JPH11503014A - Ｔ細胞レセプター並びに治療および診断におけるその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞受容体に対する核酸配列を提供する。特に、黒色腫抗原を認識するＴ細胞受容体に対する核酸配列を提供する。本発明はまた、抗原特異的Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞を提供する。加えて、本発明は抗原特異的Ｔ細胞受容体あるいはキメラ受容体を発現する幹細胞を提供する。本発明はさらに、療法的および診断的組成物および本明細書中で提供されるＴ細胞受容体およびキメラ受容体を使用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｔ細胞レセプター並びに治療および診断におけるその用途 発明の分野 本発明の分野は、一般的には、哺乳動物の病気を治療または予防するための組 成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍関連抗原を認識する Ｔ細胞レセプターおよびキメラレセプター、ならびにこれらのＴ細胞レセプター を用いる予防、診断および治療への応用に関する。発明の背景 ヒトの癌、自己免疫病、ウイルス、細菌、寄生虫および真菌病のような病気治 療の伝統的典型的方法には、外科手術、放射線化学療法、抗生物質またはそれら の組み合わせ療法が含まれる。しかしながら、これらの治療法は、これらの疾病 の大多数に対して効果的ではない。ヒトの疾病を予防または治療するために、別 の治療の必要性が大である。過去十年間で、Ｔリンパ球を用いた免疫療法および 遺伝子療法がヒトの疾病、特にヒト癌を治療する新しく有望な方法として現れて きた。 Ｔ細胞は、大多数のマウス腫瘍モデルでの腫瘍の退縮に重要な役割を果たす。 唯一の癌抗原を認識する腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉ ｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）（ＴＩＬ）は、多数のマウス腫瘍から単離するこ とができる。これらのＴＩＬとインターロイキン−２の養子移入は、起こってし まった肺および肝臓への転移の退縮を仲介することができる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒ ｇ，Ｓ．Ａ．ら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２３３：１３１８−１３２１） 。さらに、注入されたＴＩＬによるＩＦＮ−γの分泌は、生体内でのマウス腫瘍 の退縮に関係し、腫瘍抗原によってＴ細胞が活性化されていることを示唆してい る（Ｂａｒｔｈ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，６４ ７−６５８）。ＴＩＬを転移した黒色腫を持つ患者内に養子移入した場合、黒色 腫患者の３５％から４０％で転移癌の退縮を仲介することがＴＩＬの能力として 知 られており、このことは、抗原を認識することが医療上重要であることを実証し ている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、１９８８、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅ ｄ．，３１９：１６７６−１６８０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．１９９２、 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１０：１８０−１９９）。 ＣＤ８⁺ Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターは、抗原性ペプチド（ＨＬＡ−Ａ２の９ −１０アミノ酸）、β−２ミクログロブリンおよび主要組織適合性複合体（ＭＨ Ｃ）Ｉ型の重鎖（ヒトのＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）からなる複合体を認識する。生体 内で合成されたタンパク質の消化によって生成したペプチドは、小胞体内に輸送 され、ＭＨＣ−Ｉ型重鎖およびβ２ミクログロブリンと結合し、最終的に細胞表 面のＭＨＣ−Ｉ型分子の溝に表示される。 ヒトの中に癌に対する免疫応答が存在するという強力な証拠は、黒色腫沈査内 に腫瘍反応性リンパ球が存在することによって提供される。これらのリンパ球は 、分離された場合、ＭＨＣ制限様式で、自己由来および同種異系の黒色腫上の特 定の腫瘍抗原を認識する能力を持つ（Ｉｔｏｈ，Ｋ．ら、１９８６、Ｃａｎｃｅ ｒ Ｒｅｓ．，４６：３０１１−３０１７；Ｍｕｕｌ，Ｌ．Ｍ．ら、１９８７、 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：９８９−９９５；Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ． ら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３７１４−３７２５；Ｄａｒｒ ｏｗ，Ｔ．Ｌ．ら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３３２９−３３ ３５；Ｈｏｍ，Ｓ．Ｓ．ら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１０：１ ５３−１６４；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８：６３８−６４３；Ｈｏｍ，Ｓ．Ｓ．ら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔ ｈｅｒ．，１３：１８−３０；Ｏ’Ｎｅｉｌ，Ｂ．Ｈ．ら、１９９３、Ｊ．Ｉｍ ｍｕｎｏｌ．，１５１：１４１０−１４１８）。転移メラノーマ患者からのＴＩ Ｌは、生体外で、メラノサイト−黒色腫の家系に特異的な組織抗原を含む共有の 抗原を認識する（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈ ｅｒ．，１４：８８−９３；Ａｎｉｃｈｉｎｉ，Ａ．ら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ ．Ｍｅｄ．，１７７：９８９−９９８）。抗黒色腫Ｔ細胞は、生体内では、多分 、腫瘍部位でのクローンの拡大および蓄積の結果としてＴＩＬ内に豊富に存在す ると考えられる（Ｓｅｎｓｉ，Ｍ．ら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７ ８：１２３ １−１２４６）。サイトカインのような様々な遺伝子のＴ細胞への形質導入が実 証された。Ｔ細胞は、外来遺伝子の生成物を発現することが示された（Ｂｌａｅ ｓｅ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．，３３（増補第一版）：Ｓ４９−Ｓ ５３．１９９３；Ｈｗｕ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０：４１０４− ４１５、１９９３；Ｃｕｌｖｅｒ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ，８８：３１５５−３１５９、１９９１）。患者が腫瘍関連抗原に 対する細胞応答および体液性応答を増すと言う事実は、さらなる腫瘍抗原の同定 および特徴付けが癌患者の免疫治療に重要であろうことを示唆している。発明の概要 本発明は、一般的には、腫瘍関連抗原を認識または結合するＴ細胞レセプター の核酸およびアミノ酸配列、ならびに同一物を用いた組成物および方法に関する 。特に、本発明では、抗原特異的Ｔ細胞レセプターの可変−結合（Ｖａｒｉａｂ ｌｅ−Ｊｏｉｎｉｎｇ）（Ｖ／Ｊ）または可変−多様−結合（Ｖａｒｉｚｂｌｅ −Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｊｏｉｎｉｎｇ）（Ｖ／Ｄ／Ｊ）の連結配列のアミノ酸 および核酸配列について記載した。本発明は、さらに、Ｔ細胞レセプターの核酸 およびアミノ酸配列に関しての治療用途を提供する。また、本発明の目的は、こ れらＴ細胞レセプターまたはキメラレセプターを持つＴ細胞または造血幹細胞お よびそれらの使用方法を提供することである。 本発明の目的は、腫瘍関連抗原を認識する、分離されたＴ細胞レセプターまた はその部分をコードする核酸配列を提供することである。 本発明の目的は、腫瘍関連抗原を認識または結合するＴ細胞レセプターまたは その部分のアミノ酸配列を提供することにある。 本発明のその他の目的は、黒色腫抗原を認識する、分離されたＴ細胞レセプタ ーの核酸配列を提供することにある。 本発明のその他の目的は、腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞レセプターの全体ま たはその部分をコードする組換え分子を作り出すことにある。 本発明のその他の目的は、抗原に特異的なＴ細胞レセプターをコードする核酸 配列を検出する方法を提供することにある。 本発明のその他の目的は、ヒトの疾病、特に癌の診断方法を提供することにあ る。 本発明のさらなるその他の目的は、Ｔ細胞からのＣＤ２８の細胞質領域に結合 した抗体可変領域または共刺激シグナルをＴ細胞に提供することのできる同様の 領域を含むキメラレセプターを提供することにある。 本発明のさらなる目的は、腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞の核酸配列またはア ミノ酸配列の全体または部分を含む予防的または治療的使用方法を提供すること にある。 また、本発明の目的は、Ｔ細胞レセプターあるいはキメラレセプターを持つ造 血幹細胞またはＴ細胞を用いる免疫療法の組成物およびその方法を提供すること にある。 さらに、本発明のその他の目的は、ここに記載された核酸配列の全体または部 分、および腫瘍関連抗原を認識するその他のＴ細胞レセプターを含む組み合わせ 治療を提供することにある。 本発明のその他の目的は、ここに記載された方法を用いて癌の予防的または治 療的処置方法を提供することにある。 本発明のさらなる目的は、免疫療法に用いる癌抗原を認識するレセプターを持 つＴ細胞または造血幹細胞を提供することにある。図面の簡単な説明 図１Ａ−１Ｂは、黒色腫に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）（ＣＴＬ）クローンからのＴＣＲαおよびＴＣＲ β連結配列を示している。図１Ａは、クローンＣ１０−１が一つの機能性ＴＣＲ α転写物および一つのフレーム内ＴＣＲβ転写物を含むことを示している。Ｖα １４．１／Ｊα３２／Ｃα転写物はフレーム内にあったが、Ｎ（Ｎ多様性領域） 領域配列は、Ｊα３２内でフレームシフトを起こし、結果としてよく保存された ＦＧＸＧの構造モチーフが失われた（Ｋｏｏｐら、１９９３、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ，８４：４７８−４９３）。Ｊα３２セグメントの３’末端の別の部位でスプラ イシングされると、結果としてＣ領域にリーディングフレームが再構築された。 Ｖ α８．２／Ｊα４９／Ｃαを用いたＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子が作成 され再配列された。箱囲い（Ｂｏｘ）は、Ｖ遺伝子の３’末端およびＣ領域の５ ’末端を示している。生殖細胞系のＪ領域を下線で示している。Ｎ領域はマーク していない。不変領域の５’末端のみ示している。図１Ｂは、ＴＩＬを制限消化 してできた３つのＨＬＡ−Ａ２からのＴＣＲαおよびＴＣＲβ連結配列のアライ メントを示している。それぞれのＪ領域のアミノ酸配列は、同一のＪ領域を用い たその他の転写物で報告された配列に適合する。Ｎ領域には、ＤＮＡまたはアミ ノ酸配列の相同性は認められなかった。不変領域の５’末端のみを示している。 図２は、ＭＡＲＴ−１エピトープＭ９−２特異的細胞毒性Ｔリンパ球クローン からのＴＣＲαおよびＴＣＲβの連結配列を示している。Ｖ遺伝子の３’末端お よびＣ領域の５’末端が標識されている。生殖細胞系Ｊ領域を下線で示している が、Ｎ領域はマークしていない。それぞれのＪ領域のアミノ酸配列は、同一のＪ 領域を用いたその他の転写物で報告された配列と適合する。不変領域の５’末端 のみを示している。 図３Ａから３Ｌは、クローン５ ＴＣＲ−移入［バルク（ｂｕｌｋ）（図３Ｂ 、３Ｆおよび３Ｊ）、クローン１３（図３Ｃ、３Ｇおよび３Ｋ）、およびクロー ン２２（図３Ｄ、３Ｈおよび３Ｌ）］ならびに非移入［ネオ（ｎｅｏ）（図３Ａ 、３Ｅ、および３Ｉ）］Ｊｕｒｋａｔ細胞系の免疫蛍光分析を示している。Ｊｕ ｒｋａｔ移入細胞（１ｘ１０⁶）を、１００μｌのＪｕｒｋａｔ ＴＣＲ β鎖 −特異的 ｍＡｂ Ｃ３０５．２ 上澄み液と共に（実線の度数分布図で示す） 、または含まずに（点線の度数分布図で示す）、３７°Ｃで１２時間インキュベ ートした。次いで、４つの細胞系のすべてを：図３Ａ−３Ｄは抗−ＣＤ３ ｍＡ ｂで；図３Ｅ−３Ｈはｐａｎ−特異的 抗−ＴＣＲ−１ ｍＡｂで；図３Ｉ−３ Ｌはｃ３０５．２ ｍＡｂで：再染色すると、内因性ＴＣＲが下方調整されてい ることが確かめられた。 図４は、クローン５ ＴＣＲ移入（バルク、クローン１３およびクローン２２ ）Ｊｕｒｋａｔ細胞系によるＩＬ−２生成を、ペプチド濃度のレベルを変化させ てグラフに示している。抗原刺激に応答するＪｕｒｋａｔＴＣＲ移入細胞の感受 性は、Ｔ２細胞上にパルス標識した免疫優性Ｍ９−２ペプチドの一連の５倍連続 希 釈物（初発最大濃度５０ｍＭ）を作り、次に、Ｊｕｒｋａｔ細胞からのＩＬ−２ の遊離を仲介するＴ２細胞の能力を求めることによって評価した。相対的感受性 は、最大のサイトカイン応答の５０％を達成するに必要なペプチド濃度を測定す ることによって決定した。 図５Ａ−５Ｃは、抗体一抗原認識によってＴＣＲシグナルの形質導入を可能に するキメラ抗体／Ｔ細胞レセプターを示している。図５Ａは抗体を示し、図５Ｂ はＴＣＲを示し、また図５ＣはｓｃＦｖ−γを示している。一本鎖の抗体可変領 域（ｓｃＦｖ）は、ＴＣＲ−ζ鎖と相同性を持ちＴＣＲシグナルの形質導入を仲 介する能力を持つ、Ｆｃレセプターのγ鎖のようなＴＣＲシグナル化鎖に連結さ れる（Ｏｒｌｏｆｆ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３４７：１８９−１９１，１９９ ０：Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ，Ｆ．およびＫｌａｕｓｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８９０５−８９０９，１９９１ ；Ｒｏｍｅｏ，Ｃ．ら、Ｃｅ．．，６８：８８９−８９７，１９９２；Ｒｏｍｅ ｏ，Ｃ．およびＳｅｅｄ，Ｂ．，Ｃｅｌｌ，６４：１０３７−１０４６，１９９ １；Ｉｒｖｉｎｇ，Ｂ．Ａ．およびＷｅｉｓｓ，Ａ．，Ｃｅｌｌ，６４：８９１ −９０１，１９９１）。 図６Ａから６Ｄは、様々な腫瘍系における葉酸結合タンパク質（ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＦＢＰ）の発現を測定するための、Ｍｏ Ａｂ Ｍｏｖ１８を伴うＦＡＣＳ分析を示している。ＩＧＲＯＶ−１とは、ヒト 卵巣癌（図６Ｃ）のことである。２４ＪＫとは、免疫原性に乏しいメチルコラン トレンによって誘導されたマウス肉腫ＭＣＡ−１０２（図６Ｂ）のクローンのこ とである。２４ＪＫ細胞は、ＦＢＰ遺伝子を含むベクターをレトロウイルスのよ うに形質導入して、２４ＪＫ−ＦＢＰ細胞系を形成する（図６Ｄ）。８８８ＭＥ Ｌは、ヒト黒色腫細胞系である（図６Ａ）。［白抜きのグラフ（ｏｐｅｎ ｇｒ ａｐｈ）＝対照抗体；陰付きグラフ（ｓｈａｄｅｄ ｇｒａｐｈ）＝Ｍｏｖ１８ 抗体；ｙ軸＝細胞の相対数；ｘ軸＝蛍光強度対数］ 図７は、２４ＪＫ−ＦＢＰ細胞注入後１１日目の肺での出現を示している。腫 瘍注入後３日目、実施例４に記載の材料および方法に従って、マウスの治療を、 ＩＬ−２（左上方）、修飾されていないＴＩＬ＋ＩＬ−２（右上方）、またはＭ ｏｖ−γを形質導入したＴＩＬ＋ＩＬ−２（下方）のいずれかで、始めた。肺は 、気管内に墨汁を注入した後、収集した。肺をＦｅｌｅｔｅ溶液で漂白すると、 黒のバックグラウンド上に転移部が白く現れた。転移の実質的縮小は、他のグル ープと比較して、Ｍｏｖ−γを形質導入したＴＩＬ＋ＩＬ−２を投与されたマウ スに見られた。 図８は、ヌードマウス内に２．５ｘ１０⁶のヒト卵巣癌ＩＧＲＯＶ細胞を腹腔 内注入した後３日間の腹膜腔の組織病理学評価を示している。卵巣ガン細胞のマ ウス網へ侵入を認めることができる。 図９は、ヒト卵巣癌（ＩＧＲＯＶ）細胞を腹腔内注入した後のヌードマウスの 生存度について示している。腫瘍注入後３日目（図８、３日目の組織病理学的評 価、を参照のこと）に、マウスを、ＨＢＳＳ、修飾されていない（ＮＶ）マウス ＴＩＬ、または、ＭＯｖ−γレセプターあるいは対照としてＳｐ−γレセプター のいずれかを形質導入したＴＩＬ（それぞれ、ＭＯｖ−ＴＩＬおよびＴＮＰ−Ｔ ＩＬ）で処理した。ＭＯｖ−ＴＩＬで処理したマウスは、他のグループと比較し て生存率が明らかに増加していることが示された。 図１０Ａ−１０Ｂは、レセプター遺伝子を含むレトロウイルス構築物、ＬＭｏ ｖγＥＮ（図１０Ａ）およびＬＰＭＯｖγ（図１０Ｂ）を示しており、これを用 いて造血幹細胞に形質導入した。発明の詳細な説明 本発明をより完璧に理解する目的で、以下の定義をここに記載しておく。核酸 配列は、これに限定されるわけではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含 む。ここに用いられる実質的に相同とは、ここに提供される腫瘍抗原特異的Ｔ細 胞レセプターのα鎖およびβ鎖のＶ−ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊ連結配列の核酸配列と 他の任意の核酸配列が実質的に一致することをさす。例として、実質的相同とは 、核酸配列とその他の任意の核酸配列との間の、約５０−１００％の相同性、望 ましくは約７０−１００％、最も望ましくは９０−１００％の相同性を意味する 。さらに、また、ここに用いられているように、実質的に相同とは、ここに提供 された抗原特異的Ｔ細胞レセプターのＶ−ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊ連結配列のアミノ 酸 配列とその他の任意のアミノ酸配列が実質的に一致することをさす。 主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）とは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を含む異な る種で記載されている組織適合性抗原システムを包含する一般的名称である。癌 と言う言葉は、これらに限定されるわけではないが、黒色腫、癌から誘導された 上皮細胞、肺癌、結腸癌、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、前立腺癌、脳癌、または肉腫 を含む。 哺乳動物のそのような癌は、染色体異常、退行性増殖および発達障害、分裂促 進剤、紫外線照射（ＵＶ）、ウイルス感染、遺伝子の不適切組織での発現、遺伝 子発現の変化または発癌剤を原因として起こりうる。黒色腫と言う言葉は、これ らに限定されるわけではないが、黒色腫、転移黒色腫、メラノサイトあるいはメ ラノサイト関連母斑細胞のいずれかから誘導される黒色腫、黒色癌、黒色上皮腫 、黒色肉腫、表皮内黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性ほくろ黒色 腫、先端部ほくろ黒色腫、浸潤性黒色腫または家族性異型母斑および黒色腫（ｆ ａｍｉｌｉａｌ ａｔｙｐｉｃａｌ ｍｏｌｅ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ）（ ＦＡＮ−Ｍ）症候群を含む。前述の癌は、本明細書に記載の方法に従って、治療 、評価または診断することができる。 Ｔリンパ球は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）座のクラスＩおよびクラスII 分子に結合したペプチドフラグメントの形の抗原を認識する。抗原のためのＴ細 胞レセプター（ＴＣＲ）は、少なくとも８つのポリペプチド鎖の複合体である（ ”Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９４ 、Ｓｔｉｔｅｓ、ＴｅｒｒおよびＰａｒｓｌｏｗ編、ＡｐｐｌｅｔｏｎおよびＬ ａｎｇｅ、Ｎｅｎｍａｃｋ Ｃｏｎｎ．）。これらのうちの２つの鎖（α鎖およ びβ鎖）は、ＭＨＣ分子に結合した抗原性ペプチドを認識するジスルフィド結合 二量体を形成し、それ故、ＴＣＲ内での実際のリガンド結合構造である。ＴＣＲ αおよびβ鎖は、免疫グロブリンタンパク質と多くの点で類似している。αお よびβ鎖のアミノ末端領域は、多型性が大きく、それ故、Ｔ細胞集団全体では、 多数の異なるＴＣＲ α／β二量体が存在し、そのそれぞれが抗原性ペプチドお よびＭＨＣの特定の組み合わせを認識または結合する能力を持つ。 α／β二量体は、ＣＤ３と呼ばれるタンパク質複合体と提携する。ＣＤ３分子 は、ＴＣＲが抗原／ＭＨＣを認知したとき、これを形質導入に関する細胞内シグ ナルに変換することを可能ならしめることによって、シグナル形質導入にかかわ る。 抗原決定基の幅広いスペクトルを認識するために必要とされるＴＣＲの多様性 を作り出すために、ＴＣＲ αおよびβ遺伝子は、免疫グロブリン遺伝子のそれ によく似たＤＮＡの再配列による結合戦略を用いる。生殖細胞系のＴＣＲ β遺 伝子は、約６５のＶ（可変）、２つのＤ（多様性）、１３のＪ（連結）遺伝子セ グメントおよび２つのＣ（不変領域セグメント）を含む。ＴＣＲ β遺伝子がＴ 細胞発生の初期に再配列される場合、Ｖβ領域セグメントの一つは、Ｄβ領域の 一つおよびＪβセグメントの一つと連結し、一つの転写単位を形成するようにな る。Ｖ−Ｄ−Ｊは、不変Ｃβ（不変）領域にスプライスし、機能性タンパク質を コードするＴＣＲ β ｍＲＮＡを形成する。卓越した多様性は、この組み合わ せ連結によって生ずる。ＴＣＲ α座には、４５−５０セグメントより多いＶセ グメントおよび約６０のＪセグメント、一つのＣセグメントが含まれる、Ｄセグ メントは含まれない。機能性ＴＣＲα鎖遺伝子を形成するために、Ｖαセグメン トはＪαセグメントに連結し、Ｖ−Ｊ転写物は、不変領域（Ｃα）にスプライス する。 多様性は、遺伝子セグメントの非精密な連結によって、および／または再配列 の過程の間に起こるセグメント間への非生殖細胞系をコードするヌクレオチドの 挿入（Ｎ領域と呼ばれる）によって、さらに強められる。これらのメカニズムは 、連結の多様性、特にＶαとＪαの間、およびＶβ、ＤβおよびＪβセグメント の間の連結部での配列の多様性を生じさせる。Ｖ−ＪおよびＶ−Ｄ−Ｊ連結配列 は、それぞれのＴ細胞レセプターのクローンタイプごとに独特であり、Ｔ細胞レ セプターの多様性の一因となる。 本発明に従って、腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞レセプターのαおよびβ鎖の Ｖ−ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊ連結領域またはその部分のアミノ酸配列が提供される。 一般的には、本発明は、ＭＨＣクラスＩに関連して存在する腫瘍関連抗原を認識 または結合するＴ細胞レセプターに関連する。望ましい実施態様では、本発明の Ｔ細胞レセプターによって認識される腫瘍関連抗原は、黒色腫抗原である。例と して、本発明の黒色腫特異的Ｔ細胞レセプターは、ＨＬＡ−Ａ２．１またはＨＬ Ａ−Ａ１に関連する黒色腫抗原を認識することができる。Ｔ細胞レセプターによ って認識される黒色腫抗原の例としては、これらに限定されるわけではないが、 ＭＡＲＴ−１あるいはそのペプチド、またはｇｐ−１００あるいはそのペプチド が含まれる。望まし実施態様では、細胞レセプターは、ＭＡＲＴ−１ペプチド、 特にエピトープＭ９−１（ＴＴＡＥＥＡＡＧＩ）、Ｍ９−２（ＡＡＧＩＧＩＬＴ Ｖ）、Ｍ１０−３（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）およびＭ１０−４（ＡＡＧＩＧＩＬ ＴＶＩ）（一文字アミノ酸コードで示す、実施例２および３）またはｇｐ−１０ ０ペプチドのエピトープを認識または結合する。 本発明のヘテロ二量体のＴ細胞レセプターの機能性α鎖は、以下の式： Ｖ−Ｊ−Ｃ 式中、Ｖはα鎖の可変領域を含むアミノ酸配列である： を持つことができる。例として、再配列後のＶ遺伝子は、システイン−Ｘａａ_n （式中、ｎは約１−５であって良く、Ｘａａは任意のアミノ酸またはアミノ酸の 組み合わせであって良い）のカルボキシ末端配列をコードする３’末端を持つで あろう。望ましくは、Ｘａａは、アラニンまたはセリンである。望ましい実施態 様では、Ｖ遺伝子の３’末端は、システイン−アラニンのカルボキシ末端をコー ドする。Ｖα遺伝子の望ましいカルボキシ末端を図１Ａおよび１Ｂならびに図２ に示す。この領域を作り出すに用いられるであろうＶα遺伝子の例としては、こ れらに限定されるわけではないが、Ｖα８．２またはＶα１７、Ｖα９、Ｖα１ 、Ｖα２５、またはＶα２１が含まれる。 Ｊは、連結領域を示す。この領域を作り出すために用いることのできるＪ遺伝 子の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｊα４９、Ｊα４２、Ｊ α１６またはＪα５４ が含まれる。さらにまた、Ｊ領域は、図１Ａ−１Ｂおよ び２に示すようなＮ領域を含んでもよい。