JPH11504835A

JPH11504835A - 強度を増強したレーザー媒介の組織接合のための方法

Info

Publication number: JPH11504835A
Application number: JP8536773A
Authority: JP
Inventors: ピー．ポパス，ディックス; マークス，ジェラード
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1995-06-02
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1999-05-11
Also published as: AU5971596A; EP0830087A2; WO1996038093A3; WO1996038093A2; US5713891A; CA2222633A1; IL122328A0

Abstract

(57)【要約】増殖因子や止血剤のような生物学的に活性な因子を取り込んだ接合物(solder)を使用する組織を接合するための方法が開発された。改善された接合物組成物もまた規定され、これはタンパク質濃度の関数としてより強い破裂強度を生じ、そしてタンパク質の使用によりレーザー媒介の変性の前に折り畳みを展開し(unfolding)、そして結合する。組織の併置が不可能な場所での欠損を充填するための柱状物を形成するために、接合物濃縮物と組み合わせて発光団として水を使用する、瘻孔の修復のための方法が見出された。二極性の電気外科手術および光を含む、他の形態の指向性のエネルギーと共に使用するための方法もまた、適用された。単独、および接合指向性物の濃度の関数として、接合物内への増殖因子の取り込みにより修復強度が増加する例が実施された。トロンビン、または血管収縮薬であるエピネフリンのような、止血剤の取り込みによって出血を妨げることにより、接着の増強が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】強度を増強したレーザー媒介の組織接合のための方法発明の背景本発明は、一般には、タンパク質接合物(solder)のレーザー媒介の結合を使用する、組織接合のための方法の分野であり、そしてより詳細には、この接合物内に生物学的に活性な化合物を取り込む、改善された方法および組成物である。組織をつなぐためのレーザーエネルギーの使用は、「組織接合(tissue weldin g)」という。目的は、瘢痕を最小にし、そしてくっつけた縁(apposed edge)の引っ張り強度を良好にして、組織をつなぐことを容易にすることである。組織接合のために使用されてきたレーザーは、ネオジウム：イットリウム-アルミニウム- ガーネット(Nd：YAG)レーザー、アルゴンレーザーおよびCO₂レーザーを含む。これらはコラーゲンフィブリルの相互鉗合(interdigitation)を生じるようであり、おそらく組織の表面で加熱し、組織におけるタンパク質を変性しそして結合する。最初の研究は、血管の吻合術に焦点を当てた。後の研究は、他の組織(例えば、腸)、および神経修復に視点を置いた。組織結合の成功は、いくつかの因予(張力を伴わなずに密接に接近するよう組織の縁を整列させること、末梢組織の破壊を最少にし、そして組織の加熱を制御するためにレーザーパラメーターを調節すること、および適切なタンパク質接合物の使用を含む)に依存する。40％アルブミンのような種々の接合物は、Poppasら、J ．Urol. 139,415-417(1988)，Poppas ら、J ．Urol.150,648-650(1993)，Poppasら、Lasers in Surgery & Med ．13,577 -580(1993)，Chomaら、Lasers in Surg ．& Med．12,639-644(1992),およびPoppa sら、J ．Urol. 150，1052-1055(1933)に記載されている。アルブミンは、好ましい接合物である。なぜなら、アルブミンは、接合物のない場合または血液の使用と比較して、レーザー創傷閉鎖の引っ張り強度を顕著に改善し、漏出点の圧力(l eak point presssure)を増加し、安価でそして容易に製造され、そして免疫原性応答を誘発せず、そして無菌のウイルスのない形態で利用可能であるからである。 Poppasらの米国特許第5,334,191号、および同第5,409,148号およびPoppasら(199 3)に記載されるように、接合物は、フルオレセインまたは酸化鉄のような発光団の含有および発光団の含有および入念な温度制御の使用により、さらに改善される。発光団の含有は、レーザーエネルギーの吸収を増加させ、組織接合を達成するに必要な出力の量を減少させる。組織接合の利点は数多くあり、そして流体の強固なシール(fluid tight seal) の迅速な(1mm/秒)の形成、非結石形成性、治癒の改善、創傷感染の減少、およびより短い入院期間および術後の結果の改善を含む。しかし、接合物を使用しないかまたは現在利用可能なタンパク質接合物を使用する組織接合の不利な点は、修復の引っ張り強度が低いということである。