JPH11276183A - 新規な癌抑制遺伝子およびそれによりコ―ドされるタンパク質、それらの製造および使用の方法 - Google Patents
新規な癌抑制遺伝子およびそれによりコ―ドされるタンパク質、それらの製造および使用の方法Info
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- JPH11276183A JPH11276183A JP11043760A JP4376099A JPH11276183A JP H11276183 A JPH11276183 A JP H11276183A JP 11043760 A JP11043760 A JP 11043760A JP 4376099 A JP4376099 A JP 4376099A JP H11276183 A JPH11276183 A JP H11276183A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 del-27遺伝子座由来の新規な癌抑制遺伝子を
提供することが、本発明の課題である。 【解決手段】 本発明により、新規な癌抑制遺伝子であ
る、配列番号：1および相補配列とストリンジェントな
条件下でハイブリダイズする核酸分子が単離される。
提供することが、本発明の課題である。 【解決手段】 本発明により、新規な癌抑制遺伝子であ
る、配列番号：1および相補配列とストリンジェントな
条件下でハイブリダイズする核酸分子が単離される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な癌抑制遺伝
子del-27、それによりコードされるタンパク質、ならび
に、特に癌の分野における、診断および治療のためのそ
れらの使用に関する。特に、本発明は、哺乳動物細胞、
特に癌細胞における癌抑制遺伝子del-27の欠損の診断、
ならびに哺乳動物細胞、特に癌細胞においてdel-27およ
びその機能を回復させるための遺伝子治療法に関する。
子del-27、それによりコードされるタンパク質、ならび
に、特に癌の分野における、診断および治療のためのそ
れらの使用に関する。特に、本発明は、哺乳動物細胞、
特に癌細胞における癌抑制遺伝子del-27の欠損の診断、
ならびに哺乳動物細胞、特に癌細胞においてdel-27およ
びその機能を回復させるための遺伝子治療法に関する。
【０００２】
【従来の技術】癌抑制遺伝子は、典型的には、癌細胞に
おいて発現が減少しているか、または欠如している遺伝
子であると考えられている（Knudson, Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 19(1993) 10914-10921）。発現の欠如は、それ
らのタンパク質をコードする遺伝子に変異が起きること
から生じる。これらのタンパク質は、細胞増殖を抑制す
ることにより、負の増殖制御因子として機能すると考え
られるため、癌細胞においてはそれらの発現が欠如する
ことにより、細胞増殖の増大が観察され、悪性形質転換
が引き起こされる。負の成長制御因子として、癌抑制遺
伝子産物は、分化した組織の発達に重要な正常機能も有
している可能性が高い。これに関して、増殖制御は発生
および分化の正常な特徴であるため、癌抑制遺伝子は、
細胞分化の開始に必要な増殖停止において重要な役割を
果たしている可能性がある。癌抑制遺伝子の概略につい
ては、例えば[Gutmann,D.H., Int.J.Deph.Biol.39(199
5) 895-907]を参照のこと。
おいて発現が減少しているか、または欠如している遺伝
子であると考えられている（Knudson, Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 19(1993) 10914-10921）。発現の欠如は、それ
らのタンパク質をコードする遺伝子に変異が起きること
から生じる。これらのタンパク質は、細胞増殖を抑制す
ることにより、負の増殖制御因子として機能すると考え
られるため、癌細胞においてはそれらの発現が欠如する
ことにより、細胞増殖の増大が観察され、悪性形質転換
が引き起こされる。負の成長制御因子として、癌抑制遺
伝子産物は、分化した組織の発達に重要な正常機能も有
している可能性が高い。これに関して、増殖制御は発生
および分化の正常な特徴であるため、癌抑制遺伝子は、
細胞分化の開始に必要な増殖停止において重要な役割を
果たしている可能性がある。癌抑制遺伝子の概略につい
ては、例えば[Gutmann,D.H., Int.J.Deph.Biol.39(199
5) 895-907]を参照のこと。
【０００３】癌抑制遺伝子の不活化は、多くの癌の発生
および進展における主要な遺伝学的事象であると考えら
れる。正常な細胞においては、これらの遺伝子は、細胞
の増殖および分化の制御に関与していると考えられてい
る（Fearon,E.,and Vogelstein,B.,Cell 61(1990)759-7
67）。従って、癌抑制遺伝子の不活化変異および欠損に
より、正常な増殖の制約が解除され、癌細胞の発生また
は進展がもたらされるのかもしれない。推定癌抑制遺伝
子を含むゲノム領域は、正常な対立遺伝子のヘテロ接合
度の減少（loss of heterozygosity/LOH）が高頻度であ
ることと、残りの対立遺伝子が癌細胞において機能しな
いという推定とを組み合わせ、同定することができる
（Fearon,E.,and Vogelstein,B.,Cell 61(1990)759-76
7）。
および進展における主要な遺伝学的事象であると考えら
れる。正常な細胞においては、これらの遺伝子は、細胞
の増殖および分化の制御に関与していると考えられてい
る（Fearon,E.,and Vogelstein,B.,Cell 61(1990)759-7
67）。従って、癌抑制遺伝子の不活化変異および欠損に
より、正常な増殖の制約が解除され、癌細胞の発生また
は進展がもたらされるのかもしれない。推定癌抑制遺伝
子を含むゲノム領域は、正常な対立遺伝子のヘテロ接合
度の減少（loss of heterozygosity/LOH）が高頻度であ
ることと、残りの対立遺伝子が癌細胞において機能しな
いという推定とを組み合わせ、同定することができる
（Fearon,E.,and Vogelstein,B.,Cell 61(1990)759-76
7）。
【０００４】最近、ヒト肺癌において、第5染色体の短
腕上のdel-27遺伝子座でLOHが高頻度であることが証明
された（Wieland,I.,and Bohm,M.,Cancer Res.54(1994)
1772-1774; Wieland,I.et al.,Oncogene 12(1996)97-10
2）。さらに、del-27遺伝子座のLOHは、移行上皮癌にお
ける腫瘍の進展と相関している（Bohm,M.et al.,Int.J.
Cancer 72(1997)1-5）。del-27は、ゲノム・ディファレ
ンシャル・クローニングにより単離された。そして、肺
癌細胞系においてホモ接合性の欠損が検出されているこ
とから、新規な推定癌抑制遺伝子との密接な連鎖が裏付
けられている（Wieland,I.et al., Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 87(1992) 2720-2724）。しかし、これら文献に
は、癌抑制遺伝子をコードするcDNAは開示されていな
い。
腕上のdel-27遺伝子座でLOHが高頻度であることが証明
された（Wieland,I.,and Bohm,M.,Cancer Res.54(1994)
1772-1774; Wieland,I.et al.,Oncogene 12(1996)97-10
2）。さらに、del-27遺伝子座のLOHは、移行上皮癌にお
ける腫瘍の進展と相関している（Bohm,M.et al.,Int.J.
Cancer 72(1997)1-5）。del-27は、ゲノム・ディファレ
ンシャル・クローニングにより単離された。そして、肺
癌細胞系においてホモ接合性の欠損が検出されているこ
とから、新規な推定癌抑制遺伝子との密接な連鎖が裏付
けられている（Wieland,I.et al., Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 87(1992) 2720-2724）。しかし、これら文献に
は、癌抑制遺伝子をコードするcDNAは開示されていな
い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】del-27遺伝子座由来の
新規な癌抑制遺伝子を提供することが、本発明の目的で
ある。
新規な癌抑制遺伝子を提供することが、本発明の目的で
ある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、 ａ）配列番号：1なる核酸配列を有するか、または ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、もしくは相補的な核酸とストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞増殖を抑
制することができる、単離された核酸分子（del-27）を
含む。
び3070〜3137全て、もしくは相補的な核酸とストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞増殖を抑
制することができる、単離された核酸分子（del-27）を
含む。
【０００７】本発明は、細胞増殖を抑制し、かつ ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、 ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる組換えポ
リペプチドをさらに含む。
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、 ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる組換えポ
リペプチドをさらに含む。
【０００８】ポリペプチドは、そのDNA配列、およびそ
れから導出されるアミノ酸配列により定義されうる。de
l-27ポリペプチドは、個体ごとに異なる天然の対立遺伝
子変異として存在しうる。そのようなアミノ酸の変異
は、通常、アミノ酸置換である。しかし、全配列に対す
るアミノ酸の欠失、挿入、または付加である場合もあ
る。本発明に係るdel-27タンパク質は、グリコシル化さ
れていることもあるし、グリコシル化されていないこと
もある。それは、程度に関しても型に関しても、該タン
パク質を発現している細胞および細胞型に依存する。癌
抑制活性を有するポリペプチドは、該ポリペプチドを発
現する癌細胞系を用い、該ポリペプチドを発現していな
い癌細胞と比較して増殖能およびアポトーシスを測定す
る、癌増殖阻害アッセイにより、容易に同定されうる。
れから導出されるアミノ酸配列により定義されうる。de
l-27ポリペプチドは、個体ごとに異なる天然の対立遺伝
子変異として存在しうる。そのようなアミノ酸の変異
は、通常、アミノ酸置換である。しかし、全配列に対す
るアミノ酸の欠失、挿入、または付加である場合もあ
る。本発明に係るdel-27タンパク質は、グリコシル化さ
れていることもあるし、グリコシル化されていないこと
もある。それは、程度に関しても型に関しても、該タン
パク質を発現している細胞および細胞型に依存する。癌
抑制活性を有するポリペプチドは、該ポリペプチドを発
現する癌細胞系を用い、該ポリペプチドを発現していな
い癌細胞と比較して増殖能およびアポトーシスを測定す
る、癌増殖阻害アッセイにより、容易に同定されうる。
【０００９】「del-27活性を有するポリペプチドまたは
del-27」とは、小さなアミノ酸変異を有するが、実質的
に同等のdel-27活性を有するタンパク質をも意味する。
実質的に同等とは、活性の生物学的性質が同一であり、
ポリペプチドが好ましくは少なくとも75％のアミノ酸配
列相同性を示すことを意味する。より好ましくは、アミ
ノ酸配列は、少なくとも90％同一である。
del-27」とは、小さなアミノ酸変異を有するが、実質的
に同等のdel-27活性を有するタンパク質をも意味する。
実質的に同等とは、活性の生物学的性質が同一であり、
ポリペプチドが好ましくは少なくとも75％のアミノ酸配
列相同性を示すことを意味する。より好ましくは、アミ
ノ酸配列は、少なくとも90％同一である。
【００１０】「核酸分子」という用語は、例えばDNA、R
NA、または誘導体化された活性なDNAもしくはRNAであり
うるポリヌクレオチドを指す。しかし、DNAおよび／ま
たはRNA分子が好ましい。
NA、または誘導体化された活性なDNAもしくはRNAであり
うるポリヌクレオチドを指す。しかし、DNAおよび／ま
たはRNA分子が好ましい。
【００１１】「ストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズする」という用語は、2つの核酸断片が、サムブル
ックら（Sambrook,J.）の「大腸菌におけるクローン遺
伝子の発現（Expression of cloned genes in E.col
i）」（Molecular Cloning:A laboratory manual(1989)
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, US
A,9.47-9.62および11.45-11.61）に記載された標準的な
ハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイ
ズできることを意味する。
イズする」という用語は、2つの核酸断片が、サムブル
ックら（Sambrook,J.）の「大腸菌におけるクローン遺
伝子の発現（Expression of cloned genes in E.col
i）」（Molecular Cloning:A laboratory manual(1989)
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, US
