JPH11187870A - 新規なトランス−４−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素、及び、それを用いた重水素化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxy
toca）菌体から得ることができ、トランス−４−ヒドロ
キシケイ皮酸を基質とするトランス−４−ヒドロキシケ
イ皮酸脱炭酸酵素、及び、脱炭酸酵素を用いた重水素化
を提供する。 【解決手段】 本発明は、クレブシエラ オキシトカ
（Klebsiella oxytoca）菌体から得ることができ、トラ
ンス−４−ヒドロキシケイ皮酸を基質とするトランス−
４−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素、及び、脱炭酸酵素
を用いた重水素化方法等に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、クレブシエラ オ
キシトカ（Klebsiella oxytoca）菌体から得ることがで
き、トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸を基質とするト
ランス−４−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素に関する。
また、本発明は、トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸又
はその誘導体を、４−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシ
ラーゼ（４−ＨＣＤ）の存在下に脱炭酸させることによ
る、重水素化４−ヒドロキシスチレン又はその誘導体の
位置選択的な重水素化方法に関する。本発明の方法によ
れば、高収率、高選択率で目的とする重水素化物を製造
することができる。

【０００２】

【従来の技術】幾つかの有機酸の非酸化的酵素反応によ
る脱炭酸反応が知られている。これらの非酸化的酵素反
応による脱炭酸反応は、基質の構造や性状によってグル
ープ分けをすることが可能である。最も大きなグループ
のひとつであるアミノ酸脱炭酸酵素は、アミノ化炭素原
子に結合するカルボキシル基を脱炭酸し、脂肪族アミン
類を生成する（例えば、グルタミン酸デカルボキシラー
ゼ）。また、安息香酸脱炭酸酵素は、ベンゼン環上のカ
ルボキシル基を脱炭酸し、それを水素原子に置換する
（例えば、没食子酸デカルボキシラーゼ）。

【０００３】一方、４−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキ
シラーゼ（４−ＨＣＤ）は、α，β−不飽和カルボン酸
をもつケイ皮酸類を脱炭酸してビニル基を持つスチレン
化合物を生成させることから、これらとは別のグループ
に分けられる。本発明者らは、クレブシエラ オキシト
カ（Klebsiella oxytoca）という植物着生細菌（エンテ
ロバクター科）が４−ＨＣＤ活性を有していることを報
告してきた（橋床ら、「ジェイ、バイオサイ、バイオテ
ク、バイオケム」第５７巻、第２１５頁、１９９３年
（Hashidoko,Y, et al.,J.Biosci.Biotech.Biochem.,(1
993),57,215））。しかし、当該植物着生細菌から、４
−ＨＣＤを単離するには至らなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、さらに
研究を進め、このクレブシエラ オキシトカ（Klebsiel
la oxytoca）中の酵素を初めて単離し、この酵素の特性
及び活性を確認したところ、この酵素が新規な４−ＨＣ
Ｄの一種であることを見出した。そして、この新規な酵
素が特異的にトランス−４−ヒドロキシケイ皮酸類を脱
炭酸することを見出し、かつ、当該酵素反応においては
カルボキシル基の開裂反応時の水素導入に際して、高度
な幾何選択性があることを見出した。さらに、本発明者
らは、この酵素的脱炭酸反応においては、α位の炭素原
子に導入される水素は酵素タンパクのアミノ酸残基上の
交換性プロトン（Ｈ⁺） に由来するとされているので、
重水を含有する緩衝液中で反応を行うことにより、生成
するスチレンのＣ−８炭素原子へ重水素を幾何選択的に
導入することができることを見出した。

【０００５】即ち、本発明は、クレブシエラ オキシト
カ（Klebsiella oxytoca）菌体由来のトランス−４−ヒ
ドロキシケイ皮酸を基質とする新規なトランス−４−ヒ
ドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素を提供するものであり、ま
た、本発明は、トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸又は
その誘導体を用いて、重水を含有する反応溶媒中で脱炭
酸反応を行うことにより、対応する４−ヒドロキシスチ
レン又はその誘導体のビニル位のトランス位（Ｅ配置）
が位置選択的に重水素化された化合物及びその製造方法
を提供するものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、クレブシエラ
オキシトカ（Klebsiella oxytoca）菌体から得ること
ができ、トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸を基質とす
る新規なトランス−４−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素
に関する。また、本発明は、トランス−４−ヒドロキシ
ケイ皮酸又はその誘導体を、４−ヒドロキシケイ皮酸デ
カルボキシラーゼ（４−ＨＣＤ）の存在下に脱炭酸させ
ることによる重水素化−４−ヒドロキシスチレン又はそ
の誘導体のビニル位を位置選択的に重水素化する方法に
関する。さらに、本発明は次式（II）

【０００７】

【化３】

【０００８】（式中、Ｄは重水素原子を示し、Ｒは水
素、低級アルキル基、水酸基、又は、低級アルコキシ基
を示し、当該Ｒはベンゼン環上に各々独立して１〜４個
存在することができる。）で示される重水素化−４−ヒ
ドロキシスチレン類に関する。本発明の重水素化−４−
ヒドロキシスチレン類は、立体選択的に化合物を製造す
る際の製造法を確立させるための多様な試薬として有用
である。

