JPH11501927A - ポリヌクレオチド架橋剤としての非ヌクレオシドクマリン誘導体 - Google Patents
ポリヌクレオチド架橋剤としての非ヌクレオシドクマリン誘導体Info
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Abstract
(57)【要約】
非ヌクレオシド主鎖成分に連結されるクマリン成分を含んで成る新規のクマリン誘導体が開示される。その得られる分子は、典型的には、核酸ハイブリダイゼーション反応を包含する工程に使用されるプローブに存在する1又は複数の相補的ヌクレオシド塩基のための置換体としてポリヌクレオチド中に組込まれる場合、光活性架橋基として使用される。
Description
【発明の詳細な説明】
ポリヌクレオチド架橋剤としての非ヌクレオシドクマリン誘導体
技術分野
本発明は、相補的な標的核酸配列の架橋への使用のための、自動化された DNA
合成の間、合成オリゴヌクレオチド中に組込まれ得る光活性ヌクレオシド類似体
に関する。
背景
標的配列に架橋する、核酸ハイブリダイゼーションアッセイへの架橋可能なプ
ローブの使用は、K.Yabusakiなどによりアメリカ特許第 4,826,967号に示されて
おり;化合物は、存在するポリヌクレオチドに結合される(通常、アダクト形成
を通して)フロクマリン(又はソラレン)に基づいており、そして多くの用途の
ために満足するものである。しかしながら、架橋基/ヌクレオシドアダクトは、
特に多量に合成することが困難である。アメリカ特許第 5,082,934号において、
Sabaなどは、介在塩基成分の不在下でリボース又はデオキシリボース糖成分の1
位にそのフェニル環を通して連結されたクマリン成分を含んで成る光活性化可能
なヌクレオシド類似体を記載する。その得られるヌクレオシド類似体は、ハイブ
リダイゼーションアッセイに使用されるプローブに存在する1又は複数の相補的
ヌクレオシド塩基のための置換体としてポリヌクレオチド中に挿入される場合、
光架橋基として使用される。
それにもかかわらず、追加の利点、たとえばプローブ合成及び使用を通しての
安定性、及び構造の柔軟性を付与する新規タイプの化合物が、所望し続けられて
いる。
発明の要約
本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ及び治療用途において光−架
橋試薬として使用され得る、安定した光活性非ヌクレオシド化合物、及び最終生
成物を調製するために使用され得る技法及び中間体を提供する。
前記化合物は、、ヒドロキシ又はポリヒドロキシ炭化水素分子、たとえばグリ
セロール分子の末端ヒドロキシ基の1つに、クマリン分子又は誘導体のフェニル
環を連結することによって調製されるクマリニル誘導体を含んで成る。その得ら
れる化合物の(ポリ)ヒドロキシ炭化水素成分は、ヌクレオシドの糖と同等であ
り、他方クマリン成分は、塩基の位置を占める。従って、前記化合物は、ポリヌ
クレオチド合成の自動化された(又は手動)技法を用いての成長するポリヌクレ
オチド鎖に挿入され得る。クマリン環系の3及び4位間の二重結合は、この非ヌ
クレオシド類似体(“プローブ”)を含むオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼ
ーションアッセイ及び/又は治療用途に使用される場合、相補的鎖におけるヌク
レオシドに共有結合する光活性基である。
多くの場合、光活性化合物は、下記式:
〔式中、置換基及び結合基は下記により詳細に記載されている〕を有する。
(ポリ)ヒドロキシ炭化水素主鎖は、それらが配置されるオリゴ糖構造体に最
大の柔軟性及び安定性、並びに水性及び有機媒体において良好な溶解性を付与す
る。
特定態様の記載
本発明は、ハイブリダイゼーションアッセイ及び/又は治療用途に使用される
オリゴヌクレオチドプローブにおいて光活性化可能な非ヌクレオシド架橋剤とし
て使用され得る架橋可能な化合物を提供する。ハイブリダイゼーションアッセイ
においては、本発明の化合物は、サンプルにおける特定の DNA及び RNA塩基配列
の存在又は不在を決定するために合成 DNA又は RNAオリゴヌクレオチドの部分と
して典型的には使用される。より特定には、本発明は、ハイブリダイゼーション
アッセイにおいて光活性架橋化合物として作用する、安定して、柔軟な(ポリ)
ヒドロキシ炭化水素主鎖に結合したクマリン誘導体を提供する。
本発明の化合物は、下記一般式:
主鎖成分−結合成分−架橋成分
を有する。
本明細書における“成分”とは、指摘される機能を行なう分子の一部を示す。
与えられた成分は通常、複数の分子を一緒に共有結合することによって他の分子
から誘導され、そして元の分子の同定できる残存物が“成分”として言及される
。たとえば、ソラレン(psoralen)分子が二価リンカー、たとえばメチレン基に
よりグリセリン分子に結合される場合、その得られる単一の分子はグリセリン、
メチレン及びソラレン成分から形成されたものとして言及される。しかしながら
、前記3種の成分は実際、下記で論ぜられるように、3種の別々の分子から生じ
る必要はない。従って“誘導される”とは、理論的な、及び実際的な前駆体を意
味することができる。
架橋成分は、融合ベンゾピロン構造を有する分子、たとえば次のものから誘導
されるであろう:(1)クマリン及びその単純な誘導体;(2)ソラレン及びそ
の誘導体、たとえば8−メトキシソラレ
ン又は5−メトキシソラレン(少なくとも40の他の天然に存在するソラレンが
文献に記載されており、そして本発明の実施において有用である);(3)シス
−ベンゾジピロン及びその誘導体;(4)トランス−ベンゾジピロン;及び(5
)融合クマリン−シノリン環系。それらの分子のすべては、標的鎖におけるヌク
レオチドと架橋するために正しい配向で且つ正しい距離で位置するのに必要な架
橋基(活性化された二重結合)を含む。それらの分子のすべてはクマリン誘導体
であり、ここですべては、基本的なクマリン(ベンゾピロン)環系を含み、その
上に分子の他の部分が位置する。
結合成分は、他の成分をお互いに結合するために2つの位置で官能基を有する
、1〜100、好ましくは1〜25、より好ましくは1〜10個の原子の前駆体から通
常、形成されるであろう。結合成分を形成するための前駆体の反応の後、クマリ
ン環系と主鎖成分(糖置換体)との間の最も短い原子の結合鎖における原子の合
計数は、一般的に1〜15、好ましくは1〜7、より好ましくは1〜3である。他
方では、前記構造体のこの部分は、それが架橋成分から主鎖成分へのまさに柔軟
な結合であるように、広く変化することができる。
結合成分は、しばしば、一端で架橋分子及び他端で主鎖を結合するための適切
な官能基を担持する分子(通常、その末端で)の反応により誘導される安定した
環状又は非環式成分である。しかしながら、十分な官能基が主鎖及び架橋成分に
存在する場合、結合成分への前駆体は使用される必要はない(すなわち、主鎖及
び架橋成分は共有結合により連結され得る)。
上記で同定された分子の特定成分に属するものとしての最終分子の特定部分の
記載は、多少任意であり、そして最終生成物を形成するために反応した3種の元
の成分が存在することを必ずしも意味しないことが理解されるべきである。わず
か2種の出発材料から生成
物を形成するために主鎖成分前駆体上の官能基と反応することができる、クマリ
ン環に結合される官能化されたメチル又はメトキシ基を有する多くのクマリン誘
導体が存在する。しかしながら、その得られる構造体は一般的に、上記で示され
たような次の3種の部分を有するように見えるであろう:ポリヌクレオチドの糖
主鎖中に組込まれる主鎖分子、通常のヌクレオシドにおける塩基により占有され
る空間を占有する架橋成分、及び2つの主要部分を一緒に連結する原子(すなわ
ち、連結成分)。便宜上、結合成分は、結合点での架橋成分の環原子と、糖分子
を置換する成分中の主鎖構造の一部を明らかに形成する最後の炭素原子との間の
原子、通常、架橋成分に最も近いヒドロキシル基(又はヒドロキシル基の反応生
成物)を担持する炭素原子から成ると思われる。
主鎖成分は、いわゆる、それは究極的には、ポリヌクレオチドの主鎖のリボー
ス又はデオキシリボース部分の代わりに機能するので、一般的には、異なったsp3
−ハイブリダイズした炭素原子に結合される1〜3個(時々、それ以上)のヒ
