JPH11504632A - カルボキシ末端タンパク質またはペプチドの配列決定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アセチルクロリドまたはホスホリルクロリドを用いることによる、カルボキシ末端のチオヒダントインアミノ酸誘導体への誘導化のための酸性条件下での適当なイソチオシアネートとの反応によるタンパク質またはペプチドの有効な新規Ｃ−末端配列決定法を提供する。誘導化されたチオヒダントインアミノ酸の開裂は、水中チオシアン酸および酢酸の使用、および緩衝液およびカリウムまたはナトリウムチオシアネートまたはカリウムまたはナトリウムジチオナイト試薬を用いた新規手段により起こる。本発明はまた、まずペプチドまたはタンパク質をアセチルクロリド、またはホスホリルクロリドなどの酸塩化物試薬と反応させることからなる２または３段階プロセスによるタンパク質またはペプチドのＣ−末端配列決定のための新規で有効な手段を提供する。安定なタンパク質カルボキシ末端アミノ酸塩化物を次に有機イソチオシアネート、有機塩チオシアネート、または金属チオシアネートと反応させてチオヒダントインアミノ酸誘導体を得る。このチオヒダントインアミノ酸誘導体を、好ましくは前記で開示した新規試薬を用いた酸性または塩基性条件を用いて開裂させる。

Description

【発明の詳細な説明】 カルボキシ末端タンパク質またはペプチドの配列決定法発明の分野 本発明はペプチドまたはタンパク質のＣ−末端アミノ酸の測定法および該方法 において有用な試薬、ならびにそのＣ−末端からのペプチドまたはタンパク質の 配列決定法に関する。発明の背景 カルボキシ末端からのタンパク質の配列決定は、タンパク質構造決定における 課題である。Ｎ−末端配列決定に関する多くの方法が公開され、当業者には容易 に利用可能であるが、Ｃ−末端に関してはほとんどなされておらず、商業的用途 に用いられる方法は少ない。 シュラック（Schlack）ら、フィジオロジカル・ケミストリー(Physiol.Chem.) 、１５４：１２５−１７０（１９２６）により記載されているチオシアネート法 は、タンパク質またはペプチドのある種のイソチオシアネート試薬との無水酢酸 の存在下での反応を含み、Ｃ−末端チオヒダントインアミノ酸を形成する。誘導 されたアミノ酸を加水分解して、短縮されたポリペプチドおよびチオヒダントイ ンアミノ酸を得る。チオヒダントインアミノ酸は現在ＨＰＬＣ法により分析され る。この反応は、Ｃ−末端アミノ酸の完全な誘導に必要な条件の厳しいことが難 点である。 スターク、ジー・アール（Srark,G.R.）、バイオケミストリー(Biochemistry) 、７：１７９６−１８０７（１９６８）はさらにもう一つの穏やかで、より迅速 な開裂を行うことができる試薬としてのアセトヒドロキサメート試薬の使用を導 入した。米国特許第４８３７１６５号はトリメチルシリルイソチオシアネート試 薬（ＴＭＳ−ＩＴＣ）の使用を開示し、その結果、チオヒダントイン形成の収率 が向上し、得られる副生成物の数量が減少することを開示している。繰り返すこ とにより行われる分解サイクルの回数が制限され、収率は低かった。さらに、ア ミ ノ酸はすべて、この方法によりチオヒダントイン誘導体を形成できるわけではな かった。 ベイレイ（Bailey）ら、米国特許第５１８０８０７号はホスホロイソチオシア ネーチデートとピリジンの組み合わせのイソチオシアネート試薬の配列決定試薬 としての使用を開示する。ホスホロイソチオシアネーチデートは式：(ＰhＯ)₂− Ｐ(Ｏ)−ＮＣＳのジフェニル部分または(ＥtＯ)₂−Ｐ(Ｏ)−ＮＣＳのジエチル誘 導体を包含する。ベイレイら、米国特許第５２２７３０９号はアルキルまたはＲ_x Ｓn(ＮＣＳ)_yなどのアリールスズイソチオシアネート誘導体の使用を開示する 。ベイレイら、米国特許第５２５４４７５号はカップリング剤としてのシリルイ ソチオシアネートに関する優先性において利用するトリアルキルシラノールのア ルカリ金属塩およびトリアルキルアミンＮ−オキシドの使用を開示する。 