従って、本発明の目的は、より強い引っ張り強度および改善された創傷治癒特性を有する修復を生じる組織接合のための方法および組成物を提供することである。本発明の別の目的は、瘻孔、ならびに潰瘍および慢性創傷を含む他の開放した領域の組織修復を提供することである。発明の要旨増殖因子、血栓溶解剤、または凝固阻害剤または止血剤のような生物学的に活性な因子を取り込んだ接合物を使用する組織接合のための方法が開発された。タンパク質濃度の関数としてより強い破裂強度を生じ、そしてタンパク質の使用によりレーザー媒介の変性前に折り畳みを展開し、そして結合する、改善された接合組成物もまた規定される。組織の付着が不可能な場所での欠損を充填するための柱状物を形成するために、接合物の濃縮物と共に、発光団として水を使用する、瘻孔の修復のための方法が見出された。二極性の電気外科手術および光を含む、他の形態の指向性のエネルギーと共に使用するための方法もまた、適用された。実施例は、接合物内への増殖因子の取り込みにより修復の強度が増加することを、単独でおよび接合物の濃度の関数として、示す。トロンビンのような止血剤、ヘパリンまたは他の凝固阻害剤、または血管収縮剤であるエピネフリンの取り込みによって、出血を妨げることにより、接着の増強が得られる。図面の簡単な説明図１は、25％、38％、45％、および50％アルブミン(w/v)についての、管腔内破裂圧(mmHg)の関数として、破裂圧に対するアルブミン濃度の影響を示すグラフである。図２ａおよび２ｂは、安定化アルブミン(図２ａ)および非安定化アルブミン( 図２ｂ)についての時間(秒)対温度(℃)の関数として、熱変性閾値をより低くするために、アルブミン接合物がどのように修飾され得るかを示すグラフである。図３ａ、３ｂ、および３ｃは、手術３日後(図３ａ)、手術５日後(図３ｂ)、および手術７日後(図３ｃ)の、縫合、レーザー＋接合物、レーザー＋HB-EGF、レーザー＋接合物＋bFGF、およびレーザー＋接合物＋TGFβ₁で修復した創傷について、最大応力(kPa)の関数として、経時的に創傷強度を比較するグラフである。図４は、レーザー＋接合物＋ＴＧＦβ₁(菱形)、縫合(四角)、またはレーザー＋接合物(三角)について、最大応力(kPa)対時間の関数として、経時的に修復強度を比較するグラフである。図５は、増殖因子で増強したアルブミン接合物を用いてまたは用いないで、レーザーを用いる修復およびレーザーを用いない(縫合)修復を、縫合単独、縫合＋アルブミン接合物、縫合＋アルブミン接合物＋bFGF、縫合＋アルブミン接合物＋ TGFβ₁、レーザー＋縫合＋アルブミン接合物、レーザー＋縫合＋アルブミン接合物＋bFGF、およびレーザー＋縫合＋接合物＋TGFβ₁について、最大応力(kPa)の関数として、比較するグラフである。図６は、縫合単独、レーザー＋アルブミン接合物、およびレーザー＋接合物＋ TGFβ₁を使用する修復についての全コラーゲン含量(μg/mg乾燥重量)のグラフである。発明の詳細な説明Ｉ．エネルギー媒介修復のシステムレーザー Nd:YAGレーザー、GaAlAsレーザー、アルゴンレーザー、およびCO₂レーザーを、組織接合のために使用し得る。レーザーは、Laserscope Corp．San Jose，CA のような種々の会社から購入可能であり、そして現在種々の外科的適用のために使用されている。Dewらの米国特許第5,409,479号、およびSawyerの米国特許第5, 156,613号は、本明細書中で参考として援用され、組織接合により組織創傷を閉鎖するためのレーザーおよび無線周波数エネルギーの使用を記載する。Poppasらの米国特許第5,334,191号は、本明細書中で参考として援用され、組織接合における使用のための好ましいシステムを記載する。全ての外科的手順におけるように周辺組織への外傷が最少化される場合、レーザー接合は最も成功したといえる。レーザー接合手順は非接触的方法であるので、広範な熱的損傷が存在する場合、主要な問題が生じる。従って、レーザーエネルギーの熱の堆積は、首尾よくレーザー接合を得るためには非常に重要であり、そしてレーザーのパラメーターは、接合される組織における受容可能な温度プロフィールを保証するために選択されなければならない。本明細書中での使用のために適切なレーザーは、ABIOMED R&D Inc.，Danvers ，MAから入手可能である。ABIOMED R&D Inc.は、1.9μm(この波長は、小血管の壁厚への最大透過性(-0.1mm)を達成する)での小血管を接合するためのレーザー/ 赤外線温度計システム、および±３℃以内の一定温度で接合を維持するための温度フィードバックループを構築した。操作盤は、レーザーダイオード(その関連する電源および駆動電子回路を伴う)、および一定の表面温度を維持するために組織温度をモニターしそしてレーザー出力を決定するための、マイクロプロセッサベースのデータ獲得システムおよび制御システムを備える。移動可能なハンドピースが、ケーブルおよびコネクタを介して操作盤に取り付けられており、接合部位へ光パワーを送達し、そして赤外線温度計を備える。さらに、オーディオフィードバックシステムを、所望の接合温度に達したときに外科医に知らせるために使用する。レーザー出力を、300μm(コア直径)のシリカファイバーを介して組織に送達する。