本発明のＴ細胞レセプターのα鎖に望 ましいＪ領域を、図１Ａおよび１Ｂならび図２に示す。Ｃは、α鎖の不変領域を 示す。 本発明のＴ細胞レセプターの望ましいＶ−Ｊ連結配列を、図１Ａ−１Ｂおよび 図２に示す。 ヘテロ二量体であるＴ細胞レセプターの機能性β鎖は、式： Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃ 式中、Ｖはβ鎖の可変領域を含むアミノ酸配列である： を持つであろう。Ｖ遺伝子は、システイン−Ｘａａ_n（式中、ｎは約１−５であ って良く、またＸａａは任意のアミノ酸または任意のアミノ酸の組み合わせであ って良い）のカルボキシ末端をコードする３’末端を持つであろう。望ましくは 、Ｘａａは、アラニンまたはセリンのいずれかである。望ましい実施態様では、 Ｖ領域の３’末端は、システイン−アラニン−セリンまたはシステイン−アラニ ン−セリン−セリン、またはシステイン−アラニンのカルボキシ末端をコードす る。Ｖβ領域の望ましいカルボキシ末端を、図１Ａ−図１Ｂおよび図２に示す。 Ｖ領域に用いることのできるＶ遺伝子の例としては、これらに限定されるわけで はないが、Ｖβ１３．６、Ｖβ６．５、Ｖβ２２．１、Ｖβ７．３、またはＶβ ３．１が含まれる。 Ｊは、連結領域を示す。連結領域を作り出すために用いることのできるＪβ遺 伝子の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｊβ１．５、Ｊβ２． １、Ｊβ１．１、またはＪβ２．７が含まれる。連結領域は、また、図１Ａ−１ Ｂおよび図２に示すようなＮ領域を含むであろう。ここに用いられるであろうＤ （多様性）遺伝子の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｄβ１． １、またはＤβ２．１が含まれる。 Ｃは、β鎖の不変領域を示す。用いることのできる不変領域の例としては、こ れらに限定されるわけではないが、Ｃβ１またはＣβ２が含まれる。ここに提供 されるＴ細胞レセプターのβ鎖の望ましいＶ−Ｄ−Ｊ連結配列を、図１Ａ−１Ｂ および図２に示す。 一つの実施態様では、本発明のＴ細胞レセプターは、システインＸａａ_nのカ ルボキシ末端をコードする３’末端を持つ可変領域、Ｊ領域および不変領域をコ ードする核酸配列を含むα鎖を、システインＸａａ_nのカルボキシ末端をコード する３’末端を持つ可変領域、Ｄ領域およびＪ領域ならびに不変領域をコードす る核酸配列を含むβ鎖と共に、含む。Ｔ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖は、望 ましくは腫瘍関連抗原、最も望ましくは黒色腫抗原を認識するリガンド結合ドメ インを形成する。 望ましい実施態様では、ここに提供される黒色腫に特異的なＴ細胞レセプター は、以下のαおよびβ鎖の組み合わせ；図１Ａに示したＶ−Ｊ連結配列を持つＶ α８．２／Ｊα４９／Ｃα鎖（配列番号：１および１４）および図１Ａに示した Ｖ−Ｄ−Ｊ連結配列を持つＶβ１３．６／Ｄβ１．１／Ｊβ１．５／Ｃβ１（配 列番号：３および１６）を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ） Ｃ１０−１Ｔ細胞 クロノタイプ；図１Ｂに示したＶ−Ｊ連結配列を持つＶα１７／Ｊα４２／Ｃα （配列番号：４および１７）ならびに図１Ｂに示したＶ−Ｄ−Ｊ連結配列を持つ Ｖβ６．５／Ｄβ１．１／Ｊβ１．５／Ｃβ１（配列番号７および２０）を含む ＴＩＬ Ｆ２−２クロノタイプ；図１Ｂに示したＶ−Ｊ連結配列を持つＶα９／ Ｊα１６／Ｃα（配列番号５および１８）ならびに図１Ｂに示したＶ−Ｄ−Ｊ連 結配列を持つＶβ２２．１／Ｄβ２．１／Ｊβ２．１／Ｃβ２（配列番号８およ び２１）を含むＴＩＬ１２００クロノタイプ；図１Ｂに示したＶ−Ｊ連結配列を 持つＶα１／Ｊα４９／Ｃα（配列番号６および１９）ならびに図１Ｂに示した Ｖ−Ｄ−Ｊ連結配列を持つＶβ７．３／Ｄβ２．１／Ｊβ２．１／Ｃβ２（配列 番号９および２２）を含むＴＩＬ５クロノタイプ；図２に示したＶ−Ｊ連結配列 を持つＶα２５／Ｊα５４／Ｃα（配列番号１０および２３）ならびに図２に示 したＶ−Ｄ−Ｊ連結配列を持つＶβ３．１／Ｄβ１．１／Ｊβ１．１／Ｃβ１（ 配列番号：１２および２５）を含むＴＩＬ １Ｅ２クロノタイプ；または、図２ に示したＶ−Ｊ連結配列を持つＶα２１／Ｊα４２／Ｃα（配列番号１１および ２４）ならびに図２に示したＶ−Ｄ−Ｊ連結配列を持つＶβ７．３／Ｄβ２．１ ／Ｊβ２．７／Ｃβ２（配列番号１３および２６）を含むＴＩＬ Ａ４２クロノ タイプ；を持つ。 本発明のＴ細胞レセプターは、自然発生のものであっても、合成によって作り 出されたものであっても良い。本発明のＴ細胞レセプターを含むαおよびβ鎖は 、 当業者に周知の標準的な組換え法によって、作り出すことができる。本発明のＴ 細胞レセプターのαおよびβ鎖を構築するのに用いることのできるＶα、Ｊα、 Ｃα、Ｖβ、ＤβおよびＪβ遺伝子の例としてのＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号を以下 に提供する。これらの遺伝子は、本発明のＴ細胞レセプターのためにここに提供 された唯一のＪ−ＶまたはＪ−Ｄ−Ｊ連結配列を挿入するためのフレームとして 用いることができる。 さらに、本発明は、腫瘍関連抗原、特に黒色腫抗原を認識するまたは結合する 本発明のＴ細胞レセプターと、実質的に同じ機能性または活性を持つＴ細胞レセ プターおよびその類似体を含む。そのようなレセプターまたはタンパク質は、こ れらに限定されるわけではないが、ここに提供されたＴ細胞レセプターのタンパ ク質のフラグメント、または置換、付加あるいは欠失変異体が含まれる。また、 この発明は、ここに提供され得るＴ細胞レセプターと実質的に相同であり、同じ 活性を保持しているタンパク質またはペプチドを包含する。「類似体」と言う言 葉は、一つまたはそれより多くの残基が機能的に類似した残基と保存的に置換さ れ、また、ここに記載されたＴ細胞レセプターの機能性特色を示す、ここに提供 されたＴ細胞レセプターと実質的に同一のアミノ酸残基配列を持つ任意のタンパ ク質またはポリペプチドを含む。例として、そのようなレセプターは、腫瘍関連 抗原、ＭＡＲＴ−１またはｇｐ１００、またはそれから誘導されたペプチドを認 識することができる。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシ ンまたはメチオニンのような一つの非極性（疎水性）残基の相互置換、アルギニ ンとリジン、グルタミンとアスパラギン、グリシンとセリンの間で行われるよう な一つの極性（親水性）残基の相互置換、リジン、アルギニンまたはヒスチジン のような一つの塩基性残基の相互置換、またはアルパラギン酸またはグルタミン 酸のような一つの酸性残基の相互置換が、含まれる。 また、「保存的置換」と言う句は、非誘導残基の代わりに化学的に誘導された 残基を用いることを含む。「化学誘導体」とは、機能性側鎖の反応によって化学 誘導された一つまたはそれより多くの残基を持つ従属ポリペプチドをさす。その ような誘導体分子の例として、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン 塩酸、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカル ボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するそれらの分子を含む。 遊離のカルボキシル基は、誘導体化されて、塩、メチルおよびエチルエステルま たは他の型のエステルあるいはヒドラジドを形成することができる。遊離のヒド ロキシル基は、誘導体化されて、Ｏ−アセチルまたはＯ−アルキル誘導体を形成 することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化されて、Ｎ−ｉ ｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。また、化学誘導体としては、 ２０の標準アミノ酸からの、一つまたはそれより多くの自然発生アミノ酸誘導体 を含むそのようなタンパク質またはペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキ シプロリンはプロリンの代わりであり；５−ヒドロキシリジンはリジンの代わり であり；３−メチルヒスチジンはヒスチジンの代わりであり；ホモセリンはセリ ンの代わりであり；オルニチンはリジンの代わりでありうる。また、本発明のタ ンパク質またはポリペプチドは、必要な活性を維持している限りにおいて、レセ プターのＤＮＡ配列によってコードされる配列のポリペプチド配列と比較して１ つまたはそれより多くの付加および／または欠失または削除された残基を持つ任 意のポリペプチドをも含む。ここに提供された腫瘍抗原特異的Ｔ細胞レセプター の核酸配列は、本発明の望ましい実施態様を示す。しかしながら、核酸配列内の 遺伝子コード変化の縮重によってもまた、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞レセプターをコ ードする能力を持つ配列を結果として生ずることを、当業者は理解している。そ れ故、そのような配列は、ここに示した配列と機能的に等価である。そのレセプ ターの機能活性を持つ腫瘍抗原Ｔ細胞レセプターをコードする核酸配列もまた、 本発明の内にある。 また、本発明は、ここに提供されるＴ細胞レセプター核酸配列の全体または部 分およびベクターを含む組換えＤＮＡ分子を提供する。本発明のＴ細胞レセプタ ーのαおよびβ鎖をコードする核酸配列を、単一の発現ベクター内に位置させる ことができる。代わりに、α鎖およびβ鎖をそれぞれ別々の発現ベクター内に位 置させることもできる。本発明で用いるのに適当な発現ベクターは、核酸配列に 機能できるように連結した少なくとも一つの発現制御エレメントを含むことがで きる。発現制御エレメントをベクター内に挿入すると、核酸配列の発現が制御さ れ調節される。発現制御エレメントの例としては、これらに限定されるわけでは ないが、ｌａｃシステム、ファージλのオペレーターおよびプロモーター領域、 酵母のプロモーターおよびポリオーマより誘導されたプロモーター、アデノウイ ルス、レトロウイルス、シトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＳＲα、ＭＭＬＶ、Ｓ Ｖ４０またはホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）およびβアクチンのような ハウスキーピングプロモーターが含まれる。さらに、望ましいまたは必要とされ る有効なエレメントとしては、これらに限定されるわけではないが、リーダー配 列、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよび宿主システムでの核酸配列の適 当な転写およびそれに続いて起こる翻訳に必要なあるいは望ましいその他の任意 の配列が含まれる。必要とされるまたは望ましい発現制御エレメントの適正な組 み合わせが選択された宿主システムに依存するであろうことは、当業者によって 理解されるであろう。さらに、発現ベクターは宿主システム内での核酸配列を含 む発現ベクターの運搬およびそれに続いて起こる複製に必要なさらなるエレメン トを含んで良いことが、理解されるであろう。そのようなエレメントの例として は、これらに限定されるわけではないが、複製開始点および選択可能マーカーな らびに長い末端繰り返し（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴ Ｒ）および内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）が含まれる。また、発現ベクターは、リー ダーペプチド配列を含むことができる。さらに、そのようなベクターは、慣用的 方法（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を用いて簡単に構築される 、または商品として入手できることを、当業者は理解しているであろう。 本発明のもう一つの態様は、本発明のＴ細胞レセプターの核酸配列の全体また は部分を含む組換え発現ベクターが導入される宿主微生物に関する。本発明のＴ 細胞のαおよびβ鎖は、異なる宿主内または同一の宿主内で独立的に発現させる ことができる。望ましくは、αおよびβ鎖は、同一宿主内に導入され、機能性Ｔ 細胞レセプターの形成を可能にする。本発明のＴ細胞レセプター核酸配列の全体 または部分で形質転換された宿主細胞には、動物、植物、昆虫および酵母細胞の ような真核生物、ならびに大腸菌のような原核生物が含まれる。例として、動物 細胞には、ＪＵＲＫＡＴ細胞、Ｔリンパ球、末梢血液細胞、単球、幹細胞、ナチ ュラルキラー細胞またはマクロファージが含まれる。遺伝子を持つベクターを細 胞内に導入することのできる手段としては、これらに限定されるわけではないが 、微量注入、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、形 質導入、レトロウイルス形質導入、またはＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェク チン、リン酸カルシウム、遺伝子運搬を仲介する粒子衝撃、あるいは本発明のＴ 細胞レセプターをコードする核酸配列の直接注入を用いた移入、または当業者に 既知のその他の方法が含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、”Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏ ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。発現ベクターによって作り出されるＴ細胞レセプターを単離し、 生成し、さらに、結晶学研究または抗体の形成に用いることができる。 望ましい実施態様では、真核細胞で機能する真核生物の発現ベクターが用いら れる。そのようなベクターの例としては、これらに限定されるわけではないが、 レトロウイルスベクター、ワクチンウイルスベクター、アデノウイルスベクター 、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ヘルペスウイルスベクター、鶏痘ウイルスベク ター、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のよ うなプラスミド、またはバキュロウイルス運搬ベクターが含まれる。例として、 用いることのできる真核生物発現ベクターは、これらに限定されるわけではない が、Ｇ１ＥＮ（Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ，８５：１３９；Ｍｏｒ ｇａｎら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：１２９３ −１２９９）、ＬＸＳＮ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、Ｍｅｃｈｏｄｓ Ｅｎｚ ｙｍｏｌ．，２１７：５８１−５９９、１９９３；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、 Ｂｉ ｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７：９８０−９８８、１９８９；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ． Ｄ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：２８９５−２９０２，１９８６； Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．，１５８：１−２４，１９９２）またはＳＡＭ−ＥＮベクター（Ｔｒｅｉ ｓｍａｎ，Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ，８５：１３９）が含まれる。望ましい真核生物 細胞系には、これらに限定されるわけではないが、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈ ｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、２９３細胞（ＡＴＣＣ♯ ＣＲＬ１５７３） 、Ｔ２細胞、樹状細胞、単球、またはＪＵＲＫＡＴ細胞が含まれる。望ましい実 施態様では、組換えＴ細胞レセプタータンパク質発現ベクターは、ＮＩＨ／３Ｔ ３、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、２９３細胞（ＡＴＣＣ♯ ＣＲＬ１５７３）、Ｔ２細 胞、樹状細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞または単球のような 哺乳動物細胞内に導入されて、適切なプロセシングおよびレセプタータンパク質 の修飾を確実なものにする。 一つの実施態様では、発現した組換えＴ細胞レセプターは、コマジブルー染色 および特異的Ｔ細胞レセプターに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティン グを含む、この技術分野で既知の方法に従って、検出することができる。さらな る実施態様では、宿主細胞によって発現した組換えタンパク質は、粗溶解細胞液 として得られるか、または分画沈殿、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、アフィニティ ー、およびイムノアフィニティクロマトグラフィーおよびその類似法を含むこの 分野で既知の標準的なタンパク質精製法によって精製することができる（Ａｕｓ ｕｂｅｌら、１９８７、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。イムノアフィニティークロマトグラフ ィーの場合、組換えタンパク質は、本発明のＴ細胞レセプターに特異的な抗体を 通して結合させた樹脂を含むカラムを通過させることによって精製することがで きる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。 本発明の核酸配列またはその部分は、本発明のＴ細胞レセプターをコードする 再配列された遺伝子の発現ならびに関連するｍＲＮＡを検出するためのプローブ として、有用である。それ故、本発明のもう一つの態様は、本発明のＴ細胞レセ プターをコードするメッセンジャーＲＮＡまたはＤＮＡを生物サンプル中で検出 するためのアッセイに関する。 ＲＮＡは、全細胞ＲＮＡとして、またはポリ（Ａ）⁺ＲＮＡとして、分離する ことができる。全細胞ＲＮＡおよびポリＡ ＲＮＡは、当業者に既知の様々な方 法に従って、分離することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、”Ｃｕｒｒ ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。生体試料から ＤＮＡを分離し、遺伝子内での変化を検出し、核酸プローブとゲノムＤＮＡ配列 との間の複合体を検出するための標準的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８ ９、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ ｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎ ｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、”Ｃｕｒ ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏ ｒｋのような、マニュアルに提供されている。慣用的方法論は、ｍＲＮＡまたは ＤＮＡを分析し検出するために用いることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９ ８９、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ ａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉ ｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、”Ｃｕｒｒｅｎ ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈ ｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。 標準的技術を用いて、本発明のプローブを標識することができる。Ｓａｍｂｒｏ ｏｋら編、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌ ａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、” Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇ ｙ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。放射能活性および非放射能活性の標識キットもまた、商品として入手 できる。 バイオアッセイに用いることのできる生物サンプルの例としては、これらに限 定されるわけではないが、リンパ節のような組織、末梢血液リンパ球、腫瘍生検 、骨髄、リンパ系器官、黒色腫のような生検標本、病理標本、および検死標本が 含まれる。望ましい実施態様では、プローブとして用いられる核酸配列は、Ｔ細 胞レセプターを含むαおよびβ鎖のＪ−ＶまたはＪ−Ｄ−Ｖ連結配列領域から誘 導される（図１Ａ−１Ｂおよび図２）。プローブとして用いられる望ましい核酸 配列は、Ｎ領域を含む。代わりに、ここに提供される核酸配列の全長またはその 部分をプローブとして用いることもできる。 その他の実施態様では、図１Ａ−１Ｂおよび２にそれぞれ示したαおよびβ鎖 のＪ−ＶまたはＪ−Ｄ−Ｖ連結配列を基本としたオリゴヌクレオチド対の組み合 わせを用いて、生体サンプルのＲＮＡまたは再配列された生殖細胞系配列を検出 するためのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを誘導できる。これらのプ ライマーは、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕａｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第１５章，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．に詳 細に記載されている、選択されたＲＮＡ核酸配列を増幅させるための逆転写酵素 −ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法に続く方法に用いることができる。オ リゴヌクレオチドは、様々な製造者から発売されている自動装置によって合成す ることができ、または、本発明の核酸配列に基づき商品として調製することもで きる。当業者は、サンプル中のＲＮＡまたは再配列された生殖細胞系配列ＤＮＡ を増幅させるための核酸配列に基づいたＰＣＲプライマーを選択する方法を知っ ているであろう。ここに提供されたＴ細胞レセプターをコードするＲＮＡまたは ＤＮＡを検出する方法は、Ｔ細胞レセプターを用いるここに提供された治療方法 の効果を評価するまたは治療方針を決定するために用いることができる。 さらに、本発明のその他の実施態様では、ここに提供される抗原特異的Ｔ細胞 レセプターの核酸配列の全体またはその部分を用いて、形質転換動物を作り出す ことができる。望ましくは、本発明の抗原特異的Ｔ細胞のαおよびβ鎖をコード する配列は、胚芽期、望ましくは、一細胞期および一般的には八細胞期より遅く ない時期に、動物または動物の祖先に導入される。Ｔ細胞レセプター遺伝子を運 搬を持つ形質転換動物を作ることのできる手段は、いくつかある。一つの方法に は、Ｔ細胞レセプター配列の全体または部分を持つレトロウイルスを用いること が含まれる。トランスジーンを含むレトロウイルスは、トランスフェクションに よって胚芽期の動物内に導入される。その他の方法は、胚芽内へのトランスジー ンの直接注入を含む。さらに、その他の方法では、この分野で働く人々に既知の 胚芽期幹細胞法または相同体組換え法を用いる。Ｔ細胞レセプタートランスジー ンを導入することのできる動物の例としては、これらに限定されるわけではない が、ヒト以外の霊長類、マウス、ラットまたはその他の齧歯類が含まれる。形質 転換されたそのような動物は、癌研究の生物モデルとして、および癌、特に黒色 腫を治療するための診断法または治療法を評価するために、有用であろう。 さらに、本発明は、本発明のＴ細胞レセプターまたはその部分と反応する抗体 または抗体群を含む。本発明のこの実施態様では、抗体群は、もとはモノクロー ナルであるか、またはポリクローナルである。抗体生成に用いられる抗原特異的 Ｔ細胞レセプターまたはその部分は、天然または組換え体を源とすることができ る、または化学合成によって作り出すことができる。天然のＴ細胞レセプターは 、哺乳動物の生物サンプルから分離することができる。生物サンプルは、これら に限定されるわけではないが、末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）、血液、リンパ系器 官、リンパ節、Ｔ細胞、または黒色腫からの生検サンプルのような哺乳動物の組 織が含まれる。天然タンパク質は、組換えタンパク質について上記した方法と同 じ方法で分離することができる。組換えＴ細胞レセプタータンパク質またはペプ チドは、慣用的方法によって生成し、精製することができる。