ボイド（Boyd）ら、米国特許第５１８５２６６号はアルキル化剤でアシルチオ ヒダントイン結合を開裂し、チオヒダントイン上に付加物を形成する方法を開示 する。アシル−チオヒダントインを含有する付加物は実質的に無水酸性条件下で の反応により開裂する。 ボイドら、米国特許第５０５１３６８号はアミノ酸のケテンイミンでの活性化 によりチオヒダントインを形成し、シリルまたはピリジンイソチオシアネートと の反応によりエステルをチオヒダントインに変換する方法を開示する。 ボイドら、米国特許第５０４１３８８号はイソチオシアン酸およびカルボン酸 または炭酸の混合無水物の、塩基性条件下での使用を開示し、これはペプチドを 前記のように誘導化した活性化支持体と反応させる。 ボイドら、米国特許第５３０４４９７号は、好ましいチオシアネート、例えば ＴＭＳ−ＩＴＣ、またはメタロチオシアネートのクラウンエーテル付加物ととも にウロニウム化合物を利用するＣ−末端ペプチド配列決定において用いるＮ−保 護アミノ酸の形成法を開示する。 ミラー（Miller）、米国特許第４９３５４９４号は、アミノ酸のアリールヒダ ントイン誘導体を得るためのホスホリル（チオ）アミドカップリング剤を開示す る。ミラーら、米国特許第５０６６７８５号は、式： (Ｒ₁)_nＸ_a−Ｐ(＝Ｘ_c)((Ｒ₂)_nＸ_b)−Ｎ(Ｒ₃)−Ｃ(＝Ｘ_d)−Ｘ_eのＣ−末端ペプチ ドにおいて用いるカップリング試薬を開示する。 ホーク（Hawke）ら、米国特許第５０４９５０７号に対する特許出願は、Ｃ− 末端配列決定法であって、ペプチドを、イソチアン酸およびカルボン酸、炭酸ま たはスルホン酸の混合無水物と塩基性条件下で反応させる方法を開示する。 Ｃ−末端ペプチドの配列決定において用いる種々の基質物質が、活性化カルボ ン酸修飾ポリエチレン膜を開示するベイレイら、米国特許第５３０６７８１号お よび多孔質ポリマー材料を開示するシェリントン（Sherringto）ら、米国特許第 ５０６６７８４号により提案されている。発明の要約 本発明は手動式配列決定に適した一段階プロセスにおいて酸性条件下でのアセ チルイソチオシアネート（Ａｃ−ＮＣＳ）試薬の使用によるタンパク質のＣ−末 端でのチオヒダントインアミノ酸（ＴＨ−ＡＡ）の調製に関する。タンパク質か らのＴＨ−ＡＡのチオシアネート媒介開裂（酸性または塩基性）は、タンパク質 のＣ−末端配列決定についての新規化学的性質を構成し、公知のタンパク質およ びペプチドのエドマン（Edman）分解に匹敵する。 本発明の他の具体例は、酸塩化物、好ましくは塩化アセチル試薬の使用により タンパク質のＣ−末端でチオヒダントインアミノ酸（ＴＨ−ＡＡ）を調製するか 、またはタンパク質カルボキシクロリド誘導体を調製し、これを適当なイソチオ シアネートと反応させて、チオヒダントインアミノ酸（ＴＨ−ＡＡ）を形成し、 これを酸性または塩基性条件下で開裂させることである。この二段階反応プロセ スは、自動化配列決定機などの商業的設定における使用に適している。図面の説明 図１は適当なタンパク質またはペプチドをアセチルイソチオシアネート試薬と 反応させてカルボキシ末端チオヒダントイン誘導体を形成することによるＣ−末 端アミノ酸の配列決定および測定に関して提案される反応スキームを示す。カル ボキシ末端チオヒダントイン誘導体をこの例ではリン酸緩衝液およびチオシアン 酸カリウムを用いた塩基性条件下で開裂させてチオヒダントインアミノ酸誘導体 を放出させ、これをＨＰＬＣにより分析する。 図２は固定化した適当なタンパク質またはペプチドをアセチルイソチオシアネ ート試薬と反応させてカルボキシ末端チオヒダントイン誘導体を形成することに よるＣ−末端アミノ酸の配列決定および鑑定に関して提案される反応スキームを 示す。カルボキシ末端チオヒダントイン誘導体をこの例ではチオシアン酸および 酢酸を用いて開裂させる。 図３はｐＨ範囲にわたるＣ−末端チオヒダントインアミノ酸の安定性を示すグ ラフである。高温下または増加するpＨ下で、チオヒダントイン誘導体は安定で なく、タンパク質またはペプチドのカルボキシ末端から開裂する。 図４はカルボキシ末端のチオヒダントインアミノ酸誘導体の形成に関するＨＰ ＬＣにより分析した温度依存性を示す。 