JPH11206400A - Ｄｎａの塩基配列決定方法 - Google Patents
Ｄｎａの塩基配列決定方法Info
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- JPH11206400A JPH11206400A JP10010471A JP1047198A JPH11206400A JP H11206400 A JPH11206400 A JP H11206400A JP 10010471 A JP10010471 A JP 10010471A JP 1047198 A JP1047198 A JP 1047198A JP H11206400 A JPH11206400 A JP H11206400A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【課題】耐熱性のRNAポリメラーゼを用いることなしに
標的ＤＮＡの増幅と核酸転写物の生成とを同時並行して
行える新たな方法を利用したＤＮＡの塩基配列決定方法
を提供する。 【解決手段】標的ＤＮＡ断片を増幅させつつ、増幅され
た標的ＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによ
り、核酸転写反応のターミネーターの存在下、核酸転写
物を生成させ、生成した核酸転写物を解析することで標
的ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する方法であって、上記
標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写物の生成とを等温下で
行う方法。標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写物の生成と
は常温付近で行われ、標的ＤＮＡ断片の増幅は鎖置換増
幅法により行うことができる。
標的ＤＮＡの増幅と核酸転写物の生成とを同時並行して
行える新たな方法を利用したＤＮＡの塩基配列決定方法
を提供する。 【解決手段】標的ＤＮＡ断片を増幅させつつ、増幅され
た標的ＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによ
り、核酸転写反応のターミネーターの存在下、核酸転写
物を生成させ、生成した核酸転写物を解析することで標
的ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する方法であって、上記
標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写物の生成とを等温下で
行う方法。標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写物の生成と
は常温付近で行われ、標的ＤＮＡ断片の増幅は鎖置換増
幅法により行うことができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、鎖置換増幅法を利
用する塩基配列決定方法に関する。さらに詳しくは、本
発明は、鎖置換増幅法を利用することで、温度の昇降を
することなしに標的ＤＮＡ断片の増幅と塩基配列決定の
ためのリボヌクレオチド断片の調製とを並行して行え
る、ＲＮＡポリメラーゼを用いる塩基配列決定方法に関
する。
用する塩基配列決定方法に関する。さらに詳しくは、本
発明は、鎖置換増幅法を利用することで、温度の昇降を
することなしに標的ＤＮＡ断片の増幅と塩基配列決定の
ためのリボヌクレオチド断片の調製とを並行して行え
る、ＲＮＡポリメラーゼを用いる塩基配列決定方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法は優れ
た方法であり、年々その利用範囲が広がっている［Rand
all K. Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491]。
PCR 法では、１分子のDNA 断片を増幅することも可能で
ある。PCR 法で増幅した生成物をクローニングすること
なくシークエンスする方法（ダイレクト・シークエンス
法）も有用な方法である［Corinne Wong et al. (1988)
Nature, 330,384-386]。この方法はライブラリー作製
やそのライブラリーのスクリーニングが不要であり、多
くのサンプルの配列情報を同時に得られる迅速な方法で
ある。
た方法であり、年々その利用範囲が広がっている［Rand
all K. Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491]。
PCR 法では、１分子のDNA 断片を増幅することも可能で
ある。PCR 法で増幅した生成物をクローニングすること
なくシークエンスする方法（ダイレクト・シークエンス
法）も有用な方法である［Corinne Wong et al. (1988)
Nature, 330,384-386]。この方法はライブラリー作製
やそのライブラリーのスクリーニングが不要であり、多
くのサンプルの配列情報を同時に得られる迅速な方法で
ある。
【０００３】さらに、本発明者は、PCR 反応系中に残存
する未反応のプライマー及び２’デオキシリボヌクレオ
シド５’トリフォスフェート（２’ｄＮＴＰｓ）を除去
することなく、かつＰＣＲ反応生成物が迅速に再生する
問題を回避するため、変性自体を全く行わないで良い、
全く新しいDNA の塩基配列決定方法を提案した〔WO96/1
4434〕。この方法は、T7 RNAポリメラーゼ等のRNA ポリ
メラーゼとＲＮＡ転写反応のターミネーター（例えば、
３’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェー
ト、３’ｄＮＴＰｓ）を用いるダイレクト転写シークエ
ンス法である。
する未反応のプライマー及び２’デオキシリボヌクレオ
シド５’トリフォスフェート（２’ｄＮＴＰｓ）を除去
することなく、かつＰＣＲ反応生成物が迅速に再生する
問題を回避するため、変性自体を全く行わないで良い、
全く新しいDNA の塩基配列決定方法を提案した〔WO96/1
4434〕。この方法は、T7 RNAポリメラーゼ等のRNA ポリ
メラーゼとＲＮＡ転写反応のターミネーター（例えば、
３’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェー
ト、３’ｄＮＴＰｓ）を用いるダイレクト転写シークエ
ンス法である。
【０００４】上記ダイレクト転写シークエンス法は、以
下のように行われる。ＰＣＲ法等で増幅したＤＮＡを鋳
型として、RNAポリメラーゼをリボヌクレオシド５’ト
リフォスフェート類（ＮＴＰ）及びデオキシリボヌクレ
オチド（３’ｄＮＴＰ）の混合物中で反応させる。この
反応において、鋳型のＤＮＡ配列に相応した塩基を有す
るリボヌクレオチドがリボヌクレオチド配列中に逐次取
り込まれ、３’デオキシリボヌクレオチドが取り込まれ
ることでターミネーションが起こりポリリボヌクレオチ
ドが合成される。得られるポリリボヌクレオチド（核酸
転写生成物）を分離し、得られる分離分画から核酸の配
列を読み取ることでＤＮＡの塩基配列が決定される。特
に、核酸転写のターミネーターとして、蛍光標識された
３’ｄＮＴＰ誘導体を用い、ターミネーターが有する標
識を読み取ることで塩基配列を容易に決定できる。
下のように行われる。ＰＣＲ法等で増幅したＤＮＡを鋳
型として、RNAポリメラーゼをリボヌクレオシド５’ト
リフォスフェート類（ＮＴＰ）及びデオキシリボヌクレ
オチド（３’ｄＮＴＰ）の混合物中で反応させる。この
反応において、鋳型のＤＮＡ配列に相応した塩基を有す
るリボヌクレオチドがリボヌクレオチド配列中に逐次取
り込まれ、３’デオキシリボヌクレオチドが取り込まれ
ることでターミネーションが起こりポリリボヌクレオチ
ドが合成される。得られるポリリボヌクレオチド（核酸
転写生成物）を分離し、得られる分離分画から核酸の配
列を読み取ることでＤＮＡの塩基配列が決定される。特
に、核酸転写のターミネーターとして、蛍光標識された
３’ｄＮＴＰ誘導体を用い、ターミネーターが有する標
識を読み取ることで塩基配列を容易に決定できる。
【０００５】この方法によれば、ポリメラーゼ連鎖反応
により増幅したＤＮＡ生成物の塩基配列を、プライマー
及び２’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェ
ート（２’ｄＮＴＰｓ）を除去することなしにそのまま
シークエンスに使用できる。これは２’ｄＮＴＰｓがＲ
ＮＡポリメラーゼの基質として働かないためである。さ
らに、変性自体を全く行わないため、ＰＣＲ生成物が迅
速に再生する問題も回避でき、極めて優れた方法であ
る。
により増幅したＤＮＡ生成物の塩基配列を、プライマー
及び２’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェ
ート（２’ｄＮＴＰｓ）を除去することなしにそのまま
シークエンスに使用できる。これは２’ｄＮＴＰｓがＲ
ＮＡポリメラーゼの基質として働かないためである。さ
らに、変性自体を全く行わないため、ＰＣＲ生成物が迅
速に再生する問題も回避でき、極めて優れた方法であ
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ところで、ヒトゲノム
のように膨大な量のゲノムの塩基配列を解析する場合、
短期間に結果を得ようとすると、現存する方法に比べ桁
違いに迅速かつ簡便な方法が必要となる。上記ダイレク
ト転写シークエンス法は、ＤＮＡポリメラーゼを用いる
従来のシークエンス法に比べて迅速な方法ではあるが、
さらに迅速かつ簡便な方法が必要である。そこで、上記
ダイレクト転写シークエンス法を利用し、さらに迅速か
つ簡便にシークエンスを行う方法として、ポリメラーゼ
連鎖反応によるＤＮＡの増幅とダイレクト転写シークエ
ンス法の核酸転写反応とを同じ反応液中で同時に並行し
て行うことが考えられる。
のように膨大な量のゲノムの塩基配列を解析する場合、
短期間に結果を得ようとすると、現存する方法に比べ桁
違いに迅速かつ簡便な方法が必要となる。上記ダイレク
ト転写シークエンス法は、ＤＮＡポリメラーゼを用いる
従来のシークエンス法に比べて迅速な方法ではあるが、
さらに迅速かつ簡便な方法が必要である。そこで、上記
ダイレクト転写シークエンス法を利用し、さらに迅速か
つ簡便にシークエンスを行う方法として、ポリメラーゼ
連鎖反応によるＤＮＡの増幅とダイレクト転写シークエ
ンス法の核酸転写反応とを同じ反応液中で同時に並行し
て行うことが考えられる。
【０００７】ところが、ポリメラーゼ連鎖反応において
は、ＤＮＡ鎖の増幅のために反応液の温度の昇降が必須
である。そのため、ポリメラーゼ連鎖反応に使用される
ＤＮＡポリメラーゼは高い耐熱性を有するものである。
