JPH11313687A - 超耐熱性リブロ―スビスリン酸カルボキシラ―ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラ
ーゼを提供すること。 【解決手段】 超好熱性始原菌KOD-1株から超耐熱性リ
ブロースビスリン酸カルボキシラーゼをコードするDNA
を単離し、このDNAを用いて超耐熱性リブロースビスリ
ン酸カルボキシラーゼ生産宿主細胞を得、そしてこの宿
主細胞を培養する工程を包含する方法により、超耐熱性
リブロースビスリン酸カルボキシラーゼを生産する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、超耐熱性リブロー
スビスリン酸カルボキシラーゼおよびそれをコードする
DNAに関する。

【０００２】

【従来の技術】リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ
は、光合成反応を触媒する酵素であり、植物の葉緑体中
および光合成能を有する微生物などに存在する。

【０００３】高等植物などのリブロースビスリン酸カル
ボキシラーゼは、大サブユニット８個および小サブユニ
ット８個からなる巨大分子であり（タイプＩ）、植物に
おいては葉の主要な可溶性タンパク質である。一方、細
菌などの微生物のリブロースビスリン酸カルボキシラー
ゼは、小サブユニットのみからなる（タイプII）。

【０００４】リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ
は、植物の分類上のマーカーとして利用されており、例
えば、細胞融合における細胞のマーカーとして利用され
ている。

【０００５】さらに地球環境の改善の観点からは、リブ
ロースビスリン酸カルボキシラーゼ遺伝子を改変して、
大気中のCO₂の固定化能を上昇させた植物を育種するな
どの試みがなされようとしている。同様に光合成細菌の
育種または光合成能を有するデバイスの開発なども意図
され得る。このような目的において、より高い酵素活性
を有し、かつ構造的に安定なリブロースビスリン酸カル
ボキシラーゼをコードする遺伝子が有用である。

【０００６】また、多くのリブロースビスリン酸カルボ
キシラーゼ遺伝子の発現は光誘導性であり、特に植物の
リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現は
器官特異的かつ高レベルであるので、そのプロモーター
は植物の育種（例えば、耐病性または耐虫性の付与）に
おいて有用であるとされている。

【０００７】超好熱始原菌は、高温で生存するので、こ
の微生物が生産するタンパク質（例えば、酵素）は、一
般に高度に耐熱性である（すなわち、構造的に安定であ
る）。さらに、超好熱始原菌が属する始原菌は従来から
知られていた原核生物および真核生物とは異なる生物で
あると提唱されていることからも明らかなように、進化
的にもこれらの生物とは異なる。従って、たとえ原核生
物および真核生物に由来する公知の酵素などと類似の機
能を有していても、超好熱始原菌由来の酵素は、構造的
にも酵素学的にも従来の酵素とは異なる場合が多い。例
えば、超好熱始原菌KOD-1株（Morikawa, M.ら、Appl. E
nviron. Microbiol. 60(12), 4559-4566(1994)）から単
離されたシャペロニンは、Escherichia coli由来のGroE
Lと同様の機能を有している。しかし、GroELがこれ自体
が14量体を形成し、さらに７量体を形成しているGroES
とともに複合体を形成して機能するのに対し、KOD-1株
由来のシャペロニンは単独で機能する（Yan, Zら、App
l. Environ. Microbiol. 63:785-789）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、超耐熱性リ
ブロースビスリン酸カルボキシラーゼおよびそれをコー
ドするDNAを提供すること、このDNAを含むベクターおよ
びこのベクターを含む宿主細胞を提供すること、ならび
にこの宿主細胞を培養する工程を包含する超耐熱性リブ
ロースビスリン酸カルボキシラーゼの生産方法を提供す
ることをその目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、配列番
号２のアミノ酸配列を含む超耐熱性リブロースビスリン
酸カルボキシラーゼ、または配列番号２のアミノ酸配列
において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしく
は付加されたアミノ酸を含みかつリブロースビスリン酸
カルボキシラーゼ活性を有するその改変体が提供され
る。

