JPH11506939A - Secretory leader trap cloning - Google Patents

Secretory leader trap cloning

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JPH11506939A
JPH11506939A JP9501386A JP50138696A JPH11506939A JP H11506939 A JPH11506939 A JP H11506939A JP 9501386 A JP9501386 A JP 9501386A JP 50138696 A JP50138696 A JP 50138696A JP H11506939 A JPH11506939 A JP H11506939A
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ロック，シ
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ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
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Abstract

(57)【要約】 アミノ末端シグナル配列のクローニングのための発現ベクターと方法を開示する。これらのベクターと方法は未知のシグナル配列の選択、発現、単離のための有用な手段である。また、未同定のシグナル配列は、それが細胞表面に誘導する対応する未同定の蛋白質のクローニング、同定、単離に活用できる。これらのベクターと方法の使用により未同定の蛋白質が、その蛋白質を検出する機能的な測定をすることなくクローニングできる。   (57) [Summary] Disclosed are expression vectors and methods for cloning an amino-terminal signal sequence. These vectors and methods are useful tools for selecting, expressing, and isolating unknown signal sequences. In addition, the unidentified signal sequence can be used for cloning, identifying, and isolating the corresponding unidentified protein that it induces on the cell surface. Using these vectors and methods, an unidentified protein can be cloned without a functional assay to detect the protein.

Description

【発明の詳細な説明】 分泌リーダーのトラップクローニング法 技術分野 本発明は、アミノ末端シグナル配列のクローニングのためのベクター及び方法 に関する。新規なシグナル配列の同定により、未同定の分泌型蛋白質及び膜透過 性蛋白質、特にシグナル伝達に関与する蛋白質を同定できる。 発明の背景 分泌蛋白の多くが成長因子又は細胞表面受容体の様にシグナル分子として機能 している。一般に細胞性蛋白質の１〜５％が分泌蛋白質である。成長因子は細胞 間伝達を媒介する拡散性分子である。成長因子にはインターロイキン類、血小板 由来成長因子（PDGF）、上皮細胞成長因子(EGF)、顆粒球・マクロファージ・コ ロニー刺激因子（GM-CSF）、エリスロポイエチン(EPO)、トロンボポイエチン(TP O)及びカルチトニンが含まれる。受容体には一体性（integral）膜蛋白及び可溶 性受容体がふくまれる。 これらの注目の分子の共通な特徴はそのコード領域のＮ−末端の分泌リーダー （「シグナル」）配列の存在である。このシグナル配列はde novo 合成された蛋 白質を、小胞体または細胞外へ誘導するアミノ酸をコードしている。既知シグナ ル配列のヌクレオチドの相同性が最小かまたは存在しないので、核酸ハイブリダ イゼーション法による新規のシグナル配列の分離は不可能ではないにしても困難 である。 シグナル配列の選択的クローニング（「シグナルトラッピング」 ）はK.Tashiro らによって記述されている(Science 261:600-03,1993)。この方 法は平均400 bpのcDNAを含むcDNAライブラリーを特徴とした。平均400 bpのcDNA を作成するにあたり、cDNAを超音波処理し、ランダムにcDNAを切断した。ランダ ムに切断されたcDNAは、シグナル配列が正しい方向にフレームを合わせて挿入さ れれば細胞表面でTac 融合蛋白質を発現できるベクター（内因性のシグナル配列 を欠く）に挿入された。この細胞表面Tac 融合蛋白質の存在は、抗Tac 抗体によ る免疫染色法で顕微鏡的に検出された。数回のサブプールと蛍光顕微鏡検出の後 、600 のクローンから免疫学的に活性を示す6 クローンが得られた。この6 クロ ーンのうちインタークリンαサイトカイン系の新規２種が同定された。 Tashiro らのシグナルトラップクローニングは以下に示す欠点を伴う。（１） ランダムな切断による、短いcDNA断片の制御ではない方向の定らない形成；（２ ）各クローンについての免疫染色とサブプールの多数の繰り返し；（３）クロー ニング手順での選択法の特徴の欠如。本発明による方法はこれらの欠点を解決し 、更に、分泌リーダーのトラップクローニングへの一般化され且つ改良されたア プローチをもたらす。 発明の要約 本発明の目的は、それぞれが遺伝子の５’末端を持つDNA を調製し、その５’ 末端を、第一の互いに相補的なペアのうちの第一のメンバーに連結し、これよっ て標識された５’末端を形成し；制限エンドヌクレアーゼによりDNA 分子を切断 してDNA 断片を形成し、このDNA 断片を、第一の互いに相補的なペアのもう一方 のメンバーに曝して、標識した５’末端を持つDNA をもう一方のメンバーに結合 させ、さらにDNA 断片を第一の互いに相補的なペアから分離するこ とを包含する、５’末端を持つDNA 分子の選択の方法を提供する事にある。 この発明の態様の一つにおいて、第一の互いに相捕的なペアは、ビオチン／ア ビジン・ペア、受容体／リガンド・ペア、抗体／エピトープ・ペア、センス／ア ンチセンスヌクレオチド・ペアから成るグループから選択され、アビジン／ビオ チン・ペアが好ましい。また、第一の互いに相補的なペアのうちの一のメンバー が磁性ビーズのような固相媒体に固定されることが好ましい。ほかに好ましい実 施様態として、制限エンドヌクレアーゼは４−カッターの制限酵素とする。 この発明の他の様態において、この方法はさらに、DNA 断片を分離する段階後 の更なる段階として、このDNA 断片と構造蛋白質をコードするDNA 部分を連結し て融合DNA を形成し、このとき融合DNA が発現ベクターに含まれるようにし、宿 主細胞中でこの融合DNA が発現するための他のDNA 因子に機能が発揮されるよう に連結し、発現ベクターを宿主細胞し誘導して融合DNA が発現できるようにする ことを包含する。 好ましい形態において、この構造蛋白質は成長因子の受容体であり、好ましく はMpl である。ほかの好ましい形態において、発現ベクターはpSLSV-1、pSLSV-2 、pSLSV-3 又はこの組み合わせである。他の好ましい形態において、宿主細胞は BaF3細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、FDC-P1 細胞、またはMO7e細胞で、好ましくはBaF3細胞である。 さらに本発明のほかの態様おいて、本方法は、発現宿主細胞の培養段階後の更 なる段階として、発現宿主細胞に標識した試薬を、発現宿主細胞が影響を受けず に標識した試薬がDNA 部分にコードされている構造蛋白質に結合するような条件 下で作用させ、さらに標識 試薬と結合した発現宿主細胞を分離することを包含する。好ましい形態において 、この標識試薬は蛍光標識試薬であり、分離の段階は蛍光活性化セルソーターを 用いて行う。他の好ましい形態として、宿主細胞は因子依存型宿主細胞であり、 BaF3、FDC-P1またはMO7eが好ましく、BaF3が最も好ましい。 本発明の更なる様態において、この構造蛋白質は発現宿主細胞の外表面に導か れ、第二の互いに相補的なペアの一メンバーであり、それにより、構造蛋白質と 第二の互いに相補的なペアのもう一方のメンバーとの相互反応は、構造蛋白質を 産生する発現宿主細胞を刺激し増殖させる。好ましい形態において、第二の互い に相補的なペアは受容体／リガンド・ペアであり、構造蛋白質はMpl、IL-4受容 体、EPO 受容体またはGM-CSF受容体である。他の好ましい実施形態においては、 培養の段階は、因子依存性宿主細胞の生育に必須な因子の非存在下、および第二 の互いに相補的なペアのうちのもう一方のメンバーの存在下で実施される。 本発明の他の目的は、機能が発揮されるように連結された次に示す因子、即ち 転写プロモーター、５’末端DNA 断片を挿入するためのクローニング部位をコー ドする第一DNA セグメント、リーダーを欠く成長因子受容体をコードする第二DN A セグメント、転写ターミネーターを持つ発現ベクターを提供することであり、 ここで機能を持つシグナル配列がクローニング部位に挿入されると第二DNA セグ メントと第一DNA セグメントとのin-frame連結が成長因子受容体の細胞表面での 発現をもたらし、こうした融合DNA 発現ベクターが形成され、因子依存型宿主細 胞への融合DNA 発現ベクターの導入が相補的な成長因子リガンドの存在下での宿 主細胞の増殖を可能にする。 好ましい実施形態において、クローニング部位は配列番号：２； 配列番号：３；または配列番号：４である。このほかの好ましい実施形態におい て、成長因子受容体はMpl である。 本発明の、これら及びその他の様態は、以下の詳細な説明の参照により明瞭と なるであろう。 発明の詳細な説明 本発明は、機能的クローニング法をシグナルペプチドの分泌機能に組み合わせ て、未知のシグナルペプチドの同定とクローニングのためのより改良された方法 を提供する。推定されるシグナル配列を的確に検出可能なマーカー蛋白質をコー ドする配列に連結する事により、そのマーカー蛋白質の細胞表面での発現が検出 できる。 本発明の分泌リーダートラップクローニング法及びベクターは、細胞の分泌経 路を通過する未知の因子（例えば、新規のサイトカインや成長因子など）及び未 知の細胞膜透過性分子（例えば、新規の受容体など）をコードするcDNA断片のク ローニング、同定、及び単離をするのに優利に活用できる。未知の因子や受容体 は「オーファン」（orphan）因子及び受容体とも呼ばれる。一般的にそういった オーファン蛋白質のクローニングは困難で煩雑である。しかしこれらのオーファ ン因子や受容体は、研究及び産業における細胞培養技術において、細胞生理及び 細胞代謝の研究において、因子と受容体と細胞系統の相互関係の研究において、 並びにヒトをふくむ動物への治療的介入において有利に活用されうる。 本発明書において、「分泌リーダー配列」及び「シグナル（またはシグナルペ プチド）配列」という用語は、シグナルか分泌ペプチドをコードしているDNA を 示す用語として相互交換可能に使用する。シグナル配列はリーダー配列、プレプ ロ配列、プレ配列とも呼ばれる。分泌リーダーは、成熟型のペプチド又は蛋白質 の細胞からの 分泌の指令に関与するアミノ酸配列である。より具体的には、分泌リーダーは細 胞質網様構造（分泌経路の入り口）を経るポリペプチドまたは蛋白質の転移（tr anslocation）を指令する。分泌ペプチドは疎水性アミノ酸残基により特徴付け られ、そして、典型的には（全てにおいてではない）新しく合成された蛋白質の アミノ末端に見られる。分泌ペプチドは分泌の段階で一回もしくはそれ以上の切 断により高い頻度で成熟型蛋白質から切り取られる。このような分泌ペプチドは 、それらが分泌経路を通過するときに分泌ペプチドが成熟型蛋白質から切り取ら れるプロセッシング部位を持っている。本明細書において「アミノ末端シグナル 配列」と言う用語は蛋白質のアミノ末端に存在するシグナルペプチドをコードす るDNA を示す。 本明細書において、「リーダー欠失蛋白質」と言う用語は、天然蛋白質の機能 的シグナルペプチド（または「リーダー」）が除去された分泌構造蛋白質を示す 。リーダー欠失蛋白質の取得法の一つにおいては、天然シグナルペプチドをコー ドするヌクレオチド遺伝子操作により天然シグナルペプチドが除去される。 本明細書において、「受容体」という用語は、生物活性を持つ分子（すなわち ホルモン及び成長因子を含むリガンド）に結合しリガンドの細胞上での効果を媒 介する細胞関連蛋白質を指して使用する。受容体は、シグナルの変換に典型的に 関与するリガンド結合部位とエフェクター部位をもつマルチドメイン構造により 特徴づけられる。リガンドが受容体に結合すると受容体のコンホーメーションが 変化し、エフェクター部位と細胞内のほかの分子との相互作用が惹起される。こ の相互作用は今度は、細胞の代謝に変化を起こす。受容体とリガンドの相互作用 に関連する代謝作用には、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、環状AMP の生成 の増加、細胞内カルシウムの流動、細胞膜脂質の流動、細胞付着、イノシトール 脂質の加水分 解、及びリン脂質の加水分解が含まれる。受容体は細胞膜に結合できるか、細胞 質ゾル性か又は核性であり、単量体（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベー タアドレナリン作動性受容体など）又は多量体（例えば、PDGF受容体、成長ホル モン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF 受容体、エリトスロポエチン受 容体、及びIL-6受容体など）である。 受容体は保存されている構造の特徴によりファミリーとスーパーファミリーに 分類される。一般的に、生物が新しい生体的機能を獲得する選択圧のもとで、既 存の受容体遺伝子の倍数化から新しい受容体ファミリーが出現して多様な遺伝子 ファミリーの存在を引き起こすと信じられる。 最もよく知られている受容体スーパーファミリーのうちの二つは、サイトカイ ン受容体スーパーファミリー及び７−膜透過性ドメイン（7-TMD）受容体スーパ ーファミリーである。表１にこれら三つの受容体スーパーファミリーの一部を示 す。 多くのサイトカイン受容体は、一定の構造上の特徴に基づき、５個のファミリ ーの１つに分類することができる。５個の全てのファミリーは、単一の膜貫通配 列により分離される、細胞外リガンド結合ドメインと細胞内ドメインの存在によ り特徴づけられる。サイトカイン受容体の構造はUrdal（Ann.Reports med．Chem ．26:221-28，1991）と Cosman,（Cytokine 5: 95-106，1993）により概説され ている。 7-TMD 受容体は大きな遺伝子スーパーファミリーによりコードされた機能的に 多様なグループである。この受容体スーパーファミリーの二つの特徴点は７個の 螺旋状膜貫通ドメインと１個の細胞質ドメインの存在であり、このうち後者は受 容体のＧ蛋白への結合のために役立つと信じられる。このスーパーファミリーは Lamehら（Ph arm Res．7:1213-21，1990）Hagrave、（Curr．Opin.Struct.Biol.1:575-81 199 1）、Probst ら（DNA and Cell Biol．11:1-20，1992）により概説されている。 また受容体は、共通の機能によっても分類される。表２に機能による分類の受 容体ファミリーの一覧を示す。各チロシンキナーゼファミリーについてはプロト タイプの受容体を表２に示す。なお以下の記述を参照のこと。Ullrich ら （Nat ure 308:418-25,1984；Nature 313:756-61，1985）Yadenら（Nature 323:226-32 ,1986）Hiraiら（Science 238:1717-20,1987）Sanchez-madridら（Proc.Natl.Ac ad.Sci．USA 79:7489-93,1982）Takeichi ら（Science 251:1451-55,1991；Ann. Rev.Biochem．59:237-52,1990）Cunningham ら（Science 236:799-806,1987） 多くのオーファン受容体が同定されており、細胞の分子生物学の解明につれよ り多くが発見される事が期待される。既知のオーファン受容体には、核性受容体 であるCOUP-TF1/EAR３、COPU-TF2/ARP-1、EAR-1、EAR-2、TR-2、PPAR1、HNF-4、 ERR-1、ERR-2、NGFI-B/Nur77、ELP/SF-1、そして、ここに開示する研究に先立っ てMpl （Parkerらの概説、Curr．Opin.Cell Biol．5:499-504,1993; power ら Tips 13 :318-23,1992を参照のこと）を含む。EPH ファミリーにおいて多くのオーファン 受容体が同定されている（Hirai 上記、引用により本明細書に組み入れる）。HE R3及びHER4（Plowman らProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1746-50,1993、引用によ り本明細書に組み入れる）は上皮細胞成長因子受容体ファミリーのオーファン受 容体で、多くの腫瘍において過度に発現されるとみられる。ILA は新しく同定さ れた、ヒト神経細胞成長因子／腫瘍壊死因子受容体ファミリーの一つである（Sc hwarz らGene 134:295-98,1993、引用により本明細書に組み入れる）。インスリ ン受容体関連受容体（IRRR）と呼ばれるインスリン受容体ファミリーのオーファ ン受容体はScher らによって明らかにされている（J.Biol.Chem．264:14606-08, 1989、引用により本明細書に組み入れる）。IRRRは膜貫通チロシンキナーゼであ る。加えて、チロシンキナーゼタイプのオーファン受容体の一つがショウジョウ バエから発見されている（Perrimonによる総説、Curr.Opin.Cell.Biol．6:260-6 6,1994、引用により本明細書に組み入れる）。ショウジョウバエのオーファン受 容体は生化学的分析と同様に遺伝学的分析の機会を与えてくれる点で興味深い。 ショウジョウバエのリガンドの同定及びそれに続く相同性によるクローニングに よって、ショウジョウバエのリガンドに対する、ヒトあるいは他の生物の対応物 を取得する方法がもたらされる。 本明細書において、「成長因子」という用語は、細胞の増殖を刺激するポリペ プチドを意味し、その活性は細胞表面受容体により介在される。成長因子の例に は、インターロイキン類及びコロニー刺激因子類が含まれる。 本明細書において、「発現ベクター」という用語は、宿主細胞内でのその発現 及び維持をもたらす様な他のDNA 配列に機能的に連結 された注目の遺伝子を含んで成る一本鎖あるいは二本鎖の、線状あるいは環状の DNA 分子を示す。発現ベクターはプラスミドまたはウィルス由来物であるかある いはプラスミドとウィルスの両者の因子をもつ。一般的に構造遺伝子をコードす るDNA セグメントは、１又は複数の複生起点、１又は複数の選択マーカー、エン ハンサー、スプライシングのシグナル又は他の因子をさらに有する発現ベクター 中で、発現調節配列に連結される。本発明の好ましい形態において、構造遺伝子 は、細胞表面に正常に移送されるリーダーを欠く蛋白質、好ましくは成長因子受 容体である。特に好ましい形態においては、リーダーを欠く蛋白質はMpl である 。発現ベクターは常法によって宿主細胞に挿入される。発現ベクターの構築法と 培養細胞へのトランスフェクション法は当業者において既知である。例えば、Le vinsonらU.S.Patent No.4,713,339、Hagen らU.S.Patent No.4,784,950、Palmit erらU.S.patent No.4,579,821、Ringold U.S.Patent No.4,656,134 を参照のこ と。遺伝子工学技術、因子依存型細胞株、細胞培養技術の明細については、参考 資料にその全文を含む係属出願USSN 08/250,859 を参照のこと。引用によりこれ らの全文を本明細書に組み入れる。 一般に、未知蛋白質の標準的クローニングは、その蛋白質を検出するための特 異的、機能的な測定法を開発し、予測される生体活性のある蛋白質または膨大な cNDAライブラリーの発現産物の活性を測定することを伴う。しかしながら、新規 の因子や蛋白質のクローニングへのこれら従来のアプローチには避けがたい限界 がある。（１）実施される測定の感度および／または特異性は未知の蛋白質を検 出するには充分とは言えない。（２）挿入した未知蛋白質が必ず存在するか、検 出可能レベルまで発現されていなくてはならない。（３）複雑な混合物中のプロ テアーゼ及び、阻害物質及び、アンタゴ ニストの存在が、期待される蛋白質の存在をマスクする可能性がある。（４）も し未知の蛋白質が大きく、そして／またはその生物活性のために非連続性のドメ インが必要な場合、生物学的測定は、全長より短い蛋白質産物の発現を検出でき ないと思われる。