JPH11504016A

JPH11504016A - 毛髪の成長を調節する組成物及び方法

Info

Publication number: JPH11504016A
Application number: JP8531963A
Authority: JP
Inventors: ラヴカー，ロバート・エム; サン，トゥン−ティエン; ユ，ダーウェン
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 1999-04-06
Also published as: EP0821592A1; WO1996032961A1; MX9708045A; EP0821592A4; CA2216870C; CA2216870A1

Abstract

(57)【要約】選択した細胞を選択した成長調節分子と接触させることにより毛髪の成長を調節する方法を提供する。選択した細胞をｉｎｖｉｔｒｏで成長させそしてそれらの細胞と毛髪の成長を調節するほかの細胞とを組み合わせることにより毛髪の再構築をしあるいは毛髪の移植をするための方法も提供する。ろ胞細胞により合成され、そして毛髪の細胞周期依存的に毛胞中で濃度が変化する成長調節分子を含む組成物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】毛髪の成長を調節する組成物及び方法緒言本発明は、毛髪の成長を調節する組成物及び方法に関する。本出願は、１９９１年３月２７日に出願され現在は放棄された、米国特許出願第０７／６７６１８５号の継続出願である、１９９２年１１月４日に出願され１９９４年１月１８日に米国特許第５２７９９６０号として発行された、米国特許出願第０７／９７１６８７号の一部継続出願である、１９９３年７月１日に出願された米国特許出願第０８／０８６１９９号の一部継続出願である。本発明はナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルス（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ）により支援された研究の過程においてなされた。米国政府は本発明において特定の権利を有しうる。発明の背景幹細胞（stem cell）はその定義によれば、すべての自己再生性の組織に存在する。これらの細胞は、長期間生存すると考えられ、細胞分裂に対して非常に潜在性をもち、そして究極的には定常状態の組織の恒常性を担うものである。幹細胞は一回の放射線標識の後ではほとんど放射性アイソトープを取り込まないことから、通常は細胞周期が遅い細胞であることが示される。しかしながら、それらの細胞については、特定の成長刺激に反応して増殖プールに入るように誘導することができる。幹細胞が時々細胞分裂をした場合には、単回照射した後にトリチウム化チミジン（³Ｈ−ＴｄＲ）などの放射線標識（radiolabel）を取り込む、より早く増殖する”一過性増殖細胞（transient amplifying cells）”（”TA” ）を幹細胞から生ずる。幹細胞は、多くの以下に挙げる特性を有する。幹細胞は微細構造からも生化学的にも比較的未分化である。幹細胞は増殖に関して大きな潜在能力を有し、長期にわたって組織を維持し再生することができる。幹細胞は、恐らくは増殖の潜在能力を保持し続けるために、そして複製の過程で起こりうるＤＮＡのエラーを最小限にするために、通常は”細胞周期が遅い細胞（slow-cycling）”である。障害及び特定の成長刺激に反応して幹細胞が増殖するように刺激することができる。幹細胞はしばしば、（１）幹細胞から（２）ＴＡ細胞を介して（３）最終分化細胞へという概念中における、一過性増殖細胞”ＴＡ”に相当するものとして、速い速度で増殖している細胞の集団のすぐ近くに位置しており、そして通常は、よく保護されて高度に血管新生が起こり神経支配された領域に見られる。本発明がなされるまでは、上皮幹細胞に特異的な免疫学的あるいは生化学的マーカーが知られていなかったため、幹細胞が存在することを特定することは困難であった。幹細胞は通常”細胞周期の遅い細胞”であるため、活性化された増殖しているＴＡ細胞を検出するために一般に使用されている放射線活性物質を単回でパルス状に投与することによっては、幹細胞を標識することができない。幹細胞を標識するには、長い間をかけて継続的に標識する必要があることが、この度見いだされた。いったん標識されると、これらの細胞周期の遅い細胞は長期間にわたって放射性物質を保持し続ける。このような細胞を”標識保持細胞（Label- retaining cells）”あるいは”ＬＲＣｓ”と呼んできた。Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓら（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍｏｌ．１９８９ａ，９２（３））は、過形成を誘導する刺激に反応して、増殖性を回復された細胞周期の遅い細胞の能力に基づいて、ＬＲＣｓの検出を容易にする方法を開示している。１日あたり２０μＣｉのトリチウム化チミジン（³Ｈ−ＴｄＲ）を１４日間にわたって送達するために、Ａｌｚｅｔ^TM浸透性ミニポンプを成熟したＳＥＮＣＡＲマウスの腹腔内に移植した。この標識をしている期間ずっと、石油（Ｐｅｔ）中に溶かして０．０１％にしたＯ−テトラデカノイルフォルボール１３−アセテート（O-tetradecanoylphorbol 13-acetate）（ＴＰＡ）を一日に一回、４日間にわたり局所的に右腹側部に塗布した。反対側には、Ｐｅｔのみで処置した。動物をさまざまな期間標識した後、犠死させた。ＴＰＡ処置あるいはＰｅｔ処置された皮膚は、光学顕微鏡によりそして組織切片のオートラジオグラフィーにより検査した。ＴＰＡ処置により、表皮とろ胞に顕著な過形成が引き起こされることが認められた。しかし一方で、Ｐｅｔ処置した部位には、形態学的な変化は特に見られなかった。１４日間継続的に³Ｈ−ＴｄＲを投与した結果、ＴＰＡ処置した部位及びＰｅｔ処置した部位の両方で、有核の表皮細胞及びろ胞上皮細胞のすべてのうち９０％以上の細胞が結果として標識された。４週間後には、ほんの少数の細胞が標識を保持するに過ぎなかった（ＬＲＣｓ）。これらの細胞は、Ｐｅｔ処置した表皮と比べて、ＴＰＡ処置した表皮においてずっと頻繁に検出された。トリチウム化チミジン（³Ｈ−ＴｄＲ）の標識を使用することにより、角膜縁と呼ばれる領域中にある周辺部角膜に位置する角膜上皮基底細胞のサブポピュレーションが、Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓら（Ｃｅｌｌ，１９８９ｂ，５７：２０１− ２０９）により同定された。これらの細胞は、通常は細胞周期の遅い細胞であるが、外傷及びＴＰＡの投与に反応して増殖するために刺激することができる。角膜上皮は、例外的な状況の一例のようである。ＬＲＣｓは、角膜縁上皮の基底層において検出された。このような細胞で角膜上皮の中心部分で検出されるものはなかった。角膜上皮の中心部分から１−２ｍｍ外れた場所に傷をつけることにより、角膜縁上皮を選択的に増殖を刺激することができることがわかった。ＴＰＡを局所的に目の前表面に塗布したときに、角膜縁上皮の増殖を選択的に刺激することを観察した。そのため角膜縁上皮は、角膜上皮中心部よりも増殖の潜在能力を有すると結論を下した。７日間にわたって皮下注射によって³Ｈ−ＴｄＲで継続的に標識することにより、標識保持細胞をマウスの表皮中で特定した。この方法により、ほとんどすべての表皮細胞が標識された。４週間にわたって追跡した後、表皮基底細胞のサブポピュレーションが標識されたＬＲＣｓとして維持されていることがわかった。様々な上皮の幹細胞は、Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓら（１９８９ｂ、上記）の図７に概説されている一般的な一連の特徴を共有している。角膜上皮細胞と同時に、手のひら（ｐａｌｍ）上皮、体幹表皮（trunk epidermis）、毛胞（hair follic le）、後舌上皮（dorsal tongue epithelium）、及び腸管上皮（intestinal epi thelium）を含む多くの他の上皮の幹細胞においても、その特徴的な位置と生物学的特徴とが検討されている。図７（ｅ）において、毛胞では、基底部でろ胞乳頭と非常に接近してそして脈管構造と関連した状態で、非常に色素化された幹細胞が位置していることが示されている。しかしながらこれに続く研究において、Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓら（Ｃｅｌｌ，１９９０，６１：１３２９−３７）が示したことによれば、毛胞の幹細胞が、上述のＣｏｔｓａｒｅｌｉｓら（１９８９ｂ）において誤って同定されていた。実際、標識保持細胞はもっぱら立毛筋（ａｒｒｅｃｔｏｒｐｉｌｉｍｕｓｃｌｅ）の接着部位にある、毛胞の”膨大部”（”ｂｕｌｇｅ”）と呼ばれているろ胞の中心部分に存在することがわかった（Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓら，１９９０，上記）。マウス感覚毛及び毛胞にある細胞周期が遅い細胞のすべてが、膨大部に集中していることが示されたことにより、ろ胞上皮の幹細胞が上部ろ胞中の膨大部の近縁に存在しているという見解が支持される（Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓｅｔａｌ．，１９９０，上記；Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔａｌ．，ＰＮＡＳＵＳＡ１９９３９０：７３９１−７３９５；Ｒｏｃｈａｔｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１９９４，７６：１０６３−１０７３；Ｙａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．１９９３，１０１：６５２−６５９）。ろ胞乳頭細胞は、通常の細胞周期の遅いろ胞上皮幹細胞を増殖させるために”活性化”することにより重要な働きをし、結果としてアナゲン（anagen）（毛髪細胞周期の成長期；Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓら，１９９０，上記）を開始させることが示されてきた。ろ胞乳頭細胞が実際に上皮幹細胞に細胞分裂のためのシグナルを送るために使用する分子機構は、まだはっきりとはしていない。毛髪細胞周期の特定の時期において乳頭細胞により合成され分泌される分子をよりよく理解することにより、成長させるために、アポトーシスを誘起するために、ある程度の期間休止期にとどめさせるために、そしてその後成長を再開させるために、何がろ胞上皮細胞を調節しているのかについての理解を大きく増進することができる。ろ胞細胞により大量に合成されている（しかしその他の近傍の細胞によっては合成されていない）成長調節分子をコードし、そして毛髪細胞周期依存的に変化する、表皮乳頭に特異的に発現している伝令ＲＮＡが、現在までに同定されてきた。たとえばネクシンＩは、成長している毛胞の乳頭の主要な成分であり（しかし休止期の細胞ではそうではないが）、そしてろ胞の調節及び毛髪の成長において重要であることがこれまでにわかってきた。発明の概要ろ胞乳頭細胞（follicular papilla cell）には存在するが発生学的に近縁な関連する表皮の繊維芽細胞（dermal fibroblast）には存在しない分子が、現在までにランダムプライマーを使用したＰＣＲ法により同定されている。同一のin vitro の条件下で培養した、ラットのろ胞乳頭細胞の集団から得た全ＲＮＡと、表皮の繊維芽細胞の集団から得た全ＲＮＡとのおよそ２０％を比較した後、乳頭細胞にのみ特徴的な種の主要なｃＤＮＡが同定された。配列解析により、これらのｃＤＮＡの一つが、トロンビン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、及びウロキナーゼを含む多くの成長調節セリンプロテアーゼを不活性化することができる、強力なプロテアーゼ阻害剤であるネクシンＩ（nexin Ｉ）をコードすることがわかった。このｍＲＮＡは、感覚毛及び毛胞の両方の乳頭中に非常に優勢に存在している。さらに、その濃度は、毛髪細胞周期の様々な時期において顕著に変化し、アナゲンの時期ＶＩをピークとしている。いくつかの樹立されたラットろ胞乳頭細胞株では、無胸腺マウスにおいてろ胞を再構築するためにろ胞上皮細胞を支持するというそれぞれの細胞株のもつ能力と相関していると思われているネクシンＩのｍＲＮＡが、幅広い濃度で見られる。成長しているが、しかし休止していない毛胞の乳頭における主要な成分（休止している細胞ではそうではないが）としてのネクシンＩを同定することは、ネクシンＩあるいはその類似体がろ胞の調節及び毛髪の成長において主要な働きをしうるということを示している。その他の表皮乳頭細胞では、オステオポンチン（osteopontin）をコードするｃＤＮＡが見つかっている。発明の詳細な説明本発明者らは、毛胞の、そして恐らくは皮脂腺と表皮の、幹細胞と推定される細胞が、毛胞の膨大部にあることを突き止めた。細胞周期の遅い細胞（標識保持細胞；ＬＲＣｓ）を検出するために計画されたオートラジオグラフを用いた技術を使用することにより、予期しなかったことではあるが、表皮には非常に少数のＬＲＣｓしか存在しないことがわかった。さらに毛胞を測定すると、ろ胞幹細胞のすべてを含むと考えられていた領域である毛根を含むマトリックスの細胞にはＬＲＣｓが一つも存在しないことを、発明者は同定した。むしろ、”膨大部（bu lge）”として知られる領域においてろ胞の上部にＬＲＣｓのサブポピュレーションが存在することを、発明者は示した。膨大部の細胞は、幹細胞の特徴の多くを有している。幹細胞は、毛胞の永久部分の末端を示している。幹細胞は比較的原始的な細胞質を有している。幹細胞は通常は細胞周期の遅い細胞であるが、腫瘍プロモーターであるＴＰＡにより増殖するように刺激することができる。最終的には、幹細胞は生理学的によく保護されていて、そしてよく栄養化された領域中に存在している。膨大部近傍に選択的に位置する幹細胞と推定される細胞の集団が、毛胞だけでなく皮脂腺および表皮を発生する分化可能な幹細胞であると長い間仮定されてきた幹細胞と一致していることを、本発明者は示した。膨大部は、立毛筋の接着部位のろ胞の中心部分に位置する外根鞘細胞のサブポピュレーションである。以前の技術により、毛胞幹細胞はマトリックスあるいは毛根のより低い毛根領域に存在するといわれた。