【００１０】１つの実施態様において、前記超耐熱性リ
ブロースビスリン酸カルボキシラーゼまたはその改変体
は、超好熱始原菌KOD-1株に由来する。

【００１１】本発明によれば、前記超耐熱性リブロース
ビスリン酸カルボキシラーゼまたはその改変体をコード
するDNAが提供される。

【００１２】１つの実施態様において、前記DNAは、配
列番号１の１位〜1335位のヌクレオチド配列を含む。

【００１３】１つの実施態様において、前記DNAは、超
好熱始原菌KOD-1株に由来する。

【００１４】本発明によれば、前記のDNAを含むベクタ
ーが提供される。

【００１５】本発明によれば、前記のベクターを含む組
換え宿主細胞が提供される。

【００１６】本発明によれば、前記の宿主細胞を培養す
る工程を包含する、超耐熱性リブロースビスリン酸カル
ボキシラーゼまたはその改変体の生産方法が提供され
る。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明は、超好熱始原菌が産生す
る超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼを、
本来この酵素を生産する超好熱始原菌を培養することに
より、またはこの酵素をコードするDNAを単離し、このD
NAを含むベクターを構築し、このベクターを含む宿主細
胞を作製し、そしてこの宿主細胞培養することによって
超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼを産生
する方法に関する。

【００１８】本明細書において、リブロースビスリン酸
カルボキシラーゼとは、リブロースリン酸にCO₂を付加
して２分子の3-ホスホグリセリン酸を生成する酵素をい
う。さらにリブロースビスリン酸カルボキシラーゼはO₂
存在下において、リブロースリン酸にO₂を付加して2-ホ
スホグリコール酸および3-ホスホグリセリン酸を生成す
る活性（オキシゲナーゼ活性）を有する。

【００１９】本発明のリブロースビスリン酸カルボキシ
ラーゼの至適pHは好ましくは約７〜10、より好ましくは
約８〜９、最も好ましくは約8.3である。本発明のリブ
ロースビスリン酸カルボキシラーゼの至適温度は好まし
くは約65℃以上、より好ましくは約80℃以上、最も好ま
しくは約90℃である。本発明のリブロースリン酸カルボ
キシラーゼは、好ましくは80℃において約５時間以上、
より好ましくは約10時間以上、最も好ましくは約15時間
の半減期を有する。

【００２０】高等植物などのリブロースビスリン酸カル
ボキシラーゼは、大サブユニット８個および小サブユニ
ット８個からなり、これは「タイプＩ」と分類される。
タイプＩのリブロースビスリン酸カルボキシラーゼを産
生する生物の例としてはAnabaena sp.およびAlnus inca
naなどが挙げられる。細菌などのリブロースビスリン酸
カルボキシラーゼは、小サブユニットのみからなり、こ
れは「タイプII」と分類される。タイプIIのリブロース
ビスリン酸カルボキシラーゼを産生する生物の例として
は、Thiobacillus denitrificansおよびRhodospirillum
rubrumなどが挙げられる。

【００２１】本発明において使用される超好熱始原菌
は、90℃以上で生育する微生物であると定義される。好
ましくは超好熱始原菌は、超耐熱リブロースビスリン酸
カルボキシラーゼを産生する、本発明者らが単離した耐
熱性チオールプロテアーゼ産生菌KOD-1株（Appl. Envir
on. Microbiol. 60(12), 4559-4566(1994)）である。KO
D-1株は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され
ており、その受託番号はFERM P-15007号である。なお、
このKOD-1株は、上記文献に記載されているように、分
離された当初Pyrococcus属に分類されていた。しかし、
DNASIS（日立ソフトウェアーエンジニアリング社製）に
入力されているGenBank R91.0 October, 1995＋Daily U
pdateの登録データを用いた16S rRNAの配列の比較を実
施したところ、KOD-1株はPyrococcus属よりはむしろThe
rmococcus属に近縁であることが示唆されている。

【００２２】本来の本発明の超耐熱性リブロースビスリ
ン酸カルボキシラーゼを生産する超好熱始原菌の培養
は、例えばAppl. Environ. Microbiol. 60(12), 4559-4
566(1994)（前出）に記載の培養条件下で実施し得る。
培養は、静置培養または窒素ガスによる通気撹拌培養の
いずれかであり得、そして連続的または回分的のいずれ
かであり得る。

【００２３】組換え宿主細胞を培養する条件は、使用さ
れる宿主細胞の種類に依存して適切に選択される。宿主
細胞としては、組換えDNA技術において使用可能な任意
の宿主細胞が使用され得る。これらは例えば、細菌細
胞、酵母細胞、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞など
を包含する。好ましい宿主細胞は細菌細胞である。

【００２４】培養後、得られる培養物から当該分野に公
知の方法により本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸
カルボキシラーゼを精製し得る。発現産物が細胞外に分
泌される場合は、例えば培養物を遠心分離またはろ過す
ることによって上清を得、これを直接精製するかあるい
は沈澱法または限外ろ過などにより濃縮してから精製す
る。発現産物が細胞中に蓄積される場合は、細胞を、細
胞壁溶解酵素、浸透圧の変化、ガラスビーズ、ホモジナ
イザーまたは超音波処理などを用いて破壊して細胞抽出
物を得、これを精製する。精製は、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフ
ィー、電気泳動などの当該分野で公知の方法を組み合わ
せて実施され得る。

