JPH11503519A - インシュリンの擬似剤及び増強剤のアッセイ - Google Patents

インシュリンの擬似剤及び増強剤のアッセイ

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JPH11503519A JP8529629A JP52962996A JPH11503519A JP H11503519 A JPH11503519 A JP H11503519A JP 8529629 A JP8529629 A JP 8529629A JP 52962996 A JP52962996 A JP 52962996A JP H11503519 A JPH11503519 A JP H11503519A
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Abstract

(57)【要約】 インシュリン擬似剤及び増強剤である化合物、並びにインシュリン作用を擬似し、増強する化合物の同定方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 インシュリンの擬似剤及び増強剤のアッセイ 発明の背景 本発明は、インシュリンの擬似剤及び増強剤、並びに更に詳細にはインシュリ ン作用を擬似する化合物及び増強する化合物の同定方法及び該方法で同定される 化合物に関する。 インシュリンは、哺乳動物の正常な炭水化物、タンパク質及び脂肪代謝に必要 なホルモンである。インシュリン依存性（Ｉ型）糖尿病のヒトは、生命を支える このホルモンのインシュリンを十分産生しないので、生存のために外部のインシ ュリンに依存する。対照的に、インシュリン非依存性（II型）のヒトは、生存に 外部のインシュリンに依存しない。しかし、時間がたつとII型糖尿病のヒトの多 くは、インシュリン産生が減少し、適切な血液グルコース制御のために、特にス トレス又は病気の間、インシュリンを補充することが必要である。外部インシュ リン療法は、二次糖尿病、即ち膵臓疾患などの他の疾患状態に関連して起る糖尿 病の治療にしばしば必要である。インシュリンはまた、妊娠糖尿病のいくつかの 場合において、最適の血液グルコース制御を達成するために使用される。インシ ュリン投与の 通常の経路は注射針と注射器を介してである。注入ポンプを用いる連続的皮下イ ンシュリン注入は、血液グルコースの正常レベルを達成するために、通常の注射 治療の代替策である。 インシュリンはその四量体レセプターに結合すると、その代謝及び成長促進効 果を開始する。結合は、それ自身のβ−サブユニットの特別なチロシン残基の分 子内自己リン酸化を触媒するβ−サブユニットのキナーゼを活性化する。自己リ ン酸化は、他のタンパク質基質に対するチロシンキナーゼ活性を増強する。多く の証拠が、インシュリンレセプターチロシンキナーゼ活性は、インシュリンの生 物効果の全部ではないにしろ多くの生物効果のために必須であることを示唆する 。しかし、細胞の代謝経路の制御に対するレセプターキナーゼ仲介チロシンリン 酸化に関連する正確な生化学的機構は、完全には分ってはいない。 本発明は、インシュリン擬似化合物及びインシュリン増強化合物を同定する新 規アッセイである。本アッセイを“インシュリン擬似剤及び増強剤アッセイ（In sulin Mimetic and Enhancer Assay）”と命名する。ＩＭＡ−IIの目的は、イン シュリン擬似剤及びインシュリン増強剤として開発されうる非ペプチド性の小分 子を発見することである。アッセイは、インシュリン刺 激の直下の、インシュリンレセプターチロシンリン酸化及びレセプターチロシン キナーゼの活性化に基づく。要約して述べると、ヒトインシュリンレセプターを 発現しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をプレートに蒔き、イ ンシュリン又は試験薬剤で処理する。ＣＨＯ．Ｔ細胞は、ヒトインシュリンレセ プターを発現するＣＨＯ細胞の一つの型である。処理細胞を溶解し、インシュリ ンレセプターを精製する。レセプターのチロシンリン酸化のレベルを、アルカリ 性ホスファターゼに結合した抗−リン酸化チロシン抗体とその発色基質を用いて 測定する。インシュリンレセプターチロシンキナーゼ活性（ＩＲＴＫ）は、外部 基質とγ−32Ｐ−ＡＴＰを用いて測定する。本アッセイにより、試験化合物の速 くて多くのスクリーニングが容易に可能となる。発明の概要 本発明は、インシュリン擬似剤及び増強剤、並びにより詳細には、インシュリ ン作用を擬似し、及び増強する化合物の同定方法及び本方法で同定される化合物 に関する。図面の簡単な説明 図１は、インシュリン擬似剤及び増強剤アッセイのスキーム を示す。 図２は、ＣＨＯ．Ｔ細胞でのインシュリンによるＩＰＴＫの活性化を示す。 図３は、天然産物（Ｎ−４００３０６）によるＩＲＴＫの活性化を示す。 図４は、天然産物（Ｎ−４００３０６）によるＩＲＴＫのインシュリン刺激の 増強を示す。発明の詳細な説明 本発明は、インシュリン擬似剤及び増強剤、並びにより詳細にはインシュリン 作用を擬似し、増強する化合物の同定方法及び本方法によって同定される化合物 に関する。より詳細には、本発明は、インシュリン擬似化合物及び増強化合物を 同定する新規アッセイである。本アッセイを“インシュリン擬似剤及び増強剤ア ッセイ”と命名する。本アッセイの目的は、インシュリン擬似剤及びインシュリ ン増強剤として開発されうる非ペプチド性の小分子を発見することである。アッ セイは、インシュリン刺激の直下の、インシュリンレセプターチロシンリン酸化 及びレセプターチロシンキナーゼの活性化に基づく。