で階段希釈し、各ウェルに100μlずつ加える。プレートを37℃で90 分処理して洗浄し、標準的な方法を用いて評価する。例えば、ウサギで作成した 特異的抗 体を用いる場合には、過酸化酵素を結合したヤギの抗ウサギ血清を加えることが できる。37℃で90分処理した後、プレートを洗浄する。適切な基質を加えて反応 を進行させ、反応結果を吸光度(吸光度計により計測される吸光度)により測定 する。これらの実験条件の下では、少なくとも約50倍、好ましくは少なくとも約 500倍の希釈度でO.D.値1.0が計測されれば、反応が陽性であることが示される。 ドットブロットによるアッセイでは、細胞の全抽出物でも使用することはでき るが、精製産物が好ましい。簡単にいえば、約100μg/mlの濃度の産生物の溶液 を、50mM Tris-HCl(pH7.5)で2倍ずつ階段希釈する。各希釈を100μlずつ、0. 45μmのニトロセルロース膜のようなフィルターに滴下し、96穴のドットブロッ ト用装置(Biorad)にセットする。システムに吸引をかけて緩衝液を除去する。 50mMのTris-HCl(H7.5)を加えてウェルを洗浄し、膜を風乾する。ブロッキング 緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.15M NaCl、10g/lスキムミルク)で膜を飽 和し、約50倍から約5,000倍、好ましくは約500倍に希釈した抗血清と反応させる 。標準的な方法を用いて、反応を検出する。例えば、ウサギで作成した特異的抗 体を用いる場合には、過酸化酵素を結合したヤギの抗ウサギ血清を加えることが できる。37℃で約90分処理した後、ブロットを洗浄する。適切な基質を加えて反 応を進行させ、停止する。その後、着色スポットの出現を、比色計を用いて、視 覚的に反応を測定する。これらの実験条件下では、少なくとも約50倍、好ましく は少なくとも約500倍の希釈で行った反応の着色スポットが検出されれば、反応 は陽性である。本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体の治療的または 予防的な効用は、以下に述べるようにして評価することができる。 本発明の第7の局面に従って、(i)希釈液または担体とともに本発明のポリペ プチドを含む材料の組成物、(ii)本発明のポリペプチドを、治療的または予防的 有効量で含む薬学的組成物、(iii)たとえばヘリコバクターに対する防御的免疫 応答のような免疫応答を惹起するために、本発明のポリペプチドの免疫学的な有 効量を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物内にヘリコバクターに対する免 疫反応を誘導する方法、及び、(iv)処置の必要な個体に対して、本発明のポリペ プチドを、予防的または治療的に有効な量投与することにより、ヘリコバクター (たとえば、H.Pylori、H.felis、H.mustelaeまたはH.heilmanii)感染を予防お よび /または治療する方法を提供する。さらに、本発明のこの局面には、ヘリコバク ター感染を予防および/または治療するための薬剤を製造する際に本発明のポリ ペプチドを使用することも含まれる。 本発明の免疫原性組成物は、例えば粘膜(たとえば眼、鼻腔、肺、口腔、胃、 脳管、直腸、膣、または尿管)表面経由、もしくは非経口(たとえば皮下、皮内 、筋肉内、血管内、または腹腔内)経路のような、ワクチンの分野で用いられる 通常の経路のいずれによっても投与することができる。投与経路は、使用するア ジュバントのような数多くのパラメーターによって選択される。例えば、粘膜用 のアジュバントを用いた場合には、経鼻腔または経口の経路が好ましく、脂質製 剤またはアルミニウム化合物を用いれば、非経口経路が好ましい。後者の場合に は、皮下または筋肉内への経路が最も好ましい。また、ワクチン物質の性質によ っても、投与経路は制限される。例えば、本発明のポリペプチドをCTBまたはLTB に融合させたものは、粘膜表面に投与することが最良である。 本発明の組成物は、一種または数種の本発明のポリペプチドまたは誘導体を含 む可能性がある。また、さらに少なくとももう一種の、ウレアーゼアポ酵素のよ うなヘリコバクター抗原、もしくは、それらに由来するサブユニット、断片、相 同体、変異体、または誘導体をも含む可能性がある。 本発明に係る組成物として使用するために、輸送の促進および/または免疫応 答の増強を目的として、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を、中性または 陰イオン性のリポソーム、微小球体、ISKOMS、またはウイルス様粒子(VLP)の ようなリポソーム中に、またはリポソームとともに、製剤することができる。こ れらの組成物は、当業者が容易に使用できる;例えば、リポソーム:実用的アプ ローチ(Liposomes:A Practical Approach)(前記)参照。リポソーム以外のア ジュバントもまた、当技術分野では既知のものであり本発明に用いることが可能 である(例えば、以下にあげたリスト参照)。 投与は、一回または、必要に応じて当業者が定める間隔で繰り返し行うことが 可能である。例えば、最初の投与後、毎週または毎月という間隔で三回ブースト をかけることもできる。投与の適正量は、投与を受ける側の性質(例えば、被投 与者が成人か幼児か)、特定のワクチン抗原、投与の経路および頻度、アジュバ ントの有無またはタイプ、ならびに好ましい効果(たとえば、予防および/また は治療)を含む様々なパラメーターに左右され、当業者が容易に決定することが できるものである。一般に、本発明のワクチン抗原は、約10μgから約500mg、好 ましくは約1mgから約200mgの範囲の量で、粘膜に投与することが可能である。非 経口的な経路で投与するには、通常は投与量が約1mg、好ましくは、約100μgを 超えてはならない。 ワクチン成分として用いる場合、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ ドは、マルチステップの免疫過程の一部として、連続的に使用することが可能で ある。例えば、哺乳動物を最初はポックスウイルスのような本発明のワクチン用 ベクターで、たとえば非経口的に刺激し、次にワクチン用ベクターがコードする ポリペプチドで、たとえば粘膜経由の経路で2回ブーストをかける。別の例とし ては、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドの誘導体と結合したリポソーム で最初の刺激を行い、粘膜型のアジュバント(たとえばLT)と組み合わせた本発 明の水溶性のポリペプチドまたはポリペプチドの誘導体を用いて、経粘膜的にブ ーストをかける。 本発明のポリペプチドおよびポリペプチドの誘導体はまた、例えば血液試料中 に存在する抗ヘリコバクター抗体を検出するための診断薬として用いることも可 能である。そのようなポリペプチドは、約5から約80、好ましくは約10から約50 アミノ酸の鎖長を有し、診断法に応じて標識せずに用いることも可能である。そ のような薬剤を含む診断方法を、以下に記述する。 本発明のポリヌクレオチド分子を発現させてポリペプチドまたはポリペプチド の誘導体を産生し、これを既知の方法を用いて精製することが可能である。例え ば、ポリペプチドまたはポリペプチドの誘導体を、精製を容易にするための融合 尾部を含む融合蛋白質として産生することが可能である。この融合産物を、たと えばマウスまたはウサギのような小型の哺乳類を免疫して、このポリペプチドま たはポリペプチドの誘導体に対する単一抗原特異的な抗体を作成するために用い ることができる。故に、本発明の第八の局面は、本発明のポリペプチドまたはポ リペプチドの誘導体に結合する単一抗原特異的抗体を提供することである。 「単一抗原特異的抗体」という用語は、天然に産生される単一のヘリコバクタ ーポリペプチドと反応できる抗体を意味する。本発明の抗体は、ポリクローナル またはモノクローナルでありうる。単一抗原特異的抗体は、例えばキメラ(たと えばマウス由来の可変領域およびヒト由来の定常領域からなる)、ヒト化(たと えばヒトの免疫グロブリン定常領域および例えばマウスのような動物由来の可変 領域)、および/または単一鎖のような、組換え体であり得る。ポリクローナル 抗体および単一抗原特異的抗体はまた、両方とも、たとえばF(ab)'2またはFab断 片のような免疫グロブリン断片の形でもあり得る。本発明の抗体は、たとえばIg GまたはIgAのようないかなるアイソタイプである可能性もあり、ポリクローナル 抗体は、単一のアイソタイプから成るかまたはアイソタイプの混合体を含むこと もあり得る。 本発明のポリペプチドまたはポリペプチドの誘導体に対して作成されうる本発 明の抗体を作成し、たとえばウエスタンブロットによるアッセイ、ドットブロッ トによるアッセイ、またはELISAのような標準的な免疫学的アッセイを用いて、 (たとえばColiganら、免疫学の現行プロトコール集(Current Protocols in Im munology)、John Wiley & Sons,Inc.、New York、NY、1994参照)同定するこ とが可能である。これらの抗体は、生物試料のような試料中に存在するヘリコバ クター抗原を検出するための診断法に用いることも可能である。これらの抗体は また、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドの誘導体を精製するための親和 性クロマトグラフィー法に用いることもできる。以下で更に検討するように、こ れらの抗体はまた、予防的および治療的な受動免疫法に用いることも可能である 。 従って、本発明の第九の局面は、(i)本発明の抗体、ポリペプチドまたはポリ ペプチドの誘導体を含む生物試料中からヘリコバクターの存在を検出するための 試薬;および(ii)本発明の抗体、ポリペプチドまたはポリペプチドの誘導体を生 物試料と接触させて免疫複合体を形成させ、試料または試料が由来する生物中に ヘリコバクターが存在する証明としてその複合体を検出することにより、生物試 料中に存在するヘリコバクターを検出する診断法を提供する。試料成分および抗 体、ポリペプチドまたはポリペプチドの誘導体との間で免疫複合体を形成し、す べての非結合物質を除去してから、この複合体を検出する。たとえば血液試料の ような試料中に存在する抗ヘリコバクター抗体を検出するためにポリペプチド試 薬 を用いることができるが、本発明の抗体を、胃抽出物または生検試料のような試 料中にヘリコバクターポリペプチドが存在するかどうかをスクリーニングするた めに用いることができる。 診断法に用いるために、試薬(たとえば本発明の抗体、ポリペプチドまたはポ リペプチドの誘導体)は遊離状態、もしくは、例えばチューブ内壁もしくはビー ズの表面または孔内部のような固体支持相に固定した状態にすることも可能であ る。固定は、直接または間接的な方法で行うことができる。直接的手段としては 、支持相と試薬とを受動的吸着(すなわち非共有結合)または共有結合で固定す ることが含まれる。「間接的方法」という用語は、試薬と反応する抗試薬成分を まず固体支持相に接着させることを意味する。例えば、ポリペプチド試薬を用い る場合、この試薬に結合する抗体は、生物試料中の抗体を認識するには不要なエ ピトープに結合するのであれば、抗試薬成分として作用する。間接的方法として はまた、例えばビタミンのような分子をポリペプチド試薬にさらに結合させ、こ れに対応する受容体を固体支持相に固定するような、リガンドー受容体システム も用いることができる。この概念は、有名なビオチン−ストレプトアビジンシス テムで説明される。または、例えば、化学的にまたは遺伝子工学の手法を用いて 試薬にペプチド尾部を付加し、このペプチド尾部で受動的吸着または共有結合を 行うことにより、付加産物または融合産物を固定するという、間接的手段を用い ることができる。 本発明の第十の局面によれば、本発明の単一抗原特異的抗体を用いて、抗体を 用いた生物試料の親和性クロマトグラフィーを行うことを含む、生物試料から本 発明のポリペプチドまたはポリペプチドの誘導体を精製する過程が提示される。 本発明を精製過程に用いる場合、抗体は、ポリクローナルまたは単一抗原特異 的、好ましくは、IgGタイプでありうる。精製IgGは、抗血清から、標準的な方法 (たとえばColiganら、前記)を用いて精製することができる。従来のクロマト グラフィー用担体は、抗体を付加する標準的な方法同様に、例えばHarlowらによ り記述されている(抗体:実験室マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual )、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1 988)。 端的に言えば、好ましくは緩衝液中から抽出されたH.ピロリ抽出物のような生 物試料は、好ましくは生物試料を希釈するために用いる緩衝液で平衡化したクロ マトグラフィー担体に滴下し、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドの誘導 体(すなわち抗原)を担体に吸着させる。本発明の抗体にカップリングさせたゲ ルまたは樹脂などのクロマトグラフィー担体は、バッチまたはカラムの形にする ことができる。非結合成分を洗浄除去し、グリシン緩衝液、たとえばグアニジン 塩酸のようなカオトロピズム試薬を含む緩衝液、または高塩濃度(たとえば3M M gCl2)の緩衝液のような適切な溶出緩衝液で、抗原を溶出する。溶出したフラク ションを回収し、たとえば280nmでの吸光度を測定することにより、抗原が存在 するかどうかを検出する。 本発明の抗体は、以下のようにして、治療効果をスクリーニングすることがで きる。本発明の第十一の局面によれば、(i)希釈液または担体とともに本発明の 単一抗原特異的抗体を含む材料の組成物;(ii)本発明の単一抗原特異的抗体の治 療的または予防的な有効量を含む薬学的組成物、および(iii)処置の必要な個体 に、治療または予防に必要な量の本発明の単一抗原特異的抗体を投与することに より、ヘリコバクター(たとえば、H.pylori、H.felis,.H.mustelaeまたはH.he ilmanii)感染を治療または予防する方法を提示する。さらに、本発明の第十一 の局面には、ヘリコバクター感染を治療または予防する薬物を製造する際に本発 明の単一抗原特異的抗体を使用することも含まれる。 単一抗原特異的抗体はポリクローナルまたはモノクローナルの可能性があり、 好ましくは、主にIgAアイソタイプである。受動免疫法においては、この抗体を 、例えば胃粘膜のような哺乳類の粘膜表面に、たとえば経口または胃内に、必要 に応じて炭酸水素緩衝液存在下で投与する。あるいは、炭酸水素塩緩衝液を必要 としない全身投与を行うことも可能である。本発明の単一抗原特異的抗体は、異 なるヘリコバクターポリペプチドに特異的な単一抗原特異的抗体との混合物とし て、投与することができる。使用する抗体の量および特定の処方は、当業者が容 易に決定できる。例えば、一週間にわたって約100〜1,000mgの抗体を毎日投与す る、または、2〜3日にわたって、約100〜1,000mgの抗体を毎日3当量投与する 、という処方は、多くの目的に有用である可能性がある。 治療または予防における有効性は、当技術分野における標準的な方法、例えば 粘膜免疫反応の誘導もしくは、例えばH.felisマウスモデルを用いた予防的およ び/または治療的免疫の誘導の測定、およびLeeら(Eur.J.Gastroenterology & Hepatology 7:303,1995)またはLeeら(J.Infect.Dis.172:161,1995)が報告し た手順によって評価することができる。当業者は、このモデルにおけるH.felis 種の菌株は、他のHelicovobacter種の菌株によって置き換えられることが認識で きると期待される。例えば、H.ピロリ由来のポリヌクレオチド分子およびポリペ プチドの有効性は、好ましくは、H.ピロリ種の菌株を用いたマウスモデルで評価 される。感染防御は、胃組織中のヘリコバクターの感染の程度を、例えばウレア ーゼ活性、細菌数、または胃炎によって評価し、対照群のものと比較することに よって決定することができる。対照群と比較して感染が減少しているとき、感染 防御が示される。こうした評価の方法は、本発明の抗体に対してと同様に、ポリ ヌクレオチド、ワクチンベクター、ポリペプチド、およびポリペプチド誘導体に 対しても行うことができる。 例えば、本発明の抗体を様々な濃度で、例えばLeeら(上記)が記載している ようにH.ピロリを予め感染させたマウスの胃粘膜に投与することができる。その 後、適当な時間経過の後に、粘膜における細菌の負荷を、ウレアーゼ活性を対照 群と比較して評価することによって判断できる。ウレアーゼ活性が減少すれば、 抗体が治療上有効であることを示している。 これまで記載したいずれかのワクチン組成物中で用いられたアジュバントは、 以下の通りである。非経口投与のためのアジュバントには、例えば水酸化アルミ ニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウムといったアルミニ ウム化合物が含まれる。抗原は、標準的な方法によってアルミニウム化合物で沈 殿、または吸着できる。RIBI(ImmunoChem,Hamilton,MT)のようなこのほかのア ジュバントもまた、非経口投与に用いることができる。 粘膜投与の場合に用いることのできるアジュバントには、例えば、コレラ毒素 (CT)、E.coli(大腸菌)非耐熱性毒素(LT)、クロストリジウム・ジフィシル (Clostridium difficile)毒素A、pertussis(百日咳)毒素(PT)、およびこ れらの組み合わせのような細菌毒素、およびこれらの、サブユニット、トキソイ ド 、または変異体が含まれる。例えば、天然のコレラ毒素サブユニットCTBの精製 物を用いることができる。これらの毒素のいずれの断片、同族体、誘導体、およ び融合体も、それらがアジュバント活性を維持しているかぎり、用いることがで きる。好ましくは毒性の減少した変異体を用いる。適切な変異体は、例えば国際 公開公報第95/17211号(Arg-7-Lys CT変異体)、国際公開公報第96/6627号(Arg-19 2-Gly LT変異体)、および国際公開公報第95/34323号(Arg-9-LysおよびGlu-129-G ly PT変異体)中に記載されている。本発明の方法および成分に用いられたその他 のLT変異体には、例えばSer-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-110-AspおよびGlu-112-A sp変異体が含まれる。例えば大脳菌、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minne sota)、サルモネラ・ティフィミュリアム(Salmonella typhimurium)、または シゲラ・フレクシネリ(Shigella flexneri)等の細菌性単リン酸脂質A(MPLA) 、サポニン、およびグリコール酸化ポリ乳糖(PLGA)微細球の様なこのほかのア ジュバントもまた粘膜投与に用いることができる。ポリフォスファゼン(poliph osphazene)(WO 95/2415)の様な粘膜および非経口投与の両方に役立つアジュ バントも用いることができる。 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチドの誘導体、または抗 体を含む、本発明の薬学的組成物はいかなるものも、標準的な手法を用いて生産 することができる。これは、例えば、水、または、必要に応じて、例えば0.1〜0 .5Mの炭酸水素ナトリウムの様な炭酸水素塩を含むPBSなどの生理食塩水のような 、薬学的に許容される希釈剤または担体と共に処方することができる。炭酸水素 塩は、経口または胃内への投与を目的とする製剤に、効果的に添加することがで きる。一般に、希釈剤または坦体は、投与の様式および経路、ならびに標準的な 製薬上の実際に基づいて選択できる。適切な薬学的坦体および希釈剤は、薬学的 処方においてこれらを用いるための製薬上の必要物と同様に、この分野およびUS P/NFにおける標準的な参考文献である「レミントンの製薬科学(Remington's Ph armaceutical Sciences)」に記載されている。 本発明はまた、ヘリコバクター感染のような胃十二指腸感染症を、抗生物質、 抗分泌剤、ビスマス塩、制酸剤、スクラルファート、またはこれらの組み合わせ と共に、本発明のヘリコバクターポリペプチドおよび粘膜アジュバントを経口投 与することで治療する方法を含んでいる。こうしたワクチン抗原およびアジュバ ントとともに投与できる化合物の例として、以下のものが含まれる;例えばマク ロライド類、テトラサイクリン類、βラクタム類、アミノグリコシド類、キノロ ン類、ペニシリン類、およびこれらの誘導体(本発明に用いることのできる特別 な抗生物質の例として、例えばアモキシリン、クラリスロマイシン、テトラサイ クリン、メトロニダゾル、エリスロマイシン、セフロキシム、およびエリスロマ イシン);例えばH2受容体アンタゴニスト類(例えば、シメチジン、ランチジン 、ファモチジン、ニザチジン、およびロクソチジン)、プロトンポンプインヒビ ター類(例えば、オメプラゾール、ランソプラゾール、およびパントプラゾール )、プロスタグランジン類似体類(例えばミソプロスチルおよびエンプロスチル )、および抗コリン剤類(例えば、ピレンゼピン、テレンゼピン、カルベノキソ レンおよびプログルミド)を含む抗分泌剤類;ならびにコロイド状ビスマス次ク エン酸塩、三ナトリウム二クエン酸ビスマス塩、次サリチル酸ビスマス、二クエ ン酸ペプチド、およびペプトービスモルを含むビスマス塩類(例えばGoodwinら、 ヘリコバクター・ピロリ、生物学および臨床実習(Helicobacter pylori,Biolo gy and Clinical Practice)、CRC Press、Boca Raton、FL、pp 366-395、1993; 臨床家デスクリファレンス(Physicians’Desk Reference)、49版、Medical Ec onomics Data Production Company、Montvale、New Jersey、1995参照)。さらに 、例えば次クエン酸ビスマスにラニチジンを結合させた物のような、上記にあげ た成分のうち一つ以上が結合し合った化合物も用いることができる。本発明はま た、これらの方法を実行するための化合物、即ち、本発明のヘリコバクター抗原 (または複数の抗原)、アジュバント、および上記の化合物の一つまたはそれ以 上を薬学的に許容される坦体または希釈剤中に含む化合物をも含んでいる。 本発明の方法および組成物における上記化合物の使用量は、当業者が容易に決 定できる。さらに、当業者であれば、容易に治療/免疫の計画をたてることがで きる。例えば、第1〜14日目までワクチンでない化合物を投与し、ワクチン抗原 +アジュバントを第7、14、21および28日目に投与する。 本発明の方法および薬学的組成物は、ヘリコバクター感染症、従って急性、慢 性および萎縮性胃炎ならびに、例えば胃および十二指脳潰瘍の様な消化性潰瘍疾 患を含む、これらの感染症に関連した胃十二指脳疾患の治療または予防に用いる ことができる。 GHPO 386、GHPO 789、およびGHPO 1516を含む76kDaの蛋白質バンド(以降、「 精製76kDa蛋白質」と称する)、GHPO 1360ならびにGHPO 750は、ヘリコバクター ・ピロリ株ATCC 43579(アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル 、メリーランド州)から、以下の実施例1に記述の方法を用いた免疫アフィニテ ィに基づくクロマトグラフィーによって精製し、これは以下のように有効なワク チン抗原であることが示された。 1、5または25μgの精製76kDa蛋白質、精製GHPO 1360または精製GHPO 750を 大腸菌の熱不安定エンテロトキシン(LT)5μgと共に、各群10匹のマウスに経口 で免疫した。組換え型ウレアーゼ25μgをLT 5μgと共に陽性対照として用い、L T5μgのPBS溶液を陰性対照として用いた。免疫はそれぞれ、実験の0、7、14 および21日目に4回実施した。33日目に、血液試料をマウスから採取して34日目 に唾液試料を回収した。35日目に、全てのマウスに1×107個ストレプトマイシ ン耐性マウス適合H.ピロリを胃内投与することによってチャレンジした。49日 目に、さらなる唾液試料を回収し、チャレンジの約2週間後、52〜53日に、マウ スを屠殺した。マウスから胃を摘出して、無傷の胃の組織におけるウレアーゼ活 性を測定することによって、および定量的培養試験によって、ヘリコバクター感 染症について分析した(表1)。 簡単に説明すると、これらの試験によって、精製76kDa蛋白質(すなわち、1 、5および25μg)の3つ全ての量をLTと組み合わせて免疫したマウスの試料に おける胃のウレアーゼ活性は、一般的にLT単独で免疫したマウスまたはチャレン ジ前に無処置のマウスの試料中の胃のウレアーゼ活性より概して低いことが示さ れた。胃のウレアーゼ活性のレベルは、概して投与した蛋白質量が増加すれば減 少し、25μgを投与した場合の胃のウレアーゼ活性レベルは一般に、25μgの組換 え型ウレアーゼのおよびLTで免疫したマウスの活性レベルに近づく。 定量的培養分析によって、精製76kDa蛋白質、精製GHPO 1360、または精製GHPO 750で免疫したマウスの胃において検出されたヘリコバクターのレベルは、一般 に、用量が増加すれば減少するが、LT単体で免疫した対照マウスまたはヘリコバ クターのチャレンジ前に無処置のマウスの胃に検出されたレベルより低いことが 示された(表1および2)。精製76kDa蛋白質、精製GHPO 1360または精製GHPO 7 50による免疫によって保護されたマウスの割合は、ウレアーゼ処置によって保護 されたマウスの割合と一致またはこれに近づいた(表1および2)。これらの結 果は、76kDa精製蛋白質、GHPO 1360、およびGHPO 750がヘリコバクター感染症の 予防において用いられる有効なワクチン抗原であることを示している。 本発明はさらに、以下の実施例によって説明する。実施例1は、ヘリコバクタ ー培養物からのGHPO 1516(76kDa)、GHPO 1360(32kDa)、およびGHPO 750(50 kDa)の精製を記述する。実施例2は、ヘリコバクターゲノムにおける遺伝子、 例えばGHPO 386、GHPO 789、GHPO 1516、GHPO 1197、GHPO 1180、GHPO 896、GHP O 711、GHPO 190、GHPO 185、GHPO 1417、およびGHPO 1414、のような76kDa蛋白 質、32kDa蛋白質(GHPO 1360)、ならびに50kDa蛋白質(GHPO 750)をコードす る遺伝子の同定と共に、シグナル配列の同定およびシグナル配列を欠損する遺伝 子増幅のためのプライマーデザインについて記述する。実施例3は、GHPO 386、 GHPO 789、GHPO 1516、GHPO 896、GHPO 1360、およびGHPO 750をコードするDNA の、ヒスチジンタグを提供するベクターへのクローニング、ならびに得られたヒ スチジンタグ融合蛋白質の産生および精製について記述する。実施例4は、ヒス チジンタグなしで産生できるように、本発明のポリペプチドをコードするDNAの クローニング法について記述する。実施例5は、本発明の組換え型ポリペプチド を精製する方法を記述し、実施例6は、H.ピロリ感染症に対する血清診断学的 ツールとしてのGHPO 1360ポリペプチドの使用について記述する。 実施例1:ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)由来のGHPO 1516(76 kDa)、GHPO 1360(32kDa)、およびGHPO 750(50kDa)蛋白質の精製および部 分的配列解析 1.A.培養および初回精製段階 H.ピロリ株ATCC 43579からの凍結種子を用いて、二相性培地(6%新鮮ヒツ ジ赤血球を含むコロンビア・ゲロースからなる固相および20%仔ウシ胎児血清を 含む大豆トリプトケースからなる液相)を含む75cm2フラスコに播種する。微好 気性条件下で24時間培養した後、液相を用いてヒツジ赤血球を含まない二相性培 地を含むいくつかの75cm2フラスコに播種する。24時間培養した後、液相を用い て10g/Lβ-シクロデキストリンを含む大豆トリプトケース液相を2Lの生物発酵 槽に播種する。ODが1.5〜1.8となれば、この培養物を、液体培地を含む10Lの生 物発酵槽の中で希釈する。24時間後、細菌を4,000×gで4℃で30分間遠心する。 培養液10Lは細菌約20〜30g(湿重量)を含む。 上記の方法を用いて得られたペレットを、培養1LあたりPBS(7.650g NaCl、0 .724g燐酸二ナトリウム、および燐酸一カリウム0.210gを1L中に含む(pH7.2) )500mLで洗浄する。次に細菌を同じ条件下で再度遠心する。 ペレット(C1)を1%N-オクチル-D-グルコピラノシド(NOG;30ml/L;シグマ 社)に懸濁する。細菌懸濁液を攪拌しながら室温で一時間インキュベートして、 17,600×gで4℃にて30分遠心して、ペレット(C2)を回収する。 上清(S2)を、PBSに対して4℃で一晩攪拌しながら透析する。沈降物を、2,6 00×gで4℃にて30分遠心することによって回収する。上清(S2d)を捨て、ペレ ット(Cs2d)を回収して-20℃で保存する。 ペレット(C2)を20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)および100μMペファブロッ ク(緩衝液A)に再懸濁し、ウルトラ・チュラックス(3821、Janke&Kungel)で ホモジナイズする。ライソザイムおよびEDTAをそれぞれ0.1mg/mlおよび1mMで加 える。 ホモジネートを4℃で各2分間3回超音波処理して、210,000×gで4℃にて30 分間超遠心を行う。細胞質およびペリプラスム蛋白質を含む上清(S3)を廃棄し て、ペレットを回収して緩衝液Aで洗浄し、210,000×gで4℃にて30分超遠心す る。上清(S4)を捨てて、ペレット(C4)を-20℃で保存する。このペレット(C 4)は膜蛋白質を含む。 ペレット(C4)を50mM NaCO3(pH9.5)および100μMペファブロック(緩衝液B )で洗浄する。懸濁液を210,000×gで4℃にて30分超遠心する。上清(S5)を捨 てて、ペレット(C5)を洗浄して上記のように超遠心する。上清(S6)を捨てて 、ペレット(C6)を-20℃で保存する。 1.B.分離用SDS-PAGEによる膜分画C4の蛋白質の精製 5%ポリアクリルアミド濃縮ゲルおよび10%ポリアクリルアミド分離用ゲルを 含む二相性のゲルを用いて、ラムリ(Laemmli、前記)の方法に従ってSDS-PAGE を行う。膜分画C4を緩衝液Aに再懸濁して、2×試料緩衝液の等量で希釈して95 ℃で5分間加熱する。蛋白質約19mgをゲル(16×12cm;厚さ5mm)に載せる。50 Vで2時間予備移動を行い、その後65Vで一晩移動させる。クーマシー・ブルーで 染色すると、見かけの分子量87、76、54、50および32kDaを有する主なバンド5 個が現れる。50および32kDaのバンドはそれぞれ、47および35kDaのバンドがわず かに混入しているように思われる。 精製した76kDa蛋白質、32kDa蛋白質(GHPO 1360)、または50kDa蛋白質(GHPO 750)に対応するバンドをゲルから切り出し、抽出緩衝液(25mMトリス塩酸(pH 8.8)、8M尿素、10%SDS、100μMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、 および10μMペファブロック(緩衝液C))10〜20mL中でウルトラ・チュラックス によって粉砕する。 各ホモジネートを室温で7バールにてミリポアAP20フィルターを通じて濾過し 、5〜10mLの緩衝液Cで洗浄し、再度濾過する。75%メタノールおよび75%イソ プロパノールの50/50混合液の3倍量を加えて各濾液を沈殿させ、240,000×gで1 0℃にて16時間遠心する。 各ペレットを、1M NaCl、0.1%サルコシル(Sarkosyl)、100μM PMSF、およ び6M尿素(緩衝液D)を含む10mM NaPO4(pH7.0)2mLに再懸濁する。可溶化し た試料を、4M尿素を含む緩衝液D100mL、2M尿素および0.5%サルコシルを含む 緩衝液D100mL、および尿素またはサルコシルを含まない緩衝液D100mLで2回の順 に透析する。透析は室温で攪拌しながら各1時間実施する。最後の透析物を氷浴 中で30分インキュベートした後、低速で4℃にて10分間遠心する。上清を回収し てミリポアフィルター(0.45μm)を通して濾過し、-20℃で保存する。 1.C.免疫アフィニティに基づくクロマトグラフィーによる76kDa、32kDa、また は50kDa蛋白質の精製 1.C.1.抗血清の調製 分離用SDS-PAGEによって精製した精製76kDa蛋白質、32kDa蛋白質(GHPO 1360 )または50kDa蛋白質(GHPO 750)に対する特異的ポリクローナル抗血清を、以 下のようにウサギを過免疫することによって調製する。0日目に、蛋白質50μg を含む調製物をフロイントの完全アジュバントと共に混合して、ウサギの多数の 部位に皮下投与する。21日および42日目に、フロイントの不完全アジュバントと 共に蛋白質25μgでウサギを追加免疫して、60日目に屠殺する。56℃で30分加熱 することによって血清から補体を除去する。次に、ミリポアメンブレン(0.22μ m)を通じての濾過によって過免疫血清を滅菌する。 1.C.2.IgG精製 上記のように調製した過免疫血清を、100mMトリス塩酸(pH8.0)で平衡にした プロテインAセファロースファストフローカラム(Pharmacia)に載せる。カラム を100mMトリス塩酸(pH8.0)のカラム10倍容量、次に10mMトリス塩酸(pH8.0) のカラム10倍容量で洗浄する。IgGは0.1Mグリシン緩衝液(pH3.0)において溶出 し、5mL分画として回収し、そのそれぞれにトリス塩酸(pH8.0)0.25mLを加え る。各分画の吸光度を280nmで測定し、IgGを含む分画を合わせてプールし、必要 であれば、-70℃で凍結する。 1.C.3.カラムの調製 CNBr-活性化セファロース4Bゲル(Pharmacia;照会:17-0430-01)の適当量を 1mM NaCl緩衝液(乾燥ゲル1gは水和ゲル3.5mLとなる;水和ゲルは1mLあたりI gG 5〜10mgを保持することができる)に再懸濁する。次に、ブフナーを用いて 1mM塩酸の少量を加えることによって、ゲルを洗浄する。使用する1mM塩酸の総 量はゲルの200mL/gとなる。 精製IgGを室温で500mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)の50倍容量に対して4 時間透析する。次にIgGを同じ緩衝液で3mg/mlに希釈する。IgGをゲルと共に5 ±3℃で攪拌しながら一晩インキュベートする。ゲルをクロマトグラフィーカラ ムに充填して、500mM燐酸緩衝液(pH7.5)のカラム容量の2倍量で洗浄する。次 にゲルをチューブに移して100mMエタノールアミン(pH7.5)と共にインキュベー トし、PBSのカラム容量の2倍量で洗浄する。ゲルはPBS/メルチオレート1/10,00 0中で保存することができる。 1.C.4.吸着および溶出 76kDa蛋白質は、以下のように吸着させて溶出する。膜分画Cs2dを50mMトリス 塩酸(pH8.0)、2mM EDTAに懸濁して、0.45μmのメンブレンを通して濾過する 。50mMトリス塩酸(pH8.0)、2mM EDTAで平衡化したカラムに、上清を載せて約 10ml/時間の流速で流す。カラムを50mMトリス塩酸(pH8.0)、2mM EDTAのカラ ム容量の20倍容量、そして次に10mM燐酸緩衝液(pH6.8)2〜6倍容量で洗浄す る。 抗原を100mMグリシン緩衝液(pH2.5)で溶出する。溶出液を3mL分画に回収し てそれぞれに1M燐酸緩衝液(pH8.0)150μlを加える。各分画の吸光度を280nm で測定し、76kDa蛋白質を含む分画をプールして-70℃で保存する。 10%SDS-PAGEによる分析によって、76kDaに一本のバンドが現れる。この精製 された76kDa調製物についてN末端配列解析を行ったところ、得られた配列は以下 の通りである:EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV(配列番号:58)。 32kDa蛋白質(GHPO 1360)、または50kDa蛋白質(GHPO 750)を以下のように 免疫アフィニティに基づくクロマトグラフィーによって精製する。32または50kD a蛋白質を混入している蛋白質(それぞれ、47および35kDa蛋白質)から分離する ために、膜分画C4を50mM NaCO3(pH9.5)中で室温で攪拌しながら30分可溶化し て調製物を200,000×gで4℃にて30分遠心する。47および35kDa蛋白質はNaCO3緩 衝液中では不溶性であるため、ペレットとなって除去される。 上清を50mMトリス塩酸(pH8.0)、2mM EDTAに対して透析し、0.45μmメンブ レンを通して濾過する。濾過した上清を、50mMトリス塩酸(pH8.0)、2mM EDTA で平衡にしたカラムに載せ、約10mL/時間の流速で流す。カラムを50mMトリス塩 酸(pH8.0)、2mM EDTAのカラム容量の20倍量、そして次に10mM燐酸緩衝液(pH 6.8)2〜6倍容量で洗浄する。 抗原は100mMグリシン緩衝液(pH2.5)で溶出する。溶出液を3mL分画に回収し 、そのそれぞれに1M燐酸緩衝液(pH8.0)150μlを加える。各分画の吸光度を 280nmで測定し、50または32kDa蛋白質を含む分画をプールして-70℃で保存する 。 精製した蛋白質の10%SDS-PAGEによる分析によって、50および32kDaに単一の バンドが現れる。精製した50kDa蛋白質調製物についてN末端のシークエンシング を行う。認められた配列は以下の通りである:MKEKFNRTKPHVNIGTIGHVDH(配列番 号:73)。同様に、精製した32kDa調製物についてN-末端および内部シークエン シングを行う。認められた配列は以下の通りである:AHNANNATHNTKK(配列番号: 74)およびKPAHNA(配列番号:75)(N末端)、ならびにIDKQPKAKK(配列番号: 76)およびFWAKKQAE(配列番号:77)(内部)。 1.D.膜分画Cs2dからの76kDa蛋白質の精製および膜分画C4からの32kDa および50kDa蛋白質の精製 76kDa蛋白質もまた以下のように精製することができる。40mLのQ-セファロー スカラム(直径2.5cm:高さ8cm)を製造元(Pharmacia)の指示に従って調製す る。カラムを洗浄して、50mM NaCO3(pH9.5)、100μMペファブロックおよび0.1 %ツヴィッターゲント(Zwittergent)3-14を含む緩衝液Bで平衡化する。クロ マトグラフィーは、カラム出口での280nmにおける吸光度を測定することによっ てモニターする。 緩衝液Bに再懸濁した膜分画Cs2dからの蛋白質140mgをカラムに載せる。カラム を0.1M NaClの緩衝液B溶液で洗浄して、その後0.1〜0.5M NaCl勾配をカラムに与 える。0.35〜0.45M NaClの間で溶出された分画を、製造元(Pharmacia)の指示 に従って調製した10mLのS-セファロースカラム(直径:1.5cm;高さ:5cm;ゲ ル1mlあたり蛋白質10mgまで)でさらに精製する。得られた分画を、100μMペフ ァブロックおよび0.1%ツヴィッターゲント3-14を含む50mM酢酸塩(pH5.0)に 対して透析し、これを酢酸緩衝液で平衡化したカラムに載せる。 280nmでの吸光度が安定化するまでカラムを酢酸緩衝液で洗浄する(カラム容 量の約3倍を必要とする)。蛋白質を、酢酸緩衝液中の0〜0.5M NaCl勾配で溶出 する。0.15M NaClで溶出した分画を76kDa蛋白質で濃縮する。 32kDa蛋白質(GHPO 1360)は、以下のように精製することも可能である。膜分 画C4を、50mM NaCO3緩衝液(pH9.5)中で室温で30分攪拌しながら可溶化する。 次に懸濁液を200,000×gで4℃にて30分遠心する。35kDa蛋白質はNaCO3緩衝液に 不溶性であるため、これによって32および35kDa蛋白質が分離される。上清を50m M NaPO4緩衝液(pH7.0)に対して透析し、NaPO4緩衝液で平衡化したSP-セファロ ースカラムに載せる。カラムをNaPO4緩衝液で洗浄し、0〜0.5M NaCl勾配をカラ ムに与える。0.26〜0.31Mの間で溶出した分画が32kDa蛋白質を含む。 50kDa蛋白質は、以下のように精製することも可能である。膜分画C4を50mM Na CO3緩衝液(pH9.5)中で室温で30分攪拌しながら可溶化する。次に懸濁液を200, 000×gで4℃にて30分遠心する。47kDa蛋白質はNaCO3緩衝液に不溶性であるため 、これによって50および47kDa蛋白質が分離される。上清を50mM NaPO4緩衝液(p H7.0)に対して透析する。 40mLのQ-セファロースカラム(直径2.5cm:高さ8cm)を製造元(Pharmacia) の指示に従って調製し、洗浄して、緩衝液B(pH9.5)(50mM NaCO3、100μMペフ ァブロックおよび0.1%ツヴィッターケント3-14)で平衡化する。 クロマトグラフィーは、カラム出口での280nmでのUV検出によってモニターす る。上記のように可溶化した蛋白質140mgをカラムに載せ、これを280nmでの吸光 度が安定化するまで緩衝液Bで洗浄する。蛋白質を緩衝液B(10倍VT)での0.1〜0 .5M NaCl勾配で溶出し、その後0.5M、次に1M NaClを含む(2倍VT)緩衝液Bで 洗浄する。分画を回収してSDS-PAGEによって分析し、電気泳動プロフィールに従 ってプールする。 1M NaClでの洗浄開始に相当し、酸性蛋白質を含む分画9を、以下のようにさ らに精製する。10mLのDEAEセファロースカラム(直径:1.5cm、高さ:5cm)を 製造元(Pharmacia)の指示に従って調製する(ゲル1mlあたり蛋白質10mgまで )。カラムを緩衝液Bで洗浄して平衡化する。クロマトグラフィーは上記のよう にモニターする。 分画9を緩衝液Bに対して透析すると、蛋白質約10mgを含む。分画9をDEAE-セ ファロースカラムに載せる。280nmでの吸光度が安定化するまでカラムを緩衝液B で洗浄する。蛋白質を0〜0.5M NaCl勾配の緩衝液B溶液(10倍VT)で溶出し、そ の後1M NaCl(2倍VT)を含む緩衝液Bで洗浄する。分画を回収してSDS-PAGEに よって分析する。0.3〜0.4M NaClで溶出される分画に50kDa蛋白質が認められる 。 実施例2:76kDa蛋白質、32kDa蛋白質(GHPO 1360)、および50kDa蛋白質(GHPO 750)をコードする遺伝子などのH.ピロリ菌(H.pylori)ゲノム上の遺伝子の 同定、シグナル配列の同定、ならびにシグナル配列を持たない遺伝子を増幅する ためのプライマーの設計 2.A.H.ピロリ菌(H.pylori)のゲノムデータベースの構築 H.ピロリ菌(H.pylori)のゲノムは、長さ1.76メガベースと決定された、単 一の連続したヌクレオチド鎖を含んだテキストファイルとして提供された。全ゲ ノムを、プログラムSPLIT(Creativity in Action)を用いて、17個の別々のフ ァイルに分けた結果、それぞれが10万ヌクレオチドを含む16個の連続断片と、残 りの7万6千ヌクレオチドを含む17番目の連続断片を得た。17個のファイルのそれ ぞれに、以下のフォーマットを用いてヘッダを付加した:hpgo.txt(最初の連続 断片を表す)、.hpgl.txt(2番目の連続断片を表す)、以下同様。こうしてで きた17個のファイルをhpg0からhpg16と名付け、コピーしてまとめ、H.ピロリ菌 (H.pylori)全ゲノムのプラス鎖を表示するファイルを作成した。構築したデ ータベースを、「H」と名付けた。H.ピロリ菌(H.pylori)ゲノムのマイナス 鎖のデータベースは、最初にSeqPupプログラム(D.G.Gilbert、インディアナ大 学生物学科(Indiana University Biology Department))を用いてプラス鎖(p ositive strand)の逆相補鎖を作成してから、プラス鎖について上記したのと同 じ作業を行うことにより、同様に作成した。このデータベースを、「N」と名付 けた。 H.ピロリ菌(H.pylori)の全ゲノムにおいて、オープンリーディングフレー ム(open reading frames(ORFs))をコードしていると推定される領域を、登 録商標GENEMARKプログラム(Borodovskyら、Comp.Chem.17:123、1993)を用い て定めた。プラス鎖およびマイナス鎖の両鎖について、H.ピロリ菌(H.pylori )ゲノムがコードしていると椎定されオープンリーディングフレームのすべての 注釈つきバージョンを含んだテキストファイルからデータベースを作成し、これ を「0」と名付けた。各オープンリーディングフレームには、ゲノム上の位置、 および他の遺伝子との相対位置を表す数字を与えた。テキストファイルの操作は 必要でなかった。 2.B.H.ピロリ菌(H.pylori)データベースの検索 上記の方法で構築したデータベースを、FASTAプログラム(Pearsonら、Proc. Natl.Acad.Sci.USA、85:2444〜2448、1988)を用いて検索した。FASTAは、遺 伝子データベースのいずれか(「H」および/または「N」)に対してはDNA配列 を検索するために、または、オープンリーディングフレームのライブラリー(「 0」)に対してはペプチド配列を検索するために使用した。TFASTXは、DNAデータ ベース(「H」および/または「N」ライブラリー)のすべての可能な読み枠(rea ding frame)に対して、任意のペプチド配列を検索するために使用した。読み枠 のずれ(フレームシフト(frameshift))が起きた可能性を解決するためにも、 FASTXを用いて、DNAデータベースに対してDNA配列の翻訳される読み枠を検索す るか、または、蛋白質データベースに対してペプチド配列を検索した。 2.C.H.ピロリ菌ゲノムからのDNA配列の単離 FASTAは、一つ以上の分離された連続断片上に正確な塩基位置を同定し、それ ゆえに標的DNAの位置を同定する、構築されたDNAデータベースに対する検索を行 なう。標的配列の正確な位置が分かった場合、その遺伝子を持つと同定された連 続断片を、MapDrawソフトウェアパッケージ(DNAスター社(DNAStar,Inc.)) に出力し、その遺伝子を単離した。そして、前後のDNA配列とともに遺伝子配列 を切り出して、さらに解析するためにEditSeq.ソフトウェアパッケージ(DNAス ター社(DNAStar,Inc.))にコピーした。 2.D.シグナル配列の同定 標的遺伝子配列をコードしている推定蛋白質を、PROTEANソフトウェアパッケ ージ(DNAスター社(DNAStar,Inc.))を用いて解析する。この解析は、カイト −ドリトル計算則(Kyte-Doolittle algorithm)を用いて、蛋白質の疎水性領域 を予測し、また、疎水性の中心領域(core region)に先行する可能性のある極 性残基を同定するものである。このような極性残基は、多くのシグナル配列に典 型的である。その後、確認のために、標的蛋白質を、多くのモチーフと特徴的な 構造とから成るPROSITEデータベース(DNAスター社(DNAStar,Inc.))に対し て検索する。多くのシグナル配列と疎水性領域に一般的に特徴的なのは、原核生 物の脂質付着部位と推定される部位が同定されることである。上記二つの方法の 間で確認されたことが、任意の蛋白質のN末端において明らかになった場合には 、推定切断 部位を求める。特に、疎水性領域中心の直後に、アラニン(A)、セリン(S)、 またはグリシン(G)のいずれかのアミノ酸残基が存在することを含む。リポ蛋 白質の場合には、システイン(C)残基が切断後の第一番目の残基(+1 residue )として同定されることが多い。 2.E.シグナル配列の同定にもとづいた合理的なPCRプライマーの設計 N末端にヒスチジンタグを持つ組換え蛋白質を生成するために、翻訳によってN 末端に融合する配列を遺伝子配列としてクローニングする目的で、シグナル配列 の特徴を持つ遺伝子配列を省いた。N末端プライマーの遺伝子特異的な部分の5' 末端は、切断部位をこえて最初のコドンから始まるように設計されている。リポ 蛋白質の場合、N末端プライマーの5'末端は、切断後の+1の位置にある修飾され 得る残基の直後にある2番目のコドンから始まる。組換え蛋白質からシグナル配 列を除去すると、1段階での精製が可能になり、ハイブリッド構築物(hybrid c onstruct)を持つ宿主菌株の膜の中にシグナル配列を挿入することに関して生じ る可能性のある問題が避けられる。 実施例3:GHPO 386、GHPO 789、GHPO 1516、GHPO 896、GHPO 1360、およびGHPO 750をコードする単離DNAの調製、およびヒスチジンタグを持つ融合蛋白質とし てのこれらのポリペプチドの生産 3.A.ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)菌のゲノムDNAの調製 50%グリセロールを含むLB培地に縣濁して−70℃で保存されたヘリコバクター ・ピロリ(Helicobacter pylori)菌株ORV2001を、7%羊血を含むコロンビア・ア ガー培地上で、微好気性条件下(8〜10% CO2、5〜7% O2、85〜87% N2)48時間増 殖させる。細胞を回収して、PBS(pH7.2)で洗浄した後、Rapid Prep Genomic D NA Isolation Kit(Pharmacia Biotech社製)を用いて細胞からDNAを抽出する。 3.B.PCRによる増幅 GHPO 386、GHPO 789、GHPO 1516、GHPO 896、GHPO 1360、およびGHPO(奇数)、 65および67をコードするDNA分子を、上記の方法などで調製可能なゲノミックDNA から、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅する 。GHPO 386 N末端プライマー: 各クローンのN末端およびC末端プライマーはいずれも、クローニング目的のた めに5'クランプならびに制限酵素認識配列(BamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGA G)認識部位)を含む。 遺伝子特異的DNAの増幅は、製造元の指示に従って、熱安定DNAポリメラーゼ( 例えば、サーマラーゼDNAポリメラーゼ(Amresco))を用いて行う。反応混合液 は、蒸留水で最終容量を100μlとし、以下の通りである: dNTPミックス 200μM 10×サーモポル緩衝液 10μl プライマー それぞれ300nM DNA鋳型 50ng DNAポリメラーゼ 2単位 適当な増幅反応条件は、当業者によって容易に決定することができる。この場 合、以下の条件を用いた。GHPO 386およびGHPO 789の場合、Taq DNAポリメラー ゼ(Appligene)を含む反応において、変性段階は95℃で30秒間行い、その後50 ℃で1分間アニーリング段階を行い、72℃で2分30秒間、伸長段階を行った。25 サイクル行った。GHPO 896に関しては、Taq DNAポリメラーゼを含む反応におい て、変性段階を97℃で30秒間行い、その後50℃で1分間アニーリング段階を行い 、72℃で2分30秒間、伸長段階を行った。25サイクル行った。クローンGHPO 151 6ではTaq DNAポリメラーゼの代わりにVent DNAポリメラーゼを用い、アニーリン グ温度が55℃であったことを除いては、GHPO 1516に関してはGHPO 896と同じ反 応条件を用いた。GHPO 1360およびGHPO 750に関しては、サーマラーゼDNAポリメ ラーゼを用いた。変性段階は95℃で30秒間行い、その後アニーリング段階を55℃ で1分間行い、伸長段階を72℃で2分間行った。30サイクル行った。GHPO 711に 関しては、Vent DNAポリメラーゼを用いた。変性段階は94℃で30秒間行い、その 後アニーリング段階を50℃で30秒間行い、伸長段階を72℃で1分間行った。25サ イクル行 った。 3.C.形質転換と形質転換体の選抜 単一のPCR産物をこのようにして増幅し、20μlの反応液容量にして、37℃で2 時間、BamHI、およびXhoIもしくはNotIで同時に切断した。制限酵素消化した産 物を、同様に切断され、ウシ小腸山来アルカリホスファターゼ(CIP)処理によっ て、ライゲーション前にあらかじめ脱リン酸化しておいたpET28a(Novagen社製 )に連結させる。このようにして構築された遺伝子融合物は、ベクターがコード している複数のヒスチジン残基が融合蛋白質のN末端に存在するため、産生され た融合蛋白質を一段階でアフィニティー精製することが可能である。 ライゲーション反応(20μl)を14℃で一晩行い、その後、これを用いて、100 μlのフレッシュな大腸菌XL1-blueコンピテント細胞(ノバジェン社(Novagen) 製)を形質転換する。細胞を氷上で2時間インキュベートした後、42℃で30秒間 ヒートショックを加え、90秒間氷上にもどして置く。次に、このサンプルを、選 択剤を含まないLB培地1mlに加え、37℃で2時間増殖させる。この細胞を、カナマ イシン(50mg/ml)を含むLBアガープレート上に10倍および適切な希釈倍率で展 開し、37℃で一晩培養する。翌日、コロニーを50個つつき取り、2次プレート上 に移して、37℃で一晩培養する。 5個のコロニーをつつき取り、カナマイシン(100mg/ml)含有LB培地3mlに入れ て、37℃で一晩培養した。プラスミドDNAをキアゲンのミニプレップを用いて抽 出し、アガロースゲル電気泳動により定量する。 