A,9.47-9.62および11.45-11.61）に記載された標準的な
ハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイ
ズできることを意味する。
【００１２】より具体的には、本明細書で使用されるよ
うに「ストリンジェントな条件」とは、約45℃にて6.0
×SSCでハイブリダイゼーションを行った後に、50℃で
2.0×SSCで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの
選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低スト
リンジェンシーとしての約2.0×SSC、50℃から、高スト
リンジェンシーとしての約0.2×SSC、50℃まで選択する
ことができる。さらに、洗浄工程における温度を、低ス
トリンジェンシー条件の室温、約22℃から、高ストリン
ジェンシー条件の約65℃にまで増大させることができ
る。
うに「ストリンジェントな条件」とは、約45℃にて6.0
×SSCでハイブリダイゼーションを行った後に、50℃で
2.0×SSCで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの
選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低スト
リンジェンシーとしての約2.0×SSC、50℃から、高スト
リンジェンシーとしての約0.2×SSC、50℃まで選択する
ことができる。さらに、洗浄工程における温度を、低ス
トリンジェンシー条件の室温、約22℃から、高ストリン
ジェンシー条件の約65℃にまで増大させることができ
る。
【００１３】本願を通して使用されるように「単離され
た」という用語は、del-27活性を有し、組換えDNA技術
により作製された場合には細胞物質または培養培地を実
質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質
またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸また
はポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましく
は、該核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接
している配列（即ち、該核酸の5'末端および3'末端に位
置する配列）を含まない。
た」という用語は、del-27活性を有し、組換えDNA技術
により作製された場合には細胞物質または培養培地を実
質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質
またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸また
はポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましく
は、該核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接
している配列（即ち、該核酸の5'末端および3'末端に位
置する配列）を含まない。
【００１４】del-27は、組換え作製後、免疫沈降、ゲル
濾過、イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォー
カシング、等電点フォーカシング、選択的沈降、電気泳
動などを含む、公知のタンパク質精製技術を用いたアフ
ィニティ・クロマトグラフィーにより精製されうる。
濾過、イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォー
カシング、等電点フォーカシング、選択的沈降、電気泳
動などを含む、公知のタンパク質精製技術を用いたアフ
ィニティ・クロマトグラフィーにより精製されうる。
【００１５】本発明に係るポリペプチドは、組換え法に
よっても、合成法によっても製造することができる。原
核細胞において組換え作製した場合には、非グリコシル
化del-27ポリペプチドが得られる。本発明により提供さ
れる核酸配列を利用すれば、いかなる所望の細胞のゲノ
ムにおいても（例えば、ヒト細胞以外に、他の哺乳動物
細胞においても）、del-27遺伝子またはその変異体を探
索し、これらを同定し、del-27タンパク質をコードする
所望の遺伝子を単離することが可能である。そのような
方法および適当なハイブリダイゼーション条件は、当業
者に公知であり、例えば、サムブルックら（Sambrook,
J.）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Expres
sion of cloned genes in E.coli）」（Molecular Clon
ing:A laboratory manual(1989)Cold Spring Harbor La
boratory Press,New York,USA）ならびにヘイムズおよ
びヒギンズ（B.D.Hames,S.G.Higgins）の「核酸ハイブ
リダイゼーション−実践的方法（Nucleic acid hybridi
zation-a practical approach）」（(1985)IRL Press,O
xford,England）に開示されている。この場合、通常、
これらの出版物に開示された標準的なプロトコルが実験
に使用される。
よっても、合成法によっても製造することができる。原
核細胞において組換え作製した場合には、非グリコシル
化del-27ポリペプチドが得られる。本発明により提供さ
れる核酸配列を利用すれば、いかなる所望の細胞のゲノ
ムにおいても（例えば、ヒト細胞以外に、他の哺乳動物
細胞においても）、del-27遺伝子またはその変異体を探
索し、これらを同定し、del-27タンパク質をコードする
所望の遺伝子を単離することが可能である。そのような
方法および適当なハイブリダイゼーション条件は、当業
者に公知であり、例えば、サムブルックら（Sambrook,
J.）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Expres
sion of cloned genes in E.coli）」（Molecular Clon
ing:A laboratory manual(1989)Cold Spring Harbor La
boratory Press,New York,USA）ならびにヘイムズおよ
びヒギンズ（B.D.Hames,S.G.Higgins）の「核酸ハイブ
リダイゼーション−実践的方法（Nucleic acid hybridi
zation-a practical approach）」（(1985)IRL Press,O
xford,England）に開示されている。この場合、通常、
これらの出版物に開示された標準的なプロトコルが実験
に使用される。
【００１６】組換えDNA技術を使用すれば、多数の活性
なdel-27誘導体を製造することが可能である。そのよう
な誘導体は、例えば、置換、欠失、または付加により個
々のアミノ酸またはいくつかのアミノ酸が修飾されてい
る。誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発法に
より実施することができる。そのような変化は、当業者
により容易に実施されうる（J.Sambrook,B.D.Hames、前
記）。下記の癌細胞増殖阻害アッセイにより、del-27の
特徴的な性質が保存されていることを確認することのみ
が必要である。従って、本発明は、さらに、原核細胞ま
たは真核細胞における外因性DNAの発現の産物であるdel
-27ポリペプチドにも関する。
なdel-27誘導体を製造することが可能である。そのよう
な誘導体は、例えば、置換、欠失、または付加により個
々のアミノ酸またはいくつかのアミノ酸が修飾されてい
る。誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発法に
より実施することができる。そのような変化は、当業者
により容易に実施されうる（J.Sambrook,B.D.Hames、前
記）。下記の癌細胞増殖阻害アッセイにより、del-27の
特徴的な性質が保存されていることを確認することのみ
が必要である。従って、本発明は、さらに、原核細胞ま
たは真核細胞における外因性DNAの発現の産物であるdel
-27ポリペプチドにも関する。
【００１７】del-27タンパク質をコードするそのような
核酸を利用すれば、本発明のタンパク質を再現可能に大
量に入手することが可能である。原核宿主細胞または真
核宿主細胞のような原核生物または真核生物における発
現のためには、当業者に周知の方法に従い、核酸を適当
な発現ベクターへと組み込む。そのような発現ベクター
は、好ましくは、制御可能／誘導可能なプロモーターを
含む。次に、これらの組換えベクターを、例えば原核宿
主細胞である大腸菌、または真核宿主細胞であるサッカ
ロミセス・セレビシエ（saccharomyces cerevisiae）、
奇形癌腫細胞系PA-1 sc 9117（Buttner et al.,Mol.Cel
l.Biol.11(1991) 3573-3583）、昆虫細胞、CHO細胞、も
しくはCOS細胞のような適当な宿主細胞へと導入して発
現させ、形質転換または形質導入された宿主細胞を、異
種遺伝子が発現されうるような条件下で培養する。宿主
細胞または宿主細胞の培養上清からのタンパク質の単離
は、公知の方法により実施できる。そのような方法は、
例えば、[Ausubel I.,Frederick M.,Current Protocols
in Mol.Biol.(1992),John Wiley and Sons,New York]
に開示されている。細胞培養物中に可溶型のタンパク質
が見出されない場合には、タンパク質をインビトロで再
活性化することが必要となる場合もある。
核酸を利用すれば、本発明のタンパク質を再現可能に大
量に入手することが可能である。原核宿主細胞または真
核宿主細胞のような原核生物または真核生物における発
現のためには、当業者に周知の方法に従い、核酸を適当
な発現ベクターへと組み込む。そのような発現ベクター
は、好ましくは、制御可能／誘導可能なプロモーターを
含む。次に、これらの組換えベクターを、例えば原核宿
主細胞である大腸菌、または真核宿主細胞であるサッカ
ロミセス・セレビシエ（saccharomyces cerevisiae）、
奇形癌腫細胞系PA-1 sc 9117（Buttner et al.,Mol.Cel
l.Biol.11(1991) 3573-3583）、昆虫細胞、CHO細胞、も
しくはCOS細胞のような適当な宿主細胞へと導入して発
現させ、形質転換または形質導入された宿主細胞を、異
種遺伝子が発現されうるような条件下で培養する。宿主
細胞または宿主細胞の培養上清からのタンパク質の単離
は、公知の方法により実施できる。そのような方法は、
例えば、[Ausubel I.,Frederick M.,Current Protocols
in Mol.Biol.(1992),John Wiley and Sons,New York]
に開示されている。細胞培養物中に可溶型のタンパク質
が見出されない場合には、タンパク質をインビトロで再
活性化することが必要となる場合もある。
【００１８】本発明は、さらに、del-27の発現に適した
組換え発現ベクター、そのような発現ベクターでトラン
スフェクトされた組換え宿主細胞、および癌抑制遺伝子
del-27によりコードされるタンパク質の組換え作製の方
法を含む。
組換え発現ベクター、そのような発現ベクターでトラン
スフェクトされた組換え宿主細胞、および癌抑制遺伝子
del-27によりコードされるタンパク質の組換え作製の方
法を含む。
【００１９】本発明は、さらに、試料（例えば、血液の
ような体液、細胞溶解物）を単離された本発明の核酸分
子と共にインキュベートすること、およびdel-27癌抑制
遺伝子である核酸分子の存在の決定として、該単離され
た核酸分子と標的核酸分子とのストリンジェントな条件
下でのハイブリダイゼーションを決定することを含む、
癌抑制遺伝子del-27の核酸分子を検出するための方法を
含む。
ような体液、細胞溶解物）を単離された本発明の核酸分
子と共にインキュベートすること、およびdel-27癌抑制
遺伝子である核酸分子の存在の決定として、該単離され
た核酸分子と標的核酸分子とのストリンジェントな条件
下でのハイブリダイゼーションを決定することを含む、
癌抑制遺伝子del-27の核酸分子を検出するための方法を
含む。
【００２０】本発明は、さらに、原核宿主細胞または真
核宿主細胞において外因性DNAを発現させ、所望のタン
パク質を単離することにより、細胞増殖を抑制すること
ができるタンパク質の製造方法を含む。該方法におい
て、DNAは、 ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、 ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる。
核宿主細胞において外因性DNAを発現させ、所望のタン
パク質を単離することにより、細胞増殖を抑制すること
ができるタンパク質の製造方法を含む。該方法におい
て、DNAは、 ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、 ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる。
【００２１】本発明は、さらに、配列番号：1に記載さ
れたヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードさ
れる、本発明に係る単離タンパク質を含む。
れたヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードさ
れる、本発明に係る単離タンパク質を含む。
【００２２】本発明は、癌進行遺伝子として特に特徴付
けられる、癌抑制遺伝子のクローニングおよび特徴決定
に関する。本発明の癌抑制遺伝子（del-27）の機能的欠