【０００９】本発明の新規な酵素は、クレブシエラ オ
キシトカ（Klebsiella oxytoca）という植物着生細菌
（エンテロバクター科）から得ることができるものであ
る。本発明の新規な酵素は、例えば、トランス−カフェ
酸などの存在下にジャガイモ煮汁などの培地で培養した
クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）菌体
を、超音波などの手段によりこれを破砕することにより
得られる可溶化されたタンパクを、常法により、例えば
硫安などで沈殿させることにより得ることができる。

【００１０】本発明の酵素の理化学的性質を示す。本発
明の酵素は、α，β−不飽和カルボン酸を脱炭酸する作
用を有する。本発明の酵素は、４−ヒドロキシケイ皮酸
を特異的な基質とするものである。本発明の酵素の基質
について検討した結果を図１に示す。図１には左側に本
発明の酵素の基質となる物質を示しており、右側に基質
とならない物質を示している。これらの結果は、本発明
の酵素の基質特異性を示すものである。基質となる物質
は、図１中の化合物番号１、２、３、４、５、及び、１
８として示される物質である。図１中の化合物番号６、
７、８、９、１０、及び、１１で示される化合物は、ベ
ンゼン環のパラ位（４位）にヒドロキシ基を有していな
いために本発明の酵素の基質にならない物質である。化
合物番号１２及び１３はカルボン酸基のα、β位に不飽
和結合が無く共役結合が延びていないために本発明の酵
素の基質とならないものである。

【００１１】図１中の化合物番号１４及び１５で示され
る化合物はシス体であり、また、化合物番号１６で示さ
れる化合物は共役がさらに延びている化合物であり、不
飽和結合と反応する位置が不適合なものであるから本発
明の酵素の基質とならないものである。図１中の化合物
番号１７で示される化合物は隣接する電子吸引基が存在
するために、反応に関与する部位の電子密度が不足して
おり本発明の酵素の基質とならないものである。

【００１２】本発明の酵素の至適ｐＨは、７．０付近で
あり（図９及び１０参照）、安定ｐＨとしてはｐＨ約
６．０〜８．０である。本発明の酵素の特性と公知の４
−ＨＣＤの特性を比較すると次の表１のとおりとなる。

【００１３】

【表１】

【００１４】表１中の、文献１は、ビー ジェー フィン
ケルら、ジャーナル バイオロ ケム、２３７巻、第２９
２６−２９３１頁（１９６２年）（Ｂ．Ｊ．Ｆｉｎｋｌ
ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２３
７，２９２ ６−２９３１(１９６２)）、
文献２は、エイチ ジー バインら、ジャーナル ジェネ
ラル ミクロバイオロ、 ９５巻、第１８
８−１９０頁（１９７６年）（Ｈ．Ｇ．Ｂａｙｎ
ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．， ９５，１８８−１９
０(１９７６)）、文献３は、ティー ハラダら、キャン
ジャーナル ミクロバイオロ、２２巻、
第１２５８−１２６２頁（１９７６年）（Ｔ．Ｈａｒａ
ｄａ，ｅ ｔ ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，２２，１２５８ −１
２６２(１９７６)）、文献４は、エー アール グッディ
ーら、ジャーナル ジェネラル ミクロバイオロ、１２８
巻、第２６１５−２６２０頁（１９８２年）（Ａ．Ｒ．
Ｇｏｏｄｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍ
ｉｃｒ ｏｂｉｏｌ．，１２８，２６１５
−２６２０(１９８２)）、文献５は、アール エフ リン
ドセイら、ジャーナル アプリ バクテリアル、３９巻、
第１８１−１８７頁（１９７５年）（Ｒ．Ｆ．Ｌｉｎｄ
ｓａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．，３ ９，１８１−１８７(１９７
５)）、文献６は、ジー デグラシーら、アプリ エンバ
イロン ミクロバイオロ、６１ 巻、第３
２６−３３２頁（１９９５年）（Ｇ．Ｄｅｇｒａｓｓ
ｉ， ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉ
ｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６１，
３２６−３３２(１９９５)）、を各々示す。

【００１５】表１に示す酵素特性からも明らかなよう
に、本発明の酵素は文献６に記載の４−ＨＣＤと酵素の
タイプが同じであるが至適ｐＨ及びミカエリス定数にお
いて明確な相違がみられ、また基質において文献１、
２、３、５及び６のものと同じにみえても、至適ｐＨ、
ミカエリス定数において明確な相違がみられる。さらに
本発明の酵素はＺ−異性体に不活性な点において公知の
４−ＨＣＤとも相違するものである。このように、本発
明の酵素は、公知の４−ＨＣＤとは作用、至適ｐＨ、及
び、ミカエリス定数を異にする新規な酵素である。

【００１６】図２〜１０に本発明の新規な酵素の特性を
示す。図２は、本発明の酵素の基質による活性の変化を
示したものである。使用した酵素液は、１μｌで１．８
×１０^-2単位のものを０．５μｌ相当とし、反応液はト
リス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．２）５
０ｍｌで、反応条件は２５℃、３０分であった。活性の
変化は、４−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩を１０
０とした相対活性度で示しており、遊離のカフェ酸が基
準とした４−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩の約
１．４倍の活性を有していることがわかる。