遺伝子特異的なプライマーを用いて、上記に示されている条件の下でPCRを行 い、形質転換体DNAが求めるインサートを持つことを確認する。PCRの結果が陽性 の時は、大腸菌XL-1blue細胞から抽出したプラスミドDNAサンプル5つのうちの ひとつ(500ng)を使用して、大腸菌BL21(λDE3)コンピテント細胞(ノバジェ ン社(Novagen)製;以前述べた通り)を形質転換する。形質転換体(10個)を 、カナマイシン(50μg/ml)を含む選択用のLBアガープレート上に展開し、50% グリセロールを含むLBに縣濁して研究用ストックとして保存する。 3.D.組換え蛋白質の精製 3.C.に述べた方法で調製した凍結グリセロールストック1mlを用いて、250ml のエーレンマイヤーフラスコ(Erlenmeyer flask)に入った、カナマイシン(25 mg/ml)入りのLB培地50mlに植菌する。フラスコを37℃で2時間培養するか、また は600nmでの吸光度(OD600)が0.4〜1.0に到達するまで培養する。培養液は、フ ラスコを4℃に一晩置いて、増殖を停止させる。翌日、10mlの一晩培養液を用い て、最初のOD600値が約0.02〜0.04になるようにカナマイシン(25μg/ml)入り のLB培地240mlに植菌する。各ORFについて、フラスコ4本に植菌する。 細胞はOD600値が1.0になるまで増殖させ(37℃でおよそ2時間)、遠心して1ml のサンプルを回収し、漏出発現(leaky expression)を検出するために、SDS-PA GEにて解析する。残りの培養液は1mMのIPTGで誘導をかけ、37℃でさらに2時間増 殖させる。 最終的なOD600値を測定し、4℃で15分間、5,000×gで遠心分離して、細胞を 回収する。上清を捨て、ペレットを50mMトリス塩酸(Tris-HCl(pH8.0))、2mM E DTAに縣濁する。1リットルの培養液に対し、250mlの緩衝液を用い、細胞を12,00 0xgで20分間遠心して回収する。上清を捨て、ペレットを−45℃に保存する。 3.E.蛋白質の精製 3.D.で得られたペレットを解凍し、95mlの50mMトリス塩酸(Tris-HCl(pH8.0) )に再縣濁する。ペファブロック(Pefabloc)とリゾチームを、終濃度がそれそ れ100μM、100μg/mlになるように加える。この混合液を5℃で30分間マグネチッ クスターラーで撹拌してホモジナイズする。DNAの完全消化を確実に行なうため に、10mM塩化マグネシウム(MgCl2)の存在下でベンゾナーゼ(Benzonase)(メ ルク社(Merck)製)を終濃度1U/mlで加える。この縣濁液を、1サイクルあたり 2分間の条件で3サイクル、それぞれ最大出力にて超音波破砕する(ブランソンソ ニファイアー(Branson Sonifier)450を使用)。ホモジナイズしたものは、19, 000xgで15分間遠心し、上清とペレットの両方をSDS-PAGEで解析し、下記でさら に記載されているように、可溶性画分あるいは不溶性画分における標的蛋白質の 細胞内局在を調べる。 3.E.1.可溶性画分 標的蛋白質が、可溶性の形で(つまり3.E.で得られた上清に)生産される場合 、終濃度が50mMトリス塩酸(pH8.0)、0.5M塩化ナトリウム(NaCl)、10m Mイミダゾール(緩衝液A)になるように、上清に塩化ナトリウムとイミダゾール を加える。この混合液を0.45μmの膜に通して濾過し、あらかじめ製造者が椎奨 するところに従って、ニッケルイオンを荷電したIMACカラム(ファルマシアHiTr apキレートセファロース(Pharmacia HiTrap chelating Sepharose);1ml)に かける。その後、50カラム分の容量の緩衝液Aでカラムを洗浄してから、標的の 組換え蛋白質を5mlの緩衝液B(50mMトリス塩酸(pH8.0)、0.5M塩化ナトリウム (NaCl)、500mMイミダゾール)で溶出する。 各分画の280nmにおける吸光度を測定して、溶出のプロフィールをモニターす る。蛋白質のピークに相当する分画を一つにまとめて、0.5Mアルギニンを含むPB Sに対して透析し、0.22μmの膜に通して濾過し、−45℃に保存する。 3.E.2.不溶性画分 標的蛋白質が、不溶性の画分(つまり3.E.で得られたペレット)で発現してい る場合、精製は変性条件下で行う。塩化ナトリウム(NaCl)、イミダゾール、お よび尿素を、終濃度が50mMトリス塩酸(pH8.0)、0.5M塩化ナトリウム(NaCl) 、10mMイミダゾール、6M尿素(緩衝液C)になるように、縣濁したペレットに加 える。完全に可溶化した後、混合液を0.45μmの膜に通して濾過し、IMACカラム にかける。 IMACカラムでの精製過程は、すべての緩衝液に6M尿素が加えられる点と、蛋白 質をのせた後カラムを洗浄するのに、50カラム分の代わりに、10カラム分の緩衝 液Cを使用する点を除けば、3.E.1.に記載したところと同じである。 緩衝液D(500mMイミダゾールを含む緩衝液C)でIMACカラムから溶出した蛋白 質画分を一つにまとめる。この溶液にアルギニンを終濃度が0.5Mになるように加 え、その混合液を0.5Mアルギニン、および様々な濃度の尿素(4M、3M、2M、1M、 および0.5M)を含むPBSに対して、段階的に尿素の濃度を下げながら透析する。 最終的な透析液を0.22μmの膜に通して濾過し、−45℃に保存する。 または、上記の精製過程がそれほどには効果的でない場合、以下のようにして 、他の二つの方法を用いることが可能である。最初の代替法は、弱い変性剤であ るN-オクチルグルコシド(N-octyl glucoside(NOG))を使用することを含む。簡 潔に述べると、3.E.で得られたペレットを、5mMイミダゾール、500mM塩化ナ トリウム、20mMトリス塩酸(Tris-HCl(pH7.9))の中で、15,000psiの圧力で微小 流動化(microfluidize)することによりホモジナイズし、4,000〜5,000xgで遠 心して清澄にする。このペレットを回収し、体積あたりの重量で1〜2%のNOGを含 む50mMリン酸ナトリウム(NaPO4(pH7.5))に縣濁してホモジナイズする。NOG可 溶性の不純物を遠心により除く。前述の抽出段階を繰り返し、ペレットをもう一 度抽出する。このペレットを8M尿素、50mMトリス塩酸(pH8.0)に溶解する。尿 素で可溶化された蛋白質を等量の2Mアルギニン、50mMトリス塩酸(pH8.0)で希 釈し、1Mアルギニンに対して24〜48時間透析して、尿素を除く。最終的な透析液 を0.22μmの膜に通して濾過し、−45℃に保存する。 2つ目の代替法は、グアニジン塩酸のような強力な変性剤を使用することを含 む。簡潔に述べると、3.E.で得られたペレットを5mMイミダゾール、500mM塩化ナ トリウム、20mMトリス塩酸(pH7.9)溶液中で、15,000psiの圧力で微小流動化( microfluidize)することによりホモジナイズし、4,000〜5,000xgで遠心して清 澄にする。このペレットを回収し、6Mグアニジン塩酸に縣濁し、ニッケルイオン (Ni++)で荷電したIMACカラムに通す。結合した抗原を8M尿素(pH8.5)で溶出 する。ベータ-メルカプトエタノールを終濃度が1mMになるように、溶出した蛋白 質に加え、その後、溶出蛋白質を、0.1M酢酸で平衡化したセファデックス(Seph adex)G-25カラムに通す。カラムから溶出した蛋白質を、4倍容の50mMリン酸緩 衝液(pH7.0)にゆっくりと加える。蛋白質は溶液中に残る。 3.F.精製蛋白質の防御活性の評価 精製した天然の蛋白質の防御活性を調べるために、防御作用試験を上記のよう に実施した。この試験はまた、組換え型蛋白質の防御効率を調べるためにも用い ることができる。または、以下の試験を用いることができる。 10匹のOF1マウス(IFFA Credo)から成るグループを、生理的緩衝液に溶かし た1μgのコレラ毒素(Berna)と混ぜた25μgの精製組換え蛋白質で直腸から免疫 する。マウスは、0、7、14、および21日目に免疫する。最終免疫の14日後に、液 体培地で増殖させたH.ピロリ菌株ORV2001(1.A.記載したようにして、細胞をア ガープレート上で増やして、回収後、ブルセラ用培地(Brucella broth)に再縣 濁してから、37℃で一晩フラスコ培養する)をマウスに抗原投与する。投与の14 日 後に、マウスを殺して、その胃を取り出す。胃内におけるウレアーゼ活性の測定 、および培養によって、H.ピロリ菌の量を判定する。 3.G.単一の抗原に特異的なポリクローナル抗体の生産 3.G.1.過免疫性のウサギ抗血清 3.E.1.または3.E.2.で得られるような精製した融合ポリペプチド100μgを、全 量およそ2mlで、フロインドの完全アジュバントの存在下で、ニュージーランド ウサギの皮下および筋肉内に注射する。最初の注射から7および14日後に、フロ インドの不完全アジュバントを使用する以外は初期投与量に等しい量で、追加免 疫投与を行なう。最終注射の15日後に、動物の血清を回収し、補体を除き、0.45 μmの膜に通して濾過する。 3.G.2.マウスの過免疫性腹水液 3.E.1.または3.E.2.で得られるような精製した融合ポリペブチド10〜50μgを 、約200μlの量で、フロインドの完全アジュバントの存在下、10匹のマウスに皮 下注射した。最初の注射から7および14日後に、フロインドの不完全アジュバン トを使用する以外は初期投与量に等しい量で、追加免疫投与を行なう。最初の注 射から21および28目後に、50μgの抗原のみをマウスの腹腔内に投与する。21日 目には、肉腫180/TG細胞CM26684もマウスの腹腔内に投与する(Lennetteら、ウ イルス、リケッチア、およびクラミジア感染の診断法(Diagnostic Procedures for Viral,Rickettsial,and Chlamydial Infections)、第5版、ワシントンD C、アメリカ公衆衛生協会(American Public Health Association)、1979)。腹 水液を最終注射の10〜13日後に回収する。 実施例4:ヒスチジンタグを持たない転写融合物を産生させる方法 本発明のポリペプチドをヒスチジンタグを欠いた転写融合物としてコードする DNAを増幅し、クローニングする方法を以下に記載する。それぞれのクローンに 対し、それらをコードするポリヌクレオチドの配列をもとに、2つのPCRプライ マーを設計する(配列番号:1〜21(奇数番号)、配列番号:65、および配列番 号:67)。これらのプライマーを用いると、例えば、ORV2001およびATCC寄託番 号43579としてアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC,Rockville,Ma ryland)寄託されているH.ピロリ菌株を含む、任意のヘリコバクター・ピロリ菌 株から 、また、他のヘリコバクター菌種からも、本発明のポリペプチドをコードするDN Aを増幅することが可能である。 N末端プライマーは、標的遺伝子のリボゾーム結合部位、ATG開始部位、(ある 場合は)シグナル配列、および切断部位を含むように設計されている。N末端プ ライマーは、5'クランプ(clamp)と、その後引き続き行われるクローニングが 容易になるように、BamHI(GGATCC)部位などの制限酵素認識部位を含むことが 可能である。同様に、C末端プライマーは、その後のクローニングに使用可能な 、XhoI(CTCGAG)部位などの制限酵素認識部位、およびTAA終止コドンを含むこ とが可能である。使用できるプライマーを上記に列挙している。 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の増幅は、上記実施例3に記載の条 件下でVent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)またはTaqDNAポリメラー ゼ(Appligene)を用いて行うことができる。または、製造者によって提供され る指示にしたがい、サーマラーゼDNAポリメラーゼ(Thermalase DNA Polymerase )またはPwo DNAポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)を用いて行うことも可能 である。 それぞれのクローンについて単一のPCR産物を増幅して、BamHI-XhoI部位で切 断されたpET 24にクローニングし、ヒスチジンタグ無しで蛋白質の発現を可能に する転写融合物を構築した。発現された産物は、1Mアルギニンで透析することに より再生させることが可能な変性蛋白質として精製することが可能である。 pET 24にクローニングすることにより、遺伝子はベクター由来のT7プロモータ ーから転写されるが、その転写は、遺伝子に元来あるリボゾーム結合部位へのRN A特異的DNAポリメラーゼ(RNA-specific DNA polymerase)の結合に依存し、そ れによってな読み枠(ORF)全長の発現が可能になる。増幅反応、制限酵素処理 、およびクローニングのプロトコールは、翻訳融合物の構築について前記したよ うにおこなう。 実施例5:免疫アフィニティーによる本発明のポリペプチドの精製 5.A.特異的イムノグロブリンG(IgG)の精製 セクション3.G.で調製したような免疫血清を、100mMトリス塩酸(pH8.0)で平 衡化したプロテインAセファロースファーストフロー(protein A Sepharose F ast Flow)カラム(ファルマシア(Pharmacia)社製)にかける。カラムに、10カ ラム分の容積の100mMトリス塩酸および10カラム分の10mMトリス塩酸(pH8.0)を 通して、レジンを洗浄する。IgG抗体を0.1Mグリシン緩衝液(pH3.0)で溶出し、 それぞれ0.25mlの1Mトリス塩酸(pH8.0)を加えて、5mlの分画として回収する。 溶出液の吸光度を、280nmで測定し、イムノグロブリンG(IgG)抗体を含む分画 をひとまとめにし、50mMトリス塩酸(pH8.0)に対して透析し、必要に応じて、 −70℃で凍結保存する。 5.B.カラムの調製 ファルマシア社製(17-0430-01)の臭化シアン活性化(CNBr-activated)セフ ァロース(Sepharose)4Bゲルを適当量(1グラムの乾燥ゲルはおよそ3.5mlの水 和ゲルを提供する;ゲルの許容量は、ゲル1mlあたり5〜10mgのIgGを結合する) 、1mM塩酸緩衝液に縣濁し、漏斗を用いて少量の1mM塩酸緩衝液を加えて洗浄する 。緩衝液の全体積は、ゲル1グラムあたり200mlである。 精製したIgG抗体を、50容量分の500mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)に対 して、20±5℃で4時間透析する。その後、この抗体を終濃度3mg/mlになるように 500mMのリン酸緩衝液(pH7.5)で希釈する。 IgG抗体を、5±3℃でゲルと一晩混合する。このゲルを、クロマトグラフィー カラムにつめて、2カラム分の容量の500mMリン酸緩衝液(pH7.5)、および1カラ ム分の容量の500mM塩化ナトリウム(pH7.5)を含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液 で洗浄する。次に、ゲルをチューブに移し、室温で100mMのエタノールアミン(pH 7.5)と4時間混合し、2カラム分の容量のPBSで2回洗浄する。そして、ゲルは、 1万分の1量のメルチオレートを含むPBS(1/10,000PBS/merthiolate)で保存す る。ゲルに結合したIgG抗体の量は、IgG溶液と直接の溶出液、および洗浄液の、 280nmにおける吸光度を測定することにより測定する。 5.C.抗原の吸着と溶出 例えば、3.E.1で得られた上消または3.E.2で得られた可溶化ペレットなど、50 mMトリス塩酸(pH8.0)、2mM EDTAに溶けた抗原溶液を、遠心して0.45μmの膜 で濾過した後、1時間あたりおよそ10mlの流速で、50mMトリス塩酸(pH8.0)、2 mM EDTAで平衡化したカラムにのせる。そして、このカラムを20倍量の50 mMトリス塩酸(pH8.0)、2mM EDTAで洗浄する。または、5±3℃で一晩混合する ことにより吸着させることが可能である。 吸着させたゲルを、2〜6倍量の10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)で洗浄 し、抗原を100mMのグリシン緩衝液(pH2.5)で溶出する。溶出液を3mlの画分と して回収し、それぞれに150μlの1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)を加える 。各画分について280nmの吸光度を測定する;抗体を含む画分をひとつにまとめ 、−20℃で保存する。 実施例6:GHPO 1360ポリペプチドはH.ピロリ感染症に対する診断血清学的ツー ルとして有用である H.ピロリ蛋白質に対する患者の血清の反応性をイムノブロット技法によって 分析した。簡単に説明すると、H.ピロリ株ORV2001の総溶解物について12.5%ゲ ル上でSDS-PAGE電気泳動(バイオラドプロティーンII(BioRad protean II)シス テム)を行った。イムノブロットアッセイのために蛋白質をニトロセルロース紙 に電気的に移した。ブロッキングを行った後、ニトロセルロース紙を患者の血清 (ブロッキング緩衝液中で500倍希釈)と共に室温で1時間インキュベートして 、洗浄して、さらにペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgGと共にインキュベート した。適当な基質と共にインキュベートすると陽性バンドが現れた。結果から、 H.ピロリ陽性潰瘍患者の血清は、50〜60kDaおよび約30〜35kDaの分子量を有す る蛋白質と特異的に反応することが示された。これらの蛋白質の性質を同定する ために、患者血清の反応性を同様の分子量を有する精製蛋白質:ウレアーゼ(67 kDaおよび30kDa)、カタラーゼ(54kDa)、熱ショック蛋白質B(60kDa)、およ び実施例5において記述のように発現および精製したGHPO 1360ポリペプチド(3 2kDa)に対するイムノブロットアッセイによって分析した。全ての患者の血清は GHPO 1360ポリペプチドに対して強い反応性を示したが、他の精製蛋白質に対す る反応性はかなり多様であった。これらの結果は、GHPO 1360ポリペプチドがH. ピロリ感染症の診断において用いられる有用な抗原であることを示している。 その他の態様は以下の請求の範囲に含まれる。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION   76kDa , 32 kDa, and 50 kDa Helicobacter polypeptides And corresponding polynucleotide molecules   The present invention relates to Helicobacter sensation in mammals such as humans. Helicobacter pylori, which can be used in a method for preventing or treating infections. Relates and corresponding polynucleotide molecules.                                Background of the Invention   Helicobacter colonize the gastrointestinal tract of mammals, It is a spiral gram-negative bacterium. Some species colonize the stomach, most Famous ones are H. pylori, H. pylori. H. Heilmanii, H .; H H. felis, and H. felis. It is a H. mustelae bacterium. H. Pylori Bacteria are the most commonly associated species for human infections, but H. e. Hailmanni and H . Felis bacteria have also been isolated from humans, albeit less frequently than H. pylori. Destination In developed countries, more than 50% of the adult population is infected with Helicobacter, and developing countries and And some Pacific Rim countries are almost 100% infected, making them the most It is one of the infectious diseases that are going on.   Helicobacter is used in human stomachs with histological signs of gastritis and peptic ulcers. It is generally recovered from an examination. In fact, H. Helicobacter pylori causes the chronic stomach In that inflammation is a risk factor for developing peptic ulcer disease and gastric cancer. It is now recognized as an important human pathogen. Therefore, Helicobacter Developing safe and effective vaccines to prevent and treat infections is critical Desirable.   Many Helicobacter antigens have been characterized or isolated . Among these are ureas, which consist of two structural subunits of about 30 and 67 kDa. Aase (Hu et al., Infect. Immun. 58: 992, 1990; Dunn et al., J. Biol. Chem. 265: 9464, 1990; Evans et al., Microbial Pathogenesis 10:15, 1991; Labigne et al., J. . Bact., 173: 1920, 1991); 87 kDa vacuolating cytotoxin (VacA) (Cover et al., J. . Biol. Chem. 267: 10570, 1992; Phadnis et al., Infect. Immun. 62: 1557, 1994 WO 93/18150); a 128 kDa immunodominant antigen (Ca gA, also called TagA; WO 93/18150; US Pat. No. 5,403,924) The 13 and 58 kDa heat shock proteins HspA and HspB (Suerbaum et al., Mol. Microb. iol. 14: 959, 1994; WO 93/18150); 54 kDa catalase (Hazel l et al. Gen. Micobiol. 137: 57, 1991); a 15 kDa histidine-rich protein (H pn) (Gilbert et al., Infect. Immun. 63: 2682, 1995); 20 kDa membrane-associated lipoprotein. Quality (Kostrcynska et al., J. Bact. 176: 5938, 1994); a 30 kDa outer membrane protein (Bolin J. et al. Clin. Microbiol. 33: 381, 1995); lactoferrin receptor (FR 2,724,9) 36); and molecular weights named HopA, HopB, HopC, HopD, and HopE Porins that are 48-67 kDa (Exner et al., Infect. Im. mun. 63: 1567, 1995; Doig et al. Bact. 177: 5447, 1995). this Some of these proteins have been proposed as potential vaccine antigens . In particular, urease appears to be a vaccine candidate (WO 94/9823). WO 95/22987; WO 95/3824; Mitchetti et al. (M ichetti), Gastroenterology 107: 1002, 1994). Nevertheless, Waku It appears that tin may eventually require some antigens.                                Summary of the Invention   The present invention provides, for example, the prevention and treatment of Helicobacter infection, Can be used in diagnostics, GHPO 386, GHPO 789, GHPO 1516, GHPO 1197, GHPO 1180, GHPO 896, GHPO 711, GHPO 190, GHPO 185, GHPO 1417, and A 76 kDa Helicobacter polypeptide called GHPO1360, also called GHPO1360 A family of 32 kDa polypeptides, as well as a 50 kDa polypeptide called GHPO 750. A polynucleotide molecule that encodes a nucleic acid is provided. The polypeptide includes a sequence Nos. 2 to 22 (even number), polypeptides having amino acid sequences shown in 66 and 68 included. One skilled in the art will appreciate the addition, deletion or deletion of non-essential amino acids, as described in more detail below. Encode variants and derivatives of these polypeptides, which may be due to substitution It will be understood that polynucleotide molecules are also included in the present invention.   In addition to the polynucleotide molecules described above, the present invention also includes the corresponding polypeptides ( That is, the polypeptide encoded by the polynucleotide molecule of the present invention, or Or fragments thereof), and a single antigen specific for specifically binding to these polypeptides Target antibodies.   The invention has many applications, including expression cassette vectors and polynucleic acids of the invention. Includes cells transformed or transfected with leotide. Therefore, the present invention Comprises (i) a polynucleotide of the invention in a recombinant host system, as well as Produce expression cassettes, vectors, and transformed or transfected cells (Ii) containing the polynucleotide of the present invention in combination with a diluent or carrier. , Poxviruses, SalHlonella typhimurium and virus Live vaccine vectors (such as the Vibrio cholerae vector) Vaccine vectors such as for example prevent or treat Helicobacter infections. And related pharmaceutical compositions and related therapeutics. Therapeutic and / or prophylactic methods; (iii) the polynucleotide molecule alone, or A delivery vehicle, polypeptide, or mixture of polypeptides, or Polynucleotide molecules formulated with monoantigen-specific antibodies and related drugs And / or prophylactic methods, including the administration of a pharmaceutical composition; Including the use of oligonucleotide molecules, single antigen-specific antibodies, or polypeptides. A method for detecting the presence or absence of Helicobacter in a biological sample; and (v) The polypeptides of the present invention can be purified by antibody-based affinity chromatography. A method of purification.                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 shows GHPO386 (sequence) together with the consensus sequence of the 76 kDa protein family. No. 2), GHPO 789 (SEQ ID NO: 4), and GHPO 1516 (SEQ ID NO: 6). This is the arrangement of the Shiitake amino acid sequence.   FIG. 2 shows the GHPO 1197 (sequence) together with the consensus sequence of the 76 kDa protein family. No. 8), GHPO 1180 (SEQ ID NO: 10), GHPO 896 (SEQ ID NO: 12), GHPO 71 1 (SEQ ID NO: 14), GHPO 190 (SEQ ID NO: 16), GHPO 185 (SEQ ID NO: 18), G HPO 1417 (SEQ ID NO: 20) and GHPO 1414 (SEQ ID NO: 22) Column arrangement.Detailed description   GHPO 386, GHPO 789, GHPO 1516, GHPO 1197, GHPO 1180, GHPO 896, GHPO 71 1, a new full length called GHPO 190, GHPO 185, GHPO 1417, and GHPO 1414 A membrane-associated 76 kDa polypeptide, a 32 kDa polypeptide called GHPO 1360, and G An open readout encoding a family of 50 kDa polypeptides called HPO750 Framing frame (ORF) Has been identified in the H. pylori genome. 76kDa point The amino acid sequence of the peptide is shown in FIGS. 76kDa, 32kDa, and 50kDa Polypeptides can be used in vaccines to prevent or treat Helicobacter infections, for example. It can be used in seed methods. For example, GHPO 750, GHPO 1360, GHPO 190 And GHPO 1516 have been shown to be protective antigens. "Protective antigen" means An antigen that can reduce the level of infection after challenge compared to a sex control. To taste. Complete protection against infection is also included in the present invention, but is not required .   The polypeptides of the invention (excluding GHPO750, see below) are in their mature form (i.e., Or as a polypeptide transported through the class II or class III secretory pathway ) Or during excretion / secretion by cleavage at the mature N-terminus Can be produced as a precursor containing a signal peptide that can be removed Secreted polypeptide. (The cleavage site is the signal peptide adjacent to the mature form. At the C-terminus of the drug). Cleavage site of the polynucleotide of the present invention, and The first amino acid of a more mature polypeptide was deduced by estimation.   According to a first aspect of the invention, Helicobacter GHPO 386, GHPO 789, GHPO 151 6, GHPO 1197, GHPO 1180, GHPO 896, GHPO 711, GHPO 190, GHPO 185, GHPO 14 17, a single coding for the precursor and mature forms of GHPO 1414, GHPO 1360 and GHPO 750 An isolated polynucleotide is provided.   The isolated polynucleotide of the invention encodes the following (i) or (ii):   (I) a group of which the Helicobacter amino acid sequence consists of the following amino acid sequences: Helicobacter amyloid of a polypeptide associated with the Helicobacter membrane A polypeptide having an amino acid sequence homologous to a noic acid sequence:         Any one of amino acid positions -19 to 5, preferably position -19 or 1 Starting at and ending at amino acid position 689, SEQ ID NO: 2 (GHPO 386);         Amino acid at any one of positions -20 to 5, preferably at position -20 or 1 Starting at and ending at amino acid position 713, SEQ ID NO: 4 (GHPO 789);         Amino acid at any one of positions -20 to 5, preferably at position -20 or 1 Starting at and ending at amino acid position 725, SEQ ID NO: 6 (GHPO 1516);         Amino acid at any one of positions -20 to 5, preferably at position -20 or 1 Beginning at and ending at amino acid position 691, SEQ ID NO: 8 (GHPO 1197);         Amino acid at any one of positions -20 to 5, preferably at position -20 or 1 Starting at and ending at amino acid position 652, SEQ ID NO: 10 (GHPO 1180);         Any one of amino acids -18 to 5, preferably -18 or 1 Starting at and ending at amino acid position 673, SEQ ID NO: 12 (GHPO 896);         Any one of amino acid positions -21 to 5, preferably position -21 or 1 Starting at and ending at amino acid position 619, SEQ ID NO: 14 (GHPO 711);         Any one of amino acid positions -17 to 5, preferably position -17 or 1 Beginning at and ending at amino acid position 635, SEQ ID NO: 16 (GHPO 190);         Any one of amino acid positions -19 to 5, preferably position -19 or 1 Starting at and ending at amino acid position 626, SEQ ID NO: 18 (GHPO 185);         Amino acid at any one of positions -16 to 5, preferably at position -16 or 1 Starting at and ending at amino acid position 467, SEQ ID NO: 20 (GHPO 1417);         Any one of amino acids -18 to 5, preferably -18 or 1 Starting at and ending at amino acid position 673, SEQ ID NO: 22 (GHPO 1414);         Amino acid at any one of positions -20 to 5, preferably at position -20 or 1 Starting at and ending at amino acid position 279, SEQ ID NO: 66 (GHPO 1360); and         SEQ ID NO: 68 starting at amino acid position 1 and ending at amino acid position 399 (GHPO 750); or   (Ii) derivatives of the polypeptide.   The term "isolated polynucleotide" is used to deviate from its naturally occurring environment. Defined polynucleotide. For example, in the genome of live bacteria or in genes DNA molecules that naturally occur as part of a bank have not been isolated, but are Separated from the rest of the bacterial genome as a result of a cloning event (amplification) The same molecule that is being "isolated". Typically, an isolated DNA molecule is a native gene. DNA regions adjacent to the 5 'or 3' end in the nom (eg, coding region ) No. Such an isolated polynucleotide can be part of a vector or composition. Such a vector or composition is not part of its natural environment Therefore, it can be said that it was isolated.   The polynucleotide of the present invention may be RNA or DNA (eg, cDNA, genomic DNAN). Or synthetic DNA), or RNA or DNA modification or combination. You. Polynucleotides may be double-stranded or single-stranded, and may be single-stranded. In some cases, it may be the coding (sense) strand, but the non-coding (antisense) strand. There may be. Sequences encoding the polypeptides of the present invention include SEQ ID NOs: 2-22. (Even), 66 and 68, (a) SEQ ID NOs: 1-21 (odd), 65 and And (b) a ribonucleotide sequence derived from the transcription of (a); or (c) SEQ ID NOs: 1-21 (odd) as a result of duplication or degeneracy of the genetic code , 65 and 67, the same polypeptide as the polynucleotide molecule having the sequence shown in any of It can be a different coding sequence, which encodes the peptide. Polypep of the present invention Pide is described, for example, in H. et al. Ferris (H. felis); Mustera (H. mustelae); Hail Mani (H. Heilmanni), or H. H. pylori (H. pylori) It may be a polypeptide that is excreted or excreted.   "Polypeptide" or "protein" refers to length, or post-translational modifications (e.g., (Glycosylated or phosphorylated) with or without any chain You. Both terms are used interchangeably in the present invention.   "Homologous amino acid sequence" refers to a position that does not disrupt the specific antigenicity of the polypeptide. Due to one or more non-conservative amino acid substitutions, deletions or additions present in the sequence No .: amino acid sequence or sequence shown in any of 2 to 22 (even number), 66 and 68 Nos. 1 to 21 (odd), 65 and 67 Means an amino acid sequence different from the amino acid sequence to be encoded. Preferably, the Such a sequence comprises the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2-22 (even), 66 and 68. At least 75%, more preferably at least 80%, and most preferably the acid sequence Are at least 90% identical.   The homologous amino acid sequence is any of SEQ ID NOs: 2 to 22 (even number), 66 and 68 And amino acid sequences identical to or substantially identical to the amino acid sequences shown in Table 1. "Substantially same An "amino acid sequence that is one" is at least 90%, preferably at least 90%, At least 95%, more preferably at least 97%, and most preferably less Are 99% identical, and if any, are referred to by many conservative amino acid substitutions. It means an array different from the reference array.   Conservative amino acid substitutions typically involve substitutions within the same class of amino acids. This These classes include, for example, asparagine, glutamine, serine, threonine, And amino acids having uncharged polar side chains such as tyrosine; lysine, arginine And amino acids having a basic side chain such as histidine; aspartic acid and Amino acids having an acidic side chain such as glutamic acid and glycine, alani Valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methioni Amino acids with non-polar side chains, such as amino acids, tryptophan, and cysteine Is included.   Homology can be determined using sequence analysis software (eg, University of Wisconsin Biotechno). Sequence analysis software package from the Gene Computer Group Cage, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705) Can be. Maximum homology (ie, identity) between similar amino acid sequences So that For this reason, it is necessary to artificially introduce gaps in the sequence. May be. Degree of homology (ie, identity) if optimal placement is set Records all positions where the amino acids in both sequences are identical compared to the total number of positions Is established by   Homologous polynucleotide sequences are similarly defined. Preferably, a homologous arrangement The columns are as small as the coding sequence of any of SEQ ID NOs: 1-21 (odd), 65 and 67. At least 45%, more preferably at least 60%, and most preferably at least 85% % Identical sequences.   Has a sequence homologous to one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 22 (even number), 66 and 68 Polypeptides have the sequences shown in SEQ ID NOs: 2-22 (even), 66 and 68 Variants or other non-naturally occurring variants that are similar in antigenicity to a different polypeptide As well as naturally occurring allelic variants.   