JPH11255805A - β−グルカン認識蛋白活性化抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規な昆虫体液中のβ−グルカン認識蛋白（β
ＧＲＰ）活性化抑制剤、これを用いた活性化抑制方法、
昆虫体液の処理剤、これを用いた処理方法、及びペプチ
ドグリカン（ＰＧ）測定方法並びにＰＧ測定用試薬の提
供。 【解決手段】β１→３結合を有する糖化合物であって該
糖化合物を構成する糖残基として６位に置換基を有する
糖残基を含む化合物を含有してなる、昆虫体液中のβＧ
ＲＰの活性化抑制剤、これを用いた活性化抑制方法、該
化合物を含有してなる昆虫体液の処理剤、これを用いた
処理方法、該化合物の存在下に昆虫体液と試料とを反応
させるＰＧの測定方法、及び昆虫体液と該化合物を含有
してなるＰＧ測定用試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、昆虫体液中のβ−
グルカン認識蛋白の活性化抑制剤及び活性化抑制方法、
昆虫体液の処理剤及び処理方法、並びに新規なペプチド
グリカン測定方法及び測定試薬に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ペプチドグリカン（以下、ＰＧと略記す
る。）は、Ｎ−アセチルムラミン酸又はＮ−グリコリル
ムラミン酸とＤ−アミノ酸を含む糖タンパクであり、細
菌の細胞壁成分として菌の形状の保持に重要な働きをし
ている。

【０００３】ＰＧは、例えば、マクロファージ，Ｂリン
パ球，Ｔリンパ球等の免疫応答細胞に対する種々の作
用、血小板の破壊、繊維芽細胞の増殖促進、骨吸収の促
進、補体の活性化、体液性免疫応答の増進又は抑制、細
胞性免疫の増強、細胞内皮系の刺激、一過性の白血球減
少並びにその後の白血球増加、インターフェロン誘導因
子の作用増強、自然抵抗力の強化、自己免疫疾患の実験
的誘導、発熱誘発、エンドトキシン（以下、ＥＴと略記
する。）の毒性に対する感受性向上、睡眠の促進乃至抑
制、類上皮肉芽腫形成、結核菌等で処理した部位での出
血壊死性炎症の惹起、急性並びに慢性毒性等、種々の生
物活性を持っている。

【０００４】また、ＥＴがグラム陰性菌のみに存在する
のに対して、ＰＧはグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方
に存在し、グラム陽性菌では細胞壁の最外殻に分厚い層
を、グラム陰性菌では外膜の内側に薄い層を形成してい
る。ＥＴもＰＧも持っていない古細菌（例えばメタン細
菌、高度好酸性好熱菌等）を除くと、殆どの原核生物が
ＰＧをその細胞壁に持っている。一方、哺乳動物等の真
核生物の細胞成分中にはＰＧは存在しないため、ＰＧが
存在するところには細菌が存在すると考えられる。

【０００５】従ってＰＧの測定は、ＰＧを細胞壁の構成
成分としている細菌類、藍藻類等の微生物の微量検出に
有用であり、医薬品等の安全性試験、水や食品等の微生
物試験、感染症の診断等への応用が期待されている。

【０００６】そして、ＰＧの測定方法としては、昆虫体
液由来の試薬を用いる方法（特公平7ー114707号）等が報
告されている。昆虫体液中には、フェノール酸化酵素前
駆体（以下、proPOと略記する。）カスケードに関与す
る因子が存在し、通常は活性化が起こっていない状態
（不活性型因子）である。この因子の一つに、ＰＧと結
合してｐｒｏＰＯカスケードを活性化する物質（ＰＧ認
識蛋白）がある。上記方法は、試料中のＰＧが、昆虫体
液中のこのＰＧ認識蛋白と結合してｐｒｏＰＯカスケー
ドを活性化する性質を利用する方法である。しかしなが
ら、昆虫体液中には、もう一つの因子としてβ―１，３
―グルカン（以下、βＧと略記する、）と結合してｐｒ
ｏＰＯカスケードを活性化する物質（βＧ認識蛋白。以
下、βＧＲＰと略記する。）も存在する（Yoshida,H.,O
chiai,M., and Ashida,M.(1986) Biochem.Biophys.Res.
Commun.141,1777-1184）。そのため、上記方法でＰＧの
みを測定するには、試薬を調製するために用いる昆虫体
液から、アフィニティークロマトグラフィー法等により
βＧＲＰを除去しなければならず、手間のかかる方法で
あった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
した如き状況に鑑みなされたもので、新規な昆虫体液中
のβＧＲＰ活性化抑制剤、これを用いた活性化抑制方
法、昆虫体液の処理剤、これを用いた処理方法、及び簡
便なＰＧの測定方法並びにＰＧ測定用試薬を提供するこ
とにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、β１→３結合
を有する糖化合物であって該糖化合物を構成する糖残基
として６位に置換基を有する糖残基を含む化合物を含有
してなる、昆虫体液中のβＧＲＰの活性化抑制剤の発明
である。

【０００９】また、本発明は、昆虫体液を、β１→３結
合を有する糖化合物であって該糖化合物を構成する糖残
基として６位に置換基を有する糖残基を含む化合物で処
理することを特徴とする、昆虫体液中のβＧＲＰの活性
化抑制方法の発明である。

【００１０】更に、本発明は、β１→３結合を有する糖
化合物であって該糖化合物を構成する糖残基として６位
に置換基を有する糖残基を含む化合物を含有してなる、
昆虫体液の処理剤の発明である。

