【発明の詳細な説明】
チロシンおよび重合アレルゲンの組成物
本発明は、アレルギー患者の脱感作療法のための新規組成物に関する。
GB-A-1 492 973には、分散された修飾アレルゲンを有するチロシンの共沈物質
の製造方法が開示されている。該アレルゲンは、分子内架橋を生じるか、または
、非修飾アレルゲンに関連する生成物のアレルゲン性を低下させる、グルタルア
ルデヒドなどの薬剤での治療によって修飾された。
EP-A-0 367 306およびNakadaら（Allergy，54［1985］437以下参照）には、架
橋剤により延長処理して分子内架橋を生じさせ、次いで、濾過または透析して非
重合生成物を除去することによる重合アレルゲンの製造方法が開示されている。
該重合アレルゲンは、低下したアレルゲン性を有すると開示されている。
本発明は、チロシンおよび重合アレルゲン性を含有してなる医薬組成物を提供
するものである。典型的には、該アレルゲンは、例えば共沈などにより、チロシ
ンで被覆されているか、および／またはチロシンに吸着されている。
該アレルゲンは、花粉（例えば、ブタクサまたは樺の花粉）、食物、昆虫毒、
カビ、動物毛皮、またはハウスダストダニ（ディ・ファリナエ（Ｄ．farinae）
またはディ・プテロナイスシナス（Ｄ．pteronyssinus））などのアレルギー原
因物質から得られてよい。特定の態様では、該アレルゲンは、ディ・プテロナイ
スシナスから得られる。本明細書で用いる場合、「アレルゲン」としては、単一
供給源または１以上の供給源由来であってもよいアレルゲンの混合物が挙げられ
る。
本発明のさらなる態様は、（ａ）アレルゲンを重合化し、（ｂ）該アレルゲン
の水溶液を強い水性酸中のチロシンの溶液と混合し、（ｃ）溶液の混合物を中和
し、これにより、チロシンおよび重合アレルゲンを共沈させ、次いで、（ｄ）所
望により、該生成物を生理学的に許容される担体と混合することを特徴とする、
本発明の医薬組成物の製造方法を提供するものである。
適切な生理学的に許容される担体としては、フェノール−生理食塩水および無
菌水が挙げられる。
該アレルゲンは、pＨ３〜１０、典型的にはpＨ７±１で、０〜１００℃の温度
、典型的には４〜３７℃の温度で、１０時間まで、例えば、室温で約２時間、水
溶液中で、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒドで処理することによって重合
化される。グルタルアルデヒドに対するアレルゲンの比率は、１：２５〜１：２
の範囲、例えば、約１：４（ｗ／ｗ）であるが、より長い反応時間と共に、より
高いアレルゲン比を用いてよい（例えば、約３：１の比および約７時間の反応時
間を用いる、EP-A-0 367 306を参照）。
次いで、低分子量生成物を、ゲル濾過または透析、例えば、接線流透析（tang
ential flow dialysis）によって除去し、該生成物を凍結乾燥するかまたは次工
程でそのまま用いる。遮断された分子量は、典型的には、少なくとも１００キロ
ダルトン、例えば、少なくとも２５０キロダルトン、より好ましくは、３００キ
ロダルトンである。
次いで、重合化プロセスまたは固体の溶媒和により反応混合物として得られた
pＨ７±１の重合アレルゲンの溶液を、強い水性酸中のチロシンの溶液と混合す
る。この工程で用いた重合アレルゲンの溶液は、典型的には、０.１μg／ml〜１
００μg／mlのアレルゲンタンパク質を含有する。該混合物中のアレルゲン：チ
ロシンの比率は、典型的には、１：４×１０5〜１：４×１０2ｗ／ｗの範囲であ
る。
得られたアレルゲンおよびチロシンの溶液の混合物を中和する。中和とは、４
.０〜７.５の範囲内の値にpＨを調節することを意味する。中和の間、かつて一
度も、または少なくとも延長された時間で一度も、溶液のpＨが７.５以上に相当
に上昇しないことは重要である。この条件は、所望により、該溶液を強く撹拌す
ることによって、および必要量の塩基の使用のみによって、満たすことができる
。アレルゲンの該溶液に種々の緩衝化剤を注意深く添加して、混合および中和工
程の間にpＨ調節を助けることができる。
中和を行うのに特に有用な方法は、酸中のチロシンの溶液およびアレルゲンの
溶液中に送り込もうとする中和性塩基の分流についてである。添加された溶液の
流速は、pＨ状態によって、すなわち、反応混合物のpＨが予め決定されたレベル
で実質的に一定のままであるように溶液の一方または両方の流れを調節する装置
によって調節される。本発明者らは、正確なpＨはアレルゲンの性質にしたがっ
て変化するかもしれないが、通常、最適な結果が６.５〜７.５の範囲内でのpＨ
調節によって得られることを見いだした。
中和の結果は、チロシンの即時沈殿であり、この間および／またはこの後にア
レルゲンの溶液が吸蔵されるか、および／または吸着される。沈殿後、該混合物
を即時洗浄するか、または、洗浄前に数時間から１または２日間放置させる。該
沈殿物は、できる限り微細な状態で得られるのが望ましく、このことは、該沈殿
が行われている間の強い撹拌と組み合わせた溶液の迅速な中和によって行われる
。
得られた沈殿物は、遠心分離または濾過によって該溶液から除去され、フェノ
ール−生理食塩水または無菌水などの生理学的に許容される担体中に再懸濁させ
る前に、例えばフェノール−生理食塩水などで洗浄されて、脱感作療法における
使用に適している注射用組成物を調製してよい。
以下の実施例は、本発明を説明する：
実施例
透析または分別によって一部精製した約２.５mg／mlのディ・プテロナイスシ
ナス（Ｄ．pteronyssinus）抽出タンパク質の中性溶液を、等量の１％ｗ／ｖグ
ルタルアルデヒドの添加によって重合化させ、該混合物を室温で約２時間撹拌し
た。該反応を、等量の２％ｗ／ｖグリシンの添加によってクエンチし、該混合物
を室温でさらに１時間撹拌した。３００キロダルトンの分子量排除を有する膜を
横切るジアフィルトレーション（diafiltration）によって、低分子量物質を除
去した。次いで、該混合物を濾過滅菌し、凍結乾燥させた。
重合アレルゲンの溶液は、濾過滅菌溶液から直接、または、凍結乾燥固体の再
生によって調製した。この溶液は、リン緩衝液pＨ７±１中、１０μg／mlを含有
した。ＨＣl中の１容量倍のＬ−チロシン（Ｌ−チロシン２４gを３.４Ｍ ＨＣl
で１００mlに溶解させて調製した）および１容量倍の３.２Ｍ ＮaＯＨを強く撹
拌しつつ同時添加してアレルゲン溶液の４容量倍にすることによって、アレルゲ
ン溶液をチロシンと共沈させた。このようにして形成された懸濁液を遠心分離し
、緩衝生理食塩水で繰り返し洗浄して汚染物質を除去し、緩衝生理食塩水pＨ６
±１中で初期容量に再懸濁させた。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Composition of Tyrosine and Polymerized Allergen The present invention relates to a novel composition for desensitization therapy of allergic patients. GB-A-1 492 973 discloses a method for producing a co-precipitated tyrosine with a dispersed modified allergen. The allergen has been modified by treatment with an agent such as glutaraldehyde that causes intramolecular cross-linking or reduces the allergenicity of the product associated with the unmodified allergen. EP-A-0 367 306 and Nakada et al. (See Allergy, 54 [1985] 437 et seq.) Provide a