要約して述べると、ヒトイ ンシュリンレセプターを発現しているチャイ ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ−Ｔ）をプレートに蒔き、インシ ュリン又は試験薬剤で処理する。処理細胞を溶解し、インシュリンレセプターを 精製する。レセプターのチロシンリン酸化のレベルを、アルカリ性ホスファター ゼに結合した抗−リン酸化チロシン抗体とその発色基質を用いて測定する。ＩＲ ＴＫ活性は、外部基質とγ−32Ｐ−ＡＴＰを用いて測定する。本アッセイはまた 、インシュリン増感剤を同定するために、最大に近いインシュリン濃度の存在下 で、細胞を試験薬剤で処理することによって行う。本アッセイにより、試験化合 物の速くて多くのシクリーニングが容易に可能となる。 本明細書で使用するインシュリン関連疾患とは、インシュリン発現、代謝及び 作用の、ある面が混乱している疾患、病気もしくは異常、又はインシュリン作用 のため疾患にかかる疾患のことである。本明細書で使用するインシュリン耐性疾 患とは、正常量のインシュリンが、正常生物応答よりもより少ない応答しかもた らさない疾患、病気又は異常のことである。インシュリンが不十分な疾患の例に は、Ｉ型即ちインシュリン依存性糖尿病が含まれる。インシュリン耐性疾患の例 には、II型糖尿病、肥満、年齢関連インシュリン耐性、及び感染、ホルモン異常 又 は他の原因のために二次的に生じるインシュリン耐性が含まれる。 インシュリン耐性は、II型糖尿病、肥満及び高血圧などの幾つかの重大な疾患 に存在しているであろう。インシュリン耐性は、非耐性状態で得られるインシュ リンのある一定の投与量の有効性に比較して、有効性の減少として現われる。従 って、II型糖尿病のインシュリン耐性患者において、内部インシュリンと外部か ら投与されたインシュリンの両方の、上記の患者が被っている慢性高血糖を制御 する能力が非常に低下している。Ｉ型及びII型糖尿病患者の両方で、制御されな い高血糖症候により、壮年型アテローム性動脈硬化症、毛細血管間糸球体硬化症 、網膜症、ニューロパシー、及び腎不全などの合併症になる。 本発明は、細胞でのインシュリンシグナル伝達の活性化における治療薬の効果 のアッセイ方法を包含する。本方法は、試験生物、例えば培養細胞又は哺乳動物 に薬剤を投与し、インシュリンレセプター代謝の面での薬剤の効果を測定するこ と、例えばインシュリンレセプターリン酸化のレベルを測定することを包含する 。インシュリンレセプター代謝の面での変化は薬剤の効果を示す。 本発明は、チロシンキナーゼが基質をリン酸化する能力を変化させる治療薬の 効果のアッセイ方法を包含する。本方法は、試験生物、例えば培養細胞又は哺乳 動物に薬剤を投与し、基質のリン酸化のレベルを測定することを包含する。 本発明は更に、インシュリン欠乏又はインシュリン耐性によって起る疾患、例 えばＩ型及びII型糖尿病に罹患している哺乳動物、例えばヒトの治療方法を包含 する。本方法は、治療薬、例えば、インシュリンレセプターのリン酸化のレベル などのインシュリンレセプターの代謝の面を変化させる薬剤（例えばキナーゼ活 性を増加させるか、ホスファターゼ活性を増加させることによって）の治療有効 量を上記哺乳動物に投与することを包含する。 本発明の方法はまた、種々の疾患、例えばインシュリン関連疾患、インシュリ ン耐性疾患、細胞増殖の異常を特徴とする疾患、チロシンキナーゼによる基質の リン酸化によって起る疾患及びインシュリンレセプター代謝の面に干渉すること によって起る疾患などの治療を含む。 本発明は、インシュリンレセプターと相互作用する化合物の同定方法を提供す る。化合物の同定方法の例は、 （ａ）ヒトインシュリンレセプターを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞 を、試験化合物だけを含む溶液、又は最大に近い濃度のインシュリンの存在下で 試験化合物を含む溶液とインキュベートすること； （ｂ）チロシンキナーゼ活性を測定すること；及び （ｃ）混合液のチロシンキナーゼ活性を標準と比較すること； を特徴とするアッセイである。 本発明はまた、インシュリンによって制御される遺伝子をコードするＤＮＡ又 はＲＮＡの発現を調節する化合物、又はインシュリンによって制御されるタンパ ク質の機能を調節する化合物のスクリーニング方法に関する。これらの活性を調 節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質又は非タンパク質性有 機分子でありうる。化合物は、インシュリンによって制御される遺伝子をコード するＤＮＡ又はＲＮＡの発現を、又はインシュリンによって制御されるタンパク 質の機能を、増加又は減少させることによって、調節しよう。インシュリンによ って制御される遺伝子をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現を、又はインシュリ ンによって制御されるタンパク質の機能を、調節する化合物は、種々のアッセイ で検出しうる。このアッセイ は、発現又は機能の変化があるかどうかを測定する単純な“ｙｅｓ／ｎｏ”アッ セイでありうる。試験サンプルの発現又は機能を、標準サンプルでの発現又は機 能のレベルと比較することによって、アッセイは定量的になりうる。 ＤＮＡ、ＲＮＡ、インシュリンによって制御されるタンパク質に対する抗体、 又はインシュリンによって制御されるタンパク質を調節しうる化合物を含むキッ トを製造できうる。このようなキットは、法医学研究、分類学研究又は疫学的研 究を含むがこれらに限定されない種々の目的に有用である。 