合成ペプチドは、 本発明のアミノ酸配列を基本として、注文生産すること、商品として作られるこ と、または当業者に既知の方法によって合成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉ ｅｌｄ,Ｒ．Ｂ．１９６３，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９）。もし ペプチドが抗原として短すぎる場合、ペプチドの抗原性を強化するために、キャ リヤー分子と結合させることができる。キャリヤー分子の例としては、これらに 限定 されるわけではないが、ヒトアルブミン、ウシアルブミンおよびキーホールリン ペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニンを含む（”Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９１、Ｓｔｉｔｅｓ ，Ｄ．Ｐ．およびＴｅｒｒ，Ａ．Ｉ．編，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇ ｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ，Ｃａｌｉ ｆｏｒｎｉａ）。 本発明の検出方法に用いられる典型的な抗体は、完全なイムノグロブリン分子 であり、実質的には、完全なイヌムノグロブリン分子または抗原結合部位を含む イムノグロブリン分子のそれらの部分であり、この分野ではＦ（ａｂ）、Ｆ（ａ ｂ’）；Ｆ（ａｂ’）₂およびＦ（ｖ）として知られているイムノグロブリン分 子のそれらの部分を含む。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、この技 術分野で既知の方法によって作り出すことができる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌ ｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７；Ｃａｍｐｂｅ ｌｌ，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔ ｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏ ｆ Ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”、Ｂｕｒｄｏ ｎら編、１９８５、”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第 １３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔ ｅｒｄａｍ）。また、抗体または抗原結合フラグメントは、遺伝子工学によって 作り出すこともできる。大腸菌内に重鎖および軽鎖の両方の遺伝子を発現させる 技術は、以下のＰＣＴ特許出願：出願番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３ およびＷＯ９０１４４２４：およびＨｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２ ４６：１２７５−１２８１の主題である。 この発明の抗体は、天然または変性させたＴ細胞レセプタータンパク質あるい はペプチドまたはその類似体と反応することができる。抗体を用いる具体的イム ノアッセイは、どの抗体が望ましいかを指図するであろう。抗体は、天然のＴ細 胞レセプタータンパク質あるいはその部分に対して、またはＴ細胞レセプターの アミノ酸配列に独特な領域に相同な合成ペプチドに対して、上昇させることがで きる。 一つの実施態様では、本発明の抗体をイムノアッセイに用いて、生物サンプル 内の抗原特異的Ｔ細胞レセプタータンパク質を検出する。この方法では、本発明 の抗体を生物サンプルと接触させ、Ｔ細胞レセプターと抗体の間に複合体が形成 されていることを検出する。本発明のイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ 、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、化学 発光アッセイ、免疫組織化学アッセイおよびその類似アッセイであって良い（” Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ ａｙ”、１９９１、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｐ．ＰｒｉｃｅおよびＤａｖｉｄ Ｊ．Ｎｅｏｍａｎ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ ｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ ｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。この技術分 野でＥＬＩＳＡとして知られている標準的な技術は、”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ”、第２版、ＲｏｓｅおよびＢｉｇａｚｚｉ編 、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０およ びＣａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｅｃｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ． Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｉｎｃ．，１９６４（これらは両方とも、ここに参照と して取り入れられる）。そのようなアッセイは、この技術分野に記載されている ように、直接的、間接的、拮抗または非拮抗のイムノアッセイであって良い（” Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ ａｙ”、１９９１、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｐ．ＰｒｉｃｅおよびＤａｖｉｄ Ｊ．Ｎｅｏｍａｎ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓ，ＮＹ，ＮＹ；Ｏｅｌｌｉ ｒｉｃｈ，Ｍ．，１９８４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．，２２：８９５−９０４）。そのような検出アッセイに適当な生物サンプル には、哺乳動物の組織、黒色腫およびリンパ節、病理標本、検死標本、骨髄、末 梢血液リンパ球および生検標本が含まれる。タンパク質は、以下に記載の慣用的 方法に従って、生物サンプルから分離することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら編、 １９８７、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ ｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。 本発明の抗体は、本発明の特異的Ｔ細胞レセプターを検出するためにイムノア ッセイに、または生物サンプル内に黒色腫特異的Ｔ細胞レセプターを持つＴ細胞 の発現レベルを変化させるために、用いることができる。生物サンプルの例とし ては、これらに限定されるわけではないが、黒色腫、末梢血液リンパ球、骨髄、 腫瘍生検、リンパ節、リンパ系器官および組織サンプルのような、生検組織サン プルのような哺乳動物組織が含まれる。これらのイムノアッセイによって評価で きる病気の例としては、これらに限定されるわけではないが、黒色腫および黒色 腫転移による二次的腫瘍部位となる組織が含まれる。それ故、本発明の抗体は、 病気にかかった哺乳動物を診断、評価または予知するためのイムノアッセイに用 いることができる。 その他の実施態様では、本発明の抗体は、腫瘍関連抗原、特に黒色腫抗原を認 識するここに提供されたレセプターを持つＴ細胞を精製する、または豊富にする ために用いることができる。イムノアフィニティークロマトグラフィーは、当業 者に既知の慣用的方法によって行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８ ７、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ ｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。さらに、そのようなＴ細胞は、哺乳動物、望ましくはヒト に、予防または治療目的のいずれかで、治療に有効な量を投与することができる 。さらに、そのような方法は、効き目を評価する、または哺乳動物の治療法を決 定するために、用いることもできる。 その他の実施態様では、Ｔ細胞レセプターの全体または部分、望ましくはユニ ークな領域に対する、動物内で作り出されたモノクローナル抗体またはポリクロ ーナル抗血清を、イムノアッセイに用いることができる。望ましい実施態様では 、αおよびβ鎖ペプチドに特異的な抗原にユニークな領域を基にしたペプチドを 、（Ｍ．Ｂｏｎｄａｎｓｚｋｙ、１９８４、”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐ ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅ ｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、に記載の方法に従って）、キャリヤーと結合 さ せることができる。慣用的方法を用いると、ウサギをキャリヤーと結合させたタ ンパク質またはペプチドで免疫化することもできる。動物は、同様量の追加免疫 投与を受け、抗血清の滴定は、ＥＬＩＳＡアッセイによって評価される。満足な レベルの抗血清は、抗ペプチド抗体滴定が、一定値（プラトー）に達した場合に 得られる。この抗体は、上記の標準的なイムノアッセイに用いることができる。 代わりに、Ｔ細胞レセプターに対する抗イディオタイプ抗体を用いると、ここ に記載の方法で治療される哺乳動物内での、本発明のレセプターを持つ特異的Ｔ 細胞のレベルを評価することができる。 本発明は、腫瘍細胞を、ここに提供された抗原特異的Ｔ細胞レセプターまたは キメラレセプターを発現する細胞に晒すことによって、腫瘍細胞の増殖を阻害ま たは予防する方法を提供する。また、腫瘍関連抗原を認識するまたは結合する本 発明のＴ細胞レセプターは、予防目的または治療目的のいずれかに用いることが できる。予防目的に提供される場合、Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプター を導入した細胞は、癌、特に黒色腫による哺乳動物内のいかなる証拠または兆候 が現れるより早く、提供される。Ｔ細胞レセプターまたは抗原特異的Ｔ細胞レセ プターを導入された細胞を予防的に用いると、哺乳動物の癌、特に黒色腫を予防 するまたは弱めるのに役立つ。治療に提供される場合、Ｔ細胞レセプターまたは 本発明のレセプターを発現する細胞は、哺乳動物では疾病の初期に（またはその 少し後に）提供される。Ｔ細胞レセプターまたはそれらのレセプターを発現する 細胞の治療目的での投与は、病気を弱めるのに役立つ。 最近では、細胞を基本とした免疫治療は、ｅｘ ｖｉｖｏで増やした腫瘍特異 的ＴＩＬの患者への養子移入を利用して行う（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．， １９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１０：８０；ＲｏｓｅｎＢｅｒｇ，Ｓ Ａ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１９：１６７６；Ｈｗｕ，Ｐ．ら、１ ９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：３６１）。Ｔ細胞の特異性は、本発明 の腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞レセプターをコードする核酸配列の生体外での伝達 によって、再び指図されるであろう。例として、ＴＩＬ内の非特異的なＴ細胞集 団に対して抗腫瘍反応性を授けることによって、または分化していないＴリンパ 球のクローンの拡大によって、ＴＩＬのようなＴ細胞の種々雑多の集団の効果を 高めることができる。 提供された抗原特異的Ｔ細胞レセプターを発現するために遺伝的に修飾するこ とのできる細胞としては、これらに限定されるわけではないが、リンパ球、細胞 毒性Ｔリンパ球、造血幹細胞、単球、幹細胞、末梢血液細胞およびナチュラルキ ラー細胞が含まれる。本発明の望ましい実施態様では、Ｔ細胞は、遺伝的に修飾 されて、ここに提供された腫瘍抗原特異的Ｔ細胞レセプターを発現することがで きる。望ましい抗原特異的Ｔ細胞レセプターを、図１Ａ−１Ｂおよび図２に示す 。本発明のＴ細胞レセプターをコードする核酸配列の全体または部分を含む構築 物は、慣用的方法によってＴリンパ球内に導入することができる。例として、そ のような方法には、これらに限定されるわけではないが、リン酸カルシウムトラ ンスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、レトロウイル スによる形質導入、ＤＮＡ注射、粒子射撃、およびレトロウイルスベクター、ウ イルスベクターを用いる遺伝子仲介伝達、ウイルスの生成細胞系との共培養によ るトランスダクションが含まれる。望ましくは、本発明の核酸配列を持つ構築物 および構築物群は、ウイルス上澄み液でのトランスダクションまたはレトロウイ ルス生成細胞系との共培養によって、Ｔ細胞内に導入される。用いることのでき るベクターの例としては、これらに限定されるわけではないが、不完全なレトロ ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクチンウイスルベクター、ニワ トリの発疹ウイルスベクター、またはその他のウイルスベクターが含まれる（Ｍ ｕｌｌｉｇａｎ Ｒ．Ｃ．、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３ ２）。真核生物発現ベクター Ｇ１ＥＮ（Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｊ．ら編、Ｂｌｏ ｏｄ，８５：１３９；Ｍｏｒｇａｎら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：１２９３−１２９９）、ＬＸＳＮ（ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ． ら、Ｍｅｃｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７：５８１−５９９、１９９３； Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７：９８０−９８８ 、１９８９；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６： ２８９５−２９０２、１９８６；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：１−２４、１９９２）、およ びＳＡＭ−ＥＮ（Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ，８５：１３９）もま た、用 いることができる。レセプターを構成するαおよびβ鎖をコードする遺伝子を個 々に持つ構築物を、Ｔリンパ球内に導入することができるが、代わりに、Ｔ細胞 レセプターのαおよびβ鎖の両方をコードする核酸配列を持つ構築物が単一の構 築物であっても良い。望ましくは、レトロウイルスベクター、例えばＴ細胞レセ プター遺伝子の転写を促進するマウスのモロニー（ｍｏｌｏｎｅｙ）白血病ウイ スルＬＴＲを持つベクターが用いられる。望ましい実施態様では、複製能のない レトロウイルスベクターが用いられる。代わりに、ホスホグリセロールキナーゼ （ＰＧＫ）遺伝子からのプロモーターのような内部ハウスキーピングプロモータ ーを用いて、遺伝子を発現させることもできる。 Ｔ細胞レセプターのαおよびβ鎖は、別々のレトロウイルスベクター上で、ま たは同一のレトロウイルスベクター上で、中間に置かれたリボソーム侵入部位（ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）（ＩＲ ＥＳ）によって隔てることによって、発現させることができる（Ｔｒｅｉｓｍａ ｎ，Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ，８５：１３９；Ｍｏｒｇａ，Ｒ．Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：１２９３−１２９９、１９９２）。ＩＲＥ Ｓを含むベクターを用いると、両方のＴ細胞レセプター遺伝子を単一のＲＮＡメ ッセンジャーから翻訳させることが可能になる。どこからＴリンパ球を分離でき るかの例としては、これらに限定されるわけではないが、末梢血液細胞リンパ球 （ＰＢＬ）、リンパ節、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、または血液が含ま れる。そのようなリンパ球は、この技術分野で既知の方法によって、治療される 個体またはドナーから分離することができ、さらに生体外で培養することもでき る（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：２ ４５３−３４６１）。 Ｔ細胞は、レトロウイルス発現ベクターを持つレトロウイルス生成細胞と共に 、またはウイルス上澄み液と共に、インキュベートすることができる。リンパ球 の生存度は、トリパンブルー色素排除試験のような慣用的方法によって評価する ことができる。その後、望ましい黒色腫特異的Ｔ細胞レセプターを発現する遺伝 的に修飾されたリンパ球は、そのような治療を必要とする哺乳動物、望ましくは ヒトに、治療有効量を投与することができる。慣用的に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩ Ｌ） の治療に用いられるリンパ球の投与養生法または範囲（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、 １９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ｉｔｕｔｅ、第８６巻、１１５９）は、そのような治療に必要とされる哺乳動物 へ投与するためのＴ−リンパ球の投与量または数の一般的ガイドラインとして用 いることができる。例として、ここに提供された方法では、治療のそれぞれのサ イクルで、約１ｘ１０¹⁰から約１ｘ１０¹¹のＴ細胞を投与することができる。こ れらの抗原特異的Ｔ細胞を哺乳動物に投与することのできる方法の例としては、 これらに限定されるわけではないが、静脈内、腹腔内、または病変内を含む。こ れらの移入されたＴリンパ球の効果を測定するために評価することのできるパラ メータとしては、これらに限定されるわけではないが、治療される哺乳動物内で の免疫細胞の生成または腫瘍の抑制が含まれる。これらのパラメーターを評価す るために、慣用的方法が用いられる。そのような処置は、サイトカインまたは遺 伝子修飾細胞と協力して（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、１９９２、Ｈｕｍ ａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：７５−９０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ． Ａ．ら、１９９２、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：５７−７３） 、化学療法または活性免疫化療法を与えることができる。当業者は、正確な治療 スケジュールおよび投薬量、または投与されるＴリンパ球の量が、与えられる個 体に関して最適化される必要があるであろうことを、認識しているであろう。 また、本発明は、ここに提供されるように、キメラレセプターまたは腫瘍抗原 を認識するＴ細胞レセプターを発現する幹細胞に関する。特異的抗体の一本鎖Ｆ ｖドメインおよびＴ細胞レセプターのような免疫細胞の少なくとも一つの膜貫通 ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第二のセグメント、ＣＤ３レセプタ ー複合体からの鎖の一つ、Ｆｃレセプター、ＣＤ２８レセプター、またはＩＬ− ２レセプターあるいはそれらによく似た細胞質ドメインからなるキメラレセプタ ー遺伝子。望ましい実施態様では、キメラレセプターは、Ｆｃレセプターに関連 するγ鎖に連結したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の可変ドメインを含み、これ はＴ細胞内へのシグナルトランスダクションを仲介する能力を持つ（Ｈｗｕら、 １９９３、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎ ｅ，１７８：３６１−３６６；Ｅｓｃｈｅｒら、１９９３、ＰＮＡＳ、９０：７ ２０−７２４；Ｈｗｕら、１９９３、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ，１５０：４１０４およびＷＯ９３／１９１６３、これらはここに参考とし て取り入れられる）。造血幹細胞の分離、濃縮化、および培養の方法は、当業者 に既知である（Ｔｓｋａｍｕｔｏら、米国特許第５，０６１，６２０号およびＰ ｅａｕｌｔ、米国特許第５，１４７，７８４号、ここに参照として取り入れられ る）。 造血幹細胞の供給源である骨髄の単離、およびレトロウイルストランスダクシ ョンは常法により実施する［Ｂｊｏｒｋｓｔｒａｎｄ，Ｂ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ ｅ Ｔｈｅｒ ．，５：１２７９−１２８６（１９９４）；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｌ ａｎｃｅｔ ，３４２：１１３４−１１３７（１９９３）；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ． Ｋ．ら、Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｎｅ ｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ （抄録２１１９９３），４６：７１１；Ｂｒ ｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｋ．ら、Ｌａｎｃｅｔ，３４１：８５−８６（１９９３）；Ｂ ｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ，３：３３−３６（１９ ９４）；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ，２：７−１ ７（１９９３）；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５ ：４８１−４９９（１９９４）；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｋ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．，７１６：２０４−１４（１９９４）；Ｏ’Ｓｈａｕｇｈ ｎｅｓｓｙ，Ｊ．Ａ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：３３１−３５４ （１９９３）；Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ，Ｊ．Ａ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ．，５：８９１−９１１（１９９４）；Ｂｌａｅｓｅ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｈ ｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ．，４：５２１−５２７（１９９３）；Ｃａｓｓ ｅｌ，Ａ．ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ，２１：５８５−５９１（１９９３）； Ｄｕｎｂａｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７１６：２ １６−２４（１９９４）；Ｂｏｄｉｎｅ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ，８２：１９ ７５−１９８０（１９９３）］。例えば、ヒトＣＤ３４⁺造血幹細胞は末梢血か ら容易に単離でき［Ｂａｒｒａｎｄｅ Ｃ．ら、１９９３．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ，１２（２）：２０３；Ｋａｔｏ Ｋ．およびＡ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ．１９９３ ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１４（４）：３８４］、レトロウイルス仲介遺伝子伝達 のための標的として使用されるであろう［Ｃａｓｓｅｌ Ａ．