prolongation treatment with a cross-linking agent to produce intramolecular cross-linking, followed by filtration or dialysis to remove unpolymerized products. A method for producing a polymerized allergen by removal is disclosed. The polymerized allergen is disclosed as having reduced allergenicity. The present invention provides a pharmaceutical composition comprising tyrosine and polymerized allergenicity. Typically, the allergen is coated with tyrosine and / or adsorbed to tyrosine, such as by co-precipitation. The allergen may be pollen (eg, ragweed or birch pollen), food, insect venom, mold, animal fur, or house dust mite (D. farinae or D. pteronyssinus). It may be obtained from allergic substances such as. In certain embodiments, the allergen is obtained from Di Pteronais sinus. As used herein, "allergen" includes a mixture of allergens, which may be from a single source or from one or more sources. Further aspects of the invention include (a) polymerizing the allergen, (b) mixing an aqueous solution of the allergen with a solution of tyrosine in a strong aqueous acid, and (c) neutralizing the mixture of solutions, whereby the tyrosine And co-precipitating the polymerized allergen, and then (d) optionally mixing the product with a physiologically acceptable carrier, to provide a method for producing the pharmaceutical composition of the present invention. is there. Suitable physiologically acceptable carriers include phenol-saline and sterile water. The allergen is at pH 3-10, typically pH 7 ± 1, at a temperature of 0-100 ° C., typically 4-37 ° C., for up to 10 hours, for example at room temperature for about 2 hours, in aqueous solution. And polymerized by treatment with a dialdehyde such as glutaraldehyde. The ratio of allergen to glutaraldehyde is in the range of 1:25 to 1: 2, for example, about 1: 4 (w / w), but with longer reaction times, higher allergen ratios may be used (eg, Using a ratio of about 3: 1 and a reaction time of about 7 hours, see EP-A-0 367 306). The low molecular weight product is then removed by gel filtration or dialysis, for example, tangential flow dialysis, and the product is lyophilized or used directly in the next step. The blocked molecular weight is typically at least 100 kilodaltons, for example, at least 250 kilodaltons, more preferably 300 kilodaltons. The solution of the polymerized allergen at pH 7 ± 1, obtained as a reaction mixture by the polymerization process or by solvation of the solid, is then mixed with a solution of tyrosine in a strong aqueous acid. The solution of the polymerized allergen used in this step typically contains 0.1 μg / ml to 100 μg / ml of the allergen protein. The allergen: tyrosine ratio in the mixture typically ranges from 1: 4 × 10 5 to 1: 4 × 10 2 w / w. Neutralize the resulting mixture of allergen and tyrosine solution. Neutralization refers to adjusting the pH to a value within the range of 4.0 to 7.5. It is important that the pH of the solution does not rise significantly above 7.5, once, or at least once for an extended period of time, during neutralization. This condition can, if desired, be met by vigorously stirring the solution and only by using the required amount of base. Various buffers may be carefully added to the solution of the allergen to aid pH adjustment during the mixing and neutralization steps. A particularly useful method for performing the neutralization is with a diversion of the tyrosine in acid and the neutralizing base to be pumped into the solution of the allergen. The flow rate