【００１１】更にまた、本発明は、昆虫体液と、β１→
３結合を有する糖化合物であって該糖化合物を構成する
糖残基として６位に置換基を有する糖残基を含む化合物
を接触させることを特徴とする、昆虫体液の処理方法の
発明である。

【００１２】また、本発明は、β１→３結合を有する糖
化合物であって該糖化合物を構成する糖残基として６位
に置換基を有する糖残基を含む化合物の存在下に、昆虫
体液と試料とを反応させることを特徴とする、ＰＧの測
定方法の発明である。

【００１３】更に、本発明は、昆虫体液と、β１→３結
合を有する糖化合物であって該糖化合物を構成する糖残
基として６位に置換基を有する糖残基を含む化合物を含
んでなるＰＧ測定用試薬の発明である。

【００１４】即ち、本発明者等は、昆虫体液中のβＧＲ
Ｐの活性化を抑制し得る物質を求めて鋭意研究を重ねた
結果、β１→３結合を有する糖化合物であって該糖化合
物を構成する糖残基として６位に置換基を有する糖残基
を含む化合物がその作用を有することを見出した。更
に、本発明者等は、これを昆虫体液中のβＧＲＰ活性化
抑制剤として使用すれば、当該βＧＲＰの活性化を抑制
することができ、ＰＧに特異的な測定試薬が簡便に得ら
れることを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１５】本発明に於いて用いられる、β１→３結合
を有する糖化合物であって該糖化合物を構成する糖残基
として６位に置換基を有する糖残基を含む化合物（以
下、本発明に係る糖化合物と略記する。）としては、少
なくとも１以上のヘキソース残基を有し、βＧＲＰの活
性化を抑制し得るものであればよく、特に限定されな
い。

【００１６】また、本発明に係る糖化合物を構成する糖
残基としては、例えばトレオース残基，エリトロース残
基，エリトルロース残基等のテトロース残基、例えばリ
ボース残基，デオキシリボース残基，アラビノース残
基，キシロース残基，リキソース残基，リブロース残
基，キシルロース残基，アラビヌロース残基，リクスロ
ース残基等のペントース残基、例えばグルコース残基，
マンノース残基，アロース残基，アルトロース残基，ガ
ラクトース残基，タロース残基，イドース残基，グロー
ス残基，フコース残基，フルクトース残基，ソルボース
残基，タガトース残基，プシコース残基等のヘキソース
残基、例えばグルコサミン残基，ガラクトサミン残基，
アセチルグルコサミン残基等のアミノ糖残基、例えばア
セチルノイラミン酸残基等のシアル酸残基、例えばソル
ビトール残基，イノシトール残基，マンニトール残基，
リビトール残基，エリトリトール残基，アラビトール残
基，キシルトール残基等の糖アルコール残基等が挙げら
れ、なかでも、ヘキソース残基が好ましく、特にグルコ
ース残基が好ましい。

【００１７】本発明に係る糖化合物に於ける、β１→３
結合の数としては、通常２個以上、好ましくは２〜1000
個、より好ましくは10〜600個、更に好ましくは20〜600
個の範囲から適宜選択される。尚、β１→３結合として
は、β１→３グルコシド結合が好ましい。

【００１８】尚、本発明に係る糖化合物としては、βＧ
ＲＰの活性化を抑制し得る作用を有するものであれば、
直鎖状でも分岐状でも何れでもよい。

【００１９】本発明に係る糖化合物に於ける、該糖化合
物を構成する６位に置換基を有する糖残基としては、例
えばグルコース残基，マンノース残基，アロース残基，
アルトロース残基，ガラクトース残基，タロース残基，
イドース残基，グロース残基，フコース残基，フルクト
ース残基，ソルボース残基，タガトース残基，プシコー
ス残基等のヘキソース残基が挙げられるが、なかでも、
グルコース残基が好ましい。

【００２０】また、６位の置換基としては、本発明に係
る糖化合物の溶解性を著しく低下させないものであれば
特に限定されないが、例えば親水性基、親水性を損なわ
ない基等が好ましい。

【００２１】本発明に於ける親水性基としては、例えば
カルボキシメチル基，カルボキシエチル基等のカルボキ
シ低級アルキル基、例えばヒドロキシエチル基，ヒドロ
キシプロピル基等のヒドロキシ低級アルキル基、例えば
スルホプロピル基等のスルホ低級アルキル基、硫酸基等
が挙げられる。また、親水性を損なわない基としては、
例えばメチル基等の低級アルキル基、例えばアセチル基
等のカルボン酸由来の低級アシル基、例えばグルコース
残基，マンノース残基，ガラクトース残基等の糖残基、
これら糖残基からなる糖鎖等が挙げられる。

【００２２】本発明に係る糖化合物に於ける置換基の数
としては、βＧＲＰの活性化を抑制する作用を有し、本
発明に係る糖化合物の溶解性を著しく低下させない範囲
であれば特に限定されないが、糖化合物を構成する糖残
基に10％以上の割合で置換基が導入されているものが特
に好ましい。

【００２３】本発明に係る糖化合物としては、例えばβ
１→３結合を有する糖化合物であって該糖化合物を構成
する糖残基として６位に上記した如き置換基を有する糖
残基を含む糖類が挙げられるが、なかでも、多糖類が好
ましい。これら多糖類の具体例としては、例えばシゾフ
ィラン、ラミナリン、ラミナラン、クレスチン^TM（かわ
らたけ由来多糖体製剤，呉羽化学工業(株)商品名）、パ
キマン、ザイモザンＡ等が挙げられる。尚、これらの多
糖類は、例えば各種細菌類（例えば、Alcaligenes属，A
grobacterium属，Rhizobium属等）、酵母類（例えば、S
accharomyces属等）、キノコ類（例えば、シイタケ，ス
エヒロタケ，カワラタケ等）等の細胞壁或いは藻類（例
えば、Eisenia属，Laminaria属等）等から得られるもの
等が挙げられる。