従って、核酸転写反応に用いられるＲＮＡポリメラーゼ
についても同様に高い耐熱性を有することが要求され、
ＤＮＡポリメラーゼと同様の耐熱性を有するＲＮＡポリ
メラーゼが出現すれば、上記組合せ方法は可能となる。
しかるに、現在のところそのような耐熱性のＲＮＡポリ
メラーゼは知られていない。
は、ＤＮＡ鎖の増幅のために反応液の温度の昇降が必須
である。そのため、ポリメラーゼ連鎖反応に使用される
ＤＮＡポリメラーゼは高い耐熱性を有するものである。
従って、核酸転写反応に用いられるＲＮＡポリメラーゼ
についても同様に高い耐熱性を有することが要求され、
ＤＮＡポリメラーゼと同様の耐熱性を有するＲＮＡポリ
メラーゼが出現すれば、上記組合せ方法は可能となる。
しかるに、現在のところそのような耐熱性のＲＮＡポリ
メラーゼは知られていない。
【０００８】そこで、本発明の目的は、耐熱性のRNAポ
リメラーゼを用いることなしに標的ＤＮＡの増幅と核酸
転写物の生成とを同時並行して行える新たな方法を利用
したＤＮＡの塩基配列決定方法を提供することにある。
リメラーゼを用いることなしに標的ＤＮＡの増幅と核酸
転写物の生成とを同時並行して行える新たな方法を利用
したＤＮＡの塩基配列決定方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、標的ＤＮＡ断
片を増幅させつつ、増幅された標的ＤＮＡ断片を鋳型と
してＲＮＡポリメラーゼにより、核酸転写反応のターミ
ネーターの存在下、核酸転写物を生成させ、生成した核
酸転写物を解析することで標的ＤＮＡ断片の塩基配列を
決定する方法であって、上記標的ＤＮＡ断片の増幅と核
酸転写物の生成とを等温下で行うことを特徴とする方法
（第１の方法）に関する。
片を増幅させつつ、増幅された標的ＤＮＡ断片を鋳型と
してＲＮＡポリメラーゼにより、核酸転写反応のターミ
ネーターの存在下、核酸転写物を生成させ、生成した核
酸転写物を解析することで標的ＤＮＡ断片の塩基配列を
決定する方法であって、上記標的ＤＮＡ断片の増幅と核
酸転写物の生成とを等温下で行うことを特徴とする方法
（第１の方法）に関する。
【００１０】さらに本発明は、（ａ−１）標的ＤＮＡ断
片配列を含むＤＮＡ断片（但し、このＤＮＡ断片は、ニ
ック形成能を有する配列及び少なくとも一方の鎖にＲＮ
Ａポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む）、
（ｂ）標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対するプライマー配
列及びニック形成能を有する配列を含むプライマー（以
下、プライマーＧ１という）、（ｃ）標的ＤＮＡ断片の
他方の鎖に対するプライマー配列及びニック形成能を有
する配列を含むプライマー（以下、プライマーＧ２とい
う）、（但し、上記プライマーＧ１及びＧ２の少なくと
も一方はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列
を含む）（ｄ）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴ
ＴＰ又はそれらの誘導体からなるデオキシリボヌクレオ
シド５’トリフォスフェート類（以下、ｄＮＴＰ誘導体
という）、（ｅ）ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ又
はそれらの誘導体からなるリボヌクレオシド５’トリフ
ォスフェート類（以下、ＮＴＰ誘導体という）、及び
（ｆ）３’dATP、３’dGTP、３’dCTP、３’dUTP及びそ
れらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも1種の
３’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェート
(以下、３’dNTP誘導体という)の存在下、（ｇ）ＤＮＡ
ポリメラーゼ、及び（ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用さ
せ、かつ上記ＤＮＡ断片（ａ−１）のニック形成能を有
する部位にニックを形成させて、前記標的ＤＮＡ断片配
列を含むＤＮＡ断片を増幅しつつ核酸転写生成物を得る
工程、及び得られた核酸転写生成物を分離し、分離分画
から核酸の配列を読み取る工程を含むＤＮＡの塩基配列
決定方法（第２の方法）に関する。
片配列を含むＤＮＡ断片（但し、このＤＮＡ断片は、ニ
ック形成能を有する配列及び少なくとも一方の鎖にＲＮ
Ａポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む）、
（ｂ）標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対するプライマー配
列及びニック形成能を有する配列を含むプライマー（以
下、プライマーＧ１という）、（ｃ）標的ＤＮＡ断片の
他方の鎖に対するプライマー配列及びニック形成能を有
する配列を含むプライマー（以下、プライマーＧ２とい
う）、（但し、上記プライマーＧ１及びＧ２の少なくと
も一方はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列
を含む）（ｄ）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴ
ＴＰ又はそれらの誘導体からなるデオキシリボヌクレオ
シド５’トリフォスフェート類（以下、ｄＮＴＰ誘導体
という）、（ｅ）ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ又
はそれらの誘導体からなるリボヌクレオシド５’トリフ
ォスフェート類（以下、ＮＴＰ誘導体という）、及び
（ｆ）３’dATP、３’dGTP、３’dCTP、３’dUTP及びそ
れらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも1種の
３’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェート
(以下、３’dNTP誘導体という)の存在下、（ｇ）ＤＮＡ
ポリメラーゼ、及び（ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用さ
せ、かつ上記ＤＮＡ断片（ａ−１）のニック形成能を有
する部位にニックを形成させて、前記標的ＤＮＡ断片配
列を含むＤＮＡ断片を増幅しつつ核酸転写生成物を得る
工程、及び得られた核酸転写生成物を分離し、分離分画
から核酸の配列を読み取る工程を含むＤＮＡの塩基配列
決定方法（第２の方法）に関する。
【００１１】さらに本発明は、標的ＤＮＡ断片に、プラ
イマーＢ１（標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対するプライ
マー）、プライマーＢ２（標的ＤＮＡ断片の他方の鎖に
対するプライマー）、プライマーＧ１及びプライマーＧ
２をハイブリダイズする工程（但し、プライマーＢ１は
プライマーＧ１より、標的ＤＮＡ断片の一方の鎖の５’
側にハイブリダイズし、プライマーＢ２はプライマーＧ
２より、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖の５’側にハイブリ
ダイズする） （ａ−２）ハイブリダイズにより得られた標的ＤＮＡ断
片に、（ｂ）プライマーＧ１、（ｃ）プライマーＧ２、
（ｄ）ｄＮＴＰ誘導体、（ｅ）ＮＴＰ誘導体及び（ｆ）
少なくとも１種の３’dNTP誘導体の存在下、（ｇ）ＤＮ
Ａポリメラーゼ、（ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用さ
せ、かつ上記ＤＮＡ断片（ａ−２）のニック形成能を有
する部位にニックを形成させて、前記標的ＤＮＡ断片配
列を含むＤＮＡ断片を増幅しつつ核酸転写生成物を得る
工程、及び核酸転写生成物を分離し、得られる分離分画
から核酸の配列を読み取る工程を含むＤＮＡの塩基配列
決定方法（第３の方法）に関する。
イマーＢ１（標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対するプライ
マー）、プライマーＢ２（標的ＤＮＡ断片の他方の鎖に
対するプライマー）、プライマーＧ１及びプライマーＧ
２をハイブリダイズする工程（但し、プライマーＢ１は
プライマーＧ１より、標的ＤＮＡ断片の一方の鎖の５’
側にハイブリダイズし、プライマーＢ２はプライマーＧ
２より、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖の５’側にハイブリ
ダイズする） （ａ−２）ハイブリダイズにより得られた標的ＤＮＡ断
片に、（ｂ）プライマーＧ１、（ｃ）プライマーＧ２、
（ｄ）ｄＮＴＰ誘導体、（ｅ）ＮＴＰ誘導体及び（ｆ）
少なくとも１種の３’dNTP誘導体の存在下、（ｇ）ＤＮ
Ａポリメラーゼ、（ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用さ
せ、かつ上記ＤＮＡ断片（ａ−２）のニック形成能を有
する部位にニックを形成させて、前記標的ＤＮＡ断片配
列を含むＤＮＡ断片を増幅しつつ核酸転写生成物を得る
工程、及び核酸転写生成物を分離し、得られる分離分画
から核酸の配列を読み取る工程を含むＤＮＡの塩基配列
決定方法（第３の方法）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明の方法は、いずれも、大き
く分けて、標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮＡ断片を増幅
し、かつ増幅されたＤＮＡ断片を鋳型として核酸転写生
成物を得る工程、及び、得られた核酸転写生成物を分離
し、分離分画から核酸の配列を読み取る工程とからな
る。
く分けて、標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮＡ断片を増幅
し、かつ増幅されたＤＮＡ断片を鋳型として核酸転写生
成物を得る工程、及び、得られた核酸転写生成物を分離
し、分離分画から核酸の配列を読み取る工程とからな
る。
【００１３】第１の方法は、標的ＤＮＡ断片を増幅させ
つつ、増幅された標的ＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡポ
リメラーゼにより、核酸転写反応のターミネーターの存
在下、核酸転写物を生成させ、生成した核酸転写物を解
析することで標的ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する方法
である。この方法は、上記標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸
転写物の生成とを等温下で行うことを特徴とする。ここ
で「等温下」とは、反応温度を意図的に上下させること
なく、という意味である。標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸
転写物の生成とは、常温付近で行うことができ、使用さ
れるＲＮＡポリメラーゼ等の酵素の最適温度を考慮して
決定することができる。
つつ、増幅された標的ＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡポ
リメラーゼにより、核酸転写反応のターミネーターの存
在下、核酸転写物を生成させ、生成した核酸転写物を解
析することで標的ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する方法
である。この方法は、上記標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸
転写物の生成とを等温下で行うことを特徴とする。ここ
で「等温下」とは、反応温度を意図的に上下させること
なく、という意味である。標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸
転写物の生成とは、常温付近で行うことができ、使用さ
れるＲＮＡポリメラーゼ等の酵素の最適温度を考慮して
決定することができる。
【００１４】標的ＤＮＡ断片の増幅は、例えば、鎖置換
増幅法により行うことができる。鎖置換増幅法について
はNucleic Acids Research, Vol.20, No.7, 1691-1696
に記載がある。鎖置換増幅法は、標的ＤＮＡ断片に、Ｄ
ＮＡポリメラーゼの基質及び標的ＤＮＡ断片に対するプ
ライマーの存在下、ＤＮＡポリメラーゼ及び制限酵素を
作用させる方法である。但し、上記プライマーは、順方
向及び逆方向の１組あり、いずれも制限酵素によりニッ
クが形成され得る配列を含む。さらに、少なくとも一方
のプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列も含むものである。
増幅法により行うことができる。鎖置換増幅法について
はNucleic Acids Research, Vol.20, No.7, 1691-1696
に記載がある。鎖置換増幅法は、標的ＤＮＡ断片に、Ｄ
ＮＡポリメラーゼの基質及び標的ＤＮＡ断片に対するプ
ライマーの存在下、ＤＮＡポリメラーゼ及び制限酵素を
作用させる方法である。但し、上記プライマーは、順方
向及び逆方向の１組あり、いずれも制限酵素によりニッ
クが形成され得る配列を含む。さらに、少なくとも一方
のプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列も含むものである。
【００１５】また、標的ＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡ
ポリメラーゼにより、核酸転写反応のターミネーターの
存在下、核酸転写物を生成させ、生成した核酸転写物を
解析する方法は、核酸転写反応が、ＲＮＡポリメラーゼ
の基質及び標識されたターミネーターの存在下で行わ
れ、核酸転写物の解析を、核酸転写物に取り込まれた上
記標識を検出することにより行う方法であることができ
る。そのような方法としては、例えば、WO96/14434に記
載された、T7 RNAポリメラーゼ等のRNA ポリメラーゼと
ＲＮＡ転写反応のターミネーター（例えば、３’デオキ
シリボヌクレオシド５’トリフォスフェート、３’ｄＮ
ＴＰｓ）を用いるダイレクト転写シークエンス法を挙げ
ることができる。
ポリメラーゼにより、核酸転写反応のターミネーターの
存在下、核酸転写物を生成させ、生成した核酸転写物を
解析する方法は、核酸転写反応が、ＲＮＡポリメラーゼ
の基質及び標識されたターミネーターの存在下で行わ
れ、核酸転写物の解析を、核酸転写物に取り込まれた上
記標識を検出することにより行う方法であることができ
る。そのような方法としては、例えば、WO96/14434に記
載された、T7 RNAポリメラーゼ等のRNA ポリメラーゼと
ＲＮＡ転写反応のターミネーター（例えば、３’デオキ
シリボヌクレオシド５’トリフォスフェート、３’ｄＮ
ＴＰｓ）を用いるダイレクト転写シークエンス法を挙げ
ることができる。
【００１６】第２及び第３の方法は、第１の方法の１実
施態様である。増幅及び核酸転写工程 第２の方法においては、増幅の鋳型として、標的ＤＮＡ
断片配列を含むＤＮＡ断片（ａ−１）を用いるが、この
ＤＮＡ断片は、ニック形成能を有する配列及び少なくと
も一方の鎖にＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター
配列を含む。第３の方法では、増幅の鋳型として標的Ｄ
ＮＡ断片に、プライマーＢ１、プライマーＢ２、プライ
マーＧ１及びプライマーＧ２をハイブリダイズしたもの
（ａ−２）を用いる。
施態様である。増幅及び核酸転写工程 第２の方法においては、増幅の鋳型として、標的ＤＮＡ
断片配列を含むＤＮＡ断片（ａ−１）を用いるが、この
ＤＮＡ断片は、ニック形成能を有する配列及び少なくと
も一方の鎖にＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター
配列を含む。第３の方法では、増幅の鋳型として標的Ｄ
ＮＡ断片に、プライマーＢ１、プライマーＢ２、プライ
マーＧ１及びプライマーＧ２をハイブリダイズしたもの
（ａ−２）を用いる。
【００１７】「標的ＤＮＡ断片」は、塩基配列を決定す
る断片である。標的ＤＮＡ断片の種類や長さ等には特に
制限はない。「ニック形成能を有する配列」とは、例え
ば、「ヘミホスホロチオエート部位またはその類縁部位
を含む制限酵素部位」である。「ヘミホスホロチオエー
ト部位を含む制限酵素部位」は、制限酵素部位を構成す
るヌクレオチドのひとつがαＳ体（１−チオトリフォス
フェート）であるものである。ヘミホスホロチオエート
部位を含む制限酵素部位に制限酵素を作用させると、α
Ｓ体と相補関係にあるヌクレオチドが切断されてニック
を形成する（一方の鎖のみが切断される）。また、制限
酵素部位の配列は後述のニック形成のために使用される
制限酵素に応じて適宜決定することができる。「ＲＮＡ
ポリメラーゼのためのプロモーター配列」は、後述する
核酸転写反応に使用されるＲＮＡポリメラーゼのための
プロモーター配列である。ＲＮＡポリメラーゼのための
プロモーター配列は、用いるＲＮＡポリメラーゼの種類
に応じて適宜選択することができる。
る断片である。標的ＤＮＡ断片の種類や長さ等には特に
制限はない。「ニック形成能を有する配列」とは、例え
ば、「ヘミホスホロチオエート部位またはその類縁部位
を含む制限酵素部位」である。「ヘミホスホロチオエー
ト部位を含む制限酵素部位」は、制限酵素部位を構成す
るヌクレオチドのひとつがαＳ体（１−チオトリフォス
フェート）であるものである。ヘミホスホロチオエート
部位を含む制限酵素部位に制限酵素を作用させると、α
Ｓ体と相補関係にあるヌクレオチドが切断されてニック
を形成する（一方の鎖のみが切断される）。また、制限
酵素部位の配列は後述のニック形成のために使用される
制限酵素に応じて適宜決定することができる。「ＲＮＡ
ポリメラーゼのためのプロモーター配列」は、後述する
核酸転写反応に使用されるＲＮＡポリメラーゼのための
プロモーター配列である。ＲＮＡポリメラーゼのための
プロモーター配列は、用いるＲＮＡポリメラーゼの種類
に応じて適宜選択することができる。
【００１８】上記標的ＤＮＡ断片配列、ニック形成能を
有する配列及びＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ
ー配列を含むＤＮＡ断片（ａ−１）は、例えば、以下の
方法により調製できる。プライマーＢ１、プライマーＢ
２、プライマーＧ１及びプライマーＧ２を標的ＤＮＡ断
片にハイブリダイズする工程、及びハイブリダイズによ
り得られた標的ＤＮＡ断片に、ｄＮＴＰ誘導体の存在
下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる工程からなる方法
により調製される。プライマーＢ１は、標的ＤＮＡ断片
の一方の鎖に対するプライマーであり、プライマーＢ２
は、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖に対するプライマーであ
り、プライマーＧ１は、標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対
するプライマー配列及びニック形成能を有する配列を含
むプライマーであり、プライマーＧ２は、標的ＤＮＡ断
片の他方の鎖に対するプライマー配列及びニック形成能
を有する配列を含むプライマーである。但し、プライマ
ーＢ１はプライマーＧ１より、標的ＤＮＡ断片の一方の
鎖の５’側にハイブリダイズし、プライマーＢ２はプラ
イマーＧ２より、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖の５’側に
ハイブリダイズする。
有する配列及びＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ
ー配列を含むＤＮＡ断片（ａ−１）は、例えば、以下の
方法により調製できる。プライマーＢ１、プライマーＢ
２、プライマーＧ１及びプライマーＧ２を標的ＤＮＡ断
片にハイブリダイズする工程、及びハイブリダイズによ
り得られた標的ＤＮＡ断片に、ｄＮＴＰ誘導体の存在
下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる工程からなる方法
により調製される。プライマーＢ１は、標的ＤＮＡ断片
の一方の鎖に対するプライマーであり、プライマーＢ２
は、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖に対するプライマーであ
り、プライマーＧ１は、標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対
するプライマー配列及びニック形成能を有する配列を含
むプライマーであり、プライマーＧ２は、標的ＤＮＡ断
片の他方の鎖に対するプライマー配列及びニック形成能
を有する配列を含むプライマーである。但し、プライマ
ーＢ１はプライマーＧ１より、標的ＤＮＡ断片の一方の
鎖の５’側にハイブリダイズし、プライマーＢ２はプラ
イマーＧ２より、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖の５’側に
ハイブリダイズする。
【００１９】標的ＤＮＡ断片に対するプライマーのハイ
ブリダイズは、例えば、９５℃で４分間熱処理し、徐冷
することで行うことができる。尚、プライマーＢ１とプ
ライマーＧ１では、プライマーＢ１が５’の上流に位置