As is known in the art, allelic variants alter the biological function of a polypeptide. Characterized by having one or more substitutions, deletions or additions of amino acids not to be converted Another form of a polypeptide. "Biological function" means that even if the function Or polypeptides in naturally occurring cells, even if not required for survival Means the function. For example, the biological function of porin is The compound is allowed to flow into the cells. Biological functions differ from antigen functions. Polypep A tide can have one or more biological functions.   Allelic variants are very common in nature. For example, bacterial species such as H. H. pylori is usually expressed as a diverse strain that differs from each other by minor allelic changes. Is done. In fact, polypeptides that exhibit the same biological function in different strains These strains can have amino acid sequences that are not identical. Such a pair Changes in progeny can be equally reflected at the polynucleotide level.   Using allelic variants of a polypeptide antigen can be performed, for example, by using Helicobacter Supported by (Helicobacter) urease antigen studies. Helicova Although the amino acid sequence of lectin urease varies widely between species, This can be attributed to the use of urease molecules as immunogens, since protection occurs. It shows that it is very resistant to the change of amino acids. Single species of H. Pillow Even in different strains, there are changes in the amino acid sequence.   For example, H. H. pylori and H. UreA and UreB subunits of ferris urease The amino acid sequences of 5% and 11. 8% different (Feroro (Ferroro), Molecular Microbiology 9 (2): 323-333, 1993); Pylori Urease is H. It has been shown to protect mice from ferris infection (mi (Michetti, Gastroenterology 107: 1002, 1994). In addition, The individual structural subunits of rease, UreA and UreB, have different amino acid sequences. Columns, but all are shown to be protective antigens against Helicobacter infections (Michetti et al., Supra). Similarly, Cuenca et al. Gastroenterology 110: 1770, 1996). Ferret infected with Mustera To H. Upon therapeutic immunization with H. pylori urease, Good for the cure of Mustera infection It was shown to be effective. Further, for example, recombinant UreA + Ur expressed from pORV142 eB apoenzyme (H. UreA and UreB sequences from H. pylori strain CPM630; Lee et al. J. I nfect. Dis. 172: 161, 1995); recombinant UreA + UreB antigen expressed from pORV214. Poenzyme (H. H. pylori strain CPM630 is modified by one and two amino acid changes, respectively. UreA and UreB sequences; Lee et al., Supra, 1995); UreA-glutathio -S-transferase fusion protein (H. UreA sequence from H. pylori ATCC 43504; Thomas, Thomas, Acta Gastro-Enterologica Belgica 56:54, 1993); H . UreA + UreB holoenzyme purified from H. pylori strain NCTC11637 (Marchetti et al. rchetti), Science 267: 1655, 1995); UreA-MBP fusion protein (H. H. pylori strain 85P UreA from Ferroro et al., Infection and Immunity 62: 4981, 19 94); UreB-MBP fusion protein (H. UreB from H. pylori strain 85P; Feroro et al. (Ferror o), supra); UreA-MBP fusion protein (H. UreA from Ferris strain ATCC 49179; (Ferroro, supra); UreB-MBP fusion protein (H. Ferris strain ATCC 49179 UreB from Ferroro et al., Supra) and including 220-569 amino acids. UreB 37 kDa fragment (Dore-Davin et al., “The UreB 37 kDa fragment is Is enough to provide protection against Helicobacter felis infections. '' ), Including some urease variants, have been reported to be effective vaccine antigens. Have been. Finally, Thomas et al. Rough sonication of H. pylori Oral immunization of mice with the Subsequent challenges with Ferris Showed that mice were protected.   Polynucleotides, such as DNA molecules encoding allelic variants, are Polymerase chain reaction (PCR) amplification of genomic bacterial DNA extracted by the method Can be easily obtained. It is located upstream and below the 5 'and 3' ends of the coding region. Use synthetic oligonucleotide primers that are paired with the current sequence including. Suitable primers are provided in SEQ ID NOs: 1-21 (odd), 65 and 67. It can be designed based on the provided nucleotide sequence information. Typically The primer contains 10 to 40 nucleotides, preferably 15 to 25 nucleotides. Ma At a ratio sufficient to ensure that effective hybridization occurs, e.g., C and G nucleotide content of at least 40%, preferably 50% of total nucleotide content It is advantageous to select primers containing C and G nucleotides containing Can be. One of skill in the art will be able to isolate polynucleotides of the invention from different Helicobacter strains. Separation Primers that can be used to perform the design can be easily designed.   By way of example, a non-processing GHPO 386 containing a signal peptide (SEQ ID NO: 2) Of a polynucleotide molecule encoding a polypeptide having an amino acid sequence of Primers useful for primer sequencing are shown in SEQ ID NO: 23 (paired at the 5 'end) and SEQ ID NO: : 25 (paired at the 3 'end). Mature GHPO386 lacking the signal peptide (sequence No. 2 encodes a polypeptide having an amino acid sequence of amino acids 1 to 689) A primer useful for cloning the DNA molecule to be cloned is SEQ ID NO: 24 (paired at the 5 'end). And SEQ ID NO: 25 (3 ', paired at the end). GHPO 1360 (SEQ ID NO: 66 ) For cloning of a DNA molecule encoding a polypeptide having the amino acid sequence of Useful primers include SEQ ID NO: 78 (paired at the 5 ′ end) and SEQ ID NO: 79 (3 ′ end) At the end). The use of these primers encodes GHPO 1360 Amplification of all genes can be performed. SEQ ID NO: 82 (coding sequence corresponding to mature protein) Having the sequence shown in SEQ ID NO: 79 (paired at the 3 'end) and SEQ ID NO: 79 (paired at the 3' end). It is possible to amplify part of the gene encoding mature GHPO 1360 using a primer. it can. Experimental conditions for performing PCR can be easily determined by those skilled in the art. A description of the implementation of PCR is provided in Examples 3 and 4.   Thus, the first aspect of the present invention includes the following (i) and (ii): (I) Helicobacter using any of the following primers, e.g. Pylori Amplification and / or cloning from the kenom using the polymerase chain reaction An isolated polynucleotide molecule (eg, a DNA molecule) that can be:         A 5 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 23, and And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 25 (non-process Singh GHPO 386);         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 26, and And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 28 (non-process Sing GHPO 789);         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 29, and And a 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 31 (non-process Sing GHPO 1516);         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 32, and And a 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 34 (non-process Singh GHPO 1197);         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 35, and And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 37 (non-process Singh GHPO 1180);         A 5 'oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 38; And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 40 (non-process Singh GHPO 896);         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 41, and And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 43 (non-process Singh GHPO 711);         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 44, and And a 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 46 (non-process Sing GHPO 190);         A 5 'oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 47; And a 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 49 (non-process Sing GHPO 185);         A 5 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 50; And a 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 52 (non-process Singh GHPO 1417);         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 53, and And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 55 (non-process Singh GHPO 1414);         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 78, 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 79 (non-process Singh GHPO 1360); or         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 80, and And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 81 (GHPO750 );and (Ii) Helicobacter using any of the following primers, for example, H. Pylori Amplification and / or cloning from the genome using the polymerase chain reaction An isolated polynucleotide molecule (eg, a DNA molecule) that can be:         A 5 'oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 24; And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 25 (mature GHPO  386);         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 27, and And a 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 28 (mature GHPO  789);         A 5 'oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 30; And a 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 31 (mature GHPO  1516);         A 5 'oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 33; And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 34 (mature GHPO  1197);         A 5 'oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 36; And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 37 (mature GHPO  1180);         A 5 'oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 39; And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 40 (mature GHPO  896);         A 5 'oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 42; And a 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 43 (mature GHPO  711);         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 45, and And a 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 46 (mature GHPO  190);         A 5 'oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 48; And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 49 (mature GHPO  185);         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 51, and And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 52 (mature GHPO  1417);         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 54, and And a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 55 (mature GHPO  1414); or         A 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence of SEQ ID NO: 82, and And a 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 79 (mature GHPO  1360).   The 5 'end of the above primer has a restriction end typically comprising 4-6 nucleotides. It is convenient to include a nuclease recognition site. For example, the sequence 5'-GGATCC-3 '(BamHI ) Or 5'-CTCGAG-3 '(XhoI). Restriction site was amplified When the DNA has been digested, if necessary, a suitable Skilled in the art so that it can be cloned into a digested vector. Selected. In addition, a 5 'clamp (eg, GCC) is It can be included 5 'of the nuclease recognition site.   Useful homologs that do not occur in nature are capable of altering and / or deleting amino acid sequences. Using known methods to identify regions of the antigen that may be tolerated can do. For example, comparing conserved sequences by comparing the sequences of antigens from different species Can be specified.   The polypeptide derivative encoded by the polynucleotide of the present invention may be, for example, For example, fragments, polypeptides having large internal deletions derived from the full-length polypeptide , And fusion proteins. The polypeptide fragment of the present invention comprises SEQ ID NOs: 2 to 22 ( Even numbers), sequences homologous to any of SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 68 From the polypeptide that has the substantial antigenicity of the parent polypeptide (specific antigen G) can be induced to such an extent as to maintain the same. Polypeptide derivatives may also be specific A large internal deletion that removes a substantial portion of the parent polypeptide while retaining antigenicity Can be built by loss. Generally, polypeptide derivatives maintain antigenicity. Requires at least 12 amino acids in length to carry. They are few Both amino acids are convenient, preferably at least 50, more preferably Is at least 75 amino acids, and most preferably at least 10 amino acids in length 0 length.   Useful polypeptide derivatives, such as polypeptide fragments, are Amino acids were used to identify potential antigen-exposed sites. It can be designed using analysis using a sequence computer (Hyu Hughs, Infect. Immun. 60 (9): 3497, 1992). For example, DNA star (DNA Star) using the laser gene program, the polypeptide of the present invention , An antigen index, and an intensity index plot can be obtained. Also this Program to determine the homology of polypeptides with known protein motifs. Information can be obtained. Those skilled in the art will recognize peptide fragments used as vaccine antigens. Information from such plots can easily be used in the selection of You. For example, selecting a fragment spanned area of a plot with a relatively high antigen index it can. Similarly, fragment span areas where both antigen index and intensity plots are relatively high Can also be selected. Fragments containing conserved sequences, especially hydrophilic conserved sequences, are also selected. You can choose.   Polypeptide fragments and polypeptides with large internal deletions are otherwise Is blocked in the parent polypeptide and induces a protective T cell-dependent immune response Can be used to detect epitopes that may be important for Deletions can also remove immunodominant hypervariable regions in the strain.   All that is required to induce an immune response to a protein is that the protein is small (eg, (8-10 amino acids) Because of the immunogenic region, fragments and modifications of proteinaceous immunogens The use of a variant as a vaccine is an accepted method in the field of immunology. this Has been performed on many vaccines against pathogens other than Helicobacter. For example, mouse mammary tumor virus (a peptide containing 11 amino acids; Dion et al. (Dion ), Virology 179: 474-477, 1990), Semliki Forest Fever Virus (16 amino acids) A peptide comprising; Snyders et al. Gen. Virol. 72: 557-565 , 1991) and canine parvovirus (two overlapping each containing 15 amino acids) Paired peptides; Langeveld et al., Vaccine 12 (15): 1473-1480. A short synthetic peptide corresponding to the surface-exposed antigen of the pathogen, such as It has been shown to be an effective vaccine antigen against each pathogen.   Polypeptide fragments and polypeptides encoding large internal deletion polypeptides Renucleotides can be synthesized by standard methods (eg, Ausubel et al., “Molecular Biology”). Current Protocols in Molecular Biology, ”John Wiley &  Sons Inc. , 1994), eg, PCR, including reverse transcription PCR, Treated DNA molecules with a restriction enzyme or the method of Kunkel et al. (Kunkel, Proc. Natl. Aca d. Sci. USA 82: 448, 1985; biological material available from Stratagene). Can be built.   Polypeptide derivatives can also be linked to other polypeptides, for example, at the N-terminus or C-terminus. Fusion polypeptides comprising a fused polypeptide or polypeptide derivative of the invention (Hereinafter referred to as peptide tail). Such a product Can be easily obtained by gene fusion, that is, translation of a hybrid gene. Can be. Vectors expressing the fusion polypeptide are commercially available, and include New England Biola with peptide tail maltose binding protein Boz pMal-c2 or pMal-p2 systems, Pharmacia glutathione-S-to Transferferase system or His-Tag system sold by Novagen System. These and other expression systems can be used for polypeptides of the invention and for induction. It provides a convenient means for further purification of the body.   Another specific example of a fusion polypeptide included in the present invention includes Polypeptides having adjuvant activity, such as cholera toxin or E. coli heat-labile poison Polypeptide or polypeptide of the present invention fused to any of the subunits B Tide derivatives are included. There are several possible ways to produce such a fusion protein. Can be used. First, the polypeptide of the present invention is used for adjuvant activity. Can be fused to the N-terminus or preferably the C-terminus of a polypeptide having . Second, the polypeptide fragment of the present invention is a polypeptide having adjuvant activity. Can be fused within the amino acid sequence. Spacer sequences are also desirable Ba Can be included.   As described above, the polynucleotides of the invention may be in the precursor or mature form, Encodes a polypeptide. They may also be matured polypeptides of the invention. Encodes a hybrid precursor containing a heterologous signal peptide capable of becoming can do. “Heterologous signal peptide” refers to the polypeptide of the present invention. Means a signal peptide not found in the natural precursor.   Polynucleotides of the invention preferably have a sequence under stringent conditions. No. 1 to 21 (odd number), SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 67 Hybridizes with the polynucleotide having the sequence. Hybridization method Are, for example, Ausubel et al. (Supra); Silaviy et al. Experiments with Gene Fusions ", Cold Spring Harbor Laboratory  Press, Cold Spring Harbor, New York, 1980); and Davis et al. s, “Gene Manipulation Manual: Applied Bacterial Genetics (A Manual for Genetic Engine) ering: Advanced Baterial Genetics), Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss, Cold Spring Harbor, New York, 1980). Hybrida Important parameters that can be considered in order to optimize the optimization conditions are Reflected in the formula below, which allows two complementary DNAs to exceed this temperature And the melting point (Tm), which is the temperature at which they are separated from each other, becomes easier (casey et al. sey), Nucl. Acids. Res. 4: 1539, 1977): Tm = 81. 5 + 0. 5 x (% G + C) + 1. 6 log (cation concentration)-0. 6x (% formamide). Appropriate stringency provisions Under the conditions, the hybridization temperature (Th) is about 20-40 ° C, 20-25 ° C, Alternatively, it is preferably 30 to 40 ° C. lower than the calculated Tm. Those skilled in the art will recognize that Optimal temperature and salt concentration can be easily determined empirically in the preliminary experiments used You will understand that. For example, the incubation before hybridization For both the incubation and the incubation during hybridization, i) within 4-16 hours at 42 ° C. in 6 × CCS containing 50% formamide, or (ii) 6 × SSC aqueous solution (1M NaCl, 0. 1M sodium citrate (pH 7. 0)) at 65 ° C in 4 ~ Stringent conditions of less than 16 hours can be obtained. 30-600 Nuku For polynucleotides containing leotide, using the above formula, then (600 / salt Base pair Can be corrected by subtracting the indicated polynucleotide size). You. Stringent conditions are defined by Th being 5-10 [deg.] C below Tm.   Hybridization conditions with oligonucleotides shorter than 20-30 bases are: Do not follow the above rules exactly. In such a case, the formula for calculating Tm is as follows: : Tm = 4 × (G + C) +2 (A + T). For example, with a 50% G + C 18 nucleotide fragment About 54 ° C is a suitable Tm.   The polynucleotide of the present invention containing RNA, DNAN or a modification or combination thereof The child can be applied in various ways. For example, a polynucleotide molecule may comprise the set (i) In a process for producing the encoded polypeptide in a recombinant host system, (Ii) Methods and compositions for prevention and / or treatment of Helicobacter infections The construction of vaccine vectors, such as poxviruses, further used in products In construction, (iii) a vaccine formulated as such or with a vehicle And (iv) overexpressing the polynucleotide of the present invention. Or an attenuated helicoba capable of expressing it in a non-toxic variant In the construction of strains of bacterium.   According to the second aspect of the present invention, therefore, (i) the elements required for expression ( (Eg, a promoter). (Ii) an expression vector comprising the expression cassette of the present invention; Transformation or transfection with the expression cassette and / or vector of the invention Prokaryotic or eukaryotic cells, (iv) expressing the polynucleotide molecule of the present invention. Enables the encoded polypeptide or polypeptide derivative from cell culture Under conditions that allow for recovery, the expression cassette and / or vector of the invention Culturing prokaryotic or eukaryotic cells transformed or transfected with The polypeptide encoded by the polynucleotide of the present invention. Or a process for producing a polypeptide derivative.   Recombinant expression systems can be selected from prokaryotic and eukaryotic hosts. Eukaryotic host For example, yeast cells (eg, Saccharomyces cerevisiae) cerevisiae) or Pichia Pastoris), mammalian cells ( For example, COSI, NIH 3T3, or JEG3 cells), arthropod cells (Spodoptera f Lugi Perda (Spodoptera frugiperda (SF9) cells), and plant cells. Good Preferably, a prokaryotic host such as E. coli is used. Bacteria and eukaryotic cells are known to those of skill in the art. Many different sources of knowledge, such as the American Type Culture Collection (AT CC; Rockville, MD).   The choice of the expression cassette will depend on the desired characteristics with respect to the expressed polypeptide. Depends on the host system chosen. For example, a specific lipid type or other It may be useful to produce a repeptide. Typically, an expression cassette Include a constitutive or inducible promoter that is functional in the host system of choice -; Ribosome binding site; initiation codon (ATG); signal peptide if necessary For example, a region encoding a lipidation signal peptide; A stop codon; and optionally a 3 'terminal region (translation and / or Photo-terminator). The signal peptide coding region is a polynucleic acid of the present invention. Adjacent to Leotide and in a suitable reading frame. Signal peptide The coding region is homologous or non-homogeneous to the polynucleotide molecule encoding the mature polypeptide. May be homologous, specific for the secretory organ of the host used for expression, and Is also good. The polynucleotide molecule of the present invention alone or together with a signal peptide The open reading frame constructed is transcribed and translated in the host system Is under the control of a promoter so that Promoters and signals Peptide coding regions are widely known and available to those of skill in the art and include For example, it can be induced by arabinose (promoter araB) and Salmonella typhi, which is functional in such Gram-negative bacteria, murium) (and derivatives thereof) (US Pat. No. 5,028,530; Kag) (Cagnon), Protein Engineering 4 (7): 843, 1991); T7 Polymerer A bacteriophage T7 RNA vector that is functional in many E. coli strains that express Promoter of remerase gene (US Pat. No. 4,952,496); OspA lipidase Signal peptide; and RlpB lipidation signal peptide (Takase et al.) (Takase), J.M. Bact. 169: 5692, 1987).   An expression cassette is typically part of an expression vector, which is The ability to replicate. Expression vector (eg, plasmid or virus) Vectors) are described, for example, in Pouwels et al., "Cloning Vectors. : Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supplement, 1 987) and can be purchased from various sources. Methods for transforming or transfecting host cells with expression vectors are described in the art. Depending on the host system chosen, as is well known in the art and as described by Ausubel et al. .   