【００２４】また、本発明に係る糖化合物には、例えば
カルボキシメチル化カードラン等の、β１→３結合を有
する糖化合物であるが、該糖化合物を構成する糖残基が
６位に置換基を有さない糖類に自体公知の方法に準じて
上記した如き置換基を導入することにより得られる糖類
が包含される。

【００２５】これらβ１→３結合を有する糖化合物であ
るが、該糖化合物を構成する糖残基の６位に置換基を有
さない糖類としては、特に限定されないが、β１→３結
合を有する糖化合物、例えばカードラン、スクレロタ
ン、レンチナン、コリオラン、リケニン、パラミロン、
カロース等の多糖類が好ましい。尚、これらの糖類は、
例えば各種細菌類（例えば、Alcaligenes属，Agrobacte
rium属，Rhizobium属等）、酵母類（例えば、Saccharom
yces属等）、キノコ類（例えば、シイタケ，スエヒロタ
ケ，カワラタケ等）等の細胞壁或いは藻類（例えば、Ei
senia属，Laminaria属等）等から得られるもの等が挙げ
られる。

【００２６】また、糖残基の６位に置換基を導入する方
法としては、例えば大有機化学第19巻，第７版，70〜10
1頁，小竹無二雄監修，昭和42年５月10日，朝倉書店、
A.E.Clarke et al.,Phytochemistry, 1,175-188(196
7)、T.Sasaki et al.,Europ.J.Cancer,15,211-215(197
9)等に記載された自体公知の導入方法が挙げられる。

【００２７】また、本発明に係る糖化合物には、上記し
た如きβ１→３結合を有する糖化合物であって該糖化合
物を構成する糖残基の６位に上記した如き置換基を有す
る天然に存在する多糖類に、更に自体公知の方法に準じ
て上記した如き置換基を導入することにより得られる多
糖類等も包含される。

【００２８】上記した如き本発明に係る糖化合物のなか
でも、６位に置換基を有する糖残基１個と、６位に置換
基を有さない糖残基２個がβ１→３結合で結合した糖残
基３個からなる単位を１以上有する糖化合物が好まし
く、その具体例としては、例えばシゾフィラン、カルボ
キシメチル化カードラン、ラミナリン、ラミナラン、ク
レスチン^TM等が挙げられる。

【００２９】中でも糖残基が何れもグルコース残基であ
り、且つ６位の置換基がグルコース残基である糖化合物
が特に好ましく、より好ましい具体例としては、例えば
シゾフィラン、クレスチン^TM等が挙げられる。

【００３０】本発明に係る糖化合物の使用濃度として
は、昆虫体液由来のβＧＲＰの活性化を抑制し得る濃度
であれば良く、特に限定されない。より具体的には、使
用する本発明に係る糖化合物の種類により一概には言え
ないが、βＧＲＰを含む組成物、例えば昆虫体液中のβ
ＧＲＰ100 μｇあたり通常１μg〜１g、好ましくは５μ
g〜100mg、より好ましくは10μg〜10mgの範囲から適宜
選択される。 また、より具体的には、昆虫体液１mlあ
たり通常１μg〜１g、好ましくは５μg〜100mg、より好
ましくは10μg〜10mgの範囲から適宜選択される。

【００３１】本発明に係る糖化合物は、夫々単独で用い
ても良いし、二種以上適宜組み合わせて用いても良い。

【００３２】尚、βＧＲＰ量の測定は、例えば公知の文
献（Ochiai,M.,Ashida,M.(1988)J.Biol.Chem.263,12056
-12062）に記載の方法に準じて行えばよい。

【００３３】本発明に於いて使用される昆虫体液として
は、昆虫の体液から得られたもので、ｐｒｏＰＯカスケ
ード〔Ashida and Yamazaki,Molting and Metamorphosi
s,239-265,Japan Sci.Soc.Press(1990)〕に関与する因
子であって活性化が起こっていない状態のもの（不活性
型因子）を含有し、微生物細胞壁に存在するβＧやＰＧ
と反応してｐｒｏＰＯを活性化し得る性質を有するもの
であればよい。

【００３４】昆虫体液はヘモリンパ（hemolymph）と呼
ばれる。体液の得られる昆虫としては、特に制限はない
が、なるべく大型のもので飼育方法の確立しているもの
が望ましく、例えば、タバコスズメガ，ハチミツガ，セ
クロピア蚕，カイコガ等の鱗翅類、センチニクバエ，イ
エバエ等の双翅類、トノサマバッタ，エンマコオロギ等
の直翅類、センノキカミキリ等の甲虫類等が挙げられる
が、これらに限定されるものではない。入手の容易さか
らいうと、例えば錦秋鐘和等のカイコガ，クワゴ，オオ
クワゴモドキ，カギバモドキ等のカイコガ科の昆虫が挙
げられる。また、昆虫体液を得るには、成虫を用いても
幼虫を用いても良いが、体液の採取の容易さからすれ
ば、幼虫が望ましい。尚、カイコガの一種である錦秋鐘
和の幼虫を用いるときは５周令の幼虫（Silkworm）が好
ましく用いられる。