of the added solution is adjusted by the pH conditions, i.e. by means of a device that adjusts the flow of one or both of the solutions so that the pH of the reaction mixture remains substantially constant at a predetermined level. . We have found that although the exact pH may vary according to the nature of the allergen, optimal results are usually obtained with pH adjustments in the range of 6.5 to 7.5. The result of the neutralization is the immediate precipitation of tyrosine, during and / or after which the solution of the allergen is occluded and / or adsorbed. After precipitation, the mixture is immediately washed or left for several hours to one or two days before washing. The precipitate is desirably obtained in the finest possible form, which is effected by rapid neutralization of the solution in combination with strong stirring while the precipitation is taking place. The resulting precipitate is removed from the solution by centrifugation or filtration and resuspended in a physiologically acceptable carrier such as phenol-saline or sterile water, e.g., phenol-saline. And the like, to prepare an injectable composition suitable for use in desensitization therapy. The following examples illustrate the invention: Examples About 2.5 mg / ml of a neutral solution of D. pteronyssinus extracted protein, partially purified by dialysis or fractionation, is prepared by adding an equal volume of Polymerization was effected by the addition of 1% w / v glutaraldehyde and the mixture was stirred at room temperature for about 2 hours. The reaction was quenched by the addition of an equal volume of 2% w / v glycine and the mixture was stirred at room temperature for another hour. Low molecular weight materials were removed by diafiltration across a membrane with a molecular weight exclusion of 300 kilodaltons. The mixture was then filter sterilized and lyophilized. Solutions of the polymerized allergen were prepared directly from filtered sterile solutions or by reconstitution of a lyophilized solid. This solution contained 10 μg / ml in a phosphate buffer pH 7 ± 1. One volume of L-tyrosine in HCl (prepared by dissolving 24 g of L-tyrosine in 100 ml of 3.4 M HCl) and one volume of 3.2 M NaOH were added simultaneously with vigorous stirring to form an allergen solution. The allergen solution was co-precipitated with tyrosine by increasing the volume by 4 times. The suspension thus formed was centrifuged, repeatedly washed with buffered saline to remove contaminants, and resuspended in buffered saline pH 6 ± 1 to the initial volume.
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ
，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ
Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
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Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ
，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 テイラー，イエイン
イギリス、ケイティ18・５エックスキュ
ー、サリー、エプソム、ユー・トゥリー・
ボトム・ロード、グレート・バーグ、スミ
スクライン・ビーチャム・ファーマシュー
ティカルズ────────────────────────────────────────────────── ───
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(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
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, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN,
MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, S
D, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT
, UA, UG, US, UZ, VN
(72) Inventor Taylor, Yane
Katy 18.5 XCue, UK
ー, Sally, Epsom, You Tree
Bottom Road, Great Berg, Sumi
Skline Beecham Pharmaceutical
Tikals