JPH11164698A - Detection of legionella in floc - Google Patents
Detection of legionella in flocInfo
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- JPH11164698A JPH11164698A JP9335892A JP33589297A JPH11164698A JP H11164698 A JPH11164698 A JP H11164698A JP 9335892 A JP9335892 A JP 9335892A JP 33589297 A JP33589297 A JP 33589297A JP H11164698 A JPH11164698 A JP H11164698A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
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- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、フロック中のレジ
オネラ菌の検出方法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for detecting Legionella bacteria in flocs.
【０００２】[0002]
【従来の技術】レジオネラ菌は、在郷軍人病の病原菌で
ある。在郷軍人病は、インフルエンザ様症状と急速に上
昇する高熱とを前駆症状とし、次いで重症肺炎と、通
常、非膿性の痰、精神錯乱、肝脂肪変化および尿細管変
性とが起こる。最近、24時間風呂システムにおけるレジ
オネラ菌の存在が問題となっている。24時間風呂システ
ムにおいてレジオネラ菌が存在する部分は、浴槽水、浴
槽壁(内側)、浴槽中のフィルターや吸入口のスポンジ部
分、温浴器の浄化石や浄化槽などである。特に、浴槽壁
の内側、浴槽中のフィルターや吸入口のスポンジ部分、
温浴器の浄化石等などに付着しているフロックに多数の
レジオネラ菌が存在していることが明らかとなってい
る。2. Description of the Related Art Legionella is a pathogen of Legionnaires' disease. Legionnaires' disease is a precursor to flu-like symptoms and rapidly rising high fever, followed by severe pneumonia and usually nonpurulent sputum, mental confusion, hepatic fat changes and tubular degeneration. Recently, the presence of Legionella bacteria in 24-hour bath systems has become a problem. The parts where the Legionella bacteria are present in the 24-hour bath system are bathtub water, the bathtub wall (inside), the filter in the bathtub and the sponge part of the suction port, and the purification stones and septic tanks of hot water baths. In particular, the inside of the bathtub wall, the filter in the bathtub and the sponge part of the suction port,
It has been clarified that a large number of Legionella bacteria are present on flocs adhering to purified stones and the like in hot water baths.
【０００３】従来、水中のレジオネラ菌の検出方法は知
られており(Smith.,K.Carroll 及びS.Mottice (199
3))、この方法を用いて浴槽水中のレジオネラ菌を検出
することができる。しかし、この方法では、フロックに
存在するレジオネラ菌の検出を行なうことができない。
そこで、フロック中に存在するレジオネラ菌の検出方法
の開発が緊急の課題となっている。Hitherto, methods for detecting Legionella bacteria in water are known (Smith., K. Carroll and S. Mottice (199).
3)), Legionella bacteria in bath water can be detected using this method. However, this method cannot detect Legionella bacteria present on flocs.
Therefore, development of a method for detecting Legionella bacteria present in flocs has become an urgent issue.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、フロック中
に存在するレジオネラ菌の検出方法を提供することを目
的とする。An object of the present invention is to provide a method for detecting Legionella bacteria present in flocs.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究した結果、フロックを含む試
料からフロックを分離し、これを滅菌処理し、滅菌処理
したフロックを培地上で培養することにより、フロック
中のレジオネラ菌を検出できることを見出し、本発明を
完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の工程： （ａ）フロックを含む試料からフロックを分離する工
程、（ｂ）分離されたフロックを滅菌処理する工程、
（ｃ）滅菌処理したフロックを培地上で培養する工程、
を含んでなることを特徴とする、フロック中のレジオネ
ラ菌の検出方法である。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors separated flocs from a sample containing flocs, sterilized the flocs, and placed the sterilized flocs on a medium. The present inventors have found that Legionella bacterium in flocs can be detected by culturing the cells in the medium, and completed the present invention. That is, the present invention provides the following steps: (a) a step of separating flocs from a sample containing flocs; (b) a step of sterilizing the separated flocs;
(C) culturing the sterilized floc on a medium,
A method for detecting Legionella bacteria in flock, characterized by comprising:
【０００６】[0006]
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のフロック中のレジオネラ菌の検出方法は、以下
の工程： （ａ）フロックを含む試料からフロックを分離する工
程、（ｂ）分離されたフロックを滅菌処理する工程、
（ｃ）滅菌処理したフロックを培地上で培養する工程、
を含んでなることを特徴とする。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described below in detail.