するように配列を選択する。さらに、ハイブリダイズ物
において、プライマーＢ１とプライマーＧ１との間には
１本鎖の領域が存在するように各プライマーの配列を選
択する。同様に、プライマーＢ２とプライマーＧ２で
も、プライマーＢ２が５’の上流に位置し、かつハイブ
リダイズ物において、プライマーＢ２とプライマーＧ２
との間に１本鎖の領域が存在するように各プライマーの
配列を選択する。尚、各プライマーは常法により適宜合
成することができる。
ブリダイズは、例えば、９５℃で４分間熱処理し、徐冷
することで行うことができる。尚、プライマーＢ１とプ
ライマーＧ１では、プライマーＢ１が５’の上流に位置
するように配列を選択する。さらに、ハイブリダイズ物
において、プライマーＢ１とプライマーＧ１との間には
１本鎖の領域が存在するように各プライマーの配列を選
択する。同様に、プライマーＢ２とプライマーＧ２で
も、プライマーＢ２が５’の上流に位置し、かつハイブ
リダイズ物において、プライマーＢ２とプライマーＧ２
との間に１本鎖の領域が存在するように各プライマーの
配列を選択する。尚、各プライマーは常法により適宜合
成することができる。
【００２０】このようなプライマーＢ１とプライマーＧ
１またはプライマーＢ２とプライマーＧ２がハイブリダ
イズした鎖は、ｄＮＴＰ誘導体の存在下、ＤＮＡポリメ
ラーゼを作用させることで、鎖置換増幅により増幅され
る。鎖置換増幅法についてはNucleic Acids Research,
Vol.20, No.7, 1691-1696に記載がある。さらに上記増
幅において、ｄＮＴＰ誘導体のうちの１種にαＳ体を用
いることで、ヘミホスホロチオエート部位を含む制限酵
素部位を形成することができる。尚、どのｄＮＴＰ誘導
体をαＳ体とするかは、制限酵素部位の配列に応じて適
宜決定できる。
１またはプライマーＢ２とプライマーＧ２がハイブリダ
イズした鎖は、ｄＮＴＰ誘導体の存在下、ＤＮＡポリメ
ラーゼを作用させることで、鎖置換増幅により増幅され
る。鎖置換増幅法についてはNucleic Acids Research,
Vol.20, No.7, 1691-1696に記載がある。さらに上記増
幅において、ｄＮＴＰ誘導体のうちの１種にαＳ体を用
いることで、ヘミホスホロチオエート部位を含む制限酵
素部位を形成することができる。尚、どのｄＮＴＰ誘導
体をαＳ体とするかは、制限酵素部位の配列に応じて適
宜決定できる。
【００２１】第3の方法では、増幅の鋳型として標的Ｄ
ＮＡ断片に、プライマーＢ１、プライマーＢ２、プライ
マーＧ１及びプライマーＧ２をハイブリダイズしたＤＮ
Ａ断片（ａ−２）を用いる。「標的ＤＮＡ断片」は、塩
基配列を決定する断片である。標的ＤＮＡ断片の種類や
長さ等には特に制限はない。プライマーＢ１、プライマ
ーＢ２、プライマーＧ１及びプライマーＧ２は上述のと
おりであり、プライマーＢ１とプライマーＧ１では、プ
ライマーＢ１が５’の上流に位置するように配列を選択
する。さらに、ハイブリダイズ物において、プライマー
Ｂ１とプライマーＧ１との間には１本鎖の領域が存在す
るように各プライマーの配列を選択する。同様に、プラ
イマーＢ２とプライマーＧ２でも、プライマーＢ２が
５’の上流に位置し、かつハイブリダイズ物において、
プライマーＢ２とプライマーＧ２との間に１本鎖の領域
が存在するように各プライマーの配列を選択する。尚、
各プライマーは常法により適宜合成することができる。
標的ＤＮＡ断片に対するプライマーのハイブリダイズ
は、例えば、９５℃で４分間熱処理し、徐冷することで
行うことができる。第３の方法では、増幅及び核酸転写
工程の初期に、ハイブリダイズ物を鋳型として、上記し
たようにＤＮＡポリメラーゼの作用により、標的ＤＮＡ
断片配列を含むＤＮＡ断片（但し、このＤＮＡ断片は、
ニック形成能を有する配列及び少なくとも一方の鎖にＲ
ＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む）
（ａ−２）が生成される。
ＮＡ断片に、プライマーＢ１、プライマーＢ２、プライ
マーＧ１及びプライマーＧ２をハイブリダイズしたＤＮ
Ａ断片（ａ−２）を用いる。「標的ＤＮＡ断片」は、塩
基配列を決定する断片である。標的ＤＮＡ断片の種類や
長さ等には特に制限はない。プライマーＢ１、プライマ
ーＢ２、プライマーＧ１及びプライマーＧ２は上述のと
おりであり、プライマーＢ１とプライマーＧ１では、プ
ライマーＢ１が５’の上流に位置するように配列を選択
する。さらに、ハイブリダイズ物において、プライマー
Ｂ１とプライマーＧ１との間には１本鎖の領域が存在す
るように各プライマーの配列を選択する。同様に、プラ
イマーＢ２とプライマーＧ２でも、プライマーＢ２が
５’の上流に位置し、かつハイブリダイズ物において、
プライマーＢ２とプライマーＧ２との間に１本鎖の領域
が存在するように各プライマーの配列を選択する。尚、
各プライマーは常法により適宜合成することができる。
標的ＤＮＡ断片に対するプライマーのハイブリダイズ
は、例えば、９５℃で４分間熱処理し、徐冷することで
行うことができる。第３の方法では、増幅及び核酸転写
工程の初期に、ハイブリダイズ物を鋳型として、上記し
たようにＤＮＡポリメラーゼの作用により、標的ＤＮＡ
断片配列を含むＤＮＡ断片（但し、このＤＮＡ断片は、
ニック形成能を有する配列及び少なくとも一方の鎖にＲ
ＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む）
（ａ−２）が生成される。
【００２２】増幅及び核酸転写工程においては、上記
（ａ−１）または（ａ−２）標的ＤＮＡ断片に、（ｂ）
プライマーＧ１、（ｃ）プライマーＧ２、（ｄ）ｄＮＴ
Ｐ誘導体（但し、ｄＮＴＰ誘導体のうちの１種はαＳ体
である）、（ｅ）ＮＴＰ誘導体及び（ｆ）少なくとも1
種の３’dNTP誘導体の存在下、（ｇ）ＤＮＡポリメラー
ゼ、及び（ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用させ、かつ上
記ＤＮＡ断片（ａ−１）または（ａ−２）のニック形成
能を有する部位にニックを形成させる。この反応は、温
度を昇降させることなく、実質的に等温下で行われる。
但し、反応温度は、各酵素の至適温度を考慮して適宜決
定される。また、ＤＮＡ断片（ａ−１）及び（ａ−２）
へのニックの形成は、制限酵素を用いて行うことができ
る。制限酵素は、制限酵素部位に存在する、例えば、ヘ
ミホスホロチオエート部位を認識してニックを形成する
ことができる。また、ニック形成能を有する配列は、ヘ
ミホスホロチオエート部位またはその類縁部位を含む制
限酵素部位であることができ、その際に使用するｄＮＴ
Ｐ誘導体のうちの１種はαＳ体またはその類縁化合物で
ある。
（ａ−１）または（ａ−２）標的ＤＮＡ断片に、（ｂ）
プライマーＧ１、（ｃ）プライマーＧ２、（ｄ）ｄＮＴ
Ｐ誘導体（但し、ｄＮＴＰ誘導体のうちの１種はαＳ体
である）、（ｅ）ＮＴＰ誘導体及び（ｆ）少なくとも1
種の３’dNTP誘導体の存在下、（ｇ）ＤＮＡポリメラー
ゼ、及び（ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用させ、かつ上
記ＤＮＡ断片（ａ−１）または（ａ−２）のニック形成
能を有する部位にニックを形成させる。この反応は、温
度を昇降させることなく、実質的に等温下で行われる。
但し、反応温度は、各酵素の至適温度を考慮して適宜決
定される。また、ＤＮＡ断片（ａ−１）及び（ａ−２）
へのニックの形成は、制限酵素を用いて行うことができ
る。制限酵素は、制限酵素部位に存在する、例えば、ヘ
ミホスホロチオエート部位を認識してニックを形成する
ことができる。また、ニック形成能を有する配列は、ヘ
ミホスホロチオエート部位またはその類縁部位を含む制
限酵素部位であることができ、その際に使用するｄＮＴ
Ｐ誘導体のうちの１種はαＳ体またはその類縁化合物で
ある。
【００２３】上記反応系では、ＤＮＡポリメラーゼ、制
限酵素及びＲＮＡポリメラーゼによる反応が並列的に行
われている。制限酵素は、（ａ−１）または（ａ−２）
の標的ＤＮＡ断片が有するニック形成能を有する配列、
例えば、ヘミホスホロチオエート部位を含む制限酵素部
位に作用して、断片の制限酵素部位にニックを形成す
る。一般にヘミホスホロチオエート部位を含む制限酵素
部位にこの制限酵素部位を認識する制限酵素を作用させ
ると、片鎖のみにヘミホスホロチオエート部位を有する
鎖の相補鎖にニックが形成されることは知られている。
本発明においては、プライマー鎖Ｇ１及びＧ２はヘミホ
スホロチオエートを含まないので、プライマー鎖を含む
２本鎖中に存在する制限酵素部位には片鎖のみにヘミホ
スホロチオエート部位が存在することになり、この制限
酵素部位にニックが形成される。しかし、標的ＤＮＡ断
片中に制限酵素部位と同一配列が存在しても、プライマ
ー鎖を含まない部位においては、両鎖中にヘミホスホロ
チオエート部位が存在することになり、不必要なニック
が形成される恐れはない。尚、実際には制限酵素により
ニックの形成のされ易さがことなるので、制限酵素の性
能を考慮して適宜選択することができる。制限酵素とし
ては、ＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｔＢＩ、Ａｖａｌ等を挙げる
ことができるが、これらに制限されるものではない。
尚、制限酵素は市販品を適宜入手できる。
限酵素及びＲＮＡポリメラーゼによる反応が並列的に行
われている。制限酵素は、（ａ−１）または（ａ−２）
の標的ＤＮＡ断片が有するニック形成能を有する配列、
例えば、ヘミホスホロチオエート部位を含む制限酵素部
位に作用して、断片の制限酵素部位にニックを形成す
る。一般にヘミホスホロチオエート部位を含む制限酵素
部位にこの制限酵素部位を認識する制限酵素を作用させ
ると、片鎖のみにヘミホスホロチオエート部位を有する
鎖の相補鎖にニックが形成されることは知られている。
本発明においては、プライマー鎖Ｇ１及びＧ２はヘミホ
スホロチオエートを含まないので、プライマー鎖を含む
２本鎖中に存在する制限酵素部位には片鎖のみにヘミホ
スホロチオエート部位が存在することになり、この制限
酵素部位にニックが形成される。しかし、標的ＤＮＡ断
片中に制限酵素部位と同一配列が存在しても、プライマ
ー鎖を含まない部位においては、両鎖中にヘミホスホロ
チオエート部位が存在することになり、不必要なニック
が形成される恐れはない。尚、実際には制限酵素により
ニックの形成のされ易さがことなるので、制限酵素の性
能を考慮して適宜選択することができる。制限酵素とし
ては、ＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｔＢＩ、Ａｖａｌ等を挙げる
ことができるが、これらに制限されるものではない。
尚、制限酵素は市販品を適宜入手できる。
【００２４】ＤＮＡポリメラーゼは、上記制限酵素の作