使用される赤外線温度計は、直接目視するためのデバイスであり、これはレーザーで加熱された領域において0.3mmの点をモニターする。この点は１つのZnSeレンズを使用してサーモパイル上で直接画像化される。小さなステンレス綱のチューブを、接合部位へファイバーを向けるために使用し、そしてこのチューブの末端に取り付けられたガイドワイヤを、接合する領域を規定するためおよび触感できるフィードバックを外科医に提供するために使用する。サーモパイル、画像化レンズ、ならびに利得およびオフセット電子回路からなる赤外線温度計は、ハンドルの本体内に位置する。他のレーザー接合システムは、米国特許第5,001,051号、同第4,854,320号、および同第4,672,969号に記載される。パラメーター組織によるレーザー光の吸収特性および散乱特性、組織の組成および生理学的状態、組織の熱伝導率、壁の厚さ、曝露時間、およびレーザー強度は、全て重要な要素である。レーザーエネルギーの大部分が組織の深度を全体を通して吸収される場合、接合の急性強度が顕著に改善され得ることが示されている。最大の急性強度は、レーザーの吸収深度が組織の厚さの深度と等しい場合に得られる。従って、最適な接合は、レーザー光の組織中への透過深度が組織の壁(well)の厚さとほぼ等しい場合に得られる。しかし、組織コンプライアンスのような長期にわたる結果は、基底膜が熱に損傷されていない場合は、より所望である特性を有し得る。このことは、組織の厚みに部分的に透過するレーザー源を用いてのみ達成され得る。このことは、必要とされる高い最初の接合強度(この強度は、全層接合で最適に達成され得る)に起因して、血管接合については所望ではないが、最初の強度はより弛緩していることが必要とされる泌尿器科での適用のような他の適用においては、部分厚接合は、長期間の組織コンプライアンスについてより所望され得る。接合についての診断的情報を提供し得る組織のパラメーターとしては、生来のの自家蛍光(native autofluorescence)、光学的複屈折、および組織の温度が挙げられる。組織接合反応速度についての単純なアレニウスモデル(すなわち、反応速度は温度と共に指数関数的に増加する)は、受容可能な接合は、組織温度に極めて感受性であるべきであるということを意味し、レーザー接合手順のための優れた真の時間モニターを提供する。接合プロセスの間に組織温度をモニターすることによって、レーザー接合のための最適な温度範囲(これは最も所望である臨床的結果を生じる)が決定され得る。フィードバックループをレーザー出力を調節するために使用し得、これにより接合プロセスを通してこの最適な範囲内に組織温度が維持される。この結果、再現性のある、信頼性のあるレーザー接合が得られるはずである。実施例１は、２つのレーザー源(膀胱組織における組織厚に適合したレーザー(1.32μm)および透過性のより低いレーザー(1.9μm)の代表) についての急性接合強度に対する温度の影響を比較する。組織表面温度については、70℃で、またはそれより低い温度では、接合は生じない；これらの接合は、全身の圧力に抵抗し得ない(破局的開通性不全(catastrophic failure))。90℃より高い表面温度は、顕著な組織の縮小を生じ、これにより狭窄および閉塞が生じる。接合は、70℃〜90℃の温度の範囲の間で達成し得る。切断され、そして表面温度50℃〜90℃の範囲の熱で制御したレーザー接合を用いて修復された、ラットの尿道で実証されたように、PCにフィードバックされる赤外線検出器組織温度(これは、アルゴンレーザーを制御し、接合部位に最適な出力を送達する)を使用して同様の結果が得られた。破裂圧力は接合温度80℃で最大であった。しかし、接合の組織学的試験により、この温度で組織の損傷が示された。この損傷は、接合の寿命を減少させ得る。60℃および70℃での接合は、最初はさほど強力ではないが、超生理学的状態をなお保っており、このことは、これらの接合がより長期間すぐれているかもしれないということを示す。これらの研究は両方とも、80℃付近の組織表面温度が接合プロセスに好ましいことを示した。表面温度は、組織接合をモニターするための便利でかつ重要な物理的パラメーターであるが、接合プロセスの完全な情況を提供しない。厚い組織では、表面温度は所望の温度に達し得、そしてこのようなレベルで維持され得る一方で、組織の内部は接合されるべき適切な温度に達しない。この場合、実質的な温度の差異がモニターされている外層と接合形成が所望である内層との間に存在し得る。これらの温度勾配は計算され得る。一般に、曝露時間は熱の拡散時間と比較して長いので、組織表面での空間的に指数関数的なエネルギーの堆積および伝導的な熱の損失を伴う定常状態の溶液は、接合プロセスのために有効であるべきである。２つの波長(1.32μmおよび1.9μm)は、接合されるべき組織厚に関連して、２つの顕著な透過深度を表す。例えば、健常なヒトの膀胱においては、1.32μmレーザーは、その透過深度が約2.5mmであるので、２〜３mmの組織を透過する。壁が５mmもの厚さであり得る肥大した膀胱、または低張状態の、１mmの壁厚の代償不全の膀胱でさえ、1.9μmレーザーは、これらの厚さに関して、その組織透過深度が低いので(0.1mm)、良好な対照を提供する。