（５）新規の因子や蛋白質の機能的な測定法は存在しないと思 われる。（６）その機能が未知の蛋白質はクローニングできない。 請求の範囲に記載されている発明の方法を用いれば、それを新規の未知蛋白質 に活用することで、従来のクローニングアプローチの短所が克服できると思われ る。 A. ５’シグナル配列cDNAの濃縮 請求の範囲に記載されているシグナルトラップクローニング法はN 末端（即ち ５’末端）コード配列の濃縮を包含する。本発明において、全長の、オリゴｄＴ プラムcDNAライブラリーは、ビオチン標識５’PCR リンカー（「５’PCR プライ マー」とも呼ばれる）の連結により５’末端がビオチン標識されている。 ここでビオチンは例示的に、互いに相補的なペアの一方として使用されている 。このような、互いに相補的なペアには、受容体／リガンド・ペア、抗体／抗原 （またはハプテン、またはエピトープ）・ペア、センス／アンチセンスヌクレオ チド・ペア、ビオチン／アビジン（またはストレプトアビジン）・ペア及びその ほか同種類のものを含む。本発明での使用については、互いに相補的なペアは好 ましくは＜１０-9Ｍの結合親和性を持つ。 ビオチン標識した５’PCR リンカーは所定の制限酵素認識部位を含有する。好 ましい形態において、ビオチン標識５’PCR リンカーはEcoRＩ認識部位を含有す る。ビオチン標識cDNAはプールに分けられ、そして各プールは「4-カッター」の 制限酵素のパネルの一つで切断されて短鎖のcDNA断片が生ずる。ここでは「4-カ ッター制限酵 素」という用語は4 塩基対（4 bp）の認識部位を持つ制限酵素を意味する。平均 的には、4-カッター制限酵素はcDNAをおよそ250 ｂｐごとに切断する。多くの4- カッター制限酵素が市販品にて入手できる。代表的な4-カッター制限酵素の一覧 を表３に示す。 ビオチン標識５’末端の断片は固相マトリクスに固定したアビジンの使用によ り単離される。好ましい実施形態においては、ストレプトアビジン結合磁性粒子 を使用する。アビジンにより捕捉された５’断片を含有する固相マトリクスは洗 浄され、そして３’PCR リンカーが、断片の4-カッターにより生じた付着端によ り断片に連結される。好ましい実施形態において、３’PCR リンカーは所定の制 限酵素認識部位を含有し、特に XhoＩの認識部位であることが好ましい。次に、 捕捉されたcDNA断片は、５’および３’PCR リンカー上に存在する制限酵素認識 部位により固相マトリクスから離される。そして、この５’濃縮されたcDNA調製 物はシグナル配列ライブラリーの構築に使用される。あるいは、捕捉したcDNAの 量が不足している場合は、シグナル配列ライブラリーの構築に先立ち、５’およ び３’PCR プライマーによるPCR で増幅することができる。他の核酸増幅法は当 業界において周知であり（例えばKwohら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-77, 1989；Van Gelderら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1663-67,1990；Fahy ら、PCR Meth.Appl．1:25-33，1991；Kievitis ら、J.Virol.Meth．35:273-86,1991を参 照のこと。）、本実施に使用できる。 本発明の５’シグナル配列cDNAの濃縮法は次に示す長所を持つ。第一に、この 手法は、出発cDNAの量に依存して、５’cDNA断片の直接クローニングまたはPCR 増幅／クローニングに順応できる。第二に、4-カッター制限酵素のパネルによる 全長の配列の消化は、ランダム切断法に比べて、断片の生成を調節できる。第三 に、アビジンがビオチン標識５’cDNAを捕捉することにより、天然のN 末端コー ドcDNAが充分濃縮できる。第四に、cDNAを取得した4-カッター制限酵素消化物を 同定することにより、５’末端が濃縮されたcDNA断片の特異的4-カッター制限酵 素による末端を適当な３’リンカーと高効率で連結できる。第五に、cDNA断片に 取り付けられた既知の５’リンカー及び３’−リンカーは適当なベクターへの指 向性のクローニングを可能にする。第六に、捕捉されたcDNAのPCR による増幅を 利用すれば、捕捉されたcDNAの恒久的なコピーが固相にとどまる。この恒久的な コピーはのちにPCR の鋳型として使用できる。 B. シグナル配列cDNAの検出／選択 既に述べたとおり、tashiro らがシグナル配列トラップクローニングに用いた 免疫染色法は煩雑であり、いくつかの選択機能を欠く。請求の範囲に記載された 本発明はシグナル配列cDNAのクローニングに有利に使用できる、検出／選択に関 する二つの改良を提供する。 両法において、推定されるシグナル配列cDNAを、管理された、特 異的な手法で、リーダーを欠く蛋白質のコード配列を持つ発現ベクターに挿入す る。この発現ベクター調製物は目的に適する宿主細胞に導入され、発現宿主細胞 を形成する。発現宿主細胞は、細胞の増殖に適する条件であって、リーダーを欠 く蛋白質の遺伝子がそのシグナル配列に機能的に連結された場合に細胞表面での 発現を許容する条件で培養される。機能的シグナル配列cDNAが発現ベクターに正 確に挿入されれば、前述のリーダーを欠く蛋白質（「マーカー蛋白質」）は発現 され、発現宿主細胞の表面に誘導される。 第一法では、発現宿主細胞を、細胞表面のマーカー蛋白質が検出に十分になる までの時間培養する。これらの細胞を、(I) 特異的にマーカー蛋白質に結合し、 (ii)検出可能な標識により標識された試薬と反応させる。この目的に適する試薬 には、抗体、リガンド、可溶性受容体とそれに類するものがある。使用に適する 検出可能な標識には、蛍光、蛍光クエンチング、染料、磁性標識及びそれに類す るものがある。加えて、結合する標的物の光散乱特性を変化させる様な標識が使 用に適する。本発明において、好ましい試薬は蛍光標識された抗−マーカー蛋白 質抗体である。次に、発現宿主細胞は、細胞表面に結合した標識／試薬の存否に より分別される。従って、一段階だけで、機能的シグナル配列を持つ発現宿主細 胞が、機能的シグナル配列を欠く集団から分離される。好ましい様態においては 、細胞ごとの試験を可能にする自動装置（例えば、フローサイトメーター）が細 胞表面でマーカー蛋白質を発現した発現宿主細胞の分別／選択に使用される。特 に好ましい様態においては、蛍光活性化フローサイトメーターが、機能的シグナ ル配列を持つ細胞の分離に使用される。 第二法では、生物学的選択手法が使われる。この方法の原型では、発現ベクタ ーにコードされた、リーダーを欠く蛋白質はサイトカ イン受容体または成長因子受容体である。そのような受容体が因子依存型細胞株 （「親細胞」）に導入された場合、(I) 受容体の対応するサイトカイン又は成長 因子の存在下、及び(ii)導入前の細胞株が依存している因子の非存在下において 、細胞表面での受容体の発現が細胞増殖を可能にする。 従って、リーダーを欠く蛋白質及び推定上のシグナル配列cNDNA（上記の第一 法の記述を参照のこと）を含有する発現ベクター調製物は因子依存型の親宿主細 胞に導入され、因子依存型発現宿主細胞が形成される。この因子依存型の発現宿 主細胞は親細胞の増殖に必要な因子の存在下で培養される。加えて、選択された 培養条件が、因子依存型発現宿主細胞の生育を促し、そしてリーダーを欠く蛋白 質が、それ自体のシグナル配列に機能的に連結されていれば、リーダーを欠く蛋 白質の細胞表面で発現を可能にする。 因子依存型の発現宿主細胞は、機能的シグナル配列を持つ細胞の表面でのリー ダーを欠く蛋白質の発現を許容するのに十分な期間培養される。この後、因子依 存型の発現宿主細胞は、選択のための条件：(I)親細胞の増殖に必要な因子の非 存在下、(ii)細胞表面で該蛋白質（もとはリーダーを欠く）を発現する細胞の増 殖を可能にする分子の存在下、で培養される。この選択条件で培養を続けること で、機能的シグナル配列を持つ細胞だけが生き残る。 このたび開示した方法を用いてクローニング、同定及び、単離をされた分泌リ ーダーは、研究及び製造の手段として活用できる代替的な、および／または優れ た分泌リーダーを提供する。原核生物、酵母、菌類、昆虫またはほ乳類の分泌リ ーダーがここに記述された手法の利用により発見できる。例えば、これらの分泌 リーダーは分泌の効率と特異性の範囲を示すものである。新規の宿主細胞が入手 可能になれば、これらの方法は、そのような宿主細胞における異種 性蛋白質の発現のために適する発現ベクターの作成に活用できる、１のまたはそ れ以上の分泌リーダーを同定するのに使用できる。比較的に性質が明確でない発 現宿主細胞を使用する場合、適切な生物学的検定法の無い分泌リーダーの同定の ための方法は特に有効な手段となり得る。 この方法の、より詳細な記述を以下に示す。 １．機能的シグナルシグナル配列cDNAの自動的選択 原型の手順においては、第一の選択の方法は自動的細胞分別を用い、機能的シ グナル配列の挿入により検出可能な細胞表面蛋白質質を発現するクローンを単離 する。一つの実施形態において、推測上のシグナル配列cDNAをもつ核酸断片の複 雑な混合物は、その内因性のリーダー（またはシグナル配列）に連結すれば通常 は細胞表面に輸送される、リーダーを欠く構造蛋白質質をコードする、適当なベ クター中のヌクレオチド上流に指向性を持ってクローンされる。 ここでの例示的な構造蛋白質質（即ち「マーカー蛋白質」）はトロンボポエチ ン受容体（即ち、Mpl）である。本発明においてマーカー蛋白質として使用する にふさわしいその他の受容体は、（１）「独立性の」（即ち、付加的なある決ま ったサブユニットの存在無しに機能し／細胞を増殖させる）受容体、及び（２） 独立の、関連を持たない遺伝子に、細胞の増殖の為にコードされた、１かそれ以 上のサブユニットの存在を必要とする受容体である。少なくとも一つの付加的な サブユニットを必要とする受容体の例はIL-6、IL-3、IL-4である。当業者は、（ １）内因性のシグナルペプチドに通常は連結された、（２）細胞表面に発現し、 そして（３）標識試薬に安定的に結合し、検出される蛋白質は、マーカーもしく は構造蛋白質として使用できることを認識するであろう。当業者はさらに、選択 されたマーカー蛋白質は他者より長いN-末端改変の断片を受け入れ ることを認識するであろう。 例示的な選択ベクターはリーダーを欠くMpl コード領域を含有する。リーダー を欠くMpl のcDNAは通常法（例えば係属出願特許USSN08/250,859を参照のこと） を用いた逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により単離された。示したと おり、例示的な発現ベクターは、推定上のシグナル配列とMpl をコードする遺伝 子の間の連結部でXho 認識部位がMpl に関して３通りのフレーム（「Xho（１， ２，３フレーム）」）を持つこと以外では同一である３種のベクターを象徴する 。この連結部に位置するプライマー（３’プライマー）は内因性の構造蛋白質シ グナル配列が増幅しないように設計されている。さらに推定上のシグナル配列の 上流連結部に位置するPCR プライマー（５’プライマー）も内因性の構造蛋白質 シグナル配列が増幅しないように設計されている。従って、もし機能的シグナル 配列cDNAがEcoRＩ-Xho認識部位に挿入されなければ、構造蛋白質は発現されるこ とも細胞表面に移送されることもない。BaF3からのゲノムDNA またはcDNAが鋳型 として使われる。ゲノムDNA は単離が簡便で迅速だが、cDNAはより単純な構造で より人的影響が少ない。 適当なベクターに挿入された推定上のシグナル配列cDNAのライブラリーは、対 象の構造蛋白質の発現が可能な宿主細胞に導入される。例示的な宿主細胞には原 核細胞及び真核細胞、さらに具体的には哺乳動物、酵母、昆虫細胞を含む。発現 ベクターの宿主細胞への導入とその発現細胞の培養の後、これらの細胞に標識し た検出可能な試薬を反応させる。これらの標識試薬は細胞表面で発現したマーカ ー蛋白質に結合できる。好ましい標識試薬は蛍光標識した抗体で、特にフルオロ セイン・イソチオシアネート（FITC）標識抗Mpl モノクローナル抗体が好ましい 。 機能的シグナル配列が正確に発現ベクターに挿入されると、マー カー蛋白質が細胞表面で発現される。適当な、検出可能な標識試薬を培養された 発現宿主と反応させ、適当時間の後、細胞は結合していない標識試薬から分離さ れる。この「洗浄した」細胞を適当な細胞分別の操作下に置けば、機能的シグナ ル配列をもつ発現宿主のみが検出され選択される。例えば、蛍光標識細胞分別は 、機能的シグナル配列を持つ細胞をそれを持たない細胞群から素早く、一段階で 分離することを可能にする。 検出され、分別（選択）された発現宿主細胞から、対象のシグナル配列cDNAが クローニング手法で、あるいはen masseな手法により単離される。クローンの単 離のため、機能的シグナル配列をもつ発現宿主細胞をクローニングでき、増幅で き、そして、またはシグナル配列cDNAをプローブとして又はPCR プライマーとし て使用して対象のcDNAが配列解析できる量になるまで増幅する。en masseな手法 では、シグナル配列DNA の全てを、機能的シグナル配列をもつ全ての発現宿主細 胞群から単離することができる。次に、全シグナルトラップcDNA調製物は、PCR のようなヌクレオチド配列増幅技術の利用して得られる。 対象のcDNAの混合物が増幅された後、ひとつの選択としては、取得されたcDNA を発現ベクターに再クローニングして更に濃縮を繰り返す事ができる。濃縮の後 、各cDNAは配列解析のために単離できる。他の選択としては、増幅されたcDNAの 混合物を、対象の全長cDNAを作成するためのセンスプライマーとして使用できる 。そして、この全長cDNAのライブラリーは、均一cDNAを得るためのクローン単離 に使用することができる。クローニングされた各cDNAは配列決定し、発現させ、 そして特性決定する事ができる。 利用可能な配列データベース（例えばGenbank、EMBL）に含まれる既知のシグ ナル配列と同一性又は有意な相同性を示さないシグナ ル配列は、新規の分泌蛋白質をコードするcDNAの断片と見られる。従ってこのよ うな新規のシグナル配列は、その内因性の全長構造蛋白質コード配列を単離する ためのハイブリダイゼーション用プローブもしくはPCR のプライマーとして利用 することができる。この技術の活用により、サイトカイン、成長因子及び膜透貫 通蛋白質のような新規の分泌蛋白質を、その蛋白質に特異的な生物学的検出法を あらかじめ開発しておく必要なくクローニング及び同定することができよう。 ２．生物学的選択 機能的シグナル配列の選択法は生物学的選択のスキームを包括する。その生物 学的選択の手順は、高価で特殊な機材（例えばフローサイトメーター）を必要と せず一般的な実験設備で好都合に実施することができるため、自動の細胞選別／ 選択への魅力ある選択肢である。 例示的な手順として、シグナル配列cDNAライブラリーが発現ベクターに挿入さ れ（既にＢ．１で記述）、この発現ベクターは因子依存型細胞株に導入される。 この発現ベクターはリーダーを欠く構造蛋白質をコードしている。この生物学的 選択法に適する構造蛋白質は、細胞内でのシグナル伝達を媒介できる細胞表面受 容体を含む。このシグナルの伝達は直接または間接的に細胞の増殖を引き起こす ものである事が好ましい。好ましい構造蛋白質は、Mpl、IL-4受容体、EPO 受容 体、GM-CSF受容体及びこれらの類似物を含む。 これに関し、適当な因子依存型細胞株には成長因子依存型骨髄細胞、リンパ幹 細胞が含まれる。これらは、分化した血球をつくり、骨髄、脾臓、胎児肝のよう な造血組織にみられる細胞である。骨髄性受容体、リンパ性受容体はまた、動物 をサイトカイン処理した後の末梢血液にみられる。検出可能な受容体を発現でき るようにトラ ンスフェクトできる成長因子依存型細胞株は、BsF3（PalaciostoとSteinmetz，C ell 41:727-34,1985; Mathey-Prevot らMol.Cell.Biol.6:4133-35,1986）、FDC- P1（Hepll ら、Blood 64:786-90,1984）、及びMO7e（Kiss Leukenia 7:235-40,1 993）を含む。追加的な成長因子依存型細胞株は、当業界において周知で入手可 能であり、例えば、Greenberger らのProc.Natl.Acsd.Sci．USA 80:2931-35,198 3、DexterらのJ.Exp.Med．152:1036-47,1980、Greenberger らのVirology 105:4 25-35,1980に記述されている。更に、成長因子依存型細胞株は公表されている方 法により作成することができる（例えばGreenberger らLeukemia Res．8:363-75 ,1984、Dexterら、in Baum ら、Experimental Hematology Today,8th ann.Mtg.I nt.soc.Exp.Hematol．1979,145-56,1980）。 本発明において、好ましい因子依存型細胞株は外因性のDNA を素早く取り込み 、そして既知のサブユニットのレパートリーを持つ。当業者は、いくつかの因子 依存型細胞株を用いて、使用されるべき選択ベクターでの好ましいマーカー因子 として特定の細胞表面発現構造蛋白質を選択されることができることを認識する であろう。例えばBaF3宿主細胞では、リーダーを欠くIL-4、EPO、GM-CSF受容体 のコード領域が、選択ベクターのMpl コード領域のかわりに置換され得る。BaF3 宿主細胞をチロシンキナーゼ受容体ファミリーのひとつをコードしたベクターに 組み合わせる場合、EGF 受容体構造遺伝子は適するが、Tyro3 受容体構造遺伝子 は適さない（例えば、Stitt ら、Cell 80:661-70,1995 を参照のこと）。一般的 に、チロシンキナーゼ受容体ファミリーの選択されたメンバーを提案され宿主細 胞中の適当なアクセサリーサブユニットに「組み合わせ」すれば、ここに示した 発現ベクターのマーカー構造遺伝子としての利用に適する。 因子依存型発現宿主細胞表面にMpl を向けることができる機能性シグナル配列 をコードする挿入されたcDNA断片は、この宿主細胞にトロンボポエチン(TPO)依 存性を与えるであろう。即ち、因子依存型の親細胞の増殖に必要な因子が除かれ ると、細胞表面にMpl を発現する因子依存型の発現宿主細胞はTPO の存在下での み、生存し増殖することができる。こうして機能的シグナル配列をコードしたcD NAは、要求される因子は存在しないがTPO の存在下で因子依存型発現細胞を生育 させることにより選択され得る。好ましい態様において、因子依存型細胞株はBa F3であり、因子依存型の親細胞の増殖に必須の因子はIL-3である。機能的シグナ ル配列を持たない因子依存型発現細胞は細胞表面でMpl を発現できない。したが って、親細胞の生育に必須の因子が存在しなければ、機能的シグナル配列を持た ない因子依存型宿主細胞はTPO の存在下での培養において生存しない。対象の機 能的シグナル配列cDNAは、Ｂ．２で記述したように、蛍光活性化フローサイトメ トリーで選択された最後まで生存した細胞因子依存型発現細胞の集団から、クロ ーニング手法によりまたはen masseに単離される。 上記の細胞分別法、生物学的選択法のいずれも、機能的シグナル配列コード領 域の最小の選抜作業での濃縮を可能にする。 本発明を、次の非、制限的実施例により更に解説する。実施例 実施例１．選択ベクターの構築 選択ベクター系は、推測上のシグナル配列をコードする、EcoRＩ/XhoＩのcDNA の短い断片の指向性クローニングを可能にするために構築された。簡潔に記述す れば、プラスミドpHZ-1 は、MT-1プロモーターの下流の XhoＩ認識部位で線状に された。プラスミドpHZ-1 は、in vitroで転写されたmRNAを、哺乳動物細胞やカ エル卵母細胞 における翻訳によって蛋白質を発現させるのに利用できる発現ベクターである。 ｐHZ-1の発現ユニットは、マウス・メタロチオネイン−１プロモーター、コード 配列を挿入するためのユニーク酵素認識部位を持つマルチクローニングバンクに 隣り合うバクテリオファージT7プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター 、及びバクテリオファージT7ターミネーターを持つ。加えて、pHZ-1 はE.coliの 複製開始点、細菌性ベータ・ラクタマーゼ遺伝子、SV40のプロモーターと開始点 をもつ哺乳類選択マーカー発現ユニット、ネオマイシン耐性遺伝子、及びSV40転 写ターミネーターを持つ。 XhoＩ認識部位に、MT-1プロモーターと同じ指向で、３個のリーディングフレ ームのそれぞれに成熟ネズミMpl をコードする XhoＩ/SalＩcDNA断片がクローン された。このネズミMpl コード配列は、例えば、Skoda らのEMBO J．12:2645-53 ,1993、Viron らのOncogene 8:2607-15,1993 に記載されている。リーダーを欠 くMpl をコードするcDNAは、(I)SalＩの認識部位を含有するアンチセンスプライ マー（GAG GAG AAG GTC GAC TCA AGG CTG CCA ATA GCT TAG；SalＩ 認識部位は下線部；配列番号１）、及び(ii)Mpl のコード配列に関する３個のリ ーディングフレームのひとつに XhoＩ認識部位をもつ３個のセンスプライマーの それぞれ、を用い、マウスMpl 全長cDNA鋳型からPCR 増幅された。