用によりＤＮＡ断片に形成されたニックを起点とし、か
つニックを有する断片を鋳型として、鎖置換増幅反応を
起こし、配列の増幅を行う。その際、ｄＮＴＰ誘導体が
基質となる。さらに、ニック形成能を有する配列が、ヘ
ミホスホロチオエート部位を含む制限酵素部位である場
合、ｄＮＴＰ誘導体のうちの１種としてαＳ体を用いる
ことで、増幅されるＤＮＡ断片の制限酵素部位にヘミホ
スホロチオエート部位を形成する。ｄＮＴＰ誘導体のα
Ｓ体は、市販品を適宜入手できる。尚、どのｄＮＴＰ誘
導体をαＳ体とするかは、制限酵素部位の配列に応じて
適宜決定できる。使用されるＤＮＡポリメラーゼの種類
には特に制限はなく、鎖置換増幅反応を起こしやすい種
類のＤＮＡポリメラーゼから適宜選択することができ
る。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｂｓｔ ｐ
ｏｌ、ｅｘｅ-ｋｌｅｎｏｗ等を挙げることができる
が、これらに制限されるものではない。ＤＮＡポリメラ
ーゼも市販品を適宜入手できる。
用によりＤＮＡ断片に形成されたニックを起点とし、か
つニックを有する断片を鋳型として、鎖置換増幅反応を
起こし、配列の増幅を行う。その際、ｄＮＴＰ誘導体が
基質となる。さらに、ニック形成能を有する配列が、ヘ
ミホスホロチオエート部位を含む制限酵素部位である場
合、ｄＮＴＰ誘導体のうちの１種としてαＳ体を用いる
ことで、増幅されるＤＮＡ断片の制限酵素部位にヘミホ
スホロチオエート部位を形成する。ｄＮＴＰ誘導体のα
Ｓ体は、市販品を適宜入手できる。尚、どのｄＮＴＰ誘
導体をαＳ体とするかは、制限酵素部位の配列に応じて
適宜決定できる。使用されるＤＮＡポリメラーゼの種類
には特に制限はなく、鎖置換増幅反応を起こしやすい種
類のＤＮＡポリメラーゼから適宜選択することができ
る。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｂｓｔ ｐ
ｏｌ、ｅｘｅ-ｋｌｅｎｏｗ等を挙げることができる
が、これらに制限されるものではない。ＤＮＡポリメラ
ーゼも市販品を適宜入手できる。
【００２５】ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラー
ゼにより増幅されたＤＮＡ断片を鋳型とし、かつ（ｅ）
塩基の異なる４種類のＮＴＰ誘導体及び（ｆ）少なくと
も1種の３’dNTP誘導体を基質として核酸転写生成物を
生じる。転写生成物であるＲＮＡ又は核酸の３’末端に
は、３’ｄＮＴＰ誘導体が取り込まれることにより、
３’ヒドロキシ基が欠落し、ＲＮＡ又は核酸の合成が阻
害される。その結果、３’末端が３’ｄＮＴＰ誘導体で
ある種々の長さのＲＮＡ又は核酸断片が得られる。塩基
の異なる４種類の３’ｄＮＴＰ誘導体について、それぞ
れ、このようなデオキシリボヌクレオチド・アナログ体
を得る。このデオキシリボヌクレオチド・アナログ体を
４通り用意することで、ＲＮＡ又は核酸配列の決定に用
いることができる〔Vladimir D. Axelred er al. (198
5) Biochemistry Vol. 24, 5716-5723 〕。配列の決定
のための読み取りには、３’dNTP誘導体が標識を有する
ことが好ましい。３’dNTP誘導体の標識としては、例え
ば、蛍光物質または放射性若しくは安定同位元素を挙げ
ることができる。同位元素で標識された３’dNTP誘導体
は市販されており、また標識された３’dNTP誘導体も公
知の方法〔例えば、WO96/14434〕により合成することが
できる。
ゼにより増幅されたＤＮＡ断片を鋳型とし、かつ（ｅ）
塩基の異なる４種類のＮＴＰ誘導体及び（ｆ）少なくと
も1種の３’dNTP誘導体を基質として核酸転写生成物を
生じる。転写生成物であるＲＮＡ又は核酸の３’末端に
は、３’ｄＮＴＰ誘導体が取り込まれることにより、
３’ヒドロキシ基が欠落し、ＲＮＡ又は核酸の合成が阻
害される。その結果、３’末端が３’ｄＮＴＰ誘導体で
ある種々の長さのＲＮＡ又は核酸断片が得られる。塩基
の異なる４種類の３’ｄＮＴＰ誘導体について、それぞ
れ、このようなデオキシリボヌクレオチド・アナログ体
を得る。このデオキシリボヌクレオチド・アナログ体を
４通り用意することで、ＲＮＡ又は核酸配列の決定に用
いることができる〔Vladimir D. Axelred er al. (198
5) Biochemistry Vol. 24, 5716-5723 〕。配列の決定
のための読み取りには、３’dNTP誘導体が標識を有する
ことが好ましい。３’dNTP誘導体の標識としては、例え
ば、蛍光物質または放射性若しくは安定同位元素を挙げ
ることができる。同位元素で標識された３’dNTP誘導体
は市販されており、また標識された３’dNTP誘導体も公
知の方法〔例えば、WO96/14434〕により合成することが
できる。
【００２６】上記核酸転写反応においては、塩基が異な
る４種類の３’dNTP誘導体であって、かつ互いに異なる
標識を有する誘導体を用い、得られた核酸転写反応生成
物を分離し、得られる分離分画が有する標識から得られ
るシグナルから核酸の配列を読み取ることが、１回の反
応で全ての塩基についての配列を決定できることから好
ましい。但し、１つの核酸転写反応に１種類の３’ｄＮ
ＴＰ誘導体を用い、異なる４種類の３’ｄＮＴＰ誘導体
を用いて４回核酸転写反応を行い、３’末端の３’ｄＮ
ＴＰ誘導体の塩基の異なる４通りの転写生成物を得るこ
ともできるが、効率的ではない。
る４種類の３’dNTP誘導体であって、かつ互いに異なる
標識を有する誘導体を用い、得られた核酸転写反応生成
物を分離し、得られる分離分画が有する標識から得られ
るシグナルから核酸の配列を読み取ることが、１回の反
応で全ての塩基についての配列を決定できることから好
ましい。但し、１つの核酸転写反応に１種類の３’ｄＮ
ＴＰ誘導体を用い、異なる４種類の３’ｄＮＴＰ誘導体
を用いて４回核酸転写反応を行い、３’末端の３’ｄＮ
ＴＰ誘導体の塩基の異なる４通りの転写生成物を得るこ
ともできるが、効率的ではない。
【００２７】第２の方法においては、ＤＮＡ断片（ａ−
１）の一方の鎖が、ニック形成能を有する配列及びＲＮ
Ａポリメラーゼのためのプロモーター配列を含み、プラ
イマーＧ１及びＧ２の一方がＲＮＡポリメラーゼのため
のプロモーター配列を含み（但し、プロモーター配列
は、ＤＮＡ断片（ａ−１）に含まれる配列と同一であ
る）、かつ上記プロモーター配列により作動するＲＮＡ
ポリメラーゼを用いて核酸転写の工程を行うことができ
る。この場合、標的ＤＮＡ断片いずれか一方の鎖に配列
についてのみ配列の読み取りが行われる。標的ＤＮＡ断
片の両方の鎖について配列の読み取りを行うこともでき
る。その場合、ＤＮＡ断片（ａ−１）として、両方の鎖
が、それぞれニック形成能を有する配列及びＲＮＡポリ
メラーゼのためのプロモーター配列を含むものを用い
る。さらに、プライマーＧ１及びＧ２として、それぞれ
がＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む
ものを用いる。但し、プライマーＧ１に含まれるプロモ
ーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−１）に含まれる一方の
プロモーター配列と同一のものとする。プライマーＧ２
に含まれるプロモーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−１）
に含まれる他方のプロモーター配列と同一のものとす
る。そして、核酸転写の工程を含む塩基配列の解析は、
上記２種のプロモーター配列のいずれか一方によっての
み作動する２種のＲＮＡポリメラーゼのいずれか一方を
用いて行う。異なるＲＮＡポリメラーゼを用いて、核酸
転写の工程を含む塩基配列の解析を２回行うことで、標
的ＤＮＡ断片のそれぞれの鎖について解析データが得ら
れる。得られた２種の解析データに基づいて標的ＤＮＡ
断片の塩基配列の決定を行うことができる。この場合、
標的ＤＮＡ断片の両方の鎖について独立に塩基配列の決
定を行い、得られた２つの鎖の配列に基づいて配列決定
を行うことができ、読み取りの精度を向上させることが
できるという利点がある。
１）の一方の鎖が、ニック形成能を有する配列及びＲＮ
Ａポリメラーゼのためのプロモーター配列を含み、プラ
イマーＧ１及びＧ２の一方がＲＮＡポリメラーゼのため
のプロモーター配列を含み（但し、プロモーター配列
は、ＤＮＡ断片（ａ−１）に含まれる配列と同一であ
る）、かつ上記プロモーター配列により作動するＲＮＡ
ポリメラーゼを用いて核酸転写の工程を行うことができ
る。この場合、標的ＤＮＡ断片いずれか一方の鎖に配列
についてのみ配列の読み取りが行われる。標的ＤＮＡ断
片の両方の鎖について配列の読み取りを行うこともでき
る。その場合、ＤＮＡ断片（ａ−１）として、両方の鎖
が、それぞれニック形成能を有する配列及びＲＮＡポリ
メラーゼのためのプロモーター配列を含むものを用い
る。さらに、プライマーＧ１及びＧ２として、それぞれ
がＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む
ものを用いる。但し、プライマーＧ１に含まれるプロモ
ーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−１）に含まれる一方の
プロモーター配列と同一のものとする。プライマーＧ２
に含まれるプロモーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−１）
に含まれる他方のプロモーター配列と同一のものとす
る。そして、核酸転写の工程を含む塩基配列の解析は、
上記２種のプロモーター配列のいずれか一方によっての
み作動する２種のＲＮＡポリメラーゼのいずれか一方を
用いて行う。異なるＲＮＡポリメラーゼを用いて、核酸
転写の工程を含む塩基配列の解析を２回行うことで、標
的ＤＮＡ断片のそれぞれの鎖について解析データが得ら
れる。得られた２種の解析データに基づいて標的ＤＮＡ
断片の塩基配列の決定を行うことができる。この場合、
標的ＤＮＡ断片の両方の鎖について独立に塩基配列の決
定を行い、得られた２つの鎖の配列に基づいて配列決定
を行うことができ、読み取りの精度を向上させることが
できるという利点がある。
【００２８】ＲＮＡポリメラーゼは、野性型ＲＮＡポリ
メラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼのいずれでも良
い。但し、対応する野性型ＲＮＡポリメラーゼの能力と
比較して、３’dNTP誘導体を取り込む能力を増加させる
ように、野性型ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つの
アミノ酸が修飾されたものである変異型のＲＮＡポリメ
ラーゼであることが好ましい。ここで、「野性型ＲＮＡ