【００３５】上記した如き昆虫から体液を得る方法とし
ては、例えば、昆虫を氷上に置き動きを止めた後、トウ
キビ因子（サトウキビに含まれるグルコース，アミノ酸
などからなる高分子物質）を不純物として含むショ糖、
トウキビ因子そのもの、或いは例えば（p−アミジノフ
ェニル）メタンスルホニルフルオリド（p−ＡＰＭＳ
Ｆ）、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ）、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、p−
ニトロフェニル p'−グアニジノベンゾエート（ＮＰＧ
Ｂ）、ジヒドロキシクロロメチルクマリン（ＤＣＣ）等
のセリンプロテアーゼインヒビター等を含む生理食塩水
を体腔に注射し、その後しばらく放置して、体腔より昆
虫体液を集める方法、上記した如きセリンプロテアーゼ
インヒビター等を含む昆虫体液と等張な溶液に昆虫体液
を添加して採取する方法（Ashida,M.,Insect Biochem.,
11,57-65,1981、特開平1-14266号公報）等が挙げられ
る。このようにして得られた昆虫体液は、通常遠心分離
処理して血球を除き、その後透析して用いられる。尚、
要すれば適当なカラムクロマトグラフィーにより更に精
製して用いてもよい。また、昆虫体液は市販されている
もの（例えば、ＳＬＰ^TM試薬セット、和光純薬工業
（株）製）を使用しても良い。

【００３６】尚、昆虫体液は、通常これにβＧやＰＧと
反応した結果活性化される酵素の基質であって該酵素の
作用により適当な色素等（蛍光性、発光性のものでも
可。）を生じる物質（所謂合成基質を含む。）等を添加
して使用される。

【００３７】また、上述した如く、不活性型因子は、昆
虫の体液由来のものが一般的であるが、遺伝子組換え等
の操作により作製されたｐｒｏＰＯカスケードの不活性
型因子を適宜組み合わせて調製されたものであっても何
等差し支えない。

【００３８】本発明に係る昆虫体液中のβ―グルカン認
識蛋白の活性化抑制剤は、上記した如き本発明に係る糖
化合物を含有するものである。

【００３９】本発明に於いて、昆虫体液中のβ―グルカ
ン認識蛋白の活性化抑制方法としては、最終的に昆虫体
液中に本発明に係る糖化合物を共存させ得る方法であれ
ばよく、特に限定されないが、最も一般的な方法として
は、昆虫体液に本発明に係る糖化合物を添加・溶解させ
て共存させる方法、昆虫体液と、本発明に係る糖化合物
を含む溶液とを混合する方法等が挙げられる。

【００４０】本発明に於いて、本発明に係る糖化合物を
含有させる溶液としては、ｐｒｏＰＯカスケードを活性
化することなく、且つ本発明に係る糖化合物のβＧＲＰ
の活性化を抑制する作用を阻害する性質を有さないもの
であれば、特に限定されず、例えば蒸留水、緩衝液等が
挙げられる。緩衝液を構成する緩衝剤としては、通常こ
の分野で用いられるものは全て使用可能であり、具体的
には、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、トリス緩衝
剤、グッドの緩衝剤等が挙げられ、その使用濃度は、通
常この分野に於ける使用濃度範囲から適宜選択すればよ
い。

【００４１】本発明に係る昆虫体液の処理剤は、本発明
に係る糖化合物を含有するものである。

【００４２】本発明に係る昆虫体液の処理方法として
は、本発明に係る糖化合物を、本発明に係る昆虫体液中
に、上記した如き濃度範囲となるように共存させればよ
く、共存させるには、上記した活性化抑制方法に於ける
共存させる方法に準じて行えばよい。

【００４３】本発明のＰＧ測定方法は、上記した如き本
発明に係る糖化合物を上記した如き濃度範囲で存在させ
る以外は、昆虫体液を用いる自体公知のＰＧ測定法に準
じて実施すれば良く、使用するその他の試薬類もこれら
自体公知の測定法に準じて適宜選択すればよい。

【００４４】即ち、試料を、本発明に係る糖化合物の存
在下、昆虫体液を用いる自体公知のＰＧ測定法に準じて
測定を行うことにより、試料中のＰＧを特異的に測定す
ることができる。

【００４５】また、本発明のＰＧ測定方法に於いては、
昆虫体液と試料とを反応させる際に、最終的に本発明に
係る糖化合物を上記した如き濃度範囲で共存させ得れば
よく、その方法については特に限定されない。

【００４６】具体的には、例えば上記した如き昆虫体液
中に、本発明に係る糖化合物を含有させ、これと試料と
を混合する方法、例えば上記した如き本発明に係る糖化
合物を含有する緩衝液等の溶液で試料を希釈し、該希釈
試料と上記した如き昆虫体液とを混合する方法等が挙げ
られる。

【００４７】昆虫体液を用いる自体公知のＰＧ測定法と
しては、例えば試料と、昆虫体液とを混合・反応させ、
一定時間後の反応液中の例えばＮ−α−ベンゾイル−Ｌ
−アルギニンエチルエステル分解酵素（ＢＡＥＥａｓ
ｅ）、プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素（ＰＰＡ
Ｅ）、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）等の酵素の活性
を自体公知の測定法に従って測定し、予め濃度既知のＰ
Ｇの標準液を用いて同様の操作により作製した検量線か
らＰＧの量を算出する方法（M.Tsuchiya et al.FEMS Im
munology and Medical Microbiology,15(1996)129-13
4、特開平7-184690号公報等）、ｐｒｏＰＯが活性化さ
れてＰＯとなる時間が試料中のＰＧ濃度に依存する現象
を利用して、ＰＰＯ試薬と試料とを混合した後、ＰＯに
よる反応生成物の量がある一定値となるまでの時間を測
定する方法（M.Tsuchiya et al.FEMSImmunology and Me
dical Microbiology,15(1996)129-134等）等が好ましく
挙げられる。