できあがった プラスミドはpSLSV-1、pSLSV-2，pSLSV-3と命名され、これらは、EcoRＩと Xho Ｉとの消化によりリーダー配列のクローニングを容易にする。 pSLSV-1、pSLSV-2 及びpSLSV-3 のクローニング領域の配列は以下に示す通り である。 PSLSV-1（フレーム１）： PSLSV-2（フレーム２） PSLSV-3（フレーム３） フレーム１−３の下線部分は完全な又は部分的 XhoＩの認識部位を示す。「(T )」は天然のMpl シグナルペプチド切断部位にあるアデニンに代わるチミンを示 す。 実施例２．選択ベクターに断片サイズ許容範囲 ヒトGM-CSFの様々な長さの成熟型配列のみならず、huGM-CSFのシグナル配列を コードする多様なサイズのcDNA（Wongら Science 228:810-15,1985）が、pSVSL- 1、-2及び-3のEcoRＩ/XhoＩクローニング部位に挿入された。詳しく述べれば、 以下の挿入物が適当なpSLSV 発現ベクターにフレームを合わせて入れられた：（ １）1-66 huGM-CSF（挿入物は、17アミノ酸のシグナルペプチドと、そのほかの 49アミノ酸をコードする）、（２）1-133 huGM-CSF(挿入物は、17アミノ酸のシ グナルペプチドとそのほかの116 アミノ酸をコードする)、（３）1-17 huGM-SC F（挿入物は、17アミノ酸のシグナルペプチドのみをコードする）。陰性対照の 挿入は次のものを含有した：（ａ）18-116 huGM-SCF（挿入物は、シグナルペプ チドを越えた116 アミノ酸をコードするが、ただしシグナルペプチドはコードし ない）、（ｂ）18-66 huGM-SCF(挿入物は、シグナルペプチドを越えた66アミノ 酸をコードするが、ただしシグナルペプチドはコード しない)。そのほかに、ATG（Met）コドンをリーダーを欠くMpl コード領域の隣 りに挿入し、シグナルペプチドの非存在下ではMpl が分泌されないことをしめす 陰性対照を設けた。 これらのプラスミドは、RPMI培地中のIL-3依存型BaF3細胞に電気穿孔法でトラ ンスフェクトされ、そしてIL-3の存在下で１０5細胞／mlで一昼夜培養した（５ ％WEHI調製培地）。第１日に、トランスフェクトされたBaF3細胞は500 細胞／穴 でマイクロタイタープレートに移され、G418と組換えTPO(100単位/ml)の存在下 で培養された。G418は、pHZ-1 プラスミド（ネオマイシン耐性）を持つ形質転換 体を選択する。次に示すDNA 断片がpHZ-1 ベクターに挿入されている場合、生存 するクローンが見られた：1-66 huGM-CS、1-133 FhuGM-CSF、及び1-17 huGM-C SF。ほかの全ての構築物は、生存可能な、トランスフェクトされたBaF3細胞を作 らなかった。従って、機能的な異種性のhuGM-CSFシグナル配列を持つcDNAのpSLV L-1、-2、及び／または-3のEcoRＩ/XhoＩのクローニング部位へのフレームを合 わせた挿入は、トランスフェクトされたBaF3細胞集団をトロンボポエチン生育依 存型にした。更に、これらの発現ベクターは、huGM-CSFシグナルペプチドの末端 を越えて100 以上のアミノ酸をコードする追加のヌクレオチドを挿入できる許容 性を持った。 この操作手順の変更態様には、（ｉ）トランスフェクト体のTPO 選択への切り 替え前に先立っての、形質転換体のIL-3存在下での１，２または４日間の生育、 及び（ii）組換えTPO の濃度と種類の検討、を含む。（ｉ）に関しては、TPO 依 存型クローンの生存は、記述した操作を第４日に行うより、第１日か第２日に行 うほうが良好であった。（ii）に関しては、TPO 濃度の上昇は本法の感度を上昇 せしめ、より多くの生存株の検出をもたらすとみられた。 IL-3救済の実験を実施した。トランスフェクトした細胞をプール の状態でIL-3の存在下にて一昼夜培養した。第１日に細胞を洗浄し、TPO 及びG4 18存在下でマイクロタイタープレートに移した。第２、４または７日に、IL-3を ウェルに添加した（「IL-3救済」）。第２及び７日のIL-3救済でクローンを観察 した。 実施例３．選択ベクターと生物学的選択 ストレプトアビジン親和性クロマトグラフィーによって５’cDNA断片を濃縮し た後、EcoRＩにする消化によりcDNA断片を固相から放出させる。分離したcDNAの XhoＩによる消化により分泌トラップライブラリーを構築し、そして等モル量の 、pSLSV-１，pSLSV-２及びpSLSV-３のEcoRＩ/XhoＩ消化物から成るベクター調製 物に指向性にクローンされる。あるいは、取得したcDNA断片の量が限られている 場合は、これらを、選択ベクターへのクローニングに先だって、５’及び３’プ ライマーによるPCR で増幅することができる。分泌ライブラリーをIL-3依存型Ba F3細胞にトランスフェクトした後、この細胞を、G418及びトロンボポエチンが存 在し、IL-3が存在しない条件下で培養する。Mpl は、BaF3細胞表面で発現されれ ば増殖の経路に組み込まれ、そのリガンドであるトロンボポエチンの存在下で宿 主細胞は他の外因性の成長因子（例えば、IL-3）から独立した生育を示す。生存 できた細胞から、機能的な分泌配列が、細胞のmRNAからのRT-PCRまたは細胞ゲノ ムDNA からのPCR により、ベクター配列に対する５’センスプライマー及びベク ターの XhoＩ認識部位をまたぐ３’アンチセンスプライマーの使用により、単離 される。分泌リーダー配列のPCR による単離は、単離された細胞のクローンまた は、en massePCR の細胞群の使用により実施できる。分泌リーダー配列は、BsF3 細胞における更なる濃縮のための選択ベクターにクローンされ得る。 分泌配列が由来するところの全長cDNAは、分泌配列に対して合成 された５’センスプライマーと、オリゴdT-cDNA 合成プライマーに結合されたア ンカー配列に向けられた３’アンチセンスプライマーと用いて、オリゴdTのプラ イムのcDNAライブラリーからPCR 法により単離され得る。あるいは、完全なシグ ナル配列は、全長のcDNAを一括的に増幅するセンスプライマーとして使用される 。 前述より、本発明の特定な態様を例示を目的として記述したが、様々な変更を この発明の精神および範囲から逸脱することなく実施することができると認める ものである。従って、本発明は添付された請求の範囲以外で制限を受けることは ない。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Secretory leader trap cloning Technical field   The present invention relates to vectors and methods for cloning amino-terminal signal sequences. About. Unidentified secreted proteins and transmembrane transduction through identification of novel signal sequences Sex proteins, particularly those involved in signal transduction, can be identified. Background of the Invention   Many secreted proteins function as signal molecules, such as growth factors or cell surface receptors doing. Generally, 1 to 5% of cellular proteins are secreted proteins. Growth factors are cells It is a diffusible molecule that mediates intercellular communication. Growth factors include interleukins, platelets Derived growth factor (PDGF), epidermal growth factor (EGF), granulocytes, macrophages, Ronny stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TP O) and calcitonin. The receptor has integral membrane proteins and soluble Sex receptors are included.   A common feature of these molecules of interest is the secretory leader at the N-terminus of the coding region. ("Signal") sequence presence. This signal sequence contains the de novo synthesized protein. Encodes amino acids that direct white matter out of the endoplasmic reticulum or extracellularly. Known Signa Nucleic acid hybrids with minimal or no nucleotide sequence homology Separation of new signal sequences by the method of isolation is difficult, if not impossible It is.   Selective cloning of signal sequence ("signal trapping" ) Are described by K. Tashiro et al. (Science 261: 600-03, 1993). This one The method featured a cDNA library containing an average of 400 bp of cDNA. Average 400 bp cDNA In preparing, the cDNA was sonicated to randomly cut the cDNA. Landa The cleaved cDNA is inserted with the signal sequence aligned in frame with the correct orientation. A vector capable of expressing the Tac fusion protein on the cell surface (endogenous signal sequence Lacking) was inserted. The presence of this cell surface Tac fusion protein was determined by anti-Tac antibody. Detected microscopically by immunostaining. After several subpools and fluorescence microscopy detection Out of 600 clones, 6 immunologically active clones were obtained. This 6 black Of the intercrine alpha cytokine system were identified.   The signal trap cloning of Tashiro et al. Has the following disadvantages. (1) Uncontrolled formation of short cDNA fragments by random cleavage; (2 ) Multiple repeats of immunostaining and subpools for each clone; Of features of the selection method in the training procedure. The method according to the invention overcomes these disadvantages. And a generalized and improved approach to trap cloning of secretory leaders. Bring the approach. Summary of the Invention   It is an object of the present invention to prepare DNA, each having the 5 'end of a gene, The ends are ligated to a first member of a first mutually complementary pair, thereby To form a labeled 5 'end; cleavage of the DNA molecule with a restriction endonuclease To form a DNA fragment, which is then replaced with the other of the first complementary pair. Exposure to a member of the group to bind the labeled 5'-end DNA to the other member And separate the DNA fragment from the first complementary pair. An object of the present invention is to provide a method for selecting a DNA molecule having a 5 'end, which includes the following.   In one embodiment of the invention, the first mutually complementary pair is biotin / a Vidin pairs, receptor / ligand pairs, antibody / epitope pairs, sense / a Avidin / biotin selected from the group consisting of antisense nucleotide pairs Chin pairs are preferred. A member of a first mutually complementary pair Is preferably immobilized on a solid phase medium such as magnetic beads. More favorable fruit In an embodiment, the restriction endonuclease is a 4-cutter restriction enzyme.   In another embodiment of the present invention, the method further comprises the step of separating the DNA fragments. As a further step, this DNA fragment is ligated to the DNA portion encoding the structural protein. To form a fusion DNA, so that the fusion DNA is included in the expression vector. Other DNA factors may be responsible for the expression of this fusion DNA in primary cells To the host cell to induce the expression vector so that the fusion DNA can be expressed. It is included.   In a preferred form, the structural protein is a receptor for a growth factor, preferably Is Mpl. In another preferred embodiment, the expression vector is pSLSV-1, pSLSV-2. , PSLSV-3 or a combination thereof. In another preferred form, the host cell is BaF3 cells, Chinese hamster ovary cells, baby hamster kidney cells, FDC-P1 Cells or MO7e cells, preferably BaF3 cells.   In yet another embodiment of the present invention, the method further comprises the step of culturing the expression host cell after the culturing step. As an additional step, the reagents labeled on the expression host cells are Conditions under which the labeled reagent binds to the structural protein encoded in the DNA portion Act under and further label Isolating the expression host cells associated with the reagents. In a preferred form This labeling reagent is a fluorescent labeling reagent, and the separation step uses a fluorescence activated cell sorter. Perform using In another preferred form, the host cell is a factor-dependent host cell, BaF3, FDC-P1 or MO7e is preferred, and BaF3 is most preferred.   In a further aspect of the invention, the structural protein is directed to the outer surface of an expression host cell. And is a member of a second mutually complementary pair, thereby providing structural protein Interaction with the other member of the second, complementary pair causes the structural protein to The resulting expression host cells are stimulated and grown. In a preferred form, the second Is a receptor / ligand pair, and the structural proteins are Mpl and IL-4 receptor Body, EPO receptor or GM-CSF receptor. In another preferred embodiment, The culturing step is performed in the absence of factors essential for the growth of factor-dependent host cells, and Performed in the presence of the other member of the mutually complementary pair of   Another object of the present invention is to provide the following factors that are operatively linked: A cloning site for inserting a transcription promoter and a 5 ' The first DNA segment to load, the second DN encoding a growth factor receptor lacking a leader To provide an expression vector having an A segment and a transcription terminator, When a functional signal sequence is inserted into the cloning site, In-frame ligation between the DNA fragment and the first DNA segment results in growth factor receptor cell surface Expression and the formation of such a fusion DNA expression vector, resulting in a factor-dependent host cell. Transfection of the fusion DNA expression vector into the vesicle Allows growth of primary cells.   