ポリメラーゼ」は、天然に存在する全てのＲＮＡポリメ
ラーゼを含み、さらに、及び野性型ＲＮＡポリメラーゼ
であって、対応する野性型ＲＮＡポリメラーゼの能力と
比較して、３’デオキシリボヌクレオチドまたはそれら
の誘導体を取り込む能力を増加させることを目的とする
修飾以外のアミノ酸の変異、挿入または欠落を、さらに
有するものであることもできる。即ち、野性型ＲＮＡポ
リメラーゼを人為的に上記以外の目的で修飾したＲＮＡ
ポリメラーゼも、上記「野性型ＲＮＡポリメラーゼ」に
含まれる。但し、そのようなアミノ酸の変異、挿入また
は欠落は、ＲＮＡポリメラーゼとしての活性を維持する
範囲で、行われたものであることが適当である。
メラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼのいずれでも良
い。但し、対応する野性型ＲＮＡポリメラーゼの能力と
比較して、３’dNTP誘導体を取り込む能力を増加させる
ように、野性型ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つの
アミノ酸が修飾されたものである変異型のＲＮＡポリメ
ラーゼであることが好ましい。ここで、「野性型ＲＮＡ
ポリメラーゼ」は、天然に存在する全てのＲＮＡポリメ
ラーゼを含み、さらに、及び野性型ＲＮＡポリメラーゼ
であって、対応する野性型ＲＮＡポリメラーゼの能力と
比較して、３’デオキシリボヌクレオチドまたはそれら
の誘導体を取り込む能力を増加させることを目的とする
修飾以外のアミノ酸の変異、挿入または欠落を、さらに
有するものであることもできる。即ち、野性型ＲＮＡポ
リメラーゼを人為的に上記以外の目的で修飾したＲＮＡ
ポリメラーゼも、上記「野性型ＲＮＡポリメラーゼ」に
含まれる。但し、そのようなアミノ酸の変異、挿入また
は欠落は、ＲＮＡポリメラーゼとしての活性を維持する
範囲で、行われたものであることが適当である。
【００２９】上記変異型ＲＮＡポリメラーゼとしては、
例えば、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y及びL665P/F66
7Yを挙げることができる。ここで番号は、ポリメラーゼ
蛋白質のN末端からの番号であり、例えばF667は、この
ポリメラーゼの667番目のアミノ酸残基がFであることを
示し、Ｆ667Ｙの記述は、667番目のアミノ酸残基FをYに
置換させたことを意味する。これらは、RNA合成活性を
充分保持し、さらに３’dNTPsの取り込み能力が大幅に
改善し、野生型で観察された強いバイアスが著しく低下
している。変異型ＲＮＡポリメラーゼは、通常の遺伝子
組み換え技術を用いて作成することが可能である。ま
た、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y、L665P/F667Yを生
産する大腸菌pT7RF644Y(DH5α)及びpT7RL665P/F667Y(DH
5α)は、生命研国際寄託番号がそれぞれ5998号(FERM-BP
-5998)及び5999号(FERM-BP-5999)として1997年7月2日に
寄託されている。
例えば、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y及びL665P/F66
7Yを挙げることができる。ここで番号は、ポリメラーゼ
蛋白質のN末端からの番号であり、例えばF667は、この
ポリメラーゼの667番目のアミノ酸残基がFであることを
示し、Ｆ667Ｙの記述は、667番目のアミノ酸残基FをYに
置換させたことを意味する。これらは、RNA合成活性を
充分保持し、さらに３’dNTPsの取り込み能力が大幅に
改善し、野生型で観察された強いバイアスが著しく低下
している。変異型ＲＮＡポリメラーゼは、通常の遺伝子
組み換え技術を用いて作成することが可能である。ま
た、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y、L665P/F667Yを生
産する大腸菌pT7RF644Y(DH5α)及びpT7RL665P/F667Y(DH
5α)は、生命研国際寄託番号がそれぞれ5998号(FERM-BP
-5998)及び5999号(FERM-BP-5999)として1997年7月2日に
寄託されている。
【００３０】上記では、標的ＤＮＡ断片配列を含むＤＮ
Ａ断片の増幅と核酸転写反応とを同時並列的に行う系に
ついて説明したが、鎖置換増幅法を用いて標的ＤＮＡ断
片配列を含むＤＮＡ断片の増幅し、次いで得られたＤＮ
Ａ断片を鋳型として核酸転写反応を行うこともできる。
但し、上述のように、ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写反応
とを１つの反応容器内で同時並列的に行う方がはるかに
簡便かつ効率的である。
Ａ断片の増幅と核酸転写反応とを同時並列的に行う系に
ついて説明したが、鎖置換増幅法を用いて標的ＤＮＡ断
片配列を含むＤＮＡ断片の増幅し、次いで得られたＤＮ
Ａ断片を鋳型として核酸転写反応を行うこともできる。
但し、上述のように、ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写反応
とを１つの反応容器内で同時並列的に行う方がはるかに
簡便かつ効率的である。
【００３１】核酸転写生成物の分離及び読み取り 本発明の方法では、核酸転写生成物を分離する。この分
離は、転写生成物に含まれる分子量の異なる複数の生成
物分子を、分子量に応じて分離することができる方法で
適宜行うことができる。このような分離方法としては、
例えば電気泳動法を挙げることができる。その他にＨＰ
ＬＣ等も用いることができる。電気泳動法の条件等には
特に制限はなく、常法により行うことができる。転写生
成物を電気泳動法に付することにより得られるバンド
（核酸ラダー）からＲＮＡ又は核酸の配列を読み取るこ
とができる。
離は、転写生成物に含まれる分子量の異なる複数の生成
物分子を、分子量に応じて分離することができる方法で
適宜行うことができる。このような分離方法としては、
例えば電気泳動法を挙げることができる。その他にＨＰ
ＬＣ等も用いることができる。電気泳動法の条件等には
特に制限はなく、常法により行うことができる。転写生
成物を電気泳動法に付することにより得られるバンド
（核酸ラダー）からＲＮＡ又は核酸の配列を読み取るこ
とができる。
【００３２】ＲＮＡ又は核酸ラダーの読み取りは、転写
物反応において各フラグメントに取り込まれた３’dNTP
誘導体が有する標識を読み取ることにより行うことがで
きる。具体的には、標識された転写生成物を電気泳動に
付して得られるバンドの放射性若しくは安定同位元素又
は蛍光を検出することで、転写生成物の配列を読み取る
ことができる。放射性若しくは安定同位元素又は蛍光を
発生するラダーの検出は、例えば、ＤＮＡシーケンシン
クに用いている装置を適宜用いて行うことができる。
物反応において各フラグメントに取り込まれた３’dNTP
誘導体が有する標識を読み取ることにより行うことがで
きる。具体的には、標識された転写生成物を電気泳動に
付して得られるバンドの放射性若しくは安定同位元素又
は蛍光を検出することで、転写生成物の配列を読み取る
ことができる。放射性若しくは安定同位元素又は蛍光を
発生するラダーの検出は、例えば、ＤＮＡシーケンシン
クに用いている装置を適宜用いて行うことができる。
【００３３】上記のように読み取られたＲＮＡ又は核酸
配列から、転写の鋳型として用いられたＤＮＡ配列を決
定することができる。各塩基について、それぞれラダー
を形成した場合には、４種類のラダーから得られたＲＮ
Ａ又は核酸配列情報を総合して、転写の鋳型として用い
られたＤＮＡ配列を決定することができる。また、２種
以上の塩基について同時にラダーを形成した場合（同一
のラダー内に２種以上の塩基のバンドが共存する場合）
には、各ラダーから得られたＲＮＡ又は核酸配列情報を
総合して、転写の鋳型として用いられたＤＮＡ配列を決
定することができる。特に、４種の塩基について同時に
ラダーを形成した場合（同一のラダー内に４種の塩基の
バンドが共存する場合）には、１つのラダーから得られ
たＲＮＡ又は核酸配列情報から、転写の鋳型として用い
られたＤＮＡ配列を決定することができる。
配列から、転写の鋳型として用いられたＤＮＡ配列を決
定することができる。各塩基について、それぞれラダー
を形成した場合には、４種類のラダーから得られたＲＮ
Ａ又は核酸配列情報を総合して、転写の鋳型として用い
られたＤＮＡ配列を決定することができる。また、２種
以上の塩基について同時にラダーを形成した場合（同一
のラダー内に２種以上の塩基のバンドが共存する場合）
には、各ラダーから得られたＲＮＡ又は核酸配列情報を
総合して、転写の鋳型として用いられたＤＮＡ配列を決
定することができる。特に、４種の塩基について同時に
ラダーを形成した場合（同一のラダー内に４種の塩基の
バンドが共存する場合）には、１つのラダーから得られ
たＲＮＡ又は核酸配列情報から、転写の鋳型として用い
られたＤＮＡ配列を決定することができる。
【００３４】
【発明の効果】本発明の方法は、標的ＤＮＡの増幅と核
酸転写物の生成とを同時並行して行える新たな方法を利
用したＤＮＡの塩基配列決定方法である。本発明の方法
では、従来は、逐次独立して行っていた標的ＤＮＡの増
幅と核酸転写物の生成と同時並行して行えるため、これ
までの方法に比べて格段に効率的にＤＮＡの塩基配列決
定を行なうことができる。
酸転写物の生成とを同時並行して行える新たな方法を利
用したＤＮＡの塩基配列決定方法である。本発明の方法
では、従来は、逐次独立して行っていた標的ＤＮＡの増
幅と核酸転写物の生成と同時並行して行えるため、これ
までの方法に比べて格段に効率的にＤＮＡの塩基配列決
定を行なうことができる。
【００３５】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに説明す
る。変異ガンの診断などに用いられるヒトｐ５３遺伝子
の特定部位について、本発明の塩基配列決定方法を適用
した。 材料 １）プライマーの作成： プライマーの作成：以下に示す資料（1）及び（2）を参
考にして、ｐ５３エキソン８近傍に４種類のプライマー
を作成した。 資料（１）ＳＤＡに関するもの Walker, G. T., Fraiser, M. S., Schram, J. L., Litt
le, M. C., Nadeau, J. G. and Malinowski, D. P. Nu
cleic Acids Res. 20 (1992) 1691-1696. Strand displ
acement amplification - an isothrmal, in vitro DNA
amplificationtechnique.Walker, G. T., Little, M.