組織の上２〜３mmに固定された300 μmのファイバーを通して最適な光線が送達される場合、150mW〜250mWの出力で、80℃またはそれ以上の接合温度での1.9μmレーザーダイオードを使用することが可能である。約1.5〜２mmの壁厚のイヌ尿管を使用した研究により、500mWより低い出力レベルでの組織の影響を示し、そして、１〜1.5ワットの出力で、組織の上３mmに固定された300μmのファイバーを通して送達される場合に、接合を達成し得ることが示された。1.9μmレーザーは２つの方法の１つによって出力を増加され得る：より高い出力のダイオード(１ワットはSDLおよびApplied Optronic sから入手可能である)、または現在のダイオードの出力を、送達用の１本のファイバー内で第２の同一のダイオードの出力と組み合わせ得る。二極性電気外科手術他のタイプのエネルギーを、レーザーの代わりに使用し得る。好ましい供給源は、二極性の外科手術用デバイスであり、Treatの米国特許第4,493,320号に記載され、その教示は本明細書中に援用される。無線周波数エネルギーもまた使用し得、Sawyerの米国特許第5,156,613号に記載され、その教示は本明細書中に援用される。 II．接合物材料の選択好ましい接合物は、アルブミン、フィブリノーゲン、またはコラーゲンのようなタンパク質であり、これらは80または90℃までの局所的な加熱に曝されると変性し、そして互いにおよび隣接する組織に架橋し、接合を形成する。架橋は、イオン性、共有結合性、またはそれらの混合であり得る。濃度好ましい実施態様において、タンパク質は、乾燥粉末(粒子、ミクロスフェア、または凍結乾燥された形態)、または約25％と50％タンパク質との間の溶液として、適用される。２cmの創傷の修復のための代表的な量は、50μLである。キャリア任意の生体適合性のキャリアを使用し得る。水溶液が好ましい。例として、水、生理食塩水(0.15M NaCl)、およびリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)が挙げられる。接合物は、代表的には、乾燥または凍結乾燥された形態で提供され、次いで使用の時点で再構成される。発光団水は、特定の波長の光を吸収し、そしてその光を熱エネルギーに変換するために使用し得る発光団である。他の発光団を、接合物に添加し得る。一般的な発光団は、墨汁または酸化鉄のような黒色の色素である。墨汁は、代表的には、1064nmの波長を発するNd:YAGレーザーのようなレーザーと共に使用される。インドシアニングリーン(ICG)(吸収ピーク805nm)は、808〜810nmの波長でのGaAlAsダイオードレーザーのような780n mと820nmとの間の波長のレーザーと共に使用される。フルオレセイン(吸収ピーク496nm)は、532nmの波長でのYAGレーザーと共に使用され；メチレンブルー(吸収ピーク661nm)は、670nmで光を発するレーザーと共に使用される。濃度範囲は変動するが、代表的な濃度は50％アルブミン中約0.54mMである。発光団は、凍結乾燥したアルブミンを再構成するために使用する水溶液中で可溶化される。修飾タンパク質は、特定の条件下で得られる架橋の量を増加するために修飾し得る。最も単純な例において、アルブミンを透析して、60℃での低温殺菌の間アルブミンを変性から保護するために使用される安定剤を除去する。接合物材料をまた、折り畳みを減少し、そして架橋に利用可能な部位を増加するために化学的に修飾し得る。例えば、アルブミンを、グルタチオン、2PDS、またはL-システインのようなジスルフィド還元剤に曝露し得、そしてシステイン基をカルボキシル化して、より容易に架橋される折り畳まれていないタンパク質を生じ得る。 III．生体活性剤材料の選択種々の材料を、接合の前に接合物に添加し得、そして／または接合後に投与し得る。有用な材料の例としては、タンパク質、多糖、核酸、ビタミン、および金属またはイオン(カルシウム、ナトリウム、およびカリウム)、および合成有機分子が挙げられ、これらは10分の１秒と２分間との間の時間、80℃までの熱に曝された場合、その生物学的活性を保持している。例としては、コラゲナーゼインヒビターのような酵素、トロンビン、フィブリノゲン、またはカルシウムイオンのような止血剤、ヘパリンのような血栓溶解剤または凝固阻害剤、増殖因子、血管形成因子、および他の増殖エフェクター分子、静菌因子もしくは殺菌因子、抗炎症剤、化学治療剤、または抗血管形成剤、およびビタミン(特にビタミンＣ)が挙げられる。血栓溶解剤または凝固阻害剤は、瘻孔および血栓症に次ぐ微小血管のレーザー接合の両方において、合併症を減少させるために、添加され得る。接合物における抗生物質の使用により、皮膚レベルで、または膀胱の再構築の領域においてのいずれかで、創傷感染を減少させる本発明者らの目的が補助される。マーカインまたはリドカインのような麻酔剤のアルブミン接合物への添加は、術後の疼痛を減少させる局所麻酔として作用し得る。本明細書中で使用される増殖エフェクター分子とは、細胞表面レセプターに結合し、そして標的細胞または組織の増殖、複製または分化を調節する分子をいう。好ましい増殖エフェクター分子は、増殖因子または細胞外マトリックス分子である。