ドロキシル基(又は下記で論ぜられるような類似の官能基)を有するであろう。
主鎖成分は一般的には荷電されておらず、従って、それが最終の変性されたヌク
レオチドにおいてリボース又はデオキシリボースのための置換体として機能する
ことができる。主鎖成分は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定され
ない:(1)−OH,−NH2, −SH,−COOH、酸ハロゲン化物及び酸無水物から
成る群から選択された適切な官能基を有する長い炭化水素鎖又は線状炭化水素成
分、たとえば3−炭素プロパン単位、及び(2)1〜3個のヒドロキシル基又は
上記(1)におけるような他の官能基を担持する5−〜7−員の炭素環構造を典
型的には有する環状炭化水素成分。官能基は、前述におけるように未反応形で示
され、そして多くの態様において指摘され
た官能基の誘導体として存在するであろう。上記の反応性官能基(−OH及び−SH
以外)は一般的に、中間体においてのみ存在するが、しかしながら、他の官能基
との反応の後、それらは安定した基になり、又は分子の他の部分に対して共有結
合を形成する。
上記の基本構造の他に、1又は複数のカップリング成分が、存在し又は成長す
るポリヌクレオチド鎖への結合の形成を促進するために主鎖成分に結合され得る
。カップリング成分は典型的には、問題の分子がプローブ分子の調製に使用され
る中間体である場合、溶液又は固相核酸合成に使用される、ヒドロキシルカップ
リング及び/又は保護基を含んで成る。典型的なカップリング基は、ホスホラミ
ジット、ホスホネート、H−ホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホ
ネート、トリチル、ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル及びピクシル基
を包含する。非リンカップリング基は、カルバメート、アミド、及びヘテロ原子
置換基、たとえば−COCH3, −CH2OH, −CF3, −NHCH3及びPO2CH2CH3を有
する分子に典型的には連結する線状及び環状炭化水素基を包含する。そのような
化学のレビューのためには、“Oligonucleotide Synthesis,A Practical Appro
ach,”M.J.Gait,ed.,IRL Press Ltd.,Oxford,Great Britain,1984(引用に
より本明細書に組込まれる)を参照のこと。
本発明の好ましい化合物は、下記式(I):
〔式中、
Bは、(1)2〜15個、好ましくは3〜10個、より好ましくは3
〜6個の炭素原子、及び環状の場合、5−又は6−員環を含む、線状、枝分れし
た、又は環状の炭化水素基、あるいは(2)5−又は6−員環を含んで成る複素
環式芳香族環システムを表わし、B(1)及びB(2)の両者は、式 OR1で表わ
される1,2又は3個の基により置換され得;
Xは、(1)1〜15個、好ましくは2〜10個、より好ましくは3〜6個の炭素
原子を含む線状、枝分れした又は環状の炭化水素基、あるいは(2)前記炭化水
素基の1〜3個(好ましくは1個)の炭素原子が酸素、硫黄又は窒素原子により
置換されており、そしてXに結合した前記式の他の部分における原子間のX中の
原子の最とも短い結合鎖が1〜10個の原子であるようなX(1)基を表わし、こ
こで前記Xは、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、アジド、カルボキシ、
カルボニル、ニトロ、チオ、ペルフルオロメチル及びシアノ官能基から成る群か
ら選択された1〜3個の置換基により任意に置換され得;
nは0,1,2又は3であり;
個々のWは、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、アジド、ニトロ、チオ
、カルボキシ、カルボニル、ペルフルオロメチル又はシアノ官能基;10又はそれ
よりも少ない炭素原子、好ましくは6又はそれよりも少ない炭素原子、より好ま
しくは3又はそれよりも少ない炭素原子の置換されていないヒドロカルビル基;
又は1〜3個の前記官能基により置換されているか又は1つの炭素原子が酸素、
硫黄又は窒素原子により置換されているようなヒドロカルビル基を独立して表わ
し;
但し、(1)X又はWが置換された炭化水素である場合、X又はWにおける置
換基の合計数がX又はWにおける炭素原子の合計数よりも少なく、そして1つ以
下の置換基又はヘテロ原子が所定の炭素
に結合されており、但し、前記置換基は前記所定の炭素上のハロゲン原子ではな
く;(2)すべてのW置換基における合計の炭素原子が15又はそれよりも少なく
、好ましくは10又はそれよりも少なく、より好ましくは6又はそれよりも少なく
;そして(3)2つのWが、それらが結合される残りの原子と一緒になって、環
を一緒に形成でき(たとえば、、ソラレンにおけるように);
Y及びZは、H,F又は低級アルキル(通常、5又はそれよりも少ない炭素、
好ましくは3又はそれよりも少ない炭素)を独立して表わし;そして
個々のR1は、H,F、又はポリヌクレオチドの合成の間、ヒドロキシ基を保
護し又はカップリングすることができるヒドロキシ−保護又はヒドロキシカップ
リング基を独立して表わし、又は1又は2個(好ましくは2個)のR1はヌクレ
オチド、又は化合物に結合されるポリヌクレオチドを表わす〕を有する。
B−X結合を架橋する官能基(たとえばエーテル又はカルボキシレート)の酸
素原子又は他の非−C原子(存在するなら)がBの前駆体におけるヒドロキシル
基から生じるが、しかしとくにことわらない限り、この及び次の式におけるXリ
ンカー(種々の基を容易に定義するために)の一部と思われる。
上記一般式I内の一定の化合物が好ましい。分子の最とも重要な部分(少なく
とも、それらの化合物とこれまで知られているものとの間の差異の観点から)は
、B又は主鎖成分である。好ましいB成分は、次の第1の副一般式の基:
次の第3の副一般式の基:
に属し、ここで、
sは2又は3であり;
Rx,Ry,及びRzは独立して、H又は OR1を表わし;
m,n,p,q及びrは独立して、0又は1であり;
前記副一般式の1つの水素がX基への共有結合により置換され;
そして
化合物の式のすべての他の置換基及び定義は、一般式Iについて前で定義され
た通りである。
X基への共有結合により置換される、副一般式の水素原子は通常、ヒドロキシ
ル基の水素である(すなわち、少なくとも1つの OR1は、そのような前駆体分子
におけるヒドロキシル基を表わす)。しかしながら、この選択は、得られるB−
X結合は(ポリ)ヒドロキシ炭化水素前駆体(これらの多くは市販されている)
から容易に調製され得るので、合成のみの便利さのためである。他の水素は、所
望により、指摘される共有結合により置換され得る。合成に使用される実際の分
子は、ヒドロキシル基の1つが、しばしば一連の反応を通して官能基により置換
されている(ポリ)ヒドロキシ化合物から、しばしば誘導される。たとえば、ヒ
ドロキシル基はハロゲン原子又は他の脱離基により置換され得、そして前記脱離
基はX基の前駆体における電子供与基による結合形成に関与することができる。
Bが飽和炭化水素から形成される化合物が好ましいが、但し不飽和化合物(環
状芳香族を含む)も許容される。不飽和化合物(芳香
族を含む)においては、−OR1置換基は好ましくは、sp2−ハイブリダイズされた
炭素に直接的に結合されないが、しかし個々のZがH又はアルキル基を表わす−
CZ2OR1におけるように、介在sp3炭素に結合される。
Bが第3の副一般式を有する式Iの化合物、特にm+n+p+q+rが0,1
又は2である化合物が、3種の副一般式の間で好ましい。さらにより好ましくは
、第3の副一般式のそれらの化合物は、非環式飽和二又は三ヒドロキシ炭化水素
、特にグリセロール及び指摘されたヒドロキシ基から最とも遠いそれらの末端位
置でX基に結合される、3〜5個の炭素の1,2−又は1,3−ジヒドロキシア
ルカン、たとえば4,5−ジヒドロキシペンチル、3,5−ジヒドロキシペンチ
ル、2,4−ジヒドロキシ−2−メチルブチル、3−ヒドロキシ−2−(ヒドロ
キシメチル)プロピル及び2,3−ジヒドロキシプロピルを表わす。
すでに指摘されたように、そのような化合物は好ましくはないが、芳香族環系