インシュリン活性の調節剤を含む医薬として有用な組成物は、医薬として許容 できる担体との混合などの公知の方法により処方できうる。このような担体と処 方方法の例は、Remington著、Pharmaceutical Sciences に記載されている。有 効な投与に適した医薬として許容できる組成物を製造するために、このような組 成物は有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は調節剤を含むであろう。 本発明の治療用組成物又は診断用組成物は、疾患の治療又は診断に十分な量を 個々のヒトに投与する。有効量は、個々のヒトの状態、体重、性別、及び年齢な どの種々の因子により異な りうる。その他の因子には投与方法がある。 医薬組成物は、皮下、局所、経口、及び筋肉内などの種々の経路により個々の ヒトに投与できうる。 “化学的誘導体”という用語は、通常はベース分子の一部ではない付加的化学 的部分を含む分子を意味する。このような部分は、ベース分子の溶解性、半減期 、吸収などを改善しうる。あるいは、上記部分は、ベース分子の望ましくない副 作用を減少させるか、又はベース分子の毒性を減少させうる。このような部分の 例は、Remington著、Pharmaceutical Sciencesなどの種々の教科書に記載されて いる。 本明細書に開示した方法によって同定される化合物は、適切な投与量で単独で 使用されうる。あるいは、他の薬剤との同時投与又は逐次的投与が望ましいこと もありうる。 本発明はまた、本発明の新規治療方法での使用のために、適切な局所、経口、 全身及び非経口用組成物を提供するという目的を有する。本発明により活性成分 として同定される化合物を含む組成物は、投与のための通常のビヒクル中で種々 の治療投与形態で投与できる。例えば、化合物は、錠剤、カプセル（各々は時間 規定型放出組成物及び持続型放出組成物を含む）、丸薬、 粉末、顆粒、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップ、及びエマルシ ョンなどの経口投与形態で、又は注射により投与できる。同様に、化合物はまた 、静脈内（ポーラスと輸液の両方）、腹腔内、皮下、局所（閉塞有り又は閉塞無 し）、又は筋肉内形態で投与できうるが、全ての使用形態は、製薬業者に周知で ある。 本発明の化合物は便宜的に、１日１回投与できうるし、又は１日分合計投与量 を１日につき２回、３回、もしくは４回の分割投与ができうる。更に、本発明の 化合物は、適切な鼻内用ビヒクルの局所投与を介し鼻内形態で投与できるし、又 は当業者周知の経皮皮膚パッチの形態を用いる経皮経路を介して投与できる。経 皮送達系の形態で投与するためには、投与は、勿論、投与治療中、間歇的という よりもむしろ連続的であろう。 ２種以上の活性剤を用いる組合せ治療の場合（活性剤は別々の投与組成物にあ る場合）、活性剤は同時に投与できるし、又は活性剤は時間をずらして投与でき る。 本発明の化合物を利用する投与法は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別及 び医学的状態；治療する状態の程度；投与経路；患者の腎肝機能；及び用いる特 定の化合物などの種々の因 子により選択する。通常の技術を有する医師又は獣医ならば、疾患の進行を予防 し、反撃し、又は防止するために必要な薬剤の有効量を容易に決定でき、処方で きる。効力を有するが毒性の無い範囲の薬剤濃度を最適な正確さで達成するため には、標的部位の薬剤の利用性の動力学に基づく投与法が必要である。このため に、薬剤の分布、平衡及び排除を考慮することが必要である。 本発明のＣＨＯ．Ｔ細胞は、スタンフォード大学のDr.Richardから得られる； あるいは本明細書で使用するＣＨＯ．Ｔ細胞と類似の細胞株は、当業者により製 造できよう。例えば、ヒトインシュリンレセプターをコードするｃＤＮＡでトラ ンスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ラット−１細胞及びその他の 適切な線維芽細胞も、本アッセイで使用できる。 本発明は、糖尿病、及びレセプター型チロシンキナーゼ、特にインシュリンレ セプターチロシンキナーゼによるシグナル伝達の機能不全によって起る他の疾患 の治療の新規方法に関する。 本発明は更に、インシュリンレセプターチロシンキナーゼ活性を調節できる化 合物のスクリーニング及び同定方法に関する。このような化合物は、レセプター と直接的又は間接的に相互作 用することによる、インシュリン擬似剤又は増感剤でありうる（例えば、インシ ュリンレセプター特異的チロシンホスファターゼ阻害を介して）。このような化 合物は、糖尿病及びインシュリンレセプター型チロシンキナーゼによって仲介さ れるその他の疾患の治療に用いられうる。 シグナル伝達 細胞シグナル伝達は、多様な細胞プロセスを制御する外部の刺激を細胞内部に 中継する基本的機構である。一般的にこのプロセスは、細胞外因子（ホルモン及 び成長因子など）が細胞表面の膜レセプターに結合することによって模倣される 。シグナルが細胞内に伝達される生化学的経路は、直接的又は機能的に連結した 相互作用するタンパク質の回路要素を含む。経路の各タンパク質成分は上流のア クティベーターからのシグナルを統合し、シグナルを種々の下流のエフェクター タンパク質に渡す。 シグナル伝達の鍵となる生化学的機構の一つは、タンパク質のチロシン残基の 可逆的リン酸化である。タンパク質のリン酸化状態は、そのコンフォメーション 及び／又は酵素活性、並びにその細胞内局在に影響を及ぼしうる。