【００２５】超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシ
ラーゼをコードするDNAは、例えば、超好熱始原菌から
染色体DNAを単離し、この染色体DNAを含むライブラリー
を作製し、このライブラリーをスクリーニングすること
により取得され得る。

【００２６】超好熱始原菌の染色体DNAは、培養された
細菌細胞を、界面活性剤（例えば、N-ラウリルサルコシ
ン）などを用いて溶解し、得られた溶解物を塩化セシウ
ムエチジウムブロミド平衡密度勾配超遠心分離法などに
より分画して得ることができる。ライブラリーは、得ら
れた染色体DNAを各種制限酵素で切断した後、同一の制
限酵素または共通の切断末端を与える制限酵素で切断し
たベクター（ファージまたはプラスミドなどのような）
にT4 DNAリガーゼなどを用いて連結することにより得る
ことができる。

【００２７】ライブラリーのスクリーニングは、このラ
イブラリーから目的の超耐熱性リブロースビスリン酸カ
ルボキシラーゼをコードするDNAを含むベクターを選択
することにより行い得る。選択は、例えば、予め決定さ
れた超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼの
部分アミノ酸配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオ
チド、目的のDNAと相同性を有すると推測されるクロー
ン化DNAなどをプローブとして用いて実施され得る。あ
るいは、選択は、目的の酵素を発現させることにより実
施され得る。例えば、発現の検出は、目的の酵素の活性
が容易に検出され得る場合は、プレートに加えられた基
質に対する発現産物の活性を検出することにより、また
は目的の酵素に対する抗体が利用可能である場合は、発
現産物と抗体との反応性を利用して実施され得る。

【００２８】得られたクローン化DNAの解析は、例えば
選択されたDNAを単離し、この制限地図を作製するこ
と、およびヌクレオチド配列を決定することなどにより
実施され得る。クローン化DNAの調製、制限酵素処理、
サブクローニング、ヌクレオチド配列の決定などの技術
は当該分野において周知であり、例えば、「Molecular
Cloning: A Laboratory Manual第２版」（Sambrook, Fr
itschおよびManiatis編, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, 1989）に記載されている。

【００２９】次いで、得られたクローン化DNAを、使用
される宿主細胞に適合性の発現ベクター中に作動可能に
挿入し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形
質転換された宿主細胞を培養することにより、超耐熱性
リブロースビスリン酸カルボキシラーゼを発現させ得
る。

【００３０】発現された組換えタンパク質は、加熱処
理、塩析、遠心分離、カラムクロマトグラフィーなどの
常法を、単独で、または組み合わせて使用することによ
って、さらに精製され得る。

【００３１】本明細書中以下で、本発明を実施例により
詳細に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例によ
り限定されない。

【００３２】

【実施例】（実施例１：超耐熱性リブロースビスリン酸
カルボキシラーゼをコードするDNAの単離） 1.1. PCR 1.1.1. KOD-1株の染色体DNAの調製 KOD-1株を、Appl. Environ. Microbiol. 60(12), 4559-
4566(1994)に記載の0.5×2216マリンブロース培地（221
6マリンブロース：18.7g/L、PIPES 3.48g/L、CaCl₂・H₂O
0.725g/L、0.4 mL 0.2%レザズリン、475mL人工海水（N
aCl 28.16 g/L、KCl 0.7 g/L、MgCl₂・6H₂O 5.5 g/L、Mg
SO₄・7H₂O 6.9 g/L）、蒸留水500 mL、pH7.0）1,000mlに
接種して、２リットルの発酵槽を用いて培養した。培養
に際しては、発酵槽内を窒素ガスで置換し、同ガスで内
圧を0.1Kg/cm²に維持した。培養は、温度85±１℃にて1
4時間実施した。なお、培養は静置培養で実施し、培養
中窒素ガスの通気および撹拌は行わなかった。培養終了
後、培養液（約1,000ml）を10,000rpmで10分間遠心分離
することにより菌体を回収した。