増殖因子の例として、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、形質転換増殖因子(TGFα、TGFβ)、肝細胞増殖因子、ヘパリン結合因子、インスリン様増殖因子IまたはII、線維芽細胞増殖因子(FGF)、VEGF、LPA、エリスロポイエチン、神経成長因子、骨形成タンパク質、筋形成タンパク質、および当業者に公知の他の因子が挙げられる。さらなる増殖因子は、例えば、「ペプチド増殖因子およびそれらのレセプターI」M．B．SpornおよびA．B．Roberts編(Springer -Verlag，New York，1990)に記載され、その教示は本明細書中で参考として援用される。増殖因子は、当業者に公知の方法を使用して、組織から単離され得る。例えば、増殖因子を組織から単離し得、細菌、酵母、または哺乳動物細胞中での組換え手段によって生成し得る。例えば、EGFをマウスの下顎腺から単離し得、そしてG enetechは組換え的にTGFβを生成する。多くの増殖因子がまた、Sigma Chemical Co．of St．Louis，MO、Collaborative Research、Genzyme，Boehringer、R&D Systems、およびGIBCOのような業者から、天然の形態および組換え形態の両方で市販されている。細胞外マトリックス分子の例としては、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、およびプロテオグリカンが挙げられる。他の細胞外マトリックス分子は、 Kleinmanら(1987)に記載されるか、または当業者に公知である。他の増殖エフェタター分子としては、インターロイキンおよびGM-コロニー刺激因子のようなサイトカイン、ならびにインスリンのようなホルモンが挙げられる。これらはまた、上記の文献に記載され、そして市販されている。コラゲナーゼインヒビターは、組織インヒビターメタロプロテイナーゼ(TIMP) を含み、また、増殖エフェクター分子として有用であり得る。止血剤の例としては、トロンビン、第Xa因子、フィブリノーゲン、およびカルシウムイオン(代表的には塩化カルシウムまたはグルコン酸カルシウムの形態)が挙げられる。トロンビンは、トロンビンが創傷治癒に有用な多くの特性(すなわち、線維芽細胞のような細胞に対する走化性、種々の細胞に対するマイトジェン性)を有するので、好ましい止血剤であり、そしてレーザー手順の間に失われた領域がトロンビンの凝集活性に起因してふさがれる。エピネフリンのような血管収縮剤もまた使用され得、血管を収縮し、それによって出血が減少される。接合部位での出血は、修復強度の低下、および接合領域の視覚的な損傷に導くので、所望されない。静菌剤および殺菌剤は、抗生物質、および創傷における感染を防止するかまたは処置するために使用される他の化合物を含む。これらは、接合物が補てつのデバイスの移植時に使用される場合に特に有用である。濃度生体活性剤は、代表的には0.1mlの接合物溶液の容量中にナノグラムからマイクログラムの範囲で取り込まれるが、これらはまた、ペーストのような乾燥形態または懸濁液において創傷に適用され得る。下記の実施例に置いて、増殖因子は、500ng/mlの濃度の接合物またはビヒクル中に添加される。増殖エフェクター分子は、創傷治癒を促進および／または修復の機能的強度を加速もしくは増強するに有効な量で接合物に添加される。投与の方法接合物は、接合時に、ブラッシング、スプレー、ドリップ、または当業者に公知の他の方法のいずれかによって投与される。生体活性剤は、接合物と同時に、別々に、または接合物と組み合わせて、あるいは接合の後に、接合物の適用方法と同一の投与方法を使用して、投与され得る。 IV．処置の条件および方法接合接合を、組織表面が密接に近接し得る組織の創傷を修復するために使用する。供給源の波長を接合される組織の透過深度に適合させるために変化させること、流出が制御された温度を保つようにレーザー出力を制御すること、接合物としてのアルブミンの使用、および組織の適切に近接した状態は、縫合を行わずに首尾よく組織または血管をつなげるのに寄与する重要な要素である。好ましい実施態様において、組織は、縫合、ステープル、または当業者に公知の他の方法を使用して密接に近接して固定されている。レーザーを溶接物の適用直後に適用し、創傷に沿って約1mm/秒の速度で移動させる。温度制御を維持して、生体活性剤を変性し得るかまたは過剰な組織の損傷を生じる、過剰な加熱を避ける。レーザーおよび発光団の選択は、例えば、浅い透過深度(0.1mm)のレーザー(1.9μm)、または深い透過深度(2.5mm)のレーザー(1.32μm)を使用することによって、異なるレーザー修復を達成するために、使用され得る。実施例で示すように、温度は、種々の生体活性剤を封入し得るように、修復強度を変化させるために使用し得る。縫合よりもレーザーが有利である点としては、より短い手術時間、異物の身体の反応の減少、出血の減少、治癒の改善、および使用の技術的な容易性が挙げられる。侵襲性の手順を最少にするために、従来の縫合が困難である場所では、組織のレーザー接合は好ましい代替であり得る。組織接合を、内視鏡手術と共に使用し得る。内視鏡手術の利点は明らかである。多くの手順を、診療所においてまたは外来患者の主薬に対して、実施し得、これにより患者の費用およびリスクが減少する。