The method for detecting Legionella in floc according to the present invention comprises the following steps: (a) a step of separating floc from a sample containing floc; (b) a step of sterilizing the separated floc;
(C) culturing the sterilized floc on a medium,
Is characterized by the following.
【０００７】以下、各工程について説明する。 （１）工程（ａ） 工程（ａ）は、フロックを含む試料からフロックを分離
することからなる。Hereinafter, each of the steps will be described. (1) Step (a) Step (a) consists of separating flocs from a sample containing flocs.
【０００８】フロックを含む試料は、フロックを含む限
り特に限定されず、いかなる試料であってもよい。この
ような試料としては、例えば、フロックが付着している
温浴器の浄化石、浴槽中のフィルターや吸入口のスポン
ジ部分などを用いることができる。The sample containing floc is not particularly limited as long as it contains floc, and any sample may be used. As such a sample, for example, a purifying stone of a warm bath to which flock is attached, a filter in a bathtub, a sponge portion of a suction port, and the like can be used.
【０００９】フロックを含む試料からのフロックの分離
は、該試料からフロックを分離することができる限り、
公知のいかなる方法をも用いることができる。例えば、
フロックを含む試料に生理食塩水を加え振盪した後、超
音波処理することによって、該試料からフロックを分離
することができる。この場合、フロックを含む試料に加
える生理食塩水の量は、試料の大きさやフロックの量に
従って５〜10mlの範囲から適宜選択することができる。
また、振盪は、例えばボルテックミキサーを用いて行な
うことができ、振盪時間は、１〜２分、好ましくは１分
とすることができる。また、超音波処理時間は、10〜15
分、好ましくは10分とすることができる。[0009] The separation of floc from a sample containing the floc is performed as long as the floc can be separated from the sample.
Any known method can be used. For example,
Physiological saline solution is added to a sample containing floc, shaken, and then subjected to ultrasonic treatment, whereby the floc can be separated from the sample. In this case, the amount of the physiological saline to be added to the sample containing the floc can be appropriately selected from the range of 5 to 10 ml according to the size of the sample and the amount of the floc.
Shaking can be performed using, for example, a vortex mixer, and the shaking time can be 1 to 2 minutes, preferably 1 minute. The sonication time is 10-15
Minutes, preferably 10 minutes.
【００１０】（２）工程（ｂ） 工程（ｂ）は、分離されたフロックを滅菌処理すること
からなる。滅菌処理としては、レジオネラ菌は生存でき
るがレジオネラ菌以外の雑菌は生存できないような処理
であれば特に限定されず、公知のいかなる処理をも用い
ることができる。このような滅菌処理としては、例え
ば、酸又は加熱による処理が挙げられる。(2) Step (b) Step (b) comprises sterilizing the separated floc. The sterilization treatment is not particularly limited as long as Legionella bacteria can survive, but bacteria other than Legionella bacteria cannot survive. Any known treatment can be used. As such a sterilization process, for example, a process using an acid or heating may be mentioned.
【００１１】酸による処理は、KCl−HCl緩衝液を添加す
ることにより行なうことができる。酸のpHは1.0〜4.0と
することができるが、2.2とするのが好ましい。また、
酸を加えた後、室温で10〜20分間程度放置することによ
り十分に滅菌処理するのが好ましい。加熱による処理
は、例えば、フロックを含む溶液を50℃で20分間加熱す
ることにより行なうことができる。The treatment with an acid can be carried out by adding a KCl-HCl buffer. The pH of the acid can be between 1.0 and 4.0, but is preferably 2.2. Also,
After adding the acid, it is preferable to sufficiently sterilize the mixture by leaving it at room temperature for about 10 to 20 minutes. The treatment by heating can be performed, for example, by heating a solution containing flocs at 50 ° C. for 20 minutes.