【００１７】図３は、緩衝液系に各種の溶質を添加した
ときの、本発明の酵素の活性の変化を４−ヒドロキシケ
イ皮酸アンモニウム塩（１ｍｇ／ｍｌ）を基質として用
い、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．
２）を基準とした相対活性度で示したものである。使用
した酵素液は、１μｌで１．８×１０^-2単位のものを
０．５μｌあるいは０．０２μｌ相当とし、反応液はＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）５０ｍｌで、反応条件は
２５℃、３０分であった。クエン酸又はＥＤＴＡ（エチ
レンジアミン四酢酸）の添加により本発明の酵素の活性
が大幅に増強されることがわかる。

【００１８】図４は、本発明の酵素の濃度が一定のとき
の、基質濃度と反応速度のとの関係を示したものであ
る。使用した基質は、４−ヒドロキシケイ皮酸アンモニ
ウム塩（１ｍｇ／ｍｌ）であり、酵素液は、１μｌで
１．８×１０^-2単位のものが０．０２μｌ相当であり、
反応液はＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）５０ｍｌで、
反応条件は２５℃、３０分であった。基質濃度が０．５
ｍｇ／ｍｌ付近までは、反応速度は基質濃度にほぼ正比
例するが、それ以上の基質濃度になるとほぼ飽和状態を
示すことがわかった。本酵素のＫｍ値はおよそ０．５ｍ
Ｍである。

【００１９】図５の（Ａ）及び（Ｂ）は、基質濃度に対
する４−ヒドロキシスチレンの生成量の変化をプロット
したものであり、この図からミカエリス定数（Ｋｍ）が
約０．５ｍＭであることが判る。

【００２０】図６は、本発明の酵素の量と基質の反応速
度との関係を示したものである。使用した基質は、４−
ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩（１ｍｇ／ｍｌ）で
あり、酵素液は、１μｌで１．８×１０^-2単位のもので
あり、反応液はＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）５０ｍ
ｌ（黒三角印）及びクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）５０
ｍｌ（黒丸印）で、反応条件は２５℃、３０分であっ
た。反応速度は酵素の量に正比例していることがわか
る。

【００２１】図７は、塩化ナトリウムの濃度が本発明の
酵素の活性に与える影響を示したものである。使用した
基質は、４−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩（１ｍ
ｇ／ｍｌ）であり、酵素液は、１μｌで１．８×１０^-2
単位のものが０．２５μｌ相当であり、反応液はＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）５０ｍｌで、反応条件は２５
℃、３０分であった。塩化ナトリウムの濃度が１モル付
近までは、反応速度は塩化ナトリウムの濃度の影響をあ
まり受けないが、それ以上の濃度になると塩化ナトリウ
ムの濃度の上昇に伴って反応速度が少しづつ減少する傾
向にあることがわかる。

【００２２】図８は、エタノールの濃度が本発明の酵素
の活性に与える影響を示したものである。使用した基質
は、４−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩（１ｍｇ／
ｍｌ）であり、酵素液は、１μｌで１．８×１０^-2単位
のものが０．５μｌ相当であり、反応液はＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．２）５０ｍｌで、反応条件は２５℃、３
０分であった。反応速度はエタノールの濃度の増加によ
り急激に減少し、本発明の酵素がエタノールの影響を極
めて敏感に受けることがわかる。

【００２３】図９は、クエン酸緩衝液（５０ｍｌ）にお
ける本発明の酵素のｐＨの影響を示したものである。使
用した基質は、４−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩
（１ｍｇ／ｍｌ）であり、酵素液は、１μｌで１．８×
１０^-2単位のものが０．０２μｌ相当であり、反応条件
は２５℃、３０分であった。図１０は、トリス塩酸緩衝
液（５０ｍｌ）における本発明の酵素のｐＨの影響を示
したものである。使用した基質は、４−ヒドロキシケイ
皮酸アンモニウム塩（１ｍｇ／ｍｌ）であり、酵素液
は、１μｌで１．８×１０^-2単位のものが０．５μｌ相
当であり、反応条件は２５℃、３０分であった。図９と
図１０に示したｐＨ曲線から、本発明の酵素の至適ｐＨ
が７．２付近であることがわかった。アエロバクター
アエロゲネス（Aerobacter aerogenes）由来の公知の
４−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素の至適ｐＨは５．７
（B.J.Finkle,et al.,J.Biol,Chem.,237,2926(196
2)）、バチルス プミルス（Bacillus pumilus）由来の
公知の４−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素の至適ｐＨは
５．５（G.Degrassi,et al.,Appl.Environ.Microbiol.,
61,326(1995)）、クラドスポリウムフィレイ（Cladospo
rium phlei）由来の公知の４−ヒドロキシケイ皮酸脱炭
酸酵素の至適ｐＨは６．０であり（T.Harada, et al.,C
an. J. Microbiol., 22,1258(1976)）、本発明の酵素が
公知のものと異なるものであることがこの至適ｐＨから
も明らかとなった。