タンパク質の リン酸化状態は、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫｓ）及びタンパ ク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰｓ）の相互作用によって修飾される。一般 的に、細胞が細胞外因子によって刺激された後、チロシンリン酸化のレベルは増 加する。この分野の研究は主としてタンパク質チロシンキナーゼに焦点があてら れている（Seftonら、1980,Cell,20:807-16;Heldin & Westermark,1984,Cell,37 :9-20;Yarden & Ullrich,1990,Ann.Rev.Biochem.,57:443-78；Ullrich & Schles singer，1990，Cell，61: 203-12）。 タンパク質チロシンキナーゼは、多機能性ドメインを有する膜貫通酵素及び細 胞質酵素の大ファミリーを含む（Taylorら、1992，Ann.Rev.Cell Biol.，8:429- 62）。細胞外因子又はリガンドの結合は細胞膜の内面にシグナルをアロステリッ クに伝達する。そこにおいて、レセプタータンパク質チロシンキナーゼ（ＲＰＴ Ｋｓ）の細胞質部分は分子相互作用のカスケードを開始させ、そのカスケードは シグナルを細胞中及び核内に伝達する。 キナーゼドメインのリガンド誘導活性化及びそのシグナル発生能力はレセプタ ーの二量体化に仲介される。レセプター二量体化は隣接する細胞質ドメイン間の 相互作用を安定化させ、レセプターの固有のキナーゼ活性を活性化する。活性化 されると、 レセプターは、細胞質ドメインの特別のチロシン残基を自己リン酸化する（自己 リン酸化又はトランスリン酸化）（Schlessinger，1988，Trends Biochem.,Sci. ，13: 443-7；Schlessinger & Ullrich，1992，Neuron，9:383-91；及びその中 の参考文献）。インシュリンレセプター型ＲＰＴＫの場合、天然ではレセプター は二量体として存在し、リガンドが結合するとコンフォメーション変化を起こし 、自己リン酸化が起る。 これらのＲＰＴＫがシグナル伝達で鍵となる役割を果たすことが広く理解され ているが、ホスファターゼの果たす部分はよく理解されていない。ＰＴＫと同様 に、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）は膜貫通酵素及び細胞質酵素 のファミリーを含む（Hunter，1989，Cell，58:1013-16；Fischerら、1991,Scie nce,253:401-6;Saito & Streuli,1991,Cell Growth and Differentiation，2:59 -65；Pot & Dixon，1992，Biochem．Biophys.Acta,1136:35-43）。ＲＰＴＫはシ グナル伝達において引き金となる役割を果たし、ＲＰＴＰは引き金がリセットさ れるようにし、経路を不活化するように働くと考えられている。インシュリンレ セプターに特異的なＰＴＰは現在同定されていない。 インシュリンレセプター インシュリンレセプター（ＩＲ）（Ebinaら、1985,Cell,40,747-758；Ullrich ら、1985,Nature,313:756-61）は、２個のαサブユニットと２個のβサブユニッ トのヘテロ四量体として構造的に定まったＲＰＴＫのファミリーの原型である。 インシュリンレセプター型タンパク質チロシンキナーゼ（ＩＲ−ＰＴＫ）ファミ リーの他のメンバーには、インシュリン様成長因子Ｉのレセプター（ＩＧＦ−１ Ｒ；Ullrichら、1986,EMBO J,5:2503-12）及びインシュリン関連レセプター（Ｉ ＲＲ；Zhangら、1992,J.Biol.Chem.267:18320-8）（そのリガンドは現在不明） などがある。 インシュリンレセプターへのインシュリン結合によって、種々の代謝的及び成 長促進効果の引き金がひかれる。代謝的効果には、グルコース輸送、グリコーゲ ン及び脂肪の生合成、トリグリセリド分解の阻害が含まれ、成長促進効果には、 ＤＮＡ合成、細胞分裂及び分化が含まれる。インシュリンのこれらの生物効果の いくつかは、バナジン酸塩及び過バナジン酸塩などのバナジウム塩によって模倣 されうる。しかし、このクラスの化合物は一般的にホスホチロシンホスファター ゼを阻害するよ うであり、重金属を含むため毒性が大きい（米国特許第5,155,031号；Fantusら 、1989,Biochem.,28:8864-71；Swarupら、1982，Biochem．Biophys．Res．Commu n．107:1104-9）。 糖尿病は、一般的にインシュリン欠乏又はインシュリン耐性又は両方を含む多 重病源学的因子を有する炭水化物代謝の、様々の一次疾患である。Ｉ型、又は若 年発病、又はインシュリン依存性糖尿病は、殆ど又は全く内因性インシュリン分 泌能力の無い患者で起る。これらの患者は非常な高血糖症を有し、現在の生存の ために外部からのインシュリン治療に完全に依存する。II型、又は成人発症、又 はインシュリン非依存性糖尿病はいくらかの内因的インシュリン分泌能力を保持 する患者で起るが、かれらの大部分はインシュリン欠乏性且つインシュリン耐性 である。インシュリン耐性は、不十分なインシュリンレセプター発現、インシュ リン結合アフィニティの減少、又はインシュリンシグナル経路でのいずれかのス テップでの異常のためでありうる（Olefsky,1988,“Cecil Textbook of Medicin e,”18版、2:1360-81）。 