【００４８】これら自体公知の測定法に於いて用いられ
るその他の試薬類としては、例えば３，４−ジヒドロキ
シフェニルアラニン（ドーパ），合成基質等の測定する
酵素の基質、共役酵素、補酵素等、要すれば、発色剤、
賦活剤、安定化剤、界面活性剤等、目的とする酵素活性
の測定法として自体公知の方法に於いて使用される試薬
類が挙げられる。

【００４９】本発明の測定方法に於ける反応ｐＨとして
は、測定する酵素の種類等によって異なるが、通常ｐＨ
４〜11、好ましくはｐＨ６〜９である。また、この反応
ｐＨを維持するために緩衝剤を使用しても良く、緩衝剤
としては反応に影響を与えないものであれば、種類，使
用濃度ともに特に制限されず、例えばリン酸塩，ホウ酸
塩，酢酸塩，トリス緩衝剤，グッドの緩衝剤等が挙げら
れる。

【００５０】また、反応温度及び反応時間については、
反応が進行する温度，時間であれば特に制限されず、反
応温度としては、通常０〜50℃、好ましくは４〜30℃、
反応時間としては、通常１秒〜20時間、好ましくは10秒
〜２時間の範囲から適宜選択される。

【００５１】また、本測定に於いては、0.001〜1000m
M、好ましくは５〜100mMの範囲内の２価の金属イオン、
例えばＣａ²⁺、Ｍｇ²⁺等が存在していることが望まし
い。

【００５２】本発明のＰＧ測定方法により測定可能な試
料としては、試料中の微生物の有無を検出する必要があ
るものであれば特に限定されないが、例えば半導体用洗
浄水、例えば血液，血漿，血清，髄液等の体液、尿、水
道水、工場廃液、食品、飲料、医療器具等を洗浄した後
の洗浄液等が挙げられる。

【００５３】本発明の測定法を実施するには、例えば以
下の如く行えばよい。

【００５４】即ち、上記した如き試料と、本発明に係る
糖化合物を含有する昆虫体液とを混合し、一定の反応条
件で反応（例えば、０〜50℃、好ましくは４〜30℃で、
１秒〜20時間、好ましくは10秒〜２時間）させ、例えば
市販のマイクロプレートリーダーThermo-Max（Molecula
r Devices社製）、トキシノメーター（和光純薬工業
（株）製）等を用いて該反応液の吸光度が予め設定した
閾値に達するまでの反応時間を測定する。得られた反応
時間の測定値と、予め既知濃度のＰＧを含有する試料を
用いて同様に行って得られた、ＰＧ濃度と反応時間との
関係を示す検量線から、試料中のＰＧ含有量を算出する
ことができる。

【００５５】本発明に係る糖化合物を、前述した如き昆
虫体液中に、上記した如き濃度範囲となるように含有さ
せることにより、ＰＧのみを特異的に測定することがで
きるＰＧ測定用試薬を容易に得ることができる。

【００５６】本発明のＰＧ測定用試薬は、例えば半導体
用洗浄水、例えば血液，血漿，血清，髄液等の体液、
尿、水道水、工場廃液、食品、飲料、医療器具等を洗浄
した後の洗浄液等の微生物の有無を検出する必要がある
各種試料中のＰＧを測定するために使用されるもので、
本発明に係る糖化合物をβＧＲＰ活性化抑制剤として用
いる以外は、上記した如き昆虫体液を用いる自体公知の
ＰＧ測定法に使用される試薬類を、この分野で通常使用
される濃度範囲で含有するように調製されたものであ
り、構成要件の好ましい態様や使用濃度等は、上で述べ
た通りである。

【００５７】以下に参考例、実施例及び比較例をあげて
本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより
何ら限定されるものではない。尚、以下の参考例及び実
施例に於いて使用される蒸留水及び注射用水（大塚製薬
（株）製）は、市販のＳＬＰ^TM試薬セット（和光純薬工
業（株）製）を用いて、βＧ又は／及びＰＧが検出され
ないことを確認したものを使用した。

【００５８】

〔試薬〕

（１）測定試薬；Ashida.M.,(1981)Insect Biochem.,1
1,57-65に記載の方法に準じて得られたカイコ（錦秋鐘
和，Bombyx mori）５周令の体液の分画画分を測定試薬
とした（βＧＲＰ量：１μg／ml以下）。尚、測定試薬
中のβＧＲＰ量は、Ochiai,M.,Ashida,M.(1988)J.Biol.
Chem.263,12056-12062の方法に準じて測定した。 （２）ドーパ・カルシウム溶液；0.1Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液
（pH6.5）に、ドーパ ６mM及び塩化カルシウム 24mM
の濃度になるように溶解した後、ゼータポア膜（Cuno社
製）を使用して濾過したものをドーパ・カルシウム溶液
とした。