ら、１９９３．Ｅ ｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ ．，２１（４）：５８５；Ｂｒｅｇｎｉ Ｍ．ら、１９９ ２．Ｂｌｏｏｄ，８０：１４１８］。哺乳類から単離された骨髄は抗ＣＤ３４⁺ モノクローナル抗体を用いることによりＣＤ３４⁺を濃縮できるであろう。ＣＤ ３４⁺細胞はＩＬ−３、ＩＬ−６および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む培地で培養 できる。細胞をレトロウイルス上清液に暴露して採取し、そのような処置の必要 に応じて 哺乳類に再注入する。 キメラレセプターまたは黒色腫特異的Ｔ細胞レセプターを含む構築物はマイク ロインジェクション、エレクトロポレーション、ウイルス形質導入、形質導入、 またはＤＥＡＥデキストランを用いるトランスフェクション、リポフェクション 、リン酸カルシウム、粒子衝撃媒介遺伝子伝達または本発明のＴ細胞レセプター をコードしている核酸配列の直接的注入または当業者には既知であるその他の方 法を含む（しかしこれらに制限されるわけではない）通常の方法により細胞に導 入される。好適な態様において、幹細胞を含んでいる骨髄はウイルス上清液また はレトロウイルス構築物（類）を運んでいる産生細胞株とインキュベートされる 。本発明のキメラレセプターまたは黒色腫抗原特異的Ｔ細胞レセプターを発現す るベクターの例には、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のようなプラスミドまたはバキュロウイルス伝達ベクター が含まれるが、これらに制限されるわけではない。例えば、使用されるであろう 真核生物発現ベクターにはＧ１ＥＮ（Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ， ８５：１３９；Ｍｏｒｇａｎら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．： ２０ １２９３−１２９９）、ＬＸＳＮ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、Ｍｅｔｈ ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ．，２１７：５８１−５９９（１９９３）；Ｍｉｌｌｅ ｒ，Ａ．Ｄ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７：９８０−９８８（１９８９ ）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：２８９５−２ ９０２（１９８６）；Ｍｉ１ｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．，１５８：１−２４（１９９２））またはＳＡＭ −ＥＮベクター（Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ，８５：１３９）が含 まれるが、これらに制限されるわけではない。 ここに提供されるキメラレセプターかまたは黒色腫反応性Ｔ細胞レセプターを 運ぶ幹細胞はそのような処置が必要とされる哺乳類、好適にはヒトへ治療有効量 で投与される。この態様で使用されるべき好適なＴ細胞レセプターは図１Ａ１Ｂ および図２に示されている。哺乳類の処置において評価されるパラメーターには 、 分化した造血細胞が導入されたレセプター遺伝子により認識される抗原により活 性化されるかまたは特異的に結合するようになる能力の研究、導入されたレセプ ター遺伝子の存在についての末梢血リンパ球および他の組織のＤＮＡ分析、およ びレセプター遺伝子発現の免疫組織化学的抗体研究が含まれるが、これらに制限 されるわけではない。さらに、インビボ抗腫瘍応答が評価できる。完全な腫瘍撲 滅には反復処置、腹腔内および静脈内処置の組み合わせ、または他の処置法との 組み合わせが必要とされる。抗原ダウンレギュレーションまたは抗原陰性細胞の インビボ免疫選択が明白な場合には、異なった抗原を標的とする種々のキメラレ セプターまたはＴ細胞レセプターを用いる腫瘍治療もまた使用されうる。 キメラレセプター遺伝子が形質導入された幹細胞から誘導された分化リンパ球 の治療効率は他のレセプター型を加えることにより促進される。従って、本発明 はＴ細胞に同時刺激信号を提供でき、Ｔ細胞からのＣＤ２８の細胞質領域に連結 された抗体の可変領域または同様な領域を含むキメラレセプターにも関している 。例えば、ＣＤ２８レセプターは同時刺激分子Ｂ７により活性化される（Ｌｉｎ ｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ，８７：５０３１−５０３５（１９９０）；Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ，７１ ：１０９３−１１０２ （１９９２）；Ｓｔｅｉｎら、（１９９４）Ｍｏｌ．＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ．１４：３３９２）。ＣＤ２８レセプターの細胞質領域（Ｓ ＣＦＶ−ＣＤ２８）へ連結されたモノクローナル抗体の可変領域からなるキメラ レセプター遺伝子の同時投与では他のキメラレセプターも同時投与される。ＳＣ ＦＶ−γおよびＳＣＦＣ−ＣＤ２８レセプターの両方によりＴ細胞は抗体規定抗 原との接触によるＴＣＲ活性化および同時刺激信号を受け取ることができる。 本発明はまた、Ｔ細胞レセプターおよび本発明のキメラレセプターを含む医薬 組成物、およびこれらのレセプター遺伝子で形質転換または形質導入された細胞 の医薬組成物にも関している。さらに、本レセプターのための遺伝子を含む発現 ベクターからなる医薬組成物が本発明に包含されていることも意図されている。 本発明の処方（家畜およびヒトでの使用の両方とも）では、各々の成分が個々に または前記のように組成物として、一つまたはそれ以上の医薬として受容可能な 担体とおよび場合により他の治療成分と一緒に含まれている。担体は処方の他の 成分と両立できおよびその受容者に有毒ではないという意味において”受容可能 ”でなければならない。処方は都合よく単一剤形で示され、薬学の分野で既知の 方法により調製される。 すべての方法は活性成分と一つまたはそれ以上の補助成分から成る担体を混合 する工程を含んでいる。一般に、処方成分は均一に調製され、最後に活性成分と 液体担体または細かく粉砕した固形担体または両方と混合し、続いて必要ならば 生成物を所望の処方に剤型化する。 静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内投与に適した処方には、活性成分と好適に は受容者の血液と等張にした溶液の無菌水溶液が含まれる。そのような処方は塩 化ナトリウム（例えば、０．１−２．０Ｍ）、グリシンなどのような生理学的に 一致する物質を含む水に固形活性成分を溶解させ、生理的条件と一致する緩衝化 ｐＨを持たせて水性溶液を作り、該溶液を無菌化することにより都合よく調製で きる。これらは単一または多用量容器（例えば、封じたアンプルまたはバイアル ）中に存在するであろう。 本発明の処方は安定化剤を含んでもよい。安定化剤の例はポリエチレングリコ ール、蛋白質、サッカライド、アミノ酸、無機酸および有機酸であり、それらは 単独でまたは混合物として使用されるであろう。これらの安定化剤は好適には各 々の成分または組成物の重量当たり重量で０．１１−１０，０００の割で混合さ れる。二つまたはそれ以上の安定化剤が使用されるなら、その総計量は好適には 前に特定した範囲に入っている。これらの安定剤は水溶液においては適した濃度 およびｐＨで使用される。そのような水溶液の浸透圧は一般に０．１−３．０ o smole の範囲、好適には０．８−１．２ osmole の範囲である。水溶液のｐＨは ５．０−９．０の範囲内、好適には６−８の範囲内に調整される。各々の成分を 別々にまたは本発明の組成物として処方する場合、抗吸着剤を使用してもよい。 別の薬学的手段が作用の持続を制御するために用いられる。徐放製剤は蛋白質 またはその誘導体を複合化または吸着させるためのポリマーの使用により達成さ れる。制御された送達は、適した高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸 、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カ ルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミン）および高分子の濃度、並びに 放 出を制御するための取り込みの方法を選択することにより行われる。徐放性製剤 により作用の持続を制御する別の可能な方法は、９−シス−レチノール酸（９− ｃｉｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）またはその誘導体を単独でまたは抗新生 物剤と組み合わせて、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸） またはエチレンビニルアセテート共重合体のようなポリマー性物質の粒子内へ取 り込ませることである。もしくは、これらの薬剤をポリマー性粒子に取り込ませ る代わりに、例えば、コアセルベーション技術または界面重合化により製造され たマイクロカプセル（例えば、各々ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン −マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に 、またはコロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェ ア、ミクロ乳剤、ナノ粒子およびナノカプセルまたはマクロ乳剤）にこれらの薬 剤を捕捉することが可能である。 経口製剤が望まれる場合成分はラクトース、スクロース、デンプン、タルクス テアリン酸マグネシウム、結晶性セルロース、メチルセルロース、カルボキシメ チルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウムまたはアラビアゴムのよう な典型的担体と混ぜ合わせる。 本発明の組成物または個々の成分の投与は予防的および治療的目的の両方であ ろう。ここで使用された方法および組成物は単独で予防的および治療的使用に、 または癌の防止または処置において当業者には既知である別の治療と連携して使 用される。もしくは、ここに開示した本方法および組成物は補助療法として使用 してもよい。獣医学での使用も本発明に包含されることが意図されている。 本明細書で参照したすべての本、論文または特許は本明細書において援用され る。以下の実施例は本発明の種々の態様を例示しているが、範囲を制限すること を意図しているものではない。 実施例１ 黒色腫特異性クローナルおよびオリゴクローナル ＴＩＬ株によるＴ細胞レセプター使用 方法および材料 ＴＩＬ株およびクローンの発生 ＴＩＬは以前に記載されているように（Ｒ ｏｓｅｎｂｅｒｇＳ．Ａ．ら、（１９８８）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９ ，１６７６−１６８０；Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ら、（１９８７）Ｊｏｕｒ ｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ．１０２，１２７−１４１）Ｎ ＣＩのＳｕｒｇｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈで処置された転移性黒色腫を持つ患者の腫 瘍生検試料から発生させた。簡単に記すと、手術試料からの組織を単一の細胞懸 濁液に解離させ、１０％ヒトＡＢ血清（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋ ｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を補給したＲＰＭＩ−１６４０（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）または１０μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（Ｂ ｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ），５０Ｕ／ｍｌ のペニシリン、１４６μｇ／ｍｌのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）および６０００国際単位（Ｉ Ｕ）／ｍｌの組換え体ヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）（Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆ．から提供された）を補給し たＡＩＭ Ｖ無血清培地（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）からなる完全培地（ＣＭ）で培養した。増殖中の培養液 には新鮮なＣＭを２−３日毎に補給し、細胞密度は５ｘ１０⁵細胞／ｍｌ以下に 維持した。ＴＩＬ１２００は患者１２００（ＨＬＡ−Ａ１，Ａ２；Ｂ８，Ｂ４４ ）の処置に使用された４５日を経たバルクＴＩＬ培養物であった。ＴＩＬ Ｃ１ ０−１およびＴＩＬ Ｆ２−２は患者１２００からの腫瘍消化物の１０００ Ｔ 細胞／ウェル微量培養から単離された。ＴＩＬ５は患者５０１（ＨＬＡ−Ａ２， Ａ２４；Ｂ１８，Ｂ３５）からの腫瘍消化物の４０００リンパ球／ウェル微量培 養から単離された。ＴＩＬ Ｆ１１−２１は患者１１０２（ＨＬＡ−Ａ２，Ａ２ ４；Ｂ５５，Ｂ６２）から得られたバルクＴＩＬの１細胞／ウェル微量培養から 単離された。ＴＩＬ Ａ１０は患者５３７（ＨＬＡ−Ａ１，Ａ２６；Ｂ４４，Ｂ ７０）から得られたバルクＴＩＬの０．３細胞／ウェル微量培養から単離された 。各々のＴＩＬの腫瘍特異性およびＭＨＣ制限は、標準的な４時間の⁵¹Ｃｒ放出 アッセイ（Ｈｏｍ，Ｓ．Ｓ．ら、（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３６，１−８）によって、一団のＨＬＡ一致および不一 致黒 色腫株、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株、（Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ，ＮＩＨ） Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ）およびＸ５２６（ＡＴＣＣ）の溶解物について試験され た。 ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成 総細胞ＲＮＡはグアニジン イソチオシア ネート／酸−フェノール法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．＆ Ｓａｃｃｈｉ， Ｎ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９）を用い て１−５ｘ１０⁶ＴＩＬから単離された。ＰＣＲのために、第一鎖ｃＤＮＡが以 前に記載されているように（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．，＆ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ ．（１９８３）Ｇｅｎｅ．２５，２６３−２６９）、オリゴ−ｄＴ₂₂およびモロ ニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒ ａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて１−５μｇの全ＲＮＡから合成された 。 ｃＤＮＡライブラリーの発生およびスクリーニング ｃＤＮＡライブラリー をＴＩＬ５およびＴＩＬ Ａ１０のＴＣＲ分析のために発生させた。第一および 第二鎖ｃＤＮＡは以前に記載されているように（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．，＆ Ｈｏ ｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．（１９８３）Ｇｅｎｅ．２５，２６３−２６９）２μｇの ポリＡ⁺ＲＮＡから合成された。二本鎖ｃＤＮＡはλｇｔ１０のＥｃｏ−ＲＩ部 位内へクローン化され、インビトロでパッケージングされ、播種された（Ｐａｃ ｋａｇｅｎｅ Ｌａｍｂｄａ ＤＮＡ パッケージングシステム，Ｐｒｏｍｅｇ ａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。組換え体λファージは³²Ｐ標識ＴＣＲ Ｃαまた はＣβ領域プローブ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．ら、（１９９４）Ｊｏｕｒｎａ ｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｖｌ６：８５−９４）でのプラークハ イブリダイゼーションによりスクリーニングした。ＴＣＲ ｃＤＮＡを含むλク ローンは３回プラーク精製され、クローニング部位に隣接するλｇｔ１０プライ マー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて完全長クロー ンが同定された。 ＰＣＲプライマー Ｖ遺伝子サブファミリー特異的ＰＣＲプライマー配列は すべてが知られているＴＣＲ ＶαおよびＶβ遺伝子配列の配置に基づいて設計 された。ＡＢＩ ３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ）を用いてすべてのオリゴヌクレオチドが合成された。アンカーＰ ＣＲに使用されたＣα、ＣβプライマーおよびＶαおよびＶβ配列およびＰＣＲ 分析のための特異性制御は記載されている（Ｆｅｒｒａｄｉｎｉ，Ｌ．ら、（１ ９９１）Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１，９２７−９３３；Ｆｅｒｒａｄｉ ｎｉ，Ｌ．ら、（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１，９３５−９４ ２；およびＮｉｓｈｉｍｕｒａら、１９９４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕ ｎｏｔｈｅｒａｐｙ １６：８５−９４）。 ＰＣＲ条件 Ｔ細胞レセプターＤＮＡ断片が、記載されているようなポリメ ラーゼ連鎖反応（Ｃｈｏｉ，Ｙ．ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ ．８６，８９４１−８９４５）を用いて、ただし以下のような修正を 加えてｃＤＮＡから増幅された。簡単に記すと、各々のＴＩＬから合成された第 一鎖ｃＤＮＡの１％が１単位のＡｍｐｌｉ−Ｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、２００μＭ ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉ ｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、１μＭ ＶαまたはＶβサブファミリー特異的プラ イマー、および１μＭの対応するＣαまたはＣβ不変部領域プライマーを含む５ ０μｌの反応液で増幅にかけられた。増幅はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６０ ０ ＤＮＡサーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃ Ｔ）中、以下のサイクルプロフィールを用いて実施された：９２℃での変性１分 、６０℃でのアニーリング１分、および７２℃での伸長２分を３０サイクル。Ｐ ＣＲ生成物は２％アガロースゲルにて分子量標準とともに分離された。エチジウ ムブロミド染色ゲル上での適切な大きさのバンドの可視化はＴ細胞レセプター（ ＴＣＲ）サブファミリーの存在を示した。 アンカーＰＣＲ ＴＣＲ遺伝子の増幅およびクローニングは記載されている ような（Ｌｏｈ，Ｅ．Ｙ．ら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４３，２１７− ２２０）アンカーＰＣＲにより、ただし、わずかに修正して実施した。簡単に記 すと、第一鎖ｃＤＮＡはＲＮａｓｅ Ｈで処理され、ＧｌａｓｓＭａｘカラム（ Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で精製した。精製ｃＤ ＮＡの１０分の１は末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（Ｇｉｂｃｏ −ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いてｄＣを末端につないだ。 増幅反応は、２５ｎｇの尾をつけたｃＤＮＡ、４ピコモルのアンカープライマー （Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、２ピコモルのＴＣ Ｒ Ｃα（Ｆｅｒｒａｄｉｎｉ，Ｌ．ら、（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ ．２１，９２７−９３３）かまたはＣβ（Ｆｅｒｒａｄｉｎｉ，Ｌ．ら、（ １９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１，９３５−９４２）特異的プライ マーおよび０．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ ｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いて５０μｌの最終反応容量で実 施された。増幅は９２℃で６０秒、５４℃で６０秒および７２℃で１２０秒続い て１５分の７２℃での伸長期間を３５サイクル実施した。 クローニングおよびシークエンシング ＰＣＲ生成物は低融点アガロースゲ ル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で分離され、ＤＮ Ａ断片はＰＣＲ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ）を用いて精製され、Ｔ／Ａベクター、ＰＣＲ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内へクローン化された。クローン化アンカーＰＣＲ 生成物はＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ．７４，５４６３−５４６７）に記載されているようにＴ７ Ｄ ＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０，ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ，Ｏｈｉｏ）によるジデオキシヌクレオチド連鎖終止法を用いてシークエンシン グした。得られた配列はＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉ ｎｃ．ソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒａｕｘ，Ｊ．ら、（１９８４）Ｎｕ ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．１２，３８７）を用いて分析された。 ＴＩＬ株の反応性および特異性 ６つのＣＤ８⁺ＴＩＬ株を転移性黒色腫を 持つ４人の患者から発生させた。腫瘍特異性は一団の黒色腫細胞株（表１）のイ ンビトロ溶解でアッセイすることにより決定された。ＴＩＬ−１２００、ＴＩＬ −５およびＴＩＬ−Ｆ２−２はＨＬＡ−Ａ２⁺患者から誘導され、ＨＬＡ−Ａ２⁺ を溶解したが、ＨＬＡ−Ａ２^-黒色腫は溶解しなかった。ＴＩＬ−Ｃ１０−１お よびＴＩＬ−Ｆ１１−２１は各々ＨＬＡ−Ａ１⁺およびＨＬＡ−Ｂ５５⁺黒色腫標 的のみを溶解した。ＴＩＬ−Ａ１０は自家腫瘍を溶解したが、ＨＬＡ−Ａ１⁺標 的は溶解しなかった。同種ＨＬＡ−Ａ２６⁺、ＨＬＡ−Ｂ４４⁺およびＨＬＡ−Ｂ ７０⁺標的に対しては試験しなかったので、ＴＩＬ−Ａ１０の制限は規定できな かった。ＤａｕｄｉおよびＫ５６２の溶解の欠如により示されるように、リンホ カイン活性化キラー（ＬＡＫ）またはナチュラルキラー（ＮＫ）活性による非特 異的溶解はＴＩＬのどれも示さなかった。 ＴＩＬ株によるＶ遺伝子使用の分析 ＴＣＲレパートリーがＶ遺伝子サブフ ァミリー特異的プライマーによるＰＣＲ、およびクローン化アンカーＰＣＲ生成 物（ＴＩＬ−Ｆ１１−２１、ＴＩＬ−Ｆ２−２、ＴＩＬ−Ｃ１Ｏ−１、ＴＩＬ− １２００）の配列分析またはｃＤＮＡライブラリー（ＴＩＬ−Ａ１０、ＴＩＬ− ５）からのクローンの配列分析により試験された。６つのＴＩＬによるＴＣＲ Ｖ遺伝子使用は表２に示されている。ＴＩＬ−Ａ１０（Ｖα２．２，Ｖβ４）、 ＴＩＬ−５（Ｖα１．１，Ｖβ７．３）、ＴＩＬ−Ｆ１１−２１（Ｖα１５，Ｖ β１５）およびＴＩＬ−Ｆ２−２（Ｖα１７，Ｖβ６．５）の各々は単一のＶα および単一のＶβを発現し、クローン性を示している。ＴＩＬ−１２００はＶ遺 伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲで分析した場合、２つのＶα（Ｖα２，Ｖ α９）および６つのＶβ（Ｖβ４，Ｖβ５，Ｖβ６，Ｖβ１３，Ｖβ１４，Ｖβ ２２）鎖を発現した。