図５はカルボキシ末端のチオヒダントインアミノ酸誘導体の形成に関するＨＰ ＬＣにより分析した時間依存性を示す。 図６はｍｇ量で調製したプロリンおよびトレオニンのチオヒダントインアミノ 酸誘導体の吸収スペクトルを示す。 図７はＨＰＬＣにより分析したアミノ酸チオヒダントイン標準の混合物の分析 を示す。アミノ酸に存在する大きなピークは恐らくアセチル−ＮＣＳとともに形 成されるアセチル−ＳＣＮによるものであり、例えば塩基での処理により容易に 除去される。 図８は３サイクルでのＨＰＬＣ分析によるタンパク質リゾチームのＣ−末端配 列決定を示す。 図９は１サイクルでのＨＰＬＣ分析による、３種のペプチド、ＧＧＩ、ＧＧＬ 、ＧＧＦの混合物のＣ−末端配列決定を示す。 図１０は固定化された適当なタンパク質またはペプチドの酸塩化物およびチオ シアン酸塩との反応によりカルボキシ末端チオヒダントイン誘導体を形成するＣ −末端アミノ酸の配列決定および鑑定に関して提案された反応スキームを示す。 カルボキシ末端チオヒダントイン誘導体は、この例では、リン酸緩衝液、チオシ アン酸カリウムを用いた塩基性反応条件下で開裂して、チオヒダントインアミノ 酸を放出させ、これをＨＰＬＣにより分析する。 図１１は３種の酸塩化物およびチオシアン酸カリウムを用いたそのチオヒダン トイン形成のＨＰＬＣ分析による、３種のペプチド、ＧＧＩ、ＧＧＬ、ＧＧＦの 混合物のＣ−末端配列決定を示す。発明の詳細な記載 カルボキシ末端配列決定においては、Ｃ−末端誘導化の化学的性質；Ｃ−末端 誘導体の開裂；誘導体の同定；適当なアミノ酸標準の利用可能性；および各段階 でのチオヒダントインの収率を含む多くの問題がある。本発明は誘導化されたチ オヒダントイン誘導体を産する容易に利用可能な化学反応を提供する。チオヒダ ントイン誘導体は高収率で容易に開裂可能で、公知の技術および標準を用いて得 られたアミノ酸の同定が可能になる。 本発明の一態様は、Ｃ−末端誘導化プロセスの発見であり、これにより塩化ア セチル（Ａｃ−Ｃｌ）および適当なチオシアネート／イソチオシアネートの使用 によりチオヒダントインアミノ酸（ＴＨ−ＡＡ）を得、イソチオシアン酸アセチ ル（Ａｃ−ＮＣＳ）試薬を得るか；またはホスホリルクロリドＰ(Ｏ)Ｃl₃および 適当なチオシアネート／イソチオシアネート試薬の使用により、手動配列決定の ための試薬Ｐ(Ｏ)Ｃl₂−ＮＣＳ(Ｐ(Ｏ)ＮＣＳ)を得る。好ましくは、用いる最終 的な試薬はＡｃ−ＮＣＳである。 Ｐ(Ｏ)Ｃl₃部のイソチオシアネートとの反応により、Ｐ(Ｏ)Ｃl(ＮＣＳ)₂、Ｐ (Ｏ)Ｃl₂ＮＣＳまたはＰ(Ｏ)(ＮＣＳ)₃またはその組み合わせの最終試薬の組み 合わせが得られると理解される。すべて本発明で用いることについて許容され、 モル等量で測定されたその量は当業者には容易に理解できる。 したがって、本発明の一具体例は、一段階プロセスにおける酸性条件下でのＡ ｃ−ＮＣＳ、Ｐ(Ｏ)ＮＣＳ、またはＰ(Ｅt)ＮＣＳの試薬の使用によるタンパク 質のＣ−末端でのチオヒダントインアミノ酸（ＴＨ−ＡＡ）の調製であり、この プロセスは手動配列決定に適している。タンパク質からのＴＨ−ＡＡのチオシア ネート媒介開裂（酸性または塩基性）はタンパク質のＣ−末端配列決定の新規 化学的作用を構成し、タンパク質およびペプチドの公知のエドマン分解に匹敵す る。 本発明の利点は、アセチルイソチオシアネートが短期間、約１０分間で容易に 調製でき、チオヒダントイン標準も遊離アミノ酸から容易に調製されることであ る。 本発明の別の態様は、ペプチドからのＴＨ−ＡＡの新規開裂、または標準の作 成において用いる遊離アミノ酸である。本明細書において記載する場合、Ｃ−末 端誘導化ＴＨ−ＡＡのタンパク質からの開裂は、酸性または塩基性のいずれかの 条件下で行われる。本発明の好ましい具体例は、新規試薬、チオシアネート、好 ましくは、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のチオシアネート、より好まし くは、ナトリウムまたはカリウムチオシアネート、またはアルカリ金属またはア ルカリ土類金属のジチオナイト（Ｓ₂Ｏ₄）、好ましくは、カリウムまたはナトリ ウムジチオナイト（Ｓ₂Ｏ₄）、および緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液、 炭酸緩衝液またはホウ酸緩衝液、好ましくはリン酸ナトリウム緩衝液の有機溶媒 中混合物の使用である。