In a preferred embodiment, the cloning site is SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; or SEQ ID NO: 4. In another preferred embodiment Thus, the growth factor receptor is Mpl.   These and other aspects of the invention will be apparent from and elucidated with reference to the following detailed description. Will be. Detailed description of the invention   The present invention combines functional cloning methods with the secretion function of signal peptides. And improved methods for identification and cloning of unknown signal peptides I will provide a. Coding marker proteins that can accurately detect putative signal sequences Detects marker protein expression on the cell surface it can.   The secretory leader trap cloning method and vector of the present invention Unknown factors (such as novel cytokines and growth factors) and CDNA fragments encoding known cell membrane permeable molecules (eg, novel receptors) It can be used to advantage for roning, identification, and isolation. Unknown factors and receptors Are also referred to as "orphan" factors and receptors. Generally such Cloning orphan proteins is difficult and cumbersome. But these offers Factors and receptors are used in cell culture technology in research and industry, In the study of cell metabolism, in the study of the interaction between factors and receptors and cell lineages, As well as in therapeutic intervention on animals, including humans.   In the present specification, the term "secretory leader sequence" and "signal (or signal The term “peptide sequence” refers to the DNA encoding a signal or secreted peptide. The terms are used interchangeably. Signal sequence is leader sequence, prep It is also called b-array or pre-array. Secretory leader is a mature peptide or protein From the cells Amino acid sequence involved in secretory instructions. More specifically, secretory leaders Translocation of polypeptides or proteins through the sarcoplasmic reticulum (the entrance to the secretory pathway) (tr anslocation). Secretory peptides are characterized by hydrophobic amino acid residues And typically (but not all) of the newly synthesized protein Found at the amino terminus. Secretory peptides are cut one or more times during the secretion phase. It is more frequently cut off from the mature protein. Such secreted peptides are Secreted peptides are cut from the mature protein as they pass through the secretory pathway Have a processing site. As used herein, “amino terminal signal The term "sequence" encodes a signal peptide present at the amino terminus of the protein. Indicates DNA.   As used herein, the term "leader deleted protein" refers to the function of a native protein. Indicates a secretory structural protein from which the specific signal peptide (or "leader") has been removed . One method for obtaining leader-deleted proteins involves coding for a natural signal peptide. Genetic nucleotide manipulation removes the natural signal peptide.   As used herein, the term "receptor" refers to a molecule having biological activity (ie, (Ligands including hormones and growth factors) and mediate their effects on cells. Cell-associated protein to be used. Receptors are typically responsible for transducing a signal Multi-domain structure with involved ligand binding site and effector site Characterized. When the ligand binds to the receptor, the conformation of the receptor Change, causing interaction of the effector site with other molecules in the cell. This The interaction in turn causes a change in cellular metabolism. Interaction between receptor and ligand Metabolic effects related to gene transcription, phosphorylation, dephosphorylation, cyclic AMP generation Increase, intracellular calcium flux, cell membrane lipid flux, cell adhesion, inositol Lipid water content And hydrolysis of phospholipids. The receptor can bind to the cell membrane or It can be either sol-solous or nuclear and monomeric (eg, thyroid stimulating hormone receptor, Taadrenergic receptors, etc.) or multimers (eg, PDGF receptors, growth hormones). Mon receptor, IL-3 receptor, GM-CSF receptor, G-CSF receptor, erythropoietin receptor And IL-6 receptor).   Receptors fall into families and superfamilies with conserved structural features being classified. In general, under the selective pressure of organisms to acquire new biological functions, A new receptor family emerges from the doubling of existing receptor genes and diverse genes Believed to cause family existence.   Two of the best-known receptor superfamilies are Receptor superfamily and 7-membrane permeable domain (7-TMD) receptor super -Family. Table 1 shows some of these three receptor superfamilies. You.   Many cytokine receptors are classified into five families based on certain structural features. Can be classified into one of All five families have a single transmembrane arrangement. The presence of extracellular ligand binding and intracellular domains, separated by It is characterized. The structure of the cytokine receptor is described in Urdal (Ann. Reports med. Chem.). . 26: 221-28, 1991) and Cosman, (Cytokine 5: 95-106, 1993). ing.   The 7-TMD receptor is a functionally encoded by a large gene superfamily A diverse group. The two features of this receptor superfamily are The presence of a helical transmembrane domain and one cytoplasmic domain, the latter of which is It is believed that it serves for binding of the form to the G protein. This super family  Lameh et al. (Ph arm Res. 7: 1213-21, 1990) Hagrave, (Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 575-81 199). 1), Probst et al. (DNA and Cell Biol. 11: 1-20, 1992).   Receptors are also classified according to common functions. Table 2 shows the classification by function. Shows a list of condition families. Prototypes for each tyrosine kinase family Table 2 shows the types of receptors. See the following description. Ullrich et al. (Nat ure 308: 418-25,1984; Nature 313: 756-61, 1985) Yaden et al. (Nature 323: 226-32) (1986) Hirai et al. (Science 238: 1717-20, 1987) Sanchez-madrid et al. (Proc. Natl. Ac ad.Sci. USA 79: 7489-93, 1982) Takeichi et al. (Science 251: 1451-55, 1991; Ann. Rev. Biochem. 59: 237-52, 1990) Cunningham et al. (Science 236: 799-806, 1987)   Many orphan receptors have been identified and will elucidate the molecular biology of cells More are expected to be discovered. Known orphan receptors include nuclear receptors COUP-TF1 / EAR3, COPU-TF2 / ARP-1, EAR-1, EAR-2, TR-2, PPAR1, HNF-4, ERR-1, ERR-2, NGFI-B / Nur77, ELP / SF-1, and prior to the research disclosed here Mpl (Reviewed by Parker et al., Curr. Opin. Cell Biol. 5: 499-504, 1993; power et al. Tips 13 : 318-23,1992). Many orphans in the EPH family Receptors have been identified (Hirai supra, incorporated herein by reference). HE R3 and HER4 (Plowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1746-50, 1993, cited. (Also incorporated herein) are orphan receptors of the epidermal growth factor receptor family. It appears to be overexpressed in many tumors. ILA is newly identified Is a member of the human neuronal growth factor / tumor necrosis factor receptor family (Sc hwarz et al. Gene 134: 295-98, 1993, incorporated herein by reference). Insuri Of the insulin receptor family called insulin receptor-related receptors (IRRRs) Receptor has been defined by Scher et al. (J. Biol. Chem. 264: 14606-08, 1989, incorporated herein by reference). IRRR is a transmembrane tyrosine kinase. You. In addition, one of the tyrosine kinase-type orphan receptors is Found in flies (reviewed by Perrimon, Curr. Opin. Cell. Biol. 6: 260-6 6, 1994, incorporated herein by reference). Drosophila Orphans The condition is interesting in that it offers opportunities for genetic analysis as well as biochemical analysis. For identification of Drosophila ligands and subsequent cloning by homology Thus, human or other organism counterparts for Drosophila ligands Is provided.   As used herein, the term “growth factor” refers to a polypeptide that stimulates cell proliferation. Means a peptide whose activity is mediated by a cell surface receptor. Examples of growth factors Include interleukins and colony stimulating factors.   As used herein, the term "expression vector" refers to its expression in a host cell. Operably linked to other DNA sequences to bring about and maintain Single or double stranded, linear or circular, comprising the gene of interest Indicates a DNA molecule. Expression vector may be derived from plasmid or virus Or have both plasmid and viral factors. Generally encodes a structural gene DNA segments can include one or more origins of duplication, one or more selectable markers, Expression vector further comprising a Hanser, splicing signal or other factor In, linked to an expression control sequence. In a preferred embodiment of the present invention, the structural gene Is a protein lacking a leader, preferably a growth factor, that is successfully transported to the cell surface. It is a condition. In a particularly preferred form, the protein lacking a leader is Mpl . The expression vector is inserted into a host cell by a conventional method. Expression vector construction method and Methods for transfection of cultured cells are known to those skilled in the art. For example, Le vinson et al. U.S. Patent No. 4,713,339, Hagen et al. U.S. Patent No. 4,784,950, Palmit er et al. U.S. Patent No. 4,579,821; Ringold U.S. Patent No. 4,656,134. When. For reference on genetic engineering technology, factor-dependent cell lines, and cell culture technology, refer to See pending application USSN 08 / 250,859, the entire text of which is incorporated by reference. This by quote The full text of which is incorporated herein.   