【００２４】次に、本発明の位置選択的な重水素化の方
法について説明する。本発明の位置選択的な重水素化方
法に使用するトランス−４−ヒドロキシケイ皮酸又はそ
の誘導体としては、トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸
の化学構造を有するものであって、当該化学構造の他に
４−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ（４−ＨＣ
ＤＣ）よる脱炭酸反応を阻害しないいかなる置換基を有
するものであってもよく、好ましくは次式（Ｉ）

【００２５】

【化４】

【００２６】（式中、Ｒは水素、低級アルキル基、水酸
基、又は、低級アルコキシ基を示し、Ｒはベンゼン環上
に各々独立して１〜４個存在することができる。）で示
されるトランス−４−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導
体が挙げられる。式（Ｉ）で示される化合物における、
低級アルキル基としては、炭素数１〜１５、好ましくは
１〜１０、より好ましくは１〜５のアルキル基が挙げら
れ、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソ
プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基などを挙
げることができる。また、低級アルコキシ基としては、
炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０、より好ましくは
１〜５のアルコキシ基が挙げられ、例えばメトキシ基、
エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ
−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基などを挙げることが
できる。

【００２７】より具体的に本発明の好ましいトランス−
４−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体を例示すれば、
トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸、トランス−カフェ
酸、トランス−フェルラ酸、トランス−２，４−ジヒド
ロキシケイ皮酸などを挙げることができる。これらのト
ランス−４−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体は、１
種の化合物を単独で使用してもよいが、これらの化合物
の２種以上を使用することもできる。

【００２８】本発明の４−ヒドロキシケイ皮酸デカルボ
キシラーゼ（４−ＨＣＤＣ）は、トランス−４−ヒドロ
キシケイ皮酸の化学構造を有し、そのカルボキシル基を
幾何選択的に脱炭酸する能力を有するものであれば特に
制限はないが、本発明のクレブシエラ オキシトカ（Kl
ebsiella oxytoca）菌体から得ることができ、トランス
−４−ヒドロキシケイ皮酸を基質とする新規なトランス
−４−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素が好ましい。本発
明の方法によりトランス体（Ｅ体）の重水素化物を製造
する方法を化学反応式で示すと次式

【００２９】

【化５】

【００３０】（式中、Ｒは水素、低級アルキル基、水酸
基、又は、低級アルコキシ基を示し、Ｒはベンゼン環上
に各々独立して１〜４個存在することができる。）のよ
うになる。即ち、トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸又
はその誘導体、例えば式（Ｉ）で示される化合物を、重
水を含有する反応溶媒中で、４−ヒドロキシケイ皮酸デ
カルボキシラーゼ（４−ＨＣＤ）の存在下に脱炭酸させ
ることにより、ビニル基のベンゼン環に対するトランス
位（Ｅ配置）が位置選択的に重水素化された４−ヒドロ
キシスチレン又はその誘導体（III） を製造することが
できる。

【００３１】重水素を含有する反応溶媒としては、その
一部又は全部を重水で置換した緩衝液が好ましく、緩衝
液に重水を加えたものを使用することもできる。緩衝液
としては、反応を阻害しないものであれば特に制限はな
く、例えばクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）が好
ましい。反応条件としては、通常の培養条件を採用すれ
ばよく、基質や使用する酵素に応じて適宜最適条件を設
定することができる。また、本発明の方法によれば、シ
ス位（Ｚ配置）を位置選択的に重水素化した重水素化−
４−ヒドロキシスチレン又はその誘導体を製造すること
ができる。この方法は、まず、８−重水素化−トランス
−４−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体を、通常の緩
衝液中で、４−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ
（４−ＨＣＤ）の存在下に脱炭酸させることにより、シ
ス位（Ｚ配置）が選択的に重水素化された４−ヒドロキ
シスチレン又はその誘導体を製造することができる。

【００３２】この方法における８−重水素化−トランス
−４−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体としては、前
記したトランス−４−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導
体の８位（ビニル位）が重水素化されたものを使用する
ことができる。より具体的には、８−重水素化−トラン
ス−４−ヒドロキシケイ皮酸、８−重水素化−トランス
−カフェ酸、８−重水素化−トランス−フェルラ酸、８
−重水素化−トランス−２，４−ジヒドロキシケイ皮酸
などを例示することができる。

【００３３】これらの、８−重水素化−トランス−４−
ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体は、公知の種々の方
法で入手することができる。例えば、次の化学反応式

【００３４】

【化６】

【００３５】に示されるように、重水素置換したパラヒ
ドロキシベンスアルデヒド又はその誘導体とマロン酸の
混合物を、ドブナー（Dobner）反応（Dobner,O.,Ber.,1
900,33,2140参照）に従って、ピリジン／重水中で行う
ことにより、目的とする８−重水素化−トランス−４−
ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体を製造することがで
きる。得られた８−重水素化−トランス−４−ヒドロキ
シケイ皮酸又はその誘導体を、通常の軽水緩衝液中で脱
炭酸酵素と反応させると、シス位が重水素化された目的
物を得ることができる。