発明者の発見により、毛髪細胞周期の調節および皮膚の発ガンにおける毛胞の幹細胞の関与についての知見が提供され、そして診断的および療法的な目的で細胞周期の遅い細胞の活性を特定し調節するための方法、および同定された幹細胞の集団の活性を調節するための薬剤の効果を評価するための方法を開発するために利用される。もっとも特徴的な幹細胞の特徴の一つは、それら細胞の細胞周期が遅いという特性である。³Ｈ−ＴｄＲのような放射線アイソトープの単回の感作では、幹細胞は標識されないであろう。標識をするためには、長期間にわたってアイソトープを複数回投与する必要がある。いったん標識されれば、細胞周期が遅い細胞は長期間にわたってアイソトープを保持し続ける。マウスの毛胞細胞の別々の集団を同定した。これらの細胞は細胞周期が遅いが、しかし増殖を穴進させる刺激に反応して増殖期を誘導することができる。これらの細胞が存在することは予期していなかった。幹細胞は、ろ胞の幹細胞が通常存在すると考えられている毛根のマトリックス領域には見つからなかった。むしろ、細胞は外根鞘の膨大部という領域に特異的に位置することが同定された。膨大部の構造は、マウスの毛胞に独特なものではない。外根鞘の膨大部は、人も毛胞にも見られ、体幹や首の皮膚にも見られる。膨大部領域は、以前の当業者たちには魅力がなさ過ぎてこれまでに組織学の教科書で取り扱われることはほとんどなかった。毛胞の幹細胞が膨大部領域に存在しうるということが認識されることにより、毛髪周期がどのように調節されているのかおよび皮膚の発ガンにおいて毛胞がどのように関与しているのかという点において発明者の新しい知見を提供した。毛胞における細胞周期の遅い細胞の同定新生仔マウスに対して最初の７日間、一日に２回、³Ｈ−ＴｄＲを皮下に注射することにより投与したところ、マウスの表皮、毛胞、皮脂腺、繊維芽細胞および内皮細胞において、ほぼ１００％の核が標識された。続く４週間の休止期の後（”追跡”）、毛胞のマトリックス領域にはＬＲＣｓ細胞が一つも見られなかったことから、マトリックスには、細胞周期の遅い細胞は存在しないことが示された。予期しなかったことであるが、ＬＲＣｓの一群はろ胞中心、すなわち膨大部で見られた。別の一連の実験において、成熟したマウスにＡｌｚｅｔ^TM浸透性ミニポンプを移植し、³Ｈ−ＴｄＲを２週間にわたって継続的に送達した。４週間の追跡の期間の後、ＬＲＣｓは膨大部領域に選択的に見られた。ＴＰＡを塗布したときには、成熟したマウスの膨大部中に存在する通常は細胞周期の遅い細胞が、増殖するように刺激された。いったん外部からの刺激が除去されれば、膨大部の細胞は，長期間にわたって標識を保持し続けたまま、一見すると以前の細胞周期が遅い細胞に戻っている細胞でしかないようであった。膨大部活性化の理論毛髪細胞周期には３段階の別個の時期が関与する。１つはアナゲン（成長）、１つはカタゲン（catagen）（退行）、そしてもう１つはテロゲン（telogen）（休止）である。発明者は、この毛髪細胞周期がどのように調節されているかを現在までに発見した。膨大部の幹細胞は、テロゲンの終期に表皮乳頭により活性化される。これを”膨大部活性化”と呼ぶ。表皮乳頭はアナゲン中期にマトリックスにより活性化される。実際マトリックス細胞はＴＡ細胞であり、そのため以前の当該技術分野の知見とは反対に、マトリックス細胞は増殖の潜在能力については制限されていた。表皮乳頭の上方への移動は、毛髪の幹細胞の活性化のためには重要である。これらの因子のどれか一つでも欠損すると、異常な毛髪の成長が引き起こされたりあるいは毛髪の喪失が起こったりする可能性がある。発明者は、幹細胞の活性を調節するために有用な多くの成長因子を特定した。たとえば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーム増殖因子（ＴＧＦ）そしてインターロイキン−１（ＩＬ−１）などのサイトカインが有用であると考えられている。移殖片対宿主の急性疾患における細胞の標的は、幹細胞の特徴を有するケラチノサイト（角質細胞）であると仮定されてきた。幹細胞は通常は細胞周期が遅いが誘導刺激に反応して急速に増殖するため、ＴＮＦなどのサイトカインには格好の標的となりうる。ＥＧＦは幅広い生物学的活性を有することが示されてきた。もっとも顕著なものとして、基底のケラチノサイトを増殖誘導することができる。さらに、胎児発生中に成長を支持し、外傷の治癒過程において再上皮化を促進することが示されてきた。ＴＧＦ−αは上皮細胞の成長および分化の両方の調節に関与することが示されてきた。ＴＧＦ−αはｉｎｖｉｔｒｏにおいてケラチノサイトの成長を刺激することが知られている。ＩＬ−１は表皮細胞において増殖活性を誘導することが知られている。様々な増殖細胞集団においてサイトカインの効果を調べるために計画された研究において、マウスの皮膚組織片に対して選択されたサイトカインを添加する。