しかしながら、２５の連続したＴＣＲαアンカーＰＣＲク ローンおよび１３の連続したＴＣＲβアンカーＰＣＲクローンの分析ではＶα９ およびＶβ２２．１のみが同定された。同様の分析でＴＣＲアンカーＰＣＲ生成 物の頻度はＴ細胞集団中の各々のクロノタイプの頻度に比例していることが示さ れている（Ｆｅｒｒａｄｉｎｉ，Ｌ．ら、（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２，４６４９−４６５４）。従って、ＴＩＬ−１２００はＶα９およびＶβ２ ２．１を発現する単一のＴ細胞クローンから主として構成されている。ＴＩＬ Ｃ１０−１からのアンカーＰＣＲクローンの配列分析は、１５すべてのＴＣＲβ クローン化アンカーＰＣＲ生成物はＶβ１３．６であったことを示した。しかし ながら、２０の連続的ＴＣＲαアンカーＰＣＲクローンの配列分析は２つのＶα 遺伝子、Ｖα８．２（２０のクローン化アンカーＰＣＲ生成物の内の１１）およ びＶα１４．１（２０のクローン化アンカーＰＣＲ生成物の内の９）を明らかに した。 ＴＩＬによるＤ、ＪおよびＮ多様性セグメント使用の分析 Ｖ−ＪおよびＶ −Ｄ−Ｊ結合部配列は各々のＴ細胞クロノタイプに独特であり、ＴＣＲ多様性に 寄与している。しばしばＴＣＲ再配列により非機能性遺伝子産物を生じる。どの ＴＣＲα遺伝子が機能性遺伝子産物に寄与するかを決定するため、およびそのク ローン性を定義するためにＴＩＬ Ｃ１０−１からのクローン化ＴＣＲ遺伝子の Ｖ−ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊ領域が配列決定された（図１Ａ）。１５すべてのＴＩＬ −Ｃ１０−１ ＴＣＲβクローン化生成物はＶβ１３．６／Ｄβ１．１／Ｊβ１ ．５から成っていた。ＴＩＬ Ｃ１０−１で観察される両方のＴＣＲα鎖は生産 的に再配列されており、Ｖα８．２／Ｊα４９（１１／２０）およびＶα１４． １／Ｊα３２（９／２０）を使用した。しかしながら、これらのＴＣＲ ｃＤＮ Ａのアミノ酸翻訳はＶα８．２／Ｊα４９のみが機能性ＴＣＲα鎖を産生できる ことを示している。Ｖα１４．１／Ｊα３２ ｃＤＮＡは完全長ＴＣＲα蛋白質 を産生できるが、Ｊ領域はＪα３２で報告されている正しい配列および高度に保 存されているＦＧＸＧモチーフを欠いている（Ｋｏｏｐ，Ｂ．Ｆ．ら、（１９９ ３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．８４，４７８−４９３）。このモチーフはヒトおよびマ ウスＪαセグメント間で高度に保存されている（Ｋｏｏｐ，Ｂ．Ｆ．ら、（１９ ９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．８４，４７８−４９３）。ＦＸＧＸモチーフは前に記 載したＪα３２含有機能性ＴＣＲおよびＴＩＬ Ｃ１０−１により発現される他 のＴＣＲα遺伝子（Ｖα８．２／Ｊα４９）でも観察されており、それが構造的 完全さに必須であることを示唆している（Ｋｌｅｉｎ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８７ ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４，６８８４−６８８８ ）。従って、ＴＩＬのＶα８．２／Ｊα４９／ＣαＴＣＲ転写体は非機能的ＴＣ Ｒα鎖をコードしているようであり、Ｖα８．２／Ｊα４９／Ｃαが腫瘍認識に 関与している。 ＴＣＲのＶ−Ｄ−ＪおよびＶ−Ｊ結合部によりコードされているＣＤＲ３領域 は抗原認識に含まれていると信じられているため、３つのＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩ Ｌ（ＴＩＬ−Ｆ２−２、ＴＩＬ−１２００およびＴＩＬ−５）からの結合部が比 較された（図１Ｂ）。ＴＩＬ−Ｆ２−２、ＴＩＬ−１２００およびＴＩＬ−５に より利用されているＴＣＲ ＶαおよびＪβ遺伝子は各々Ｖα１７／Ｊα４２、 Ｖα９／Ｊα１６およびＶα１．１／Ｊα４９であった。ＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩ Ｌにより利用されているＴＣＲ Ｖβ、ＤβおよびＪβ遺伝子は：Ｖβ６．５／ Ｄβ１．１／Ｊβ１．５（ＴＩＬ−Ｆ２−２）、Ｖβ２２．１／Ｄβ２．１／Ｊ β２．１（ＴＩＬ−１２００）およびＶβ７．３／Ｄβ２．１／Ｊβ２．１（Ｔ ＩＬ−５）であった。制限Ｖ遺伝子使用またはＮ多様性領域での配列相同性は３ つのＨＬＡ−Ａ２制限ＴＩＬからのＴＣＲで検出されなかった。 ほとんどの従来の研究において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子使用は腫瘍生検試料から、 またはＩＬ−２拡大バルクＴＩＬ培養物から単離されたＴ細胞で決定されている （Ｓｏｌｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０，８ ００−８１１；Ｎｉｔｔａ，Ｔ．ら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４９，６ ７２−６７４；Ｋａｒｐａｔｉ，Ｒ．Ｍ．ら、（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１４６，２０４３−２０５１；Ｆｅｒｒａｄｉｎｉ，Ｌ．（１９９２）Ｃａｎ ｃｅｒ Ｒｅｓ ．５２，４６４９−４６５４）。ＴＣＲ Ｖ遺伝子サブファミリ ーの頻度の増加が観察されたが、これらのレセプターを運ぶＴ細胞の抗腫瘍活性 は知られていない。さらに、ＰＣＲ、サザンブロッティングまたは免疫蛍光法単 独による分析は生産的および非生産的転位ＴＣＲ間を区別できない。従って、こ の型の分析ではどのＴＣＲα／β対が黒色腫抗原認識を媒介するかを決定するこ とは不可能である。ここに報告されているＴＩＬ株は事実上クローナルでありお よび特異的にヒト黒色腫細胞を認識し、これらのクローンで同定されたＴＣＲク ロノタイプはインビトロで黒色腫標的の溶解に関与していることを示している。 黒色腫ＴＩＬでの制限されたＴＣＲ Ｖ遺伝子使用を記載している他の研究（ Ｓｏｌｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０，８０ ０−８１１；Ｎｉｔｔａ，Ｔ．ら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４９，６７ ２−６７４；Ｓｅｎｓｉ，Ｍ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８， １２３１−１２４６）と対照的に、本研究およびその他（Ｋａｒｐａｔｉ，Ｒ． Ｍ．ら、（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６，２０４３−２０５１；Ｆｅ ｒｒａｄｉｎｉ，Ｌ．ら、（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２，４６４９ −４６５４）で示された証拠は多ＴＣＲ Ｖ遺伝子セグメントは黒色腫腫瘍随伴 抗原（ＴＡＡ）を認識できることを示している。ここで試験されたＨＬＡ−Ａ２ 制限黒色腫特異性ＣＴＬクローン中、３つの異なったクロノタイプが同定された （Ｖα１．１／Ｖβ７．３、Ｖα９／Ｖβ２２．１およびＶα１７／Ｖβ６．５ ）。これらのＨＬＡ−Ａ２制限クロノタイプからの結合部ＴＣＲ遺伝子配列の配 置およびポリペプチド配列は相補性決定領域またはＮ領域、ＣＤＲ３内に配列相 同性または共通構造モチーフが存在しないことを明らかにした。５つのＣＴＬク ローンおよび前に記載された４つの他のクローンに対する１つのオリゴクローナ ル株からのＴＣＲクロノタイプの比較から、共通のＴＣＲ Ｖ遺伝子使用および ＣＤＲ３領域内の相同性は見いだせなかった（Ｓｅｎｓｉ，Ｍ．ら、（１９９３ ）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８，１２３１−１２４６）。従って、黒色腫特異性 ＣＴＬクローンにおける制限ＴＣＲ Ｖ遺伝子使用の証拠を見つけることはでき なかった。 本研究で分析された３つのＴＩＬ（ＴＩＬ−Ｆ２−２，ＴＩＬ−Ｃ１０−１， ＴＩＬ−１２００）は一人の患者から単離された。ＴＩＬ−Ｆ２−２およびＴＩ Ｌ−１２００はＨＬＡ−Ａ２制限であり、一方ＴＩＬ−Ｃ１０−１はＨＬＡ−Ａ １制限であった。少なくとも２つの異なった腫瘍エピトープはこの患者の腫瘍ベ ッド内のリンパ球により認識され、１つはＨＬＡ−Ａ１に関連して提示され、他 はＨＬＡ−Ａ２に関連して提示された。この結果は、一人の患者からの２つのＣ ＴＬクローンが異なったＴ細胞エピトープで認識されたという発見（Ｓｅｎｓｉ ，Ｍ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８，１２３１−１２４６）と 一致している。さらに、多ＣＴＬクロノタイプは、同一の制限要素に関連して提 示される一つまたはそれ以上の腫瘍随伴エピトープを認識する一人に患者から誘 導されるのであろう。 患者１２００の分析は免疫療法に基づく癌治療の開発に関する情報を提供した 。第一に、同一の腫瘍生検試料からの２つの独立したＴＩＬの発展により異なっ たクロノタイプ（ＴＩＬ１２００におけるＶα９／Ｖβ２２．１Ｔ細胞およびＴ ＩＬ Ｃ１０−１およびＴＩＬ Ｆ２−２におけるＶα１７／Ｖβ６．５Ｔ細胞 ）が得られたので、個々のＴ細胞クロノタイプの発展は培養条件に依存している 。この結果は、培養条件が治療的に適切な細胞の発展に影響するであろうことを 示唆している。第二に、患者１２００はＴＩＬ１２００での処置後に部分的腫瘍 退化を示した。従って、クローナルまたは高度のオリゴクローナル抗腫瘍ＣＴＬ 集 団は進行した癌を持つ患者を首尾よく処置することが可能である。第三に、Ｓｕ ｒｇｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ，ＮＣＩで確立されたすべてのＨＬＡ−Ａ２黒色腫が このＴＩＬにより溶解されるので、ＴＩＬ１２００により認識される抗原はほと んどの黒色腫で発現されている。 黒色腫特異性反応性は標準４時間⁵¹Ｃｒ放出アッセイにより決定された。ボー ルド体で示されたパーセント溶解はバックグラウンド溶解から著しく異なってい た。黒色腫株は記載されているように（Ｎｉｔｔａ，Ｔ．ら、（１９９０）Ｓｃ ｉｅｎｃｅ ２４９：６７２−６７４）誘導されＨＬＡ型分類された。各々のＴ ＩＬに対する特異的溶解は少なくとも２回実施され、代表的実験は示されている 。 ＮＤ＝行われていない。 実施例２ ＭＡＲＴ−１特異性Ｔ細胞レセプターの同定 材料および方法 ＴＩＬ株およびクローンの発生 ＴＩＬは以前に記載されているように［Ｒ ｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ，ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１９：１６７６ −１６８０．１９８８］２人の患者の腫瘍生検試料から発生させた。クローンＡ ４２は１：８００の増殖頻度、１００細胞／ウェルでの限界希釈により確立され 、クローン１Ｅ２は１細胞／ウェルで１：４３の増殖頻度の限界希釈により確立 された。クローンはインターロイキン−２（ＩＬ−２）（１２０国際単位（ＩＵ ）／ｍｌ）を含む丸底マイクロタイタープレート中で支持細胞存在下（５０００ ラドを照射した１ｘ１０⁵自家末梢血リンパ球（ＰＢＬ）／ウェル）１ｘ１０⁴の 自 家照射腫瘍細胞／ウェルで１週間毎に刺激して培養した。 細胞株 黒色腫細胞株Ｃ３２、Ｍａｌｍｅ３Ｍ、乳癌腫細胞株ＭＤＡ２３１ （ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、エーウィング肉腫細胞株ＲＤ−ＥＳ （Ｍ．Ｔｓｏｋｏｓ，ＮＩＨ）、ＣＯＳ−７細胞（Ｗ．Ｌｅｏｎａｒｄ，ＮＩＨ ）黒色腫細胞株３９７ｍｅｌ、５０１ｍｅｌ、５２６ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ、６ ７７ｍｅｌ、７０５ｍｅｌ、８８８ｍｅｌ（Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬら、Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ ．，１４２：３７１４−３７２４．１９８９に記載されているよう にＳＢ／ＮＣＩ研究室で確立された）およびＴ２細胞［Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙら 、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７−３５２．１９９４］は１０％ＦＣＳ を含むＲＰＭＩで維持された。 ペプチド合成 ペプチドは多ペプチド合成機（モデルＡＭＳ ４２２，Ｇｉ ｌｓｏｎ Ｃｏ．Ｉｎｃ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＯＨ）を用いて固相法によ り合成され、０．０５％トリフルオロ酢酸／水−アセトニトリルを用い、Ｃ−４ カラム（ＶＹＤＡＣ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）でのＨＰＬＣにより精製した。 Ｍ一系列ペプチドはＭＡＲＴ−１中の疎水性仮定トランスメンブランドメインに 位置している（Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４ ７−３５２．１９９４）。 １０−アミノ酸ペプチドＭ１０−３およびＭ１０− ４はＭ９−２配列を含んでおり、Ｍ１０−３は追加のグルタミン酸をそのＮＨ₂ 末端に持っており、Ｍ１０−４は余分のイソロイシンをそのＣＯＯＨ−末端にも っている。それらは以下のように標識される：Ｍ９−１（ＴＴＡＥＥＡＡＧＩ） 、Ｍ９−２（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）、Ｍ１０−３（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）およ びＭ１０−４（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶＩ） （ペプチドは一文字コードで示されて いる）ペプチドＧ９−２８０（ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ）は記載されているように［ Ｃｏｘ ＡＬら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：７１６−７１９．１９９４］ｇｐ１ ００から誘導される。 一時的トランスフェクション 以前に記載されているように［Ｋａｗａｋａ ｍｉ Ｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：３５１５−３５ １９．１９９４；Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ ＵＳＡ ．，９１：６４５８−６４６２．１９９４］、黒色腫抗原ＭＡＲＴ −１およびｇｐ１００をコードしているまたはＨＬＡ−Ａ２．１分子のためのｃ ＤＮＡが哺乳類発現プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内へクローン化された。ＣＯＳ−７細胞は次にＭＡＲＴ−１ かまたはｇｐ１００をコードしているベクター（ＨＬＡ−Ａ２．１ ｃＤＮＡと ともに、またはなしで）を用いＤＥＡＥデキストラン法［Ｓｅｅｄ Ｂら、Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．，８４：３３６５−３３６９．１９８７］ によりトランスフェクトされた。 ＴＩＬによる抗原認識の算定 ＴＩＬによるＨＬＡ制限黒色腫認識は標的と して黒色腫および非黒色腫細胞株を用いて実行される標準５時間⁵¹Ｃｒ放出細胞 毒性アッセイにより算定された［Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．，１６８：２１８３−２１９１．１９８８］。ＴＩＬからのＩＦＮ−γ放出を 刺激するＭＡＲＴ−１またはｇｐ１００トランスフェクトＣＯＳ−７細胞の能力 の分析は以前に記載されているようにＥＬＩＳＡを用いて評価された［Ｇａｕｇ ｌｅｒ Ｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：９２１−９３０．１９９４］。 ＴＩＬによる既知の抗原性ペプチドの認識は、１μｇ／ｍｌまたは１ｎｇ／ｍｌ の濃度でペプチドと２時間前もってインキュベートしたＴ２細胞を用いて算定さ れた。ＴＩＬからのＩＦＮ−γ放出を刺激するためペプチドパルスをかけたＴ２ 細胞の能力は酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により算定された。 ＲＮＡ単離およびアンカーＰＣＲ 全細胞ＲＮＡはグアニジン イソチオシ アネート／酸フェノール法［Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏ ｃｈｅｍ ．，１６２：１５６−１５９．１９８７］を用いて５ｘ１０⁶ＴＩＬか ら単離された。ＰＣＲのため、第一鎖ｃＤＮＡは記載されているように［Ｇｕｂ ｌｅｒ Ｕら、Ｇｅｎｅ，２５：２６３−２６９．１９８３］、１−５μｇの全 ＲＮＡから（ｄＴ）₂₂およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＧＩＢ ＣＯ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて合成された。ＴＣＲ 遺伝子の増幅およびクローニングは記載されているような［Ｌｏｈ ＤＹら、Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ，２４３：２１７−２２０．１９８９］５’アンカープライマーお よび３’ＴＣＲ Ｃα−（ＣＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣ）（配列ＩＤ 番号：３４）［Ｆｅｒｒａｄｉｎｉ Ｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２ １：９２７−９３３．１９９１］かまたはＣβ−（ＧＧＣＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣ ＣＣＴＴＧ）（配列ＩＤ番号：３５）［Ｆｅｒｒａｄｉｎｉ Ｌら、Ｅｕｒ．Ｊ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．，２１：９３５−９４２．１９９１］特異的プライマーを用 いるアンカーＰＣＲにより実施された。増幅は９２℃で６０秒、５４℃で６０秒 および７２℃で１２０秒続いて７２℃での１５分の伸長期間を３５サイクル行な うことにより実施された。 クローニングおよびシークエンシング ＰＣＲ生成物は低融点アガロースゲ ル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で分離され；ＤＮ Ａ断片はＰＣＲ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ）を用いて精製され、Ｔ／Ａベクター、ＰＣＲ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内へクローン化された。クローン化アンカーＰＣＲ 生成物はＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ．７４，５４６３−５４６７）に記載されているようにＴ７ Ｄ ＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０，ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ，Ｏｈｉｏ）によるジデオキシヌクレオチド連鎖終止法を用いてシークエンシン グした。得られた配列はＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉ ｎｃ．ソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒａｕｘ，Ｊ．ら、（１９８４）Ｎｕ ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．１２，３８７）を用いて分析された。 クローナルＴＩＬ株の反応性および特異性 モノクローナルＣＤ８⁺ＴＩＬ 株は転移性黒色腫を持つ２人のＨＬＡ−Ａ２⁺患者から発生させ、複数のアッセ イにおいて広範囲に試験された（表３が代表的である）。クローンＡ４２（表３ ）および１Ｅ２（表３）は種々のＨＬＡ−Ａ２⁺黒色腫細胞株を溶解させるが、 ＨＬＡ−Ａ２^-は溶解しない。乳癌細胞株ＭＤＡ２３１およびエーウィング肉腫 細胞株ＲＤ−ＥＳを含む非黒色腫ＨＬＡ−Ａ２⁺細胞株は両方のクローンに実施 された別々の細胞毒性アッセイにおいて溶解されなかった。しかしながら、これ らのクローンはＨＬＡ−Ａ２制限様式で同種黒色腫細胞株を認識しているようで あり、両方とも同一の認識プロフィールを示した。 ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子と一緒にＭＡＲＴ−１かまたはｇｐ１００のｃＤＮＡ を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３のＣＯＳ−７細胞内への一時的トランスフェク ションが、両方の黒色腫ＴＡＡがＴ細胞クローンにより認識されているかどうか を評価するために実施された。次に、ＣＯＳ−７細胞に対するＴＩＬの反応性が ＩＦＮ−γ放出を測定することにより評価された。両方のクローンがＭＡＲＴ− １⁺／ＨＬＡ−Ａ２⁺ＣＯＳ−７細胞に対して特異的反応性を示した（表４）。ｇ ｐ１００（ＴＩＬ１２００）、またはＭＡＲＴ−１（ＴＩＬ５０１）、または両 方（ＴＩＬ１１４３）を認識することが知られている非クローン化ＴＩＬ培養物 が陽性対照として使用された［Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．，９１：３５１５−３５１９．１９９４；Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７−３５２．１９９４］。両方の クローンが黒色腫細胞株により発現されるＭＡＲＴ−１抗原を認識するようであ る。 ２つのクローンがＭＡＲＴ−１抗原中の同一のまたは異なったエピトープを認 識しているかどうかを試験するため、Ａ４２および１Ｅ２が異なったＭＡＲＴ− １（Ｍ９−１，Ｍ９−２，Ｍ１０−３，Ｍ１０−４）またはｇｐ１００（Ｇ９− ２８０）ペプチドと前もってインキュベートされたＴ２細胞で刺激された。表５ に示したように、両方のクローンともＭ９−２およびＭ１０−３でパルス処理し たＴ２細胞に応答して特異的にＩＦＮ−γを放出した（ＭＡＲＴ−１反応性を持 っていることが知られている非クローン化ＴＩＬ株１２３５および６６０と同様 のパターンで）。放出されたＩＦＮ−γの量は両方のクローンともＭ９−２に応 答して最大であり、バルクＴＩＬ応答よりも多かった。この応答はＴ２細胞への ペプチドパルスを千倍に希釈した後でも両方のペプチドで示すことができた。 クローンＡ４２および１Ｅ２によるＴＣＲαおよびβ遺伝子使用の分析 Ｔ ＣＲαおよびβ遺伝子のどちらが機能性遺伝子産物に寄与しているかを決定する ため、およびＴ細胞のクローン性を確認するため、Ａ４２および１Ｅ２からのク ローン化遺伝子のＶ−ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊ領域が配列決定された。生産的に再配 列されたＡ４２ＴＣＲβｃＤＮＡクローンの５つすべてがＶβ７．３／Ｄβ２． １／Ｊβ２．７／Ｃβ２を含んでおり、ＴＣＲα鎖のすべてが（４のうち４）Ｖ α２１／Ｊα４２／Ｃαであった。１２ １Ｅ２ ＴＣＲβ鎖クローン産物はＶ β３．１／Ｄβ１．１／Ｊβ１．１／Ｃβ１であり、ＴＣＲα鎖はＶα２５／Ｊ α５４／Ｃα（９のうち９）であった（図２）。これらのＴＣＲ ｃＤＮＡのす べてのアミノ酸翻訳は、転写体が機能性産物を産生することができることを示し た。従って、これらの２つのＴ細胞株により利用されるＴＣＲはクローン性（異 なったＶαおよびＶβ遺伝子使用）およびＮ多様性領域での相同性がないことを 示している。 従来のＴＣＲ利用研究は腫瘍特異的抗原の配置と反応するＴ細胞において制限 ＴＣＲ Ｖ遺伝子使用が優性的であるかどうかを明瞭に示すことができなかった 。いくつかのＴＣＲ Ｖ遺伝子サブファミリーの頻度の増加は観察されているが 、抗腫瘍反応性のもととなる特異的ＴＣＲは未知である。黒色腫における制限Ｔ ＣＲ Ｖ遺伝子使用を認めた腫瘍反応性Ｔ細胞クローンの報告［Ｓｅｎｓｉ Ｍ ら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７３：１２３１−１２４８．１９９３；Ｓｅｎｓｉ Ｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１２：２０７−２１１．１９９２］とは 反対に、この研究は多ＴＣＲ Ｖ遺伝子セグメントは黒色腫腫瘍随伴抗原を認識 できるという最近の研究［Ｓｈｉｌｙａｎｓｋｙ Ｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．，９１：２８２９−２８３３．１９９４；Ｓｅｎｓｉ Ｍら 、Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ．，１９４：２６１−２７１．１９９１］を支持し ている。ここに示されたクローンＡ４２および１Ｅ２によるＴＣＲ Ｖ遺伝子の 分析は、それらが同一のＭＡＲＴ−１エピトープを認識するにも関わらず、それ らの変異および結合部領域が異なっていることを示している。