【００３６】さらに、本発明の方法による前記の方法を
組み合わせることにより、４−ヒドロキシスチレン類の
ビニル基の２個の水素原子が共に重水素化された化合物
を製造することもできる。本発明の方法によれば、従来
の合成的手段によって調製することが極めて困難である
とされていた末端の８位のみが重水素化された重水素化
スチレン類を、簡便な方法で幾何選択的に調製すること
ができる。また、本発明の方法によれば、８−重水素化
−トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸を基質とすること
により、トランス体の重水素化物のみならずシス体の重
水素化スチレン類をも簡便な方法で幾何選択的に調製す
ることもできる。

【００３７】

【実施例】以下に具体例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるもので
はない。

【００３８】実施例１ クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を凍結乾燥した
残さに、２ｍｌの重水を加え、クレブシエラ オキシト
カ（Klebsiella oxytoca）から抽出し４０％グリセリン
−トリス塩酸緩衝液として冷凍保存しておいた粗酵素液
１００マイクロを加え、これを再び凍結乾燥した。その
結果得られた固体を１０ｍｌの重水に再溶解し、ほぼ完
全に重水素置換された酵素液を調製した。３８ｍｇのト
ランス−４−ヒドロキシケイ皮酸重水素化アンモニウム
塩を基質とし、この重水素置換緩衝液酵素溶液中で脱炭
酸反応を行った。脱炭酸反応は重水中においても速やか
に進行した。唯一の生成物をエーテル転溶し、引き続い
て調製ＴＬＣで精製した（収量 １６ｍｇ）。

【００３９】生成物の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、４−
ヒドロキシスチレンに帰属できるシグナル群を示した
が、Ｃ−８に位置するビニルメチレンの一方（８−Ｅ）
が消失していた（図１１の（Ａ）のスペクトル参照）。
図１１には、シス位（Ｚ配置）が重水素化されたものの
ＮＭＲスペクトル（図１１の（Ｂ））、及び、重水素化
されていない４−ヒドロキシスチレンのＮＭＲスペクト
ル（図１１の（Ｃ））が併記されている。なお、図１１
のＮＭＲの測定条件は、ＣＤＣｌ₃を溶媒とし、２７０
ＭＨｚである。また、ＥＩ−ＭＳと¹³Ｃ−ＮＭＲのスペ
クトルは、それぞれ８位重水素化−４−ヒドロキシスチ
レン構造の正当性を支持した。

【００４０】８位−重水素化−４−ヒドロキシスチレン
： 無色シ口ップ状、 Ｒｆ ０．３（４％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ₃） ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ，％） ：１２２（Ｍ⁺＋１，１
７），１２１（Ｍ十，１００），１２０（３１），９２
（３５）¹ Ｈ−ＮＭＲ ： δ（ＣＤＣｌ₃） ７．２９（２Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）［２位及
び６位の水素］、６．７９（２Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝８．
６Ｈｚ）［３位及び５位の水素］、６．６４（１Ｈ，ｂ
ｒ．ｄ，Ｊ＝１７．５Ｈｚ）［７位の水素］、５．５８
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．５Ｈｚ）［８位Ｚ配置の水素］¹³ Ｃ−ＮＭＲ ： ６８ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３ １５５．４（４−Ｃ），１３６．０（７−ＣＨ），１３
０．５（１−Ｃ），１２７．６（２−及び６−ＣＨ），
１１５．４（３−及び５−ＣＨ），１１１．２（ｔ，８
−ＣＨＤ）

【００４１】実施例２ 基質としてトランス−４−ヒドロキシケイ皮酸に換え
て、トランス−カフェ酸、トランス−フェルラ酸、トラ
ンス−２，４−ジビドロキシケイ皮酸を用い、実施例１
と同様にして、それぞれ対応するＥ−重水素化スチレン
誘導体を生成した。

【００４２】実施例３ 基質としてトランス−４−ヒドロキシケイ皮酸に代えて
Ｚ−８−重水素化−トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸
（３８ｍｇ）を用い、緩衝液として通常の軽水緩衝液中
で、実施例１と同様に反応させることにより、Ｚ−８−
重水素化−４−ヒドロキシスチレンを得た（収量 ９ｍ
ｇ）。無色シロップ状。

【００４３】 Ｒｆ ０．３ （４％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣ１３） ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ，％） ：１２２（Ｍ⁺＋１，１
２），１２１（Ｍ⁺，１００），１２０（２７），９２
（３８）¹ Ｈ−ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ₃） ：７．３０（ｂｒ．
ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）［２位、６位水素］，６．７９
（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）［３位、５位水素］，
６．６３（ｍ−ｌｉｋｅｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ）［７位
水素］，５．１０（ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ）［８位水
素］

【００４４】実施例４ 実施例３で使用した８−Ｚ−重水素化−４−ヒドロキシ
ケイ皮酸は次のようにして製造した。重水素置換したマ
ロン酸（０．５ｇ）とパラヒドロキシベンズアルデヒド
（６５ｍｇ）を用いて、ドブナー反応（Dobner 反応）
を行った。即ち、ピリジン／重水（２ｍｌ／０．５ｍ
ｌ）中、７０℃で終夜反応をさせた後、反応混合液を水
で希釈し、塩酸で酸性にし、酢酸エチルで抽出した。目
的の８−重水素化−４−ヒドロキシケイ皮酸を、ＴＬＣ
（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ₃）により精製し、４８
ｍｇの淡黄色固体として得た（収率５５％）。