損により、癌細胞においては接触阻止および足場依存性
が解除される。従って、del-27遺伝子の欠損は、より攻
撃的な癌細胞の挙動と相関しており、転移形成能とも相
関している。
けられる、癌抑制遺伝子のクローニングおよび特徴決定
に関する。本発明の癌抑制遺伝子（del-27）の機能的欠
損により、癌細胞においては接触阻止および足場依存性
が解除される。従って、del-27遺伝子の欠損は、より攻
撃的な癌細胞の挙動と相関しており、転移形成能とも相
関している。
【００２３】本発明に従い、del-27およびその発現産物
を、好ましくは体細胞系遺伝子治療により、癌、好まし
くは散発性癌（特に、肺癌および膀胱癌）の増殖をイン
ビボで阻害するために使用することができる。
を、好ましくは体細胞系遺伝子治療により、癌、好まし
くは散発性癌（特に、肺癌および膀胱癌）の増殖をイン
ビボで阻害するために使用することができる。
【００２４】体細胞系遺伝子治療により、レトロウイル
ス・ベクターまたはアデノウイルス・ベクターと組み合
わせ、del-27 cDNAまたはその産物の観察される癌抑制
活性を、（特に肺癌および膀胱癌のような癌において）
散発性癌の癌増殖をインビボで阻害するために使用する
ことができる。
ス・ベクターまたはアデノウイルス・ベクターと組み合
わせ、del-27 cDNAまたはその産物の観察される癌抑制
活性を、（特に肺癌および膀胱癌のような癌において）
散発性癌の癌増殖をインビボで阻害するために使用する
ことができる。
【００２５】本発明に係る核酸分子においては、（１）
ａ）配列番号：1なる核酸配列を有するか、またはｂ）
配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、および30
70〜3137全て、もしくは相補的な核酸とストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞増殖を抑制す
ることができる、単離された核酸分子（del-27）である
ことを特徴とする。
ａ）配列番号：1なる核酸配列を有するか、またはｂ）
配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、および30
70〜3137全て、もしくは相補的な核酸とストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞増殖を抑制す
ることができる、単離された核酸分子（del-27）である
ことを特徴とする。
【００２６】また、本発明に係る発現ベクターにおいて
は、（２）上記(１)記載の核酸分子の発現に適した組換
え発現ベクターであることを特徴とする。
は、（２）上記(１)記載の核酸分子の発現に適した組換
え発現ベクターであることを特徴とする。
【００２７】また、本発明に係る組換えポリペプチドに
おいては、（３）細胞増殖を抑制し、かつ ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、 ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる、組換え
ポリペプチドであることを特徴とする。
おいては、（３）細胞増殖を抑制し、かつ ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、 ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる、組換え
ポリペプチドであることを特徴とする。
【００２８】また、本発明に係る製造方法においては、
（４）原核宿主細胞または真核宿主細胞において外因性
DNAを発現させ、所望のタンパク質を単離することによ
り、癌抑制活性を有するタンパク質を製造するための方
法であって、該DNAが、 ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、 ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる製造方法
であることを特徴とする。
（４）原核宿主細胞または真核宿主細胞において外因性
DNAを発現させ、所望のタンパク質を単離することによ
り、癌抑制活性を有するタンパク質を製造するための方
法であって、該DNAが、 ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、 ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる製造方法
であることを特徴とする。
【００２９】下記の実施例および配列表、ならびに本明
細書中に記載の参考文献は、本発明の理解を助けるため
に提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の請
求の範囲に記載されている。本発明の精神を逸脱するこ
となく、記載された方法を改変しうることを理解された
い。
細書中に記載の参考文献は、本発明の理解を助けるため
に提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の請
求の範囲に記載されている。本発明の精神を逸脱するこ
となく、記載された方法を改変しうることを理解された
い。
【００３０】
【発明の実施の形態】材料および方法 ファージ・クローンのスクリーニングおよび分析：正常
ヒト・ゲノミック・ライブラリー（Clontech、カタログ
番号HL1067J；Stratagene、カタログ番号946205）およ
びヒト胎児cDNAライブラリー（Clontech、カタログ番号
HL1065a）およびヒト胎盤cDNAライブラリー（Clontec
h、カタログ番号HL1075b）から作製された、105プラー
ク形成単位を含むファージ・プールを、ポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）によりスクリーニングした。PCR条件は、
記載されたとおりである（Wieland,I.,and Bohm,M.,Can
cer Res.54(1994)1772-1774）。プラーク・スクリーニ
ングのため、標準的な条件下（Sambrook,J.,et al.,Mol
ecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Har
bory,N.Y.Cold Spring Harbor Laborator,1989）で、フ
ィルター・リフト（filter lifts）に32P標識プローブ
をハイブリダイズさせ、洗浄した。陽性ファージを、PC
Rおよびプラーク・リフト・ハイブリダイゼーション（p
laque lift hybridization）により再スクリーニングし
た。単一の陽性プラークを単離し、キット（Qiagen、カ
タログ番号12523）を用いてファージDNAを調製した。制
限酵素分解およびサザンブロット・ハイブリダイゼーシ
ョンにより挿入配列を分析した。ゲノミック・クローン
については、SacI（Boehringer Mannheim）による分
解、およびプラスミド・ベクターpT7T3（Stratagene）
のSacI部位へのクローニング（Sambrook,J.,et al.,Mol
ecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Har
bor,N.Y.Cold Spring Harbor Laboratory,1989）により
ファージ挿入配列のサブクローンを作製した。単一コピ
ー断片の選択は、制限酵素分解された挿入配列のアガロ
ースゲル電気泳動、およびサザンブロット・ハイブリダ
イゼーションにおけるプローブとして全ゲノミックDNA
を用いた、反復性配列の対抗選択に基づき行った（Selt
mann,M.,et al., Cytogenet.Cell Genet.67(1994)46-5
1）。ゲノミック・サザンブロット・ハイブリダイゼー
ションは、記載された通りに行った（Wieland,I.,and B
ohm,M.,Cancer Res.54(1994)1772-1774; Wieland,I.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1992)2720-2724）。
ヒト・ゲノミック・ライブラリー（Clontech、カタログ
番号HL1067J；Stratagene、カタログ番号946205）およ
びヒト胎児cDNAライブラリー（Clontech、カタログ番号
HL1065a）およびヒト胎盤cDNAライブラリー（Clontec
h、カタログ番号HL1075b）から作製された、105プラー
ク形成単位を含むファージ・プールを、ポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）によりスクリーニングした。PCR条件は、
記載されたとおりである（Wieland,I.,and Bohm,M.,Can
cer Res.54(1994)1772-1774）。プラーク・スクリーニ
ングのため、標準的な条件下（Sambrook,J.,et al.,Mol
ecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Har
bory,N.Y.Cold Spring Harbor Laborator,1989）で、フ
ィルター・リフト（filter lifts）に32P標識プローブ
をハイブリダイズさせ、洗浄した。陽性ファージを、PC
Rおよびプラーク・リフト・ハイブリダイゼーション（p
laque lift hybridization）により再スクリーニングし
た。単一の陽性プラークを単離し、キット（Qiagen、カ
タログ番号12523）を用いてファージDNAを調製した。制
限酵素分解およびサザンブロット・ハイブリダイゼーシ
ョンにより挿入配列を分析した。ゲノミック・クローン
については、SacI（Boehringer Mannheim）による分
解、およびプラスミド・ベクターpT7T3（Stratagene）
のSacI部位へのクローニング（Sambrook,J.,et al.,Mol
ecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Har
bor,N.Y.Cold Spring Harbor Laboratory,1989）により
ファージ挿入配列のサブクローンを作製した。単一コピ
ー断片の選択は、制限酵素分解された挿入配列のアガロ
ースゲル電気泳動、およびサザンブロット・ハイブリダ
イゼーションにおけるプローブとして全ゲノミックDNA
を用いた、反復性配列の対抗選択に基づき行った（Selt
mann,M.,et al., Cytogenet.Cell Genet.67(1994)46-5
1）。ゲノミック・サザンブロット・ハイブリダイゼー
ションは、記載された通りに行った（Wieland,I.,and B
ohm,M.,Cancer Res.54(1994)1772-1774; Wieland,I.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1992)2720-2724）。
【００３１】DNA配列決定 重複cDNAクローンの両鎖を市販のものにより配列決定し
た（Eurogentec,Seraing,Bel.）。DNA配列は、DNAsis、
配列解析ソフトウェア（日立）を用いて解析した。
た（Eurogentec,Seraing,Bel.）。DNA配列は、DNAsis、
配列解析ソフトウェア（日立）を用いて解析した。
【００３２】細胞系および癌標本 ヒト肺癌細胞系は、記載された通りに入手し、培養した
（Wieland,I.,and Bohm,M.,Cancer Res.54(1994)1772-1
774; Wieland,I.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1992)272
0-2724）。
（Wieland,I.,and Bohm,M.,Cancer Res.54(1994)1772-1
774; Wieland,I.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1992)272
0-2724）。
【００３３】
【実施例】実施例１ del-27ゲノム領域の分析 del-27配列の隣接領域の分析のため、正常ヒト・ゲノミ
ック・ファージ・ライブラリーを、del-27配列の356bp
PCR産物の有無について、PCRによりスクリーニングした
（Wieland,I.,and Bohm,M.,Cancer Res.54(1994)1772-1
774）。del-27領域の21kbを含む2個の重複ファージ・ク
ローンを単離し、プラスミド・ベクターにサブクローニ
ングした。del-27領域由来の単一コピー・サブクローン
を、ゲノミック・サザンブロット上のハイブリダイゼー
ション・プローブとして用いた。内部HindII部位を含む
プローブp17Eが、4.3kbの二番目に大きいHindII断片に
ハイブリダイズした。しかし、ヒト肺癌細胞系SK-LC-17
においては、4.3kbのHindII断片は見られず、1.3kbの小
さい断片が出現した。従って、サブクローンp17Eによ
り、この細胞系に3kbのホモ接合性の欠失が存在するこ
とが同定された。このホモ接合性の欠失には、既に単離
されたdel-27配列が含まれる。PstI部位も欠失してお
り、その結果、再編成されたPstI制限断片が生じた。プ
ローブとしてサブクローンp13Bを用いると、同細胞系に
おいて、この欠失からわずか3.5kbの距離に1.4kbの第二
のホモ接合性の欠失が同定された。サザンブロット実験
により、それ以外のホモ接合性欠失または再編成は、21
kb領域内に観察されなかった。これは、ゲノムの再編成
を伴うホモ接合性欠失が、ヒト肺癌細胞系SK-LC-17のde
l-27領域の10kb内に生じたことを示している。プローブ
p13Bは、第5染色体のdel-27領域から強力なハイブリダ
イゼーション・シグナルを発しただけでなく、ゲノミッ
ク・サザンブロットでも弱いシグナルを発した。プロー
ブp13Bが、ヒトゲノム中の他の染色体領域に交叉ハイブ