適当には、それぞれのモル濃度は、約０.０１Ｍないし ０.２Ｍ、好ましくは約０.１Ｍである。適当には、有機溶媒はアセトニトリル、 短鎖アルコール、例えばメタノール、イソプロパノール、エタノール、ｔ−ブタ ノール、ｎ−ブタノール、好ましくはアセトニトリルで、約０.５ないし２０％ （ｖ／ｖ）である。ｐＨは適当には、約８ないし１２、適当には１０ないし１２ である。反応は常温、または好ましくは高温、例えば約４０ないし６０℃で起こ り得る。反応はまた約５分ないし数時間かかり、好ましくは６０℃で約１０ない し２０分かかる。タンパク質からのＴＨ−ＡＡのチオシアネート媒介塩基性開裂 についての室温の高温に対する比較をさらに図３に記載する。 本発明の別の態様は、適当な酸、例えば約０.１Ｍないし１.５Ｍのチオシアン 酸と酢酸を用いた酸性条件下でのタンパク質からのＴＨ−ＡＡの新規開裂である 。反応は常温または高温で起こり得る。反応は、また約２０分ないし１時間、好 ましくは約２５ないし４５分かかる。酸開裂の例を図７に示し、これはチオヒダ ントインアミノ酸の誘導化および開裂の最終生成物である。遊離アミノ酸は溶液 中 アセチルイソチオシアネトで適当に誘導化され、これに水を添加して、Ａｃ−Ｎ ＣＳの試薬としての使用（ＴＨ−ＡＡの誘導化に関して）から等モル比のチオシ アン酸と酢酸の混合物を形成する。 本発明の別の態様は、酸塩化物、好ましくは塩化アセチル試薬、ＣＨ₃Ｓ(Ｏ)₂ Ｃl、Ｐ(Ｏ)Ｃl₃、ジエチルホスホリルクロリド、またはフェニレンＰ(Ｏ)₃Ｃl の使用によりタンパク質のＣ−末端でチオヒダントインアミノ酸（ＴＨ−ＡＡ） を調製して、タンパク質カルボキシクロリド誘導体を得、これを適当なイソチオ シアネートと反応させてチオヒダントインアミノ酸（ＴＨ−ＡＡ）を形成するこ とである。この二段階反応プロセスは、前記のような酸性または塩基性条件下で の第三の開裂段階に添加した場合、自動化配列決定機における使用に適している 。 本明細書において用いる場合、ペプチドまたはタンパク質部分は、式： によっても表される。 本明細書において用いる場合、ペプチドカルボキシクロリド誘導体は、式： により表される。一段階プロセス 一段階プロセスにおいて、イソチオシアネートカップリング剤は適当なイソチ オシアネート試薬を用いて、好ましくは、ＫＳＣＮとの反応またはトリメチルシ リルイソチオシアネート（ＴＭＳ−ＩＴＣ）との反応のいずれかにより調製され る。 Ｃ−末端誘導化を、酢酸、トリフルオロ酢酸および塩酸、好ましくは酢酸を用 いた酸性条件下で行う。反応は、約２０ないし約８０℃の温度条件下、好ましく は約６５℃で行う。適当には、反応時間は約５分ないし約８０分、好ましくは約 ４０分間である。 タンパク質からのＣ−末端ＴＨ−ＡＡの開裂は、前記のような酸性または塩基 性のいずれかの条件下で行う。Ａｃ−ＮＣＳ試薬のこの一段階プロセスにおける 使用は、タンパク質からのＴＨ−ＡＡの開裂に関する酸性条件下をもたらすと考 えられる。このような条件は、支持されたペプチドの水の添加での処理により促 進できる。反応は、常温または高温、例えば約４０ないし８０℃で行うことがで きる。反応は、約２０分ないし１時間、好ましくは約２５ないし４５分間行う。二段階プロセス 二段階プロセスにおいて、タンパク質を適当な酸塩化物、例えばアセチルクロ リド、メチルスルホニルクロリド、またはホスホリルクロリドと酸性条件下で反 応させて、安定なタンパク質カルボキシクロリドを得る。タンパク質カルボキシ クロリドを次に酸性条件下で、有機塩チオシアネート、例えばグアニジンチオシ アネート、またはピペリジンチオシアネート；有機イソチオシアネート、例えば ＴＭＳ−ＩＴＣまたは金属チオシアネート、例えばＫ⁺またはＮａ⁺（イソ）チオ シアネートのいずれかと反応させて、Ｃ−末端タンパク質チオヒダントイン誘導 体（ＡＡ−ＴＨ）を得る。