When expressed, a recombinant polypeptide (or polypeptide derivative) of the invention Is produced and remains in intracellular organs and is secreted / excreted into the extracellular medium or pericellular space Or is incorporated into the cell membrane. Then centrifuge the cell extract or cell culture Can be recovered in substantially pure form from the supernatant. Typical In addition, recombinant polypeptides can be purified by antibody-based affinity purification or small affinity purification. Other methods known to those skilled in the art, such as gene fusion with the Therefore, it can be purified. Antibody-based affinity purification methods also It can be used to purify the polypeptide of the present invention extracted from Bacter strain. Book Antibodies effective for immunoaffinity purification of the polypeptide of the present invention are as follows: Method.   The polynucleotides of the present invention may be used as viral or bacterial hosts as gene delivery vehicles. Either with the main (live vaccine vector) or in free form, e.g. Can be used in DNA vaccination methods in which genes are inserted into it can. The therapeutic or prophylactic utility of the polynucleotide of the present invention is evaluated as follows. can do.   That is, in the third aspect of the present invention, (i) regulation of an element required for expression Such as a poxvirus, comprising an underlying polynucleotide molecule of the invention. (Ii) the vaccine vector of the present invention together with a diluent or carrier. (Iii) therapeutic or prophylactic use of the vaccine vector of the present invention. A pharmaceutical composition comprising an effective amount; (iv) an immune response, eg, against Helicobacter. To elicit a protective or therapeutic immune response, the vaccine vector of the invention may be immunized. Helicobacter in a mammal, comprising administering an epidemiologically effective amount to the mammal. For inducing an immune response against (eg, humans; or in the case of other animals, eg, Home for treating or preventing Helicobacter pylori infection in cats or birds Animal disease (V) can be used for therapeutic applications); and (v) Helicobacter (eg, comprising administering a prophylactic or therapeutic amount of a Kuching vector) For example, H. H. pylori, H .; Ferris, H. Mustera, or H. Hailmanni) infectious disease Is provided. Furthermore, the third aspect of the present invention The present invention relates to the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of Lycobacter infection. Including the use of light vaccine vectors.   The vaccine vector of the present invention is a urease apoenzyme or a subunit thereof, At least one other helicobacter, such as a fragment, homolog, variant, or derivative One or several polypeptides or derivatives of the present invention together with the Can be manifested. In addition, this is the interleukin-2 that enhances the immune response. Express cytokines such as (IL-2) or interleukin-12 (IL-12) be able to. Thus, vaccine vectors can be used, for example, in mammalian cells. Urease subunits A, B, also under the control of elements required for expression Or another polynucleotide molecule or cytokine that encodes both. Can be included.   Alternatively, the compositions of the invention each comprise a polypeptide or derivative of the invention. Can contain several vaccine vectors capable of expressing conductors . The composition also comprises urease apoenzyme, subunits, fragments, homologs, mutations thereof. A further helicobacter antigen, such as a body or derivative, or IL-2 or IL Include a vaccine vector that can express cytokines such as -12 Can be.   In a vaccination method for treating or preventing a mammalian infectious disease, the vaccine of the present invention is used. Chin vectors can be obtained by conventional routes used in the field of vaccines, such as mucosa (eg, Ocular, nasal, oral, stomach, lung, brain, rectal, vaginal or ureteral mucosa) Administered by the oral (eg, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, or intraperitoneal) route be able to. The preferred route depends on the choice of vaccine vector. Single dose administration Alternatively, it can be performed by repeated administration at intervals. The appropriate dose depends on the vaccine vector. The nature of the mammal itself, the route of administration, and the condition of the mammal to be vaccinated (eg, (Eg, mammal's weight, age, and general health) Depends on various parameters.   Live vaccine vectors that can be used in the present invention include bacterial vectors, For example, Shigella, Shimella, Salmonella, Vibrio cholera (Vi brio Cholerae), Lactobacillus, and Calmette-Guerin (BCG) ), And bacterial vectors such as Streptococcus, and adenovirus And viral vectors such as poxviruses. Adenovirus Examples of DNA vectors and vectors capable of expressing the polynucleotide molecules of the present invention. A method for constructing a virus vector is described in U.S. Patent No. 4,920,209. You. Poxvirus vectors that can be used in the present invention include, for example, They are described in U.S. Patent No. 4,722,848 and U.S. Patent No. 5,364,773, respectively. Vaccinia and canarypox viruses (eg, vaccinia virus vectors See Tartaglia et al., Virology 188: 217, 1992. And Tyler et al. (Ta) for a description of canarypox virus vectors. yler), Vaccine 13: 539, 1995). Polynuc of the present invention Poxvirus vectors capable of expressing leotide are described in Kiniy et al. (( Kieny), Nature 312: 163, 1984). Is inserted into the viral genome under conditions suitable for expression in mammalian cells. Thus, it can be obtained by homologous recombination. Generally, viral vector vaccines Dose of about 1 x 10 for therapeutic or prophylactic use.Four~ About 1 × 1011Individual Well, about 1 × 107Individual to about 1 × 10TenIf convenient, or about 1 × 107Individual to about 1 × 109It is preferably plaque forming units / kg. Preferably a viral vector For parenteral administration, for example, three doses are administered at 4-week intervals. Those skilled in the art will appreciate that Avoid adding chemical adjuvants to compositions containing vector It is desirable to minimize the immune response to the viral vector itself Seems to recognize.   Non-toxic vibrio cholera alterations can be used in live oral vaccines Variants are described in Mekalanos et al. (Mekalanos, Nature 306: 551, 1983) and U.S. Pat. No. 4,882,278 (two ctxA alleles so that no functional cholera toxin is produced International Publication No. 92/1), wherein a substantial amount of the respective coding sequence is deleted. 13 No. 54 (a strain in which the irgA locus has been inactivated due to a mutation; xA mutation); and WO 94/1533 (function Deletion mutants lacking the specific ctxA and attRS1 DNA sequences). these As described in WO 94/19482 to express a heterologous antigen. Can be genetically manipulated. Encoded by the polynucleotide molecule of the present invention. Capable of expressing a polypeptide or polypeptide derivative An effective vaccine dose of a rera strain is, for example, about 1 × 10Five~ About 1 × 109Pieces, preferably about 1 × 106Individual to about 1 × 108Live bacteria at the appropriate dose for the chosen route of administration. Can be included. Preferred routes of administration include all mucosal routes, but are most preferred. Preferably, these vectors are administered intranasally or orally.   Attenuated Salmonella typhimurium (Salmon) engineered for recombinant expression of heterologous antigens ella typhimurium) and its use as an oral vaccine are described by Nakayama et al. kayama, Bio / Technology 6: 693, 1988) and WO 92/11361. Has been described. Preferred routes of administration for these vectors include all mucosal routes It is. Most preferably, the vector is administered intranasally or orally.   Other bacterial vectors useful as vaccine vectors include High, EMBO 11: 1991, 1992) and Sisemore et al. (Sizemore, Science 270: 299, 1995; Shigella flexneri); Medaglini et al., Proc. tl. Acad. Sci. USA 92: 6868, 1995; Streptococcus gordonii (Strepto) coccus gordonii)); Flynn (Flynn, Cell. Mol. Biol. 40 (Supplementary I): 31, 11). 94), and International Publication Nos .: 88/6626, 90/0594, 91/13157, 92/1796 No. 92/21376 (Bacille Calmette Guerin) It is described. For bacterial vectors, the polynucleotides of the present invention may comprise a bacterial genome. Or can be inserted into a plasmid or integrated into a plasmid, for example. It can stay in a detached state.   Adjuvants can also be added to compositions containing the bacterial vector vaccine. Many adjuvants that can be used are known to those skilled in the art. For example, preferred New adjuvants can be selected from the list shown below.   In a fourth aspect of the present invention, (i) the polynuclear of the present invention together with a diluent or carrier. K Important compositions comprising leotide; (ii) therapeutic or therapeutic use of the polynucleotides of the invention. A pharmaceutical composition comprising a prophylactically effective amount; (iii) an immune response, eg, Helicobacter Immunology of polynucleotides of the invention to elicit a protective immune response against Administering to a mammal an effective amount of Helicobacter against Helicobacter. And (iv) in an individual in need of such treatment. By administering a prophylactically or therapeutically effective amount of a polynucleotide of the present invention. Helicobacter (eg, H. pylori, H. ferris, H. mustella, or H. pylori). Also provided is a method for preventing and / or treating Helicobacter pylori infection. Sa Furthermore, the fourth aspect of the present invention relates to the prevention and / or treatment of Helicobacter infection. The use of the polynucleotide of the present invention in the preparation of a medicament for the treatment of Of the present invention The fourth aspect preferably replicates in a mammalian cell, eg, a mammalian cell. In a plasmid that cannot be integrated into the mammalian genome Using polynucleotide molecules placed under expression conditions.   The polynucleotides (eg, DNA or RNA molecules) of the invention can be used as vaccines It can be administered like a mammal. When using the DNA molecule of the present invention , It cannot replicate in mammalian cells and integrates into the mammalian genome It can be in the form of an unrestricted plasmid. Typically, DNA molecules are expressed in mammalian cells. It is placed under the control of a currently suitable promoter. Promoters are everywhere and Can function tissue-specifically. Examples of non-tissue specific promoters include: Cytomegalovirus (CMV) promoter (US Pat. No. 4,168,062) and Rous sarcoma virus promoter (Norton et al., Molec. Cell. Biol. . 5: 281, 1985). Desmin promoter (Li et al. (Li), Gene 78: 2 43, 1989; Li et al. Biol. Chem. 266: 6562, 1991; Li et al. Bio l. Chem. 268: 10403, 1993) is tissue specific and induces expression in muscle cells. More generally, useful promoters and vectors are described, for example, in WO 94/94. No./21797, and Hartikka et al. (Hartikka, Human Gene Therapy 7: 1205, 1 996).   For DNA / RNA vaccination, the polynucleotides of the present invention It can encode a precursor or mature form of the peptide. This is the precursor type ー When applied, the precursor sequences can be homologous or heterologous. In the latter case, tissue-type Eukaryotic leader sequence, such as the leader sequence of the sminogen activator (tpA) Can be used.   A composition of the invention may comprise one or several polynucleotides of the invention. Can be. This can also be such as urease subunit A, B or both. At least one additional polynucleotide encoding another Helicobacter antigen Otides, or fragments, derivatives, variants, or analogs thereof can be included . Such as interleukin-2 (IL-2) or interleukin-12 (IL-12) Polynucleotides encoding cytokines may also enhance the immune response It can be added to the composition. These additional polynucleotides are used for expression. Is placed under appropriate adjustments. The DNA molecule of the present invention and / or an additional DNA molecule When included in the same composition, they are conveniently transported on the same plasmid.   For preparation of the therapeutic polynucleotide of the present invention, conventional methods can be used. An example For example, polynucleotides include anionic liposomes, cationic liposomes, microparticles E.g., fine gold particles, sedimentation agents such as calcium phosphate, or other trans It can be used as it is without a transport medium such as a transfection enhancer. Wear. In this case, the polypeptide, with or without a carrier, sterile physiological saline, or Is easily diluted in a physiologically acceptable solution such as sterile buffered saline be able to. If a carrier is present, the carrier is preferably isotonic, hypotonic, or weak. Hypotonic, for example, as obtained by a sucrose solution containing 20% sucrose. ON strength is relatively low.   Alternatively, the polynucleotide may be associated with an agent that aids cellular uptake. it can. That is, (i) alter cell permeability like bupivacaine Chemical substances (for example, see WO 94/16737), (ii) liposome Inclusion bodies in the soma, or (iii) cationic lipids or silica, gold or tan It can be related to gustene microparticles.   Anions and neutral liposomes are well known in the art (eg, liposomes). For a detailed description of how to make liposomes, see Liposome: A Practical Approach (Lipo somes: A Practical Approach), see RPC New Ed, IRL Press, 1990) Useful for transporting a wide range of products, including polynucleotides.   Cationic lipids can also be used for gene delivery. Such lipids are examples For example, DOTMA (N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethyl chloride Lipofection (registered trademark), DOTAP (1,2-bi (Oleyloxy) -3- (trimethylammonio) propane), DDAB (dimethyl bromide) Rudioctadecyl ammonium), DOGS (dioctadecylamide loguricil spec.) Luminin), and cholesterol derivatives. These cationic lipids Are described in EP 187,702, WO 90/11092, U.S. Pat. No. 83,185, WO 91/15501, WO 95/26356, and US It can be found in Patent No. 5,527,928. Cationic lipids for gene transfer are D OPE (Dioleyl phosphatidylethanolamine; International Publication No. 90/1109) It is preferable to use by binding to a neutral lipid such as No. 2). Cation liposomes Other transfection-enhancing compounds can be added to Wear. Many of them are described, for example, in WO 93/18759, WO 93/1. 9768, WO 94/25608, and WO 95/2397 Have been. Some of them are useful, for example, to promote DNA transport across the nuclear envelope. Effective spermine derivatives (see, for example, WO 93/18759) and GALA, Includes membrane-permeable compounds such as gramicidin S and cationic bile salts ( See, for example, WO 93/19768).   Gold or tungsten microparticles are also disclosed in WO 91/359, WO 93/17706. And gene transfer as described by Tang et al. (Tang, Nature 356: 152, 1992). Can be used. In this case, U.S. Pat.No. 4,945,050, U.S. Pat. As described in WO 94/24263, and particulate coated polynuclear Injection of nucleotide by intradermal or intraepithelial route using a needleless syringe ("gene gun") Can be fired ("gene gun").   The amount of DNA used for vaccine recipients depends, for example, on the amount of DNA used in the DNA construct. Motor strength, the immunogenicity of the expressed gene product, the condition of the mammal being administered (Eg, weight, age, and general health of the mammal), mode of administration, and formulation Depends on the type of agent. Generally, a therapeutically or prophylactically effective amount of about 1 μg to about 1 mg. , Preferably from about 10 μg to about 800 μg, and more preferably from about 25 μg to about 250 μg, human It can be administered to adults. Dosing may be done once or repeatedly at intervals. Can be done.   The administration route may be any conventional route used in the vaccine field. No. As general guidance, the polynucleotides of the present invention can be used on mucosal surfaces, e.g., Ocular, nasal, lung, oral, brain, rectal, vaginal or ureteral surface mucosa or parenterally By route, for example, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intradermal, intraepidermal, or intramuscular Can be administered. The choice of the route of administration depends, for example, on the formulation selected. Bupi Polynucleotides formulated in connection with bacaine are effective when administered to muscle. is there. Using neutral or anionic liposomes or cationic lipids such as DOTMA Intravenous, intranasal (eg, aerosolized), intramuscular, intradermal, and intravenous It can be conveniently injected by the subcutaneous route. Polynuk in its original form Leotide can be effectively administered by intramuscular, intradermal or subcutaneous routes . Although not absolutely necessary, such compositions should also include an adjuvant Can be. Systemic adjuvant that does not require co-administration to show adjuvant effect Are preferred.   The sequence information provided in the present application allows it to be used in diagnostics Special nucleotide probes and primers can be designed. Follow In a fifth aspect of the present invention, SEQ ID NOs: 1 to 21 (odd), SEQ ID NO: 65, And SEQ ID NO: 67, or the sequence shown in any of the complements thereof Or derived from their sequences due to the degeneracy of the genetic code Nucleotide probes or primers are provided.   The term "probe" as used in the present application, as defined above, SEQ ID NOS: 1-21 (odd), SEQ ID NO: 65, under stringent conditions, and A polynucleotide having a sequence homologous to any of the sequences set forth in SEQ ID NO: 67 Molecules, or SEQ ID NOs: 1-21 (odd), SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 67 DNA that hybridizes to the complementary or antisense sequence of any sequence (Preferably single-stranded) or RNA molecule (or a modification or combination thereof). Generally, the probes comprise SEQ ID NOs: 1-21 (odd), SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: issue: Significantly shorter than the full-length sequence shown in any of 67. For example, they are about 5 to about It can contain 100 nucleotides, and preferably contains about 10 to about 80 nucleotides be able to. In particular, the probes are SEQ ID NOs: 1-21 (odd), SEQ ID NO: 65, And a part of the sequence shown in any of SEQ ID NO: 67, or a sequence complementary to the sequence. Alignments that are at least 75%, preferably at least 85%, more preferably 95% homologous With columns.   Probes include inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, Modified salts such as methylamino-5-deoxyuridine or diamino-2,6-purine Groups can be included. Sugar or phosphate residues can be similarly modified or substituted. it can. For example, a deoxyribose residue may be a polyamide (Nielsen et al.). ), Science 254: 1497, 1991), and the phosphate residue is diphosphorus. Acids, alkyls, aryl phosphonates, and phosphorothioates It can be substituted by a stele group. In addition, 2'-water on ribonucleotides Acid groups can be modified, for example, by adding alkyl groups.   The probes of the present invention can be used as diagnostic tests or as capture or detection probes. Can be. Such capture probes can be directly or indirectly shared on a solid support. It can be fixed by covalent or passive absorption. Detection probe Possible labels, eg radioisotopes; peroxidase and alkaline phospha Enzymes, such as enzymes; hydrolyze chromogenic, fluorescent or luminescent substrates Enzymes that can be chromogenic, fluorescent or luminescent; nucleotide base analogs And a label selected from biotin.   The probe of the present invention is obtained by the dot blot method (Maniatis et al., Child Cloning: Experimental Manual (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1982), Southern blot method (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503). , 1975), Northern blotting (Southern except for using RNA as a target). Blot) or sandwich method (Dunn et al., Cell 12:23, 1977). ) Can be used in a conventional hybridization method. Skill As is known in the art, the latter technique is at least partially different from each other. Otide Including using specific capture and detection probes with sequence .   The primer used in the present invention contains about 10 to 40 nucleotides, and Enzymatic duplication of DNA in the process (eg, PCR), extension process, or reverse transcription. Used to initiate compounding. In diagnostic methods, including PCR, primers You can understand.   For this reason, the present invention also provides (i) the detection and detection of Helicobacter present in biological material. And / or a reagent containing the probe of the present invention for identification; (ii) (a) producing a sample (B) DNA or RNA extracted from material, recovered or derived from material Sample under the stringent conditions of the present invention. Exposed to a probe, e.g., a capture probe, a detection probe, or both. Helicobacter present in biological material, including detecting hybridization (Iii) (a) recovering a sample from biological material Or derived therefrom, (b) extracting DNA therefrom, (c) extracting the extracted DNA , At least one, or preferably two, primers of the invention Amplifies by remerase chain reaction, and (d) produces amplified DNA molecules Detecting and / or identifying Helicobacter present in the biological material, including: It also includes a method for   As described above, the polypeptide produced by expressing the polynucleotide of the present invention Pide can be used as a vaccine antigen. Therefore, the sixth aspect of the present invention Is a substantially purified amino acid sequence encoded by the polynucleotide of the present invention. It relates to polypeptides or polypeptide derivatives.   A "substantially purified polypeptide" is one that has been separated from its naturally occurring environment. Polypeptides and / or many other polypeptides present in the environment during synthesis Is defined as a polypeptide without contamination. The polypeptide of the present invention may comprise a helicopter Can be purified from natural sources such as Bacter strains or recombinant It can be produced using methods.   A polypeptide or polypeptide homologous to that encoded by the polynucleotide of the present invention. Since the peptide derivative has specific antigenicity, SEQ ID NO: 2 to 22 (even number) , Having the amino acid sequence of any of SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 68 A cross-reactivity test using antisera raised against the Can be Briefly, for example, MBP, GST or histidine Expression products of the tag system or synthetic peptides expected to have antigenicity Against a purified control or fusion polypeptide, such as One antigen-specific high titer of anti-bleeding can be created. Has specific antigenicity Homologous polypeptides or derivatives to screen for It can be made by itself or as a fusion polypeptide. In the latter case, If an antiserum to the fusion polypeptide is also made, two different fusion Use a stem. Specific antigenicity was determined by Western blot (described below). Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350, 1979). And ELISA can be detected using a number of methods, including ELISA.   For western blot assays, the product to be screened is purified material Or a whole extract of Escherichia coli, which is described, for example, by Laemmli (Nat ures 227: 680, 1970). sample After transferring to a filter like nitrocellulose membrane, from about 50 times A single antigen-specific high dilution of about 5000-fold, preferably about 100- to about 500-fold React with antisera of titer. The band corresponding to the product is rare in any of the ranges. If the reactivity is shown, the specific antigenicity has been detected.   