【００３３】得られた菌体１gを10mlのＡ溶液（50mM Tr
is-HCl、50mM EDTA、pH8.0）に懸濁し、遠心分離（8,00
0rpm、５分間、４℃）により集菌後、３mlの15％ショ糖
を含むＡ溶液に懸濁し、37℃にて30分間保温後、１％Ｎ
-ラウリルサルコシンを含むＡ溶液３mlを添加した。こ
の液にさらに5.4gの塩化セシウムおよび10mg/mlの臭化
エチジウム溶液300μlを添加し、55,000rpm、16時間、1
8℃にて超遠心分離を行い、染色体DNAを分画した。得ら
れた染色体DNA画分からｎ-ブタノール抽出により臭化エ
チジウムを除去後、TE溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、
0.1mM EDTA）に対して一夜透析し、染色体DNAを得た。 1.1.2. PCR 種々のリブロースビスリン酸カルボキシラーゼのアミノ
酸配列間で高度に保存された２つの領域のアミノ酸配列
を選択した（相同性についてはHernandez,J.M.ら、J. B
acteriol.,178(2), 347-356 (1996)を参照のこと）。

【００３４】選択したアミノ酸に基づいて２つのプライ
マーを設計し、そして合成した。

【００３５】PCRは、上記で調製した染色体DNA１μg、
各プライマー20 pmolおよびExTaq（宝酒造株式会社）を
含む50μlの反応液中で、94℃で30秒、55℃で60秒およ
び72℃で60秒を30サイクルの反応条件で実施した。

【００３６】生じた約１kbのPCR産物をサブクローニン
グし、そのヌクレオチド配列を決定したところ、このDN
Aが上記の公知の種々のリブロースビスリン酸カルボキ
シラーゼのアミノ酸配列に相同なアミノ酸を有するポリ
ペプチドをコードすることが見出された（データは示さ
ず）。このPCR産物のフラグメントを以下の実験におい
てプローブとして使用した。 1.2.染色体ライブラリーのスクリーニング 上記1.1において調製した染色体DNAを制限酵素EcoRIで
部分消化し、次いでT4DNAリガーゼを用いてファージベ
クターλEMBL4（Stratagene）と連結した。この連結混
合物をMax Plax^TM Packaging Extract（EPICENTRE TEC
HNOLOGIES）を用いてパッケージングした。

【００３７】このファージライブラリーの1.1×10⁹ pfu
をEscherichia coli XL1-Blue MRA(P2)株に感染させ、
出現したプラークを上記PCRフラグメントをプローブと
して使用して常法によりスクリーニングした（「Molecu
lar Cloning: A Laboratory Manual第２版」Sambrook,
FritschおよびManiatis編, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, 1989）。ポジティブクローン中の約15 kb
のEcoRIフラグメントを、各種制限酵素での消化および
上記プローブを用いるサザンブロッティングによって解
析することにより、リブロースビスリン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子の位置を限定した。 1.3.配列の解析 上記1.2で限定されたHindIII−SacI 2.7kbフラグメント
をpUC19にサブクローニングした後、そのヌクレオチド
配列決定したとろ、上記PCRクローンの配列を含む1335
bpのオープンリーディングフレームが見出された。この
配列を配列番号１に示す。

【００３８】このオープンリーディングフレームは445
アミノ酸（配列番号２）からなるポリペプチドをコード
していた。

【００３９】このオープンリーディングフレームが目的
のリブロースビスリン酸カルボキシラーゼをコードする
ことは、得られたクローンから発現されるタンパク質の
分子量と、KOD-1株から精製されたタンパク質の分子量
の比較によって確認された（下記）。

【００４０】次いで、この推定アミノ酸配列をBLASTプ
ログラムを使用してSwiss PlotおよびPIRデータベース
に登録されている公知のタンパク質のアミノ酸配列と比
較した。この結果、各種のリブロースビスリン酸カルボ
キシラーゼのアミノ酸配列との相同性が示された。表１
に各種のリブロースビスリン酸カルボキシラーゼとの相
同性を示す。この結果、本発明のリブロースビスリン酸
カルボキシラーゼはタイプＩのリブロースビスリン酸カ
ルボキシラーゼ大サブユニットおよびタイプIIのリブロ
ースビスリン酸カルボキシラーゼ大サブユニットに対し
て同程度の約50％の相同性を示し、これらの２つの分類
とは異なる新規のタイプに属する可能性があると考えら
れた。図１にKOD-1株由来の進化的位置を示す系統樹を
示す。

【００４１】

【表１】

【００４２】得られたリブロースビスリン酸カルボキシ
ラーゼ大サブユニットをコードする領域のヌクレオチド
配列を解析したが、小サブユニットをコードする遺伝子
は見出されなかった。

【００４３】（実施例２：リブロースビスリン酸カルボ
キシラーゼ遺伝子の発現）実施例１で得られたリブロー
スビスリン酸カルボキシラーゼをEscherichia coli内で
発現させるために、リブロースビスリン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム全体を含む
SalI−NdeI 1.4 kbフラグメント（鋳型としてKOD-1株
染色体DNAを使用し、NdeI部位を含むセンスプライマー
およびSalI部位を含むアンチセンスプライマーを使用す
るPCRにより得た）をプラスミドpET21a(+)（Novagen）
に挿入してpET-RUBISCOを構築した（図２）。このプラ
スミドを用いてEscherichia coli BL21(DE3)株を形質転
換した。