はB成分に存在することができる。それらは、炭化水素及び複素環式芳香族環系
の両者を包含する。Bがベンゼン又はナフタレン環系を含んで成るそれらの化合
物のうち、特に1,2−ジ(ヒドロキシメチル)−置換された芳香族炭化水素が
好ましい。Bが複素環式環系、たとえばフラン、ピラン、ピロール、ピラゾール
、イミダゾール、ピペリジン、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピラジジン、
チオフェン、アクリジン、インドール、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、
キノキサリン、キサンテン又は1,2−ベンゾピラン環システムを含んで成る場
合、前記同じ置換基が好ましい。
Bが架橋された炭化水素環系、たとえばビシクロ〔3.1.0〕ヘキサン又は
〔2.2.1〕ヘプタン環系を含んで成る化合物もま
た、好ましいものではないが、しかし本発明の範囲内である。それらの分子は、
種々のシス及びトランス置換パターンが容易に調製され、そして維持され得るよ
う、減じられた移動性を有する形状を有する。たとえば、Ferguson,“Organic
Molecular Structure,”Willard Grant,Boston,1975、チャプター17−19を、
この化学及び合成技法のレビューのためには参照のこと。同様の態様において、
Bがスピロ又はジスピロ炭化水素環システムを含んで成る化合物もまた、本発明
の範囲内にある。
前で指摘したように、X結合基は、それが主鎖構造体の残り又はポリヌクレオ
チドの相補的鎖のいづれかと相互作用する分子の部分に存在しないので、構造的
に特別に制限されない。しかしながら、2種の可能な配向でXを表わすことがで
きる次の基のような分子のこの部分のための好ましい構造体が存在する:
又はBrを表わし、そしてnは0,1又は2である)。
他の(しかし低い)好ましい化合物は、Xが5−もしくは6−員炭素又は複素
環式環(後者は1つのO,S又はN原子を含む)を有する環状構造体、たとえば
シクロペンタン、シクロヘキセン、ジヒドロフラン、ピロール又はピリジンを含
んで成るものである。
架橋成分において、Y及びZは一般的に、5又はそれよりも少ない炭素、好ま
しくは3又はそれよりも少ない炭素を有し、そして最とも好ましくは、それらが
アルキル基である場合、メチルである。W,Y及びZがすべて水素である化合物
は、Wが前記一般式のフェニル環に融合されるピロン又はフラン環である化合物
と同様に好ま
しい。それらの後者の化合物は好ましくは、一般式Iにおける右側の式のすべて
がクマリン、ソラレン、シス−ベンゾジピロン、又はトランス−ベンゾジピロン
又はその誘導体を表わす化合物である。
ヌクレオチド又はポリヌクレオチドが前記化合物に連結されている式Iの化合
物は通常(但し、常にではない)、リン含有結合基を通して連結される。好まし
いリン含有結合基及び他の結合基は他の部分で論ぜられる。そのような化合物は
、それらが本発明の主要な最終用途であるアッセイ及び架橋工程に直接的に使用
され得るので、本発明の好ましい化合物である。それらの化合物は式(Nm1Qm4
Nm2)m3を有し、ここでm1及びm2は通常 200以下、好ましくは 100以下の整
数であり;m1及びm2の1つは通常、少なくとも14、好ましくは17、最とも好
ましくは少なくとも20であり;m3は1〜10、好ましくは1〜5の整数であり(
m3は一般的には(m1+m2)/10よりも少なく);個々のNは独立して、所
望のポリヌクレオチド配列のヌクレオチドを表わし;Qは正常なポリヌクレオチ
ド配列中に組込まれる本発明のヌクレオチド置換分子を表わし;そしてm4は1
〜5、好ましくは1〜3である。ハイブリッドを安定性にするヌクレオチドの中
断されていない配列が存在する限り、ポリヌクレオチド配列における少数(通常
1又は2個)の正常な塩基によりお互い分離される複数のQ成分を有することも
また可能である。そのような配列は、中断されていないQ配列に等しいものと思
われる。中断されていない正常なヌクレオチド配列の好ましい長さは、m1及び
m2について上記で示される通りである。
Qは、ポリヌクレオチドの内部に又はその末端位置の1つで存在することがで
きる。内部位置においては、少なくとも2つのR1基が2つの別々の鎖の末端へ
のQ分子の連結を可能にするために存在すべきであり;Qが末端位置で挿入され
る場合、わずか1つのR1
が必要とされる。
それらの式においては、個々のNm1Qm4Nm2はm3が1よりも大きいポリヌク
レオチド配列においてお互い異なることができ、すなわち複数のQ成分は、上記
の残るパラメーターが包含される条件下で、分子の長さにそってランダムに存在
することができることが認識されるべきである。
好ましいポリヌクレオチドの1つのグループは、分子のいづれかの又は両端で
存在する1〜5のQ成分(好ましくは1〜3のQ成分)を有する中断されていな
い正常な塩基の長い配列を有する。指摘されたように、Q成分は、連続的である
ことができ、又は数個の正常なヌクレオチドにより中断され得る。プローブの中
間における複数のQ成分(連続的であるか又は連続的でない)はまた、架橋Q単
位のいづれかの側に比較的長い中断されていない配列を有する好ましい態様を表
わす。
すべての好ましい態様においては、その対応する標的ヌクレオチドに対して相
補的である、ヌクレオチドの少なくとも1つの中断されていない配列が存在する
。この中断されていない配列は、標的の正しい認識が生じるようにハイブリダイ
ゼーション工程の間、安定性を付与する。安定性及び選択性を導びく要因は、い
づれか他のハイブリダイゼーション工程におけるのと同じように本発明の工程に
おいて存在する。相補的ヌクレオチドの中断されていない配列、続くQ成分は、
標的ヌクレオチドの中断されていない配列、続く非相補的な正常な塩基とは差異
はない。従って、本発明の架橋成分を含むポリヌクレオチドの安定性は、標準の
核酸ハイブリダイゼーションを考慮して容易に予測され得る。
2つのR1基がB成分に存在し、そしてそれらの両者が異なったヒドロキシル
−カップリング基又はヒドロキシル−保護基を示す化
合物はまた、そのような化合物が架橋できるポリヌクレオチドの合成に容易に使
用され得るので、好ましい。それらの保護及び活性化基はまた、本明細書の他の
部分においても論じられている。
本発明の化合物のもう1つの特に好ましいグループは下記一般式IIを有する(
それらの多くは、一般式Iの範囲内の化合物であり、そして好ましい態様である
):
〔式中、
n1は0〜10(好ましくは0〜5、より好ましくは1〜3)であり;
n2は0〜5(好ましくは0〜2、より好ましくは0又は1)であり;
n3は0〜5(好ましくは0〜2、より好ましくは0又は1)であり;
個々のWは独立して、15個までの原子を含む小さな安定置換基(特に、低級ヒ
ドロカルビル基;ハロゲン、ニトロ、チオ、シアノ、カルボニル、カルボキシ、
ヒドロキシ、アミノ、アミド、又はポリフルオロアルキル基;又は1又はそれ以
上のヘテロ原子(すなわち水において25℃で炭素と安定した共有結合を形成する
炭素又は水素以外の原子)を含むヒドロカルビル置換基)であり;
Y及びZは独立して、H,F又は低級アルキル基を表わし;
Xは(a)1〜10個の炭素原子及び(b)0〜10個、好ましくは0〜2個の、
O,S及びNから成る群から選択されたヘテロ原子を含む有機基であり、そして
Xはそれが結合される前記一般式の他の
原子間に1〜10個の原子の最も短い結合鎖を含んで成り;
R2はH又は OR1であり;そして
R1は、H、又は自動化されたポリヌクレオチド合成の間、ヒドロキシル基と
カップリングし、又はその基を保護することができる(前者は、好ましくは、主
鎖成分の末端ヒドロキシル上にのみ位置する)基である〕。あるいは、R1はホ
スホジエステル結合、又はポリヌクレオチドにおける糖を結合するために使用さ
れる他の典型的な基により化合物に連結されるヌクレオチド又はポリヌクレオチ
ドを表わす。好ましいカップリング基は、リン含有基、たとえばホスフィット、
ホスホラミジット、ホスフェート、H−ホスホネート、ホスホロチオエート、ホ
スホロジチオエート及びメチルホスホネートを包含する。非リン含有基は、カル
バメート及びアミドを包含する。低級炭化水素基は、C1−C6アルキル及びアル