In an ELISA assay, the product to be screened is Can be used in the form. Purified material is preferred, but can also be used in whole cell extracts. Can be. Briefly, about 100 μl of about 10 μg protein / ml material was added to a 96-well ELIS Dispense into wells of A plate. Plates are treated at 37 ° C for about 2 hours, then Process in the evening. Plates are washed with phosphate buffered saline (PBS) containing 0.05% Tween 20 (P Wash with BS / Tween buffer) and remove wells by 1% to prevent nonspecific antibody binding. With 250 μl of PBS containing bovine serum albumin (BSA). 1 hour at 37 ° C After that, the plate is washed with PBS / Tween buffer. Antisera in PBS containing 0.5% BSA Dilute serially with / Tween buffer and add 100 μl to each well. Plate at 37 ° C 90 Aliquot, wash and evaluate using standard methods. For example, made with rabbits Specific anti If used, add goat anti-rabbit serum conjugated with peroxidase. it can. After treatment at 37 ° C. for 90 minutes, the plate is washed. Add appropriate substrate and react And measure the reaction result by absorbance (absorbance measured by absorptiometer) I do. Under these experimental conditions, at least about 50 times, preferably at least about An O.D. value of 1.0 measured at a 500-fold dilution indicates a positive reaction.   Dot blot assays may not work with whole cell extracts However, purified products are preferred. Briefly, a solution of the product at a concentration of about 100 μg / ml Is serially diluted 2-fold with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5). Add 100 μl of each dilution to 0. Drop onto a filter, such as a 45 μm nitrocellulose membrane, and use a 96-well dot block And set it on the device for data collection (Biorad). Aspirate the system to remove buffer. The wells are washed by adding 50 mM Tris-HCl (H7.5) and the membrane is air-dried. blocking Saturate the membrane with buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.15 M NaCl, 10 g / l skim milk). And react with the antiserum diluted about 50- to about 5,000-fold, preferably about 500-fold . The reaction is detected using standard methods. For example, a specific anti- If used, add goat anti-rabbit serum conjugated with peroxidase. it can. After treatment at 37 ° C. for about 90 minutes, the blot is washed. Add the appropriate substrate to Advance the response and stop. Then, the appearance of the colored spots was visually observed using a colorimeter. The response is measured visually. Under these experimental conditions, at least about 50-fold, preferably If a colored spot of a reaction performed at least about 500 times dilution is detected, Is positive. Therapeutic or therapeutic use of a polypeptide or polypeptide derivative of the invention Prophylactic utility can be evaluated as described below.   According to a seventh aspect of the present invention, there is provided (i) a polypeptide of the present invention together with a diluent or carrier. A composition of a material comprising the peptide, (ii) treating the polypeptide of the invention therapeutically or prophylactically. A pharmaceutical composition comprising an effective amount, (iii) protective immunity against, for example, Helicobacter In order to elicit an immune response, such as a response, an immunological By administering an effective amount to a mammal, the mammal can be immunized against Helicobacter. A method for inducing an epidemic reaction, and (iv) the polypeptide of the present invention for an individual in need of treatment. By administering a prophylactically or therapeutically effective amount of a peptide, a Helicobacter (Eg H.Pylori, H.felis, H.mustelae or H.heilmanii) And And / or a method of treating is provided. Furthermore, this aspect of the invention includes a helicobacter The manufacture of a medicament for preventing and / or treating The use of peptides is also included.   The immunogenic composition of the present invention can be used, for example, for mucosa (eg, eyes, nasal cavity, lung, oral cavity, stomach, Via the surface of the brain tube, rectum, vagina, or ureter or parenterally (eg, subcutaneously, intradermally) Used in the field of vaccines, such as, intramuscular, intravascular, or intraperitoneal) routes Administration can be by any of the usual routes. The route of administration depends on the It is selected by a number of parameters such as adjuvant. For example, for mucous membranes If an adjuvant is used, the nasal or oral route is preferred, If an agent or an aluminum compound is used, the parenteral route is preferred. In the latter case Is most preferably by the subcutaneous or intramuscular route. Also, depending on the nature of the vaccine substance However, the route of administration is limited. For example, a polypeptide of the present invention may comprise CTB or LTB Is best administered to the mucosal surface.   The composition of the invention comprises one or several polypeptides or derivatives of the invention. May be lost. It is also at least another kind of urease apoenzyme Helicobacter antigens or subunits, fragments, and phases derived therefrom It may also include homologues, variants, or derivatives.   To facilitate transport and / or immunoreactivity for use as a composition according to the present invention. In order to enhance the response, the polypeptide or polypeptide derivative is neutralized or neutralized. Of anionic liposomes, microspheres, ISKOMS, or virus-like particles (VLPs) It can be formulated in or with such liposomes. This These compositions can be readily used by those skilled in the art; for example, liposomes: See Roach (Liposomes: A Practical Approach) (supra). Other than liposomes Adjuvants are also known in the art and can be used in the present invention. (For example, see the list given below).   Administration may be performed once or, if necessary, repeatedly at intervals determined by those skilled in the art. It is possible. For example, boost three times weekly or monthly after the first dose Can also be applied. The appropriate dose will depend on the nature of the recipient (eg, Adult or infant), specific vaccine antigens, route and frequency of administration, adjuvant The presence or absence of the component, and the favorable effect (eg, prevention and / or Depends on various parameters, including treatment) and can be easily determined by those skilled in the art. You can do it. Generally, the vaccine antigens of the invention will comprise from about 10 μg to about 500 mg, preferably Preferably, it can be administered to the mucosa in amounts ranging from about 1 mg to about 200 mg. Non For administration by the oral route, usually the dosage is about 1 mg, preferably about 100 μg. Do not exceed.   When used as a vaccine component, the polynucleotides and polypeptides of the invention Can be used continuously as part of a multi-step immunization process is there. For example, mammals may be initially used for vaccines of the invention, such as poxviruses. Vector, for example, parenterally stimulated, then the vaccine vector encodes The polypeptide is boosted twice, eg, via the transmucosal route. Another example Liposome bound to the polypeptide or polypeptide derivative of the present invention First stimulation with a mucosal adjuvant (eg LT) Transmucosally with a clear water-soluble polypeptide or polypeptide derivative. Apply a blast.   The polypeptides and polypeptide derivatives of the present invention can also be used, for example, in blood samples. Can also be used as a diagnostic to detect anti-Helicobacter antibodies present in Noh. Such polypeptides have from about 5 to about 80, preferably from about 10 to about 50 It has an amino acid chain length and can be used without labeling according to the diagnostic method. So A diagnostic method involving such an agent is described below.   Expressing a polynucleotide molecule of the invention to a polypeptide or polypeptide Can be produced and purified using known methods. example For example, fusion of a polypeptide or polypeptide derivative to facilitate purification It can be produced as a fusion protein containing a tail. This fusion product Immunize a small mammal, such as a mouse or rabbit, to obtain this polypeptide or Or to generate antibodies specific to a single antigen against derivatives of the polypeptide or Can be Therefore, the eighth aspect of the present invention relates to a polypeptide or polypeptide of the present invention. The purpose is to provide a single antigen-specific antibody that binds to a derivative of the polypeptide.   The term “single antigen-specific antibody” refers to a single, naturally occurring Helicobacter -Means an antibody capable of reacting with the polypeptide. The antibody of the present invention is polyclonal Or it can be monoclonal. Monoantigen-specific antibodies include, for example, chimeras (and For example, it consists of a variable region derived from mouse and a constant region derived from human, and humanized (for example, For example, human immunoglobulin constant regions and variables derived from animals such as mice Region), and / or a single chain. Polyclonal Antibodies and monoantigen-specific antibodies can also both be, for example, F (ab) '2 or It can also be in the form of an immunoglobulin fragment, such as a piece. Antibodies of the present invention include, for example, Ig Can be of any isotype, such as G or IgA, polyclonal Antibodies may consist of a single isotype or may contain a mixture of isotypes It is possible.   The present invention that can be created for the polypeptide or polypeptide derivative of the present invention Antibodies, for example, by Western blot, dot block Using standard immunological assays such as ELISA or ELISA. (Eg, Coligan et al., Current Protocols in Im munology), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1994) And it is possible. These antibodies are derived from helicobacters present in a sample, such as a biological sample. It can also be used in diagnostic methods for detecting receptor antigens. These antibodies are Further, the affinity for purifying the polypeptide or the derivative of the polypeptide of the present invention can be improved. It can also be used for the chromatographic method. As discussed further below, These antibodies can also be used for prophylactic and therapeutic passive immunization .   Therefore, the ninth aspect of the present invention relates to (i) an antibody, polypeptide or polypeptide of the present invention. For detecting the presence of Helicobacter in biological samples containing peptide derivatives A reagent; and (ii) producing an antibody, polypeptide or polypeptide derivative of the present invention. To form an immune complex upon contact with the sample and into the sample or the organism from which the sample is derived. By detecting the complex as a proof of the presence of Helicobacter, The present invention provides a diagnostic method for detecting Helicobacter present in a sample. Sample components and anti Form an immune complex with the body, polypeptide or derivative of the polypeptide, After removing all unbound material, the complex is detected. For example, for a blood sample Polypeptide assays to detect anti-Helicobacter antibodies present in such samples medicine Can be used, but the antibodies of the invention can be used in assays such as gastric extracts or biopsy samples. To screen for the presence of Helicobacter polypeptide in the sample Can be used for   For use in diagnostics, reagents (eg, antibodies, polypeptides or polypeptides of the invention) may be used. Derivative) can be in the free state or, for example, Can be fixed to a solid support phase, such as the surface of You. Fixation can be performed in a direct or indirect manner. As a direct measure Immobilize the support phase and reagents by passive adsorption (ie, non-covalent bonding) or covalent bonding. Is included. The term "indirect method" refers to an anti-reagent component that reacts with a reagent. First, it means to adhere to the solid support phase. For example, using a polypeptide reagent In some cases, antibodies that bind to this reagent may not be necessary to recognize the antibodies in the biological sample. If it binds to the pitope, it acts as an anti-reagent component. As an indirect method Alternatively, a molecule such as a vitamin may be further attached to the polypeptide reagent, Ligand-receptor system in which the corresponding receptor is immobilized on a solid support phase Can also be used. This concept is based on the famous biotin-streptavidin cis System. Or, for example, chemically or using genetic engineering techniques Add a peptide tail to the reagent, and use this peptide tail for passive adsorption or covalent bonding. By immobilizing the addition product or fusion product. Can be   According to a tenth aspect of the present invention, using the single antigen-specific antibody of the present invention, From the biological sample, including performing affinity chromatography on the biological sample used. A process for purifying a polypeptide or derivative of a polypeptide of the invention is provided.   When using the present invention in a purification process, the antibodies may be polyclonal or single antigen specific. The target may be of the IgG type. Purified IgG can be obtained from antisera by standard methods. (Eg, Coligan et al., Supra). Conventional chromatography Chromatographic carriers can be prepared, for example, according to Harlow et al. (Antibodies: A Laboratory Manual ), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1 988).   In short, preferably a raw material such as H. pylori extract extracted from a buffer solution The biological sample is preferably cloned in a buffer equilibrated with the buffer used to dilute the biological sample. Derivation of the polypeptide or polypeptide of the present invention by dripping onto a chromatography carrier The body (ie, antigen) is adsorbed on the carrier. Genes coupled to the antibodies of the invention Chromatographic supports such as gels or resins are in batch or column form be able to. Unbound components are washed away and a glycine buffer such as guanidine Buffers containing chaotropic agents such as hydrochloric acid, or high salt concentrations (eg 3M M gClTwoThe antigen is eluted with a suitable elution buffer, such as the buffer of (1). Eluted fract The antigen is detected by collecting the solution and measuring the absorbance at 280 nm, for example. Detect whether to do.   The antibodies of the present invention can be used to screen for therapeutic effects as follows. Wear. According to the eleventh aspect of the present invention, (i) the diluent or the carrier of the present invention together with a carrier A composition of a material comprising a single antigen-specific antibody; (ii) treatment of the single antigen-specific antibody of the present invention. A pharmaceutical composition comprising a therapeutically or prophylactically effective amount, and (iii) an individual in need of treatment Administering a single antigen-specific antibody of the present invention in an amount necessary for treatment or prevention. Helicobacter (eg, H.pylori, H.felis, .H.mustelae or H.he ilmanii) Present methods of treating or preventing infection. Further, an eleventh aspect of the present invention Aspects of the production of drugs to treat or prevent Helicobacter infection Also included is the use of clear, single antigen-specific antibodies.   Monoantigen-specific antibodies can be polyclonal or monoclonal, Preferably, it is mainly of the IgA isotype. In passive immunization, this antibody is On the mucosal surface of a mammal, such as the gastric mucosa, for example orally or intragastrically. Is administered in the presence of a bicarbonate buffer according to. Alternatively, need bicarbonate buffer It is also possible to carry out systemic administration without the use. The single antigen-specific antibodies of the present invention As a mixture with a single antigen-specific antibody specific for the Helicobacter polypeptide And can be administered. Those of skill in the art will be able to determine the amount of antibody used and the particular formulation. Can be easily determined. For example, give about 100-1,000 mg of antibody daily for one week Or give 3 equivalents of antibody daily, about 100-1,000 mg, for 2-3 days The formulation, can be useful for many purposes.   Efficacy in treatment or prevention may be determined by standard methods in the art, e.g., Induction of mucosal immune response or prophylactic and And / or measurement of induction of therapeutic immunity, and Lee et al. (Eur. J. Gastroenterology & Hepatology 7: 303, 1995) or Lee et al. (J. Infect. Dis. 172: 161, 1995). Can be evaluated by the following procedure. One skilled in the art will recognize that H.felis in this model Species strains are recognized to be replaced by other Helicovobacter species strains. It is expected to come. For example, polynucleotide molecules and polypeptides derived from H. pylori The efficacy of the peptide is preferably assessed in a mouse model using H. pylori strains Is done. Infection protection measures the extent of Helicobacter infection in gastric tissue, such as urea. To be assessed by the activity of the bacteria, bacterial counts, or gastritis, and to compare with those of the control group. Therefore, it can be determined. When the infection is reduced compared to the control group, Defense is indicated. These evaluation methods are similar to those for the antibody of the present invention. For nucleotides, vaccine vectors, polypeptides, and polypeptide derivatives It can also be done.   For example, antibodies of the invention are described in various concentrations, such as those described by Lee et al. (Supra). As described above, H. pylori can be administered to the gastric mucosa of mice previously infected. That After a suitable time, the bacterial load on the mucous membrane is checked for urease activity. It can be judged by evaluating in comparison with the group. If urease activity decreases, This shows that the antibody is therapeutically effective.   The adjuvant used in any of the previously described vaccine compositions is It is as follows. Adjuvants for parenteral administration include, for example, aluminum hydroxide Aluminum, aluminum phosphate, aluminum hydroxyphosphate Compound. Antigen is precipitated with aluminum compounds by standard methods. Can be adsorbed. Other services such as RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT) Adjuvants can also be used for parenteral administration.   Adjuvants that can be used in the case of mucosal administration include, for example, cholera toxin (CT), E. coli non-thermostable toxin (LT), Clostridium difficile (Clostridium difficile) toxin A, pertussis (pertussis) toxin (PT), and Bacterial toxins, such as combinations thereof, and their subunits, toxois Do , Or variants. For example, purification of the natural cholera toxin subunit CTB Things can be used. Fragments, homologues, derivatives, and any of these toxins And fusions can be used as long as they maintain adjuvant activity. Wear. Preferably, a mutant with reduced toxicity is used. Suitable variants are e.g. international Publication No. 95/17211 (Arg-7-Lys CT mutant), International Publication No. 96/6627 (Arg-19 2-Gly LT mutant), and WO 95/34323 (Arg-9-Lys and Glu-129-G ly PT mutant). Others used in the methods and components of the present invention LT variants of, for example, Ser-63-Lys, Ala-69-Gly, Glu-110-Asp and Glu-112-A sp variants are included. For example, cerebral bacteria, Salmonella minnesota (Salmonella minne sota), Salmonella typhimurium, or Bacterial monophosphate lipid A (MPLA) such as Shigella flexneri , Saponins, and other ingredients such as glycolated polylactose (PLGA) microspheres. Adjuvants can also be used for mucosal administration. Polyphosphazene (poliph osphazene) (WO 95/2415), which is useful for both mucosal and parenteral administration Bunts can also be used.   The polynucleotide, polypeptide, derivative of the polypeptide, or anti- Any of the pharmaceutical compositions of the present invention, including the body, may be produced using standard techniques. can do. This can be, for example, water or, if necessary, e.g. Physiological saline such as PBS containing bicarbonate like .5M sodium bicarbonate Can be formulated with a pharmaceutically acceptable diluent or carrier. Hydrogen carbonate Salts can be effectively added to formulations intended for oral or intragastric administration. Wear. In general, the diluent or carrier will be administered and administered in a standard and standard manner. The choice can be based on pharmaceutical practice. Suitable pharmaceutical carriers and diluents are As well as the pharmaceutical requirements for using them in formulations, this field and the US The standard reference in P / NF is “Remington's Ph.D. armaceutical Sciences) ".   The present invention also provides a gastroduodenal infection, such as a Helicobacter infection, with an antibiotic, Antisecretory agents, bismuth salts, antacids, sucralfate, or combinations thereof Together with the Helicobacter polypeptide of the present invention and a mucosal adjuvant by oral administration. It includes a method of treating by giving. Such vaccine antigens and adjuvants Examples of compounds that can be administered with a drug include the following; Lolides, tetracyclines, β-lactams, aminoglycosides, quinolos , Penicillins, and their derivatives (special compounds that can be used in the present invention). Examples of new antibiotics include, for example, amoxicillin, clarithromycin, Clin, metronidazole, erythromycin, cefuroxime, and erythroma Isin); for example, HTwoReceptor antagonists (eg, cimetidine, lantidine , Famotidine, nizatidine, and loxotidine), proton pump inhibitors (Eg, omeprazole, lansoprazole, and pantoprazole ), Prostaglandin analogs (eg, misoprostil and enprostil) ), And anticholinergics (eg, pirenzepine, telenzepine, carbenoxo) ) And antisecretory agents, including colloidal bismuth Enoate, trisodium bismuth dicitrate, bismuth hyposalicylate, diquat Acid peptides, and bismuth salts including peptosebismol (e.g., Goodwin et al., Helicobacter pylori, Biolo gy and Clinical Practice), CRC Press, Boca Raton, FL, pp 366-395, 1993; Clinician's Desk Reference, 49th edition, Medical Ec onomics Data Production Company, Montvale, New Jersey, 1995). further Such as, for example, bismuth subcitrate combined with ranitidine Compounds in which one or more of the above components are bonded to each other can also be used. The present invention Further, a compound for carrying out these methods, that is, the Helicobacter antigen of the present invention (Or antigens), an adjuvant, and one or more of the above compounds Also included are compounds that include the above in a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.   The amount of the above compound used in the method and composition of the present invention can be easily determined by those skilled in the art. Can be determined. Furthermore, those skilled in the art can easily plan treatment / immunization. Wear. For example, administering a non-vaccine compound until days 1-14, and administering the vaccine antigen + Adjuvant is administered on days 7, 14, 21 and 28.   The methods and pharmaceutical compositions of the invention are useful for treating Helicobacter infections, and And atrophic gastritis and peptic ulcer diseases such as gastric and duodenal ulcers Used to treat or prevent gastroduodenal brain disease associated with these infections, including be able to.   A 76 kDa protein band containing GHPO 386, GHPO 789, and GHPO 1516 (hereinafter " GHPO 1360 and GHPO 750 are Helicobacter ・ Pylori ATCC 43579 (American Type Culture Collection, Rockville , Maryland), using the method described in Example 1 below. Purification by chromatography on the basis of It was shown to be a tin antigen.   