【００４４】出現したアンピシリン耐性形質転換体をア
ンピシリン（50μg/ml）を含有するNZCYM培地（１％NZ
アミン、0.5％ NaCl、0.5％イーストエキス、0.1％カザ
ミノ酸、0.2％MgSO₄・7H₂O（pH7））に接種し、37℃でO
D₆₆₀が0.5になるまで培養し、次いでイソプロピル-β-D
-チオガラクトピラノシド（IPTG、0.1 mM）を添加し、
さらに37℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心
分離により回収し、100 mMビシン／KOH（pH8.3）／10 m
M MgCl₂中で超音波処理により破砕し、これを再度遠心
分離することにより可溶性画分を回収し、次いで85℃30
分間熱処理した。熱安定性可溶性画分を遠心分離するこ
とにより得られた試料を濃縮した後、これをドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PA
GE）に供したところ、予想された分子量のバンドが検出
され、このバンドはIPTGの誘導後の時間とともに増加し
た（図３）。図３において、レーンＭは分子量マーカー
を、レーン１〜３はリブロースビスリン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子を含まないpET21a(+)プラスミド保持株の培
養０、２および４時間目の抽出物を、そしてレーン４〜
７はpET-RUBISCO保持株の培養０、２、３および４時間
目の抽出物を示す。

【００４５】上記の熱安定性可溶性画分を遠心分離する
ことにより得られた試料を、陰イオン交換カラムResour
ce Q（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Swede
n）、およびゲル濾過カラムSuperdex 200 HR 10/30（Am
ersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を用い
てさらに精製し、SDS-PAGEにより単一バンドであること
を確認した。図４において、レーン１はペレット画分
を、レーン２は上清画分を、レーン３は熱処理後のペレ
ット画分を、レーン４は熱処理後の上清を、レーン５は
Resource Qから溶出された精製タンパク質を示す。

【００４６】精製は、AKTA explorer 10S（Amersham Ph
armacia Biotech, Uppsala, Sweden）を使用して実施し
た。陰イオン交換カラムについては、分離を、100 mMビ
シン／KOH（pH8.3）／10 mM MgCl₂の緩衝液に対する、
０〜1.0 M NaClのグラジエントを使用して実施した。ゲ
ル濾過については、50 mMリン酸ナトリウム／0.15 MNaC
l緩衝液を使用した。

【００４７】ゲル濾過を使用した解析によって、発現さ
れた酵素は、ラージサブユニットのみの８量体を形成し
ていることが示唆された（データは示さず）。

【００４８】上記の精製した試料のカルボキシラーゼ活
性を、D-リブロース1,5-ビスホスフェート（RuBP）（Si
gma）を基質として、Uemura,K.ら、Plant Cell Physio
l.,37(3), 325-331 (1996)に記載の方法に従って測定し
た。

【００４９】まず、本発明の超耐熱性リブロースビスリ
ン酸カルボキシラーゼの至適pHを調べた。反応は、クエ
ン酸緩衝液（pH5.6）、リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.
3）、ビシン緩衝液（pH7.3、7.8、8.0もしくは8.3）、
またはグリシン緩衝液（pH9.1もしくは10.1）および10
mM MgCl₂を含有する緩衝液中で30 mM RuBPを基質として
各種温度で実施し、１分間当たり１mg当たり１μmolのC
O₂を固定する活性を１Ｕとした。pH8.3における活性に
対する割合としての結果を図５に示す。この結果は、本
発明の超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ
が約8.3の至適pHを有することを示す。

【００５０】本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸カ
ルボキシラーゼの至適温度を調べた。反応は、100 mMビ
シン-KOH（pH8.3）および10 mM MgCl₂を含有する緩衝液
中で30 mM RuBPを基質として各種温度で実施した。結果
を図６に示す。本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸
カルボキシラーゼは約90℃に至適温度を有することが示
された。

【００５１】本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸カ
ルボキシラーゼの耐熱性を調べた。精製酵素を80℃
（■）および100℃（●）で種々の時間インキュベート
した後の残存活性を測定した。結果を図７に示す。本発
明の超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼは
80℃において約15時間の半減期を有することが示され
た。

【００５２】本発明の超耐熱性リブロースリン酸カルボ
キシラーゼのカルボキシラーゼ活性およびオキシゲナー
ゼ活性を50℃〜90℃で測定した。さらに、カルボキシラ
ーゼ活性／オキシゲナーゼ活性比であるτ値を算出した
（Ezakiら、J. Biol. Chem.（印刷中、1999年３月出版
予定）を参照のこと）。結果を表２に示す。