In general, standard cloning of an unknown protein is specific for detecting that protein. Develop extraordinary and functional assays to predict predicted bioactive proteins or It involves measuring the activity of the expression product of the cNDA library. However, new Limitations of These Traditional Approaches to the Cloning of Human Factors and Proteins There is. (1) The sensitivity and / or specificity of the assay performed is for unknown proteins. Not enough to get out. (2) Check whether the inserted unknown protein always exists. It must be expressed to an accessible level. (3) Professionals in complex mixtures Thease and inhibitor and antago The presence of a nyst may mask the presence of the expected protein. (4) also However, unknown proteins are large and / or discontinuous due to their biological activity. If needed, biological measurements can detect the expression of protein products that are shorter than full length. I don't think there is. (5) It is thought that there is no new method for functional measurement of factors and proteins. Will be (6) A protein whose function is unknown cannot be cloned.   By using the method of the invention described in the claims, it can be used as a novel unknown protein. Can overcome the disadvantages of traditional cloning approaches You. A.Enrichment of 5 'signal sequence cDNA   The claimed signal trap cloning method uses the N-terminus (ie, 5 'end) enrichment of the coding sequence. In the present invention, a full-length oligo dT The plum cDNA library is a biotin-labeled 5 'PCR linker ("5' PCR primer"). 5 ′ end is biotin-labeled.   Here, biotin is illustratively used as one of a pair complementary to each other . Such complementary pairs include receptor / ligand pairs, antibodies / antigens (Or hapten or epitope) pairs, sense / antisense nucleones Pide pairs, biotin / avidin (or streptavidin) pairs and their In addition, the same kind is included. For use in the present invention, pairs complementary to each other are preferred. Preferably <10-9It has M binding affinity.   The biotin-labeled 5 'PCR linker contains certain restriction enzyme recognition sites. Good In a preferred form, the biotin-labeled 5 'PCR linker contains an EcoRI recognition site. You. Biotin-labeled cDNA is divided into pools, and each pool is a "4-cutter" Cleavage by one of a panel of restriction enzymes results in a short cDNA fragment. Here, "4- Limiter yeast The term "element" refers to a restriction enzyme having a 4 base pair (4 bp) recognition site. average Typically, the 4-cutter restriction enzyme cuts the cDNA approximately every 250 bp. Many 4- Cutter restriction enzymes are commercially available. List of typical 4-cutter restriction enzymes Are shown in Table 3.   The biotin-labeled 5'-end fragment was obtained using avidin immobilized on a solid phase matrix. Isolated. In a preferred embodiment, streptavidin-bound magnetic particles Use The solid phase matrix containing the 5 'fragment captured by avidin was washed. And the 3 'PCR linker is attached to the cohesive end created by the 4-cutter of the fragment. Ligated into fragments. In a preferred embodiment, the 3 'PCR linker is It preferably contains a restriction enzyme recognition site, particularly a XhoI recognition site. next, The captured cDNA fragment recognizes the restriction enzymes present on the 5 'and 3' PCR linkers. The site is separated from the solid phase matrix. And this 5 'concentrated cDNA preparation The product is used to construct a signal sequence library. Alternatively, the captured cDNA If the amount is insufficient, 5 'and 5' And 3 'PCR primers. Other nucleic acid amplification methods are not Well known in the art (eg, Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-77, 1989; Van Gelder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1663-67, 1990; Fahy et al., PCR.  Meth.Appl. 1: 25-33, 1991; Kievitis et al., J. Virol. Meth. 35: 273-86, 1991 Teru. ), Can be used in this embodiment.   The 5 'signal sequence cDNA enrichment method of the present invention has the following advantages. First, this The procedure involves direct cloning or PCR of 5 'cDNA fragments, depending on the amount of starting cDNA. Adaptable to amplification / cloning. Second, by a panel of 4-cutter restriction enzymes Digestion of the full-length sequence can control fragment generation as compared to the random cleavage method. Third In addition, avidin captures biotin-labeled 5 'cDNA, thereby allowing the natural N-terminal coding. CDNA can be sufficiently concentrated. Fourth, the 4-cutter restriction enzyme digest obtained from the cDNA is By identifying, specific 4-cutter restriction enzyme of the cDNA fragment enriched at the 5 'end Can be linked with an appropriate 3 'linker with high efficiency. Fifth, cDNA fragments The attached known 5'-linkers and 3'-linkers are the pointers to the appropriate vectors. Enables directional cloning. Sixth, amplification of the captured cDNA by PCR When used, a permanent copy of the captured cDNA remains on the solid phase. This permanent The copy can later be used as a template for PCR. B.Detection / selection of signal sequence cDNA   As already mentioned, tashiro et al. Used for signal sequence trap cloning. Immunostaining is cumbersome and lacks some selection functions. Stated in the claims The present invention relates to detection / selection that can be used advantageously for cloning signal sequence cDNA. To provide two improvements.   In both methods, the putative signal sequence cDNA is Use an unusual technique to insert into an expression vector with a coding sequence for a protein lacking a leader. You. This expression vector preparation is introduced into a suitable host cell, and the expression host cell To form Expression host cells are conditions that are suitable for growth of the cell and lack the leader. When a protein gene is operably linked to its signal sequence, Cultured under conditions permitting expression. Functional signal sequence cDNA is correct in expression vector If inserted correctly, the protein lacking the aforementioned leader ("marker protein") is expressed And induced on the surface of the expression host cell.   In the first method, the expression host cells are sufficiently detected by cell surface marker proteins. Incubate for up to time. These cells bind (I) specifically to the marker protein, (ii) reacting with a reagent labeled with a detectable label; Reagents suitable for this purpose Include antibodies, ligands, soluble receptors and the like. Suitable for use Detectable labels include fluorescence, fluorescence quenching, dyes, magnetic labels, and the like. There is something. In addition, labels are used that alter the light scattering properties of the binding target. Suitable for In the present invention, a preferred reagent is a fluorescently labeled anti-marker protein. Quality antibody. Next, the expression host cell determines the presence or absence of the label / reagent bound to the cell surface. Be more separated. Therefore, only in one step is the expression host cell with a functional signal sequence Vesicles are isolated from a population lacking a functional signal sequence. In a preferred embodiment Automatic devices (eg, flow cytometer) that allow cell-by-cell testing Used for sorting / selecting expression host cells that have expressed the marker protein on the cell surface. Special In a preferred embodiment, the fluorescence activated flow cytometer is a functional signal analyzer. Used for the separation of cells with the same sequence.   In the second method, a biological selection technique is used. In the prototype of this method, the expression vector The protein lacking a leader encoded by In receptors or growth factor receptors. Such a receptor is a factor-dependent cell line When introduced into ("parent cells"), (I) the corresponding cytokine or growth of the receptor In the presence of the factor, and (ii) in the absence of the factor upon which the cell line Alternatively, expression of the receptor on the cell surface allows cell proliferation.   Therefore, the protein lacking the leader and the putative signal sequence cNDNA (first Expression vector preparations containing parenteral host cells that are factor-dependent Into the cell to form a factor-dependent expression host cell. This factor-dependent expression host The main cell is cultured in the presence of factors necessary for the growth of the parent cell. In addition, selected Culture Conditions Promote Growth of Factor-Dependent Expression Host Cells and Leaderless Proteins If the quality is operably linked to its own signal sequence, the protein lacks a leader. Allows expression on the white matter cell surface.   