この反応は一般に図１０に記載し、実際の実施例をさ らに図１１に示す。 タンパク質Ｃ−末端誘導化は前記のように、適当な酸、例えば酢酸、トリフル オロ酢酸および塩酸を用いた酸性条件下、約２０ないし８０℃、好ましくは約５ ５ないし６５℃の種々の温度条件下で行う。適当には、反応時間は約５ないし８ ０分、好ましくは約３０ないし約４５分間である。 タンパク質からのＣ−末端ＴＨ−ＡＡの開裂は、前記のような酸性または塩基 性条件下で行う。適当には、自動化配列決定に関して、開裂は塩基性条件下で起 こる。このような目的についての適当な試薬は、新規試薬、チオシアネート、好 ましくはアルカリ金属またはアルカリ土類金属チオシアネート、より好ましくは ナトリウムまたはカリウムチオシアネート、またはアルカリ金属またはアルカリ 土類金属ジチオナイト（Ｓ₂Ｏ₄）、好ましくはカリウムまたはナトリウムジチオ ナイト（Ｓ₂Ｏ₄）、および緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液、炭酸緩衝液 またはホウ酸緩衝液、好ましくはリン酸ナトリウム緩衝液の有機溶媒中混合物の 使用である。好ましくは、試薬は緩衝液、好ましくはリン酸ナトリウム緩衝液、 およびカリウムまたはナトリウムチオシアネートまたはカリウムまたはナトリウ ムジチオナイト（Ｓ₂Ｏ₄）の有機溶媒、例えばアセトニトリル中混合物である。合成例 本発明を、単に例示にすぎず本発明の範囲を制限しない以下の実施例を参考に して説明する。特記しないかぎり、温度はすべて摂氏で表し、全溶媒は可能な限 り高純度であり、反応はすべて無水条件下で行う。 実施例１ アセチルイソチオシアネートカップリング溶液の調製 試薬および標準：トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ−ＩＴＣ）、グ アニジンチオシアネート（Ｇｕ・ＨＳＣＮ）またはピペリジンＨＳＣＮ、アセチ ルクロリド、無水酢酸および酢酸（アルトリッチ・ケミカル（登録商標））。 ａ）Ｇｕ・ＳＣＮから：２００ｍｇのＧｕ・ＳＣＮをねじ蓋マイクロ遠心管（シ グマより入手した１.６ｍｌポリプロピレンフリーズバイアル）中０.８ｍｌのア セトニトリル中に溶解した。５０ｕｌの無水酢酸および５ｕｌの酢酸を添加し、 混合した。この混合物に、０.１５ｍｌのアセチルクロリドを添加し、ボルテッ クスミキサーで約５分間混合した。Ｇｕ・ＨＣｌを沈殿させ、アセチルイソチオ シアネート（Ａｃ−ＮＣＳ）溶液から遠心分離により分離した。 ｂ）ＴＭＳ−ＩＴＣから：０.５ｍｌのアセトニトリルに、０.３ｍｌのＴＭＳ− ＩＴＣ、０.１５ｍｌのアセチルクロリド、５０ｕｌの無水酢酸および５ｕｌの 酢酸を添加し、混合した。この場合、遠心分離する必要はない。 工程（ａ）および（ｂ）において調製した両試薬は同じ結果を生じる。 実施例２ アミノ酸チオヒダントイン標準の調製： 前記の実施例１、工程（ａ）または（ｂ）にしたがって調製したアセチルイソチ オシアネート試薬を用いて、アミノ酸チオヒダントイン標準の調製を、ベックマ ン・ラボラトリーズまたはピアス・ケミカルズなどの商業的供給源から購入した 容易に入手可能な遊離アミノ酸を用いて行った。遊離アミノ酸および少量のペプ チドもシグマ・ケミカルズまたはアルトリッチ・ケミカルズから購入する。 ａ）乾燥アミノ酸を個々にまたは混合物（それぞれ＜１０ナノモル、６５℃のオ ーブンまたはＲｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍヒーティング・ブロックを用いてねじ蓋 フリーズバイアル中で乾燥した約３ｕｌのアミノ酸標準混合物）を５０ないし６ ０ｕｌのアセチルイソシアネートカップリング溶液と混合し、約１０分間超音波 処理した。バイアルを６５℃で４０分間加熱した。バイアルを室温に冷却後、反 応混合物を水で０.５ｍｌに希釈し、油状液体が水中に溶解するまでよく混合し た（約５分）。バイアルを再び６５℃で４５ないし６０分間加熱した。反応混合 物のアリコート（２５ないし５０ｕｌ）をＨＰＬＣにより分析した。 