米国では全体的に、糖尿病の罹患率は恐らく２〜４％であり、Ｉ型は全ての患 者の７〜１０％である。糖尿病の二次合併症は 重大な臨床的関連を有する。最終段階の腎不全の全ての新規患者の約２５％は、 糖尿病患者で起る。約２０，０００人の切断手術（主に足指、足（くるぶしから 下）及び脚）が糖尿病患者で行われ、これは米国で行われる非外傷性切断手術の 約半数である。更に、糖尿病は失明の新規患者の主導原因であり、毎年約５００ ０の新規患者がでる。 インシュリンはＩ型の全ての患者の治療の主要方法であり、II型糖尿病の多く の患者の治療の主要方法である。１日当りの注射の回数と用いるインシュリンの 型によって、治療の徹底性は大きくも小さくもなりうる。最も徹底的方法は、本 質的に１日２４時間患者が着けなければならないインシュリン小ポンプからなる オープンループ送達装置を介する腹部壁の皮下部位への一定のインシュリン送達 である。スルホニルウレアなどの経口血糖低下剤はII型患者に有効であるが、約 １０〜２０％の患者は反応しないか、又は治療開始後１２〜２４月で反応しなく なる。 グルコースレベルの有効な制御は、最も動機付けられた患者で最も細心のイン シュリン治療でさえ長期間達成するのは困難である。正常にインシュリンを産生 する膵臓又は島細胞移植は、 強力な治療として広範な研究が続いている。更に、グルコースセンサーを備えた より新しく且つより良い外部又は埋め込み式インシュリン送達装置を開発する努 力が続いている。 本発明は、糖尿病及びインシュリンレセプター（ＩＲ）クラスのタンパタ質チ ロシンキナーゼによるシグナル伝達の機能不全によって起るその他の疾患の治療 の新規方法に関する。本発明は更に、ＩＲＴＫを活性化するインシュリンの能力 を擬似又は増強する化合物のスクリーニング及び同定方法（インシュリン擬似剤 及び増強剤アッセイ）に関し、糖尿病及び他の疾患の治療に有用である。 本発明は、糖尿病及びインシュリンレセプター型チロシンキナーゼ（ＩＲ−Ｐ ＴＫｓ）によるシグナル伝達の機能不全によって起る他の疾患の新規治療方法に 関する。 本明細書で使用するシグナル伝達という用語は膜貫通シグナルに限定されず、 細胞中及び核内で分岐する多重経路を含む。経路の個々の回路内で、タンパク質 チロシンキナーゼとチロシンホスファターゼは一連のリン酸化及び脱リン酸化ス テップを行い、それはシグナルを伝達又は終結させるように働く。本発明は、化 合物、抗体、核酸分子の使用を包含し、又はＩＲＴＫ 標的の活性を調節し、それ故シグナル伝達に影響を与える他のアプローチを包含 する。 医薬組成物投与方法 本発明のインシュリンレセプター標的を調節する特定の化合物、抗体、アンチ センス分子又はリボザイム分子は単独で、又は適切な担体もしくは賦形剤との混 合物である医薬組成物として患者に投与できる。 本発明の実施のために本明細書で開示した化合物を処方して全身投与に適した 製剤にするための医薬として許容できる担体の使用は、本発明の範囲内である。 本発明の組成物、特に溶液として処方された組成物は、担体の適切な選択及び適 切な製造の実施により、静脈内注射などによって非経口的に投与できうる。化合 物は、当業界周知の医薬として許容できる担体を用い経口投与に適した製剤に容 易に処方できる。このような担体を用い、本発明の化合物は、治療患者の経口摂 取用に錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などと して処方できる。 本発明の使用に適した医薬組成物は、その意図した目的を達成する有効量の活 性成分を含む組成物を含みうる。有効量は、 当業者により（特に本明細書で記載した詳細な開示により）十分に決定できる。 これらの医薬組成物は、活性成分の他に、賦形剤及び補助剤を含む適切な医薬 として許容できる担体を含む。該担体は、医薬として使用できる組成物への活性 化合物のプロセッシングを容易にする。経口投与のために処方した組成物は、錠 剤、糖衣錠、カプセル、又は溶液の形態でありうる。 本発明の医薬組成物は、それ自体公知である方法、例えば通常の混合方法、溶 解方法、顆粒化方法、糖衣錠製造方法、粉末化方法、乳化方法、カプセル化方法 、エントラップ方法、又は凍結乾燥方法などの方法で製造できる。 非経口投与用医薬組成物は、水可溶形態中の活性成分の水溶液を含む。更に、 活性成分の懸濁液は、適切な油状注射懸濁液として製造できる。適切な親油性溶 媒又はビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルもしくはトリグリセ リドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。水性注射懸濁液は、カ ルボキシメチルセルロース、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁液の粘 度を増加させる物質を含みうる。懸濁液は必要に応じて、高濃度溶液製造のため に化合物の溶解度 を増加させる適切な安定化剤又は薬剤も含みうる。 経口使用用医薬組成物は、活性成分を固体の賦形剤と混合すること、必要に応 じて得られた混合物を粉にひくこと、及び所望ならば、錠剤又糖衣錠のコアを得 るために適切な補助剤の添加後、顆粒の混合物の加工を行うことによって得るこ とができる。