これらの手順により、回復率が増加する。腹腔鏡手順の間、外科医は内視鏡を通して目的の領域を診る。外科医が見る２次元的なビデオ画像では、縫合の正確な位置付けが非常に困難であり、この様式で行われ得る外科手術のタイプを制限している。クリップおよびステープルが、いくつかの腹腔供手順については適切であるが、結石形成の可能性があること、および耐水性のシールを製造し得ないことに起因して、単独では尿路系においては使用できない。組織のレーザー接合の技術は、縫合の代替として、これらの流出を軽減する。好ましい実施例は、腸の切片が、存在する膀胱の容量を増加させるために使用される、腹腔鏡膀胱拡大(腸嚢腫形成外科)における組織接合の使用である。従来的に、この手術は切開した、開腹手順として行われている。腸の一区画を、標準的な縫合手順を使用して膀胱に取り付けるが、このことが手術を腹腔鏡的に実施することを困難にしている。この手順は開腹切開を必要とするので、術後の罹患率および入院期間は重要である。腹腔鏡の腹部への接近は、大きな腹部の切開の必要を避け、そしてこれらの小児における術後の罹患率を大きく減少させる。しかし、腹腔鏡を通した縫合による組織の接近は、困難であり、時間を浪費する。レーザー接合を使用した組織の耐水性の閉鎖を実施する能力により、組織を腹腔鏡的に近接させ得ることを顕著に改善することができる。この技術は、縫合が広範に必要であるために、腹腔鏡の考慮から現在は制限されている、無数の泌尿器科手順に適合され得る。縫合に対するレーザー接合の利点は多い。手術時間が、特に小血管を扱う場合、顕著に減少する。異物に対する反応が最少にされ、このことは、クリップおよびステープルが結石形成性であるため所望されない尿路系において、特に重要である。耐水性のシールを提供するレーザー接合の能力はまた、尿路系における使用を魅力的なものにしている。また、現在の微小縫合技術と比較して、レーザー接合が改善された治癒を示すことも見出されている。瘻孔の修復、管腔のシーリング瘻孔は、上皮化しているため、組織の切除または一般的な麻酔の使用なしでは、標準的な外科的技術を使用して修復することが困難である。対照的に、組織接合は、局所麻酔のみを使用して、長期の入院期間を必要とすることなく、組織修復を達成するために使用され得る。可能な瘻孔修復の例として、膀胱子宮膣、結腸直腸、および他の腸および皮膚の瘻孔が挙げられる。瘻孔を、好ましくは増殖因子、最も好ましくはTGFβ1と組み合わせて接合物で充填する。次いで、レーザーエネルギーを、接合物を完全に重合化する波長、ならびに接合物および／または発光団濃度を使用して適用する。例えば、50％アルブミン溶液を、1.32ミクロン光でのレーザーを使用して重合化し得、ここで水は発光団である。25％アルブミン溶液は、同一の条件で、上(すなわち、レーザーに最も近接した部分)から下まで重合化するが、これは有効ではない。レーザーは、瘻孔の表面の「脱上皮化」を生じ、瘻孔表面が一緒に回復するのを可能にする。外科的連結の代わりに組織接合を使用して、シールされ得る管腔の他のタイプは、精管およびファロピオン管のような再生性の管腔を含む。例えば、泌尿器系および胃腸管系の修復を含む、修復の多くの他のタイプがまた、達成され得る。潰瘍のような開放性創傷のシーリング組織接合を使用してまた、褥瘡性潰瘍のような開放性または慢性の創傷、あるいは他の慢性または非治癒性創傷を覆う、「円柱」または保護的な被覆を作製し得る。これは、接合物をレーザー接合することにより、好ましくは増殖エフェクター分子と組み合わせて、創傷を覆って達成され、創傷は、標準的な外科的手段またはレーザーのいずれかにより、壊死組織または感染した組織を最初に切除するために清浄にされ得る。本発明は、以下の限定しない実施例を参照することによりより理解される。実施例１：創傷強度へのアルブミン濃度および接合温度の影響。全層創傷を、ブタの背部皮膚にナイフの刃で作製した。レーザー接合での創傷の閉鎖の効率を評価する意図において、最大の創傷応力を、最適な接合温度の温度制御研究において比較した。最初の実験において、創傷を、種々の濃度のアルブミン(25％、38％、45％、および50％)と共に温度制御したレーザーを使用してレーザー接合した。図１に示すように、創傷強度は、アルブミン濃度に比例し、最大強度は50％アルブミンで得られた。第２の実験において、創傷を、50％ヒトアルブミン接合物(Albuminar-25，Arm our Pharmaceutical Co.，Kankakee，IL、凍結乾燥され、そして8mlの滅菌水を6 .45〜6.50gのアルブミンに添加して再構成した)を用いてまたは用いずに、温度制御したレーザーを使用してレーザー接合した。接合を65、75、85、および95℃ で行った。コントロールとして簡単な縫合閉鎖を用い、各温度での最大の創傷応力を、直ちに、そして術後３、８、および14日に評価した。1.32μ Nd:YAGレーザー(Lasrescope)を、温度の制御に必要であるように2.5ワット未満に調節した。アルブミン接合物を用いない急性の創傷においては、65、75、および85℃での創傷強度において有意な差は存在せず、そして95℃でのみわずかに強度が増加した。