ＨＰＬＣ分析：チオヒダントインを適当なカラム、例えば、HypercarbｐＨ（３. ０×１００ｍｍ、黒鉛化炭素、オールテックより入手可能なシャンドン）カラム を用い、水中（溶媒Ａ）およびアセトニトリル中（溶媒Ｂ）０.１％ ＴＦＡを 用いて分離した。用いた流量は、３５℃（カラムヒーターを使用）で０.４ｍｌ ／分であった。ＡＡ−ＴＨ分離に関して、３０分で３ないし６０％Ｂの線状勾配 、続いて１００％Ｂでの洗浄を採用した。Ｔｒｐ−ＴＨが洗浄液中に溶出した。 他の適当なカラムを代用してもよい［ベイレイら、プロテイン・サイエンス（Pr otein Science）、１：１６６２−３３（１９９２）参照］。脱水形については ３１９ｎｍで検出されたＳｅｒ−ＴｈおよびＴｈｒ−Ｔｈを除いて、チオヒダン トインを２６５ｎｍで検出した。 ＳｅｒおよびＴｈｒはこれらの本明細書中に記載した酸性条件下でさえも相当 量の脱水生成物を生じた。Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｓ−Ｃｍ−Ｃｙｓに関して問題はあ ってもほとんどなく、これはこの方法により非常に容易に製造できる。当業者に よ り理解される適当な修飾を加えた反応条件を１０ないし１００ｍｇのＡ−ＴＨ標 準を迅速に調製するのに用いることができる。 手動式配列決定に関して、第１サイクルに関する配列化収率は＞９０％であり 、第２サイクルに関しては第１サイクルの約５０％である。この条件はＨＰＬＣ により同じヒダントインを産するＳｅｒおよびＣｙｓを有する。 実施例３ タンパク質またはペプチドの末端カルボキシ配列決定 前記の実施例１、工程（ａ）または（ｂ）にしたがって調製したアセチルイソチ オシアネート試薬を用いて、固定化されたペプチドまたはタンパク質をカルボキ シ末端から配列決定するために調製した。この例においては、タンパク質リゾチ ームを示した。別法として、タンパク質組換えイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、 β−ラクトグロブリン、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を以下に示すのと 同様の手順を用いて行う。 リゾチームをSequelon（登録商標）−ＤＩＴＣ（ミリポア・コーポレイション 製品）（または等価物）膜上に製造業者の指示にしたがって固定した。リゾチー ムを含有するSequelon（登録商標）ディスクを０.１ないし０.２ｍｌのアセチル イソチオシアネートカップリング溶液で４５ないし７５℃、好ましくは６５℃で 、４０ないし１００分間、好ましくは４０分間処理した。タンパク質ディスクを 連続してアセトニトリル、メタノールおよび３０％（ｖ／ｖ）水中メタノールで 洗浄した。形成されたＣ−末端チオヒダントインを０.１Ｍ ＫＳＣＮを含有する ０.１５ｍｌの０.１Ｍ リン酸ナトリウムｐＨ１１（６０℃）またはｐＨ１２（ 外界温度）および３０％メタノール溶液を用いて５ないし８０分、好ましくは６ ０℃で１５分、室温で４０分間、リゾチームから開裂させた。タンパク質ディス クを開裂溶液から除去し、チオヒダントインを希酢酸で酸性にした。開裂したチ オヒダントインを前記の実施例２のようにしてHypercarbカラムを用いてＨＰＬ Ｃにより確認した。 第二サイクルについて、タンパク質を含有するディスクを連続して、５％水中 トリフルオロ酢酸、３０％メタノール−水およびアセトニトリルで洗浄し、前記 の誘導化法をそっくりそのまま繰り返した。 実施例４ 酸塩化物およびチオシアネートを用いたカルボキシ末端誘導化： 等モル量のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＩｌｅおよびＧｌｙ− Ｇｌｙ−Ｐｈｅのペプチド混合物を前記実施例３に記載したようにSequelon−Ｄ ＩＴＣ膜ディスク上に固定化した。ペプチドを含有するディスクをまず過剰の酸 塩化物（例えば、アセチルクロリド、メチルスルホニルクロリド、ホスホリルク ロリドおよびジエチルホスホリルクロリドなど）で約５５ないし６０℃で約１０ 分間処理した。