適切な賦形剤は特に、乳糖、砂糖、マンニトール、もしくはソルビ トールを含む糖などの充填剤；例えばトウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉 、ポテト澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプ ロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又は ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物である。所望ならば、 架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウ ムなどのその塩のような崩壊剤を加えてもよい。 糖衣錠コアは適切な被膜を備える。この目的のために、必要に応じてアラビア ゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコ ール、及び／又は二酸化チタニウム、ラッカー溶液、並びに適切な有機溶媒、又 は溶媒混合液を含みうる濃縮糖溶液を使用できうる。同定のために、又 は活性化合物投与の異なる組合せを特徴付けるために、染料又は色素を錠剤又は 糖衣錠被膜に加えてもよい。 経口的に使用できる医薬組成物は、ゼラチンから作られるプッシュ−フィット のカプセル、並びにゼラチンから作られる軟密封カプセル、及びグリセロール又 はソルビトールなどの可塑剤を含む。プッシュ−フィットのカプセルは、活性成 分と、乳糖などの充填剤、澱粉などの結合剤、及び／又はタルク又はステアリン 酸などの潤滑剤、及び必要に応じて安定化剤を混合して含みうる。軟カプセルで は、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール などの適切な液体中に溶解又は懸濁してもよい。更に、安定化剤を加えてもよい 。 本発明の方法で使用する任意の化合物の場合、治療有効投与量は、最初に細胞 培養アッセイから推定できる。例えば、投与量は、細胞培養で測定したＩＣ50を 含む循環濃度範囲（即ち、ＰＴＰ活性の最大の半分の阻害を示す試験化合物の濃 度）を達成するために、動物モデルで処方できる。このような情報を用いて、ヒ トの有効投与量をより正確に決定できる。 治療有効投与量は、患者の症状の軽減又は生存の延長をさせる化合物量を指す 。このような化合物の毒性及び治療効力は、 例えばＬＤ５０（集団の５０％の致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％の治療有 効投与量）の決定のための、細胞培養又は実験動物における標準的医薬方法で決 定できる。毒性効果と治療効果の投与比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０ 比として表せる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養ア ッセイ及び動物研究から得られるデータを用いて、ヒトで使用する投与量範囲の 処方ができる。好ましくは、このような化合物の投与量は、殆ど又は全く毒性の 無いＥＤ５０を含む循環濃度範囲内である。投与量はこの範囲内で、使用する投 与形態及び使用する投与経路によって変りうる。正確な処方、投与経路及び投与 量は、患者の状態を考慮し個々の医師によって選択できる（例えば、Finglら、1 975,“The Pharmacological Basis or Therapeutics”、Ch.1p1を参照）。 スクリーニングアッセイ インシュリンレセプターを発現する細胞株を用いて、チロシンキナーゼ活性を 調節する分子をスクリーニングすることができる。このような分子は、コンフォ メーション変化の誘導により直接的にＩＲＴＫを活性化し、レセプターを自己リ ン酸化する、又はＩＲ特異的ホスファターゼの阻害剤を介し間接的に ＩＲＴＫを活性化する、有機又は無機の小化合物、抗体、ペプチド、又はその他 の分子を含みうる。合成化合物、天然産物及び他の源の生物活性を有する可能性 のある物質が幾つかの方法でスクリーニングできる。 ＩＲＴＫ活性、それ故シグナル伝達を調節する試験分子の能力は、標準的生化 学的技術を用いて測定できる。触媒活性の活性化もしくは抑制、他のタンパク質 のリン酸化もしくは脱リン酸化、第２メッセンジャー産生の活性化もしくは調節 、細胞イオンレベルの変化、シグナル発生分子の解離もしくは移動、遺伝子誘導 又は特定の遺伝子の転写もしくは翻訳などの他の反応もモニターできる。スクリ ーニング過程でこれらの目的のために開発した通常の技術を用い、これらのアッ セイを行える。 細胞レセプターへのリガンド結合は、シグナル伝達経路を介し、種々の細胞プ ロセスに影響を与えうる。インシュリンシグナル経路の制御の下の細胞プロセス は、炭水化物代謝、増殖、分化、細胞形の維持、及び接着などの正常細胞機能、 並びにアポトーシス、接触阻害の喪失、分化の阻害、又は細胞死などの異常又は 有害の可能性のあるプロセスを含みうるがそれらに限定されない。当業界公知の 技術による記載した任意の細胞プロ セスの定性的又は定量的観察及び測定は、スクリーニング過程でのシグナル伝達 の評価の方法として適宜使用できる。 ＩＲと直接的に又は間接的に相互作用し、インシュリンレセプターシグナル経 路の制御下に種々の細胞プロセスに影響を与えうる化合物のスクリーニング、同 定、及び評価のために、種々の実施態様を以下に記載する。 