1, 5 or 25 μg of purified 76 kDa protein, purified GHPO 1360 or purified GHPO 750 5 μg of heat-labile enterotoxin (LT) of Escherichia coli orally to 10 mice in each group Immunized with Using 25 μg of recombinant urease with 5 μg of LT as a positive control, L A PBS solution of T5 μg was used as a negative control. Immunization was performed at 0, 7, 14 And four times on day 21. On day 33, a blood sample was taken from the mouse and on day 34 The saliva sample was collected. On day 35, all mice received 1 x 107Streptomyces H. compatible mouse. H. pylori was challenged by intragastric administration. 49th In the eyes, additional saliva samples were collected and approximately two weeks after challenge, on days 52-53, mouse Suicide was killed. The stomach is removed from the mouse and the urease activity in intact stomach tissue Helicobacter sensation by measuring sex and by quantitative culture tests The staining was analyzed (Table 1).   Briefly, these studies demonstrate that the purified 76 kDa protein (ie, 1 , 5 and 25 μg) in combination with LT in immunized mouse samples Urease activity in the stomach in mice is generally measured in mice or charen immunized with LT alone. Shown to be generally lower than gastric urease activity in pre-treated mouse samples Was. Gastric urease activity levels generally decrease as the amount of protein administered increases. Slightly, the level of urease activity in the stomach when 25 μg is administered is generally 25 μg of recombinant Approaches the activity level of mouse urease and LT immunized mice.   By quantitative culture analysis, purified 76 kDa protein, purified GHPO 1360, or purified GHPO  Helicobacter levels detected in the stomach of mice immunized with 750 were generally In addition, the dose decreases when the dose increases, but control mice or helicobacters immunized with LT alone Levels lower than those detected in the stomach of untreated mice prior to (Tables 1 and 2). Purified 76 kDa protein, purified GHPO 1360 or purified GHPO 7 50% of mice protected by immunization protected by urease treatment Matched or approached the percentage of mice given (Tables 1 and 2). These conclusions The results indicate that the 76 kDa purified protein, GHPO 1360, and GHPO 750 It shows that it is an effective vaccine antigen used in prevention.   The present invention is further described by the following examples. Example 1 is a helicobacter. -GHPO 1516 (76 kDa), GHPO 1360 (32 kDa), and GHPO 750 (50 k Describes purification of kDa). Example 2 describes genes in the Helicobacter genome, For example, GHPO 386, GHPO 789, GHPO 1516, GHPO 1197, GHPO 1180, GHPO 896, GHP 76 kDa proteins such as O 711, GHPO 190, GHPO 185, GHPO 1417, and GHPO 1414 Encodes a 32 kDa protein (GHPO 1360) and a 50 kDa protein (GHPO 750) Signal sequence identification and signal sequence deficiency Describe the primer design for amplification of offspring. Example 3 is GHPO 386, DNA encoding GHPO 789, GHPO 1516, GHPO 896, GHPO 1360, and GHPO 750 Cloning into a vector providing a histidine tag, and The production and purification of a stidine tag fusion protein is described. Example 4 is a His DNA encoding the polypeptide of the present invention so that it can be produced without a thiidine tag. The cloning method is described. Example 5 shows the recombinant polypeptide of the present invention. Example 6 describes a method for purifying H. Serodiagnosis for H. pylori infection Describes the use of GHPO 1360 polypeptide as a tool. Example 1 GHPO 1516 from Helicobacter pylori (76 kDa), GHPO 1360 (32 kDa), and GHPO 750 (50 kDa) proteins Sequential analysis 1.A. Culture and initial purification steps   H. Using frozen seeds from H. pylori strain ATCC 43579, a biphasic medium (6% fresh sheep) was used. A solid phase consisting of Columbia Gelose containing di-erythrocytes and 20% fetal calf serum Liquid phase consisting of soybean trypto case)TwoSeed into flask. Slight preference After culturing for 24 hours under aerobic conditions, use the liquid phase for biphasic culture without sheep red blood cells. Some 75cm including the groundTwoSeed into flask. After culturing for 24 hours, use the liquid phase Fermentation of soybean tryptocase liquid phase containing 10g / L β-cyclodextrin to 2L Seed the tank. When the OD is 1.5-1.8, the culture is transferred to 10 L Dilute in the fermenter. After 24 hours, the bacteria are centrifuged at 4,000 × g at 4 ° C. for 30 minutes. 10 L of culture solution contains about 20 to 30 g (wet weight) of bacteria.   The pellet obtained using the above method was mixed with PBS (7.650 g NaCl, 0 .724g disodium phosphate and monopotassium phosphate 0.210g per liter (pH 7.2) ) Wash with 500 mL. The bacteria are then centrifuged again under the same conditions.   Pellets (C1) were mixed with 1% N-octyl-D-glucopyranoside (NOG; 30 ml / L; Sigma) Suspension). Incubate the bacterial suspension for 1 hour at room temperature with stirring, Centrifuge at 17,600 × g at 4 ° C. for 30 minutes to collect a pellet (C2).   The supernatant (S2) is dialyzed against PBS at 4 ° C. with stirring overnight. Sediment, 2,6 Collect by centrifugation at 00 × g for 30 minutes at 4 ° C. Discard the supernatant (S2d). Collect (Cs2d) and store at -20 ° C.   Pellets (C2) are mixed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and 100 μM (Buffer A) and resuspend in Ultra Turrax (3821, Janke & Kungel) Homogenize. Lysozyme and EDTA were added at 0.1 mg / ml and 1 mM, respectively. I can.   The homogenate is sonicated 3 times for 2 minutes each at 4 ° C. and 210,000 × g at 4 ° C. for 30 minutes. Ultracentrifuge for minutes. Discard the supernatant (S3) containing cytoplasmic and periplasmic proteins. The pellet is collected, washed with buffer A, and ultracentrifuged at 210,000 × g at 4 ° C. for 30 minutes. You. Discard the supernatant (S4) and store the pellet (C4) at -20 ° C. This pellet (C 4) contains membrane proteins.   Pellets (C4) with 50 mM NaCOThree(PH9.5) and 100 μM Pefabloc (buffer B ). The suspension is ultracentrifuged at 210,000 × g at 4 ° C. for 30 minutes. Discard the supernatant (S5) Wash the pellet (C5) and centrifuge as above. Discard the supernatant (S6) Store pellet (C6) at -20 ° C. 1.B. Purification of protein of membrane fraction C4 by SDS-PAGE for separation   5% polyacrylamide concentrated gel and 10% polyacrylamide separation gel SDS-PAGE using the biphasic gel containing Laemmli according to the method of Laemmli, supra. I do. The membrane fraction C4 was resuspended in buffer A and diluted with an equal volume of 2x sample buffer to 95 Heat at 0 ° C. for 5 minutes. About 19 mg of protein is loaded on a gel (16 × 12 cm; thickness 5 mm). 50 Perform preliminary movement at V for 2 hours, then move at 65V overnight. In Coomassie Blue Staining shows a major band 5 with apparent molecular weights of 87, 76, 54, 50 and 32 kDa. Individuals appear. 50 and 32 kDa bands are missing 47 and 35 kDa bands, respectively Crab seems to be mixed.   Purified 76 kDa protein, 32 kDa protein (GHPO 1360), or 50 kDa protein (GHPO 1360)  The band corresponding to 750) was cut out of the gel and extracted with an extraction buffer (25 mM Tris-HCl (pH 8.8), 8M urea, 10% SDS, 100 μM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), And 10 μM Pefabloc (buffer C)) in 10-20 mL Ultra Turrax Crush by.   Each homogenate was filtered through a Millipore AP20 filter at room temperature and 7 bar. Wash with 5-10 mL of buffer C and filter again. 75% methanol and 75% iso Each filtrate was precipitated by adding 3 times the volume of a 50/50 mixture of propanol, and the precipitate was collected at 240,000 xg. Centrifuge at 0 ° C for 16 hours.   Each pellet was mixed with 1 M NaCl, 0.1% Sarkosyl, 100 μM PMSF, and 10 mM NaPO containing 6 M urea (buffer D)Four(PH 7.0) Resuspend in 2 mL. Solubilized 100 mL of buffer D containing 4 M urea, containing 2 M urea and 0.5% sarkosyl 100 mL of buffer D and 100 mL of buffer D without urea or sarkosyl twice Dialyze to The dialysis is carried out for 1 hour each with stirring at room temperature. Ice bath the last dialysate After incubating for 30 minutes in the medium, centrifuge at 4 ° C. for 10 minutes at low speed. Collect the supernatant And filter through a Millipore filter (0.45 μm) and store at −20 ° C. 1.C. 76 kDa, 32 kDa by immunoaffinity-based chromatography, and Is a 50kDa protein purification         1.C.1. Preparation of antiserum   Purified 76 kDa protein and 32 kDa protein purified by SDS-PAGE for separation (GHPO 1360 ) Or a specific polyclonal antiserum to the 50 kDa protein (GHPO 750). Prepared by hyperimmunizing rabbits as follows. On day 0, 50 μg protein Is mixed with complete Freund's adjuvant to obtain a large number of rabbits. Administer subcutaneously to the site. On days 21 and 42, Freund's incomplete adjuvant Both rabbits are boosted with 25 μg of protein and sacrificed on day 60. Heat at 56 ° C for 30 minutes To remove complement from the serum. Next, Millipore membrane (0.22μ Sterilize the hyperimmune serum by filtration through m).         1.C.2. IgG purification   The hyperimmune serum prepared as described above was equilibrated with 100 mM Tris-HCl (pH 8.0). Load on a Protein A Sepharose Fast Flow column (Pharmacia). column Is 10 times the volume of 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), then 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) Wash with 10 volumes of the column. IgG elutes in 0.1 M glycine buffer (pH 3.0) And collect as 5 mL fractions, and add 0.25 mL of Tris-HCl (pH 8.0) to each You. Measure the absorbance of each fraction at 280 nm, pool the fractions containing IgG, and If so, freeze at -70 ° C.         1.C.3. Column preparation   Appropriate amount of CNBr-activated Sepharose 4B gel (Pharmacia; reference: 17-0430-01) 1 mM NaCl buffer (1 g of dried gel becomes 3.5 mL of hydrated gel; gG 5-10 mg can be retained). Next, using Buchner The gel is washed by adding a small amount of 1 mM hydrochloric acid. 1mM hydrochloric acid used The volume will be 200 mL / g of gel.   Purified IgG was added to 50 volumes of 500 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) at room temperature. Dialyze for hours. The IgG is then diluted to 3 mg / ml with the same buffer. IgG with gel 5 Incubate overnight at ± 3 ° C with shaking. Chromatographic gel And wash with twice the column volume of 500 mM phosphate buffer (pH 7.5). Next Transfer the gel to a tube and incubate with 100 mM ethanolamine (pH 7.5). And wash with twice the column volume of PBS. Gel is PBS / merthiolate 1 / 10,00 Can be stored in 0.         1.C.4. Adsorption and elution   The 76 kDa protein is adsorbed and eluted as follows. 50 mM Tris for membrane fraction Cs2d Hydrochloric acid (pH 8.0), suspended in 2 mM EDTA, and filtered through a 0.45 μm membrane . Place the supernatant on a column equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 2 mM EDTA, and Flow at a flow rate of 10 ml / hour. Use a column of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 2 mM EDTA. Wash with 20 times the volume of the medium and then 2-6 times the volume of 10 mM phosphate buffer (pH 6.8). You.   The antigen is eluted with 100 mM glycine buffer (pH 2.5). Collect the eluate in 3mL fractions Add 150 μl of 1M phosphate buffer (pH 8.0) to each. 280nm absorbance of each fraction Fractions containing the 76 kDa protein are pooled and stored at -70 ° C.   Analysis by 10% SDS-PAGE shows a single band at 76 kDa. This purification When the N-terminal sequence analysis was performed on the prepared 76 kDa preparation, the obtained sequence was as follows: As follows: EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV (SEQ ID NO: 58).   32 kDa protein (GHPO 1360) or 50 kDa protein (GHPO 750) as follows Purify by immunoaffinity based chromatography. 32 or 50kD aSeparate from contaminating proteins (47 and 35 kDa proteins, respectively) For membrane fraction C4 to 50 mM NaCOThree(PH9.5) solubilize for 30 minutes with stirring at room temperature And centrifuge at 200,000 xg for 30 minutes at 4 ° C. 47 and 35 kDa proteins are NaCOThreeLoose Since they are insoluble in the impact liquid, they are removed as pellets.   The supernatant is dialyzed against 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 2 mM EDTA, and a 0.45 μm membrane Filter through wren. The filtered supernatant was washed with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 2 mM EDTA. And flow at a flow rate of about 10 mL / hour. Column is 50 mM Tris salt Acid (pH 8.0), 20 times the column volume of 2 mM EDTA, and then 10 mM phosphate buffer (pH 6.8) Wash with 2-6 volumes.   Antigen is eluted with 100 mM glycine buffer (pH 2.5). Collect the eluate in 3mL fractions Then, 150 μl of 1M phosphate buffer (pH 8.0) is added to each of them. Absorbance of each fraction Fractions containing 50 or 32 kDa protein are pooled and measured at 280 nm and stored at -70 ° C .   Analysis of the purified protein by 10% SDS-PAGE showed single and single 50 and 32 kDa A band appears. N-terminal sequencing of a purified 50 kDa protein preparation I do. The observed sequences are as follows: MKEKFNRTKPHVNIGTIGHVDH (SEQ ID NO: No .: 73). Similarly, N-terminal and internal sequencing was performed on the purified 32 kDa preparation. Do a thing. The sequences found are: AHNANNATHNTKK (SEQ ID NO: 74) and KPAHNA (SEQ ID NO: 75) (N-terminal), and IDKQPKAKK (SEQ ID NO: 76) and FWAKKQAE (SEQ ID NO: 77) (internal).         1.D. Purification of a 76 kDa protein from membrane fraction Cs2d and 32 kDa from membrane fraction C4 And 50kDa protein purification   The 76 kDa protein can also be purified as follows. 40 mL Q-Sepharose Prepare a column (diameter 2.5 cm; height 8 cm) according to the manufacturer's instructions (Pharmacia) You. Wash the column and add 50 mM NaCOThree(PH 9.5), 100 μM Pefabloc and 0.1 Equilibrate with buffer B containing% Zwittergent 3-14. Black Matography is performed by measuring the absorbance at 280 nm at the column outlet. Monitor.   140 mg of protein from membrane fraction Cs2d resuspended in buffer B is loaded onto the column. column Was washed with a 0.1 M NaCl buffer B solution and then a 0.1-0.5 M NaCl gradient was applied to the column. I can. Fractions eluted between 0.35 and 0.45 M NaCl were collected according to the manufacturer's instructions (Pharmacia). 10-mL S-Sepharose column (diameter: 1.5 cm; height: 5 cm; gel (Up to 10 mg protein / ml). The obtained fraction was added to a 100 μM In 50 mM acetate (pH 5.0) containing Problock and 0.1% Zwittergent 3-14 It is dialyzed and loaded on a column equilibrated with acetate buffer.   Wash the column with acetate buffer until the absorbance at 280 nm stabilizes (column volume). About 3 times the amount). Elute proteins with a 0-0.5M NaCl gradient in acetate buffer I do. The fraction eluted with 0.15 M NaCl is concentrated with a 76 kDa protein.   The 32 kDa protein (GHPO 1360) can be purified as follows. Film Paint C4 with 50 mM NaCOThreeSolubilize in buffer (pH 9.5) at room temperature with stirring for 30 minutes. The suspension is then centrifuged at 200,000 × g at 4 ° C. for 30 minutes. 35 kDa protein is NaCOThreeIn buffer This separates the 32 and 35 kDa proteins because they are insoluble. 50m supernatant M NaPOFourDialysis against buffer (pH 7.0)FourSP-cephalo equilibrated with buffer Place on a base column. Column is NaPOFourWash with buffer and run a 0-0.5M NaCl gradient. Give to The fraction eluted between 0.26 and 0.31 M contains the 32 kDa protein.   The 50 kDa protein can be purified as follows. 50 mM Na for membrane fraction C4 COThreeSolubilize in buffer (pH 9.5) at room temperature with stirring for 30 minutes. Then add 200 suspensions Centrifuge at 000 xg for 30 minutes at 4 ° C. 47 kDa protein is NaCOThreeInsoluble in buffer This separates the 50 and 47 kDa proteins. Supernatant is 50 mM NaPOFourBuffer (p Dialysis against H7.0).   Manufacturer of 40 mL Q-Sepharose columns (2.5 cm diameter, 8 cm height) (Pharmacia) Prepare and wash according to the instructions in buffer B (pH 9.5) (50 mM NaCO3).Three, 100 μM Pef And equilibrate with 0.1% Zwitterkent 3-14).   Chromatography is monitored by UV detection at 280 nm at the column outlet. You. 140 mg of the protein solubilized as described above was loaded on the column, and this was absorbed at 280 nm. Wash with buffer B until stabilization. Buffer protein B (10 times VT0.1 ~ 0 in) Elution with a 0.5M NaCl gradient followed by 0.5M then 1M NaCl (2x VT) With buffer B Wash. Fractions were collected, analyzed by SDS-PAGE, and analyzed according to the electrophoresis profile. Pool.   Fraction 9, which corresponds to the start of washing with 1 M NaCl and contains acidic proteins, was prepared as follows. Purify further. Use a 10 mL DEAE Sepharose column (diameter: 1.5 cm, height: 5 cm) Prepare according to manufacturer's instructions (Pharmacia) (up to 10 mg protein / ml gel) ). Wash and equilibrate the column with buffer B. Chromatography is as above To monitor.   Fraction 9 is dialyzed against buffer B and contains about 10 mg of protein. Fraction 9 is DEAE- Place on a Faroose column. Column is buffer B until absorbance at 280 nm stabilizes. Wash with. The protein was treated with a 0-0.5M NaCl gradient in buffer B solution (10-fold VT) After 1M NaCl (2 times VT). Collect fractions for SDS-PAGE Therefore, it is analyzed. Fraction eluted with 0.3-0.4M NaCl shows 50kDa protein . Example 2: 76 kDa protein, 32 kDa protein (GHPO 1360), and 50 kDa protein (GHPO 1360)  750), such as the gene encoding H. Of genes on the H. pylori genome Identification, signal sequence identification, and amplification of genes without signal sequence Primer design for 2.A. H. Construction of H. pylori genome database   H. The genome of H. pylori was determined to be 1.76 megabases long, It was provided as a text file containing a single continuous nucleotide chain. All games Nom is divided into 17 separate files using the program SPLIT (Creativity in Action). As a result, 16 contiguous fragments, each containing 100,000 nucleotides, A 17th contiguous fragment containing 76,000 nucleotides was obtained. That of 17 files In each case, a header was added using the following format: hpgo.txt (first consecutive Fragment), .hpgl.txt (representing the second contiguous fragment), and so on. In this way The 17 files that came from were named hpg0 to hpg16, copied and summarized. Helicobacter pylori (H. pylori) A file showing the plus strand of the whole genome was created. The built de The database was named "H". H. H. pylori genome minus The chain database was first created by the SeqPup program (D.G.Gilbert, Indiana Univ. Plus strand (p) using the Indiana University Biology Department ositive strand), and then create the same as above for the plus strand. By performing the same work, it was created similarly. Name this database "N" I did.   H. Open reading frames in the entire genome of H. pylori Area that is supposed to code the open reading frames (ORFs) Using the registered trademark GENEMARK program (Borodovsky et al., Comp. Chem. 17: 123, 1993). Determined. For both the plus and minus strands, H. pylori ) The genome encodes all open reading frames Create a database from a text file containing the annotated version Was named "0". Each open reading frame has a location on the genome, And a number indicating the relative position with respect to other genes. Manipulating text files Not needed. 2.B. H. Searching the H. pylori database   The database constructed by the above method was used for the FASTA program (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448, 1988). FASTA remains DNA sequence for any of the gene databases ("H" and / or "N") Or to search for a library of open reading frames (" 0 ") was used to search for peptide sequences. TFASTX is DNA data All possible reading frames (rea) of the base ("H" and / or "N" libraries) ding frame) was used to search for any peptide sequence. Reading frame In order to resolve the possibility of a shift (frameshift), Using FASTX, search the DNA database for the open reading frame of the DNA sequence. Alternatively, peptide sequences were searched against a protein database. 2.C. H. Isolation of DNA sequence from H. pylori genome   FASTA identifies the exact base positions on one or more separated contiguous fragments and Therefore, a search was performed against the constructed DNA database to identify the location of the target DNA. Now. If the exact location of the target sequence is known, the sequence identified as having that gene Connect the continuous fragments to the MapDraw software package (DNAStar, Inc.) And the gene was isolated. And the gene sequence along with the surrounding DNA sequence The EditSeq. Software package (DNA slides) for further analysis Co., Ltd. (DNAStar, Inc.). 2.D. Identification of signal sequence   Put the putative protein encoding the target gene sequence into the PROTEAN software package. The analysis is performed using a DNA (DNAStar, Inc.). This analysis is -The hydrophobic region of a protein is calculated using the Kyte-Doolittle algorithm. And the potential that may precede the hydrophobic core region Sex residues are identified. Such polar residues are common in many signal sequences. It is typical. Then, for confirmation, target proteins were identified with many motifs and characteristic Against a PROSITE database (DNAStar, Inc.) Search. Many signal sequences and hydrophobic regions are generally characterized by prokaryotes That is, a site presumed to be a lipid attachment site of the substance is identified. Of the above two methods If what is confirmed between the N-terminal of any protein , Estimated disconnection Find the part. In particular, immediately after the hydrophobic region center, alanine (A), serine (S), Or the presence of any amino acid residue of glycine (G). Lipoprotein In the case of white matter, the cysteine (C) residue is the first residue after cleavage (+1 residue ) Is often identified. 2.E. Rational PCR primer design based on signal sequence identification   To produce a recombinant protein with a histidine tag at the N-terminus, N In order to clone the sequence fused to the end as a gene sequence, a signal sequence The gene sequence having the following characteristics was omitted. 5 'of the gene-specific part of the N-terminal primer The ends are designed to start at the first codon beyond the cleavage site. Lipo For proteins, the 5 'end of the N-terminal primer is modified at the +1 position after cleavage. Begin with the second codon immediately after the residue to be obtained. Signal distribution from recombinant protein Removal of the row allows for a one-step purification and the hybrid construct (hybrid c on the insertion of a signal sequence into the membrane of a host strain with an onstruct) Potential problems are avoided. Example 3: GHPO 386, GHPO 789, GHPO 1516, GHPO 896, GHPO 1360, and GHPO  Preparation of isolated DNA encoding 750, and fusion protein with histidine tag Production of these polypeptides 3.A. Preparation of genomic DNA of Helicobacter pylori   Helicobacter suspended in LB medium containing 50% glycerol and stored at -70 ° C -Helicobacter pylori strain ORV2001 was isolated from Columbia, containing 7% sheep blood. On gar medium, under microaerobic conditions (8-10% COTwo, 5-7% OTwo, 85-87% NTwo) 48 hours increase Let them breed. After harvesting the cells and washing with PBS (pH 7.2), Rapid Prep Genomic D DNA is extracted from the cells using NA Isolation Kit (Pharmacia Biotech). 3.B. Amplification by PCR   GHPO 386, GHPO 789, GHPO 1516, GHPO 896, GHPO 1360, and GHPO (odd), Genomic DNA that can prepare DNA molecules encoding 65 and 67 by the method described above Amplify by polymerase chain reaction (PCR) using the following primers .GHPO 386 :     N-terminal primer:   Both N-terminal and C-terminal primers for each clone were 5 'clamp and restriction enzyme recognition sequences (BamHI (GGATCC) and XhoI (CTCGA) G) recognition site).   