接合物を用いる急性の創傷において、最低の温度(65℃)での最大の創傷強度は、接合物を用いない最高温度(95℃)での強度と等しかった。接合物群においてより重要なことに、最大応力は、95℃での接合物を用いない強度のほぼ２倍まで、温度の増加と共に確実に増加した。このことは、レーザーエネルギー単独を使用して接合するために50％ヒトアルブミン接合物を添加した創傷強度において明らかな利点が存在することを示す。全ての２次的な動物の慢性の創傷を、アルブミン接合物で閉鎖し、そして縫合のコントロールと比較した。３日後、最大の創傷応力に対する温度の関係は逆転した；創傷は低い温度でさらに強い強度を得、そして95℃での強度よりも相対的に強かった(急性の創傷に対する絶対的な強度において同程度を維持していた)。しかし、より低い温度の創傷は、縫合のコントロールでの強度と等しかった。８日目で、縫合しそして低い温度の創傷は、95℃の創傷よりもごくわずかに強かった。全ての創傷は、全体的に強度が得られた。２週間までに、最大創傷応力は、全ての温度の創傷および縫合した創傷について同一になった。簡潔にいうと、50％ヒトアルブミン接合物でレーザー接合された創傷は、レーザー単独を使用して修復したものよりも有意に強い。高温での閉鎖は、低い温度よりも急性的には強かった。しかし、高温での修復(85および95℃)は、より遅く治癒することが見出された。２週間目までに、創傷閉鎖の全ての方法が、創傷強度の点で、等価しかった。実施例２：より低い熱変性閾値のためのアルブミンの修飾。ヒトアルブミンを、熱低温殺菌の間のアルブミンを安定化するために、0.8mM のカプレート(caprolate)Naおよび0.8mMのN-アセチルトリプトファンと組み合わせてパッケージングする。安定剤を、蒸留水中への十分な透析によって除去した。安定剤の除去により、変性閾値が顕著に変化した。処置前のアルブミンと処置後のアルブミンとの比較を、図２ａおよび図２ｂに示す。実施例３：接合物内への増殖因子の取り込みの影響。ヒト組み換え増殖因子は、モデルシステムにおいて創傷治癒を加速させることが示されている。従って、ヒトアルブミンが、レーザー媒介の創傷閉鎖後の組織の修復を加速させる目的のための増殖因子のための時間放出送達ビヒクルトしてもまた使用し得るかどうかを決定するために、研究を行った。これらの薬剤の取り込みのための重要な条件は、増殖因子がレーザーによって変性されないことであった。熱制御したレーザー送達システム(TCL)を、接合の間の安定な温度を正確に維持するために使用し、これにより生体活性増殖因子の熱変性を避けた。３つの増殖因子(HB-EGF、bFGF、およびTGFβ１)を、水浴槽中で80℃の温度に曝した後、または1.32μMのNd:YAGレーザーエネルギーを使用するTCLで、生体活性の維持について、インビトロで試験した。両方の方法による加熱後の生体活性の維持を、Balb/C-3T3マイトジェン性アッセイ(HB-EGFおよびbFGF)、またはルシフェラーザレポーターアッセイ(TGFβ₁)を使用して、各因子について実施した。インビボの実験を行って、ブタ皮膚の背側の、縫合を行っていない２cmの全層瘻孔切開の閉鎖について、増殖因子で増強した組織接合物の効力を決定した。切開を、 50μLの50％ヒトアルブミン単独、あるいはHB-EGF(２μg)、bFGF(10μg)、またはTGFβ₁(１μg)で増強したヒトアルブミンを使用して、閉鎖した。レーザー接合を、0.4mm/秒の速度で70℃で実施した。縫合のコントロール創傷は、２本の5- 0ナイロン縫合糸で閉鎖した。５つの創傷を、各群において修復した。創傷を、術後３、５、および７日後に切り出した。引っ張り強度、全コラーゲン容量、および組織学を実施した。結果を、図３ａ、３ｂ、および３ｃに示し、時間の関数としての処置の修復強度を比較する。３日目では、各群の間で、引っ張り強度における有意差は見られなかった。５日目までに、TGFβ₁群の引っ張り強度は、レーザー接合物単独および縫合群のそれぞれより、50％および25.5％増加した。図４に示すように、７日目で、TGFβ₁群は、レーザー接合物単独、または縫合よりもそれぞれ、118％および52％高まった。HB-EGF群およびbFGF群は、全ての時点でレーザー接合物群と等しかった。図５に示すように、７日目での全コラーゲン容量は、TGFβ₁群において、縫合群よりも６％、そしてレーザー接合物群よりも21％、増加した。組織学により、引っ張り強度およびコラーゲン容量において観察されるマトリックスの変化が確認された。結果として、TGFβ₁で増強したアルブミン接合物は、レーザーで接合した創傷の強度を増加し、そして創傷の処置を加速する手段を提供しこれにより術後の回復期間、入院期間、および創傷感染が減少する。実施例４：増殖因子単独とレーザー接合を用いる増殖因子との比較。最大創傷応力を、５つの群において70℃で閉鎖した創傷について比較した；縫合単独；レーザーおよび接合物；レーザー、接合物およびHB-EGF(２μg/創傷)；レーザー、接合物、および塩基性-FGF(10μg/創傷)；およびレーザー、接合物、およびTGFβ₁(１μg/創傷)。ブタを屠殺し、そして実施例３に記載するように、３、５、および７日後に創傷強度を評価した。結果を図６に示す。３日後、以下の例外を除いて群間での創傷強度に有意差はなかった：TGF処置した創傷は、縫合およびb-FGF処置した創傷の両方よりもわずかに強かった。しかし、５日後で、TGF処置した創傷は、全ての他の創傷よりも有意に強く、そしてレーザーで閉鎖した他の３つの群に対して、強度においてほぼ２倍であった。１週間目まで、関係および絶対的な創傷強度は、５日目でのそれらと同様であった。レーザー接合の非存在における増殖因子の影響の比較は、レーザー接合とTGFβ₁との組み合わせはTGFβ₁単独の投与よりもよいことを示す。データは、50％ヒトアルブミン接合物へのTGFβ₁の添加が、他の増殖因子および縫合単独と比較して、５日目および７日目で最大創傷応力を有意に増加することを決定的に示す。