従って、多ＴＣＲ Ｖ遺伝子セグメントが黒色腫抗原を認識できるだけでなく、一つ以上のＴＣＲ Ｖ遺伝子が同一の特異的抗原性ペプチドを認識できる。 Ａ４２と同じ患者からの別のＨＬＡ−Ａ２制限黒色腫特異的Ｔ細胞クローン、 クローン５（Ｓｈｉｌｙａｎｓｋｙ Ｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ． ，９１：２８２９−２８３３．１９９４）はＡ４２と同一のＶβサブファ ミリーを利用し、独特の結合部領域を持っている。Ｊｕｒｋａｔ細胞がクローン ５ＴＣＲをコードしているベクターでトランスフェクトされ、そのデータはクロ ーン５およびＡ４２はＭＡＲＴ−１の同一のエピトープを認識することを示して いる（実施例３）。 さし当たりここで示されているのは既知の黒色腫随伴抗原の特異的エピトープ を認識できるＴＣＲ配列である。黒色腫特異的クローナルＴ細胞株によるＴＣＲ 使用は前に研究されているが、Ｔ細胞により認識されている実際の腫瘍抗原また は抗原性エピトープは未知である（Ｋａｒｐａｔｉ ＲＭら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ． ，１４６（６）：２０４３−２０５１．１９９１；Ｎｉｔｔａ Ｔら、Ｓｃ ｉｅｎｃｅ ，２４９：６７２−６７４．１９９０；Ｆｅｒｒａｄｉｎｉ ＲＭら 、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：４６４９−４６５４．１９９２）。結論とし て、本研究はＭＡＲＴ−１抗原の特異的エピトープを認識できるＴＣＲ配列の最 初の報告である。２つのＴ細胞クローンは異なったＶ−ＪおよびＶ−Ｄ−Ｊ領域 を利用し、それ故免疫系は特異的腫瘍抗原性エピトープを認識できる一つ以上の Ｔ細胞−レセプター（ＴＣＲ）を提供できるという直接的な証拠を提出している 。 ＭＡＲＴ−１またはｇｐ１００のためのｃＤＮＡ（ＨＬＡ−Ａ２．１あり、ま たはなしで）で一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞に対するＴＩＬ の反応性はＩＦＮ−γの特異的放出で評価された。ＴＩＬ単独でのバックグラウ ンドは差し引かれている。ｇｐ１００（ＴＩＬ１２００）、ＭＡＲＴ−１（ＴＩ Ｌ５０１）または両方（ＴＩＬ１１４３）を認識することが知られている非クロ ーン化ＴＩＬ細胞株が陽性対照として使用された。 ＴＩＬからのＩＦＮ−γ放出を媒介する腫瘍またはペプチド−パルスＴ２細胞 の能力は酵素連結免疫吸着アッセイにより算定された。陽性対照、ＨＬＡ−Ａ２ 制限ＴＩＬ１２３５および６６０は各々ＭＡＲＴ−１またはＭＡＲＴ−１および ｇｐ１００を認識した。アッセイに先だって、Ｔ２細胞はＭＡＲＴ−１（Ｍ９− １，９−２，１０−３，１０−４）またはｇｐ１００（Ｇ９−２８０）ペプチド と２時間インキュベートされ、６４２ｍｅｌおよび３９７ｍｅｌは各々ＨＬＡ− Ａ２陽性および陰性腫瘍株である。 実施例３ ＭＡＲＴ−１黒色腫抗原を認識するクローン化Ｔ細胞 レセプターヘテロダイマーの機能的特異性の特性付け 材料および方法 細胞株 黒色腫細胞株３９７ｍｅｌ、５０１ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ、８８８ ｍｅｌ（記載されているように［Ｔｏｐａｌｉａｎ Ｓ．Ｌ．ら、１９８９．Ｊ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．，１４２：３７１４］Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ，ＮＣ Ｉで確立された）およびＴ２細胞［Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ．ら、１９９４．Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．，１８０：３４７］は１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩで維持され た。６２４ｍｅｌは限界希釈でクローン化し、高度（６２４ｍｅｌ⁺）およびＭ ＨＣクラスＩ抗原陰性（６２４ｍｅｌ^-）クローンに対するＨＬＡ−Ａ２特異的 ｍＡｂ ＢＢ７．２（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いたＦＡＣＳ 分析によりスクリーンした。ジョルカットＴ細胞株（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ，ＭＤ）は１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで維持された。３つのＣＤ８⁺ＴＩ Ｌ株は以前に記載されているように［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ．Ａ．１９９２．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ ．，１０：８０］転移性黒色腫を持つ患者の腫瘍生検 試料から発生させた。ＴＩＬ１２３５（ＭＡＲＴ−１）および１２００（ｇｐ１ ００）の黒色腫抗原特異性は以前に報告されている［Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ．ら 、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：３５１５；Ｋａ ｗａｋａｍｉ Ｙ．ら、１９９４．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７］。 ペプチド合成 ペプチドはマルチプルペプチド合成機（モデルＡＭＳ４２２ ，Ｇｉｌｓｏｎ Ｃｏ．Ｉｎｃ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＯＨ）を用いる固相 法により合成し、０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水−アセトニトリル で溶出するＣ−４カラム（ＶＹＤＡＣ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）でのＨＰＬＣ により精製した。ＭＡＲＴ−１系列のペプチドはＭＡＲＴ−１中の疎水性推定ト ランスメンブランドメインに位置している［Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ．ら、１９９ ４．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７］。本研究で使用されたＭＡＲＴ− １ペプチドの配列は以下のものである：ＭＡＲＴ−１_(22-30)（ＴＴＡＥＥＡＡ ＧＩ） （配列ＩＤ番号：２７）、ＭＡＲＴ−１_(27-35)（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列 ＩＤ番号：２８）、ＭＡＲＴ−１_(32-40)（ＩＬＴＶＩＬＧＶＬ）（配列ＩＤ番 号：３０）、ＭＡＲＴ−１_(26-35)（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列ＩＤ番号： ２９）およびＭＡＲＴ−１_(27-36)（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶＩ）（配列ＩＤ番号： ３１）。１０−アミノ酸ペプチドＭＡＲＴ−１_(26-35)およびＭＡＲＴ−１_{(27-3 6)} は９−アミノ酸最少決定基を含んでおり、ＭＡＲＴ−１_(26-35)はそのＮＨ₂末 端に追加のグルタミン酸を持っており、およびＭＡＲＴ−１_(27-36)はそのＣＯ ＯＨ末端に余分のイソロイシンを持っている。ペプチドｇｐ１００_(457-465)（ ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ）（配列ＩＤ番号：３２）およびｇｐ１００_(280-288)（ ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ）（配列ＩＤ番号：３３）は記載されているように［Ｋａｗ ａｋａｍｉ Ｙ．ら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９ １：６４５８；Ｃｏｘ Ａ．Ｌ．ら、１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：７１ ６］ｇｐ１００から誘導された。 ＤＮＡ構築物 完全長ＴＣＲαおよびβ遺伝子はλファージＴＩＬクローン ５ ｃＤＮＡライブラリー［実施例１；Ｓｈｉｌｙａｎｓｋｙ Ｊ．ら、（１９ ９４）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：２８２９］からポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅された。Ｖαｌ ５’（ＣＴＣＧＡＧＧ ＴＴＣＡＧＣＣＡＴＧＣＴＣＣＴＧＧ）（配列ＩＤ番号：３６）、Ｃα ３’（ ＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＴＣＴＧ）（配列ＩＤ番号：３７）［Ｈａ１ １およびＦｉｎｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：２４１−２ ５７］、Ｖβ７．３ ５’（ＣＴＣＧＡＧＡＧＣＡＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴ Ｇ）（配列ＩＤ番号：３８）およびＣβ２ ３’（ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣ ＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＴＴＣ）（配列ＩＤ番号：３９）プライマー は記載されているように（Ｓｈｉｌｙａｎｓｋｙ Ｊ．ら、（１９９４）Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ，９１：２８２９）増幅のために使用された 。得られたＰＣＲ ＤＮＡ断片は次にＴ／ＡベクターＰＣＲ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔ ｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内へクローン化された。Ｖα１遺伝子 は次にネオマイシン耐性遺伝子およびＣＭＶ真核生物プロモーターを含むｐｃＤ ＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）内 へ連結され、Ｖβ７．３遺伝子はＳＲαプロモーターを含む修飾ｐＣＤＬ発現ベ クター［Ｅｎｇｅｌ Ｉ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１３１８］内へ連結さ れた。得られたクローンはＴＣＲ特異的クローニングプライマーを用いるＰＣＲ によりスクリーンされ、記載されているように［Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．ら、（１９ ７７）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５４６３］Ｔ７ Ｄ ＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０，ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ，Ｏｈｉｏ）を用いるジデオキシヌクレオチド連鎖終止法により配列決定した。 ＦＡＣＳ分析 ＪｕｒｋａｔＴ細胞レセプターＶβ８特異的ｍＡｂ Ｃ３０ ５．２［Ｗｅｉｓｓ Ａ．およびＪ．Ｄ．Ｓｔｏｂｏ．１９８４．Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ ．，１６０：１２８４］（Ａ Ｗｅｉｓｓ，ＨＨＭＩ，ＵＣＳＦ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの好意により）、ヤギ抗マウスＩ ｇＧ１（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、ヤギ 抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊ ｏｓｅ，ＣＡ）、抗Ｌｅｕ−４（ＣＤ３）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、Ｗ６／３２（抗ＨＬＡ Ａ，Ｂ，Ｃ）（Ｓｅｒａ −Ｌａｂ，Ｓｕｓｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ）および抗ＴＣＲ−ｌ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）が以前に記載されているよう な共モジュレーション実験［Ｇｅｉｓｌｅｒ Ｃ．ら、１９９０．Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ ．，１４５：１７６１］に使用された。簡単に記すと、１ｘ１０⁶のジョ ルカットトランスフェクト体を１００μｌのＣ３０５．２ ｍＡｂ上清液と（ま たはなしで）３７℃で１２時間インキュベートした。続いて、細胞株を３回ＦＡ ＣＳ緩衝液（５％ＦＣＳおよび０．０５％Ｎａアジドを含むＰＢＳ）で洗浄し、 自家ＴＣＲのダウンモジュレーションを確認するためＣ３０５．２で再染色した 。細胞表面上のトランスフェクトされたＴＣＲヘテロダイマーの存在を示すため 、抗ＣＤ３または抗ＴＣＲ抗体による続いての染色が実行された。ＨＬＡ−Ａ２ 特異的ｍＡｂ ＢＢ７．２（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）が記載され ているように高および低クラスＩ発現腫瘍クローンの同定に使用された。 トランスフェクション Ｊｕｒｋａｔ細胞は、２０μｇのプラスミドＤＮＡ （２μｇのｐＣＤＮＡ３ ＴＣＲαネオマイシン選択可能プラスミドおおび１８ μｇのｐＣＤＬ ＴＣＲβプラスミド）および全量で２５０μｌのＰＢＳに加え たた１ｘ１０⁷の細胞を用いてエレクトロポレーション（２５０Ｖ、８００ｍＦ ）によりトランスフェクトした。細胞は次に５ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ を含む６つのウェルプレート中、３７℃でインキュベートした。１２時間後、Ｇ ４１８（Ｇｉｂｃｏ Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を１ｍｇ／ｍｌの濃度 で加えた。４日後、生きている細胞をフィコール濃度勾配（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔ ｅｋｎｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）で単離し、Ｔ−７５フラスコ（Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．，Ｎａｐｉｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬＬ．）で培養した。ネオマイシン耐性 細胞が増殖して試験に適した数になるまで培地は１週間毎に取り替えた（３週間 で約１ｘ１０⁷細胞）。最初の選択の続いて、Ｇ４１８の濃度を４００μｇ／ｍ ｌまで低くした。Ｊｕｒｋａｔトランスフェクト体は１細胞／ウェルでの限界希 釈によりクローン化し、記載されているようにＥＬＩＳＡによりＩＬ−２産生で スクリーニングした。 抗原認識アッセイ ペプチドと２時間プリインキュベートしたＴ２細胞を２ 回ＰＢＳで洗浄し、１：１の比でエフェクター細胞に加えた（４８ウェルプレー ト中、総量で１ｘ１０⁶細胞／ｍｌ）。Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞を含むウ ェルにホルボール ミリステート アセテート（ＰＭＡ）（５ｎｇ／ｍｌ，Ｓｉ ｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を加えた。Ｊｕｒｋａｔトランスフェクト 体またはＴＩＬからのサイトカイン放出を刺激するペプチド−パルスＴ２細胞の 能力は、ＥＬＩＳＡ（ＲＤ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎ ｎ．）により算定された。Ｊｕｒｋａｔトランスフェクト体は、４８ウェルプレ ート中で、１ｍｌの培地、総計で１ｘ１０⁶細胞について１：１の比で１２時間 、ＨＬＡ−Ａ２陽性（５０１ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ⁺）またはＨＬＡ−Ａ２陰性 （３９７ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ^-、８８８ｍｅｌ）腫瘍細胞とインキュベートす ることにより黒色腫腫瘍株の認識が算定された。ＴＩＬ株１２３５および１２０ ０は同一の条件下で陽性対照として使用された。Ｊｕｒｋａｔトランスフェクト 体またはＴＩＬからのサイトカインを刺激する腫瘍の能力はＥＬＩＳＡ（ＲＤ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）により評価された。 クローン５ＴＣＲの細胞表面発現 Ｊｕｒｋａｔ細胞は内因性ＴＣＲを発現 し、およびクローン５ＴＣＲのαかまたはβ鎖（Ｖα１、Ｖβ７．３）を特異的 に染色するサブファミリー特異的抗体が現在入手不可能であるので、トランスフ ェクトされたＴＣＲの表面発現を示すためにはより複雑な方法が必要とされる。 Ｊｕｒｋａｔクローン５ＴＣＲバルクトランスフェクト体細胞株およびトランス フェクトされたＪｕｒｋａｔクローン１３および２２は、内因性ＴＣＲの発現を ダウンモジュレートするためＪｕｒｋａｔＴ細胞レセプターβ鎖特異的ｍＡｂ Ｃ３０５．２（Ｖβ８）と（またはなしで）一夜インキュベートした。得られた 培養物は次に内因性ＴＣＲの再発現を防止するために４℃にて０．０５％アジド を含むＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ｐａｎ−特異性抗ＴＣＲ−１、抗ＨＬＡ−Ａ２ または抗ＣＤ３ ｍＡｂで染色した。Ｃ３０５．２とインキュベートした培養物 のすべてがＣ３０５．２で染色の欠如で示されるように、内因性レセプターのダ ウンモジュレーションを示した（図３Ｉ−３Ｌ）。細胞表面上の内因性レセプタ ーをダウンモジュレーションした後、トランスフェクトされたおよびトランスフ ェクトされていないＪｕｒｋａｔ細胞株を比較するとクローン５ＴＣＲトランス フェクト体細胞株においてはＣＤ３およびＴＣＲ両方に永続的な発現が示された （図３Ａ−３Ｄ、図３Ｅ−３Ｈ）。Ｃ３０５ ｍＡｂによる前処理は、試験され たＪｕｒｋａｔ株上のＭＨＣクラスＩ発現のレベルには何の影響も与えなかった 。これらの結果は、クローン５Ｔ細胞レセプター遺伝子（ＴＣＲ）でトランスフ ェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞における非内因性ＴＣＲの表面発現を示している 。 ＭＡＲＴ−１ペプチドのクローン５ＴＣＲ認識 ＴＩＬクローン５は以前に ＨＬＡ−Ａ２⁺黒色腫を認識できることが示されている［Ｓｈｉｌｙａｎｓｋｙ Ｊ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：２８ ２９］。現在まで試験されたどの黒色腫ＴＩＬ培養物もＭＡＲＴ−１またはｇｐ １００抗原（または両方）を認識した［Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ．ら、１９９４．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．，１８０：３４７］。さらに、ＭＡＲＴ−１特異的Ｔ細胞 クローン、Ａ４２がクローン５と同一の患者から誘導され、それはクローン５Ｔ ＣＲと同一のＶβ７．３サブファミリーを共有していた（実施例２参照）。細胞 表面に発現されたクローン５ＴＣＲ複合体が機能的ヘテロダイマーかどうかを決 定するため、およびどの黒色腫ＴＡＡが認識できるかを評価するため、最初のス クリーニングが実施された。Ｊｕｒｋａｔトランスフェクト体が、異なったＭＡ ＲＴ−１（ＭＡＲＴ−１_(22-30)、ＭＡＲＴ−１_(27-35)、ＭＡＲＴ−１_(32-40) 、ＭＡＲＴ−１_(26-35)、ＭＡＲＴ−１_(27-36)）またはｇｐ１００（ｇｐ１００_(457-465) ）ペプチドで前もってインキュベートされたＴ２細胞で刺激された。 ＴＩＬ１２３５およびＴＩＬ１２００は陽性対照として使用された。ＴＩＬ１２ ３５はＭＡＲＴ−１_(27-35)、ＭＡＲＴ−１_(26-35)、ＭＡＲＴ−１_(27-36)を認 識し、ＴＩＬ１２００はｇｐ１００_(457-465)を認識した。Ｊｕｒｋａｔ細胞か らのＩＬ−２放出またはＴＩＬからのＧＭ−ＣＳＦ放出を刺激するペプチド−パ ルスＴ２細胞の能力はＥＬＩＳＡで算定された。Ｊｕｒｋａｔバルクトランスフ ェクト体細胞は純粋なＪｕｒｋａｔＴＣＲ⁺細胞集団を単離するために限界希釈 によりクローン化され、２８クローンのうちの８つがＩＬ−２産生に対してスク リーニング陽性であった。刺激されたＩＬ−２産生が最も高いレベルを示したク ローン（クローン１３および２２）がさらなるアッセイのために選択された。 表６に示したように、Ｊｕｒｋａｔクローン５ＴＣＲトランスフェクト体は、 ＭＡＲＴ−１_(27-35)ペプチドでパルスをかけたＴ２細胞を特に認識した。ＭＡ ＲＴ−１_(27-35)ペプチドのＪｕｒｋａｔクローン５ＴＣＲ⁺細胞株認識パターン は、ＭＡＲＴ−１ペプチドＭＡＲＴ−１_(27-35)、ＭＡＲＴ−１_(26-35)およびＭ ＡＲＴ−１_(27-36)の認識を示したＴＩＬ１２３５を含むいくつかのＭＡＲＴ− １特異的ＴＩＬ株と類似していた（表６）［Ｃｏｘ Ａ．Ｌ．ら、１９９４．Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ，２６４：７１６］。対照的に、ＴＩＬ Ａ４２（クローン５と同 一の親ＴＩＬ培養物から誘導された）およびＴＩＬ １Ｅ２はＭＡＲＴ−１ペプ チドＭＡＲＴ−１_(27-35)およびＭＡＲＴ−１_(26-35)を認識できたが、ＭＡＲＴ −１_(27-36)（ＭＡＲＴ−１_(27-35)配列を含みそのＣＯＯＨ末端に余分なイソロ イシンを持っている）を認識できなかった［実施例２；Ｃｏｌｅ Ｄ．Ｊ．ら、 １９９４．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．５４：５２６５−５２６８］。 モノクローナルＪｕｒｋａｔクローン５ＴＣＲ⁺細胞株によるペプチド認識の 感度の特性付けは、５０ｍＭから６４０ｐＭの範囲で希釈されたＭＡＲＴ−１ペ プチドと前もってインキュベートしたＴ２細胞を用いて実施された。最大ＩＬ− ２刺激の５０％を提供するのに必要なペプチドの濃度は５０−２００ｎＭの範囲 であった（図４）。両方のクローンともバルク細胞株単独よりも敏感であった。 黒色腫細胞株のクローン５ＴＣＲ認識 クローン５ＴＣＲのＭＡＲＴ−１特 異性を決定し、ＭＡＲＴ−１陽性黒色腫腫瘍細胞を認識するＪｕｒｋａｔクロー ン５ＴＣＲ⁺細胞株の能力を評価した。従って、サイトカイン放出のためのＴ２ 細胞アッセイと同一の条件を用いて、ＨＬＡ−Ａ２⁺黒色腫細胞株を認識するモ ノクローナルＪｕｒｋａｔクローン５ＴＣＲ⁺の能力が試験された。Ｊｕｒｋａ ｔ細胞株による腫瘍の認識は起きなかった（表７）。ＨＬＡ−Ａ２発現のレベル および腫瘍細胞表面上で利用可能なＭＡＲＴ−１ペプチドの量が、腫瘍を認識す るＪｕｒｋａｔクローン５ＴＣＲ⁺細胞の能力に影響する因子であるので、これ らのパラメーターを改良するためにアッセイ条件が変更された。腫瘍細胞／ウェ ルの数を１０倍増加させても、またはＩＦＮ−γとの４８時間の前もってのイン キュベーションを用いて腫瘍クラスＩ発現をアップレギュレートしても（ＦＡＣ Ｓ分析で確認）、Ｊｕｒｋａｔ信号伝達の刺激は生じなかった。前もって２時間 インキュベートすることにより関連したペプチドを腫瘍細胞に与えた後にのみ、 ＭＡＲＴ−１_(27-35)でＪｕｒｋａｔＴＣＲ⁺クローンによる控えめなレベルの認 識が起こる（表７）。従ってＴＩＬとは対照的に、モノクローナルＪｕｒｋａｔ クローン５ＴＣＲ⁺細胞株はＨＬＡ−Ａ２⁺腫瘍細胞上の内因性ＭＡＲＴ−１抗原 （ならびにＴ２細胞上にパルスされていても）を認識できない。 いくつかの黒色腫随伴抗原がクローン化されており、黒色腫患者からのＴＩＬ により認識されるエピトープが同定されている［Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅ ｎ Ｐ．ら、１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３；Ｂｒｉｃｈａｒｄ Ｖ．ら、１９９３．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４８９；Ｇａｕｇｌｅｒ Ｂ．ら、１９９４．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：９２１；Ｋａｗａｋａｍ ｉ Ｙ．ら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：３５ １５；Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ．ら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ．，９１：６４５８；Ｃｏｘ Ａ．Ｌ．