【００５９】（３）β−１，３−グルカン溶液；以下の
ようにしてβ−１，３−グルカン溶液を調製した。・カ
ードラン（curdlan、和光純薬工業（株）製）：0.25Ｎ
ＮａＯＨに１mg／mlになるように溶解し、蒸留水で希釈
して10pg／mlから10μg／mlまでの希釈系列を調製し
た。 ・シゾフィラン（schizophyllan、科研製薬（株）
製）：10mg／mlアンプルを蒸留水で希釈して10ng／mlか
ら10mg／mlまでの希釈系列を調製した。 ・カルボキシメチル化カードラン（ＣＭＥＣ、和光純薬
工業（株）製）：蒸留水に10mg／mlになるように溶解
し、蒸留水で希釈して10ng／mlから10mg／mlまでの希釈
系列を調製した。 ・ラミナラン（laminaran、東京化成工業（株）製）：
蒸留水に10mg／mlになるように溶解し、蒸留水で希釈し
て10ng／mlから10mg／mlまでの希釈系列を調製した。 ・ラミナリン（laminarin、Sigma社製）：蒸留水に10mg
／mlになるように溶解し、蒸留水で希釈して10ng／mlか
ら10mg／mlまでの希釈系列を調製した。 ・パキマン（pachyman、calbiochem社製）：蒸留水に１
mg／mlになるように分散し、蒸留水で希釈して１ng／ml
から１mg／mlまでの希釈系列を調製した。 ・クレスチン^TM（Krestin、呉羽化学工業（株）製）：
蒸留水に10mg／mlになるように溶解し、蒸留水で希釈し
て10ng／mlから10mg／mlまでの希釈系列を調製した。 ・ザイモザンＡ（zymosan Ａ、Sigma社製）：蒸留水に
１mg／mlになるように分散し、蒸留水で希釈して１ng／
mlから１mg／mlまでの希釈系列を調製した。

【００６０】〔測定機器〕 マイクロプレートリーダーThermo-Max（Molecular Devi
ces社製）を用い、下記条件で測定を行った。 温度：30℃ 時間：１時間40分 オンセットＯＤ：0.01 測定波長：650nm 尚、データの解析は、Soft Max version2.32を用いて行
った。 〔操作〕上記測定試薬 750μlとドーパ・カルシウム溶
液 375μlとを混合し、酵素・基質溶液とした。ポリス
チレン製96穴マイクロプレートに、該酵素・基質溶液50
μl、所定濃度の各種β−１，３−グルカン溶液 50μl
を夫々分注し、マイクロプレートリーダーを用いて、上
記の条件で測定を行った。 〔結果〕図１に、β−１，３−グルカンとしてカードラ
ン、シゾフィラン、ＣＭＥＣ又はラミナランを用いた場
合のβ−１，３−グルカン濃度に対するオンセットタイ
ムを両対数プロットした結果を、また、図２に、β−
１，３−グルカンとしてラミナリン、パキマン、クレス
チン^TM又はザイモザンＡを用いた場合のβ−１，３−グ
ルカン濃度に対するオンセットタイムを両対数プロット
した結果を夫々示し、図１及び図２に於いて、横軸は各
種β−１，３−グルカンの濃度を、縦軸はオンセットタ
イムを夫々示す。尚、図１中、−□−はカードランを用
いた場合の結果を、−◇−はシゾフィランを用いた場合
の結果を、−○−はＣＭＥＣを用いた場合の結果を、−
△−はラミナランを用いた場合の結果を夫々示し、図２
中、−□−はラミナリンを用いた場合の結果を、−◇−
はパキマンを用いた場合の結果を、−○−はクレスチン
^TMを用いた場合の結果を、−△−はザイモザンＡを用い
た場合の結果を夫々示す。

【００６１】図１及び図２の結果から明らかなように、
糖残基の６位に置換基を有さない糖残基のみから構成さ
れるカードランを測定試薬（昆虫体液）と反応させた場
合は、カードラン濃度の増加に比例してオンセットタイ
ムが短くなっていることが判る。これに対して、６位に
置換基を有する糖残基を含む糖化合物を測定試薬と反応
させた場合には、ある濃度以上、即ち、シゾフィランの
場合10μg／ml以上（反応液中濃度 ５μg／ml以上），
ＣＭＥＣの場合 100μg／ml以上（反応液中濃度 50μ
g／ml以上），ラミナランの場合１mg／ml以上（反応液
中濃度 500μg／ml以上），ラミナリンの場合 10μg
／ml以上（反応液中濃度 5μg／ml以上），パキマンの
場合 10mg／ml以上（反応液中濃度 ５mg／ml以上），
クレスチン^TMの場合10μg／ml以上（反応液中濃度 5μ
g／ml以上），ザイモザンＡの場合 １mg／ml以上（反
応液中濃度 500 μg／ml以上）を反応させるとオンセ
ットタイムが長くなることが判る。このことから、β１
→３結合を有する糖化合物であって該糖化合物を構成す
る糖残基として６位に置換基を有する糖残基を含む化合
物、即ち本発明に係る糖化合物は、測定試薬（昆虫体
液）のβＧに対する反応性を低下させることが、換言す
れば、測定試薬中のβＧＲＰの活性化を抑制し得ること
が示唆される。

【００６２】実施例１.本発明に係る糖化合物を含有す
る測定試薬と、βＧ及びＰＧとの反応性の検討 〔試薬〕 （１）測定試薬；実験例１と同じ。 （２）ドーパ・カルシウム溶液；実験例１と同じ。 （３）本発明に係る糖化合物溶液；実験例１に於いてβ
ＧＲＰ活性化抑制効果が認められたシゾフィラン及びク
レスチン^TMを用い、下記の如くして、本発明に係る糖化
合物溶液であるシゾフィラン溶液及びクレスチン^TM溶液
を調製した。 ・シゾフィラン（schizophyllan、科研製薬（株）
製）：10mg／mlアンプルを、シゾフィラン溶液として用
いた。 ・クレスチン^TM（Krestin、呉羽化学工業（株）製）：
蒸留水に５mg／mlになるように溶解し、これをクレスチ
ン^TM溶液とした。