【００４５】８−Ｚ−重水素化−４−ヒドロキシケイ皮
酸： ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ，％） ：１６６（Ｍ⁺＋１，１
８），１６５（Ｍ⁺，１００），１６４（４９），１４
８（６１），１２０（３１）¹ Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）
：８．８６（１Ｈ，ｂｒ．，４−ＯＨ），７．６０
（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，７−Ｈ），７．５５（２Ｈ，ｂｒ．
ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２−及び６−Ｈ），６．９０（２
Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，３及び５−Ｈ） なお、溶媒の重水素置換が完全でなかったために、微小
なＨ−８シグナルがｐＨ６．３５付近に約６％の強度で
観察された。

【００４６】実施例５ 本発明の酵素は次のようにして単離した。菌株クレブシ
エラ オキシトカ（ＪＣＭ１６６５）は、理化学研究所
（埼玉県）より入手した。クレブシエラ オキシトカ
（Klebsiella oxytoca）菌体を、２ｍＭ濃度のトランス
−カフェ酸を含むジャガイモ煮汁培地（Ｄｉｆｃｏ，４
００ｍｌ）で２５℃で４８時間振とう培養した。培養し
た菌体を、２，０００ｇで１０分間遠心分離して集め、
これを５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に
懸濁し、２，０００ｇで１０分間遠心分離した。得られ
た菌体を、２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０，２０ｍｌ）中に懸濁し、氷溶中で超音波破砕し
た（Ｓｏｎｉｐｈｉｅｒ２０ｍｅＶ，１５分間，１０％
パルス）。得られた液を遠心分離（１２，０００ｇで５
分間(５℃)）し、４−ＨＣＤ活性を示す浮遊物を得た。
可溶性蛋白質は、７０〜８０％Ｎａ₂ＳＯ₄で沈澱させ、
４０％グリセロールと２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０，１０ｍｌ）に再溶解させて、−２０℃で
保存した。この溶解液（蛋白質含有量は約１００μｌ／
μｌ）の、４−ヒドロキシケイ皮酸ナトリウム塩を基質
として使用した場合の脱炭酸活性は、約３０ｎｍｏｌ／
μｌ／分であった。

【００４７】実施例６ ５０ｍＭクエン酸・リン酸緩衝液１０ｍｌにシス−４−
ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩１０ｍｇをとり、同
量の粗酵素液を加え、よく攪拌した。このとき、光があ
たると基質のシス体がトランス体に光異性化するおそれ
があるので、反応容器をアルミホイルで包み、室温、暗
所で一晩放置した。また、対照として、同じ条件で基質
としてトランス体を用いて反応させた。その結果、トラ
ンス体では脱炭酸反応が生起したが、シス体では脱炭酸
反応は全く起こらなかった。

【００４８】実施例７（本発明の酵素の活性試験） 本酵素の４−ＨＣＤ活性はガスクロマトグラフィーを用
いて次のようにして決定された。まず、ガスクロマトグ
ラフィーの標準溶液として、１００ｍｇのパルミチン酸
メチル（和光純薬、分析グレード）の１００ｍｌ ｎ−
ヘキサン溶液を調整した。酵素の溶液（５μｌ）に１０
０ｍＭのリン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液を加え、こ
れに基質として５ｍＭのＥ−４−ヒドロキシケイ酸ナト
リウム（５ａ）溶液５ｍｌを加え、各々１０、２０、３
０、４０、５０及び６０分間、２５℃で放置した。各々
の反応時間の終了時に、酵素反応を終結させるために２
ｍｌの酢酸エチルを加え、少し振った。さらに、内部標
準として、前記の標準溶液１ｍｌを加え、振り混ぜた。
有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した後、ガスクロマトグ
ラフィーで分析した。４−ヒドロキシスチレンと内部標
準のピークは、リテンションタイム（ｅＲ）が各々４．
１分と８．７分のところに現れた。標準のカーブにおい
ては、１０μモルの４−ヒドロキシスチレンが標準のピ
ークに対して１．０２の一定の比率で示された。結果を
図２に示す。図２に示されるように、酵素反応が２０分
間の場合が、標準のカーブにおいて最も信頼できる値の
ようである（基質の６％が反応していると考えられ
る）。図３に示されるように、ミカエリス定数（Ｋｍ）
は約０．５ｍＭであった。

【００４９】実施例 ８ 基質特異性の試験に用いた図１に記載の化合物の合成例
を次に記載する。 （１）Ｅ−４−アミノケイ皮酸（１１） ｐ−アミノベンズアルデヒドとマロン酸とを、ピリジン
中で１００℃、一夜、ドブナー（Dobner）反応により製
造した。溶媒を除去した後、反応混合物を少量の１０％
メタノール／クロロホルムに溶解し、シリカゲルクロマ
トグラフィー（２０％メタノール／クロロホルム）にか
けた。溶出した主生成物（１１）を、薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）（１０％メタノール／クロロホルム）
で分離した。黄色固体。収率４９％。 ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ，％）：１６３（Ｍ⁺，１０
０），１４６（３５），１１８（２０），１１７（１
７），９１（１１）¹ Ｈ−ＮＭＲ δ（アセトン−ｄ₆）；7.54(d,J=15.8Hz,7
-H), 7.36(br.d,J=8.6Hz,2- and 6-H),6.64(br.d,J=8.6
Hz,3- and 5-H),6.18(d,J=15.8Hz,8-H).