ケニル基、並びにC3−C6環状基を包含し、そして好ましくは、C1−C4アルキ
ル及びアルケニル基、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、
イソブチル、sec−ブチル、及びtert−ブチルを包含する。ヘテロ原子置換基を
有する典型的なヒドロカルビル基は、−COCH3, −CH2OH, −CF3, −NHCH3
, −CO2CH2CH3及び−CON(CH3)2を含む。
本発明の化合物は、たとえばハイブリダイゼーションアッセイにおいてプロー
ブとして使用される光活性ポリヌクレオチドの調製における中間体として又は成
分として有用である。本発明は1又は複数のそれらの分子がポリヌクレオチドの
一部を実質的に形成することであるので、前記分子の一部を形成する主鎖成分は
、グリセリン又はほとんどの場合、異なったポリヒドロキシル炭化水素分子のい
づれかに由来する。グリセリル又は他のポリヒドロキシル炭化水素成分は、分子
における隣接するヌクレオチドの3′及び/又は5′
ヒドロキシル基を有するホスホジエステル型結合により典型的には核酸の主鎖中
にいづれかの位置で組込まれ、そして架橋成分は通常、そのような組込みの前、
主鎖成分に結合されている。
本発明の化合物の架橋成分部分は、クマリン自体又はいづれかの多くの置換さ
れたクマリンから誘導され得る。グリセリン又は他の主鎖成分が結合されるであ
ろう架橋成分前駆体におけるその位置での有機官能基は、典型的には、最終生成
物における主鎖成分に架橋成分を連結するために使用される。最終生成物はしば
しば、他の合成路により調製され得るので、いずれかの与えられた最終生成物は
、いくつかの可能な前駆体をたぶん有するであろう。結合成分は、別の分子から
生ぜしめられ、又は架橋成分前駆体及び主鎖成分前駆体の反応部分により形成さ
れ得る。
結合位置以外の位置で、クマリン(又は他の)環系は、置換されなくても又は
置換されても良い。フェニル環上での典型的な置換基は、有機化合物における芳
香族環上に通常見出される小さな安定した置換基である。置換基は、所望には、
クマリンの励起波長を変えるよう選択され得る。3−及び4−位での置換基は典
型的には非極性であり、そして最ともしばしばには、炭化水素置換基であり、そ
してメチル置換基が最とも通常である。クマリン置換基の位置は多種であり得る
が、置換基は最ともしばしばには、4−,5−,6−,7−及び8−位で見出さ
れる。
一定の好ましい態様において、クマリン成分前駆体は、主鎖成分前駆体との反
応の前、下記一般式:
〔式中、
Y,Z,n2,M及びWは上記で定義された通りであり;そして
X1はX結合成分のすべて又は一部の前駆体である〕を有するであろう。X1は
、共有結合を形成するためにリンカー成分の前駆体上の有機官能基と反応するで
あろう。典型的な反応性官能基は、ヒドロキシ、アミン、ハロゲン、チオ、カル
ボニル、カルボキシエステル、カルボキシアミド、シリル及びビニル基を包含す
る。それらの前駆体は、クマリン自体から又は多くの市販のクマリン誘導体から
、有機合成の標準方法により合成され得る。
一定の好ましい態様において、グリセロール主鎖成分前駆体は、下記一般式:
〔式中、
R1,R2、及びn1及びn3は、上記で定義された通りであり、そして
X2はX結合基のすべて又は一部の前駆体である〕を有する。X2は典型的には
、反応性官能基、及び求核又は求電子置換又は付加を受けることができる求核及
び求電子基から選択されるであろう。特定の官能基の例は、ヒドロキシ、アミノ
、ハロゲン、チオ、カルボニル、カルボキシエステル、カルボキシアミド、ビニ
ル及び珪素誘導体を包含する。この前駆体は、(ポリ)ヒドロキシ炭化水素、た
とえばグリセリン、市販の1,2−もしくは1,3−ジヒドロキシアルケン誘導
体、又は指摘されたヒドロキシル基の位置で保護されたヒドロキシル基を有する
そのような化合物から、有機合成の標準方法により合成され得る。ポリヌクレオ
チド合成に使用される塩基に本発明の主鎖成分の構造に類似する構造を有する成
分を結合す
る論議のためには、Misiura,K.,Durrant,I.,Evans,M.R.,and Gait,M.J.
,Nucleic Acids Res.(1990)18,4345-4354(引用により本明細書に組込まれ
る)を参照のこと。
本発明の化合物は、本明細書に概略されているガイドラインを用いて、合成有
機化学の標準技法により調製され得る。たとえば、市販の出発材料に基づく典型
的な合成は、次の反応スキームに示される。
典型的な合成のための反応スキーム
試薬:
(a)水素化ナトリウム(NaH)/CH3-O-CH2CH2-O-CH3
(b)7−ブロモメチルクマリン
(c)HCl(水性)、THF(テトラヒドロフラン)
(d)DMTrCl(4,4′−ジメトキシトリチルクロリド)、ピリジン
(e)CIPN(ipr)2OCH2CH2CN,CH2CH2N(ipr)2,CH2Cl2
例1
7−クマリニルメチルソルケタール
エチレングリコールジメチルエーテル 120gに、ソルケタール(2.64g、19.0
mモル)及び水素化ナトリウム(0.88g、22.0mモル、鉱油中、60%)を添加し
た。その得られる懸濁液に、7−ブロモメチルクマリン(4.8g、19.0mモル)
を少しづつ、7分間にわたって添加した。15分後、氷酢酸 1.5mlを添加し、反応
を停止した。次に、固形物を、遠心分離により前記懸濁液から分離した。次に、
その溶液を固体に濃縮した。次に、その固体を、溶離剤として97:3のクロロホ
ルム:酢酸エチル溶液を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。
生成物を含む画分を TLCにより同定し、そして組合し、そして真空下で白色固体
に濃縮した。収量=630mg;融点=75〜80℃;Rf2=0.55(9:1のCHCl3/酢酸
エチル中において)。
例2
1−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−3−O−(7−クマニルメチル )グリセロール
7−クマリニルメチルソルケタール(800mg、2.74mモル)を、テトラヒドロフ
ラン(12ml)及び塩酸(6ml)の溶液に20分間、溶解した。次に、前記溶液を、
油状物を得るために無水エタノール(2×5ml)と共に同時蒸発することにより
乾燥せしめた。その得られる溶液を25mlの飽和炭酸ナトリウム溶液により洗浄し
、そして3×25mlのジエチルエーテルにより抽出した。その溶液を真空下で油状
物に濃縮した。その油状物をピリジン(2×5ml)と共に同時蒸発
することにより乾燥せしめ、乾燥生成物を得た。前記液体に、ピリジン(30ml)
、4−ジメチルアミノピリジン(25ml)及びトリエチルアミン(200μl)を添加
した。その得られる溶液に、4,4′−ジメトキシトリチルクロリド(905mg、2
.95mモル)を添加した。その反応混合物を2時間撹拌した。水37.5mlを添加し
、反応を停止し、そしてその得られる溶液を2×180ml のジエチルエーテルによ
り抽出した。組合されたエーテル抽出物を真空下で濃縮し、15mlの塩化メチレン
に溶解し、そして溶離溶媒として4:6のアセトン:ヘキサン溶液を用いてシリ
カゲルクロマトグラフィーにより精製した。Rf=0.5 を有する画分を集め、そし
て蒸発乾燥せしめ、生成物(770mg、55%の収率)を得た。
例3
1−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−3−O−(7−クマリニルメチ ル)−2−O−〔(N,N−ジイソプロピル)(2−シアノエチル)ホスホラミ ジット)〕−グリセロール
1−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−3−O−(7−クマリニルメチ
ル)グリセロール(1.20g、2.18mモル)を、2×6.5ml の混合溶液(5mlのピ
リジン及び 1.5mlの塩化メチレン)と共に2度、同時蒸発せしめた。その乾燥反
応体に、塩化メチレン(4.6ml)及びジイソプロピルエチルアミン(1.87ml、8.5
9mモル)を添加した。その懸濁液を、透明な溶液になるまで撹拌した。次に、
2−シアノエチルN,N−ジイソプロピルクロロホスホラミジット(0.62ml、3.