Factor-dependent expression host cells are known to be leaky on the surface of cells with functional signal sequences. The cells are cultured for a period of time sufficient to allow expression of the protein lacking dermis. After this, factor dependent Existing expression host cells are subject to conditions for selection: (I) the absence of factors necessary for growth of the parent cell; In the presence of (ii) increased expression of the protein (which originally lacks a leader) on the cell surface Cultivated in the presence of molecules that allow for propagation. Continue culturing under these selection conditions Only cells with a functional signal sequence survive.   Secretory clones that have been cloned, identified, and isolated using the disclosed methods Leaders are alternative and / or superior tools that can be used as research and manufacturing tools. Provide a secretory leader. Secretion of prokaryotes, yeast, fungi, insects or mammals Readers can be discovered using the techniques described herein. For example, these secretions Leaders indicate the range of efficiency and specificity of secretion. New host cells available Where feasible, these methods may be useful in such heterologous host cells. One or more that can be used to create an expression vector suitable for the expression of a sex protein. Can be used to identify more secretory leaders. Sources whose properties are relatively unclear If current host cells are used, identification of secretory leaders without appropriate biological assays Can be a particularly effective means.   A more detailed description of this method is provided below.   1.Automatic selection of functional signal signal sequence cDNA   In the prototype procedure, the first method of choice uses automatic cell sorting and provides a functional screen. Isolate clones expressing cell surface proteins detectable by insertion of a signal sequence I do. In one embodiment, the copy of the nucleic acid fragment with the putative signal sequence cDNA is A messy mixture is usually linked to its endogenous leader (or signal sequence) Is a suitable vector that encodes a structural protein lacking a leader that is transported to the cell surface. Cloned directionally upstream of the nucleotides in the vector.   An exemplary structural protein (ie, “marker protein”) herein is thrombopoietin. Receptor (ie, Mpl). Used as a marker protein in the present invention Other suitable receptors include (1) "independence" (ie, additional (Functions / proliferates cells without the presence of specific subunits) and (2) One or more independent, unrelated genes encoded for cell growth It is a receptor that requires the presence of the above subunit. At least one additional Examples of receptors that require a subunit are IL-6, IL-3, IL-4. Those skilled in the art 1) normally linked to an endogenous signal peptide, (2) expressed on the cell surface, And (3) the protein that is stably bound to the labeling reagent and detected is a marker or Will recognize that it can be used as a structural protein. Those skilled in the art will further choose Marker protein accepts longer N-terminally modified fragments than others You will recognize that   An exemplary selection vector contains a Mpl coding region lacking a leader. leader Mpl cDNAs lacking the same can be obtained by conventional methods (see, for example, pending application patent USSN08 / 250,859). Was isolated by reverse transcriptase polymerase chain reaction (PCR) using Showed The exemplary expression vector contains a putative signal sequence and a gene encoding Mpl. The Xho recognition site at the junction between the offspring has three frames with respect to Mpl ("Xho (1, 2, 3 frames) "), which represent the same three types of vectors except that they have . The primer located at this junction (3 'primer) is an endogenous structural protein sequence. It is designed not to amplify the signal sequence. Furthermore, the putative signal sequence The PCR primer (5 'primer) located at the upstream junction is also an endogenous structural protein It is designed so that the signal sequence is not amplified. Therefore, if a functional signal If the sequence cDNA is not inserted into the EcoRI-Xho recognition site, the structural protein will not be expressed. Neither is transported to the cell surface. Genomic DNA or cDNA from BaF3 as template Used as Genomic DNA is easier and faster to isolate, but cDNA has a simpler structure. Less human impact.   A library of putative signal sequence cDNAs inserted into an appropriate vector contains The elephant structural protein is introduced into a host cell capable of expression. Exemplary host cells include It includes nuclear cells and eukaryotic cells, and more specifically, mammalian, yeast, and insect cells. Expression After introducing the vector into host cells and culturing the expressing cells, these cells are labeled. The detected reagent is reacted. These labeling reagents are markers expressed on the cell surface. -Can bind to proteins. Preferred labeling reagents are fluorescently labeled antibodies, especially fluoro Preference is given to anti-Mpl monoclonal antibodies labeled with cein isothiocyanate (FITC) .   When the functional signal sequence is correctly inserted into the expression vector, Kerr protein is expressed on the cell surface. Cultured appropriate, detectable labeling reagent After reacting with the expression host and after a suitable time, the cells are separated from unbound labeled reagent. It is. Placing these "washed" cells under appropriate cell sorting procedures will result in a functional signal. Only those expression hosts having the same sequence are detected and selected. For example, fluorescence-labeled cell sorting In one step, cells with a functional signal sequence can be removed from a group of cells without it Allows to be separated.   From the detected and sorted (selected) expression host cells, the target signal sequence cDNA is It is isolated by cloning techniques or en masse techniques. Clone For isolation, expression host cells with a functional signal sequence can be cloned and amplified. And / or using the signal sequence cDNA as a probe or PCR primer To amplify until the cDNA of interest becomes an amount that can be sequenced. en masse method Now, replace all of the signal sequence DNA with all expression host cells that have a functional signal sequence. Can be isolated from a population of vesicles. Next, the whole signal trap cDNA preparation was By using a nucleotide sequence amplification technique such as   After the mixture of cDNAs of interest has been amplified, one choice is to obtain the obtained cDNAs. Can be recloned into an expression vector and the concentration can be repeated. After concentration Alternatively, each cDNA can be isolated for sequence analysis. Another option is to select the amplified cDNA The mixture can be used as a sense primer to generate a full-length cDNA of interest . This full-length cDNA library is used for clone isolation to obtain a uniform cDNA. Can be used for Each cloned cDNA was sequenced, expressed, And the characteristics can be determined.   Known sig included in available sequence databases (eg Genbank, EMBL) Signa showing no identity or significant homology with null sequence The DNA sequence appears to be a fragment of the cDNA encoding the novel secreted protein. So this is Novel signal sequence isolates its endogenous full-length structural protein coding sequence As a hybridization probe or PCR primer for PCR can do. By utilizing this technology, cytokines, growth factors and transmembrane Novel secreted proteins, such as circulating proteins, and biological detection methods specific to that protein It could be cloned and identified without the need for prior development.   2.Biological selection   Methods for selecting a functional signal sequence encompass a biological selection scheme. The creature The selection procedure requires expensive and specialized equipment (eg flow cytometer) It can be conveniently carried out in a general laboratory facility without using an automatic cell sorting / It is an attractive alternative to choice.   As an exemplary procedure, a signal sequence cDNA library is inserted into an expression vector. (As already described in B.1), this expression vector is introduced into a factor-dependent cell line. This expression vector encodes a structural protein lacking a leader. This biological Structural proteins suitable for selection are cell surface receptors that can mediate signaling in cells. Including condition. Signal transduction directly or indirectly causes cell proliferation Preferably, it is Preferred structural proteins include Mpl, IL-4 receptor, EPO receptor Body, GM-CSF receptor and analogs thereof.   In this regard, suitable factor-dependent cell lines include growth factor-dependent bone marrow cells, lymphoid stems Cells. These produce differentiated blood cells that are similar to bone marrow, spleen, and fetal liver. These cells are found in various hematopoietic tissues. Myeloid and lymphoid receptors are also animals Is found in peripheral blood after cytokine treatment. Capable of expressing a detectable receptor Tiger Growth factor-dependent cell lines that can be transfected include BsF3 (Palaciosto and Steinmetz, C ell 41: 727-34,1985; Mathey-Prevot et al. Mol. Cell. Biol. 6: 4133-35, 1986), FDC- P1 (Hepll et al., Blood 64: 786-90,1984) and MO7e (Kiss Leukenia 7: 235-40,1). 