【００５０】（２）Ｅ，Ｅ−５−（４−ヒドロキシフェ
ニル）−２，４−ペンタジエン酸（１６） ４−メトキシケイ皮アルデヒドとマロン酸とを、７０℃
でドブナー（Dobner）反応により縮合させ、ＥＩ−ＭＳ
による親ピークｍ／ｚが２４８（Ｍ⁺，１００）を示す
二塩基酸を得た（収率９９％以上）。次いで、この二塩
基酸を１６０℃で一夜加熱することにより、Ｅ，Ｅ−５
−（４−メトキシフェニル）−２，４−ペンタジエン酸
（１６）を得た（収率３０％）。これを、ＢＢｒ₃／Ｃ
Ｈ₂Ｃｌ₂を用いて脱メチル化して、目的のＥ，Ｅ−５−
（４−ヒドロキシフェニル）−２，４−ペンタジエン酸
（１６）を得た（収率４５％）。 ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ，％）；１９０（Ｍ⁺，８７），
１４５（１００），１４４（３１），１２７（４２），
１１７（１６），１１５（２１）¹ Ｈ−ＮＭＲ δ（アセトン−ｄ₆）；7.39(br.d,J=8.6H
z,2- and 6-H),7.39(dd,J=15.2 and 9.9Hz,8-H), 6.94
(br.d,J=15.8Hz,7-H),6.85(dd,J=15.2 and 9.9Hz,9-H),
6.82(br.d,J=8.6Hz,3-and5-H)5.91(d,J=15.2Hz,10-H).

【００５１】（３）２−（３−プロペン−１−カルボキ
シル）−５−アセトキシ−４Ｈ−ピラン−４−オン（１
８） コウジ酸（２−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシ−４
Ｈ−ピラン−４−オン、和光製）をエタノールに溶解
し、これに等量のＫＯＨ及び等量の無水酢酸を加えて、
アセチル化することにより、２−ヒドロキシメチル−５
−アセトキシ−４Ｈ−ピラン−４−オンを得た（収率７
０％）。得られたモノアセチル体を、５０％クロロホル
ム／トルエン中で粉末状の二酸化マンガンを用いて酸化
することにより２−ホルミル−５−アセトキシ−４Ｈ−
ピラン−４−オンを得た（収率２６％、約７０％の原料
を回収した。）。 ＥＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ，％）；１１３（Ｍ⁺，１０
０），９１（４４），６５（３２），４４（３３），４
０（５８）¹ Ｈ−ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ₃）；9.70 (s,7-H), 8.02
(s,6-H), 7.07 (s,3-H), 2.35 (s,5-OAc)

【００５２】この生成物（３４ｍｇ）をマロン酸と、ピ
リジン中、７０℃で一夜処理した。溶媒を減圧で留去
し、残渣をクロロホルム溶解し、シリカゲルカラムクロ
マトグラフィーにより１０％メタノール／クロロホルム
で溶出させて目的の化合物（１８）を得た（収率４０
％）。黄色固体。 Ｒｆ ０．１（１０％メタノール／クロロホルム） ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ，％）：１８２（Ｍ⁺，１００），
１５３（３５），１２５（１７），９７（１２），７９
（１１）４４（１４）¹ Ｈ−ＮＭＲ δ（ＣＤ₃ＯＤ）；8.10(s,6-H), 7.80(d,J
=15.8 Hz,7-H), 6.77(d,J=15.8Hz,8-H),6.70(s,3-H).

【００５３】（４）Ｚ−４−ヒドロキシケイ皮酸（１
４） Ｅ−４−ヒドロキシケイ皮酸エチルエステルに、２５４
ｎｍの紫外線を照射して異性化させ、次いでこれを１Ｍ
のＮａＯＨ／メタノールで加水分解することにより目的
物（１４）を得た（収率約３０％）。¹ Ｈ−ＮＭＲ δ（アセトン−ｄ₆）；6.75(J=12.9Hz),
5.70(J=12.9 Hz)

【００５４】（５）２，４−ジヒドロキシケイ皮酸 ７−ヒドロキシクマリンを濃アンモニア水に溶解し、一
夜室温で暗所に放置した。水層を酢酸エチルで洗浄して
未反応の原料を除いた。水層を減圧下で乾燥すると、粉
状のＺ−２，４−ジヒドロキシケイ皮酸（１５）のアン
モニウム塩を得た。一方、水層に２５４ｎｍの紫外線を
３０分間照射すると、Ｃ７／Ｃ８の二重結合が異性化し
たＥ−２，４−ジヒドロキシケイ皮酸（４）のアンモニ
ウム塩が得られる。後者の乾燥した残渣を２Ｍ塩酸溶液
に溶解し、酢酸エチルで抽出した。有機層を５％ＮａＨ
ＣＯ₃と酢酸エチルに分配した。これはＥ−２，４−ジ
ヒドロキシケイ皮酸が遊離カルボン酸に止まり、Ｅ−体
のみが水層に移行するからであり、目的化合物は酸性化
して酢酸エチルで再抽出することにより得られた。