リダイズするか否かを決定するため、体細胞ハイブリッ
ド・パネルを分析した（Wieland,I.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 87(1992)2720-2724）。ヒト第13染色体を含む体
細胞ハイブリッド中に交叉ハイブリダイゼーション・シ
グナルが検出された。このことは、del-27領域由来のp1
3B配列に対する配列相同性が、ヒト第13染色体上に存在
していることを示している。サブクローンp17Eおよびp1
3Bが、可能性のあるエキソン配列を検出するか否かを調
査するため、種間の保存性を分析した。両方のサブクロ
ーンが、いくつかの種由来のゲノム断片にハイブリダイ
ズした。特に、サブクローンp13Bは、試験した哺乳動物
DNA（ヒト、アフリカミドリザル、マウス、ラット、ハ
ムスター、イヌ、ウシ）全てにハイブリダイズし、ニワ
トリにもハイブリダイズしたため、高度に保存されてい
るようであった。このことから、遺伝子のエキソン配列
がdel-27領域内に存在することが示唆された。
ック・ファージ・ライブラリーを、del-27配列の356bp
PCR産物の有無について、PCRによりスクリーニングした
（Wieland,I.,and Bohm,M.,Cancer Res.54(1994)1772-1
774）。del-27領域の21kbを含む2個の重複ファージ・ク
ローンを単離し、プラスミド・ベクターにサブクローニ
ングした。del-27領域由来の単一コピー・サブクローン
を、ゲノミック・サザンブロット上のハイブリダイゼー
ション・プローブとして用いた。内部HindII部位を含む
プローブp17Eが、4.3kbの二番目に大きいHindII断片に
ハイブリダイズした。しかし、ヒト肺癌細胞系SK-LC-17
においては、4.3kbのHindII断片は見られず、1.3kbの小
さい断片が出現した。従って、サブクローンp17Eによ
り、この細胞系に3kbのホモ接合性の欠失が存在するこ
とが同定された。このホモ接合性の欠失には、既に単離
されたdel-27配列が含まれる。PstI部位も欠失してお
り、その結果、再編成されたPstI制限断片が生じた。プ
ローブとしてサブクローンp13Bを用いると、同細胞系に
おいて、この欠失からわずか3.5kbの距離に1.4kbの第二
のホモ接合性の欠失が同定された。サザンブロット実験
により、それ以外のホモ接合性欠失または再編成は、21
kb領域内に観察されなかった。これは、ゲノムの再編成
を伴うホモ接合性欠失が、ヒト肺癌細胞系SK-LC-17のde
l-27領域の10kb内に生じたことを示している。プローブ
p13Bは、第5染色体のdel-27領域から強力なハイブリダ
イゼーション・シグナルを発しただけでなく、ゲノミッ
ク・サザンブロットでも弱いシグナルを発した。プロー
ブp13Bが、ヒトゲノム中の他の染色体領域に交叉ハイブ
リダイズするか否かを決定するため、体細胞ハイブリッ
ド・パネルを分析した（Wieland,I.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 87(1992)2720-2724）。ヒト第13染色体を含む体
細胞ハイブリッド中に交叉ハイブリダイゼーション・シ
グナルが検出された。このことは、del-27領域由来のp1
3B配列に対する配列相同性が、ヒト第13染色体上に存在
していることを示している。サブクローンp17Eおよびp1
3Bが、可能性のあるエキソン配列を検出するか否かを調
査するため、種間の保存性を分析した。両方のサブクロ
ーンが、いくつかの種由来のゲノム断片にハイブリダイ
ズした。特に、サブクローンp13Bは、試験した哺乳動物
DNA（ヒト、アフリカミドリザル、マウス、ラット、ハ
ムスター、イヌ、ウシ）全てにハイブリダイズし、ニワ
トリにもハイブリダイズしたため、高度に保存されてい
るようであった。このことから、遺伝子のエキソン配列
がdel-27領域内に存在することが示唆された。
【００３４】実施例２ del-27 cDNAの単離 高度に保存されたクローンp13Bから導出されたプライマ
ーを用いたPCRにより、ヒトcDNAライブラリーをスクリ
ーニングした。いくつかの重複するクローンが単離さ
れ、その配列を決定した。整列させた3665bpのcDNAは、
2661bp（477位から3137位のヌクレオチド）のオープン
・リーディング・フレームを含む。これは、887アミノ
酸配列に相当する。del-27 cDNAを、ジェンバンク（Gen
Bank）の既知のcDNAと比較することにより、820位から3
069位のヌクレオチドに、接触阻止および足場依存性増
殖に関与している推定膜貫通タンパク質をコードするマ
ウスcDNA（ジェンバンク登録番号U57368、MMU57368）と
相同（90％同一）な領域が同定された。
ーを用いたPCRにより、ヒトcDNAライブラリーをスクリ
ーニングした。いくつかの重複するクローンが単離さ
れ、その配列を決定した。整列させた3665bpのcDNAは、
2661bp（477位から3137位のヌクレオチド）のオープン
・リーディング・フレームを含む。これは、887アミノ
酸配列に相当する。del-27 cDNAを、ジェンバンク（Gen
Bank）の既知のcDNAと比較することにより、820位から3
069位のヌクレオチドに、接触阻止および足場依存性増
殖に関与している推定膜貫通タンパク質をコードするマ
ウスcDNA（ジェンバンク登録番号U57368、MMU57368）と
相同（90％同一）な領域が同定された。
【００３５】これらの結果から、del-27遺伝子および／
または関連遺伝子の機能的欠損により、癌細胞において
接触阻止および足場依存性が解除されることが示唆され
る。これは、del-27遺伝子が、膀胱癌における癌細胞の
より攻撃的な挙動と相関しているという観察（Bohm,M.,
Int.J.Cancer 72(1997)1-5）により裏付けられる。
または関連遺伝子の機能的欠損により、癌細胞において
接触阻止および足場依存性が解除されることが示唆され
る。これは、del-27遺伝子が、膀胱癌における癌細胞の
より攻撃的な挙動と相関しているという観察（Bohm,M.,
Int.J.Cancer 72(1997)1-5）により裏付けられる。
【００３６】実施例３ del-27 cDNAの癌抑制遺伝子としての機能試験 del-27 cDNAの癌抑制活性は、del-27 cDNAの全コーディ
ング領域またはコーディング領域の一部のいずれかを癌
細胞に導入することにより、試験することができる。
ング領域またはコーディング領域の一部のいずれかを癌
細胞に導入することにより、試験することができる。
【００３７】全コーディング領域またはインフレームの
コーディング領域の一部を、テトラサイクリンにより誘
導可能な発現ベクターpUHD10-3（Gossen,M.,and Bujar
d,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992) 5547-5551）に
クローニングする。異なる構築物を、選択マーカーと共
に、プラスミドpUHD172-1neo（Gossen,M.et al.,Scienc
e 268(1995) 1766-1769）上のrtTa遺伝子を含む癌細胞
にエレクトロポレーションにより導入する。選択された
細胞クローンにおいて、細胞をテトラサイクリンまたは
ドキシサイクリンで処理することにより、del-27 cDNA
の発現を誘導する。インビトロで、誘導された細胞の増
殖能およびアポトーシスを非誘導細胞と比較して測定す
ることにより、del-27 cDNA構築物の癌抑制活性を決定
する。得られた癌細胞を、インビボのマウス・モデルで
さらに調査する。細胞を免疫不全マウスに注入する。小
さな癌結節が出現した場合には、テトラサイクリンによ
り癌細胞中のdel-27 cDNA構築物の発現を誘導する。誘
導状態および非誘導状態で、癌抑制（癌増殖阻害、腫瘍
減退）をモニターする。
コーディング領域の一部を、テトラサイクリンにより誘
導可能な発現ベクターpUHD10-3（Gossen,M.,and Bujar
d,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992) 5547-5551）に
クローニングする。異なる構築物を、選択マーカーと共
に、プラスミドpUHD172-1neo（Gossen,M.et al.,Scienc
e 268(1995) 1766-1769）上のrtTa遺伝子を含む癌細胞
にエレクトロポレーションにより導入する。選択された
細胞クローンにおいて、細胞をテトラサイクリンまたは
ドキシサイクリンで処理することにより、del-27 cDNA
の発現を誘導する。インビトロで、誘導された細胞の増
殖能およびアポトーシスを非誘導細胞と比較して測定す
ることにより、del-27 cDNA構築物の癌抑制活性を決定
する。得られた癌細胞を、インビボのマウス・モデルで
さらに調査する。細胞を免疫不全マウスに注入する。小
さな癌結節が出現した場合には、テトラサイクリンによ
り癌細胞中のdel-27 cDNA構築物の発現を誘導する。誘
導状態および非誘導状態で、癌抑制（癌増殖阻害、腫瘍
減退）をモニターする。
【００３８】
【発明の効果】本発明により、新規な癌抑制遺伝子であ
る、配列番号：1および相補配列とストリンジェントな
条件下でハイブリダイズする核酸分子が単離された。
る、配列番号：1および相補配列とストリンジェントな
条件下でハイブリダイズする核酸分子が単離された。
SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER MANNHEIM GMBH <120> New tumor suppressor gene and the protein co
ded thereby, methods of production and use thereof <130> RC-102 <150> EP 98103334.3 <151> 1998.2.26 <160> 2 <170> PatentIn Release #1.0, Version #1.30B (EPO) <210> 1 <211> 3691 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (477)..(3137) <400> 1 gggccggggt gcggagggag tccctgaaac ttctcccaac agccccaggg ccaatcttcc 60 ctcagcccac tcccctcttc gccagctccc aggtccccac tcctgtaccg ggggtggggt 120 ggggagccag gcccgtctcc cgctgggaca cacacagggg ccggggagcg gggacgggac 180 ccccgaggcg ggggggacga accgacagac agacggctgg gcgcccgccc cagcgggcag 240 gcaggcagga ggaggcggag gcgggggtac gacggggagc actgggtctg gggagtttcc 300 tctcaactat cgggggagaa actccccgca gccggaggaa agacccagac agtgttttcc 360 tcccgggggc cgtgctcccc cgccccgcgt agcggcggtc gccgccaccg gcgcctccac 420 ctctaccatc tcctctttct ccaccacctc gggccccggt gtccccggcc agcact 476 atg ccc atc tta ctg ttc ctg ata gac acg tct gcc tct atg aac cag 524 Met Pro Ile Leu Leu Phe Leu Ile Asp Thr Ser Ala Ser Met Asn Gln 1 5 10 15 cgc agc cat ctg ggc acc acc tac ctg gac acg gcc aaa ggc gcg gta 572 Arg Ser His Leu Gly Thr Thr Tyr Leu Asp Thr Ala Lys Gly Ala Val 20 25 30 gag acc ttc atg aag ctc cgt gcc cgg gac cct gcc agc aga gga gac 620 Glu Thr Phe Met Lys Leu Arg Ala Arg Asp Pro Ala Ser Arg Gly Asp 35 40 45 agg tat atg ctg gtc act ttc gaa gag ccg ccc tat gct atc aag gct 668 Arg Tyr Met Leu Val Thr Phe Glu Glu Pro Pro Tyr Ala Ile Lys Ala 50 55 60 gga tgg aaa gaa aac cat gca acg ttt atg aat gaa ttg aaa aac ctt 716 Gly Trp Lys Glu Asn His Ala Thr Phe Met Asn Glu Leu Lys Asn Leu 65 70 75 80 cag gct gaa gga ctt acg act ctt ggc caa tcc cta agg aca gct ttt 764 Gln Ala Glu Gly Leu Thr Thr Leu Gly Gln Ser Leu Arg Thr Ala Phe 85 90 95 gat tta tta aat tta aat aga tta gta act ggc ata gac aac tat ggg 812 Asp Leu Leu Asn Leu Asn Arg Leu Val Thr Gly Ile Asp Asn Tyr Gly 100 105 110 cag gga aga aac cct ttt ttc ttg gag cca gca ata att atc aca att 860 Gln Gly Arg Asn Pro Phe Phe Leu Glu Pro Ala Ile Ile Ile Thr Ile 115 120 125 act gat ggg agc