組織片の細胞培養は４日間にわたって感作しながら、毎日順番に回収され、標準的な技術にしたがって、³Ｈ−ＴｄＲの取り込みに対するサイトカインの効果を測定した。別の一連の実験においては、一群のマウスを継続的に２週間にわたって³Ｈ− ＴｄＲで標識し、その後４週間にわたって休止させた。いったん標識されると、細胞周期が遅い細胞は長期間にわたってアイソトープを保持し続け、そしてそのために標識保持細胞として同定される。サイトカインは皮内注射により継続的に標識／追跡される動物に投与される。犠死させる４時間前に、コルセミド（colc emide）（４ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与する。動物はサイトカインの注射の後２、６、１２、および２４時間後に犠死させ、注入された領域の皮膚を固定し、そして日常的な手順にしたがってオートラジオグラフィーのために処置される。標識された有糸分裂像により、細胞周期の遅い細胞に増殖の誘導がかかったことが示される。成長調節分子の特定及び使用ろ胞細胞で合成している（しかしその他の近傍の細胞では合成されていない）そして毛胞中で毛髪の細胞周期依存的な濃度（hair-cycle-dependent concentra tion）の変化を受ける成長調節分子をコードしている伝令ＲＮＡが、現在までに特定されてきた。たとえば、ネクシンＩのメッセージは、アナゲンのろ胞の乳頭中でほぼ選択的に大量に存在していることが示された。ネクシンＩのメッセージは、テロゲンのろ胞においても検出されたが、乳頭にではなくむしろろ胞の下部に存在するケラチノサイトに存在していた。いくつかの樹立されたラットろ胞乳頭細胞株でのネクシンＩのメッセージの濃度は、ｉｎｖｉｖｏでの再構築アッセイにおいてろ胞の成長を支持するという細胞株の能力とよく相関していた。表皮乳頭特異的な伝令ＲＮＡの別の主要なものとしては、オステオポンチンをコードするものが特定された。これらの結果より、初めてろ胞細胞により合成されそして毛胞中において毛髪の細胞周期依存的な濃度の変化をする、潜在的な成長調節分子の存在を証明した。ネクシンＩは、同時にグリア細胞由来ネクシンＩとしても知られているが、４３−４７ｋＤのタンパク質であり、強力なセリンプロテアーゼ阻害剤である。その標的となる酵素を、この工程の中で分子自体のＣ末端ペプチドを切り離し、１：１の共有的な複合体を形成することにより不活性化する。標的となる酵素には、トロンビン、ウロキナーゼ、そして組織プラスミノーゲンアクチベーターが含まれる。ネクシンＩは、細胞成長および細胞分化を調節する際に重要な働きをしていることが示された。ネクシンＩおよびそれの類似体を多くの様々な状況下で使用することが提案されている。たとえば、米国特許第５，２０６，０１７号および米国特許第５，３２６，５６２号では、炎症およびより特定的に関節炎の治療の際に、ネクシンＩを含む薬剤組成物を使用することが開示されている。米国特許第５，１８７，０８９号でも、炎症の治療の際にネクシンＩの類似体を使用することが開示されている。加えて本特許出願では、気腫、先天性−α−１−抗トリプシン欠損症、ガン、敗血症ショック、脳卒中および心臓発作の治療の際に、ネクシンＩの類似体を使用することを開示する。米国特許第５，１１２，６０８号および米国特許第５，１９６，１９６号では、外傷の治癒を促進するためにネクシンＩを使用することを開示する。米国特許第５，１３４，０７６号では神経学的疾患においてネクシンＩを使用することを、国際特許第ＷＯ９１０５５６６号では、抗凝固剤としてネクシンＩを使用することをそれぞれ開示する。オステオポンチンのメッセージも、培養したろ胞表皮乳頭細胞において見られたが、しかし培養した繊維芽細胞では見られなかった。オステオポンチンは、主要な骨マトリックスタンパク質であることが知られている。しかしながらろ胞にオステオポンチンが存在することは以前は知られていなかった。オステオポンチンもろ胞上皮の成長および毛髪の成長を調節するために関与しうる分泌タンパク質である。ランダムプライマーを使用したＰＣＲ技術（ＬｉａｎｇａｎｄＰａｒｄｅｅ，１９９２）を使用して、同一のｉｎｖｉｔｒｏ条件下で培養されたラットろ胞乳頭細胞および皮膚繊維芽細胞のｃＤＮＡを作成し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動により比較した。１４種類の５’上流ランダムプライマーを１２種類の３’下流ＮＭオリゴ（ｄＴ）１２プライマーと組み合わせて使用することにより、総計で１６８種類のポリメラーゼ連鎖反応を行った。それぞれの反応からは、６％ポリアクリルアミドゲルを使用して適切に分離することができる、平均して２５のｃＤＮＡバンドが得られた。およそ４２００のｍＲＮＡ種が解析され、これは細胞のｍＲＮＡ全集団のうちおよそ２０％に相当するものであった。