Amplification of gene-specific DNA was performed according to the manufacturer's instructions using a thermostable DNA polymerase ( For example, it is carried out using a thermalase DNA polymerase (Amresco). Reaction mixture Is as follows, with distilled water to a final volume of 100 μl:         dNTP mix 200μM         10 x Thermopol buffer 10 μl         Primers 300 nM each         DNA template 50ng         DNA polymerase 2 units   Appropriate amplification reaction conditions can be easily determined by those skilled in the art. This place In this case, the following conditions were used. Taq DNA Polymerase for GHPO 386 and GHPO 789 In a reaction containing Appligene, the denaturation step was performed at 95 ° C. for 30 seconds, followed by 50% An annealing step was performed at 1 ° C. for 1 minute, and an extension step was performed at 72 ° C. for 2 minutes and 30 seconds. twenty five Cycled. For GHPO 896, in reactions containing Taq DNA polymerase, And perform a denaturation step at 97 ° C for 30 seconds, followed by an annealing step at 50 ° C for 1 minute. The extension step was performed at 72 ° C. for 2 minutes and 30 seconds. 25 cycles were performed. Clone GHPO 151 In Fig. 6, Vent DNA polymerase was used instead of Taq DNA polymerase. GHPO 1516 is the same as GHPO 896, except that the temperature was 55 ° C. Conditions were used. For GHPO 1360 and GHPO 750, thermalase DNA polymer Lase was used. The denaturation step is performed at 95 ° C for 30 seconds, followed by an annealing step at 55 ° C. For 1 minute and the extension step was performed at 72 ° C. for 2 minutes. 30 cycles were performed. GHPO 711 For this, Vent DNA polymerase was used. The denaturation step is performed at 94 ° C for 30 seconds, A post-annealing step was performed at 50 ° C. for 30 seconds, and an extension step was performed at 72 ° C. for 1 minute. 25 sa Icle row Was. 3.C. Transformation and selection of transformants   A single PCR product was amplified in this manner to a reaction volume of 20 μl and Time, BamHI, and simultaneous digestion with XhoI or NotI. Products digested with restriction enzymes The product was similarly cut and treated with bovine intestinal Yamato alkaline phosphatase (CIP). PET28a (Novagen Co., Ltd.) which had been dephosphorylated before ligation ). The gene fusion constructed in this way has a vector encoding Histidine residues are present at the N-terminus of the fusion protein. The resulting fusion protein can be affinity-purified in one step.   The ligation reaction (20 μl) was performed at 14 ° C. overnight, and then used for 100 l μl of fresh E. coli XL1-blue competent cells (Novagen) ). Incubate cells on ice for 2 hours, then at 42 ° C for 30 seconds Apply heat shock and place on ice for 90 seconds. Next, select this sample Add to 1 ml of LB medium without selector and grow at 37 ° C for 2 hours. This cell is Spread 10 times and appropriate dilution on LB agar plate containing isine (50 mg / ml) Open and incubate at 37 ° C overnight. The next day, pick 50 colonies and on the secondary plate And culture overnight at 37 ° C.   Pick 5 colonies and place in 3 ml of LB medium containing kanamycin (100 mg / ml) And cultured overnight at 37 ° C. Extract plasmid DNA using Qiagen miniprep. And quantitated by agarose gel electrophoresis.   Perform PCR using gene-specific primers under the conditions indicated above. Make sure that the transformant DNA has the desired insert. Positive PCR result In the case of the above, out of five plasmid DNA samples extracted from E. coli XL-1blue cells, E. coli BL21 (λDE3) competent cells (Novaje) (Novagen; as previously described). Transformants (10) , Spread on a selection LB agar plate containing kanamycin (50 μg / ml), 50% Suspend in LB containing glycerol and store as research stock. 3.D. Purification of recombinant protein   3.Using 1 ml of frozen glycerol stock prepared in the manner described in C., 250 ml Kanamycin (25 in an Erlenmeyer flask) (mg / ml) in 50 ml of LB medium. Incubate the flask at 37 ° C for 2 hours, or Is the absorbance at 600 nm (OD600) Until 0.4-1.0 is reached. Culture solution Rasco is placed at 4 ° C. overnight to stop growth. The next day, use 10 ml overnight culture And the first OD600Contains kanamycin (25μg / ml) so that the value is about 0.02-0.04 Inoculate 240 ml of LB medium. Inoculate 4 flasks for each ORF.   Cells are OD600Grow to a value of 1.0 (approximately 2 hours at 37 ° C), centrifuge 1 ml SDS-PA to collect samples and detect leaky expression Analyze with GE. The rest of the culture was induced with 1 mM IPTG and further increased at 37 ° C for 2 hours. Let them breed.   Final OD600Measure the value and centrifuge at 5,000 xg for 15 minutes at 4 ° C to remove the cells. to recover. Discard the supernatant and wash the pellet with 50 mM Tris-HCl (Tris-HCl (pH 8.0)), 2 mM E Suspend in DTA. For 1 liter of culture, use 250 ml of buffer and transfer cells to 12,000 Collect by centrifugation at 0xg for 20 minutes. Discard the supernatant and store the pellet at -45 ° C. 3.E. Protein purification   3. Thaw the pellet obtained in D. and add 95 ml of 50 mM Tris-HCl (Tris-HCl (pH 8.0) ). Pefabloc and lysozyme at final concentrations And add to 100 μM, 100 μg / ml. The mixture is magnetically treated at 5 ° C for 30 minutes. Stir with a stirrer and homogenize. To ensure complete digestion of DNA In addition, 10mM magnesium chloride (MgClTwo) In the presence of Benzonase (me (Merck) at a final concentration of 1 U / ml. This suspension is used per cycle Ultrasonic crushing at maximum output for 3 cycles under conditions of 2 minutes (Bransonso (Use Branson Sonifier 450). The homogenized one is 19, Centrifuge at 000xg for 15 minutes, analyze both supernatant and pellet by SDS-PAGE and further As described in, the target protein in the soluble or insoluble fraction Investigate subcellular localization. 3.E.1. Soluble fraction   When the target protein is produced in a soluble form (ie, in the supernatant obtained in 3.E.) , Final concentration 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5M sodium chloride (NaCl), 10m Sodium chloride and imidazole are added to the supernatant so as to become M imidazole (buffer A). Add. The mixture is filtered through a 0.45 μm membrane and recommended by the manufacturer in advance. IMAC column charged with nickel ions (Pharmacia HiTr) ap chelating Sepharose (Pharmacia HiTrap chelating Sepharose); 1ml) Multiply. The column is then washed with 50 column volumes of Buffer A before the target The recombinant protein was mixed with 5 ml of buffer B (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M sodium chloride). (NaCl), 500 mM imidazole).   Monitor the elution profile by measuring the absorbance at 280 nm of each fraction. You. The fractions corresponding to the protein peak were combined into a single PB containing 0.5M arginine. Dialyze against S, filter through a 0.22 μm membrane and store at −45 ° C. 3.E.2. Insoluble fraction   The target protein is expressed in the insoluble fraction (ie, the pellet obtained in 3.E.). If so, purification is performed under denaturing conditions. Sodium chloride (NaCl), imidazole, And urea at a final concentration of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M sodium chloride (NaCl) Add 10 mM imidazole and 6 M urea (buffer C) to the suspended pellet. I can. After complete solubilization, the mixture was filtered through a 0.45 μm membrane and subjected to an IMAC column. To   The purification process on the IMAC column is based on the addition of 6M urea to all buffers and the After washing the column, wash 10 columns instead of 50 columns. Same as described in 3.E.1. Except that liquid C is used.   Protein eluted from the IMAC column with buffer D (buffer C containing 500 mM imidazole) Combine the quality fractions into one. Arginine was added to this solution to a final concentration of 0.5M. The mixture was mixed with 0.5M arginine and various concentrations of urea (4M, 3M, 2M, 1M, And 0.5M) in PBS containing urea at decreasing concentrations. The final dialysate is filtered through a 0.22 μm membrane and stored at -45 ° C.   Or, if the above purification process is not as effective, , Two other methods can be used. The first alternative is a weak denaturant. Using N-octyl glucoside (NOG). Simple Briefly, the pellet obtained in 3.E. was mixed with 5 mM imidazole, 500 mM sodium chloride. Thorium in 20 mM Tris-HCl (Tris-HCl (pH7.9)) at 15,000 psi pressure Homogenize by microfluidize and remote at 4,000-5,000xg Keep it clear. The pellets are collected and contain 1-2% NOG by weight per volume. 50mM sodium phosphate (NaPOFour(pH7.5)) and homogenize. NOG possible The soluble impurities are removed by centrifugation. Repeat the previous extraction step and remove another pellet. Extract the degree. This pellet is dissolved in 8 M urea and 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). urine Dilute the solubilized protein with an equal volume of 2 M arginine and 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). And dialysis against 1M arginine for 24-48 hours to remove urea. Final dialysate Is filtered through a 0.22 μm membrane and stored at −45 ° C.   A second alternative involves using a strong denaturant such as guanidine hydrochloride. No. Briefly, the pellet obtained in 3.E. was mixed with 5 mM imidazole, 500 mM sodium chloride. Microfluidization in a solution of thorium and 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) at a pressure of 15,000 psi ( microfluidize) and centrifuge at 4,000-5,000xg to clear Clarify. Collect the pellet, suspend in 6M guanidine hydrochloride, and add nickel ion Pass through an IMAC column charged with (Ni ++). Elute bound antigen with 8M urea (pH 8.5) I do. Eluted beta-mercaptoethanol to a final concentration of 1 mM And then eluted proteins were separated by Sephadex (Sephdex) equilibrated with 0.1 M acetic acid. adex) Pass through G-25 column. Elute the protein from the column with 4 volumes of 50 mM phosphate buffer. Add slowly to the buffer (pH 7.0). The protein remains in solution. 3.F. Evaluation of protective activity of purified protein   In order to examine the protective activity of the purified natural protein, a protective effect test was performed as described above. It was carried out. This test is also used to determine the protective efficiency of recombinant proteins. Can be Alternatively, the following test can be used.   Groups of 10 OF1 mice (IFFA Credo) were dissolved in physiological buffer. Immunization from the rectum with 25 μg of purified recombinant protein mixed with 1 μg of cholera toxin (Berna) I do. Mice are immunized on days 0, 7, 14, and 21. 14 days after the last immunization, H. pylori strain ORV2001 grown in somatic medium (cells were harvested as described in 1.A. After growing on a gar plate and collecting, resuspend in Brucella broth. After turbidity, the cells are cultured in a flask at 37 ° C. overnight). 14 of administration Day Later, the mouse is killed and its stomach is removed. Measurement of urease activity in the stomach And the amount of H. pylori is determined by culturing. 3.G. Production of polyclonal antibodies specific for a single antigen 3.G.1. Hyperimmune rabbit antiserum   100 μg of purified fusion polypeptide as obtained in 3.E.1. Or 3.E.2. Approximately 2 ml, in the presence of Freund's complete adjuvant, New Zealand Rabbits are injected subcutaneously and intramuscularly. 7 and 14 days after the first injection, Except for the use of incomplete Indian adjuvants, the amount is equal to the initial dose. Administer epidemics. 15 days after the last injection, the sera of the animals were collected and, without complement, 0.45 Filter through a μm membrane. 3.G.2. Hyperimmune ascites fluid in mice   3.E.10 to 50 μg of purified fusion polypeptide as obtained in E.1. Or 3.E.2. 10 mice in the presence of Freund's complete adjuvant in a volume of approximately 200 μl. Injected below. 7 and 14 days after the first injection, Freund's incomplete adjuvant A booster dose is given in an amount equal to the initial dose, except that the initial dose is used. First note At 21 and 28 days after the injection, only 50 μg of the antigen is administered intraperitoneally to the mice. 21st In the eyes, sarcoma 180 / TG cells CM26684 are also administered intraperitoneally to mice (Lennette et al. Diagnostic procedures for ills, rickettsia, and chlamydial infections for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections), 5th edition, Washington D. C, American Public Health Association, 1979). Belly The aqueous solution is collected 10-13 days after the last injection. Example 4 Method for Producing Transcriptional Fusion Without Histidine Tag   Encodes a polypeptide of the invention as a transcriptional fusion lacking a histidine tag The method for amplifying and cloning DNA is described below. For each clone On the other hand, based on the sequence of the polynucleotide encoding them, two PCR primers are used. Design the primers (SEQ ID NOs: 1-21 (odd number), SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: No .: 67). Using these primers, for example, ORV2001 and ATCC deposit numbers No. 43579 as American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Ma ryland) any Helicobacter pylori strain, including the H. pylori strain deposited From stock Also, from other Helicobacter species, a DN encoding the polypeptide of the present invention. It is possible to amplify A.   The N-terminal primer contains the ribosome binding site of the target gene, the ATG start site, (If) a signal sequence, and a cleavage site. N terminal The limer is used for the 5 'clamp and subsequent cloning. For ease of use, it may contain a restriction enzyme recognition site such as a BamHI (GGATCC) site. It is possible. Similarly, the C-terminal primer can be used for subsequent cloning And a restriction enzyme recognition site such as a XhoI (CTCGAG) site and a TAA stop codon. And it is possible. Primers that can be used are listed above.   Amplification of the gene encoding the polypeptide of the present invention was performed according to the method described in Example 3 above. DNA Polymerase (New England Biolabs) or Taq DNA Polymerase (Appligene). Or provided by the manufacturer According to the instructions given in the Thermalase DNA Polymerase ) Or Pwo DNA polymerase (Boehringer Mannheim) It is.   A single PCR product was amplified for each clone and cut at the BamHI-XhoI site. Cloned into cleaved pET 24 to allow protein expression without histidine tag A transcribing fusion was constructed. The expressed product was dialyzed against 1M arginine. It can be purified as a denatured protein that can be regenerated more.   By cloning into pET24, the gene is vector-derived T7 promoter Transcribed from the ribosome to the ribosome binding site inherent in the gene. A Depends on the binding of RNA-specific DNA polymerase This allows expression of the full length open reading frame (ORF). Amplification reaction, restriction enzyme treatment And the cloning protocol are described above for the construction of the translation fusion. I will do it. Example 5: Purification of a polypeptide of the invention by immunoaffinity 5.A. Purification of specific immunoglobulin G (IgG)   The immune sera as prepared in Section 3.G. is washed with 100 mM Tris-HCl (pH 8.0). Equilibrated Protein A Sepharose Fast Flow (protein A Sepharose F) ast Flow) column (Pharmacia). 10 columns Add ram volume of 100 mM Tris-HCl and 10 columns of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) To wash the resin. The IgG antibody was eluted with 0.1 M glycine buffer (pH 3.0), Add 0.25 ml each of 1 M Tris-HCl (pH 8.0) and collect as 5 ml fractions. The absorbance of the eluate is measured at 280 nm and fractions containing immunoglobulin G (IgG) antibodies And dialyzed against 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). If necessary, Store frozen at -70 ° C. 5.B. Column preparation   CNBr-activated Cef of Pharmacia (17-0430-01) Sepharose 4B gel to an appropriate amount (1 gram of dried gel is approximately 3.5 ml of water) Provides a sum gel; gel capacity binds 5-10 mg IgG / ml gel) , Suspended in 1 mM hydrochloric acid buffer, and washed by adding a small amount of 1 mM hydrochloric acid buffer using a funnel . The total volume of the buffer is 200 ml per gram of gel.   The purified IgG antibody was added to 50 volumes of 500 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5). And dialyze at 20 ± 5 ° C for 4 hours. Then, adjust this antibody to a final concentration of 3 mg / ml. Dilute with 500 mM phosphate buffer (pH 7.5).   The IgG antibody is mixed with the gel at 5 ± 3 ° C. overnight. This gel is chromatographed Fill the column with two columns of 500 mM phosphate buffer (pH 7.5) and one column. 50 mM sodium phosphate buffer containing 500 mM sodium chloride (pH 7.5) Wash with. Next, transfer the gel to a tube and add 100 mM ethanolamine (pH 7.5) and wash twice with 2 column volumes of PBS. And the gel Store in PBS containing 1 / 10,000 amount of merthiolate (1 / 10,000 PBS / merthiolate) You. The amount of IgG antibody bound to the gel depends on the IgG solution and the direct eluate and wash solution. It is determined by measuring the absorbance at 280 nm. 5.C. Antigen adsorption and elution   For example, 50 liters such as the top erase obtained in 3.E.1 or the solubilized pellet obtained in 3.E.2 The antigen solution dissolved in mM Tris-HCl (pH 8.0) and 2 mM EDTA is centrifuged, and a 0.45 μm membrane is centrifuged. After filtration at 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 Load on the column equilibrated with mM EDTA. Then, use this column 20 times the volume of 50 Wash with mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM EDTA. Or mix at 5 ± 3 ° C overnight By doing so, it is possible to cause adsorption.   Wash the adsorbed gel with 2 to 6 volumes of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) Then, the antigen is eluted with 100 mM glycine buffer (pH 2.5). Elute the eluate with 3 ml fractions And collect, add 150 μl of 1 M sodium phosphate buffer (pH 8.0) to each . Measure absorbance at 280 nm for each fraction; combine fractions containing antibody Store at -20 ° C. Example 6: GHPO 1360 polypeptide is H. Diagnostic serological tools for H. pylori infection Useful as a file   H. Reactivity of patient sera to H. pylori protein by immunoblot technique analyzed. Briefly, H. 12.5% gel on total lysate of H. pylori ORV2001 SDS-PAGE electrophoresis (BioRad protean II) Tem). Nitrocellulose paper for protein for immunoblot assays Was transferred electrically. After blocking, nitrocellulose paper is removed from the patient's serum. (Diluted 500-fold in blocking buffer) at room temperature for 1 hour Wash, and further incubate with peroxidase-conjugated goat anti-human IgG did. Positive bands appeared upon incubation with the appropriate substrate. From the results, H. Serum of H. pylori-positive ulcer patients has a molecular weight of 50-60 kDa and about 30-35 kDa Specific protein. Identify the properties of these proteins Because of the reactivity of patient serum, purified protein with similar molecular weight: urease (67 kDa and 30 kDa), catalase (54 kDa), heat shock protein B (60 kDa), and And the GHPO 1360 polypeptide expressed and purified as described in Example 5 (3 2kDa) was analyzed by immunoblot assay. The serum of all patients Strongly reactive with GHPO 1360 polypeptide, but not against other purified proteins The reactivity was quite variable. These results indicate that the GHPO 1360 polypeptide is H. This indicates that it is a useful antigen used in the diagnosis of H. pylori infection.   Other embodiments are within the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 48/00 A61P 31/04 A61P 1/04 C07K 14/205 31/04 16/12 C07K 14/205 C12Q 1/68 A 16/12 C12N 15/00 ZNAA C12Q 1/68 A61K 37/02 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF ,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE, SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,LS,M W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY ,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM ,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY, CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,E S,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU,ID ,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ, LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,M G,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT ,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL, TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,V N,YU,ZW (72)発明者 リッソロ リン フランス共和国 マーシー レトワール ル ドゥ バロール 691 (72)発明者 トンブ ジーン−フランソワ アメリカ合衆国 メリーランド州 バルテ ィモア セント ポール ストリート 3501 (72)発明者 ミラー チャールズ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 メ ドフォード メイプル アベニュー 32 (72)発明者 アル−ギャラウィ アマル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ボ ストン ギャリソン ストリート 32 ナ ンバー 4501──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 48/00 A61P 31/04 A61P 1/04 C07K 14/205 31/04 16/12 C07K 14/205 C12Q 1/68 A 16/12 C12N 15/00 ZNAA C12Q 1/68 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT , LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP , KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Lissoline Lync France Mercy L'Etoile Le de Valor 691 ( 72) Inventor Tomb Jean-François, United States 3501 St. Paul Street, Baltimore, Maryland, United States Miller Charles, United States Medford, MA, MA Maple Ave -Menu 32 (72) inventor Al - Gyarawi Amal United States Massachusetts Boston Garrison Street 32 na members 4501

Claims (1)