aag ttg act acc acc agt gga gtc cag gat gag ctt 908 Thr Asp Gly Ser Lys Leu Thr Thr Thr Ser Gly Val Gln Asp Glu Leu 130 135 140 cat tta cct ctt aat tct cct ttg cct gga agt gaa ttg acc aag gaa 956 His Leu Pro Leu Asn Ser Pro Leu Pro Gly Ser Glu Leu Thr Lys Glu 145 150 155 160 cct ttt cgt tgg gat cag aga ctc ttt gca tta gtg ttg cgg ttg cct 1 004 Pro Phe Arg Trp Asp Gln Arg Leu Phe Ala Leu Val Leu Arg Leu Pro 165 170 175 ggc acc atg tca gta gaa tca gaa cag ttg aca ggt gtg cct tta gat 1 052 Gly Thr Met Ser Val Glu Ser Glu Gln Leu Thr Gly Val Pro Leu Asp 180 185 190 gac tct gca atc aca cca atg tgt gaa gtg aca ggc ggc cgt tca tat 1 100 Asp Ser Ala Ile Thr Pro Met Cys Glu Val Thr Gly Gly Arg Ser Tyr 195 200 205 tct gtg tgt tct cca aga atg ctt aat cag tgt ctg gag tcc ttg gtg 1 148 Ser Val Cys Ser Pro Arg Met Leu Asn Gln Cys Leu Glu Ser Leu Val 210 215 220 cag aaa gta caa agt ggg gtg gta ata aac ttt gaa aaa gca gga cca 1 196 Gln Lys Val Gln Ser Gly Val Val Ile Asn Phe Glu Lys Ala Gly Pro 225 230 235 240 gat cct tcc cct gta gaa gat ggg cag cca gat ata tca agg cct ttt 1 244 Asp Pro Ser Pro Val Glu Asp Gly Gln Pro Asp Ile Ser Arg Pro Phe 245 250 255 gga tct cag cct tgg cat agc tgt cac aaa ctc ata tat gtc aga cca 1 292 Gly Ser Gln Pro Trp His Ser Cys His Lys Leu Ile Tyr Val Arg Pro 260 265 270 aat cct aaa act ggg gtt cct ata ggt cat tgg cct gtt cca gag tct 1 340 Asn Pro Lys Thr Gly Val Pro Ile Gly His Trp Pro Val Pro Glu Ser 275 280 285 ttt tgg cca gat caa aat tcg cca aca cta cca cct cgt aca tct cat 1 388 Phe Trp Pro Asp Gln Asn Ser Pro Thr Leu Pro Pro Arg Thr Ser His 290 295 300 cct gta gtg aag ttt tcc tgt aca gac tgt gaa cca atg gtt att gat 1 436 Pro Val Val Lys Phe Ser Cys Thr Asp Cys Glu Pro Met Val Ile Asp 305 310 315 320 aaa ctt cct ttt gac aaa tat gag ttg gaa cct tca cca ctg act caa 1 484 Lys Leu Pro Phe Asp Lys Tyr Glu Leu Glu Pro Ser Pro Leu Thr Gln 325 330 335 ttt atc ctg gaa agg aaa tct cct caa aca tgt tgg cag gtg tac gtg 1 532 Phe Ile Leu Glu Arg Lys Ser Pro Gln Thr Cys Trp Gln Val Tyr Val 340 345 350 agc aat agt gca aaa tac agt gaa ctt ggt cat cct ttt ggt tac ttg 1 580 Ser Asn Ser Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Gly His Pro Phe Gly Tyr Leu 355 360 365 aaa gcc agt aca gca ctg aac tgt gtc aac tta ttt gtg atg cct tac 1 628 Lys Ala Ser Thr Ala Leu Asn Cys Val Asn Leu Phe Val Met Pro Tyr 370 375 380 aat tat cca gtc ctt ctt ccc ctc tta gat gac ttg ttt aaa gtg cat 1 676 Asn Tyr Pro Val Leu Leu Pro Leu Leu Asp Asp Leu Phe Lys Val His 385 390 395 400 aaa gca aaa cca aca ttg aag tgg aga cag tca ttt gaa agt tat ttg 1 724 Lys Ala Lys Pro Thr Leu Lys Trp Arg Gln Ser Phe Glu Ser Tyr Leu 405 410 415 aag aca atg cct ccc tac tat ctt ggg ccc ttg aag aaa gct gtt agg 1 772 Lys Thr Met Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Pro Leu Lys Lys Ala Val Arg 420 425 430 atg atg gga gca cct aac cta ata gca gac agt atg gaa tat gga ctt 1 820 Met Met Gly Ala Pro Asn Leu Ile Ala Asp Ser Met Glu Tyr Gly Leu 435 440 445 agt tac agt gtc att tca tac ctc aaa aaa ctg agt caa cag gcc aaa 1 868 Ser Tyr Ser Val Ile Ser Tyr Leu Lys Lys Leu Ser Gln Gln Ala Lys 450 455 460 ata gaa tct gat cga gtc att gga tct gta ggc aaa aaa gta gta cag 1 916 Ile Glu Ser Asp Arg Val Ile Gly Ser Val Gly Lys Lys Val Val Gln 465 470 475 480 gag act gga ata aaa gtc cgg agc cga tca cat ggt tta tca atg gca 1 964 Glu Thr Gly Ile Lys Val Arg Ser Arg Ser His Gly Leu Ser Met Ala 485 490 495 tat agg aaa gat ttt caa caa ctc ctc cag gga att tca gag gat gtc 2 012 Tyr Arg Lys Asp Phe Gln Gln Leu Leu Gln Gly Ile Ser Glu Asp Val 500 505 510 cct cac aga ctg cta gac ctt aat atg aag gaa tac act ggg ttc caa 2 060 Pro His Arg Leu Leu Asp Leu Asn Met Lys Glu Tyr Thr Gly Phe Gln 515 520 525 gtt gct ttg ctg aat aag gat ttg aag cca cag aca ttt aga aat gct 2 108 Val Ala Leu Leu Asn Lys Asp Leu Lys Pro Gln Thr Phe Arg Asn Ala 530 535 540 tat gac ata cca aga cga aat ctt ttg gat cac tta aca aga atg aga 2 156 Tyr Asp Ile Pro Arg Arg Asn Leu Leu Asp His Leu Thr Arg Met Arg 545 550 555 560 tct aat ctt ttg aag agc act cgc aga ttt ctg aaa gga cag gac gaa 2 204 Ser Asn Leu Leu Lys Ser Thr Arg Arg Phe Leu Lys Gly Gln Asp Glu 565 570 575 gat caa gtg cac agt gtt cct ata gca caa atg ggg aac tac cag gaa 2 252 Asp Gln Val His Ser Val Pro Ile Ala Gln Met Gly Asn Tyr Gln Glu 580 585 590 tac ctc aag caa gta cct tct cca cta aga gaa ctt gat cct gat cag 2 300 Tyr Leu Lys Gln Val Pro Ser Pro Leu Arg Glu Leu Asp Pro Asp Gln 595 600 605 cca cga agg ttg cat aca ttt ggc aac ccc ttt aag ctg gat aag aag 2 348 Pro Arg Arg Leu His Thr Phe Gly Asn Pro Phe Lys Leu Asp Lys Lys 610 615 620 ggt atg atg ata gat gaa gca gat gaa ttt gtg gct gga cct caa aat 2 396 Gly Met Met Ile Asp Glu Ala Asp Glu Phe Val Ala Gly Pro Gln Asn 625 630 635 640 aaa cat aaa cga ccc gga gaa cca aat atg caa ggg atc cct aaa aga 2 444 Lys His Lys Arg Pro Gly Glu Pro Asn Met Gln Gly Ile Pro Lys Arg 645 650 655 cgt cgg tgt atg tct cca cta cta aga ggc aga cag cag aat cct gtt 2 492 Arg Arg Cys Met Ser Pro Leu Leu Arg Gly Arg Gln Gln Asn Pro Val 660 665 670 gta aac aat cat att ggg gga aaa gga cca cct gca cct aca act caa 2 540 Val Asn Asn His Ile Gly Gly Lys Gly Pro Pro Ala Pro Thr Thr Gln 675 680 685 gca cag cca gat ctt att aaa cct ctt cct ctt cat aaa att tca gaa 2 588 Ala Gln Pro Asp Leu Ile Lys Pro Leu Pro Leu His Lys Ile Ser Glu 690 695 700 acc act aat gat tcg ata ata cat gat gtg gtt gaa aat cat gtt gca 2 636 Thr Thr Asn Asp Ser Ile Ile His Asp Val Val Glu Asn His Val Ala 705 710 715 720 gac caa ctt tca tca gac att aca cca aat gct atg gat acg gaa ttt 2 684 Asp Gln Leu Ser Ser Asp Ile Thr Pro Asn Ala Met Asp Thr Glu Phe 725 730 735 tca gca tct tct cca gcc agt tta ctg gaa cgg cca acc aat cat atg 2 732 Ser Ala Ser Ser Pro Ala Ser Leu Leu Glu Arg Pro Thr Asn His Met 740 745 750 gag gct ctt ggt cat gac cat tta gga acc aat gac ctc act gtt ggt 2 780 Glu Ala Leu Gly His Asp His Leu Gly Thr Asn Asp Leu Thr Val Gly 755 760 765 gga ttt tta gaa aat cat gag gag cca aga gat aaa gaa caa tgt gct 2 828 Gly Phe Leu Glu Asn His Glu Glu Pro Arg Asp Lys Glu Gln Cys Ala 770 775 780 gaa gag aac ata cca gca tct tca ctc aac aaa gga aag aaa ttg atg 2 876 Glu Glu Asn Ile Pro Ala Ser Ser Leu Asn Lys Gly Lys Lys Leu Met 785 790 795 800 cat tgc aga agc cat gaa gag gtc aat act gaa cta aaa gca caa ata 2 924 His Cys Arg Ser His Glu Glu Val Asn Thr Glu