993). Additional growth factor dependent cell lines are well known and available in the art. Proc. Natl. Acsd. Sci. USA 80: 2931-35,198 3, Dexter et al., J. Exp. Med. 152: 1036-47, 1980, Virology 105: 4 by Greenberger et al. 25-35, 1980. In addition, published growth factor-dependent cell lines (For example, Greenberger et al., Leukemia Res. 8: 363-75). 1984, Dexter et al., In Baum et al., Experimental Hematology Today, 8th ann. nt.soc.Exp.Hematol. 1979,145-56,1980).   In the context of the present invention, preferred factor-dependent cell lines take up exogenous DNA quickly. , And has a repertoire of known subunits. Those skilled in the art will recognize several factors Preferred marker factors in selection vectors to be used, using dependent cell lines Recognize that a specific cell surface expressed structural protein can be selected as Will. For example, in BaF3 host cells, IL-4, EPO, and GM-CSF receptors lacking leader Can be substituted for the Mpl coding region of the selection vector. BaF3 Transforming host cells into vectors encoding one of the tyrosine kinase receptor families When combined, the EGF receptor structural gene is suitable, but the Tyro3 receptor structural gene Is not suitable (see, for example, Stitt et al., Cell 80: 661-70, 1995). general Selected host members of the tyrosine kinase receptor family were "Combined" with the appropriate accessory subunits in the cell Suitable for use as an expression vector marker structural gene.   A functional signal sequence that can direct Mpl to the surface of a factor-dependent expression host cell The inserted cDNA fragment encoding thrombopoietin (TPO) Will give life. That is, factors necessary for the growth of factor-dependent parent cells are excluded. Then, a factor-dependent expression host cell that expresses Mpl on the cell surface can be expressed in the presence of TPO. Can survive and proliferate. CD thus encoding a functional signal sequence NA grows factor-dependent expression cells in the absence of required factors but in the presence of TPO Can be selected. In a preferred embodiment, the factor-dependent cell line is Ba F3, an essential factor for the growth of factor-dependent parent cells, is IL-3. Functional Signa Factor-dependent expression cells that do not have the M1 sequence cannot express Mpl on the cell surface. But Therefore, if there is no essential factor for the growth of the parent cell, it has a functional signal sequence. No factor-dependent host cells survive in culture in the presence of TPO. Target machine The functional signal sequence cDNA is B.A. As described in Section 2, fluorescence-activated flow cytometry From the population of cell factor-dependent expressing cells that survived and were selected in the tree, It is isolated by a cleaning technique or en masse.   Both the cell sorting method and the biological selection method described above use a functional signal sequence coding region. Allows for enrichment with minimal selection of area.   The present invention is further described by the following non-limiting examples.Example   Example 1.Construction of selection vector   The selection vector system is an EcoRI / XhoI cDNA encoding a putative signal sequence. Was constructed to allow directional cloning of short fragments of Write concisely The plasmid pHZ-1 is then linearized at the XhoI recognition site downstream of the MT-1 promoter. Was done. Plasmid pHZ-1 converts mRNA transcribed in vitro into mammalian cells or cells. L oocyte Is an expression vector that can be used to express a protein by translation in the above. The expression unit of pHZ-1 is the mouse metallothionein-1 promoter, Multi-cloning bank with unique enzyme recognition site for sequence insertion Adjacent bacteriophage T7 promoter, human growth hormone terminator And a bacteriophage T7 terminator. In addition, pHZ-1 is Origin of replication, bacterial beta-lactamase gene, SV40 promoter and origin Mammalian selectable marker expression unit, neomycin resistance gene, and SV40 It has a photo terminator.   At the XhoI recognition site, three reading frames with the same orientation as the MT-1 promoter. XhoI / SalI cDNA fragments encoding the mature mouse Mpl were cloned into each of the Was done. This murine Mpl coding sequence is described, for example, in Skoda et al. 12: 2645-53 1993, Viron et al., Oncogene 8: 2607-15,1993. Missing leader The cDNA encoding Mpl is composed of (I) an antisense primer containing a SalI recognition site. Ma (GAG GAG AAGGTC GAC  TCA AGG CTG CCA ATA GCT TAG; SalI The recognition sites are underlined; SEQ ID NO: 1), and (ii) the three Of three sense primers with an XhoI recognition site in one of the reading frames Using each, PCR was amplified from a mouse Mpl full-length cDNA template. Done The plasmids were named pSLSV-1, pSLSV-2, and pSLSV-3, which are EcoRI and Xho Digestion with I facilitates cloning of the leader sequence.   The sequences of the cloning regions of pSLSV-1, pSLSV-2 and pSLSV-3 are as shown below. It is. PSLSV-1 (frame 1): PSLSV-2 (Frame 2) PSLSV-3 (frame 3)   The underlined portion of frame 1-3 indicates a complete or partial XhoI recognition site. "(T ) '' Indicates thymine instead of adenine at the natural Mpl signal peptide cleavage site You.   Example 2.Fragment size tolerance for selection vector   Not only the human mature GM-CSF of various lengths but also the signal sequence of huGM-CSF Encoding various sizes of cDNA (Wong et al. Science 228: 810-15, 1985) provide pSVSL- Insertions were made at EcoRI / XhoI cloning sites at 1, -2 and -3. To elaborate, The following inserts were placed in frame with the appropriate pSLSV expression vector: ( 1) 1-66 huGM-CSF (insert is a 17 amino acid signal peptide and other (Encoding 49 amino acids), (2) 1-133 huGM-CSF (insert is a 17 amino acid sequence) (3) 1-17 huGM-SC F (insert inserts only a 17 amino acid signal peptide). Negative control The insert contained the following: (a) 18-116 huGM-SCF (insert is a signal peptide Encodes 116 amino acids beyond the peptide, except for the signal peptide. No), (b) 18-66 huGM-SCF (insert is 66 amino acids beyond the signal peptide) Encodes an acid, except for the signal peptide do not do). In addition, the ATG (Met) codon is adjacent to the Mpl coding region lacking the leader. To show that Mpl is not secreted in the absence of the signal peptide. A negative control was provided.   These plasmids were electroporated into IL-3-dependent BaF3 cells in RPMI medium by electroporation. Transfected and 10 in the presence of IL-3FiveCells were cultured overnight at cells / ml (5 % WEHI preparation medium). On day 1, 500 cells / well transfected BaF3 cells Transferred to a microtiter plate in the presence of G418 and recombinant TPO (100 units / ml) Cultured. G418 transformant with pHZ-1 plasmid (neomycin resistance) Choose a body. Survival when the following DNA fragments are inserted into the pHZ-1 vector Clones were found: 1-66 huGM-CS, 1-133 FhuGM-CSF, and 1-17 huGM-C SCIENCE FICTION. All other constructs produce viable, transfected BaF3 cells. I didn't. Thus, the pSLV of a cDNA with a functional heterologous huGM-CSF signal sequence Match the frame to the EcoRI / XhoI cloning site of L-1, -2, and / or -3. Insertion of the transfected BaF3 cell population relies on thrombopoietin growth. I did it. Furthermore, these expression vectors are compatible with the terminal of the huGM-CSF signal peptide. Allow insertion of additional nucleotides encoding more than 100 amino acids beyond I had sex.   Modifications of this procedure include (i) switching to TPO selection of transfectants. Growth of transformants in the presence of IL-3 for 1, 2 or 4 days prior to replacement, And (ii) examining the concentration and type of recombinant TPO. Regarding (i), TPO Survival of indigenous clones should be performed on the first or second day rather than on the fourth day. It was better. Regarding (ii), increasing the TPO concentration increases the sensitivity of the method At least it was expected to result in the detection of more viable strains.   An experiment on IL-3 rescue was performed. Pool transfected cells And cultured overnight in the presence of IL-3. The cells are washed on day 1 and TPO and G4 Transferred to microtiter plate in the presence of 18. On the second, fourth or seventh day, IL-3 Added to wells ("IL-3 rescue"). Observe clones at IL-3 bailout on days 2 and 7 did.   Example 3.Selection vectors and biological selection   Enrich the 5 'cDNA fragment by Streptavidin affinity chromatography After that, the cDNA fragment is released from the solid phase by digestion with EcoRI. Of isolated cDNA  A secretion trap library was constructed by digestion with XhoI and equimolar amounts Preparation of a vector comprising EcoRI / XhoI digests of pSLSV-1, pSLSV-2 and pSLSV-3 It is cloned directionally to the object. Alternatively, the amount of cDNA fragments obtained is limited If necessary, these may be ligated to the 5 'and 3' promoters prior to cloning into the selection vector. It can be amplified by PCR using a primer. Secretory library is IL-3 dependent Ba After transfection into F3 cells, the cells are incubated with G418 and thrombopoietin. And cultured under conditions where IL-3 is not present. Mpl is expressed on the surface of BaF3 cells. Is incorporated into the growth pathway and stays in the presence of its ligand, thrombopoietin. Primary cells exhibit growth independent of other exogenous growth factors (eg, IL-3). Survival From the resulting cells, functional secretory sequences can be detected by RT-PCR or cellular PCR from the DNA sequence of the 5 'sense primer and vector Isolation by using a 3 'antisense primer that spans the XhoI recognition site of the Is done. Isolation of the secretory leader sequence by PCR is based on clones of the isolated cells or Can be performed by using the cell group of en massePCR. The secretory leader sequence is BsF3 It can be cloned into a selection vector for further enrichment in cells.   