【００１２】また、レジオネラ菌の検出能を高めるため
には、本工程で滅菌処理を行なう前又は後にフロックを
希釈することが好ましい。例えば、フロックを含む試料
に生理食塩水を加え振盪した後、超音波処理することに
よって、該試料からフロックを分離した場合、得られた
フロックを含む生理食塩水を、9倍の容量の生理食塩水
に加えることにより10倍希釈することができる。フロッ
クを含む生理食塩水の希釈倍率はフロックを含む生理食
塩水の濁り具合に応じて適宜選択することができる。一
般には、10〜104倍に希釈することが好ましいが、特に1
02〜103倍に希釈するのが好ましい。In order to enhance the detection ability of Legionella bacteria, it is preferable to dilute the floc before or after performing the sterilization treatment in this step. For example, when a saline solution is added to a sample containing floc and shaken, and then sonicated, the floc is separated from the sample. It can be diluted 10 times by adding to water. The dilution ratio of the physiological saline containing flocs can be appropriately selected according to the degree of turbidity of the physiological saline containing flocs. In general, it is preferable to dilute the 10 to 10 4 times, particularly 1
It is preferred to dilute it by a factor of 0 2 to 10 3 .
【００１３】（３）工程（ｃ） 工程（ｃ）は、滅菌処理したフロックを培地上で培養す
ることからなる。フロックを含む溶液を培地に接種する
場合、接種するフロックを含む溶液の量は50〜200μl、
好ましくは100μlとすることができる。培地に接種した
フロックを含む溶液は、培地に吸収されるまでコンラー
ジ棒等によって塗り広げるのが好ましい。培地として
は、特に限定されず、公知のいかなる培地をも用いるこ
とができるが、レジオネラ菌を選択的に培養することが
できる培地が好ましい。このような培地としては、例え
ば、ＷＹＯ−α、ＭＷＹ等を用いることができるが、Ｗ
ＹＯ−αを用いるのが好ましい。(3) Step (c) Step (c) comprises culturing the sterilized floc on a medium. When inoculating a medium containing a floc-containing solution, the volume of the solution containing the floc to inoculate is 50 to 200 μl,
Preferably, it can be 100 μl. It is preferable that the solution containing the floc inoculated into the medium is spread with a conical rod or the like until it is absorbed by the medium. The medium is not particularly limited, and any known medium can be used, but a medium capable of selectively culturing Legionella is preferable. As such a medium, for example, WYO-α, MWY and the like can be used.
It is preferable to use YO-α.
【００１４】培養条件は、レジオネラ菌が生存し得る条
件であれば特に限定されない。例えば、培養温度は25〜
40℃、好ましくは35〜37℃とすることができ、培養時間
は３〜10日とすることができる。上記培養によりレジオ
ネラ菌のコロニー及び上記滅菌処理で生き残った雑菌の
コロニーが形成されるが、常法によりこれらのコロニー
からレジオネラ菌のコロニーを検出することができる。The culture conditions are not particularly limited as long as Legionella bacteria can survive. For example, the culture temperature is 25-
The temperature can be 40 ° C, preferably 35 to 37 ° C, and the culture time can be 3 to 10 days. Colonies of Legionella bacteria and colonies of various bacteria surviving the sterilization treatment are formed by the above culture, and Legionella colonies can be detected from these colonies by a conventional method.
【００１５】[0015]
【実施例】以下、本発明をさらに具体的に説明する。 （１）浴槽壁からのフロックの分離 滅菌済綿棒で浴槽壁1cm×1cmを拭き取り、滅菌生理食塩
水5mlが入ったチューブに入れた。次に、ボルテックス
ミキサーで1分間振盪させた後、超音波処理を15分間行
い、フロックを分離・細分化させた。このようにして得
られたフロックの浮遊液を原液として希釈を行なった。
希釈は、まず、原液0.5mlを生理食塩水4.5mlに加えて10
倍希釈液を作製し、以後同様の手順で原液を100倍まで
希釈した。そして、希釈液5mlに0.2M HCl‐KClバッファ
ー5mlを加えて、15分間作用させた。この溶液の100μl
をレジオネラ菌選択分離培地WYOα培地（栄研化学）に
接種し、36℃の湿潤状態で培養した。Hereinafter, the present invention will be described more specifically. (1) Separation of floc from bathtub wall The bathtub wall 1 cm x 1 cm was wiped off with a sterilized cotton swab and placed in a tube containing 5 ml of sterile physiological saline. Next, after shaking for 1 minute with a vortex mixer, ultrasonic treatment was performed for 15 minutes to separate and fragment the flocs. The floc suspension thus obtained was used as a stock solution for dilution.