本発明は、インシュリンレセプター型タンパク質キナーゼＩＲ−ＰＴＫシグナ ル伝達を調節できる化合物の同定方法であって、 （ａ）化合物を、純粋形態、膜調製物、又は生きている細胞全体もしくは固定化 細胞全体でのＩＲ又はその機能性誘導体と接触させること； （ｂ）化合物が、ＩＲＴＫ酵素活性又はシグナル伝達を刺激するために十分な時 間、ステップ（ａ）の混合物をインキュベートすること； （ｃ）ＩＲＴＫ活性又はシグナル伝達を測定すること； （ｄ）ＩＲＴＫ酵素活性又はシグナル伝達活性を、化合物無しでインキュベート したＩＲのそれと比較し、化合物がシグナル伝達を刺激するか、又は阻害するか どうかを決定すること； を特徴とする上記方法を含む。 ＩＲ−ＰＴＫシグナル伝達活性は、標準的生化学技術により、又はシグナルに よって制御される細胞プロセスをモニターすることにより測定できる。ＩＲ−Ｐ ＴＫのキナーゼ活性の調節を評価するために、試験分子をＩＲ発現細胞の培養培 地に加え、次にＩＲを免疫精製し、ＩＲＴＫ活性を測定する。試験分子がリガン ド刺激を擬似することを意図する場合には、アッセイをインシュリンの非存在下 で行う。試験分子がインシュリン活性を増強することを意図する場合には、試験 をインシュリンの存在下行う。キナーゼ活性はＡＴＰと基質の存在下測定し、結 果を対照（即ち、反応混合液は試験分子に曝されていない）で得られた結果と比 較する。 シグナル経路の制御下の細胞プロセスが、リガンド結合によって起る細胞プロ セスと同様に影響を受ける場合、シグナル伝達の擬似が起る。このような化合物 は、糖尿病の治療でのインシュリン投与を置換えうる天然の分子又は合成で作ら れる分子でありうる。 本発明は、ＩＲ−ＰＴＫシグナル伝達を調節できる遺伝子産物をコードする核 酸分子の同定単離方法であって、 （ａ）ＩＲ又はそのフラグメントを発現する宿主細胞に該核酸分子を導入するこ と； （ｂ）細胞を培養し、該核酸分子によってコードされた遺伝子産物を宿主細胞で 発現させ、ＩＲ又はそのフラグメントと相互作用させること； （ｃ）シグナル伝達活性を測定すること； （ｄ）シグナル伝達を、該核酸分子を有しない細胞でのＩＲ又はそのフラグメン トのシグナル伝達と比較し、該核酸分子によってコードされた遺伝子産物がＩＲ −ＰＴＫシグナル伝達を調節するかどうかを決定すること； を特徴とする上記方法を含む。上記方法は更に、 （ｅ）ステップ（ｄ）で同定した細胞を選別し、培養し、該核酸分子を回収し、 該核酸分子を単離すること； というステップを含んでもよい。 “核酸分子”という用語は、ヌクレオチド配列の発現を制御する要素と機能を 有するように結合したヌクレオチドを含む、天然の、又は組換え的に産生された 核酸分子を意味する。異なる遺伝子産物をコードする異なる核酸分子のプールを 宿主細胞に導入することにより、発現ラブラリーを作製できる。宿主細 胞は遺伝子工学的に処理され、ＩＲ及び他の関連タンパク質を同時発現する。こ のような遺伝子ライブラリーは、標準的生化学技術により、又はシグナルによっ て制御された細胞プロセスをモニターすることによりスクリーニングできる。こ のアプローチは、シグナル経路にも関与する他の天然のシグナル分子を同定する のに特に有用である。 本発明を全般的に記載したので、例示として提供し、本発明の限定とは意図し ない以下の実施例への言及によって本発明は更に容易に理解されよう。 以下の実施例は本発明を更に説明するために記載するが、実施例の特定例に本 発明を限定しない。 実施例１ ヒトインシュリンレセプターを過剰発現するＣＨＯ．Ｔ細胞は、スタンフォー ド大学のDr.R.A.Rothから頂いた。ＣＨＯ．Ｔ細胞（約１．５×１０5細胞／ウエ ル）を、１０％ウシ胎児血清、フンギゾン、ペニシリン、及びストレプトマイシ ンを添加したＨａｍｓ Ｆ１２培地で培養した。９６ウエルプレートを約２４時 間３７℃でインキュベートしたが、その時細胞は集密的になった。細胞をリン酸 緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３ 回洗浄し、次に血清を含まない培地で３時間３７℃でインキュベートした。イン シュリン又は試験化合物をウエルに加え、細胞を更に２０分間３７℃でインキュ ベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、溶解液を調製した。溶解液を第２の９ ６ウエルプレートに移した。第２のプレートのウエルはモノクローナル抗インシ ュリンレセプター抗体で予め被覆してあった。抗体は、２０ｍＭ ＮａＨＣＯ3 、ｐＨ９．６中で最終濃度約４ｍｃｇ／ｍＬに希釈した。希釈抗体溶液約５０ｍ ｃＬを各ウエルに加えた。インシュリンレセプターを免疫精製するために、溶解 液を１６時間４℃でインキュベートした。 プレートに捕捉されたインシュリンレセプターのチロシンリン酸化のレベルを 検出するために、洗浄プレートを、アルカリ性ホスファターゼと結合したモノク ローナル抗リン酸化チロシン抗体（Transduction Laboratories）と共に４℃で ５時間インキュベートした。非結合抗体を除去し、アルカリ性ホスファターゼの 発色基質をウエルに加える。４０５ｎｍのシグナルをミクロタイタープレートリ ーダーで検出する。 細胞培養条件、溶解液調製、及びアッセイは、本質的にB.Zhangら、J.Biol.Ch em.,Vol.266,p.990-996(1991)及びZhang & Roth，J.Biol.Chem.,Vol.267,p.18320-18328(1992)に記載されたものである。 実施例２ 約９３５の植物抽出液をインシュリン擬似剤アッセイII（ＩＭＡ−II）で試験 した。３つの異なる植物からの８個の活性抽出物を同定し、インシュリンレセプ ターチロシンキナーゼアッセイで更に解析した。チロシンキナーゼアッセイで、 抽出物はインシュリンの最大活性の４０〜５０％を示した。活性抽出物のＥＣ50 値は５〜４０ｍｃｇ／ｍＬであった。 