ディスクを無水アセトニトリルで洗浄し、チオシアネート溶液（ 例えば、ＫＳＣＮのアセトン中飽和溶液、アセトニトリル中グアニジンチオシア ネートおよびアセトニトリル中トリメチルシリル−イソチオシアネートなど）、 好ましくはアセトニトリル中約２Ｍグアニジンチオシアネートで、２２℃ないし ９０℃、好ましくは５５ないし６０℃で１０分間処理した。ディスクを連続して 、アセトニトリル、メタノールおよび３０％メタノール溶液（ｖ／ｖ）で洗浄し た。形成されたチオヒダントインを前記実施例２および３のようにして開裂し、 ＨＰＬＣにより確認した。 実施例５ アミノ酸チオヒダントイン標準の調製： 以下の方法を、大量のアミノ酸チオヒダントイン標準の調製に用いた。この手 順は、他の修飾も可能であるが、実施例２に記載した方法の一修正法である。そ れぞれ４×１.２５ｇのグアニジンチオシアネートを、４つの別々の１５ｍｌポ リプロピレンねじ蓋試験管中４×９ｍｌのアセトニトリル中に溶解した。各試験 管に、０.３７５ｍｌの無水酢酸および０.０６５ｍｌの酢酸および１.２５ｍｌ のアセチルクロリドを添加し、シェーカー（Tekmar）を用いて激しく攪拌した。 得られたグアニジン・ＨＣｌを遠心分離により分離し、上清（カップリング溶液 ）を２５０ｍｌ丸底フラスコ中で合した。約５００ｍｇの遊離アミノ酸をカップ リング溶液中に溶解した。反応混合物を３０℃ないし９０℃、好ましくは６０℃ で、２０ないし１２０分間、好ましくは６０分間加熱した。反応混合物を室温に 冷却 し、等容積の水で希釈し、前記のように、好ましくは６０℃で６０分間再加熱し た。冷却後、反応混合物をロータリーエバポレーターを用いて乾燥させた。残渣 を酢酸エチル（〜５０ないし７５ｍｌ）中に溶解し、可溶性物質を別のフラスコ に移し、前記のようにして乾燥した。この残渣を最小量の温水中に溶解し、フラ スコを冷蔵庫中に一夜放置した。黄色がかった粉末を溶液から分離し、エーテル または塩化メチレンで洗浄し、乾燥した。チオヒダントインの収率はカップリン グ溶液中のアミノ酸の溶解性にのみ依存する。プロリンおよびトレオニンに関し て、収率はそれぞれ〜９０％および４０％であった。チオヒダントインはＨＰＬ Ｃ（１つのピーク）によると純度＞９８％であった。元素分析および吸収スペク トルは、すでに開示された結果と一致した。 前記の事項は完全にその好ましい具体例を含む本発明を開示するものである。 本明細書に開示した例の修正および改良は、以下の請求の範囲に含まれる。さら に工夫することなく、当業者であれば前記の事項を用いて本発明を最大限に利用 することができると考えられる。したがって、本明細書中の実施例は単なる例示 であって、本発明の範囲をなんら制限するものではない。排他性または優先性を 含む本発明の具体例を以下に定義する。

───────────────────────────────────────────────────── 【要約の続き】 性または塩基性条件を用いて開裂させる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．カルボキシル末端の誘導化によるペプチドまたはタンパク質の配列決定法 であって、ペプチドまたはタンパク質をイソチオシアネート試薬と反応させてカ ルボキシ末端チオヒダントインアミノ酸を形成し、ここにイソチオシアネート試 薬がアセチルイソチオシアネート、Ｐ(Ｏ)−(Ｃl)₂−ＮＣＳまたはＰ(Ｏ)−(Ｃl )−(ＮＣＳ)₂であることを特徴とする方法。 ２．アセチルクロリドをイソチオシアネートのアルカリ塩または有機イソチオ シアネートと反応させることによりイソチオシアネート試薬を調製する請求項１ 記載の方法。 ３．イソチオシアネートのアルカリ塩がカリウムイソチオシアネートであり； 有機イソチオシアネート試薬がトリメチルシリルイソチオシアネートである請求 項２記載の方法。 ４．タンパク質またはペプチドを固体支持体に共有結合させる請求項１記載の 方法。 ５．カルボキシ末端チオヒダントインアミノ酸を酸または塩基で開裂させてチ オヒダントインアミノ酸を遊離させる請求項１記載の方法。 ６．アミノ酸の決定のために、遊離したチオヒダントインアミノ酸を分析する 請求項５記載の方法。 ７．