24mモル)を前記溶液に添加した。次に、反応混合物を45mlの酢酸エチル及び 7
.2mlのトリエチルアミンにより希釈し、10%水性炭酸ナトリウム(2×30ml)、
飽和炭酸ナトリウム(2×30ml)及び飽和塩化ナトリウム(2×30ml)により抽
出した。有機性を真空下で濃縮した。得られる生成物を、溶媒システム(塩化メ
チ
レン/ジエチルエーテル/トリエチルアミン 90:7.5 :1)を用いてシリカゲ
ルクロマトグラフィーにより精製した。Rf=0.73を有する画分を集めた。収穫物
を真空下で固形物に濃縮した。収量は1.06g(1.41mモル、64%)であった。
例4
非ヌクレオシドクマリン官能基を含むオリゴデオキシヌクレオチドの調製
上記例3において調製された試薬を用いて、20番目の塩基(アデニン)が3−
(7−クマリニルメチル)グリセロールにより置換されているE6遺伝子のヌク
レオチド397〜417を含んで成る、ヒト乳頭腫ウィルス型16のセグメントと同一で
あるオリゴヌクレオチドを、DNA合成のβ−シアノエチルホスホラミジットを通
して調製した。
アセンブリーした後、そのオリゴヌクレオチドを、室温で1.5時間、30% NH4O
H 3mlにより固体支持体から分離した。次に、アンモニア溶液を55℃で 1.5時
間、加熱した。冷却した後、NH4OHを真空下で除去した。粗オリゴヌクレオチド
を、逆相高性能液体クロマトグラフィーにより均質になるまで精製した。
前記オリゴヌクレオチドを、相補的5′−32P−ラベルされた標的オリゴヌク
レオチド(プローブ/標的のモル比=10:1)により0.75MのNaCl緩衝液(20
μl)において40℃で1時間ハイブリダイズせしめた。この時点で、溶液を、30
2nmの波長の光により10分間照射した。その照射された混合物の変性ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動分析は、放射性ラベルされた標的に対して達成された光化
学架橋のレベルが80%であったことを示した。Sabaなど.,アメリカ特許第 5,082
,934号に記載されるヌクレオシドクマリン誘導体の1つを含む類似するオリゴヌ
クレオチドによる対照の実験を平行して実
施した。それらの試薬により得られた最適の架橋効率は60%であった。従って、
本発明の化合物は、20%以上の効率(1/3高い相対的効率)を有する光化学架
橋を受けた。
例5
前記例1,2及び3に示される類似する反応に従って、次の構造を有する生成
物を同様にして合成した:
この化合物はまた、非ヌクレオチドソラレン誘導体を含むオリゴデオキシヌクレ
オチドの調製のためにも有用である。
例6
例3で調製された試薬を用いて、ヒト乳頭腫ウィルス型16のゲノムのセグメン
トと同一であるオリゴヌクレオチドを、DNA合成のβ−シアノエチルホスホラミ
ジット法を通して調製した。オリゴヌクレオチドは、それぞれ、E6遺伝子のヌ
クレオチド89−108及び283−302(引用により本明細書に組込まれる配列)に対し
て相補的であった。個々の分子において、天然の配列の5′末端ヌクレオチド(
アデノシン)を、3−(7−クマリニルメチル)グリセロールにより置換した。
その3′末端は、ビオチン成分により終結していた。
同様にして、2種のさらなる DNA分子を合成した。それらのオリゴヌクレオチ
ドは、E6遺伝子のヌクレオチド89−108 又は283−302 のいづれかに対する相
補的配列を有するが、しかしながら、そ
れらの変性されたオリゴヌクレオチドにおいては、3−(7−クマリニルメチル
)グリコールが、“Saba化合物”として本明細書において言及される2′−デオ
キシリボヌクレオチドの5′位置での3′−O−(N,N−ジイソプロピルホス
ホラミジット)5′−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)誘導体を用いるこ
とによって、アメリカ特許第 5,082,934号(Sabaなど)に記載されるヌクレオシ
ドクマリン誘導体により置換された。
アセンブリーした後、4種のオリゴヌクレオチドを、室温で 1.5時間、30% N
H4OH 1mlにより固体支持体から分離した。次に、アンモニア溶液を55℃でさら
に 1.5時間、加熱した。冷却の後、NH4OHを真空下で除去した。粗オリゴヌクレ
オチドを、高性能液体クロマトグラフィーにより均質まで精製した。
オリゴヌクレオチドを、相補的5′−32P−ラベルされたオリゴヌクレオチド
(ラベルされていないオリゴヌクレオチド:ラベルされたオリゴヌクレオチドの
モル比= 100:1)により40℃で1時間、0.75MのNaCl緩衝液(20μl)におい
てハイブリダイズした。この時点で、溶液を、UV-B波長の光(XL 1500UV架橋剤、
Sepctronics,Inc.)により15分間、照射した。架橋の程度(放射性ラベルされた
標的に対して)を、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続く励起されたバン
ドのシンチレーション計数により決定した。その結果は次の表に示される:
その結果は、本発明の化合物が、アメリカ特許第 5,082,934号の化合物よりも
一層効果的に光化学架橋を受けることを示す(10%以上の相対的効率)。
例7
1−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−3−O−(7−クマニリル)− 2−O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミジット)グリ セロール
本発明のもう1つの態様を、例1におけるようにして、7−ブロモメチルクマ
リンの代わりに7−ヒドロキシクマリンを用いて合成した。1−O−(4,4′
−ジメトキシトリチル)−3−O−(7−クマリニル)−2−O−(2−シアノ
エチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミジット)グリセロールの合成につい
ての反応スキームは次の通りである:
このスキーム路は、7−ブロモメチルクマリンを用いての反応順序よりも完結
するために少ない時間を必要として、そして7−ブロモメチルクマリン合成順序
に比較して約50%の費用の節約を提供する。7−ヒドロキシクマリン誘導体が、
オリゴヌクレオチド中に導入され、そしてそれは、アメリカ特許第 5,082,934号
の化合物よりもオリゴヌクレオチドの保護解除(室温で濃縮された NH3への暴露
)の間、より安定している。7−ヒドロキシクマリン誘導体は、7−ブロモメチ
ルクマリン誘導体(310nmのλ最大)に比較して異なった吸光スペクトル(325nmの
λ最大)を示す。7−ヒドロキシクマリン誘導体は、7−ブロモメチルクマリン
誘導体に比較して赤に移動(レッドシフト)され、これは消光物質、たとえば核
酸の効果を減じる。このスペクトルシフトはまた、7−ヒドロキシクマリン誘導
体のより選択的な励起を可能にする。7−グリシジルクマリンの合成
中間体7−グリシジルクマリンを、7−ヒドロキシクマリン16.2
g、エピブロモヒドリン15.8g、炭酸カリウム13.8g及びアセトン(“反応溶液
”)270mlを含む、還流冷却器を備えた反応フラスコにおいて調製した。反応溶
液を煮沸し、そして一晩、還流し、冷却し、5% NaOH 水溶液 100mlにより処理
し、そして塩化メチレン80mlにより3度抽出した。溶媒を蒸発した後、黄色の粗
固形物を得た。その粗固形物(1.5g)を、50℃で、ヘキサン30ml及びアセトン20m
lの溶液に溶解した。次に、ヘキサン/アセトン溶液を、0℃で2〜3時間、冷
却した。白色結晶が形成し、そして濾過により集め、そして白色粉末に乾燥せし
めた。290mgの白色粉末を得た。この新規化合物(7−グリシジルクマリン)の
融点は 110〜112 ℃であった。薄層クロマトグラフィー(TLC)処理を8%v/v
酢酸エチル/CHCl3溶液において行ない;7−グリシジルクマリンのRf値は 0.6
であった。グリシジルクマリンの加水分解
7−グリシジルクマリン(2.0g)を、アセトン80ml及び 1.8Mの水性H2SO4 5
0mlの溶液に溶解した。そのアセトン/酸溶液を20分間、加熱煮沸した。その溶
液を冷却し、そしてpHが7〜8に達するまで、1.6Mの NH4OH水溶液により中和
した。その中和された溶液を、50mlの酢酸エチルにより3度抽出した。溶媒を蒸
発した後、生成物、すなわち7−(1−O−グリセリルオキシ)クマリン(118〜
120℃の融点)を得た。1−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−3−O−(7−クマリニル)グリ セロールの合成
クマリニルグリセロール(1.37g)を、精製されたピリジン11mlと共に、回転
蒸発により3度、同時蒸発した。その同時蒸発されたクマリニルグリセロールを
、4−ジメチルアミノピリジン44mg、トリエチルアミン 330μl、ピリジン45ml
及び塩化ジメトキシトリチ
ル1.78gに添加した。その溶液を室温で3時間、撹拌した。反応を、脱イオン化
された水66mlを添加することによって停止せしめた。次に、その反応溶液を、塩
化メチレン35mlにより3度抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥せしめた
。溶媒を蒸発することによって得られた粗生成物を、シリカゲルカラムを用いて