実施例３ 医薬組成物の製造 実施例１の方法で同定した化合物を、標準的方法により医薬組成物に処方した 。治療の必要のある動物（ヒトを含む）の治療用に、化合物又は医薬組成物は、 単独で、又は他の化合物もしくは組成物と組合せて使用する。治療を必要とする 疾患には、糖尿病、肥満、食欲制御、鬱血性心不全、不安、高血圧、コカイン禁 断症状、鬱血性心不全、記憶増強、心臓と大脳血管痙攣、クロム親和性細胞腫、 及び神経節神経芽腫、並びにハンチントン病、アルツハイマー病及びパーキンソ ン病があるがそれらに 限定されない。 実施例４ 治療方法 インシュリンのレベルの変化又はインシュリン活性の変化から選択される因子 によって特徴付けられる疾患を有し、上記スクリーニング方法によって同定され る化合物もしくは化合物の誘導体、又は上記スクリーニング方法で同定される化 合物もしくは化合物の誘導体を含む医薬組成物で治療される動物（ヒトを含む） 。 実施例５ ヒトインシュリンレセプターを過剰発現するＣＨＯ．Ｔ細胞は、スタンフォー ド大学のDr.R.A.Rothから頂いた。ＣＨＯ．Ｔ細胞（約１．５×１０5細胞／ウエ ル）を、１０％ウシ胎児血清、フンギゾン、ペニシリン、及びストレプトマイシ ンを添加したＨａｍｓ Ｆ１２培地で培養した。９６ウエルプレートを約２４時 間３７℃でインキュベートしたが、その時細胞は集密的になった。細胞をリン酸 緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、次に血清を含まない培地で３時間３ ７℃でインキュベートした。インシュリン又は試験化合物をウエルに加え、細 胞を更に２０分間３７℃でインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、溶 解液を調製した。溶解液を第２の９６ウエルプレートに移した。第２のプレート のウエルはモノクローナル抗インシュリンレセプター抗体で予め被覆してあった 。抗体は、２０ｍＭ ＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．６中で最終濃度約４ｍｃｇ／ｍＬに 希釈した。希釈抗体溶液約１５０ｍｃＬを各ウエルに加えた。インシュリンレセ プターを免疫精製するために、溶解液を１６時間４℃でインキュベートした。 ＩＲＴＫを測定するために、キナーゼ反応混合液（５０ｍＭＨｅｐｅｓ，ｐＨ ７．６，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2，５ｍＭ ＭｎＣｌ2，０． １％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１ｍｇ／ｍＬポリ（Ｇｌｕ：Ｔｙｒ）（４：１） ，担体を含まない[γ−32Ｐ]ＡＴＰ２μＣｉ）２０μＬを、９６ウエルの各ウエ ルに加えた。１００ｍＭリン酸５０μＬを添加して、反応を止めた。混合液をマ ルチスクリーンＰＨプレートに移し、洗浄した。ウエルと結合した放射活性を、 トップカウントを用いて測定した。試験剤によって刺激されたＩＲＴＫ活性を、 インシュリンによって刺激されたＩＲＴＫ活性と比較した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＡＭ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＮ ＡＤＰ 37/26 ＡＢＵ Ｃ１２Ｑ 1/02 37/02 ＡＧＺ Ｇ０１Ｎ 33/567 37/26 ＡＢＮ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．インシュリン活性を調節する化合物の同定方法であって、 （ａ）ヒトインシュリンレセプターを発現する組換えチャイニーズハムスター卵 巣細胞を試験化合物を含む溶液とインキュベートし、混合液を作製すること； （ｂ）混合液のチロシンキナーゼ活性を測定すること；及び （ｃ）混合液のチロシンキナーゼ活性を標準と比較すること； を特徴とする上記方法。 ２．細胞がＣＨＯ．Ｔ細胞であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。 ３．請求項１に記載の方法で同定されることを特徴とする化合物。 ４．請求項３に記載の化合物を含むことを特徴とする医薬組成物。 ５．請求項２に記載の方法で同定されることを特徴とする化合物。 ６．請求項５に記載の化合物を含むことを特徴とする医薬組成物。 ７．インシュリンのレベルの変化、又はインシュリンレセプターによるインシュ リン活性の変化、又はインシュリンレセプターによるインシュリンもしくはイン シュリンレセプター活性のレベルの変化、及びそれらの組合せから選択される因 子によって特徴付けられる疾患を有する非ヒト動物の治療方法であって、請求項 ３に記載の化合物又はその誘導体を上記動物に投与することを特徴とする上記方 法。 ８．疾患が、肥満、糖尿病、不安、高血圧、コカイン禁断症状、鬱血性心不全、 記憶増強、心臓血管痙攣、大脳血管痙攣、クロム親和性細胞腫と神経節神経芽腫 、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びそれらの組合せか ら選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
JP8529629A 1995-03-31 1996-03-27 インシュリンの擬似剤及び増強剤のアッセイ Pending JPH11503519A (ja)

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