ろ胞乳頭細胞および表皮繊維芽細胞のおよそ９５％のｍＲＮＡが同一であったが、それぞれの細胞種はいくつかの独特なｍＲＮＡを発現していた。ろ胞細胞由来の多くのｃＤＮＡをクローン化した。作成されたろ胞乳頭細胞および表皮繊維芽細胞のｃＤＮＡは、繊維芽細胞でよりも表皮乳頭細胞においての方がずっと大量に存在している２１０ｂｐと１９０ｂｐのｃＤＮＡダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）以外は同一であった。上にある２１０ｂｐのバンドを増幅すると、しばしば同一の２１０ｂｐ／１９０ｂｐダブレットの形成を引き起こし、このことからこれら２つのバンドは密接に関連していることが示される。２１０ｂｐのｃＤＮＡはクローン化され、ＦＰ−８と命名された。ノザンブロット解析により、サイズがおよそ１．３ｋｂであるこのｍＲＮＡ種は、培養されたろ胞乳頭細胞中の全ＲＮＡのうち３％以上存在する主要な構成要素として存在することがわかった。しかしながらこのｍＲＮＡ種は、培養されたラット繊維芽細胞および日ヒトＷＩ−３８胎児肺繊維芽細胞においてはほとんど検出されなかった。ＤＮＡの配列解析により、このｃＤＮＡは、トロンビン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーターおよびトリプシンを含む多くのセリンプロテアーゼを不活性化することが知られているプロテアーゼ阻害剤であるネクシンＩをコードしていることがわかった。これらのデータから、ネクシンＩのｍＲＮＡは培養された感覚毛乳頭細胞において大量に存在することがはっきりと立証された。この事実がｉｎｖｉｖｏにおいても真実であるかどうかを調べるために、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法をラット口唇皮膚のパラフィン切片上で行った。その結果から、ネクシンＩのｍＲＮＡは、実際に感覚毛の乳頭においてｉｎｖｉｖｏで優勢に存在することが示された。乳頭に隣接しそして乳頭を形成することができると考えられていた”結合組織鞘”の細胞は、ネクシンＩのメッセージを発現していなかった。表皮繊維芽細胞、脂肪細胞、内皮細胞あるいは筋肉細胞を含むその他の皮膚間充組織細胞のどれにおいてもシグナルは検出されなかった。アナゲンの時期ＶＩの毛胞のケラチノサイトあるいは上皮中のケラチノサイトに関連するシグナルはなかった。ラットの背中の皮膚の毛髪ろ胞を用いて、同様の結果が得られた。退行（カタゲン）あるいは休止（テロゲン）の時期に補足されることがほとんどない感覚毛のろ胞とは異なり、毛髪ろ胞は毛髪の細胞周期と同調的に動き回って（ｔｒａｖｅｒｓｅ）いる。アナゲンの毛髪ろ胞乳頭において、大量のネクシンＩが検出された。しかしながらネクシンＩのｍＲＮＡ濃度はテロゲンの乳頭およびそれに続く初期アナゲンのろ胞においては顕著に減少した。このことより、ろ胞乳頭におけるネクシンＩのメッセージ濃度は、毛髪の細胞周期依存性に厳密な調節下におかれていることが示唆される。アナゲンの毛髪ろ胞のマトリックスのケラチノサイトにおいては、無視してもよいほどの量のネクシンＩメッセージしか見られないが、テロゲンの下部ろ胞のケラチノサイトおよび初期アナゲンのろ胞（初期アナゲンのろ胞乳頭細胞では毛髪の細胞周期のこの時期の間はネクシンＩのメッセージがないのであるが）からは顕著な量が再現性を伴って検出された。アナゲンのろ胞乳頭中にネクシンＩのメッセージが蓄積するという事実から、この分子はろ胞成長を調節することに関与することが示された。ラット感覚毛乳頭細胞の不死化された細胞からなるパネルを、その働きを評価するために使用した。これらの細胞株は、新生仔マウスの皮膚ケラチノサイトと組み合わせて無胸腺マウスに移殖した場合に、毛胞の再構築を支持する幅広い能力を示すということが示された。ろ胞形成を支持する能力が大きく異なることが知られるいくつかの細胞株から得られたｍＲＮＡを分離した。ネクシンＩを含んだｃＤＮＡを含むｃＤＮＡを作成するために、特異的プライマー対を使用したＰＣＲ反応を行った。ネクシンＩのｍＲＮＡ濃度は、これら細胞株の間で顕著に相違し、そしてろ胞の再構築を支持するための細胞株の能力とよく相関していた。したがって、ネクシンＩのメッセージは、アナゲンのろ胞においては乳頭にほぼ選択的に、大量に存在していることが示された。しかしネクシンＩのメッセージは、テロゲンのろ胞において、乳頭においては検出されず、むしろろ胞下部のケラチノサイトにおいて検出された。いくつかの樹立されたラットろ胞乳頭細胞株におけるネクシンＩメッセージの濃度は、毛髪成長を支持するための細胞株の能力とよく相関していることが示された。これらの結果から初めて、ろ胞細胞に存在しそして毛髪の細胞周期依存的に毛胞中でその濃度が変化する成長調節分子が存在することが立証された。ろ胞調節分子であるネクシンＩあるいはそれの類似体は、ろ胞マトリックスのケラチノサイトのｉｎｖｉｔｒｏでの培養を容易にするために使用することができる。