及び70%ヘキサン、28%アセトン及び2%トリエチルアミンの溶液により溶離す
ることによるクロマトグラフィー処理により精製した。2.6gの精製された生成
物(1−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−3−O−(7−クマリニル)
グリセロール)は、同じ溶媒システムを用いて、0.43のRfを有する単一の TLCス
ポットを付与した。1−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−3−O−(7−クマリニル)−2 −O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミジット)グリセ ロールの合成
1−O−4,4′−ジメトキシトリチル−3−O−(7−クマリニル)グリセ
ロール(2.5g)を、75%ピリジン及び25%塩化メチレン溶液12mlと共に2度、同
時蒸発した。塩化メチレン5ml及びピリジン5mlの溶液を、無水の粘性液体(塩
化メチレン/クマリン溶液)に添加した。塩化メチレン/クマリン溶液を、ジイ
ソプロピルエチルアミン3ml、塩化メチレン10ml及び2−シアノエチルN,N−
ジイソプロピルクロロホスホラミジット 1.8gの溶液を含む50mlのフラスコにア
ルゴン下で添加した。その溶液を90分間、撹拌した。反応混合物を、酢酸エチル
60ml及びトリエチルアミン3mlの溶液により希釈した。その反応混合物を飽和塩
化ナトリウム水溶液50mlにより2度抽出した。次に、有機相を硫酸ナトリウム上
で乾燥せしめた。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーカラムにより精製し
た。2.6gの精製された生成物は、80%ヘキサン及び20%アセトン溶離剤を用い
て 0.2のRfを有する、TLCによる単一のスポットを付
与した。
例8
例7で調製された試薬を用いて、クラミジア・トリコマチス(Chlamydia trach
omatis)の隠れた(cryptic)プラスミドのセグメントと同一であるオリゴヌクレオ
チドを、DNA合成のβ−シアノエチルホスホラミジット法により調製した。その
オリゴヌクレオチドは、前記隠れたプラスミドのヌクレオチド 876−900, 6857
−6878,7118−7140及び6725−6752(本明細書において引用により組込まれる配
列)に対して相補的であり、最初の2つのオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオ
チド当たり1つの架橋化合物を含み、そして後者の2つのオリゴヌクレオチドは
オリゴヌクレオチド当たり2つの架橋化合物を含む。
自動化された合成の後、オリゴヌクレオチドを固体支持体から分離し、そして
30% NH4OH 3mlにより室温で2時間、保護解除した。NH4OHを真空下で除去し
、そして粗オリゴヌクレオチドを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
均質まで精製した。
オリゴヌクレオチドを、相補的5′−32P−ラベルされたオリゴヌクレオチド
(ラベルされていないオリゴヌクレオチド:ラベルされたオリゴヌクレオチドの
モル比= 100:1)により40℃で20分間、0.75MのNaCl緩衝液(195μl)におい
てハイブリダイズした。この時点で、溶液を、UV-A波長の光(8Wのランプ)に
より20分間、照射した。架橋の程度(放射性ラベルされた標的に対して)を、変
性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続く励起されたバンドのシンチレーション
計数により決定した。その結果は次の表に示される:
前記結果は、本発明の化合物がアメリカ特許第 5,082,934号の化合物よりも、
より効果的に光化学架橋を受けることを示す。
例9
(1)短い側鎖、たとえばグリセロール、(2)長い側鎖、たとえばポリ(エ
チレングリコール)、(3)芳香族環及び(4)脂肪族環式環、たとえばエチレ
ン−ジオキシ環を含む種々の側鎖を含むクマリン誘導体を合成することができる
。そのようなクマリン誘導体を、適切なクマリン出発材料、たとえば7−メチル
クマリン、7−ヒドロキシクマリン、エスクレチン(6,7−ジヒドロキシクマ
リン)又は7−グリシジルクマリンから合成することができる。活性官能基を含
む所望する側鎖を、個々のクマリン出発材料に結合する。
脂肪族複素環式環誘導体を含むクマリンについての反応スキーム1−O−〔2 −シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミジット〕−2,3−O−( 6,7−クマリニル)−グリセロール
この化合物自体は、上記一般式内の化合物ではないが、しかし示される反応の
最終段階においてホスホラミジットの形成により活性化されるヒドロキシル基と
X及び/又はB単位前駆体との反応を通してそのような化合物を調製するために
使用され得る中間体である。
試薬:
(a)炭酸カリウム/アセトン
(b)水酸化カリウム
(c)2−シアノエチルN,N−ジイソプロピルクロロホスホラミジット/ジイ
ソプロピルエチルアミン/ピリジン
*:
エピブロモヒドリンの代わりに2,3−ジブロモ−1,4−ジヒドロキシブタ
ンとの段階(a)での反応は、類似する化合物2,3−O−(6,7−クマリニ
ル)−1,2,3,4−テトラヒドロキシブタンをもたらし;次にこれを、下記
に示されるような1−O−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−4−O−(
β−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミジット)−2,3−O,
O−(6,7−クマリニル)−1,2,3,4−テトラヒドロキシブタンに転換
することができる:
6,7−(ヒドロキシメチルエチレンジオキシ)クマリンの調製(段階AI及び AII)
エスクレチン(0.90g)を、炭酸カリウム(1.40g)及び水性アセトン 200ml
の溶液と共に室温で1時間撹拌した。次に、黄色の懸濁液を一晩還流した。次に
、水酸化カリウム(0.70g)を添加し、そして1時間還流した。次に、その溶液
を、遠心分離により固体から分離した。次に、その溶液を水アスピレーターによ
り蒸発した。次に、得られる生成物を水50mlに溶解した。次に、その水溶液を、
35mlの塩化メチレンにより2度抽出した。有機溶液を2Mの水酸化ナトリウム50
mlにより2度抽出した。得られる有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥せしめた。
溶媒の蒸発の後、白色固体 200mgを得た。50%アセトン/ヘキサンにおける TLC
は、Rf 0.42を示す。収率は、26%(重量)であった。脂肪族複素環式環誘導体の調製(段階AIII)
6,7−(ヒドロキシメチルエチレンジオキシ)クマリン(200mg)を、無水ピ
リジン1mlと共に2度、同時蒸発した。その無水反応体に、ジクロロメタン 0.9
ml及びピリジン 0.9mlを添加した。2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル
クロロホスホラミジット(280mg)を、ジイソプロピルエチルアミン 0.2ml及び
ジクロロメタン
0.9mlの溶液に溶解した。そのホスホラミジット溶液をクマリン溶液に添加した
。得られる溶液を室温で2時間、撹拌した。次に、その反応混合物を、酢酸エチ
ル10ml及びトリエチルアミン 0.5mlの溶液により希釈した。その溶液を、飽和塩
化ナトリウム溶液6mlにより3度抽出した。溶媒の蒸発後、得られる生成物を次
の溶離剤を用いてシリカゲルカラムにより精製した:アセトン/ヘキサン/トリ
エチルアミン=36/60/4。Rf=0.57(同じ溶離剤を用いての TLCにより)を有
する精製された生成物(100mg)を得た。芳香族側鎖に連結されるクマリンについての反応スキーム 3−O−(7−クマリニルメトキシ)−1−O−〔2−シアノエチル−N,N− ジイソプロピルホスホラミジット〕−1,3−ジヒドロキシベンゼン
試薬:
(a)2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルクロロホスホラミジット、ジ
イソプロピルエチルアミン/ピリジン/ジクロ
ロメタン7−ブロモメチルクマリンの調製(段階BI)
7−メチルクマリン(28g)、70%ベンゾイルペルオキシド(1.68g)及びN
−ブロモスクシンイミド(30.8g)を、1lのフラスコ中でクロロホルム 140ml
に添加し、そしてその懸濁液を一晩、還流した。その溶液をクロロホルム 100ml
により希釈した。得られる粗生成物をアセトン 750mlから再結晶化した。172〜1
76℃の融点を有する白色固体(21g)を得た。3−O−(7−クマリニルメチル)−1,3−ジヒドロキシベンゼンの調製(段 階BII)
7−ブロモメチルクマリン(0.70g)を、レソルシノール(2.25g)、炭酸カ
リウム(1.75g)及びアセトン(200ml)の懸濁液に添加した。その溶液を加熱し
、そして4時間、撹拌した。次に、その溶液を固体から分離した。溶媒の蒸発の
後、粗生成物をジクロロメタン40mlに溶解した。次に、有機溶液を水40mlにより