【００５３】

【表２】

【００５４】大気中の二酸化炭素濃度の上昇から、地球
温暖化などの環境問題が生じている。この問題の解決策
として、炭酸固定反応を触媒するリブロースリン酸カル
ボキシラーゼが注目されている。ここで、大気中の酸素
濃度対二酸化炭素濃度の比率は約20：0.03であり、酸素
が圧倒的に多い。従って、上記のような目的のために
は、カルボキシラーゼ反応に対する高い特異性、すなわ
ち大きなτ値が必要とされる。KOD-1株由来のの酵素
は、従来のタイプIIの酵素のτ値（約30〜200）および
タイプＩの酵素のτ値（約10）に比較して、高いτ値を
有しているので、より効率的な炭酸固定への応用が期待
される。

【００５５】

【発明の効果】本発明により、超耐熱性リブロースビス
リン酸カルボキシラーゼおよびそれをコードするDNAが
提供される。また、本発明により、このDNAを含むベク
ターおよびこのベクターを含む宿主細胞が提供される。
さらに、本発明により、この宿主細胞を培養する工程を
包含する超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシラー
ゼの生産方法が提供される。

【００５６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Imanaka, Tadayuki <120> Highly heat-resistant ribulose-bisphosphate carboxylase <130> J1-98432442 <150> JP 10-39283 <151> 1998-02-20 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1338 <212> DNA <213> KOD-1 <220> <221> CDS <222> (1)..(1335) <400> 1 atg gtt gag aag ttt gat acg ata tac gac tac tac ctt gac aag ggc 48 Met Val Glu Lys Phe Asp Thr Ile Tyr Asp Tyr Tyr Leu Asp Lys Gly 1 5 10 15 tac gag ccc agc aag aag agg gac atc ata gct gta ttc cgt gtg acg 96 Tyr Glu Pro Ser Lys Lys Arg Asp Ile Ile Ala Val Phe Arg Val Thr 20 25 30 ccg gca gag ggc tac act atc gag cag gca act cga cgg cca ggg cat 144 Pro Ala Glu Gly Tyr Thr Ile Glu Gln Ala Thr Arg Arg Pro Gly His 35 40 45 ctg cga gct caa ctg gaa cct gga cga cac tct atc cct ggt acg agc 192 Leu Arg Ala Gln Leu Glu Pro Gly Arg His Ser Ile Pro Gly Thr Ser 50 55 60 agg ata tat ggg ccg acc tct cgg cca agg cct acg act tcc cga cat 240 Arg Ile Tyr Gly Pro Thr Ser Arg Pro Arg Pro Thr Thr Ser Arg His 65 70 75 80 ggg cga cgg cag ctg gat agt cag aat agc cta cct gtt cca cgc ctt 288 Gly Arg Arg Gln Leu Asp Ser Gln Asn Ser Leu Pro Val Pro Arg Leu 85 90 95 tgg agg agg cca acc ttc cgg ggc ctt ctc gcg agc ata gcc gga aac 336 Trp Arg Arg Pro Thr Phe Arg Gly Leu Leu Ala Ser Ile Ala Gly Asn 100 105 110 att ttc gga atg aag cgc gta aag ggg ctc cgc ctt gag gat ctt tac 384 Ile Phe Gly Met Lys Arg Val Lys Gly Leu Arg Leu Glu Asp Leu Tyr 115 120 125 ttc ccg gag aag ctc ata agg gag ttc gac ggc ccg gcc ttc ggt atc 432 Phe Pro Glu Lys Leu Ile Arg Glu Phe Asp Gly Pro Ala Phe Gly Ile 130 135 140 gag ggc gta agg aag atg ctc gag att aag gac agg cct atc tat ggt 480 Glu Gly Val Arg Lys Met Leu Glu Ile Lys Asp Arg Pro Ile Tyr Gly 145 150 155 160 gtc gtt cca aag cca aag gtc ggt tat tct tcc gga gga gtt cga gaa 528 Val Val Pro Lys Pro Lys Val Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Val Arg Glu 165 170 175 ctg gcc tac gac ctt ctc tca aac ggt gcc gac tac atg aag gac gac 576 Leu Ala Tyr Asp Leu Leu Ser Asn Gly Ala Asp Tyr Met Lys Asp Asp 180 185 190 gag aac ctc acg agc ccg tgg tac aac cgc ttc gag gag agg gcc gag 624 Glu Asn Leu Thr Ser Pro Trp Tyr Asn Arg Phe Glu Glu Arg Ala Glu 195 200 205 ata atg gcg aag ata att gac aag gta gag aac gag acg ggt gag aag 672 Ile Met Ala Lys Ile Ile Asp Lys Val Glu Asn Glu Thr Gly Glu Lys 210 215 220 aag aca tgg ttc gcg aac ata acc gct gac ctc ctc gaa atg gag cag 720 Lys Thr Trp Phe Ala Asn Ile Thr Ala Asp Leu Leu Glu Met Glu Gln 225 230 235 240 agg ctt gag gtt ctt gct gac ctt ggt ctc aag cat gcg atg gtt gat 768 Arg Leu Glu Val Leu Ala Asp Leu Gly Leu Lys His Ala Met Val Asp 245 250 255 gtt gtt ata acc ggc tgg gga gcg cta agg tac atc agg gac ctc gcg 816 Val Val Ile Thr Gly Trp Gly Ala Leu Arg Tyr Ile Arg Asp Leu Ala 260 265 270 gcc gat tac ggg ctt gcc atc cac ggc cac agg gca atg cac gcg gcc 864 Ala Asp Tyr Gly Leu Ala Ile His Gly His Arg Ala Met His Ala Ala 275 280 285 ttc acg agg aac ccg tac cac ggc atc tcg gat gtt cgt tct tgc gag 912 Phe Thr Arg Asn Pro Tyr His Gly Ile Ser Asp Val