C. Nadeau, J. G. and Shank, D. D. Proc. Natl. Ac a
d. Sci. USA 89 (1992) 392-396. Isothermal in vitro
amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA
polymerase system. 資料（２）ヒトｐ５３の塩基配列に関するもの Buchman, L. L., Chumakov, P. M., Ninkina, N. N., S
amarina, O. P. and Georg iev, G. P. Gene 70 (1988)
245-252. A variation in the structure ofthe prote
in-coding region of the human p53 gene.
る。変異ガンの診断などに用いられるヒトｐ５３遺伝子
の特定部位について、本発明の塩基配列決定方法を適用
した。 材料 １）プライマーの作成： プライマーの作成：以下に示す資料（1）及び（2）を参
考にして、ｐ５３エキソン８近傍に４種類のプライマー
を作成した。 資料（１）ＳＤＡに関するもの Walker, G. T., Fraiser, M. S., Schram, J. L., Litt
le, M. C., Nadeau, J. G. and Malinowski, D. P. Nu
cleic Acids Res. 20 (1992) 1691-1696. Strand displ
acement amplification - an isothrmal, in vitro DNA
amplificationtechnique.Walker, G. T., Little, M.
C. Nadeau, J. G. and Shank, D. D. Proc. Natl. Ac a
d. Sci. USA 89 (1992) 392-396. Isothermal in vitro
amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA
polymerase system. 資料（２）ヒトｐ５３の塩基配列に関するもの Buchman, L. L., Chumakov, P. M., Ninkina, N. N., S
amarina, O. P. and Georg iev, G. P. Gene 70 (1988)
245-252. A variation in the structure ofthe prote
in-coding region of the human p53 gene.
【００３６】B1プライマー：５’-CCTATCCTGAGTA (13me
rs, 塩基配列番号1408-1420) B2プライマー：３’-TGATTCAGAACCC (13mers, 塩基配列
番号1664-1676と相補) G1プライマー：５’-TCGAATCGTTGTCTCGGGGCATAATACGACT
CACTATAGGGCCCAATCTACTGGGAC（５’端から最初の下線
部：制限酵素部位、２番目の下線部：Ｔ７ＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーター部位、３番目の下線部：13塩基：p5
3塩基配列番号1227-1338と相補） G2プライマー：３’-TCTTATAAAGTGG GGGCTCTTCAGACCTCG
CCTTAGC（３’端から最初の下線部：13塩基:p53塩基配
列番号1643-1655と相補、２番目の下線部：制限酵素部
位）
rs, 塩基配列番号1408-1420) B2プライマー：３’-TGATTCAGAACCC (13mers, 塩基配列
番号1664-1676と相補) G1プライマー：５’-TCGAATCGTTGTCTCGGGGCATAATACGACT
CACTATAGGGCCCAATCTACTGGGAC（５’端から最初の下線
部：制限酵素部位、２番目の下線部：Ｔ７ＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーター部位、３番目の下線部：13塩基：p5
3塩基配列番号1227-1338と相補） G2プライマー：３’-TCTTATAAAGTGG GGGCTCTTCAGACCTCG
CCTTAGC（３’端から最初の下線部：13塩基:p53塩基配
列番号1643-1655と相補、２番目の下線部：制限酵素部
位）
【００３７】2）酵素 制限酵素BsoBI：New England Biolabより購入。本酵素
はC/PyCGpuG配列を切断する。ＤＮＡポリメラーゼ(Bst
pol)：Epicentreより購入。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
（変異型、F644Y）：野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの6
67番目のF（フェニルアラニン）残基をY（チロシン）残
基に変化させた変異型T7ＲＮＡポリメラーゼ。 3）ＤＮＡ ヒト胎盤ＤＮＡならびにヒト大腸ガン由来細胞株ＨＴ―
２９（ＡＴＣＣより入手）を用いた。本ガン細胞株のｐ
５３ＤＮＡはエキソン８部位２７３番目のアミノ酸Ｒが
Ｈに変異していることが知られている（Ｇ→Ａ変異）
（資料（3）Murakami, Y., Hayashi, K., Hirhashi, S.
and Sekiya, T. Cancer Res. 51 (1991) 5520-55
25. Aberration of the tumor suppressor p53 and ret
inoblastoma genes in human hepatocellular carcinom
as.Murakami, Y., Hayashi, K. and Sekiya, T. Cancer
Res. 51 (1991) 3356-3361.Detection of aberrations
of the p53 alleles and the gene transcript in hum
an tumor cell lines by single-strand conformation
polymorphism analysis.参照）
はC/PyCGpuG配列を切断する。ＤＮＡポリメラーゼ(Bst
pol)：Epicentreより購入。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
（変異型、F644Y）：野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの6
67番目のF（フェニルアラニン）残基をY（チロシン）残
基に変化させた変異型T7ＲＮＡポリメラーゼ。 3）ＤＮＡ ヒト胎盤ＤＮＡならびにヒト大腸ガン由来細胞株ＨＴ―
２９（ＡＴＣＣより入手）を用いた。本ガン細胞株のｐ
５３ＤＮＡはエキソン８部位２７３番目のアミノ酸Ｒが
Ｈに変異していることが知られている（Ｇ→Ａ変異）
（資料（3）Murakami, Y., Hayashi, K., Hirhashi, S.