3度抽出した。20%(v/v)酢酸エチル/クロロホルムを用いての TLCは、Rf
=0.32を付与した。溶媒の蒸発の後、生成物をCH2Cl2/酢酸エチル溶液から再結
晶化し;精製された生成物 300mgを得た。3−O−(7−クマリニルメトキシ)−1−O−〔2−シアノエチル−N,N− ジイソプロピルホスホラミジット〕−1,3−ジヒドロキシベンゼンの調製(段 階BIII)
2−シアノエチルN,N−ジイソプロピルクロロホスホラミジットを、段階A
IIIの態様に類似する態様で段階BIIの生成物と反応せしめた。長い側鎖を含むクマリンについての反応スキーム 3−O−(7−クマリニル)−2−O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプ ロピルホスホラミジット)−1−O−(2−〔2−( 4,4′−ジメトキシトリチルオキシ)エトキシ〕エチル)グリセロール
試薬:
(a)炭酸カリウム/アセトン
(b)水酸化ナトリウム/エチレングリコールジメチルエーテル
(c)4,4′−ジメトキシトリチルクロリド/ピリジン
(d)2−シアノエチルN,N−ジイソプロピルクロロホスホラミジット、ジイ
ソプロピルエチルアミン/ジクロロメタン7−グリシジルクマリンの調製(段階CI)
この化合物は、例6に記載のようにして調製した。3−O−(7−クマリニル)−1−O−(2−〔2−ヒドロキシエトキシ〕エチ ル)グリセロールの調製(段階CII)
7−グリシジルクマリン(1g)を、水酸化ナトリウム10mg、ジエチレングリ
コール2.65g及びエチレングリコールジメチルエーテル5mlの溶液に溶解した。
その溶液を6時間、加熱還流した。反応混合物を脱イオン水10mlにより希釈し、
そしてジクロロメタン10mlにより3度抽出した。次に、有機相を硫酸ナトリウム
上で乾燥せしめた。溶媒の蒸発の後、粗生成物を、50%(v/v)アセトン/ヘ
キサンを用いてシリカゲルカラムにより精製した。Rf 0.09を有する主要生成物(
260mg)及び Rf 0.34を有するマイナーな生成物(50mg)(50%(v/v)ヘキサン
/アセトンの溶媒を用いてのTLC)を得た。3−O−(7−クマリニル)−1−O−(2−〔2−(4,4′−ジメトキシト リチルオキシ)エトキシ〕エチル)グリセロールの調製(段階CIII)
段階CIIの生成物として得られたジヒドロキシクマリン誘導体(230mg)を、無
水ピリジンと共に同時蒸発した。ジメトキシトリチルクロリド 320mg、トリエチ
ルアミン60ml及び4−ジメチルアミノピリジン10mgをクマリン誘導体に添加した
。その溶液を室温で16時間、撹拌した。その溶液を水により希釈し、そしてジク
ロロメタンにより抽出し、次に硫酸ナトリウム上で乾燥せしめた。溶媒の蒸発の
後、粗生成物を、溶離剤として40%(v/v)アセトン/ヘキサンを用いてシリ
カゲルカラムにより精製した。3−O−(7−クマリニル)−2−O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプ ロピルホスホラミジット)−1−O−(2−〔2−(4,4−ジメトキシトリチ ルオキシ)エトキシ〕エチル)グリセロールの調製(段階CIV)
2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルクロロホスホラミジットを、段階
AIIIに記載されるようにして段階CIIIの生成物と反応せしめた。段階AIII,BIII及びCIVに使用されるホスホラミジットの調製
ホスホラミジットを調製するための一般工程は、次の通りである。不活性雰囲
気下で、1.2当量の2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルクロロホスホラ
ミジット及び 2.4当量のN,N−ジイソプロピルエチルアミンを、隔膜によりキ
ャップをされたガラス容器においてジクロロメタン 0.9mlに溶解した。クマリン
前駆体(1.0当量)(たとえば、段階AII,BII又はCIIIの生成物)を、ピリジン 9
.9ml及びジクロロメタン 0.9mlに溶解した。そのクロロホスホラミジット溶液を
撹拌しながら、クマリン溶液を添加する。撹拌を2時間、続ける。エチルアセテ
ートを添加し、そして有機溶液をNaCl(水性)により3度、洗浄し、そしてNa2S
O4上で乾燥せしめる。溶媒の除去の後、粗生成物を、アトセン/ヘキサン/トリ
エチルアミン(36:60:4)を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製する
。適切な画分を集め、そして真空下で濃縮する。
本発明を十分に記載して来たが、多くの変更及び修飾が本発明の範囲内で行な
われ得ることは、当業者に明らかであろう。
本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に
組込まれる。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
C07H 19/10 C07H 19/10
19/20 19/20
21/00 21/00
// C12Q 1/68 C12Q 1/68 A
(72)発明者 テイン,ダグラス ワイ
アメリカ合衆国,カリフォルニア 94025,
メンロパーク,カレッジ アベニュ 701
(72)発明者 アルバジリ,デイビッド
アメリカ合衆国,カリフォルニア 94304,
パロアルト,サンドヒル ロード 1470,
アパートメント 206
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.下記式: 〔式中、 Bは、(1)2〜10個の炭素原子及び環状の場合、5−もしくは6−員環を含 む線状、枝分れしたもしくは環状炭化水素基、又は(2)5−又は6−員環を含 む複素環式芳香族環系を表わし、前記B(1)又はB(2)は式 OR1の1,2又 は3個の基により置換され得、ここでR1は独立して、H、又はポリヌクレオチ ドの合成の間、ヒドロキシ基を保護又はカップリングすることができるヒドロキ シ−保護又はヒドロキシ−カップリング基であり、又は OR1は前記式の残りに連 結されるヌクレオチド又はポリヌクレオチドを表わし、そして前記炭化水素基の 1〜3個の炭素原子が酸素、窒素、又は硫黄原子により置換され得; Xは、(1)結合、(2)1〜10個の炭素原子を含む線状、枝分れした、又は 環状炭化水素基、あるいは(3)前記炭化水素基の1〜3個の炭素原子が酸素、 硫黄又は窒素原子により置換されており、そしてXに結合した前記式の他の部分 における原子間のXにおける原子の最とも短い結合鎖が1〜10個の原子であるX (2)基を表わし、ここで前記Xはヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、ア ジド、カルボキシ、カルボニル、ペルフルオロメチル及びシアノ官能基から成る 群から選択された1〜3個の置換基により任意に置換され、そしてXは前記式の フェニル環に直接的に又はWを通して結 合され; nは0,1,2又は3であり; 個々のWは、独立して、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、アジド、ニ トロ、チオ、カルボキシ、カルボニル、ペルフルオロメチル又はシアノ官能基; 10又はそれよりも少ない炭素原子の置換されていないヒドロカルビル基;又は1 〜3個の前記官能基により置換されているか、又は1つの炭素原子が酸素、硫黄 又は窒素原子により置換されている前記ヒドロカルビル基を表わし、そして2つ のWが一緒になって前記式のフェニル環に融合した環を表わすことができ; 但し、(1)X又はWが置換された炭化水素である場合、X又はWにおける置 換基の合計数は、前記X又はWにおける炭素原子の合計数よりも少なく、そして 1つ以下の置換基又はヘテロ原子が所定の炭素に結合され、但し、前記置換基は ハロゲン原子又は前記所定の炭素上のハロゲン原子ではなく、そして(2)すべ てのW置換基中の合計の炭素原子が15又はそれよりも少なく;そして Y及びZは独立して、H、低級アルキル又はFを表わし、そして 前記式が1つの保護結合を含み、そして前記結合が、Y及びZが前記式におい て結合される炭素間に位置する〕を有する化合物。 2.いづれかの配向での前記Xが、−OCH2−,−SCH2−,−NHCH n−(ここでLはH,F,Cl,I又はBrを表わし、そしてnは0,1、又は2で ある)である請求の範囲第1項記載の化合物。 3.前記Xが5−もしくは6−員環、又は1つのO,SもしくはN原子を含む 5−又は6−員のヘテロ環を有する環状構造を有する請求の範囲第1項記載の化 合物。 4.Xの右側の前記式のすべてが、クマリン又は前記式内のその誘導体を表わ す請求の範囲第1項記載の化合物。 5.前記Xがクマリン成分の7位に共有結合されている請求の範囲第1項記載 の化合物。 6.前記Bが、 次の第3の副一般式の基: 〔前記式中、 Rx,Ry及びRzは独立して、H又は OR1を表わし; m,n,p,q及びrは独立して0又は1を表わし; 前記副一般式の1つの水素が、前記X基への共有結合により置換され;そして 他方では、前記化合物の前記式のすべての他の置換基及び定義は前で定義され た通りである〕を表わす請求の範囲第1項記載の化合物。 7.前記Bが飽和されている請求の範囲第6項記載の化合物。 8.前記Bが前記第3の副一般式を有する請求の範囲第6項記載の化合物。 