ｉｎｖｉｔｒｏで増殖させたこのようなろ胞上皮細胞は、適切な乳頭細胞と組み合わせることにより、毛髪の再構築、移殖および遺伝子療法において有用なものである。当業者には明らかでありうるように、その他の成長調節分子も本開示物中で記載されている方法にしたがって同定することができる。本開示物の目的にかなうものとしては、”成長調節分子（growth-modulating molecules）”は、ろ胞細胞により合成され、毛胞中で毛髪の細胞周期依存的に濃度が変化する分子である。たとえばこれらの方法を用いて、発明者はすでにオステオポンチンをコードするｃＤＮＡを表皮乳頭中で特定した。これら同一の方法を使用して、その他の成長調節分子を同定できる。本発明では、ろ胞細胞で合成されそして毛胞中で毛髪の細胞周期依存的に濃度が変化する成長調節分子、好ましくはネクシンＩあるいはその類似体を含む組成物を提供する。このような分子を特定する方法を本開示物においてはっきりと提供した。本発明のこれらの組成物は、コンフルエンシー（confluency）を通じて、選択されたろ胞細胞の成長および分化を調節する際に有用である。この方法において、ろ胞上皮細胞のような選択された細胞は、有効量の選択された成長調節分子と接触するため、このような細胞における毛髪の成長が調節される。”有効量”という語は、毛髪成長を調節することができる成長調節分子の濃度を意味している、本開示物に基づいて当業者は、このような濃度を日常的に決定することができる。本発明の組成物は、毛髪の再構築あるいは移殖にも有効である。これらの方法において、ろ胞上皮細胞を選択した成長調節分子と接触させることにより、また増殖させた細胞を選択した乳頭細胞と組み合わせることにより、ろ胞上皮細胞をｉｎｖｉｔｒｏ増殖させる。成長調節分子を含む組成物は、皮下あるいは筋肉内などの非経口的な方法によりあるいはｉｎｖｉｖｏにおいて毛髪の成長を調節するために局所的に投与（塗布）することもできる。一般的には、局所的な投与のためにはネクシンＩのような成長調節分子を純粋な形態では投与せず、１つあるいはそれ以上の賦形剤（excipient）と組み合わせて処方する。組成物には塩類のような賦形剤が含まれうる。しかしながら”賦形剤”には溶媒、分散用の媒体、コーティング、抗細菌および抗カビの薬剤、等張性でそして吸収を遅延する薬剤およびそれに類するもののどれでもあるいはすべてを含みうる。このような薬剤を使用することは、当該技術分野においては知られている。添加物として活性な合成物も援用しうる。毛髪の成長を調節するために必要とされる成長調節分子の量は、個々の患者により変化する。さらに使用回数および使用している期間は、ろ胞細胞の実際の状態に依存してかなり変動する。しかしながら投与の正確な量、回数および期間については、当業者は日常的に決定することができる。ガイドラインとしては、０．１から１．０％（重量％）のネクシンＩなどの成長調節分子と９９．９９から９９．０％（重量％）の賦形剤とを含む組成物を、基本的に毎日一ヶ月以上局所的に使用することができる。局所的な投与のためには、成長調節分子は半固形クリーム、軟膏あるいはゼリー処方により処方されるのが好ましい。しかしながら、成長調節分子を含む溶液の形態においても処方しうる。処方の形態および使用される処方の量は大部分は、注意を払う人（caregiver）によって決定されるであろう。成長調節分子の単回使用が有効でありうる場合もあるが、最高の結果を得るために、毎日あるいは一日おきなど患者によりそして処置される細胞の状況に応じて、定期的に使用する必要がありうる。成長調節分子の量およびそれを使用する頻度は、毛髪の成長において観察される視覚的な変化に基づき、当業者により容易に決定することができる問題である。以下の非限定的な実施例により、本発明をさらに説明する。実施例実施例１：細胞培養感覚毛のろ胞を若齢（１−２ヶ月齢）のウィスターラット（Ｗｉｓｔａｒｒａｔ）の口唇部からそれぞれ切りだし、それらの乳頭部を２本のピンセットを用いてしぼりだした。分離された乳頭部は少量のＣｈａｎｇの培養液（６０ｍｍのディッシュに対して１．５ｍｌ）中に静置し、誰も開けないようにされた３７℃ のインキュベーター（５％ＣＯ₂）中で４日間培養した。このような条件下で、ほとんどの乳頭部はコロニーを形成した（ＪａｈｏｄａａｎｄＯｌｉｖｅｒ，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍ．１９８１，１０５：６２３−６２７；Ｗａｒｒｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．１９９２，９８：６９３−６９９）。１０から１２日後に、細胞をリン酸緩衝塩類溶液中に溶かした０．１％トリプシンと０．１％ＥＤＴＡにより処理し、ばらばらにされた一つ一つの細胞はその後、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコの最小必須培養液（ＤＭＥＭ）中で培養皿に静置した。