【００６３】（４）ＰＧ標準液；ミクロコッカス ルテ
ウス（Micrococcus luteus）の乾燥菌体１gを、シュレ
イファーらの方法（Schleifer,K.H.,and Kandlar,O.,Ba
cteriol.Rev.,36,407-477(1972)）に準じて処理し、ト
リプシン処理細胞壁（ＰＧ）95mgを得た。得られたトリ
プシン処理細胞壁（ＰＧ）20mgを注射用水（大塚製薬
（株）製）20mlに加え、超音波処理により分散させたも
のをＰＧ原液とした。尚、使用にあたっては、該ＰＧ原
液を蒸留水で希釈して、１ng／mlから１μg／mlまでの
希釈系列を調製してＰＧ標準液とした。 （５）βＧ標準液；カードラン（和光純薬工業（株）
製）10mgを0.25Ｎ水酸化ナトリウム溶液10mlに溶解した
ものをβＧ原液とした。尚、使用にあたっては、該βＧ
原液を蒸留水で希釈して、10pg／mlから10μg／mlまで
の希釈系列を調製してβＧ標準液とした。

【００６４】〔測定機器〕実験例１と同じ。 〔操作〕予め250℃で２時間乾熱滅菌処理したガラス製
試験管に、測定試薬 575μl、ドーパ・カルシウム溶液
375μl、所定の本発明に係る糖化合物溶液 175μlを
分注・混合して反応試液とした。次いで、ポリスチレン
製96穴マイクロプレートに、所定濃度のβＧ標準液又は
所定濃度のＰＧ標準液を夫々50μlずつ分注し、次い
で、反応試液を50μlずつ分注し、マイクロプレートリ
ーダーを用いて、上記の条件で測定を行った。また、コ
ントロールとして、本発明に係る糖化合物溶液の代わり
に、蒸留水175μlを用いて調製した反応試液（本発明に
係る糖化合物無添加）を使用して、上記と同様に測定を
行った。 〔結果〕ＰＧ標準液を用いて得られたオンセットタイム
（Onset Time：オンセットＯＤ＝0.01に達するまでの時
間（秒））を表１に、また、βＧ標準液を用いて得られ
たオンセットタイム（Onset Time：オンセットＯＤ＝0.
01に達するまでの時間（秒））を表２に夫々示す。

【００６５】

【表１】 ＊表中のｎｄは、測定時間内にオンセットＯＤに達しな
かったことを示す。

【００６６】

【表２】 ＊表中のｎｄは、測定時間内にオンセットＯＤに達しな
かったことを示す。

【００６７】また、表１の結果に基づいて、本発明に係
る糖化合物無添加の反応試液，シゾフィラン含有反応試
液及びクレスチン^TM含有反応試液の夫々を使用した場合
について、ＰＧ濃度とオンセットタイムの関係を表す検
量線（座標軸は両対数）を作成したところ、何れも良好
な検量線が得られた。これらの検量線に、同じ反応試液
を用いて得られた表２のデータを当てはめて、夫々の反
応試液を用いた場合の各種βＧ標準液のＰＧ換算値を求
めた。その結果を表３に示す。

【００６８】

【表３】

【００６９】表３の結果から明らかなように、本発明に
係る糖化合物、即ち、β１→３結合を有する糖化合物で
あって、該糖化合物を構成する糖残基として６位に置換
基を有する糖残基を含む化合物であるシゾフィラン又は
クレスチン^TMを測定試薬（昆虫体液）と共存させた場合
には、ＰＧの測定には殆ど影響を与えず、βＧによるβ
ＧＲＰの活性化を抑制することができることが判る。言
い換えれば、本発明に係る糖化合物を添加することによ
り、ＰＧに特異的な測定試薬が容易に得られることが判
る。

【００７０】実施例２．本発明に係る糖化合物を含有す
る測定試薬と、ＰＧ・βＧ混合液中のＰＧの反応性の検
討。 ［試薬］ （１）測定試薬；実験例１と同じ。 （２）ドーパ・カルシウム溶液；実験例１と同じ （３）本発明に係る糖化合物；実施例１と同じ （４）ＰＧ標準液；実施例１と同じ （５）βＧ標準液；実施例１と同じ （６）ＰＧ・βＧ混合液；10 ng／ml ＰＧ標準液と10 n
g／ml βＧ標準液を１：１で混合し、５ng／ml ＰＧ・
βＧ標準混合液を調製した。また、100 ng／mlＰＧ標準
液と100 ng／ml βＧ標準液も同様に混合し、50 ng／ml
ＰＧ・βＧ混合液を調製した。 ［測定機器］実験例１と同じ。 ［操作］実施例１と同様の方法で、ＰＧ・βＧ混合液及
び標準液について、夫々のオンセットタイムを測定し
た。 ［結果］ＰＧ・βＧ混合液を用いて得られたオンセット
タイムを表４に示す。また、実施例１と同様にしてＰＧ
標準液を用いて得られたオンセットタイムをもとにＰＧ
濃度とオンセットタイムの関係を表す検量線を作成し、
これに基づいて実施例１と同様の方法で夫々のＰＧ・β
Ｇ混合液についてのＰＧ換算値を求めた。その結果を表
４に併せて示す。

【００７１】

【表４】 ＊表中のndは、測定時間内にオンセットＯＤに達しなか
ったことを示す。

【００７２】表４の結果から明らかなように、本発明に
係る糖化合物、即ちβ-1,3-結合を有する化合物であっ
て、その糖残基の６位に置換記を有する化合物であるシ
ゾフィラン又はクレスチン^TMを測定試薬（昆虫体液）と
共存させた場合には、ＰＧ・βＧ混合試料中のＰＧのみ
を特異的に検出できることが判る。