9.m+n+p+q+rが0,1又は2である請求の範囲第6項記載の化合物 。 10.前記第3の副一般式が、非環式の飽和二又は三−ヒドロキシ炭化水素を表 わす請求の範囲第6項記載の化合物。 11.前記第3の副一般式が三−O−置換されたグリセリンを表わす請求の範囲 第6項記載の化合物。 12.前記ヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、リン含有結合基を通して前記 化合物に連結される請求の範囲第1項記載の化合物。 13.前記リン含有基がホスフェート基である請求の範囲第12項記載の化合物。 14.前記Bがベンゼン又はナフタレン環を含む請求の範囲第1項記載の化合物 。 15.前記Bが架橋された炭化水素環を含む請求の範囲第1項記載の化合物。 16.前記Bがビシクロ〔3.1.0〕ヘキサン、もしくは〔2.2.1〕ヘプ タン環を含む請求の範囲第1項記載の化合物。 17.前記Bがスピロ又はジスピロ炭化水素環を含む請求の範囲第1項記載の化 合物。 18.前記少なくとも1つのR1が、トリチル、ピキシル、ジメトキシトリチル 、モノメトキシトリチル、ホスフィット、ホスホラミジット、ホスフェート、H −ホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホジチオエー ト、又はホスホトリエステル基を表わす請求の範囲第1項記載の化合物。 19.前記Bが、フラン、ピラン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、ピペ リジン、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジ ン、チオフェン、アクリジン、インドール、キノリン、イソキノリン、キナゾリ ン、キノキサリン、キサンテン、及び1,2−ベンゾピランから成る群から選択 された複素環式環を含む請求の範囲第1項記載の化合物。 20.前記化合物が、式(Nm1Qm4Nm2)m3〔式中、個々のNは所望するポリヌ クレオチド配列のヌクレオチドを表わし、Qは請求の範囲第1項記載の式におけ るヌクレオチド置換分子を表わし、そしてm1,m2及びm3は整数であり、そ してm3が1〜10である請求の範囲第1項記載の化合物。 21.前記m1及びm2が 100よりも少ない請求の範囲第20項記載の化合物。 22.前記少なくとも1つのQが末端位置で存在し、そして少なくとも1つのQ が前記ポリヌクレオチド配列の内部位置で存在する請求の範囲第21項記載の化合 物。 23.前記少なくとも1つのQが前記ポリヌクレオチド配列の内部位置で存在す る請求の範囲第21項記載の化合物。 24.前記Qが前記ポリヌクレオチド配列の末端位置で存在する請求の範囲第21 項記載の化合物。 25.前記B−X−が R1-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3-CH(OR1)-CH2-O-である請 求の範囲第1項記載の化合物。 る請求の範囲第1項記載の化合物。 27.下記一般式: 〔式中、 Bは、(1)3〜10個の炭素原子及び環状の場合、5−もしくは6−員環を含 む線状、枝分れしたもしくは環状炭化水素基、又は(2)5−又は6−員環を含 む複素環式芳香族環系を表わし、前記B(1)又はB(2)は式OR1(ここで、 R1はH、又はポリヌクレオチドの合成の間、ヒドロキシ基を保護又はカップリ ングすることができるヒドロキシ−保護又はヒドロキシ−カップリング基を表わ し)の1,2もしくは3個の基、又は2個の基(OR1が前記式の残りに連結される ヌクレオチド又はポリヌクレオチドを表わす場合)により置換され、そして前記 炭化水素基の1〜3個の炭素原子が酸素、窒素又は硫黄により置換され得;又は Bは、下記第3の副一般式: 〔前記式中、 Rx,Ry及びRzは独立して、 OR1を表わし; m,n,p,q及びrは独立して0又は1を表わし; 前記副一般式の1つの水素が、前記X基への共有結合により置換されている〕 で表わされる基を表わし; Xは、(1)結合、(2)1〜10個の炭素原子を含む線状、枝分 れした、もしくは環状炭化水素基、又は(3)前記炭化水素基の1〜3個の炭素 原子が酸素、硫黄もしくは窒素原子により置換されており、そしてXに結合され る前記式の他の部分における原子間のXにおける原子の最も短い結合鎖が1〜10 個の原子であるX(2)基を表わし、ここで前記Xはヒドロキシ、ハロゲン、ア ミノ、アミド、アジド、カルボキシ、カルボニル、ペルフルオロメチル及びシア ノ官能基から成る群から選択された1〜3個の置換基により任意に置換され、そ してXは前記式のフェニル環に直接的に又はWを通して結合され; nは0,1,2又は3であり; 個々のWは、独立して、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、アジド、ニ トロ、チオ、カルボキシ、カルボニル、ペルフルオロメチル又はシアノ官能基; 10又はそれよりも少ない炭素原子の置換されていないヒドロカルビル基;あるい は1〜3個の前記官能基により置換されているか、又は1つの炭素原子が酸素、 硫黄又は窒素原子により置換されている前記ヒドロカルビル基を表わし、そして 2つのWが前記式のフェニル環に融合される環を一緒に表わすことができ; 但し、(1)X又はWが置換された炭化水素である場合、X又はWにおける置 換基の合計数は、前記X又はWにおける炭素原子の合計数よりも少なく、そして 1つ以下の置換基又はヘテロ原子が所定の炭素に結合され、但し、前記置換基は ハロゲン原子又は前記所定の炭素上のハロゲン原子ではなく、そして(2)すべ てのW置換基における合計の炭素原子が15又はそれよりも少なく;そして Y及びZは独立して、H又は低級アルキルを表わす〕を有する化合物。 28.いづれかの配向での前記Xが、−OCH2−,−SCH2−,−NHCH n−(ここでLはH,F,Cl,I又はBrを表わし、そしてnは0,1、又は2で ある)である請求の範囲第27項記載の化合物。 29.前記Xが5−もしくは6−員環、又は1つのO,SもしくはN原子を含む 5−もしくは6−員のヘテロ環を有する環状構造を有する請求の範囲第27項記載 の化合物。 30.前記Wが前記式のフェニル環に融合されるピロン又はフラン環である請求 の範囲第27項記載の化合物。 31.Xの右側の前記式のすべてが、ソラレン、シス−ベンゾジピロン、又は前 記式内のそのトランス−ベンゾジピロンを表わす請求の範囲第27項記載の化合物 。 32.前記Xがソラレン成分のフラン環の4位に共有結合される請求の範囲第27 項記載の化合物。 33.前記Bが、 を表わし、そして他方では、前記化合物の前記式のすべての他の置換基及び定義 は前で定義された通りである請求の範囲第27項記載の化合物。 34.前記Bが飽和されている請求の範囲第27項記載の化合物。 35.前記Bが前記第3の副一般式を有する請求の範囲第27項記載の化合物。 36.m+n+p+q+rが0,1、又は2である請求の範囲第35項記載の化合 物。 37.前記Bが非環式の飽和トリ−ヒドロキシ炭化水素を表わす請求の範囲第36 項記載の化合物。 38.前記Bがトリ−O−置換されたグリセリンを表わす請求の範囲第36項記載 の化合物。 39.前記少なくとも1つのR1が、トリチル、ピキシル、ジメトキシトリチル 、モノメトキシトリチル、ホスフィット、ホスホラミジット、ホスフェート、H −ホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホジチオエー ト、又はホスホトリエステル基を表わす請求の範囲第27項記載の化合物。 40.前記Bが、フラン、ピラン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、ピペ リジン、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、チオフェン、アクリジ ン、インドール、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン、キサン テン、及び1,2−ベンゾピランから成る群から選択された複素環式環を含む請 求の範囲第27項記載の化合物。、 41.前記化合物が、式(Nm1Qm4Nm2)m3〔式中、個々のNは所望するポリヌ クレオチド配列のヌクレオチドを表わし、Qは請求の範囲第1項記載の式におけ るヌクレオチド置換分子を表わし、そしてm1,m2及びm3は整数であり、そ してm3が1〜10である請求の範囲第27項記載の化合物。 42.化合物、すなわち1−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−4−O− (β−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミジット)−2,3−O ,O−(6,7−クマリニル)−1,2,3,4−テトラヒドロブタン;2,3 −O,O−(6,7−クマリニル)−1,2,3,4−テトラヒドロキシブタン ;1−O−〔 β−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミジット〕−2,3−O, O−(6,7−クマリニル)−グリセロール;又は2,3−O−(6,7−クマ リニル)−グリセロール。
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