カルボキシ末端チオヒダントインアミノ酸の開裂がチオシアン酸および酢 酸でなされる請求項５記載の方法。 ８．水を反応混合物に添加する請求項７記載の方法。 ９．開裂が緩衝液およびアルカリ金属またはアルカリ土類金属チオシアネート 、またはアルカリ金属またはアルカリ土類金属ジチオナイト（Ｓ₂Ｏ₄）でなされ る請求項５記載の方法。 １０．アルカリ金属またはアルカリ土類金属チオシアネートがカリウムまたは ナトリウムチオシアネートであり；アルカリ金属またはアルカリ土類金属ジチオ ナイト（Ｓ₂Ｏ₄）がカリウムまたはナトリウムジチオナイトである請求項９記 載の方法。 １１．各試薬のモル濃度が約０.０１Ｍないし０.２Ｍである請求項９記載の方 法。 １２．さらに有機溶媒を有してなる請求項９記載の方法。 １３．有機溶媒がアセトニトリルである請求項１２記載の方法。 １４．反応プロセスを外界温度または約４０ないし６０℃で行い；そのｐＨが 適当には約８ないし１２である請求項９記載の方法。 １５．緩衝液がリン酸ナトリウム緩衝液、炭酸塩緩衝液またはホウ酸塩緩衝液 である請求項９記載の方法。 １６．カルボキシル末端誘導化が、酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸またはその 混合物を用いた酸性条件下で行われる請求項１記載の方法。 １７．イソチオシアネート試薬がアセチルイソチオシアネートである請求項１ 記載の方法。 １８．イソチオシアネート試薬がＰ(Ｏ)−(Ｃl)₂−ＮＣＳまたはＰ(Ｏ)−(Ｃl )−(ＮＣＳ)₂である請求項１記載の方法。 １９．カルボキシル末端誘導化によるペプチドまたはタンパク質の配列決定方 法であって、 ａ）ペプチドまたはタンパク質を、アセチルイソチオシアネート、Ｐ(Ｏ)−( Ｃl)₂−ＮＣＳおよびＰ(Ｏ)−(Ｃl)−(ＮＣＳ)₂からなる群より選択したイソチ オシアネート試薬と反応させてカルボキシ末端チオヒダントインアミノ酸を形成 し； ｂ）カルボキシ末端チオヒダントインアミノ酸を酸または塩基で開裂させてチ オヒダントインアミノ酸を遊離させる ことからなる方法。 ２０．アミノ酸の決定のために、遊離したチオヒダントインアミノ酸を分析す る請求項１９記載の方法。 ２１．カルボキシル末端誘導化によるペプチドまたはタンパク質の配列決定方 法であって、 １）ペプチドまたはタンパク質を酸塩化物と反応させてタンパク質カルボキシ クロリド誘導体を得； ２）タンパク質カルボキシクロリド誘導体を有機塩チオシアネート、有機イソ チオシアネート、またはイソチオシアネートのアルカリまたはアルカリ土類金属 塩と反応させて、カルボキシ末端チオヒダントインアミノ酸を形成する ことからなる方法。 ２２．カルボキシ末端チオヒダントインアミノ酸を酸または塩基で開裂させて チオヒダントインアミノ酸を遊離させる請求項２１記載の方法。 ２３．アミノ酸の決定のために、遊離したチドヒダントインアミノ酸を分析す る請求項２２記載の方法。 ２４．イソチオシアネートのアルカリ塩がカリウムまたはナトリウムイソチオ シアネートであり；有機イソチオシアネート試薬がグアニジンチオシアネート、 またはピペリジンチオシアネートであり；チオシアネートの有機塩がトリメチル シリルイソチオシアネートである請求項２１記載の方法。 ２５．酸塩化物誘導体がアセチルクロリド、メチルスルホニルクロリド、ジエ チルホスホリルクロリド、またはホスホリルクロリドである請求項２１記載の方 法。 ２６．酸塩化物の添加による誘導化を、酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸または その混合物を用いた酸性条件下で行う請求項２１記載の方法。 ２７．開裂が緩衝液およびカリウムチオシアネートまたはカリウムジチオナイ ト（Ｓ₂Ｏ₄）の混合物でなされる請求項２２記載の方法。 ２８．各試薬のモル濃度が０.０１Ｍないし０.２Ｍである請求項２７記載の方 法。 ２９．さらに有機溶媒を有してなる請求項２７記載の方法。 ３０．有機溶媒がアセトニトリルである請求項２９記載の方法。 ３１．反応プロセスを外界温度または約４０ないし６０℃で行い；そのｐＨが 約８ないし１２である請求項２７記載の方法。