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Claims

【特許請求の範囲】１．タンパク質接合物を使用するレーザー接合のための改善された方法であって、少なくとも10分の１秒、80℃の熱に曝した後に生物学的活性を有する、タンパク質、ポリサッカライド、核酸、ビタミン、金属またはイオン、および合成有機分子からなる群より選択される生体活性因子を、接合の時点またはその直後に、投与する工程を包含する、方法。２．前記生体活性因子が、酵素、止血剤、増殖エフェクター分子、静菌因子または殺菌因子、抗炎症剤、化学治療剤、抗生物質、血栓溶解剤または凝固阻害剤、麻酔剤、抗脈管形成剤、およびビタミンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。３．前記増殖エフェクター分子が、増殖因子および細胞外マトリックス分子からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。４．前記増殖因子が、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、変異成長因子(TGFα、TGFβ)、肝細胞増殖因子、ヘパリン結合因子、インスリン様増殖因子IまたはII、線維芽細胞増殖因子(FGF)、VEGF、LPA、エリスロポイエチン、神経成長因子、骨形成タンパク質、筋形成タンパク質、およびサイトカインからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。５．前期生体活性因子が、前記接合物と組み合わせられる、請求項１に記載の方法。６．組織接合において使用するための改善されたタンパク質接合物であって、少なくとも10分の１秒、80℃の熱に曝した後に生物学的活性を有する、タンパク質、ポリサッカライド、核酸、ビタミン、金属またはイオン、および合成有機分子からなる群より選択される、生体活性因子を含有する、タンパク質接合物。７．前記生体活性因子が、酵素、止血剤、増殖エフェクター分子、静菌因子または殺菌因子、抗炎症剤、化学治療剤、抗生物質、血栓溶解剤または凝固阻害剤、麻酔剤、抗脈管形成剤、およびビタミンからなる群より選択される、請求項６に記載の接合物。８．前記増殖エフェクター分子が、増殖因予および細胞外マトリックス分子からなる群より選択される、請求項７に記載の接合物。９．前記増殖因子が、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、変異成長因子(TGFα、TGFβ)、肝細胞増殖因子、ヘパリン結合因子、インスリン様増殖因子IまたはII、線維芽細胞増殖因子(FGF)、VEGF、LPA、エリスロポイエチン、神経成長因子、骨形成タンパク質、筋形成タンパク質、およびサイトカインからなる群より選択される、請求項８に記載の接合物。１０．発光団をさらに含む、請求項６に記載の接合物。１１．瘻孔を修復するためまたは管腔を充填するための方法であって、該瘻孔または管腔にタンパク質接合物を投与する工程、および該接合物を、該瘻孔または管腔の底部からエネルギー供給源の方向へ向かって、該タンパク質を変性させる条件下で、光エネルギーまたは無線周波数エネルギーに曝す工程、を包含する方法。１２．前記タンパク質接合物が、水性溶液中の50％アルブミンである、請求項１１に記載の方法。１３．開放性創傷または慢性創傷を修復するための方法であって、タンパク質接合物を該創傷に適用する工程、光エネルギーまたは無線周波数エネルギーの適用によって、該接合物を接合する工程、を包含する、方法。１４．創傷治癒を促進するため、および／または前記修復の機能的強度を加速または増強するために、前記創傷に有効量の増殖エフェクター分子を適用する工程を包含する、請求項１３に記載の方法。１５．前記増殖エフェクター分子が、前記タンパク質接合物中で適用される、請求項１４に記載の方法。１６．改善されたタンパク質接合物であって、該改善が、光エネルギーまたは無線周波数エネルギーへの曝露の前の、該タンパク質の熱変性または化学的変性を妨げる材料の除去を包含する、タンパク質接合物。１７．前記タンパク質が、熱安定化アルブミンであり、そして前記熱安定化化合物が該アルブミンから除去されている、請求項１６に記載の接合物。１８．前記タンパク質が、還元剤での処理に続いて、カルボキシル化試薬またはメチル化試薬との反応によって遊離のシステインをブロックすることによって、折り畳みを展開する、請求項１６に記載の接合物。