Leu Lys Ala Gln Ile 805 810 815 atg aaa gag atc cga aag cca gga aga aaa tat gaa aga atc ttc act 2 972 Met Lys Glu Ile Arg Lys Pro Gly Arg Lys Tyr Glu Arg Ile Phe Thr 820 825 830 tta ctg aag cat gtg caa ggc agt tta caa aca aga cta ata ttt tta 3 020 Leu Leu Lys His Val Gln Gly Ser Leu Gln Thr Arg Leu Ile Phe Leu 835 840 845 caa aat gtc att aaa gaa gca tca agg ttt aaa aaa cga atg cta ata 3 068 Gln Asn Val Ile Lys Glu Ala Ser Arg Phe Lys Lys Arg Met Leu Ile 850 855 860 gaa caa ctg gag aac ttc ttg gat gaa att cat cga aga gcc aat cag 3 116 Glu Gln Leu Glu Asn Phe Leu Asp Glu Ile His Arg Arg Ala Asn Gln 865 870 875 880 atc aac cat att aat agc aat taaaagaaaa tagaatgtgg ccacttattt 3 167 Ile Asn His Ile Asn Ser Asn 885 cactatcttc ttcaaataca aagtaaataa caagactgtt gtgatcttgc attcattttc 3 227 tgacatgcat tgttggctat ttgaaatact aaaagcaaat ctacagatcc tttttccatc 3 287 attttacagt gaccttttct tcattttggt ttatttttgt aatgtgaaaa gtatcactct 3 347 aaaaaacatt tttaatttaa caaactaaaa atattcctcc aaatctcttg cttgtcattg 3 407 actcttgcgt gtcaatttcc ctcaggttct attttcttaa accaaccttt aaaattgtca 3 467 cctctgttaa ggttgaactt tgccaaaaaa aaaagaagtt actttgtaat ttttggggaa 3 527 aaaagcacat acattaaaac taggtaatgt tttgtatata cagttatttt ggatatatta 3 587 ttgtaagttg tacaaatgta ttttgaagaa tatttaagaa aagcactttt gttattccat 3 647 caataaatgc tctattttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 3 691 <210> 2 <211> 887 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Ile Leu Leu Phe Leu Ile Asp Thr Ser Ala Ser Met Asn Gln 1 5 10 15 Arg Ser His Leu Gly Thr Thr Tyr Leu Asp Thr Ala Lys Gly Ala Val 20 25 30 Glu Thr Phe Met Lys Leu Arg Ala Arg Asp Pro Ala Ser Arg Gly Asp 35 40 45 Arg Tyr Met Leu Val Thr Phe Glu Glu Pro Pro Tyr Ala Ile Lys Ala 50 55 60 Gly Trp Lys Glu Asn His Ala Thr Phe Met Asn Glu Leu Lys Asn Leu 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285 Phe Trp Pro Asp Gln Asn Ser Pro Thr Leu Pro Pro Arg Thr Ser His 290 295 300 Pro Val Val Lys Phe Ser Cys Thr Asp Cys Glu Pro Met Val Ile Asp 305 310 315 320 Lys Leu Pro Phe Asp Lys Tyr Glu Leu Glu Pro Ser Pro Leu Thr Gln 325 330 335 Phe Ile Leu Glu Arg Lys Ser Pro Gln Thr Cys Trp Gln Val Tyr Val 340 345 350 Ser Asn Ser Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Gly His Pro Phe Gly Tyr Leu 355 360 365 Lys Ala Ser Thr Ala Leu Asn Cys Val Asn Leu Phe Val Met Pro Tyr 370 375 380 Asn Tyr Pro Val Leu Leu Pro Leu Leu Asp Asp Leu Phe Lys Val His 385 390 395 400 Lys Ala Lys Pro Thr Leu Lys Trp Arg Gln Ser Phe Glu Ser Tyr Leu 405 410 415 Lys Thr Met Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Pro Leu Lys Lys Ala Val Arg 420 425 430 Met Met Gly Ala Pro Asn Leu Ile Ala Asp Ser Met Glu Tyr Gly Leu 435 440 445 Ser Tyr Ser Val Ile Ser Tyr Leu Lys Lys Leu Ser Gln Gln Ala Lys 450 455 460 Ile Glu Ser Asp Arg Val Ile Gly Ser Val Gly Lys Lys Val Val Gln 465 470 475 480 Glu Thr Gly Ile Lys Val Arg Ser Arg Ser His Gly Leu Ser Met Ala 485 490 495 Tyr Arg Lys Asp Phe Gln Gln Leu Leu Gln Gly Ile Ser Glu Asp Val 500 505 510 Pro His Arg Leu Leu Asp Leu Asn Met Lys Glu Tyr Thr Gly Phe Gln 515 520 525 Val Ala Leu Leu Asn Lys Asp Leu Lys Pro Gln Thr Phe Arg Asn Ala 530 535 540 Tyr Asp Ile Pro Arg Arg Asn Leu Leu Asp His Leu Thr Arg Met Arg 545 550 555 560 Ser Asn Leu Leu Lys Ser Thr Arg Arg Phe Leu Lys Gly Gln Asp Glu 565 570 575 Asp Gln Val His Ser Val Pro Ile Ala Gln Met Gly Asn Tyr Gln Glu 580 585 590 Tyr Leu Lys Gln Val Pro Ser Pro Leu Arg Glu Leu Asp Pro Asp Gln 595 600 605 Pro Arg Arg Leu His Thr Phe Gly Asn Pro Phe Lys Leu Asp Lys Lys 610 615 620 Gly Met Met Ile Asp Glu Ala Asp Glu Phe Val Ala Gly Pro Gln Asn 625 630 635 640 Lys His Lys Arg Pro Gly Glu Pro Asn Met Gln Gly Ile Pro Lys Arg 645 650 655 Arg Arg Cys Met Ser Pro Leu Leu Arg Gly Arg Gln Gln Asn Pro Val 660 665 670 Val Asn Asn His Ile Gly Gly Lys Gly Pro Pro Ala Pro Thr Thr Gln 675 680 685 Ala Gln Pro Asp Leu Ile Lys Pro Leu Pro Leu His Lys Ile Ser Glu 690 695 700 Thr Thr Asn Asp Ser Ile Ile His Asp Val Val Glu Asn His Val Ala 705 710 715 720 Asp Gln Leu Ser Ser Asp Ile Thr Pro Asn Ala Met Asp Thr Glu Phe 725 730 735 Ser Ala Ser Ser Pro Ala Ser Leu Leu Glu Arg Pro Thr Asn His Met 740 745 750 Glu Ala Leu Gly His Asp His Leu Gly Thr Asn Asp Leu Thr Val Gly 755 760 765 Gly Phe Leu Glu Asn His Glu Glu Pro Arg Asp Lys Glu Gln Cys Ala 770 775 780 Glu Glu Asn Ile Pro Ala Ser Ser Leu Asn Lys Gly Lys Lys Leu Met 785 790 795 800 His Cys Arg Ser His Glu Glu Val Asn Thr Glu Leu Lys Ala Gln Ile 805 810 815 Met Lys Glu Ile Arg Lys Pro Gly Arg Lys Tyr Glu Arg Ile Phe Thr 820 825 830 Leu Leu Lys His Val Gln Gly Ser Leu Gln Thr Arg Leu Ile Phe Leu 835 840 845 Gln Asn Val Ile Lys Glu Ala Ser Arg Phe Lys Lys Arg Met Leu Ile 850 855 860 Glu Gln Leu Glu Asn Phe Leu Asp Glu Ile His Arg Arg Ala Asn Gln 865 870 875 880 Ile Asn His Ile Asn Ser Asn 885
ded thereby, methods of production and use thereof <130> RC-102 <150> EP 98103334.3 <151> 1998.2.26 <160> 2 <170> PatentIn Release #1.0, Version #1.30B (EPO) <210> 1 <211> 3691 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (477)..(3137) <400> 1 gggccggggt gcggagggag tccctgaaac ttctcccaac agccccaggg ccaatcttcc 60 ctcagcccac tcccctcttc gccagctccc aggtccccac tcctgtaccg ggggtggggt 120 ggggagccag gcccgtctcc cgctgggaca cacacagggg ccggggagcg gggacgggac 180 ccccgaggcg ggggggacga accgacagac agacggctgg gcgcccgccc cagcgggcag 240 gcaggcagga ggaggcggag gcgggggtac gacggggagc actgggtctg gggagtttcc 300 tctcaactat cgggggagaa actccccgca gccggaggaa agacccagac agtgttttcc 360 tcccgggggc cgtgctcccc cgccccgcgt agcggcggtc gccgccaccg gcgcctccac 420 ctctaccatc tcctctttct ccaccacctc gggccccggt gtccccggcc agcact 476 atg ccc atc tta ctg ttc ctg ata gac acg tct gcc tct atg aac cag 524 Met Pro Ile Leu Leu Phe Leu Ile Asp Thr Ser Ala Ser Met Asn Gln 1 5 10 15 cgc agc cat ctg ggc acc acc tac ctg gac acg gcc aaa ggc gcg gta 572 Arg Ser His Leu Gly Thr Thr Tyr Leu Asp Thr Ala Lys Gly Ala Val 20 25 30 gag acc ttc atg aag ctc cgt gcc cgg gac cct gcc agc aga gga gac 620 Glu Thr Phe Met Lys Leu Arg Ala Arg Asp Pro Ala Ser Arg Gly Asp 35 40 45 agg tat atg ctg gtc act ttc gaa gag ccg ccc tat gct atc aag gct 668 Arg Tyr Met Leu Val Thr Phe Glu Glu Pro Pro Tyr Ala Ile Lys Ala 50 55 60 gga tgg aaa gaa aac cat gca acg ttt atg aat gaa ttg aaa aac ctt 716 Gly Trp Lys Glu Asn His Ala Thr Phe Met Asn Glu Leu Lys Asn Leu 65 70 75 80 cag gct gaa gga