感覚毛を分離した口唇皮膚組織は、その後１ｍｍ³ 以下に完全に細かく分離され、成長用の培養条件下に静置され、そして上記のように前培養された。これらの条件下において、乳頭細胞および表皮繊維芽細胞は特徴的な形態を維持していた（ＪａｈｏｄａａｎｄＯｌｉｖｅｒ，１９８１，上記；ＪａｈｏｄａａｎｄＯｌｉｖｅr，Ｊ．Ｅｍｂｒｏ．ａｎｄＥｘｐｅｒ．Ｍｏｒｐｈ．１９８４ａ，７９：２１１−２２４）。培養された細胞のＲＮＡを、４Ｍ塩化グアニジン中で抽出し、超遠心により精製し、ＲＮａｓｅ不含ウシ膵臓ＤＮａｓｅで処理した（ＣｈｏｍｃｑｙｎｓｋｉａｎｄＳａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６２：１５６−１５９）。実施例２：ｍＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ法培養細胞から得られた全ＲＮＡを、１２種類の３’オリゴ（ｄＴ）₁₂プライマー（１４ｂｐ）と１４種類の５’ランダムプライマー（１０ｂｐのオリゴＤＮＡ）を組み合わせて用いることにより、ＬｉａｎｇとＰａｒｄｅｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９２，２５７：９６７−９７１）の方法にしたがって逆転写し／ＰＣＲした。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の後、ｃＤＮＡを６％ポリアクリルアミドＤＮＡシークエンスゲルで分離した。注目するｃＤＮＡ断片を含む乾燥させたゲルの領域に電流を流しながら、蒸留水中で９０℃、５分間かけて抽出した。可溶化された一部のｃＤＮＡを鋳型として、元のプライマーの組み合わせを使用して２段階の再増幅を行った。再増幅されたｃＤＮＡ断片の大きさをゲル電気泳動により確定した後、断片をＰＣＲＩＩベクター中にクローン化し、そしてサンガーのジデオキシヌクレオチド法（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＫｉｔ）を用いて配列決定した。ノザンブロット解析およびｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は以前に記載された手順に従って行った。実施例３：成長調節分子のｉｎｖｉｖｏにおけるスクリーニング成長調節分子の完全長ｃＤＮＡを標準的な技術を用いてＰＣＲにより作成した。ｃＤＮＡをクローニングした後、組換え成長調節分子を細菌中で生成し、それに続き成長調節分子がマウス毛髪の細胞周期のアナゲンを延長するかどうかについて調べるために、マウスに対して投与した。スクリーニングしたい成長調節分子中に浸漬したヘパリン化したアクリルビーズを皮下に移殖することにより、あるいは長期間にわたってゆっくりと分子を放出する遅速放出マイクロポンプを移殖することによるどちらかにより、成長調節分子をマウスに対して投与する。マウスの毛髪の細胞周期は、生後に発生を開始して生後１９から２１日あたりで成熟し、その後急速にカタゲンおよび短期間のテロゲンに入る、比較的原始的なろ胞を有する、新生仔動物でよく特徴がわかっている。２回目のサイクルが２５日齢あたりから始まり、およそ２０日間にわたる長期間のテロゲンに入る前までのおよそ１０日間続く。最初は成長調節分子のｉｎｖｉｖｏ投与により２回目のアナゲンが延長されるかどうかを調べる。それに加えて、このモデルを用いて、アルブミンなどの対照となるタンパク質と比較において、成長調節分子により、通常は４５日あたりに引き起こされる３回目のアナゲンの成熟前に開始しそして延長することを引き起こせるかどうかについて調べることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ラヴカー，ロバート・エムアメリカ合衆国ペンシルバニア州19355, マルヴァーン，パイクランド・ロード 155，アール・ディー・ナンバー１ (72)発明者サン，トゥン−ティエンアメリカ合衆国ニューヨーク州10583，スカーズデイル，エッジモント・ロード 107 (72)発明者ユ，ダーウェンアメリカ合衆国ニューヨーク州10012，ニューヨーク，ワシントン・スクエア・ヴィレッジ１，アパートメント２アイ

Claims

【特許請求の範囲】１．選択した細胞と有効量の選択した成長調節分子とを接触させることにより毛髪の成長を調節することを含む、毛髪の成長を調節する方法。２．ろ胞上皮細胞と選択した成長調節分子とを接触させることにより、そして増殖させた細胞と選択した乳頭細胞とを接触させることにより、ｉｎｖｉｔｒｏでろ胞上皮細胞を増殖させることを含む、毛髪の再構築または毛髪の移殖をを行う方法。３．ろ胞細胞により合成され、そして毛胞中で毛髪の細胞周期依存的濃度の変化を受ける成長調節分子を含む組成物。