【特許請求の範囲】 1.以下の(i)または(ii)をコードする単離ポリヌクレオチド: (i)ヘリコバクター(Helicobacter)膜関連ポリペプチドのアミノ酸配列が下 記に示すアミノ酸配列からなる群より選択される、ヘリコバクター膜関連ポリペ プチドのアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチド: アミノ酸-19〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-19位または1位 から始まって、アミノ酸689位で終了する、配列番号:2(GHPO 386); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸713位で終了する、配列番号:4(GHPO 789); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸725位で終了する、配列番号:6(GHPO 1516); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸691位で終了する、配列番号:8(GHPO 1197); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸652位で終了する、配列番号:10(GHPO 1180); アミノ酸-18〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-18位または1位 から始まって、アミノ酸673位で終了する、配列番号:12(GHPO 896); アミノ酸-21〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-21位または1位 から始まって、アミノ酸619位で終了する、配列番号:14(GHPO 711); アミノ酸-17〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-17位または1位 から始まって、アミノ酸635位で終了する、配列番号:16(GHPO 190); アミノ酸-19〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-19位または1位 から始まって、アミノ酸626位で終了する、配列番号:18(GHPO 185); アミノ酸-16〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-16位または1位 から始まって、アミノ酸467位で終了する、配列番号:20(GHPO 1417); アミノ酸-18〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-18位または1位 から始まって、アミノ酸673位で終了する、配列番号:22(GHPO 1414); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸279位で終了する、配列番号:66(GHPO 1360);および アミノ酸1位から始まって、アミノ酸399位で終了する、配列番号:68 (GHPO 750);または (ii)該ポリペプチドの誘導体。 2.以下の(i)または(ii)をコードする単離ポリヌクレオチド: (i)アミノ酸-19位から始まってアミノ酸689位で終了する配列番号:2(GHPO 386); アミノ酸-20位から始まってアミノ酸713位で終了する配列番号:4(GH PO 789); アミノ酸-20位から始まってアミノ酸725位で終了する配列番号:6(GH PO 1516); アミノ酸-20位から始まってアミノ酸691位で終了する配列番号:8(GH PO 1197); アミノ酸-20位から始まってアミノ酸652位で終了する配列番号:10(GH PO 1180); アミノ酸-18位から始まってアミノ酸673位で終了する配列番号:12(GH PO 896); アミノ酸-21位から始まってアミノ酸619位で終了する配列番号:14(GH PO 711); アミノ酸-17位から始まってアミノ酸635位で終了する配列番号:16(GH PO 190); アミノ酸-19位から始まってアミノ酸626位で終了する配列番号:18(GH PO 185); アミノ酸-16位から始まってアミノ酸467位で終了する配列番号:20(GH PO 1417); アミノ酸-18位から始まってアミノ酸673位で終了する配列番号:22(GH PO 1414); アミノ酸-20位から始まってアミノ酸279位で終了する配列番号:66(GH PO 1360);および アミノ酸1位から始まってアミノ酸399位で終了する配列番号:68(GHP O 750); に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と相同であるアミノ 酸配列を含むポリペプチド、または (ii)該ポリペプチドの誘導体。 3.下記の(i)または(ii)の成熟型をコードする、請求項1記載の単離ポリヌク レオチド: (i)下記に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と相同で あるアミノ酸配列を含むポリペプチド: アミノ酸-19〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-19位または1位 から始まって、アミノ酸689位で終了する、配列番号:2(GHPO 386); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸713位で終了する、配列番号:4(GHPO 789); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸725位で終了する、配列番号:6(GHPO 1516); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸691位で終了する、配列番号:8(GHPO 1197); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸652位で終了する、配列番号:10(GHPO 1180); アミノ酸-18〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-18位または1位 から始まって、アミノ酸673位で終了する、配列番号:12(GHPO 896); アミノ酸-21〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-21位または1位 から始まって、アミノ酸619位で終了する、配列番号:14(GHPO 711); アミノ酸-17〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-17位または1位 から始まって、アミノ酸635位で終了する、配列番号:16(GHPO 190); アミノ酸-19〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-19位または1位 から始まって、アミノ酸626位で終了する、配列番号:18(GHPO 185); アミノ酸-16〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-16位または1位 から始まって、アミノ酸467位で終了する、配列番号:20(GHPO 1417); アミノ酸-18〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-18位または1位 から始まって、アミノ酸673位で終了する、配列番号:22(GHPO 1414); アミノ酸-20〜5位のいずれか1つの位置、好ましくは-20位または1位 から始まって、アミノ酸279位で終了する、配列番号:66(GHPO 1360);および アミノ酸1位から始まって、アミノ酸399位で終了する、配列番号:68 (GHPO 750);または (ii)該ポリペプチドの誘導体。 4.DNA分子である、請求項1、2または3記載の単離ポリヌクレオチド。 5.下記のプライマーのいずれかを用いた、ヘリコバクターゲノムからポリメラ ーゼ連鎖反応を用いて増幅および/またはクローニングすることができるDNA分 子である、請求項1記載の単離ポリヌクレオチド: 配列番号:23に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:25に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 386); 配列番号:26に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:28に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 789); 配列番号:29に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:31に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 1516); 配列番号:32に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:34に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 1197); 配列番号:35に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:37に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 1180); 配列番号:38に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:40に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 896); 配列番号:41に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:43に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 711); 配列番号:44に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:46に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 190); 配列番号:47に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:49に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 185); 配列番号:50に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:52に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 1417); 配列番号:53に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:55に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 1414); 配列番号:78に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:79に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(非プロセ シングGHPO 1360); 配列番号:24に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:25に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 386); 配列番号:27に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:28に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 789); 配列番号30に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよび 配列番号:31に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 1 516); 配列番号:33に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:34に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 1197); 配列番号:36に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:37に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 1180); 配列番号:39に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:40に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 896); 配列番号:42に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:43に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 711); 配列番号:45に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:46に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 190); 配列番号:48に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:49に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 185); 配列番号:51に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:52に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 1417); 配列番号:54に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:55に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 1414); 配列番号:80に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:81に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(GHPO 750 );または 配列番号:82に示す配列を有する5'オリゴヌクレオチドプライマーおよ び配列番号:79に示す配列を有する3'オリゴヌクレオチドプライマー(成熟GHPO 1360)。 6.ヘリコバクターピロリゲノムからポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅および /またはクローニングすることができる、請求項5記載の単離DNA分子。 7.請求項5記載のDNA分子によってコードされるポリペプチドの成熟型または 誘導体をコードするDNA分子である、請求項1記載の単離ポリヌクレオチド。 8.請求項6記載のDNA分子によってコードされるポリペプチドの成熟型または 誘導体をコードするDNA分子である、請求項1記載の単離ポリヌクレオチド。 9.下記に示すアミノ酸配列からなる群より選択される、ヘリコバクター膜に関 連したポリペプチドのアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含むポリペプチ ドの成熟型または誘導体である、実質的に純粋型の化合物: アミノ酸-19位から始まってアミノ酸689位で終了する配列番号:2(GH PO 386); アミノ酸-20位から始まってアミノ酸713位で終了する配列番号:4(GH PO 789); アミノ酸-20位から始まってアミノ酸725位で終了する配列番号:6(GH PO 1516); アミノ酸-20位から始まってアミノ酸691位で終了する配列番号:8(GH PO 1197); アミノ酸-20位から始まってアミノ酸652位で終了する配列番号:10(GH PO 1180); アミノ酸-18位から始まってアミノ酸673位で終了する配列番号:12(GH PO 896); アミノ酸-21位から始まってアミノ酸619位で終了する配列番号:14(GH PO 711); アミノ酸-17位から始まってアミノ酸635位で終了する配列番号:16(GH PO 190); アミノ酸-19位から始まってアミノ酸626位で終了する配列番号:18(GH PO 185); アミノ酸-16位から始まってアミノ酸467位で終了する配列番号:20(GH PO 1417); アミノ酸-18位から始まってアミノ酸673位で終了する配列番号:22(GH PO 1414); アミノ酸-20位から始まってアミノ酸279位で終了する配列番号:66(GH PO 1360);および アミノ酸1位から始まってアミノ酸399位で終了する配列番号:68(GHP O 750);または (ii)該ポリペプチドの誘導体。 10.請求項5記載のDNA分子によってコードされるポリペプチドの成熟型または 誘導体である、請求項9記載の化合物。 11.請求項6記載のDNA分子によってコードされるポリペプチドの成熟型または 誘導体である、請求項9記載の化合物。 12.哺乳動物においてヘリコバクター感染症を予防または治療するための薬学的 組成物であって、予防的または治療的有効量の請求項9、10または11記載の化合 物と、薬学的に許容される希釈剤もしくは担体とを含む組成物。 13.抗生物質、抗分泌剤、ビスマス塩、またはその組合せをさらに含む請求項12 記載の組成物。 14.抗生物質が、アモキシシリン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、メ トロニジゾール、およびエリスロマイシンからなる群より選択される、請求項13 記載の組成物。 15.ビスマス塩が、次クエン酸ビスマスおよび次サリチル酸ビスマスからなる群 より選択される、請求項13記載の組成物。 16.抗分泌剤がプロトンポンプ阻害剤である、請求項13記載の組成物。 17.プロトンポンプ阻害剤がオメプラゾール、ランソプラゾール、およびパント プラゾールからなる群より選択される、請求項16記載の組成物。 18.抗分泌剤がH2-受容体拮抗剤である、請求項13記載の組成物。 19.H2-受容体拮抗剤がラニチジン、シメチジン、ファモチジン、ニザチジンお よびロキサチジンからなる群より選択される、請求項18記載の組成物。 20.抗分泌剤がプロスタグランジン類似体である、請求項13記載の組成物。 21.プロスタグランジン類似体がミソプロスチルまたはエンプロスチルである、 請求項20記載の組成物。 22.予防的または治療的有効量の第二のヘリコバクターポリペプチドまたはその 誘導体をさらに含む、請求項12記載の組成物。 23.第二のヘリコバクターポリペプチドがヘリコバクターウレアーゼ、そのサブ ユニット、または誘導体である、請求項22記載の組成物。 24.アジュバントをさらに含む、請求項12記載の組成物。 25.哺乳動物においてヘリコバクター感染症を予防または治療するための薬学的 組成物であって、予防的または治療的有効量の請求項1、2または3記載のポリ ヌクレオチドと薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む組成物。 26.哺乳動物においてヘリコバクター感染症を予防または治療するための薬学的 組成物であって、予防的または治療的有効量の請求項5、6または7記載のポリ ヌクレオチドと薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む組成物。 27.哺乳動物においてヘリコバクター感染症を予防または治療するための薬学的 組成物であって、予防的または治療的有効量の請求項8記載のポリヌクレオチド と薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む組成物。 28.ウイルスベクターを含む組成物であって、そのゲノムに請求項4記載のDNA 分子が挿入されており、該DNA分子が哺乳動物細胞において発現される条件下に あり、該ウイルスベクターが生理的に許容される希釈剤または担体と混合される ものである組成物。 29.ウイルスベクターがポックスウイルスである、請求項28記載の組成物。 30.請求項4記載のDNA分子を含む細菌ベクターを含有する組成物であって、該D NA分子が発現される条件下にあり、該細菌ベクターが生理的に許容される希釈剤 または担体と混合されるものである組成物。 31.ベクターが赤痢菌(Shigella)、サルモネラ菌(Salmonella)、ビブリオコ レラ(Vibrio cholerae)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、カルメットゲラン杆菌 なる群より選択される、請求項30記載の組成物。 32.ポリヌクレオチドが、哺乳動物のゲノムにおいて複製できず且つ実質的に組 み込まれないプラスミドに挿入され、哺乳動物細胞において発現される条件下に 置かれたDNA分子である、請求項25記載の組成物。 33.請求項4記載のDNA分子を含み、該DNA分子が原核細胞または真核細胞におい て発現される条件下にある発現カセツト。 34.請求項33記載の発現カセットで形質転換またはトランスフェクトされた原核 細胞または真核細胞を培養する段階、および培養細胞から化合物を回収する段階 を含む、請求項9記載の化合物の製造法。 35.哺乳動物においてヘリコバクター感染症を予防または治療するための薬学的 組成物であって、予防的または治療的有効量の請求項9、10または11記載の化合 物に結合する抗体と薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む組成物。[Claims] 1. An isolated polynucleotide encoding the following (i) or (ii): (i) a Helicobacter membrane-associated polypeptide, wherein the amino acid sequence of the Helicobacter membrane-associated polypeptide is selected from the group consisting of the amino acid sequences shown below. A polypeptide having an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 starting at any one of amino acids -19 to 5, preferably -19 or 1, and ending at amino acid 689; (GHPO 386); SEQ ID NO: 4 (GHPO 789), starting at any one of amino acids-20-5, preferably starting at positions -20 or 1 and ending at amino acid 713 SEQ ID NO: 6 (GHPO1516), starting at any one of positions 5, preferably at positions -20 or 1, and ending at amino acid 725; amino acids -20 to 5 SEQ ID NO: 8 (GHPO 1197), preferably beginning at position -20 or 1 and ending at amino acid 691; any one of amino acids -20 to 5, preferably -20 or 1 Beginning at and ending at amino acid position 652, SEQ ID NO: 10 (GHPO 1180); starting at any one of amino acid positions -18 to 5, preferably at position -18 or 1 and ending at amino acid position 673 SEQ ID NO: 12 (GHPO 896); SEQ ID NO: 14 (GHPO 711) starting at any one of amino acids -21 to 5, preferably -21 or 1 and ending at amino acid 619 SEQ ID NO: 16 (GHPO 190), starting at any one of amino acid positions -17-5, preferably starting at position -17 or 1 and ending at amino acid position 635; Starting at any one position, preferably at position -19 or 1, the amino SEQ ID NO: 18 (GHPO 185), ending at position 626; SEQ ID NO: starting at any one of amino acids -16-5, preferably starting at positions -16 or 1 and ending at amino acid 467 20 (GHPO 1417); SEQ ID NO: 22 (GHPO 1414), starting at any one of amino acids-18-5, preferably starting at positions -18 or 1 and ending at amino acid 673 SEQ ID NO: 66 (GHPO 1360), starting at any one of positions -5, preferably starting at position -20 or 1 and ending at amino acid position 279; and starting at amino acid position 1 at amino acid position 399 Terminates, SEQ ID NO: 68 (GHPO 750); or (ii) a derivative of the polypeptide. 2. An isolated polynucleotide encoding the following (i) or (ii): (i) SEQ ID NO: 2 (GHPO 386), starting at amino acid position -19 and ending at amino acid position 689; amino acid starting at amino acid position -20 SEQ ID NO: 4 (GH PO 789) ending at position 713; SEQ ID NO: 6 starting at amino acid -20 and ending at amino acid position 725 (GH PO 1516); Starting at amino acid -20 and ending at amino acid 691 SEQ ID NO: 8 (GH PO 1197); SEQ ID NO: 10 starting at amino acid-20 and ending at amino acid 652; SEQ ID NO: 10 (GH PO 1180); SEQ ID NO: starting at amino acid -18 and ending at amino acid 673 12 (GH PO 896); SEQ ID NO: 14 beginning at amino acid position -21 and ending at amino acid position 619 (GH PO 711); SEQ ID NO: 16 starting at amino acid position -17 and ending at amino acid position 635 190); starts at amino acid position -19 and ends at amino acid position 626 SEQ ID NO: 18 (GH PO 185); SEQ ID NO: 20 starting at amino acid-16 and ending at amino acid 467; SEQ ID NO: 20 (GH PO 1417); SEQ ID NO: starting at amino acid -18 and ending at amino acid 673 22 (GH PO 1414); SEQ ID NO: 66 beginning at amino acid position -20 and ending at amino acid position 279 (GH PO 1360); and SEQ ID NO: 68 starting at amino acid position 1 and ending at amino acid position 399 750) a polypeptide comprising an amino acid sequence homologous to an amino acid sequence selected from the group consisting of: (ii) a derivative of the polypeptide; 3. The isolated polynucleotide according to claim 1, which encodes the following mature form of (i) or (ii): (i) an amino acid sequence homologous to an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences shown below: Polypeptides comprising: SEQ ID NO: 2 (GHPO 386), starting at any one of amino acid positions -19-5, preferably starting at position -19 or 1 and ending at amino acid position 689; amino acids -20-5 SEQ ID NO: 4 (GHPO 789), starting at any one of the positions, preferably at position -20 or 1 and ending at amino acid 713; position at any one of amino acids -20-5, preferably Starts at position -20 or 1 and ends at amino acid position 725, SEQ ID NO: 6 (GHPO1516); amino acid position from any one of positions -20 to 5, preferably starting at position -20 or 1. Ending at amino acid position 691, SEQ ID NO: No. 8 (GHPO 1197); SEQ ID NO: 10 (GHPO 1180), starting at any one of amino acid positions -20 to 5, preferably -20 or 1 and ending at amino acid position 652; SEQ ID NO: 12 (GHPO 896), starting at any one of positions -5, preferably at position -18 or 1 and ending at amino acid 673; amino acid positions at any one of positions -21-5 SEQ ID NO: 14 (GHPO 711), preferably beginning at position -21 or 1 and ending at amino acid 619; any one of amino acids -17 to 5, preferably -17 or 1 Starting at and ending at amino acid position 635, SEQ ID NO: 16 (GHPO 190); starting at any one of amino acid positions -19 to 5, preferably at position -19 or 1 and ending at amino acid position 626 SEQ ID NO: 18 (GHPO 185); any one of amino acids -16 to 5 SEQ ID NO: 20 (GHPO 1417), starting at position -16, preferably at position -16 or 1 and ending at amino acid position 467; any one of amino acids -18 to 5, preferably -18 or 1 Starting at position and ending at amino acid position 673, SEQ ID NO: 22 (GHPO 1414); starting at any one of amino acid positions -20 to 5, preferably at position -20 or 1, at amino acid position 279 Ends, SEQ ID NO: 66 (GHPO 1360); and SEQ ID NO: 68 (GHPO 750), starting at amino acid position 1 and ending at amino acid position 399; or (ii) a derivative of the polypeptide. 4. The isolated polynucleotide according to claim 1, 2 or 3, which is a DNA molecule. 5. 2. The isolated polynucleotide of claim 1, which is a DNA molecule that can be amplified and / or cloned from the Helicobacter genome using the polymerase chain reaction using any of the following primers: SEQ ID NO: 23 A 5 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a 3' oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 25 (non-processed GHPO 386); and a 5 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 28 3 ′ oligonucleotide primer with sequence (non-processing GHPO 789); 5 ′ oligonucleotide primer with sequence as shown in SEQ ID NO: 29 and 3 ′ oligonucleotide primer with sequence as shown in SEQ ID NO: 31 (non-processing GHPO 1516) A 5'-e having the sequence of SEQ ID NO: 32; Oligonucleotide primers and 3 'oligonucleotide primers having the sequence shown in SEQ ID NO: 34 (non-processing GHPO 1197); 5' oligonucleotide primers having the sequence shown in SEQ ID NO: 35 and 3 having the sequence shown in SEQ ID NO: 37 'Oligonucleotide primer (non-processing GHPO 1180); 5' oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 38 and 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 40 (non-processing GHPO 896); SEQ ID NO: 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in 41 and 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 43 (non-processing GHPO 711); 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: : 3 ′ oligonucleotide having the sequence shown in 46 Reotide primer (non-processing GHPO 190); 5 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 47 and 3' oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 49 (non-processing GHPO 185); SEQ ID NO: 50 A 5 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 52 and a 3' oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 52 (non-processing GHPO 1417); a 5 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 55 A 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 78 and a 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 79 (non-processing GHPO 1414) 1360); SEQ ID NO: 24 A 5 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a 3' oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 25 (mature GHPO 386); A 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 30 and a 3' oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 31 (mature GHPO 1516); SEQ ID NO: A 5 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 33 and a 3' oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 34 (mature GHPO 1197); a 5 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 36, and SEQ ID NO: The 3 'oligonucleotide primer having the sequence shown in 37 (mature GHP O 1180); 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 39 and 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 40 (mature GHPO 896); 5 ′ having the sequence shown in SEQ ID NO: 42 Oligonucleotide primer and 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 43 (mature GHPO 711); 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 45 and 3 ′ having the sequence shown in SEQ ID NO: 46 Oligonucleotide primer (mature GHPO 190); 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 48 and 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 49 (mature GHPO 185); shown in SEQ ID NO: 51 A 5 'oligonucleotide primer having a sequence and a 3' oligonucleotide having the sequence shown in SEQ ID NO: 52. Nucleotide primer (mature GHPO 1417); 5 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 54 and 3 ′ oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 55 (mature GHPO 1414); sequence shown in SEQ ID NO: 80 A 5 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 81 and a 3' oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 81 (GHPO750); or a 5 'oligonucleotide primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 82 and the sequence shown in SEQ ID NO: 79 3 'oligonucleotide primer with (mature GHPO 1360). 6. 6. The isolated DNA molecule of claim 5, which can be amplified and / or cloned from the Helicobacter pylori genome using the polymerase chain reaction. 7. The isolated polynucleotide according to claim 1, which is a DNA molecule encoding a mature form or derivative of the polypeptide encoded by the DNA molecule according to claim 5. 8. The isolated polynucleotide according to claim 1, which is a DNA molecule encoding a mature form or derivative of the polypeptide encoded by the DNA molecule according to claim 6. 9. A substantially pure form of a compound, which is a mature or derivative form of a polypeptide comprising an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence of a Helicobacter membrane-associated polypeptide, selected from the group consisting of the amino acid sequences shown below: SEQ ID NO: 2 starting at position -19 and ending at amino acid position 689 (GH PO 386); SEQ ID NO: 4 starting at amino acid position -20 and ending at amino acid position 713 (GH PO 789); starting at amino acid position -20 SEQ ID NO: 6 beginning at amino acid position 725 and ending at amino acid position 725 (GH PO 1516); SEQ ID NO: 8 starting at amino acid position -20 and ending at amino acid position 691 (GH PO 1197); amino acid 652 starting at amino acid position -20 SEQ ID NO: 10 (GH PO 1180) ending at position 18; ending at amino acid position 673 and ending at amino acid position 18 (GH PO 896); SEQ ID NO: 12 (GH PO 896); starting at amino acid position -21 and ending at amino acid position 619 SEQ ID NO: 14 (GH PO 711); SEQ ID NO: 16 beginning at amino acid-17 and ending at amino acid 635; SEQ ID NO: 18 starting at amino acid -19 and ending at amino acid 626 (GH PO 185); SEQ ID NO: 20 starting at amino acid position -16 and ending at amino acid position 467 (GH PO 1417); SEQ ID NO: 22 starting at amino acid position -18 and ending at amino acid position 673 (GH PO 1414) SEQ ID NO: 66 starting at amino acid-20 and ending at amino acid 279 (GHPO 1360); and SEQ ID NO: 68 starting at amino acid 1 and ending at amino acid 399 (GHP O 750); or ii) Derivatives of the polypeptide. Ten. 10. The compound according to claim 9, which is a mature form or derivative of the polypeptide encoded by the DNA molecule according to claim 5. 11. 10. The compound according to claim 9, which is a mature form or derivative of the polypeptide encoded by the DNA molecule according to claim 6. 12. A pharmaceutical composition for preventing or treating Helicobacter infection in a mammal, comprising a prophylactically or therapeutically effective amount of a compound according to claim 9, 10 or 11, and a pharmaceutically acceptable diluent or A composition comprising a carrier. 13. 13. The composition of claim 12, further comprising an antibiotic, an antisecretory agent, a bismuth salt, or a combination thereof. 14. 14. The composition of claim 13, wherein the antibiotic is selected from the group consisting of amoxicillin, clarithromycin, tetracycline, metronidizole, and erythromycin. 15. 14. The composition according to claim 13, wherein the bismuth salt is selected from the group consisting of bismuth subcitrate and bismuth subsalicylate. 16. 14. The composition according to claim 13, wherein the antisecretory agent is a proton pump inhibitor. 17. 17. The composition of claim 16, wherein the proton pump inhibitor is selected from the group consisting of omeprazole, lansoprazole, and pantoprazole. 18. Antisecretory agent H 2 - is a receptor antagonist composition of claim 13. 19. H 2 - receptor antagonist ranitidine, cimetidine, famotidine, are selected from the group consisting of nizatidine and roxatidine, composition of claim 18. 20. 14. The composition of claim 13, wherein the antisecretory agent is a prostaglandin analog. twenty one. 21. The composition of claim 20, wherein the prostaglandin analog is misoprostil or enprostil. twenty two. 13. The composition according to claim 12, further comprising a prophylactically or therapeutically effective amount of a second Helicobacter polypeptide or derivative thereof. twenty three. 23. The composition of claim 22, wherein the second Helicobacter polypeptide is Helicobacter urease, a subunit or derivative thereof. twenty four. 13. The composition of claim 12, further comprising an adjuvant. twenty five. A pharmaceutical composition for preventing or treating Helicobacter infection in a mammal, comprising a prophylactically or therapeutically effective amount of the polynucleotide according to claim 1, 2 or 3, and a pharmaceutically acceptable carrier or dilution. And an agent. 26. A pharmaceutical composition for preventing or treating Helicobacter infection in a mammal, comprising a prophylactically or therapeutically effective amount of the polynucleotide of claim 5, 6, or 7, and a pharmaceutically acceptable carrier or dilution. And an agent. 27. A pharmaceutical composition for preventing or treating Helicobacter infection in a mammal, comprising a prophylactically or therapeutically effective amount of the polynucleotide according to claim 8 and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. Composition. 28. A composition comprising a viral vector, wherein the DNA molecule according to claim 4 is inserted into its genome, the DNA molecule is under conditions for expression in a mammalian cell, and the viral vector is physiologically acceptable. A composition that is mixed with a diluent or carrier to be used. 29. 29. The composition of claim 28, wherein said viral vector is a poxvirus. 30. A composition comprising a bacterial vector comprising the DNA molecule according to claim 4, wherein the bacterial vector is under conditions in which the DNA molecule is expressed, wherein the bacterial vector is mixed with a physiologically acceptable diluent or carrier. Composition. 31. The vectors are Shigella, Shimella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, and Calmette-Guerin. 31. The composition of claim 30, wherein the composition is selected from the group consisting of: 32. 26. The composition of claim 25, wherein the polynucleotide is a DNA molecule that has been inserted into a plasmid that is incapable of replicating and substantially integrating in the mammalian genome and has been placed under conditions that are expressed in mammalian cells. 33. An expression cassette comprising the DNA molecule of claim 4, wherein the DNA molecule is under conditions for expression in a prokaryotic or eukaryotic cell. 34. A method for producing a compound according to claim 9, comprising the steps of culturing prokaryotic or eukaryotic cells transformed or transfected with the expression cassette of claim 33, and recovering the compound from the cultured cells. 35. A pharmaceutical composition for preventing or treating Helicobacter infection in a mammal, comprising a prophylactically or therapeutically effective amount of an antibody that binds to the compound of claim 9, 10 or 11, and a pharmaceutically acceptable. A composition comprising a carrier or diluent.
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