ctt acg act ctt ggc caa tcc cta agg aca gct ttt 764 Gln Ala Glu Gly Leu Thr Thr Leu Gly Gln Ser Leu Arg Thr Ala Phe 85 90 95 gat tta tta aat tta aat aga tta gta act ggc ata gac aac tat ggg 812 Asp Leu Leu Asn Leu Asn Arg Leu Val Thr Gly Ile Asp Asn Tyr Gly 100 105 110 cag gga aga aac cct ttt ttc ttg gag cca gca ata att atc aca att 860 Gln Gly Arg Asn Pro Phe Phe Leu Glu Pro Ala Ile Ile Ile Thr Ile 115 120 125 act gat ggg agc aag ttg act acc acc agt gga gtc cag gat gag ctt 908 Thr Asp Gly Ser Lys Leu Thr Thr Thr Ser Gly Val Gln Asp Glu Leu 130 135 140 cat tta cct ctt aat tct cct ttg cct gga agt gaa ttg acc aag gaa 956 His Leu Pro Leu Asn Ser Pro Leu Pro Gly Ser Glu Leu Thr Lys Glu 145 150 155 160 cct ttt cgt tgg gat cag aga ctc ttt gca tta gtg ttg cgg ttg cct 1 004 Pro Phe Arg Trp Asp Gln Arg Leu Phe Ala Leu Val Leu Arg Leu Pro 165 170 175 ggc acc atg tca gta gaa tca gaa cag ttg aca ggt gtg cct tta gat 1 052 Gly Thr Met Ser Val Glu Ser Glu Gln Leu Thr Gly Val Pro Leu Asp 180 185 190 gac tct gca atc aca cca atg tgt gaa gtg aca ggc ggc cgt tca tat 1 100 Asp Ser Ala Ile Thr Pro Met Cys Glu Val Thr Gly Gly Arg Ser Tyr 195 200 205 tct gtg tgt tct cca aga atg ctt aat cag tgt ctg gag tcc ttg gtg 1 148 Ser Val Cys Ser Pro Arg Met Leu Asn Gln Cys Leu Glu Ser Leu Val 210 215 220 cag aaa gta caa agt ggg gtg gta ata aac ttt gaa aaa gca gga cca 1 196 Gln Lys Val Gln Ser Gly Val Val Ile Asn Phe Glu Lys Ala Gly Pro 225 230 235 240 gat cct tcc cct gta gaa gat ggg cag cca gat ata tca agg cct ttt 1 244 Asp Pro Ser Pro Val Glu Asp Gly Gln Pro Asp Ile Ser Arg Pro Phe 245 250 255 gga tct cag cct tgg cat agc tgt cac aaa ctc ata tat gtc aga cca 1 292 Gly Ser Gln Pro Trp His Ser Cys His Lys Leu Ile Tyr Val Arg Pro 260 265 270 aat cct aaa act ggg gtt cct ata ggt cat tgg cct gtt cca gag tct 1 340 Asn Pro Lys Thr Gly Val Pro Ile Gly His Trp Pro Val Pro Glu Ser 275 280 285 ttt tgg cca gat caa aat tcg cca aca cta cca cct cgt aca tct cat 1 388 Phe Trp Pro Asp Gln Asn Ser Pro Thr Leu Pro Pro Arg Thr Ser His 290 295 300 cct gta gtg aag ttt tcc tgt aca gac tgt gaa cca atg gtt att gat 1 436 Pro Val Val Lys Phe Ser Cys Thr Asp Cys Glu Pro Met Val Ile Asp 305 310 315 320 aaa ctt cct ttt gac aaa tat gag ttg gaa cct tca cca ctg act caa 1 484 Lys Leu Pro Phe Asp Lys Tyr Glu Leu Glu Pro Ser Pro Leu Thr Gln 325 330 335 ttt atc ctg gaa agg aaa tct cct caa aca tgt tgg cag gtg tac gtg 1 532 Phe Ile Leu Glu Arg Lys Ser Pro Gln Thr Cys Trp Gln Val Tyr Val 340 345 350 agc aat agt gca aaa tac agt gaa ctt ggt cat cct ttt ggt tac ttg 1 580 Ser Asn Ser Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Gly His Pro Phe Gly Tyr Leu 355 360 365 aaa gcc agt aca gca ctg aac tgt gtc aac tta ttt gtg atg cct tac 1 628 Lys Ala Ser Thr Ala Leu Asn Cys Val Asn Leu Phe Val Met Pro Tyr 370 375 380 aat tat cca gtc ctt ctt ccc ctc tta gat gac ttg ttt aaa gtg cat 1 676 Asn Tyr Pro Val Leu Leu Pro Leu Leu Asp Asp Leu Phe Lys Val His 385 390 395 400 aaa gca aaa cca aca ttg aag tgg aga cag tca ttt gaa agt tat ttg 1 724 Lys Ala Lys Pro Thr Leu Lys Trp Arg Gln Ser Phe Glu Ser Tyr Leu 405 410 415 aag aca atg cct ccc tac tat ctt ggg ccc ttg aag aaa gct gtt agg 1 772 Lys Thr Met Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Pro Leu Lys Lys Ala Val Arg 420 425 430 atg atg gga gca cct aac cta ata gca gac agt atg gaa tat gga ctt 1 820 Met Met Gly Ala Pro Asn Leu Ile Ala Asp Ser Met Glu Tyr Gly Leu 435 440 445 agt tac agt gtc att tca tac ctc aaa aaa ctg agt caa cag gcc aaa 1 868 Ser Tyr Ser Val Ile Ser Tyr Leu Lys Lys Leu Ser Gln Gln Ala Lys 450 455 460 ata gaa tct gat cga gtc att gga tct gta ggc aaa aaa gta gta cag 1 916 Ile Glu Ser Asp Arg Val Ile Gly Ser Val Gly Lys Lys Val Val Gln 465 470 475 480 gag act gga ata aaa gtc cgg agc cga tca cat ggt tta tca atg gca 1 964 Glu Thr Gly Ile Lys Val Arg Ser Arg Ser His Gly Leu Ser Met Ala 485 490 495 tat agg aaa gat ttt caa caa ctc ctc cag gga att tca gag gat gtc 2 012 Tyr Arg Lys Asp Phe Gln Gln Leu Leu Gln Gly Ile Ser Glu Asp Val 500 505 510 cct cac aga ctg cta gac ctt aat atg aag gaa tac act ggg ttc caa 2 060 Pro His Arg Leu Leu Asp Leu Asn Met Lys Glu Tyr Thr Gly Phe Gln 515 520 525 gtt gct ttg ctg aat aag gat ttg aag cca cag aca ttt aga aat gct 2 108 Val Ala Leu Leu Asn Lys Asp Leu Lys Pro Gln Thr Phe Arg Asn Ala 530 535 540 tat gac ata cca aga cga aat ctt ttg gat cac tta aca aga atg aga 2 156 Tyr Asp Ile Pro Arg Arg Asn Leu Leu Asp His Leu Thr Arg Met Arg 545 550 555 560 tct aat ctt ttg aag agc act cgc aga ttt ctg aaa gga cag gac gaa 2 204 Ser Asn Leu Leu Lys Ser Thr Arg Arg Phe Leu Lys Gly Gln Asp Glu 565 570 575 gat caa gtg cac agt gtt cct ata gca caa atg ggg aac tac cag gaa 2 252 Asp Gln Val His Ser Val Pro Ile Ala Gln Met Gly Asn Tyr Gln Glu 580 585 590 tac ctc aag caa gta cct tct cca cta aga gaa ctt gat cct gat cag 2 300 Tyr Leu Lys Gln Val Pro Ser Pro Leu Arg Glu Leu Asp Pro Asp Gln 595 600 605 cca cga agg ttg cat aca ttt ggc aac ccc ttt aag ctg gat aag aag 2 348 Pro Arg Arg Leu His Thr Phe Gly Asn Pro Phe Lys Leu Asp Lys Lys 610 615 620 ggt atg atg ata gat gaa gca gat gaa ttt gtg gct gga cct caa aat 2 396 Gly Met Met Ile Asp Glu Ala Asp Glu Phe Val Ala Gly Pro Gln Asn 625 630 635 640 aaa cat aaa cga ccc gga gaa cca aat atg caa ggg atc cct aaa aga 2 444 Lys His Lys Arg Pro Gly Glu Pro Asn Met Gln Gly Ile Pro Lys Arg 645 650 655 cgt cgg tgt atg tct cca cta cta aga ggc aga cag cag aat cct gtt 2 492 Arg Arg Cys Met Ser Pro Leu Leu Arg Gly Arg Gln Gln Asn Pro Val 660 665 670 gta aac aat cat att ggg gga aaa gga cca cct gca cct aca act caa 2 540 Val Asn Asn His Ile Gly Gly Lys Gly Pro Pro Ala Pro Thr Thr Gln 675 680 685 gca cag cca gat ctt att aaa cct ctt cct ctt cat aaa att tca gaa 2 588 Ala Gln Pro Asp Leu Ile Lys Pro Leu Pro Leu His Lys Ile Ser Glu 690 695 700 acc act aat gat tcg ata ata cat gat gtg gtt gaa aat cat gtt gca 2 636 Thr Thr Asn Asp Ser Ile Ile His Asp Val Val Glu Asn His Val Ala 705 710 715 720 gac caa ctt tca tca gac att aca cca aat gct atg gat acg gaa ttt 2 684 Asp Gln Leu Ser Ser Asp Ile Thr Pro Asn Ala Met Asp Thr Glu Phe 725 730 735 tca gca tct tct cca gcc agt tta ctg gaa cgg cca acc aat cat atg 2 732 Ser Ala Ser Ser Pro Ala Ser Leu Leu Glu Arg Pro Thr Asn His Met 740 745 750 gag gct ctt ggt cat gac cat tta gga acc aat gac ctc act gtt ggt 2 780 Glu Ala Leu Gly His Asp His Leu Gly Thr Asn Asp Leu Thr