Arg Ser Cys Glu 290 295 300 ctt tac ttg gct aat agc aat gga cca gct tca cgt gga acc gct gga 960 Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Asn Gly Pro Ala Ser Arg Gly Thr Ala Gly 305 310 315 320 gct ggc aag ctt gag ggc ggc aag tgg gac gtc att cag aac gcc agg 1008 Ala Gly Lys Leu Glu Gly Gly Lys Trp Asp Val Ile Gln Asn Ala Arg 325 330 335 att ctc agg gag agc cac tac aag ccc gat gaa aac gac gtc ttc cac 1056 Ile Leu Arg Glu Ser His Tyr Lys Pro Asp Glu Asn Asp Val Phe His 340 345 350 ctt gag cag aag ttc tac agc ata aag gcc gcg ttc ccg aca agc tct 1104 Leu Glu Gln Lys Phe Tyr Ser Ile Lys Ala Ala Phe Pro Thr Ser Ser 355 360 365 ggt gga tta cat ccg ggc aac atc cag ccc gtt ata gag gcc ctc gga 1152 Gly Gly Leu His Pro Gly Asn Ile Gln Pro Val Ile Glu Ala Leu Gly 370 375 380 acc gac ata gtc ctc cag ctc gga ggt gga acc ctc ggc cat ccg gac 1200 Thr Asp Ile Val Leu Gln Leu Gly Gly Gly Thr Leu Gly His Pro Asp 385 390 395 400 ggg cct gcc gca ggt gca cgg gca gtc agg cag gca atc gat gcc ata 1248 Gly Pro Ala Ala Gly Ala Arg Ala Val Arg Gln Ala Ile Asp Ala Ile 405 410 415 atg cag gga ata ccg ctc gac gag tac gcg aag act cac aag gag ctt 1296 Met Gln Gly Ile Pro Leu Asp Glu Tyr Ala Lys Thr His Lys Glu Leu 420 425 430 gcg aag gcc ctg gag aag tgg ggt cac gtt act cca gtc tga 1338 Ala Lys Ala Leu Glu Lys Trp Gly His Val Thr Pro Val 435 440 445 <210> 2 <211> 445 <212> PRT <213> KOD-1 <400> 2 Met Val Glu Lys Phe Asp Thr Ile Tyr Asp Tyr Tyr Leu Asp Lys Gly 1 5 10 15 Tyr Glu Pro Ser Lys Lys Arg Asp Ile Ile Ala Val Phe Arg Val Thr 20 25 30 Pro Ala Glu Gly Tyr Thr Ile Glu Gln Ala Thr Arg Arg Pro Gly His 35 40 45 Leu Arg Ala Gln Leu Glu Pro Gly Arg His Ser Ile Pro Gly Thr Ser 50 55 60 Arg Ile Tyr Gly Pro Thr Ser Arg Pro Arg Pro Thr Thr Ser Arg His 65 70 75 80 Gly Arg Arg Gln Leu Asp Ser Gln Asn Ser Leu Pro Val Pro Arg Leu 85 90 95 Trp Arg Arg Pro Thr Phe Arg Gly Leu Leu Ala Ser Ile Ala Gly Asn 100 105 110 Ile Phe Gly Met Lys Arg Val Lys Gly Leu Arg Leu Glu Asp Leu Tyr 115 120 125 Phe Pro Glu Lys Leu Ile Arg Glu Phe Asp Gly Pro Ala Phe Gly Ile 130 135 140 Glu Gly Val Arg Lys Met Leu Glu Ile Lys Asp Arg Pro Ile Tyr Gly 145 150 155 160 Val Val Pro Lys Pro Lys Val Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Val Arg Glu 165 170 175 Leu Ala Tyr Asp Leu Leu Ser Asn Gly Ala Asp Tyr Met Lys Asp Asp 180 185 190 Glu Asn Leu Thr Ser Pro Trp Tyr Asn Arg Phe Glu Glu Arg Ala Glu 195 200 205 Ile Met Ala Lys Ile Ile Asp Lys Val Glu Asn Glu Thr Gly Glu Lys 210 215 220 Lys Thr Trp Phe Ala Asn Ile Thr Ala Asp Leu Leu Glu Met Glu Gln 225 230 235 240 Arg Leu Glu Val Leu Ala Asp Leu Gly Leu Lys His Ala Met Val Asp 245 250 255 Val Val Ile Thr Gly Trp Gly Ala Leu Arg Tyr Ile Arg Asp Leu Ala 260 265 270 Ala Asp Tyr Gly Leu Ala Ile His Gly His Arg Ala Met His Ala Ala 275 280 285 Phe Thr Arg Asn Pro Tyr His Gly Ile Ser Asp Val Arg Ser Cys Glu 290 295 300 Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Asn Gly Pro Ala Ser Arg Gly Thr Ala Gly 305 310 315 320 Ala Gly Lys Leu Glu Gly Gly Lys Trp Asp Val Ile Gln Asn Ala Arg 325 330 335 Ile Leu Arg Glu Ser His Tyr Lys Pro Asp Glu Asn Asp Val Phe His 340 345 350 Leu Glu Gln Lys Phe Tyr Ser Ile Lys Ala Ala Phe Pro Thr Ser Ser 355 360 365 Gly Gly Leu His Pro Gly Asn Ile Gln Pro Val Ile Glu Ala Leu Gly 370 375 380 Thr Asp Ile Val Leu Gln Leu Gly Gly Gly Thr Leu Gly His Pro Asp 385 390 395 400 Gly Pro Ala Ala Gly Ala Arg Ala Val Arg Gln Ala Ile Asp Ala Ile 405 410 415 Met Gln Gly Ile Pro Leu Asp Glu Tyr Ala Lys Thr His Lys Glu Leu 420 425 430 Ala Lys Ala Leu Glu Lys Trp Gly His Val Thr Pro Val 435 440 445