【００７３】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、新規な、昆
虫体液中のβＧＲＰの活性化抑制剤、これを用いた活性
化抑制方法、昆虫体液の処理剤、これを用いた処理方
法、及び簡便なＰＧの測定方法並びにＰＧ測定用試薬を
提供するものであり、ＰＧに特異的な測定用試薬が簡便
に得られる点に顕著な効果を奏するものである。

【００７４】

【図面の簡単な説明】

【図１】実験例１で得られた、β−１，３−グルカン
（βＧ）としてカードラン、シゾフィラン、カルボキシ
メチル化カードラン（ＣＭＥＣ）又はラミナランを用い
た場合のβＧ濃度に対するオンセットタイムを両対数プ
ロットした結果を示したものである。

【図２】実験例１で得られた、βＧとしてラミナリン、
パキマン、クレスチン^TM又はザイモザンＡを用いた場合
のβＧ濃度に対するオンセットタイムを両対数プロット
した結果を示したものである。

【符号の説明】

図１中、−□−はカードランを用いた場合の結果を、−
◇−はシゾフィランを用いた場合の結果を、−○−はＣ
ＭＥＣを用いた場合の結果を、−△−はラミナランを用
いた場合の結果を夫々示す。図２中、−□−はラミナリ
ンを用いた場合の結果を、−◇−はパキマンを用いた場
合の結果を、−○−はクレスチン^TMを用いた場合の結果
を、−△−はザイモザンＡを用いた場合の結果を夫々示
す。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】β１→３結合を有する糖化合物であって該
   糖化合物を構成する糖残基として６位に置換基を有する
   糖残基を含む化合物を含有してなる、昆虫体液中のβ−
   グルカン認識蛋白の活性化抑制剤。
2. 【請求項２】糖化合物が多糖類である、請求項１記載の
   活性化抑制剤。
3. 【請求項３】多糖類が６位に置換基を有する糖残基１個
   と６位に置換基を有さない糖残基２個がβ１→３結合で
   結合した糖残基３個からなる単位を１以上有する糖化合
   物である、請求項２に記載の活性化抑制剤。
4. 【請求項４】糖残基が何れもグルコース残基であり且つ
   ６位の置換基がグルコース残基である、請求項３に記載
   の活性化抑制剤。
5. 【請求項５】糖化合物がシゾフィラン、カルボキシメチ
   ル化カードラン、ラミナリン、ラミナラン又はクレスチ
   ン^TMである、請求項１に記載の活性化抑制剤。
6. 【請求項６】糖化合物がシゾフィラン又はクレスチン^TM
   である、請求項１に記載の活性化抑制剤。
7. 【請求項７】昆虫が鱗翅類、双翅類、直翅類、甲虫類で
   ある、請求項１〜６の何れかに記載の活性化抑制剤。
8. 【請求項８】昆虫がカイコガである、請求項１〜６の何
   れかに記載の活性化抑制剤。
9. 【請求項９】昆虫体液を、β１→３結合を有する糖化合
   物であって該糖化合物を構成する糖残基として６位に置
   換基を有する糖残基を含む化合物で処理することを特徴
   とする、昆虫体液中のβ−グルカン認識蛋白の活性化抑
   制方法。
10. 【請求項１０】糖化合物が多糖類である、請求項９に記
    載の活性化抑制方法。
11. 【請求項１１】多糖類が６位に置換基を有する糖残基１
    個と６位に置換基を有さない糖残基２個がβ１→３結合
    で結合した糖残基３個からなる単位を１以上有する糖化
    合物である、請求項１０に記載の活性化抑制方法。
12. 【請求項１２】糖残基が何れもグルコース残基であり、
    且つ６位の置換基がグルコース残基である、請求項１１
    に記載の活性化抑制方法。
13. 【請求項１３】糖化合物がシゾフィラン、カルボキシメ
    チル化カードラン、ラミナリン、ラミナラン又はクレス
    チン^TMである、請求項９に記載の活性化抑制方法。
14. 【請求項１４】糖化合物がシゾフィラン又はクレスチン
    ^TMである、請求項９に記載の活性化抑制方法。
15. 【請求項１５】昆虫が鱗翅類、双翅類、直翅類、甲虫類
    である、請求項９〜１４の何れかに記載の活性化抑制方
    法。
16. 【請求項１６】昆虫がカイコガである、請求項９〜１４
    の何れかに記載の活性化抑制方法。
17. 【請求項１７】β１→３結合を有する糖化合物であって
    該糖化合物を構成する糖残基として６位に置換基を有す
    る糖残基を含む化合物を含有してなる、昆虫体液の処理
    剤。
18. 【請求項１８】昆虫体液と、β１→３結合を有する糖化
    合物であって該糖化合物を構成する糖残基として６位に
    置換基を有する糖残基を含む化合物を接触させることを
    特徴とする、昆虫体液の処理方法。
19. 【請求項１９】β１→３結合を有する糖化合物であって
    該糖化合物を構成する糖残基として６位に置換基を有す
    る糖残基を含む化合物の存在下に、昆虫体液と試料とを
    反応させることを特徴とする、ペプチドグリカンの測定
    方法。
20. 【請求項２０】昆虫体液と、β１→３結合を有する糖化
    合物であって該糖化合物を構成する糖残基として６位に
    置換基を有する糖残基を含む化合物を含んでなるペプチ
    ドグリカン測定用試薬。