and Sekiya, T. Cancer Res. 51 (1991) 5520-55
25. Aberration of the tumor suppressor p53 and ret
inoblastoma genes in human hepatocellular carcinom
as.Murakami, Y., Hayashi, K. and Sekiya, T. Cancer
Res. 51 (1991) 3356-3361.Detection of aberrations
of the p53 alleles and the gene transcript in hum
an tumor cell lines by single-strand conformation
polymorphism analysis.参照）
【００３８】方法 （１）下記のものを混ぜ合わせ、９５℃４分熱変性さ
せ、３７℃１分でプライマーのアニーリングを行った。 ヒト胎盤ＤＮＡまたはヒトガン細胞株ＤＮＡ 0.5μg/ml ----1μl プライマーG1及びG2(10μM)各々-------------------------1μl プライマーB1及びB2(1μM)各々--------------------------1 μl dGTP, dATP, dTTP (各々2mM) ---------------------------2 μl dαSCTP (10 mM) ---------------------------------------2 μl 10Ｘバッファー*-----------------------------------------2 μl GTP, ATP, UTP, CTP (各々2mM)----------------------------5 μl 水------------------------------------------------------1 μl ４色蛍光標識ヌクレオチド混液**--------------------------1 μl （注：*500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH7.5), 100 m
M MgCl2, 10 mM DTT液、**R11C-３’dGTP 1μM, R6G-
３’dATP 1μM, R0X-３’dCTP 50μM, TMR-３’dUTP 1
2.5μMの混液、R11C-３’dGTP、R6G-３’dATP、R0X-
３’dCTP及びTMR-３’dUTPはいずれも蛍光標識した３’
ｄＮＴＰである）
せ、３７℃１分でプライマーのアニーリングを行った。 ヒト胎盤ＤＮＡまたはヒトガン細胞株ＤＮＡ 0.5μg/ml ----1μl プライマーG1及びG2(10μM)各々-------------------------1μl プライマーB1及びB2(1μM)各々--------------------------1 μl dGTP, dATP, dTTP (各々2mM) ---------------------------2 μl dαSCTP (10 mM) ---------------------------------------2 μl 10Ｘバッファー*-----------------------------------------2 μl GTP, ATP, UTP, CTP (各々2mM)----------------------------5 μl 水------------------------------------------------------1 μl ４色蛍光標識ヌクレオチド混液**--------------------------1 μl （注：*500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH7.5), 100 m
M MgCl2, 10 mM DTT液、**R11C-３’dGTP 1μM, R6G-
３’dATP 1μM, R0X-３’dCTP 50μM, TMR-３’dUTP 1
2.5μMの混液、R11C-３’dGTP、R6G-３’dATP、R0X-
３’dCTP及びTMR-３’dUTPはいずれも蛍光標識した３’
ｄＮＴＰである）
【００３９】(2)上記（1）に更に次のものを加えて全量
を20μlとし、45℃、２時間反応させた。 制限酵素BsoBI（10ユニット／μl）---------------------1μl ＤＮＡポリメラーゼ(Bst pol) 5ユニット／μl-----------2 μl Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（F644Y）25ユニット／μl-------1 μl (3）反応液をシークエンス用ゲル電気泳動法で解析す
る。ヒト胎盤ＤＮＡ（上）及びヒトガン細胞株ＨＴ２９
ＤＮＡ（下）のｐ５３エキソンの一部に対応する塩基配
列のエレクトログラムを図1に示す。上の図では２７３
番目アミノ酸がＲ（ＣＧＴ）であるのに対して、下では
それが半分程Ｈ（ＣＡＴ）になっていることがわかる。
本発明の方法では、一度熱変性を行うだけで、後は同一
のチューブ・同一の温度で、ＤＮＡの増幅から塩基配列
の決定まで行うことができる。
を20μlとし、45℃、２時間反応させた。 制限酵素BsoBI（10ユニット／μl）---------------------1μl ＤＮＡポリメラーゼ(Bst pol) 5ユニット／μl-----------2 μl Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（F644Y）25ユニット／μl-------1 μl (3）反応液をシークエンス用ゲル電気泳動法で解析す
る。ヒト胎盤ＤＮＡ（上）及びヒトガン細胞株ＨＴ２９
ＤＮＡ（下）のｐ５３エキソンの一部に対応する塩基配
列のエレクトログラムを図1に示す。上の図では２７３
番目アミノ酸がＲ（ＣＧＴ）であるのに対して、下では
それが半分程Ｈ（ＣＡＴ）になっていることがわかる。
本発明の方法では、一度熱変性を行うだけで、後は同一
のチューブ・同一の温度で、ＤＮＡの増幅から塩基配列
の決定まで行うことができる。
【図１】実施例で得られた塩基配列のエレクトログラ
ム。
ム。
Claims (17)
- 【請求項１】 標的ＤＮＡ断片を増幅させつつ、増幅さ
れた標的ＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼに
より、核酸転写反応のターミネーターの存在下、核酸転
写物を生成させ、生成した核酸転写物を解析することで
標的ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する方法であって、上
記標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写物の生成とを等温下
で行うことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 標的ＤＮＡ断片の増幅と核酸転写物の生
成とを、常温付近で行う請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 標的ＤＮＡ断片の増幅を鎖置換増幅法に
より行う請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 鎖置換増幅法が、標的ＤＮＡ断片に、Ｄ
ＮＡポリメラーゼの基質及び標的ＤＮＡ断片に対する２
種のプライマー（但し、プライマーは制限酵素によりニ
ックが形成され得る配列を有する）の存在下、ＤＮＡポ
リメラーゼ及び制限酵素を作用させる方法である請求項
３に記載の方法。 - 【請求項５】 ２種のプライマーの一方または両方が、
制限酵素によりニックが形成され得る配列に加えて、Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む請求項４に
記載の方法。 - 【請求項６】 核酸転写反応が、ＲＮＡポリメラーゼの
基質及び標識されたターミネーターの存在下で行われ、
核酸転写物の解析を、核酸転写物に取り込まれた上記標
識を検出することにより行う請求項１〜５のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項７】 （ａ−１）標的ＤＮＡ断片配列を含むＤ
ＮＡ断片（但し、このＤＮＡ断片は、ニック形成能を有
する配列及び少なくとも一方の鎖にＲＮＡポリメラーゼ
のためのプロモーター配列を含む）、 （ｂ）標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対するプライマー配
列及びニック形成能を有する配列を含むプライマー（以
下、プライマーＧ１という）、 （ｃ）標的ＤＮＡ断片の他方の鎖に対するプライマー配
列及びニック形成能を有する配列を含むプライマー（以
下、プライマーＧ２という）、 （但し、上記プライマーＧ１及びＧ２の少なくとも一方
はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含
む） （ｄ）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ又は
それらの誘導体からなるデオキシリボヌクレオシド５’
トリフォスフェート類（以下、ｄＮＴＰ誘導体とい
う）、 （ｅ）ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ又はそれらの
誘導体からなるリボヌクレオシド５’トリフォスフェー
ト類（以下、ＮＴＰ誘導体という）、及び （ｆ）３’dATP、３’dGTP、３’dCTP、３’dUTP及びそ
れらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも1種の
３’デオキシリボヌクレオシド５’トリフォスフェート
(以下、３’dNTP誘導体という)の存在下、 （ｇ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び （ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用させ、 かつ上記ＤＮＡ断片（ａ−１）のニック形成能を有する
部位にニックを形成させて、前記標的ＤＮＡ断片配列を
含むＤＮＡ断片を増幅しつつ核酸転写生成物を得る工
程、及び得られた核酸転写生成物を分離し、分離分画か
ら核酸の配列を読み取る工程を含むＤＮＡの塩基配列決
定方法。 - 【請求項８】 ＤＮＡ断片（ａ−１）が、 標的ＤＮＡ断片の一方の鎖に対するプライマー（以下、
プライマーＢ１という）、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖に
対するプライマー（以下、プライマーＢ２という）、プ
ライマーＧ１及びプライマーＧ２を標的ＤＮＡ断片にハ
イブリダイズする工程（但し、プライマーＢ１はプライ
マーＧ１より、標的ＤＮＡ断片の一方の鎖の５’側にハ
イブリダイズし、プライマーＢ２はプライマーＧ２よ
り、標的ＤＮＡ断片の他方の鎖の５’側にハイブリダイ
ズする）、及びハイブリダイズにより得られた標的ＤＮ
Ａ断片に、ｄＮＴＰ誘導体の存在下、ＤＮＡポリメラー
ゼを作用させる工程からなる方法により調製される請求
項７に記載の方法。 - 【請求項９】 ＤＮＡ断片（ａ−１）の一方の鎖が、ニ
ック形成能を有する配列及びＲＮＡポリメラーゼのため
のプロモーター配列を含み、プライマーＧ１及びＧ２の
一方がＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を
含み（但し、プロモーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−
１）に含まれる配列と同一である）、かつ上記プロモー
ター配列により作動するＲＮＡポリメラーゼを用いて核
酸転写の工程を行う請求項７または８に記載の方法。 - 【請求項１０】 ＤＮＡ断片（ａ−１）の両方の鎖が、
それぞれニック形成能を有する配列及びＲＮＡポリメラ
ーゼのためのプロモーター配列を含み、プライマーＧ１
及びＧ２のそれぞれがＲＮＡポリメラーゼのためのプロ
モーター配列を含み（但し、プライマーＧ１に含まれる
プロモーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−１）に含まれる
一方のプロモーター配列と同一であり、プライマーＧ２
に含まれるプロモーター配列は、ＤＮＡ断片（ａ−１）
に含まれる他方のプロモーター配列と同一である）、か
つ上記２種のプロモーター配列のいずれか一方によって
のみ作動する２種のＲＮＡポリメラーゼのいずれか一方
を用いて核酸転写の工程を含む塩基配列の解析を、ＤＮ
Ａ断片（ａ−１）の両方の鎖のそれぞれについて行い、
得られた２種の解析データに基づいて塩基配列の決定を
行う請求項７または８に記載の方法。 - 【請求項１１】 標的ＤＮＡ断片に、プライマーＢ１、
プライマーＢ２、プライマーＧ１及びプライマーＧ２を
ハイブリダイズする工程、 （ａ−２）ハイブリダイズにより得られた標的ＤＮＡ断
片に、（ｂ）プライマーＧ１、（ｃ）プライマーＧ２、
（ｄ）ｄＮＴＰ誘導体、（ｅ）ＮＴＰ誘導体及び（ｆ）
少なくとも１種の３’dNTP誘導体の存在下、（ｇ）ＤＮ
Ａポリメラーゼ、（ｈ）ＲＮＡポリメラーゼを作用さ
せ、かつ上記ＤＮＡ断片（ａ−２）のニック形成能を有
する部位にニックを形成させて、前記標的ＤＮＡ断片配
列を含むＤＮＡ断片を増幅しつつ核酸転写生成物を得る
工程、及び核酸転写生成物を分離し、得られる分離分画
から核酸の配列を読み取る工程を含むＤＮＡの塩基配列
決定方法。 - 【請求項１２】 ＤＮＡ断片（ａ−１）及び（ａ−２）
へのニックの形成を制限酵素を用いて行う請求項７〜１
１のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１３】 ニック形成能を有する部位がヘミホス
ホロチオエート部位またはその類縁部位を含む制限酵素
部位であり、かつｄＮＴＰ誘導体のうちの１種はαＳ体
またはその類縁化合物である請求項７〜１２のいずれか
１項に記載の方法。 - 【請求項１４】 ＤＮＡ断片を増幅しつつ核酸転写生成
物を得る工程が実質的に等温下で行われる請求項７〜１
３に記載の方法。 - 【請求項１５】 ３’dNTP誘導体が標識を有する請求項
７〜１４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】 ３’dNTP誘導体の標識が蛍光物質また
は放射性若しくは安定同位元素である請求項１5に記載
の方法。 - 【請求項１７】 核酸転写反応において塩基が異なる４
種類の３’dNTP誘導体であって、かつ互いに異なる標識
を有する誘導体を用い、得られた核酸転写反応生成物を
分離し、得られる分離分画が有する標識から得られるシ
グナルから核酸の配列を読み取る請求項７〜１６のいず
れか１項に記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01047198A JP4317953B2 (ja) | 1998-01-22 | 1998-01-22 | Ｄｎａの塩基配列決定方法 |
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