The full-length cDNA from which the secretory sequence is derived is synthesized with the secretory sequence 5 'sense primer and the oligo dT-cDNA synthesis primer. Oligonucleotide dT using a 3 'antisense primer directed to the It can be isolated from a cDNA library of the immunization by PCR. Or a complete sig Null sequence is used as a sense primer to collectively amplify full-length cDNA .   While the foregoing has described specific embodiments of the present invention by way of example, various modifications may be made. Recognizes that the invention can be practiced without departing from the spirit and scope of the invention. Things. Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims. Absent.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ , BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, I S, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR , LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, S D, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT , UA, UG, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．遺伝子の５’末端を含んで成るDNA 分子の選択方法において、 それぞれが遺伝子の５’末端を含んで成る複数のDNA 分子を用意し、ここで該 ５’末端は第一の互いに相補的なペアの第一のメンバーに連結されて標識された ５’末端が形成されており； 前記DNA 分子を制限エンドヌクレアーゼにより切断して、DNA 断片を生成せし め； 前記DNA 断片を、前記第一の互いに相補的なペアのもう一方のメンバーに暴露 し、これによって、標識された５’末端を有するDNA 断片が外もう一方のメンバ ーに結合し； 前記第一の互いに相補的なペアからDNA 断片を単離する； ことを含んで成る方法。 ２．前記第一の互いに相補的なペアが、ビオチン／アビジン・ペア、受容体／ リガンド・ペア、抗体／エピトープ・ペア、及びセンス／アンチセンスポリヌク レオチド・ペアから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。 ３．前記第一の互いに相補的なペアの第一のメンバーがビオチンであり、もう 一方のメンバーがアビジンである、請求項１に記載の方法。 ４．前記第一の互いに相補的なペアの前記もう一方のメンバーが固相に固定さ れている、請求項１に記載の方法。 ５．前記固相が磁性粒子である、請求項１に記載の方法。 ６．前記制限エンドヌクレアーゼが４- カッター制限酵素である、請求項１に 記載の方法。 ７．前記DNA 断片の単離段階の後、 前記DNA 断片を、構造蛋白質をコードするDNA セグメントに連結してDNA 融合物 を形成せしめ、このDNA 融合物は発現ベクターに含有されており、そして該DNA 融合物が宿主細胞中で発現されるのに必要なDNA 因子に作用可能に連結されてお り； 前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、これにより発現宿主細胞を形成せしめ ；そして 前記発現宿主細胞を培養して、前記DNA 融合物の発現を可能にする； 段階をさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。 ８．前記構造蛋白質が成長因子受容体である、請求項７に記載の方法。 ９．前記構造蛋白質がMpl である、請求項７に記載の方法。 10．前記発現ベクターが、pSLSV-１、pSLSV-２、pSLSV-３およびこれらの組合 せからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。 11．前記宿主細胞が、BaF３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビー ハムスター腎細胞、FDC-P１細胞、MO７ｅ細胞からなる群から選択される、請求 項７に記載の方法。 方法。 12．前記宿主細胞細胞が、BaF３である、請求項７に記載の方法。 13．前記発現宿主細胞の培養の段階の後、 前記発現宿主細胞が無傷であり且つ、標識した試薬が前記DNA セグメントにコ ードされた構造蛋白質に結合するような条件下で、前記標識試薬と前記発現宿主 細胞とを一緒にし；そして 前記標識試薬に結合した発現宿主細胞を単離する； 段階をさらに含んで成る、請求項７に記載の方法。 14．前記標識試薬が蛍光標識抗体である、請求項13に記載の方法。 15．前記単離の段階が、蛍光活性化セルソーターによって実施される、請求項 14に記載の方法。 16．前記宿主細胞が、因子依存型宿主細胞である、請求項７に記載の方法。 17．前記因子依存型宿主細胞が BaF３細胞、FDC-P１細胞及びMO７ｅ細胞から なる群から選択される、請求項16に記載の方法。 18．前記因子依存型宿主細胞細胞がBaF ３である、請求項16に記載の方法。 19．前記構造蛋白質が発現宿主細胞の細胞外面に向けられ、そして第二の互い に相補的なペアのメンバーであり、それによって構造蛋白質と第二の互いに相補 的なペアのもう一方のメンバーとの相互作用が、構造蛋白質を産生する発現宿主 細胞の増殖を刺激する、請求項16に記載の方法。 20．前記第二の互いに相補的なペアが、受容体／リガンド・ペアである、請求 項19に記載の方法。 21．前記構造蛋白質が、Mpl、IL-4受容体、EPO 受容体及びGM-CSF受容体から なる群から選択される、請求項19に記載の方法。 22．前記培養の段階が、因子依存型宿主細胞の生育に必要な因子の非存在下、 第二の互いに相補的なペアのもう一方のメンバーの存在下で実施される、請求項 19に記載の方法。 23．以下に示す作用可能に連結された因子： 転写プロモーター、 ５’末端DNA 断片の挿入のためのクローニング部位をコードする第一のDNA セ グメント、 リーダーを欠く成長因子受容体をコードする第二のDNA セグメン ト、 転写ターミネーター、 を含んで成り、機能的シグナル配列が前記クローニング部位に挿入された場合、 第二のDNA セグメントと第一のDNA セグメントとのフレーチを合わせた連結が、 前記成長因子受容体の細胞表面での発現をもたらし、これによりDNA 融合発現ベ クターが形成され、そして 前記DNA 融合発現ベクターの因子依存性宿主細胞への導入が、相補的な成長因 子リガンドの存在下での宿主細胞の増殖を可能にする、 ことを特徴とする発現ベクター。 24．前記クローニング部位が、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４ 、からなる群から選択される、請求項23に記載の発現ベクター。 25．前記成長因子受容体がMpl である、請求項24に記載の発現ベクター。[Claims]   1. In a method for selecting a DNA molecule comprising the 5 'end of a gene,   A plurality of DNA molecules, each comprising the 5 'end of the gene, are provided, wherein the The 5 'end is linked and labeled to the first member of a first mutually complementary pair 5 'end is formed;   The DNA molecule is cleaved with a restriction endonuclease to generate a DNA fragment. Me;   Exposing said DNA fragment to another member of said first mutually complementary pair As a result, the DNA fragment having the labeled 5 'end is separated from the other member. Binding to   Isolating a DNA fragment from said first mutually complementary pair; A method comprising:   2. The first complementary pair comprises a biotin / avidin pair, a receptor / Ligand pairs, antibody / epitope pairs, and sense / antisense polynucs 2. The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of a leotide pair.   3. The first member of the first mutually complementary pair is biotin, and 2. The method of claim 1, wherein one member is avidin.   4. The other member of the first complementary pair is immobilized on a solid phase. The method of claim 1, wherein   5. The method according to claim 1, wherein the solid phase is a magnetic particle.   6. 2. The method of claim 1, wherein said restriction endonuclease is a 4-cutter restriction enzyme. The described method.   7. After the DNA fragment isolation step, The DNA fragment is ligated to a DNA segment encoding a structural protein to produce a DNA fusion. The DNA fusion is contained in an expression vector, and the DNA The fusion is operably linked to the DNA elements necessary for expression in the host cell. R;   The expression vector is introduced into a host cell, thereby forming an expression host cell. ; And   Culturing said expression host cell to allow expression of said DNA fusion; The method of claim 1, further comprising a step.   8. The method according to claim 7, wherein the structural protein is a growth factor receptor.   9. The method according to claim 7, wherein the structural protein is Mpl.   Ten. The expression vector is pSLSV-1, pSLSV-2, pSLSV-3, or a combination thereof. 9. The method of claim 7, wherein the method is selected from the group consisting of:   11． The host cells may be BaF3 cells, Chinese hamster ovary cells, baby Selected from the group consisting of hamster kidney cells, FDC-P1 cells, and MO7e cells Item 8. The method according to Item 7. Method.   12． 8. The method of claim 7, wherein said host cell is BaF3.   13. After the step of culturing the expression host cell,   The expression host cells are intact and labeled reagents are added to the DNA segment. The labeling reagent and the expression host under conditions that bind to the loaded structural protein. Put the cells together; and   Isolating the expression host cells bound to the labeling reagent; The method of claim 7, further comprising the step of:   14. 14. The method according to claim 13, wherein the labeling reagent is a fluorescently labeled antibody.   15． 3. The method of claim 1, wherein the step of isolating is performed by a fluorescence activated cell sorter. 14. The method according to 14.   16． The method according to claim 7, wherein the host cell is a factor-dependent host cell.   17． The factor-dependent host cells are derived from BaF3 cells, FDC-P1 cells and MO7e cells 17. The method of claim 16, wherein the method is selected from the group consisting of:   18． 17. The method of claim 16, wherein said factor-dependent host cell is BaF3.   19. The structural protein is directed to the extracellular surface of the expression host cell and A member of a pair that is complementary to Interacts with the other member of the genetic pair to produce an expression host that produces structural proteins 17. The method of claim 16, wherein the method stimulates cell proliferation.   20. The second complementary pair is a receptor / ligand pair Item 19. The method according to Item 19.   twenty one. The structural protein is derived from Mpl, IL-4 receptor, EPO receptor and GM-CSF receptor. 20. The method according to claim 19, wherein the method is selected from the group consisting of:   twenty two. The culturing step, in the absence of factors necessary for the growth of factor-dependent host cells, Performed in the presence of another member of a second mutually complementary pair 19. The method according to 19.   twenty three. Operably linked factors shown below:   Transcription promoter,   A first DNA sequence encoding a cloning site for insertion of a 5 'terminal DNA fragment. Gment,   Second DNA segment encoding a growth factor receptor lacking a leader To   Transcription terminator, Comprising a functional signal sequence inserted into the cloning site, The linking of the second DNA segment and the first DNA segment together Results in expression of the growth factor receptor on the cell surface, thereby providing a DNA fusion expression vector. Is formed, and   Introduction of the DNA fusion expression vector into a factor-dependent host cell is a complementary growth factor. Allowing the growth of host cells in the presence of the offspring ligand, An expression vector, characterized in that:   twenty four. The cloning site is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 24. The expression vector according to claim 23, which is selected from the group consisting of:   twenty five. 25. The expression vector according to claim 24, wherein said growth factor receptor is Mpl.
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