【図面の簡単な説明】

【図１】各種リブロースビスリン酸カルボキシラーゼの
進化系統樹を示す図である。

【図２】発現ベクターpET-RUBISCOの構築を示す図であ
る。

【図３】E. coliにおける超耐熱性リブロースビスリン
酸カルボキシラーゼの発現を示す図である。

【図４】E. coliにおいて発現された超耐熱性リブロー
スビスリン酸カルボキシラーゼの精製を示す図である。

【図５】本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸カルボ
キシラーゼの至適pHを示す図である。

【図６】本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸カルボ
キシラーゼの至適温度を示す図である。

【図７】本発明の超耐熱性リブロースビスリン酸カルボ
キシラーゼの耐熱性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 跡見 晴幸 京都府京都市上京区上御霊横通寺町西入上 御霊馬場町362−１ 上御霊アーバンライ フ502号 (72)発明者 前田 倫広 愛知県岡崎市竜美東３丁目９−11

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列を含む超耐熱
   性リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ、または配列
   番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ
   酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を含みかつ
   リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ活性を有するそ
   の改変体。
2. 【請求項２】 超好熱始原菌KOD-1株に由来する、請求
   項１に記載の超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキシ
   ラーゼまたはその改変体。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の超耐熱性リブロースビ
   スリン酸カルボキシラーゼまたはその改変体をコードす
   るDNA。
4. 【請求項４】 配列番号１の１位〜1335位のヌクレオチ
   ド配列を含む、請求項３に記載のDNA。
5. 【請求項５】 超好熱始原菌KOD-1株に由来する、請求
   項３または４に記載のDNA。
6. 【請求項６】 請求項３〜５のいずれかに記載のDNAを
   含むベクター。
7. 【請求項７】 請求項６に記載のベクターを含む組換え
   宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の宿主細胞を培養する工
   程を包含する、超耐熱性リブロースビスリン酸カルボキ
   シラーゼまたはその改変体の生産方法。