ら、１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６４：７１６］。ＴＩＬはＴ細胞の不均一な集団であり、その結果、培養物が 腫瘍抗原を認識し、インビボで観察された抗腫瘍応答を媒介するバルクＴＩＬ内 のＴ細胞クロノタイプを同定することは困難である（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｍ． Ｉ．ら、（１９９４）．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１６：８５−９４）。 本研究は、交互の細胞株の機能性腫瘍抗原特異性Ｔ細胞レセプターヘテロダイ マーの再構築および特性付けに関する最初の報告である。黒色腫反応性クローン （クローン５）からＪｕｒｋａｔ細胞へのＴＣＲの移動はクローン５の腫瘍特異 的反応性を不滅にし、それが認識するのがどのＴＡＡかを決定することを可能に する。クローン５Ｔ細胞レセプターを発現しているＪｕｒｋａｔトランスフェク ト体はバルクＴＩＬと同一のＭＡＲＴ−１ペプチドを認識する（表６）。クロー ン５およびＡ４２は同一の患者から誘導されたとしても、同一のＶβサブファミ リー遺伝子（Ｖβ７．３）を使用し、同一のＭＡＲＴ−１ ９−ｍｅｒ（ＭＡＲ Ｔ−１_(27-35)）を認識し［実施例３；Ｃｏｌｅら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，５４：５２６５−５２６１］、それらは細かい特異性のわず かな相違を持っていた。両方のクローンがＭＡＲＴ−１ １０−ｍｅｒ（ＭＡＲ Ｔ−１_(26-35)）を認識するが、クローン５のみがＭＡＲＴ−１_(27-36)を認識し た（両方の１０−ｍｅｒともコアＭＡＲＴ−１_(27-35)最小決定基を含んでおり 、ＭＡＲＴ−１_(26-35)はそのＮＨ₂末端に余分なグルタミン酸を持っており、Ｍ ＡＲＴ−１_(27-36)はそのＣＯＯＨ末端に余分のイソロイシンを持っている）。 発展した腫瘍特異性Ｔ細胞クローンに制限された能力を与えたとしても、Ｊｕｒ ｋａｔ細胞内へのＴＣＲ遺伝子の伝達は、これらのクローンの精密な特異性を同 定および特性付けるため、腫瘍反応性Ｔ細胞クローンを永続させる有用な方法を 提供するであろう。 ＭＡＲＴ−１_(27-35)パルス刺激Ｔ２細胞による（黒色腫細胞によるものでは ない）クローン５Ｊｕｒｋａｔ細胞の刺激はＴＣＲ−ペプチド−ＭＨＣ相互作用 以外のＴ細胞活性化が存在することを示している。ＨＬＡ−Ａ２⁺黒色腫細胞は ＭＡＲＴ−１_(27-35)ペプチドと前もってインキュベーションした後でのみクロ ーン５Ｊｕｒｋａt細胞を刺激できるので（表７）、腫瘍細胞の表面上の抗原性 ペプチドのレベルが黒色腫抗原の認識に重要であるように思われる。しかしなが ら、ペプチドパルス刺激Ｔ２細胞と比較してのペプチドパルス刺激腫瘍細胞によ る低レベルのＩＬ−２放出は、腫瘍細胞がＪｕｒｋａｔトランスフェクト体を刺 激することができないことがペプチドレベル単独では完全には説明不可能である ことを示唆している。さらに、Ｊｕｒｋａｔトランスフェクト体の刺激に必要と されるペプチド濃度は、正常Ｔ細胞を刺激するのに必要とされる濃度とひどくは 異なっていない。５−１０ｎＭほどの低い濃度でＭＡＲＴ−１_(27-35)パルスを かけられたＴ２細胞は我々のＪｕｒｋａｔクローンを刺激できＩＬ−２を分泌さ せる（図４）。同様に、ＴＩＬクローンＡ４２は、１ｎＭほどの低い濃度でＭＡ ＲＴ−１_(27-35)パルスをかけられたＴ２細胞により刺激されてＧＭ−ＣＳＦを 分泌した［Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ．ら、１９９４．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８ ０：３４７］。従って、ＴＩＬクローンおよびＪｕｒｋａｔトランスフェクト体 の両方が刺激のために同様な濃度のペプチドを必要としている。 クローン５Ｊｕｒｋａｔ細胞による腫瘍細胞認識の欠如は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞白 血病株中のＭＨＣクラスＩ制限、ＣＤ８⁺Ｔ細胞クローン由来のＴＣＲを発現し ているためのようである。Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ８⁺の発現の欠如は、それ らが腫瘍細胞より刺激されないことを説明しているようである。Ｔ２および黒色 腫はＪｕｒｋａｔトランスフェクト体の有効な刺激に必要とされる適切な接着分 子を特異に発現することも可能である。 ペプチドで刺激されたＴ２細胞が、トランスフェクトされていない細胞（ＪＲ Ｔ ＮＥＯ）、バルク（ｂｕｌｋ）ＴＣＲクローンをトランスフェクトされた細 胞（ＪＲＴ ＢＵＬＫ）、クローン５ＴＣＲおよびクローンによりトランスフェ クトされた細胞からのＩＬ−２放出を刺激する能力が、ＥＬＩＳＡで測定された 。アッセイに先立ち、Ｔ２細胞は２．５μＭのＭＡＲＴ−１ペプチド（ＭＡＲＴ −１（２２−３０）、ＭＡＲＴ−１（２７−３５）、ＭＡＲＴ−１（３２−４０ ）、ＭＡＲＴ−１（２６−３５）あるいはＭＡＲＴ−１（２７−３６））あるい はｇｐ１００ペプチド（ｇｐ１００（４５７−４６５））と２時間インキュベー トさ れた。陽性対照として、ＭＡＲＴ−１のエピトープであるＭＡＲＴ−１（２７− ３５）、ＭＡＲＴ−１（２６−３５）、ＭＡＲＴ−１（２７−３６）あるいはｇ ｐ１００のエピトープであるｇｐ１００（４５７−４６５）をそれぞれ認識する 、ＨＬＡ−Ａ２で制限されるＴＩＬ１２３５およびＴＩＬ１２００が、ＧＭ−Ｃ ＳＦの放出によりアッセイされた。 ペプチドで刺激されたＴ２細胞が、トランスフェクトされていない細胞（ＪＲ Ｔ ＮＥＯ）、バルク（ｂｕｌｋ）ＴＣＲクローンをトランスフェクトされた細 胞（ＪＲＴ ＢＵＬＫ）、クローン５のトランスフェクトされたＴＣＲ＋クロー ン化された（クローン１３およびクローン２２）Ｊｕｒｋａｔ細胞からのサイト カイン放出を媒介する能力が、ＥＬＩＳＡで測定された。アッセイに先立ち、Ｔ ２細胞あるいは腫瘍細胞は２．５μＭのＭＡＲＴ−１（２７−３５）ペプチドと ２時間インキュベートされた。陽性対照として、ＭＡＲＴ−１（２７−３５）を 認識する、ＨＬＡ−Ａ２で制限されるＴＩＬ１２３５が、ＧＭ−ＣＳＦの放出に よりアッセイされた。 実施例４抗体／Ｔ細胞受容体のキメラ遺伝子により向けなおされる、ｉｎ ｖｉｖｏでの Ｔ細胞の抗腫瘍活性 材料と方法 キメラ受容体遺伝子の構築 Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達を媒介する能力がある、Ｆｃ受容体γ鎖と連 結されたモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）から得られた一本鎖可変領域（ｓｃＦ ｖ）から構成されるキメラ受容体遺伝子（Ｏｒｌｏｆｆ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，３４７：１８９−１９１，１９９０；Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ，Ｆ ．ａｎｄ Ｋｌａｕｓｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，８８：８９０５−８９０９，１９９１；Ｒｏｍｅｏ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６８：８８９−８９７，１９９２；Ｒｏｍｅｏ，Ｃ．ａｎｄ Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｃｅｌｌ，６４：１０３７−１０４６，１９９１；Ｉｒｖｉ ｎｇ，Ｂ．Ａ． ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，Ａ．，Ｃｅｌｌ，６４：８９１−９０１ ，１９９１）は、以前に記載されているように構築された（図５Ａ−５Ｃ；ＰＣ Ｔ 第ＷＯ９３／１９１６３号、Ｈｗｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．，１７８：３６１−３６６，１９９３；Ｅｓｈｈａｒ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７２０−７２４，１９ ９３）。 ＭＯｖ１８から得られたキメラ受容体（Ｃｏｎｅｙ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ． ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１：６１２５−６１３２，１９９１；Ｍｉｏｔｔ ｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３９：２９７−３０３， １９８７）、卵巣腺ガンのほとんどおよびＳｐ６により発現されている３８ｋＤ の葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）と結合するＭｏＡｂ（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎ ｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６：５１１−５１９，１９７６；Ｏｃｈｉ，Ａ．，Ｈａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．，ｅ ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：６３５１ −６３５５，１９８３）、抗２，４，６ＴＮＰ ＭｏＡｂが、記載されているよ うに作成された（ＰＣＴ第ＷＯ９３／１９１６３号、Ｈｗｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：３６１−３６６，１９９３）（それぞれＭ Ｏｖ−γおよびＳｐ−γ受容体）。レトロウィルスベクター ＭＯｖ−γあるいはＳｐ−γキメラ受容体遺伝子は、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白 血病ウィルスから得られたＬＴＲの転写調節下で、Ｔｒｅｉｓｍａｎら（Ｂｌｏ ｏｄ，１９９４）によるレトロウィルスのバックボーンであるＬＸＳＮあるいは Ｇ１ＥＮ中でクローン化された（Ｈｗｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ ｅｄ．，１７８：３６１−３６６，１９９３；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ，Ｇ．Ｊ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７：９８０−９８８ ，１９８９）。レトロウィルス構築物はまた、選択的なマーカーとしてネオマイ シンリン酸基転移酵素遺伝子（Ｎｅｏ^R）をも含んでいた。 葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）をコードする遺伝子は、Ｌ．Ｃｏｎｅｙ（Ａｐ ｏｌｌｏｎ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）から得られ、レトロウィルスのバックボー ンであるＬＸＳＮ中でクローン化された。レトロウィルス構築物は、その後以前 に記載されたようにＣａＰＯ₄を用いてＰＡ３１７アンフォトロピックパッケー ジング（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ｐａｃｋａｇｉｎｇ）細胞株にトランスフェ クトされた（Ｈｗｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：３ ６１−３６６，１９９３；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，ａｎｄ Ｂｕｔｔｉｍｏｒ ｅ，Ｃ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：２８９５−２９０２，１９８６ ）。腫瘍の形質導入と細胞培養 腫瘍細胞株は、１０％加熱非働化ＦＣＳとグルタミンを含有したＲＰＭＩ１６ ４０培地（すべてはＢｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手） 中で培養された。３−メチルコラントレンにより誘発された低免疫原性のＭＣＡ １０２マウス肉腫からクローン化された２４ＪＫ腫瘍細胞は（Ｓｈｉｌｏｎｉ， Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ，３７：２８６−２９２，１９９３；Ｋａｒｐ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０：８９６−９０８，１９９３）、２４ＪＫ−ＦＢＰ腫 瘍細胞株を得るために、８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）存在下でレトロ ウィルス培養上清中でインキュベーションすることでＦＢＰ遺伝子を形質導入さ れた。培養液は、１２時間ごとに３日間、新鮮なレトロウィルス培養上清および ポリブレンと交換された。最後の培養上清の交換から７２時間後に、腫瘍細胞は 、４００μｇ／ｍｌのネオマイシンの類似化合物であるＧ４１８（ＧＩＢＣＯ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で選別された。Ｇ４１８での選別に続いて 、ＭＯｖ１８ ＭｏＡｂを用いた腫瘍細胞のＦＡＣＳ解析により、うまく形質導 入されたことが示された。リンパ球の形質導入と細胞培養 ジフェニルヒドラジンにより誘発されたＭＣ３８マウス結腸腺ガンから採取さ れたマウスＴＩＬは、記載されたようにＩＬ−２存在下で成長させた（Ｙａｎｇ ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄｉｆ．，９：１４ ９ −１５９，１９９０）。ＭＯｖ−γおよびＳｐ−γキメラ受容体遺伝子を伴うレ トロウィルス形質導入のために、（それぞれＭＯｖ−ＴＩＬおよびＴＮＰ−ＴＩ Ｌを生成するために）抗原で刺激されたＴＩＬはペレットにされ、そして３０Ｉ Ｕ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−２と２０μｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｅｌｉ Ｌ ｉｌｌｙ＆Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含むレトロウィルスの 培養上清中で、３ｘ１０⁵ ＴＩＬ／ｍｌとなるように再懸濁された。１２時間ご とにさらに１−２回の感作をするために、培養液は、部分的にＩＬ−２と硫酸プ ロタミンを含む新鮮なレトロウィルス培養上清と交換された。最後の培養上清の 交換から４８時間後に、ＴＩＬは０．３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中で５日間選別さ れた。この後、Ｇ４１８を除いて１週間の長期培養を行い、そしてその後０．３ から１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中でさらに５日間選別された。Ｇ４１８での選別に 続いて、記載されたように（Ｈｗｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．，１５０：４１０４−４１１５，１９９３）、トータルＲＮＡをノザン解析す ることにより、うまく形質導入されたことが確認された。ｍＩＦＮγのＥＬＩＳＡ ５ｘ１０⁵のＴＩＬと５ｘ１０⁵の刺激細胞が、最終容量で１ｍｌの１０％ＦＣ Ｓと３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ培養液中で、３７℃で２４時間共 培養された。培養上清は、その後吸引され、細胞を取り除くために２０００ｒｐ ｍで遠心され、デカントされ−７０℃で凍結された。解凍された一部が、マウス ＩＦＮ−γの測定をするためにＥＬＩＳＡにより検定された。ＥＬＩＳＡは、固 相化された、マウスＩＦＮ−γに特異的なラットＩｇＧ_2A ＭｏＡｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて行わ れた。試料あるいは組換えＩＦＮ−γ標準液のどちらかを添加した後、ＩＦＮ− γに特異的なビオチン化ラットＩｇＧ₁ ＭｏＡｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａ ｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が使用され、その後アビジン−ペルオキシダーゼが使用 された。呈色反応は、Ｈ₂Ｏ₂およびＡＢＴＳ基質（２，２’−アジノ−ビス［３ −エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸］（２，２’−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ ［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｆｏｎｉｃ ａ ｃｉｄ］）；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ）を添加することにより行われた。プレートはその後、４０５ｎｍでの吸光度（ ＯＤ）で計測された。マウス Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ ）およびＦｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉ ｔｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）より入手し、そして８−１６週齢で使用され た。無胸腺ヌードマウスはＦｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙより入手し、ラミナフロー飼育で維持されそして６−１２ 週齢で使用された。 肺転移腫瘍の療法モデル Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、（あらゆる宿主の抗腫瘍免疫反応を最小限にするた めに）５００ｃＧｙの全身照射を受け、それに続いて５ｘ１０⁵から１ｘ１０⁶の ２４ＪＫあるいは２４ＪＫ−ＦＢＰ腫瘍細胞をＩＶ投与（静脈内投与）された。 ３日目にはマウスは、２−３ｘ１０⁷の形質導入されたあるいは形質導入されて いない、ＭＣ３８腫瘍から得られたＴＩＬ細胞を静脈から投与され、それに続い て９回分の投与量である３００００から６００００ＩＵのＩＬ−２を腹腔内に３ 回投与された。最初の腫瘍投与の後１１から１６日後に、マウスは耳に標識され 無作為化され、そして以前に記載されているように暗号化され盲験化された様式 で肺転移の数を評価するために（Ｍｕｌｅ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ，２２５：１４８７−１４８９，１９８４）、肺が採取された。＞２５０ の転移を伴う肺は、この数が正確に計測しうる最大の数であるために、≧２５０ として評価された。示された数字は、肺転移の平均数プラス／マイナス標準誤差 である。群間の有意差は、Ｗｉｌｃｏｘｉｎ Ｒａｎｋ Ｓｕｍｓテストにより 測定された。すべてのｐ値は２方向性（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）である。腹腔内腫瘍の療法モデル ＩＧＲＯＶ−１ヒト卵巣ガン細胞（Ａｌｂｅｒｔｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７１：１０５１− １０５５，１９９０；Ｂｅｎａｒｄ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ ｓ．，４５：４９７０−４９７９，１９８５）は、細胞株が継続的に腹水として 生成されるまで、ヌードマウス中に連続的に腹腔内継代することによりｉｎ ｖ ｉｖｏで順応させた。腹腔内腫瘍モデルとして、２．５ｘ１０⁶のＩＧＲＯＶ− １の新鮮な腹水細胞が、洗浄されそしてヌードマウスの腹腔内に投与された。３ 日後に、腹膜腫瘍の重度が試料マウスで評価され、残りは１−３ｘ１０⁷の形質 導入されていないあるいは形質導入されたＭＣ３８のＴＩＬ細胞が腹腔内に１回 投与されることにより処置された。マウスはその後、ケージ効果を排除するため に耳に標識され無作為化され、そして生存について追跡調査された。非免疫原性のマウス肉腫へのＦＢＰ抗原の遺伝子導入 非免疫原性のマウス線維肉腫である２４ＪＫが、ＭＯｖ１８により認識される 抗原である葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）をコードする遺伝子を伴うレトロウィ ルスで形質導入された。ネオマイシン類似化合物であるＧ４１８で選別された後 、ＦＢＰを形質導入された２４ＪＫ腫瘍（２４ＪＫ−ＦＢＰ）は、ＭＯｖ１８を 用いたＦＡＣＳ解析により測定されたときに、ヒト卵巣ガンであるＩＧＲＯＶ− １細胞で示されたのと同様に、高濃度のＦＢＰを発現していることが示された。キメラ受容体遺伝子を形質導入されたマウスＴＩＬのin vitroでの機能 ＭＣ３８結腸腺ガンから採取されたマウスＴＩＬ（３８ＴＩＬ）は、抗卵巣腫 瘍のＭｏＡｂであるＭＯｖ１８（ＭＯｖ−γ）あるいは抗ＴＮＰのＭｏＡｂであ るＳｐ６（Ｓｐ−γ）のどちらかから得られたキメラ受容体遺伝子を形質導入さ れ（Ｈｗｕ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：３６１−３ ６６，１９９３）、そしてＧ４１８中で選別された。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性 を測定するため、形質導入され、Ｇ４１８で選別されたＴＩＬは、腫瘍細胞株と １６−２４時間共培養された。培養上清はその後回収され、そしてＥＬＩＳＡに よりｍＩＦＮ−γについて解析された。すべてのＴＩＬの培養から、（それらの 本来の抗原である）ＭＣ３８腫瘍細胞と共培養されたときあるいは抗ＣＤ３をコ ートしたプレート上で培養されたとき、大量のｍＩＦＮ−γが産生された。ＩＧ ＲＯＶ−１あるいは２４ＪＫ−ＦＢＰ腫瘍細胞と共培養されたときは、大量の葉 酸結合タンパク質の発現、ＭＯｖ−γを形質導入されたＴＩＬ（ＭＯｖ−ＴＩＬ ）によるｍＩＦＮ−γの産生は両方とも、ＭＯｖ−ＴＩＬ単独の場合と比較して 、それぞれ５４倍、１４倍に増加した。これに対して、形質導入されていない（ ＮＶ）ＴＩＬおよび抗ＴＮＰであるＳｐ−γ受容体を形質導入されたＴＩＬ（Ｔ ＮＰ−ＴＩＬ）によるｍＩＦＮ−γ産生は、ＦＢＰを発現している細胞との共培 養の時に２−４倍に増加し、ＦＢＰを発現していない細胞株との共培養と比較し て相違がなかった。ＴＩＬ培養物の中で、形質導入されていない２４ＪＫ細胞あ るいは８８８ヒト黒色腫細胞との共培養において、大量のｍＩＦＮ−γを発現し たものはなかった（表８）。これらのデータにより、ＭＯｖ−γ受容体遺伝子は 、マウスＴＩＬに対して、ＦＢＰを発現している腫瘍細胞を特異的に認識する能 力を与えうる。肺転移の治療 ＭＯｖ−ＴＩＬがｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を持つかどうかを調べるために 、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＦＢＰ遺伝子を形質導入されていないあるいは形質 導入された、１ｘ１０⁶の２４ＪＫ腫瘍細胞が尾静脈から投与された。３日後、 マウスは２．７ｘ１０⁷のＴＩＬにより処置され、その後９回分の投与量である ６００００ＩＵのＩＬ−２を８時間ごとに投与された。最初の腫瘍細胞の投与か ら１１日後に、マウスは殺され、そして肺転移が測定された。ＩＬ−２と組み合 わせてＭＯｖ−ＴＩＬで処置した場合にのみ、結果として肺転移が有為に減少し たが（その他すべての処置群と比較してｐ₂＜０．０００４）、それに対して、 ＩＬ−２単独の処置あるいは形質導入されていない（ＮＶ）ＴＩＬをＩＬ−２と 組み合わせて処置した場合には、２４ＪＫ−ＦＢＰの肺転移の個数には顕著な減 少は見られなかった。ＭＯｖ−ＴＩＬは、形質転換されていない２４ＪＫ腫瘍細 胞の個数を減少させず（表９および図７）、従ってＦＢＰを発現している腫瘍に 対するその特異性を示している。これらの知見は、２回繰り返して実験を行い確 認 された。ヌードマウスでのヒト卵巣ガン細胞の治療 ＭＯｖ−ＴＩＬがでヒト卵巣ガン細胞に対する顕著なｉｎ ｖｉｖｏ活性を持 つかどうかを調べるため、ヌードマウスの腹腔内に新鮮な腹水から得られた２ｘ １０⁶のＩＧＲＯＶ−１細胞が移植された。３日後、マウスはＴＩＬの腹腔内へ の一回投与の処置をされ、その後生存について追跡調査された。処置をしたとき の試料マウスの組織病理学的な評価により、顕著な数の疾患が存在し、腫瘍投与 から３日後にはマウス腹膜腔内に侵襲構造があることが示された（図８）。ＭＯ ｖ−ＴＩＬで処置されたマウスでは、塩類溶液のみあるいは形質導入されていな いＴＩＬあるいはＴＮＰ−ＴＩＬによる処置をされたマウス（それぞれの平均の 生存日数＝３１、３７、３１日、図９）と比較して、顕著に生存日数が増加した （平均の生存日数＝９０日、ｐ₂＜０．００２）。本研究では、同一の結果が繰 り返された。 