Val Gly 755 760 765 gga ttt tta gaa aat cat gag gag cca aga gat aaa gaa caa tgt gct 2 828 Gly Phe Leu Glu Asn His Glu Glu Pro Arg Asp Lys Glu Gln Cys Ala 770 775 780 gaa gag aac ata cca gca tct tca ctc aac aaa gga aag aaa ttg atg 2 876 Glu Glu Asn Ile Pro Ala Ser Ser Leu Asn Lys Gly Lys Lys Leu Met 785 790 795 800 cat tgc aga agc cat gaa gag gtc aat act gaa cta aaa gca caa ata 2 924 His Cys Arg Ser His Glu Glu Val Asn Thr Glu Leu Lys Ala Gln Ile 805 810 815 atg aaa gag atc cga aag cca gga aga aaa tat gaa aga atc ttc act 2 972 Met Lys Glu Ile Arg Lys Pro Gly Arg Lys Tyr Glu Arg Ile Phe Thr 820 825 830 tta ctg aag cat gtg caa ggc agt tta caa aca aga cta ata ttt tta 3 020 Leu Leu Lys His Val Gln Gly Ser Leu Gln Thr Arg Leu Ile Phe Leu 835 840 845 caa aat gtc att aaa gaa gca tca agg ttt aaa aaa cga atg cta ata 3 068 Gln Asn Val Ile Lys Glu Ala Ser Arg Phe Lys Lys Arg Met Leu Ile 850 855 860 gaa caa ctg gag aac ttc ttg gat gaa att cat cga aga gcc aat cag 3 116 Glu Gln Leu Glu Asn Phe Leu Asp Glu Ile His Arg Arg Ala Asn Gln 865 870 875 880 atc aac cat att aat agc aat taaaagaaaa tagaatgtgg ccacttattt 3 167 Ile Asn His Ile Asn Ser Asn 885 cactatcttc ttcaaataca aagtaaataa caagactgtt gtgatcttgc attcattttc 3 227 tgacatgcat tgttggctat ttgaaatact aaaagcaaat ctacagatcc tttttccatc 3 287 attttacagt gaccttttct tcattttggt ttatttttgt aatgtgaaaa gtatcactct 3 347 aaaaaacatt tttaatttaa caaactaaaa atattcctcc aaatctcttg cttgtcattg 3 407 actcttgcgt gtcaatttcc ctcaggttct attttcttaa accaaccttt aaaattgtca 3 467 cctctgttaa ggttgaactt tgccaaaaaa aaaagaagtt actttgtaat ttttggggaa 3 527 aaaagcacat acattaaaac taggtaatgt tttgtatata cagttatttt ggatatatta 3 587 ttgtaagttg tacaaatgta ttttgaagaa tatttaagaa aagcactttt gttattccat 3 647 caataaatgc tctattttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 3 691 <210> 2 <211> 887 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Ile Leu Leu Phe Leu Ile Asp Thr Ser Ala Ser Met Asn Gln 1 5 10 15 Arg Ser His Leu Gly Thr Thr Tyr Leu Asp Thr Ala Lys Gly Ala Val 20 25 30 Glu Thr Phe Met Lys Leu Arg Ala Arg Asp Pro Ala Ser Arg Gly Asp 35 40 45 Arg Tyr Met Leu Val Thr Phe Glu Glu Pro Pro Tyr Ala Ile Lys Ala 50 55 60 Gly Trp Lys Glu Asn His Ala Thr Phe Met Asn Glu Leu Lys Asn Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Gly Leu Thr Thr Leu Gly Gln Ser Leu Arg Thr Ala Phe 85 90 95 Asp Leu Leu Asn Leu Asn Arg Leu Val Thr Gly Ile Asp Asn Tyr Gly 100 105 110 Gln Gly Arg Asn Pro Phe Phe Leu Glu Pro Ala Ile Ile Ile Thr Ile 115 120 125 Thr Asp Gly Ser Lys Leu Thr Thr Thr Ser Gly Val Gln Asp Glu Leu 130 135 140 His Leu Pro Leu Asn Ser Pro Leu Pro Gly Ser Glu Leu Thr Lys Glu 145 150 155 160 Pro Phe Arg Trp Asp Gln Arg Leu Phe Ala Leu Val Leu Arg Leu Pro 165 170 175 Gly Thr Met Ser Val Glu Ser Glu Gln Leu Thr Gly Val Pro Leu Asp 180 185 190 Asp Ser Ala Ile Thr Pro Met Cys Glu Val Thr Gly Gly Arg Ser Tyr 195 200 205 Ser Val Cys Ser Pro Arg Met Leu Asn Gln Cys Leu Glu Ser Leu Val 210 215 220 Gln Lys Val Gln Ser Gly Val Val Ile Asn Phe Glu Lys Ala Gly Pro 225 230 235 240 Asp Pro Ser Pro Val Glu Asp Gly Gln Pro Asp Ile Ser Arg Pro Phe 245 250 255 Gly Ser Gln Pro Trp His Ser Cys His Lys Leu Ile Tyr Val Arg Pro 260 265 270 Asn Pro Lys Thr Gly Val Pro Ile Gly His Trp Pro Val Pro Glu Ser 275 280 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─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年３月３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】本発明は、細胞増殖を抑制し、かつ ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、または ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる組換えポ
リペプチドをさらに含む。
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、または ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる組換えポ
リペプチドをさらに含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】本発明は、さらに、原核宿主細胞または真
核宿主細胞において外因性DNAを発現させ、所望のタン
パク質を単離することにより、細胞増殖を抑制すること
ができるタンパク質の製造方法を含む。該方法におい
て、タンパク質は、 ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、または ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる。
核宿主細胞において外因性DNAを発現させ、所望のタン
パク質を単離することにより、細胞増殖を抑制すること
ができるタンパク質の製造方法を含む。該方法におい
て、タンパク質は、 ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、または ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】また、本発明に係る組換えポリペプチドに
おいては、（３）細胞増殖を抑制し、かつ ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、または ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる、組換え
ポリペプチドであることを特徴とする。
おいては、（３）細胞増殖を抑制し、かつ ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、または ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる、組換え
ポリペプチドであることを特徴とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】また、本発明に係る製造方法においては、
（４）原核宿主細胞または真核宿主細胞において外因性
DNAを発現させ、所望のタンパク質を単離することによ
り、癌抑制活性を有するタンパク質を製造するための方
法であって、該タンパク質が、 ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、または ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる製造方法
であることを特徴とする。
（４）原核宿主細胞または真核宿主細胞において外因性
DNAを発現させ、所望のタンパク質を単離することによ
り、癌抑制活性を有するタンパク質を製造するための方
法であって、該タンパク質が、 ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、または ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる製造方法
であることを特徴とする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 598170752 116 Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ Ｓｔｒａｓｓ ｅ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎ ｙ
Claims (4)
- 【請求項１】 ａ）配列番号：1なる核酸配列を有する
か、または ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、もしくは相補的な核酸とストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞増殖を抑
制することができる、単離された核酸分子（del-27）。 - 【請求項２】 請求項１記載の核酸分子の発現に適した
組換え発現ベクター。 - 【請求項３】 細胞増殖を抑制し、かつ ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、 ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる、組換え
ポリペプチド。 - 【請求項４】 原核宿主細胞または真核宿主細胞におい
て外因性DNAを発現させ、所望のタンパク質を単離する
ことにより、癌抑制活性を有するタンパク質を製造する
ための方法であって、該DNAが、 ａ）配列番号：1に示されるDNA配列によりコードされ、 ｂ）配列番号：1の核酸断片477〜819、820〜3069、およ
び3070〜3137全て、または相補的なDNA配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列により
コードされ、 ｃ）遺伝コードの縮重が存在しないのであれば、ａ）お
よびｂ）に記載の配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするDNA配列によりコードされる製造方
法。
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- 1999-02-18 AT AT99103157T patent/ATE283357T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1999-02-18 DE DE69922071T patent/DE69922071T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 2002-10-03 US US10/263,316 patent/US20030059825A1/en not_active Abandoned
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