【００５５】実施例９ 基質に化学構造が似ているが、基質にならない化合物
（９）、（１２）、（１７）、４−ヒドロキシフェニル
酢酸（１９）、及び、４−ヒドロキシケイ皮アルコール
（２０）について、４−ＨＣＤの活性阻害を検討した。
５ｍｌの１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）
又はリン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
に、酵素溶液（１０μｌ）と１００μモルの試験化合物
（５０μｌの１００μＭメタノール溶液）とを加え、２
５℃で５分間放置した。この酵素溶液に、５ｍｌの１０
ｍＭ４−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩（５ａ、５
０μモル）を加え、同じ温度で３０分間放置した。十分
な阻害活性が観察され、この阻害活性は基質の濃度にほ
ぼ定量的であった。

【００５６】

【発明の効果】本発明によれば、新規な４−ＨＣＤが提
供され、また、重水素化−４−ヒドロキシスチレン類を
位置選択的に収率よく製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の酵素の基質となる物質と基質
とならないものを示したものである。

【図２】図２は、本発明の酵素の基質による活性の変化
を示したものである。

【図３】図３は、緩衝液系に各種の溶質を添加したとき
の、本発明の酵素の活性の変化をカフェ酸アンモニウム
塩（１ｍｇ／ｍｌ）を基質として用い、トリス塩酸緩衝
液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．２）を基準とした相
対活性度で示したものである。

【図４】図４は、本発明の酵素の濃度が一定のときの、
基質濃度と反応速度との関係を示したものである。

【図５】図５の（Ａ）及び（Ｂ）は、基質濃度に対する
４−ヒドロキシスチレンの生成量の変化をプロットした
ものである。

【図６】図６は、本発明の酵素の量と基質の反応速度と
の関係を示したものである。

【図７】図７は、塩化ナトリウムの濃度が本発明の酵素
の活性に与える影響を示したものである。

【図８】図８は、エタノールの濃度が本発明の酵素の活
性に与える影響を示したものである。

【図９】図９は、クエン酸緩衝液（５０ｍｌ）における
本発明の酵素のｐＨの影響を示したものである。

【図１０】図１０は、トリス塩酸緩衝液（５０ｍｌ）に
おける本発明の酵素のｐＨの影響を示したものである。

【図１１】図１１は、４−ヒドロキシスチレンの¹Ｈ−
ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃中）のスペクトルを
示す。図１１の（Ａ）はＥ−８−重水素化物のスペクト
ルであり、（Ｂ）はＺ−８−重水素化物のスペクトルで
あり、（Ｃ）は非重水素化物のスペクトルを示す。図中
の矢印はシグナルが消失している部分を示している。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella
   oxytoca）菌体から得ることができ、トランス−４−ヒ
   ドロキシケイ皮酸を基質とするトランス−４−ヒドロキ
   シケイ皮酸脱炭酸酵素。
2. 【請求項２】 至適ｐＨが、７．２付近である請求項１
   に記載のトランス−４−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵
   素。
3. 【請求項３】 トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸又は
   その誘導体を、トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸デカ
   ルボキシラーゼ（４−ＨＣＤ）の存在下に脱炭酸させる
   ことによる、ビニル位に位置選択的に重水素原子を有す
   る４−ヒドロキシスチレン又はその誘導体の製造方法。
4. 【請求項４】 脱炭酸反応が重水を含有する反応溶媒中
   で行われることを特徴とする請求項３に記載の製造方
   法。
5. 【請求項５】 重水素化がベンゼン環に対してトランス
   位である請求項３又は４に記載の製造方法。
6. 【請求項６】 トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸又は
   その誘導体が次式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒは水素、低級アルキル基、水酸基、又は、低
   級アルコキシ基を示し、Ｒはベンゼン環上に各々独立し
   て１〜４個存在することができる。）で示される化合物
   である請求項３〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
7. 【請求項７】 トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸又は
   その誘導体が、トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸、ト
   ランス−カフェ酸、トランス−フェルラ酸、又は、トラ
   ンス−２，４−ジヒドロキシケイ皮酸のいずれか１種又
   は２種以上である請求項６に記載の製造方法。
8. 【請求項８】 重水素化がベンゼン環に対してシス位で
   ある請求項３に記載の製造方法。
9. 【請求項９】 ビニル位の２個の水素が重水素化される
   ことを特徴とする請求項３又は４に記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 トランス−４−ヒドロキシケイ皮酸デ
    カルボキシラーゼ（４−ＨＣＤ）が、請求項１又は２に
    記載の４−ＨＣＤである請求項３〜９のいずれか１項に
    記載の製造方法。
11. 【請求項１１】 次式（II） 【化２】 （式中、Ｄは重水素原子を示し、Ｒは水素、低級アルキ
    ル基、水酸基、又は、低級アルコキシ基を示し、Ｒはベ
    ンゼン環上に各々独立して１〜４個存在することができ
    る。）で示される重水素化−４−ヒドロキシスチレン
    類。