ＴＨ１対ＴＨ２の様なＴ細胞による特異的なサイトカイン産生のパターンは、 異なる免疫反応および異なる療法的結果を導出することが示されてきた（Ｒｏｍ ａｎｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：４６４７− ４６５４，１９９１；Ｄｅｌ Ｐｒｅｔｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｒｏｍａｇｎａｎｉ， Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２：４−６，１９９４；Ｒｅｉｎ ｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１４５７−１４６０ ，１９９３；Ｌｏｃｋｓｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｐ．，Ｉｍｍｕ ｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１２：Ａ５８−６１，１９９１；Ｓｔｒｅｅｔ，Ｎ．Ｅ． ａｎｄ Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．Ｒ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，５：１７１−１７７， １９９１）。 本研究により、受容体により特定される抗原を持つ腫瘍細胞に対して、キメラ 受容体遺伝子を形質導入されたＴ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで活性であることが示さ れた。形質導入されていないマウスおよびヒトのＴＩＬを用いたかつての研究で は（Ｂａｒｔｈ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３：６４７ −６５８，１９９１；Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｔｒｕｂｅｒ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａ ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２：１４７５−１４８３，１９９４）、 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの特異的なサイトカイン産生とｉｎ ｖｉｖｏでの本来の腫 瘍関連抗原を持つ腫瘍細胞に対する機能とに、相関関係があった。キメラ受容体 を発現するＴ細胞を使用する本結果でもまた、ｉｎ ｖｉｖｏで療法的な効果を 有するＴ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的にサイトカインを分泌する。 抗体を基礎にした腫瘍の認識が、腫瘍関連抗原の発現に依存しているため、腫 瘍細胞にとっての一つの考えられる逃避機構は、抗原の発現の抑制的調節である 。本研究では、ＩＧＲＯＶ腫瘍細胞をヌードマウスの腹腔内に投与し、その後Ｍ Ｏｖ−ＴＩＬを用いた腹腔内での療法をすることにより、生存日数が顕著に増加 する結果となった。生存は３倍になったが、すべてのマウスは結局腫瘍性腹水に より死亡した。これらの腫瘍細胞のＦＡＣＳ解析により、対照のマウスの腹水と 変わらず、ＦＢＰの発現が持続的に存在していることが示された。抗原の抑制的 調節がこの特定のモデルにおける逃避の機構ではないことが、これにより示唆さ れる。 ガン患者におけるこの疾患の転移の形態のうちもっとも一般的でありそしても っとも初期のものは、腹膜腔の表面に移植された細胞が剥離することによるため 、腹腔内腫瘍のモデルは、卵巣ガンに対しても部分的には相応しい。（Ｂｅｒｅ ｋ，Ｊ．Ｓ．，Ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎ： Ｊ．Ｓ．Ｂｅｒｅｋ ａｎｄ Ｎ．Ｆ．Ｈａｃｋｅｒ（ｅｄｓ．），Ｐｒａｃｔ ｉｃａｌ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３２７−３７５ ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ．１９９４ ） １ｍｌあたり５ｘ１０⁵のＴＩＬが３７℃で１６時間、何も添加せずに、ある いは５ｘ１０⁵の標的細胞（たとえばＩＧＲＯＶや８８８ＭＥＬ）とともに、あ るいは２Ｃ１１（抗ＣＤ３）抗体とともに培養された。 ２Ｃ１１は、４μｇ／ｍｌで使用され、ＨＣＯ₃緩衝液で一晩、４℃でコートさ れた。 実施例５ キメラＴ細胞受容体遺伝子による幹細胞の形質導入 効果器としてのＴ細胞の機能と抗体の持つ抗腫瘍の特異性を組み合わせるため 、Ｆｃ受容体関連γ鎖と連結された、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）から得られ た可変領域部位を含む、そしてＴ細胞において細胞内シグナル伝達を媒介するこ とができることが示されているキメラ受容体遺伝子構築物が構築された。キメラ 受容体遺伝子は、抗トリニトロフェニルｍＡｂからとともに卵巣腺ガンのほとん どにより高濃度に発現されている３８ｋＤの葉酸結合タンパク質と結合するｍＡ ｂであるＭＯｖ１８から得られた一本鎖ＶＬ／ＶＨ部位（ｓｃＦｖ）を使用して 作成された。 これらのキメラ受容体遺伝子を形質導入されたＴ細胞は、抗体で認識される抗 原に反応して特異的に細胞融解をしそしてサイトカインを分泌することができる （Ｈｗｕ，Ｐ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：３６１−３６６，１９９３） 。ＭＯｖ−γを形質導入されたＴリンパ球は、ヒト卵巣細胞を融解しそして卵巣 細胞と共培養されたときにＧＭ−ＣＳＦを放出する。これらのキメラＴ細胞受容 体はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍に対して機能的であることが示されてき た（実施例４）。 造血幹細胞にこれらのキメラ抗体／Ｔ細胞受容体遺伝子を使用することが本明 細書で示されている。造血幹細胞にキメラ受容体遺伝子あるいは抗原特異的Ｔ細 胞受容体を形質導入することにより、抗腫瘍受容体を発現する免疫細胞を永続的 に再生しながらｉｎ ｖｉｖｏで供給すること、遺伝子的に改変された幅広い種 類の細胞（たとえばＴ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞そして好中球）を産生す ること、そしてｉｎ ｖｉｖｏで自然に分化しそして増殖する形質導入された幹 細胞により腫瘍部位への交通が充進することが見込まれる。腫瘍特異的Ｔ細胞受 容体もまたこれらの方法において使用されうる。 材料と方法 骨髄の形質導入は、記載されたように行われた（Ｂｏｄｉｎｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８８９７−８９０１，１ ９８９）。簡単に言うと、ドナーマウスは幹細胞の回収率を上げるために５ＦＵ を投与された。４８時間後にマウスは殺され、そして骨髄細胞（ＢＭＣ）が大腿 骨および脛骨から採取された。ＢＭＣはその後、２００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＩＬ −１、ＩＬ−３、ＩＬ−６および１０％のＷｅｈｉ培養上清中で４８時間培養さ れた。ＢＭＣはその後、放射線照射されたキメラ受容体レトロウィルス産生細胞 上で４８時間共培養された。非接着ＢＭＣはその後回収され、投与に先立って９ ５０ｒａｄという致死量の放射線を照射されたレシピエントマウスに静脈から注 射された。 より精製された幹細胞調製物を使用すること、培養上清形質導入法あるいはそ の他の成長因子およびサイトカインを使用して幹細胞を維持する方法を含むがそ れらに限定されない、骨髄を分離しキメラ受容体を形質導入するその他の方法が 使用されうる。 マウス造血組織は、骨髄再構築の後数カ月間、数回の時点をとって解析された 。再構築されたマウスから得られた新鮮な脾臓細胞が腫瘍細胞と共培養され、そ して培養上清がマウスＩＦＮ−γについてアッセイされた。それに加えて、脾臓 細胞はＣｏｎＡにより活性化され、そして同様な方法によって１０日後にサイト カインの放出についてアッセイされた。使用されたベクター キメラ受容体遺伝子を発現する２つのレトロウィルスベクターが使用されてき た（図１０）。ヒトつめにおいては、キメラ受容体遺伝子がＭＭＬＶ ＬＴＲの 転写調節化におかれている。もう一つのベクターにおいては、ｐｇｋハウスキー ピング遺伝子プロモーターがｉｎ ｖｉｖｏでの発現を確実にするために使用さ れた。本明細書で示されたデータにおいては、抗卵巣ガンモノクローナル抗体か ら採取され、卵巣腺ガンのほとんどで過剰発現されている葉酸結合タンパク質（ ＦＢＰ）と結合する、キメラ受容体遺伝子（ＭＯｖ−γ）が使用された。他の抗 原に対するキメラ受容体もまた、使用されうる。これに加えて、他のレトロウィ ルスベクターシステムである、ＡＡＶベクター（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕ ｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９ ，１９９２）、遺伝子小片発射法、あるいはその他の様々な形質導入システムが 組換え構築物を細胞内に挿入するために使用されうる。ノザン 再構築されたマウスの脾臓細胞、骨髄細胞そして胸腺細胞から回収されたトー タルＲＮＡをノザンブロット解析することにより、それらの細胞はキメラ受容体 遺伝子の発現が陽性であったことが示された。サイトカイン放出 ３匹の正常マウスと３匹のＭＯｖ−γで再構築されたマウスから採取された新 鮮な脾臓細胞が、マウスの腫瘍細胞と共培養された。使用されたマウスの腫瘍細 胞は、共刺激分子であるＢ７−１、あるいはＭＯｖ−１８により認識される葉酸 結合タンパク質（ＦＢＰ）、あるいはＢ７−１とＦＢＰタンパク質の両方を形質 導入された、メチルコラントレン（ＭＣＡ）により誘発された肉腫細胞である、 非免疫原性の２４ＪＫ細胞であった。２４ＪＫ Ｂ７−ＦＢＰ細胞と共培養され たＭＯｖ−γ脾臓細胞から、顕著な濃度のマウスＩＦＮ−γが検出された（表１ ０）。新鮮なＭＯｖ−γ脾臓細胞からの顕著なサイトカイン分泌は、ＦＢＰタン パク質のみを発現している２４ＪＫ細胞と共培養したときには見られなかった。 このようにＭＯｖ−γで再構築されたマウスから採取された新鮮な脾臓細胞の刺 激のためには、Ｂ７とＦＢＰの発現の両方が必要でありうる。ＣｏｎＡ刺激は、 陽性対照として行われた。 ＭＯｖ−γで再構築されたマウスから採取された活性化された脾臓細胞（表１ １）は、２４ＪＫ ＦＢＰ細胞および２４ＪＫ Ｂ７−ＦＢＰ細胞の両方に反応 してマウスＩＦＮ−γを産生することができた。このようにＭＯｖ−γで再構築 されたマウスから採取された活性化された脾臓細胞の刺激は、標的細胞上でのＢ ７の発現とは無関係のように見える。 新鮮な脾臓細胞は、ｍＩＦＮ−γの発現により測定されるような刺激のために は腫瘍細胞上にＢ７および特異的抗原の両方が発現していることが必要である。 腫瘍細胞は通常はその表面にＢ７を発現していないため、形質導入された骨髄細 胞から採取された無処理の脾臓細胞内でキメラ受容体が機能するために、さらな る添加物が添加されうる。たとえば、Ｂ７はＴ細胞上のＣＤ２８受容体を刺激す ることにより機能するため、ＣＤ２８シグナル鎖と連結されたｓｃＦｖ抗体領域 を使用するキメラ受容体が、その他のキメラ受容体と組み合わされて使用されう る。ｓｃＦｖ−γおよびｓｃＦｖ−ＣＤ２８受容体の両方を発現しているＴ細胞 は、Ｔ細胞の刺激および抗原との結合に伴う共刺激のシグナルの両方を提供しう る。活性化された脾臓細胞が刺激するためにＢ７を必要としなかったことから、 患者においては別のアプローチとして末梢血リンパ球を体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ ）活性化し、その後形質導入された幹細胞を骨髄移植することが含まれうる。 これらの研究では、造血骨髄細胞がキメラＴ細胞受容体で遺伝子的に持続的に 改変されうること、そしてそれらの子孫細胞がモノクローナル抗体により認識さ れる新しい抗原に対して対象を変えうることが示される。キメラ受容体を形質導 入された幹細胞から得られた免疫細胞により治療されうる疾患の例としては、黒 色腫や卵巣ガンなどのガンが含まれるが、これらだけに限定されない。ＨＩＶや 細菌感染症あるいはカビ感染症などの感染性疾患を含む、しかしこれらだけに限 定されない、その他の疾患もまた、キメラ受容体あるいは本来のＴ細胞受容体で 形質導入された幹細胞により治療されうる。 別の方法では、本発明の抗原特異的Ｔ細胞受容体、好ましくは黒色腫特異的Ｔ 細胞受容体が、レトロウィルス形質導入により幹細胞に導入され、そして疾患に 悩まされている哺乳類を療法的にあるいは予防的に治療するために使用されうる 。ウィルスあるいは細菌の抗原あるいは寄生体に対する、抗原特異的Ｔ細胞受容 体 を発現している幹細胞を使用する免疫療法もまた、本明細書中で記載された方法 において使用されうる。 １ｍｌあたり１．５ｘ１０⁶の脾臓細胞と５ｘ１０⁵の腫瘍細胞が４８時間共培 養された。 １ｍｌあたり１．５ｘ１０⁶の脾臓細胞と５ｘ１０⁵の腫瘍細胞が１８時間共培 養された。 実施例６黒色腫に悩まされている哺乳類を療法的に治療するための、黒色腫の抗原を認識 するＴ細胞受容体を発現するリンパ球の使用 本明細書において黒色腫抗原に対して提供されるＴ細胞受容体を発現している Ｔリンパ球は、黒色腫に悩まされている哺乳類を療法的に治療するときに効果的 であり得る。黒色腫抗原特異的Ｔ細胞受容体のαおよびβ両鎖を持つレトロウィ ルス発現ベクターが、レトロウィルスパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）細 胞株に導入されうる。別の方法ではα鎖およびβ鎖がそれぞれ別々のレトロウィ ルス発現ベクター中に配置されそしてレトロウィルスパッケージング（ｐａｃｋ ａｇｉｎｇ）細胞株に導入されうる。実施例として、Ｔリンパ球が末梢血あるい は黒色腫腫瘍懸濁液から回収され、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される（Ｋａ ｗａｋａｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６ ８：２１８３−２１９１）。Ｔリンパ球あるいはＴＩＬは培養液中に再懸濁され 、そしてレトロウィルス培養上清に感作される（Ｈｗｕ，ｅｔ ａｌ．，（１９ ９３）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５）。レトロウィ ルス培養上清には、硫酸プロタミンとＩＬ−２を添加しうる。Ｔ細胞受容体を発 現しているＴリンパ球はその後、このような治療が必要なときに患者に投与され うる。リンパ球は静脈内、腹腔内、あるいは障害部位内（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏ ｎａｌｌｙ）のどれかにより投与されうる。サイトカイン、放射線療法、黒色腫 障害部位の外科的切除および化学療法薬、活性免疫化、外来（ａｄｏｐｔｉｖｅ ）Ｔ細胞導入療法などのその他の療法的治療と同時に、この治療法は施しうる。 本発明は、開示された核酸配列による範囲には限定されるべきではなく、同等 の機能をするあらゆる配列が本発明の範囲内にある。実際本明細書で示されそし て記載された改変に加えて発明の様々な改変が、前述の記載および付随する図面 から当業者には明白になるであろう。このような改変は、本明細書に添付する請 求項の範囲に属するものとするつもりである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年６月５日 【補正内容】 請求の範囲 １．Ｔ細胞受容体のα鎖の核酸配列およびβ鎖の核酸配列の両方を含む発現ベ クターを含む宿主細胞と医薬的に効果的な担体とからなる、薬剤組成物。 ２．Ｔ細胞受容体のα鎖の核酸配列およびβ鎖の核酸配列の両方を含む組換え 発現ベクターと医薬的に効果的な担体とからなる、薬剤組成物。 ３．哺乳類に治療に有効な量の請求項１の薬剤組成物を投与することを含む、 哺乳類においてガンを予防しあるいは治療するための、請求項１の薬剤組成物の 使用。 ４．ガンが肺ガン、黒色腫、卵巣ガン、乳ガン、結腸ガン、脳腫瘍、前立腺ガ ンあるいは腎臓ガンからなる群から選択される、請求項３の使用。 ５．ガンが黒色腫あるいは卵巣ガンである請求項４の使用。 ６．特異的抗体の一本鎖Ｆｖ部位から構成されたキメラ受容体をコードする核 酸配列の少なくとも一部と免疫細胞の少なくとも膜貫通領域と細胞内領域をコー ドする第２セグメントとを含む発現ベクターを含む造血幹細胞。 ７．請求項６の細胞と医薬的に許容される担体とからなる、薬剤組成物。 ８．哺乳類に治療に有効な量の請求項７の薬剤組成物を投与することを含む、 哺乳類においてガンを予防しあるいは治療するための、請求項７の薬剤組成物の 使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ニシムラ，マイケル アメリカ合衆国メリーランド州20853，ロ ックヴィル，キャシェル・ロード 16741 (72)発明者 ローゼンバーグ，スティーブン・エイ アメリカ合衆国メリーランド州20854，ポ トマック，アイロン・ゲート・ロード 10104 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞受容体であり、α鎖からなる、分離された Ｔ細胞受容体。 ２．腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞受容体であり、β鎖からなる、分離された Ｔ細胞受容体。 ３．腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞受容体であり、α鎖およびβ鎖からなる、 分離されたＴ細胞受容体。 ４．腫瘍関連抗原が黒色腫、卵巣、肺、結腸、腎臓、乳房あるいは前立腺から なる群から選択された腫瘍により発現されている抗原である、請求項１、２また は３のＴ細胞受容体。 ５．ｎは１−５であり、またＸａａは任意のアミノ酸でありうる、システイン −Ｘａａ_nのカルボキシ末端をコードする３’末端を有する核酸配列をもつ可変 領域と、図１Ａ-１Ｂ、図２に示されたＪα配列およびそれらと実質的に相同な 配列からなる群から選択された核酸配列をもつ連結領域とを含む、少なくともＴ 細胞受容体のα鎖の可変領域と連結領域とをコードする、分離された核酸。 ６．定常領域に対する核酸配列をさらに含む、請求項５の核酸配列。 ７．可変領域がＶα８．２、Ｖα１７、Ｖα９、Ｖα１、Ｖα２５、あるいは Ｖα２１からなる遺伝子群から選択される、請求項５の核酸配列。 ８．図１Ａ、図１Ｂ、図２に示されたＪα配列および実質上それらと相同の配 列からなる群から選択された配列を含む核酸である、Ｔ細胞受容体のα鎖の定常 領域をコードする、分離された核酸。 ９．ｎはおよそ１−５であり、またＸａａは任意のアミノ酸でありうる、シス テイン−Ｘａａ_nのカルボキシ末端をコードする３’末端を有する核酸配列をも つ可変領域と、図１Ａ−１Ｂ、図２に示されたＪβ配列および実質上それらと相 同の配列からなる群から選択された核酸配列をもつＪ領域とからなる、少なくと もＴ細胞受容体のβ鎖の一部分をコードする、分離された核酸。 １０．図１Ａ−１Ｂ、図２に示されたＪβ配列および実質上それらと相同の配 列からなる群から選択された配列からなる核酸配列を有する、Ｔ細胞受容体のβ 鎖の連結領域をコードする、分離された核酸。 １１．図１Ａに示されたＶ−Ｊ連結配列をもつＶα８．２／Ｊα４９／Ｃα鎖 および図１Ａに示されたＶ−Ｄ−Ｊ連結配列をもつＶβ１３．６／Ｄβ１．１／ Ｊβ１．５／Ｃβ１；図１Ｂに示されたＶ−Ｊ連結配列をもつＶα１７／Ｊα４ ２／Ｃαおよび図１Ｂに示されたＶ−Ｄ−Ｊ連結配列をもつＶβ６．５／Ｄβ． １／Ｊβ．５／Ｃβ；図１Ｂに示されたＶ−Ｊ連結配列をもつＶα９／Ｊα１６ ／Ｃαおよび図１Ｂに示されたＶ−Ｊ−Ｊ連結配列をもつＶβ２２．１／Ｄβ２ ．１／Ｊβ２．１／Ｃβ２；図１Ｂに示されたＶ−Ｊ連結配列をもつＶα１／Ｊ α４９／Ｃα；そして図１Ｂに示されたＶ−Ｄ−Ｊ連結配列をもつＶβ７．３／ Ｄβ２．６／Ｊβ２．１／Ｃβ２；図２に示されたＶ−Ｊ連結配列をもつＶα２ ５／Ｊα５４／Ｃαおよび図２に示されたＶ−Ｊ−Ｊ連結配列をもつＶβ３．１ ／Ｄβ１．１／Ｊβ１．１／Ｃβ；そして図２に示されたＶ−Ｊ連結配列をもつ Ｖα２１／Ｊα４２／Ｃαおよび図２に示されたＶ−Ｄ−Ｊ連結配列をもつＶβ ７．３／Ｄβ２．１／Ｊβ２．７／Ｃβ２を含む群から選択される、α鎖をコー ドする核酸配列とβ鎖をコードする核酸配列。 １２．請求項５−１１の核酸のいずれか１つにより産生された、組換えタンパ ク質。 １３．請求項１２のタンパク質に反応性である抗体。 １４．請求項５−１１の少なくともいずれか１つからなる核酸を含む発現ベク ター。 １５．Ｔ細胞受容体のα鎖およびβ鎖の両方に対する核酸配列を含む発現ベク ター。 １６．請求項１４の発現ベクターを含む宿主細胞。 １７．請求項１５の発現ベクターを含む宿主細胞。 １８．宿主細胞がＴリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球あるいは造血幹細 胞からなる群から選択される、請求項１６の宿主細胞。 １９．宿主がＴリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球あるいは造血幹細胞か らなる群から選択される、請求項１７の宿主。 ２０．請求項１６の細胞と医薬的に有効な担体とからなる、薬剤組成物。 ２１．請求項１７の細胞と医薬的に有効な担体とからなる、薬剤組成物。 ２２．請求項１４の組換え発現ベクターと医薬的に有効な担体からなる、薬剤 組成物。 ２３．請求項１５の組換え発現ベクターと医薬的に効果的な担体からなる、薬 剤組成物。 ２４．有効量の請求項１、２０、２１、２２あるいは２３の組成物を哺乳類に 投与することを含む、哺乳類においてガンを予防しあるいは治療する方法。 ２５．ガンが肺ガン、黒色腫、卵巣ガン。結腸ガン、脳腫瘍あるいは腎臓ガン からなる群から選択される、請求項２４の方法。 ２６．ガンが黒色腫あるいは卵巣ガンである請求項２５の方法。 ２７．Ｔ細胞から得られたＣＤ２８の細胞内領域あるいは共刺激のシグナルを 提供することができる同様な領域と連結された抗体の可変領域を含む、キメラ受 容体をコードする核酸配列。 ２８．請求項２７の核酸配列により少なくとも一部分がコードされる、組換え タンパク質。 ２９．請求項２６の核酸を少なくとも一部分含む、発現ベクター。 ３０．請求項２９による発現ベクターを含む宿主細胞。 ３１．請求項２９の発現ベクターと医薬的に許容される担体とからなる、薬剤 組成物。 ３２．請求項３０の宿主細胞と医薬的な担体とからなる、薬剤組成物。 ３３．特異的抗体の一本鎖Ｆｖ部位および免疫細胞の少なくとも膜貫通領域と 細胞内領域とをコードする第２セグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）から構成されるキ メラ受容体をコードする核酸配列の少なくとも一部を含む発現ベクターを含む造 血幹細胞。 ３４．請求項３３の細胞と医薬的に許容される担体とからなる薬剤組成物。 ３５．治療有効量の請求項３１、３２、３３あるいは３４の組成物を哺乳類に 投与することを含む、哺乳類においてガンを予防しあるいは治療する方法。 ３６．ｎは１−５であり、またＸａａは任意のアミノ酸でありうる、システイ ン−Ｘａａ_nからなるカルボキシ末端を有する核酸配列をもつ可変領域と、図１ Ａ-１Ｂ、図２に示されたＪα配列および／または実質上それらと相同の配列か らなる群から選択されたアミノ酸配列をもつ連結領域とを含む、少なくとも可変 領域と連結領域とを含むＴ細胞受容体のα鎖。 ３７．少なくとも、ｎはおよそ１−５であり、またＸａａは任意のアミノ酸で あり得る、システイン−Ｘａａ_nのカルボキシ末端を有する可変領域の少なくと も一部と、図１Ａ−１Ｂそして図２に示されたＪβ配列および実質上それらと相 同の配列の群から選択されたアミノ酸配列をもつＪ領域とからなる、Ｔ細胞受容 体のβ鎖。 ３８．図１Ａに示されたＶ−Ｊ連結配列をもつＶα８．２／Ｊα４９／Ｃα鎖 および図１Ａに示されたＶ−Ｄ−Ｊ連結配列をもつＶβ１３．６／Ｄβ１．１／ Ｊβ１．５／Ｃβ１；図１Ｂに示されたＶ−Ｊ連結配列をもつＶα１７／Ｊα４ ２／Ｃαおよび図１Ｂに示されたＶ−Ｄ−Ｊ連結配列をもつＶβ６．５／Ｄβ． １／Ｊβ．５／Ｃβ；図１Ｂに示されたＶ−Ｊ連結配列をもつＶα９／Ｊα１６ ／Ｃαおよび図１Ｂに示されたＶ−Ｊ−Ｊ連結配列をもつＶβ２２．１／Ｄβ２ ．１／Ｊβ２．１／Ｃβ２；図１Ｂに示されたＶ−Ｊ連結配列をもつＶα１／Ｊ α４９／Ｃα；そして図１Ｂに示されたＶ−Ｄ−Ｊ連結配列をもつＶβ７．３／ Ｄβ２．６／Ｊβ２．１／Ｃβ２；図２に示されたＶ−Ｊ連結配列をもつＶα２ ５／Ｊα５４／Ｃαおよび図２に示されたＶ−Ｊ−Ｊ連結配列をもつＶβ３．１ ／Ｄβ１．１／Ｊβ１．１／Ｃβ；そして図２に示されたＶ−Ｊ連結配列をもつ Ｖα２１／Ｊα４２／Ｃαおよび図２に示されたＶ−Ｄ−Ｊ連結配列をもつＶβ ７．３／Ｄβ２．１／Ｊβ２．７／Ｃβ２を含む群から選択される、α鎖および β鎖を含む分離されたＴ細胞受容体。 ３９．黒色腫を予防しあるいは治療するための医薬製造における、請求項１− ５のＴ細胞受容体の使用。 ４０．黒色腫を予防しあるいは治療するための医薬製造における、請求項５− １１の核酸配列の使用。 ４１．黒色腫を予防しあるいは治療するための医薬製造における、請求項１４ −１５の発現ベクターの使用。 ４２．黒色腫を予防しあるいは治療するための医薬製造における、請求項２７ の核酸配列の使用。 ４３．哺乳類においてガンを予防しあるいは治療するための医薬製造における 、請求項２９の組換え発現ベクターの使用。 ４４．哺乳類においてガンを予防しあるいは治療するための医薬製造における 、請求項３３の造血幹細胞の使用。 ４５．哺乳類においてガンを予防しあるいは治療するための医薬製造における 、請求項３６−３９のタンパク質の使用。