For dilution, first add 0.5 ml of undiluted solution to 4.5 ml of physiological saline and add 10 ml.
A double dilution was prepared, and thereafter the stock solution was diluted to 100-fold by the same procedure. Then, 5 ml of a 0.2 M HCl-KCl buffer was added to 5 ml of the diluted solution, and the mixture was allowed to act for 15 minutes. 100 μl of this solution
Was inoculated into a Legionella selective selection medium WYOα medium (Eiken Chemical Co., Ltd.) and cultured in a wet state at 36 ° C.
【００１６】（２）フィルタースポンジからフロックの
分離 フィルタースポンジを1cm3程度に切り取り、滅菌チュー
ブ内でさらに細かく刻んだ後、滅菌生理食塩水を5ml加
えた。以後、上記と同様の手順でフロックを分離させ、
段階希釈を行なった。そして、希釈液5mlに0.2M HCl‐K
Clバッファー5mlを加えて、15分間作用させた。この溶
液の100μlをレジオネラ菌選択分離培地WYOα培地（栄
研化学）に接種し、36℃の湿潤状態で培養した。(2) Separation of Floc from Filter Sponge The filter sponge was cut into about 1 cm 3 , cut into fine pieces in a sterile tube, and then 5 ml of sterile physiological saline was added. After that, the floc is separated by the same procedure as above,
Serial dilutions were performed. Then add 0.2M HCl-K to 5ml of diluent
5 ml of Cl buffer was added and allowed to act for 15 minutes. 100 μl of this solution was inoculated into Legionella selective separation medium WYOα medium (Eiken Chemical) and cultured in a wet state at 36 ° C.
【００１７】（３）浄化石からのフロックの分離 浴水の浄化に使われている浄化石を浄化槽内から3個程
度取り出し、滅菌遠沈管に移して滅菌生理食塩水を5ml
加えた。以後、上記と同様の手順でフロックを分離さ
せ、段階希釈を行なった。そして、希釈液5mlに0.2M HC
l‐KClバッファー5mlを加えて、15分間作用させた。こ
の溶液の100μlをレジオネラ菌選択分離培地WYOα培地
(栄研化学)に接種し、36℃の湿潤状態で培養した。(3) Separation of Floc from Purification Stone About 3 purification stones used for purification of bath water are taken out of the purification tank, transferred to a sterile centrifuge tube, and sterilized physiological saline (5 ml).
added. Thereafter, flocs were separated by the same procedure as above, and serial dilution was performed. And 0.2M HC in 5ml of diluent
5 ml of l-KCl buffer was added and allowed to act for 15 minutes. 100 μl of this solution was used for selective separation of Legionella bacteria in WYOα medium.
(Eiken Chemical) and cultured in a wet state at 36 ° C.
【００１８】（４）レジオネラ菌の検出と同定 培養３日目までに培地上に出現してきた集落について、
シャーレの裏側から印をつけた。これはレジオネラ菌と
それ以外の菌とを区別するためである。培養3日目以降
に増殖してきた乳白色の湿潤集落を釣菌し、グラム染
色、L−システイン要求性を調べた。グラム陰性でL−シ
ステイン要求性があるものをレジオネラ属菌として検出
した。さらに、馬尿酸水解試験、紫外線（365nm）照射
による自発蛍光、免疫血清による血清群別を調べて菌種
の同定を行なった。(4) Detection and identification of Legionella bacteria The colonies that appeared on the medium by the third day of culture were
Marked from the back of the petri dish. This is to distinguish Legionella bacteria from other bacteria. The milky white wet colonies that had proliferated after the third day of culture were picked for bacteria, and examined for Gram staining and L-cysteine requirement. Gram-negative L-cysteine-requiring substances were detected as Legionella spp. Furthermore, the strains were identified by examining hippuric acid hydrolysis test, autofluorescence by ultraviolet (365 nm) irradiation, and serogroup classification by immune serum.
【００１９】これまで、人工的な水環境では、レジオネ
ラ菌は水中よりもフロック中に多く生息していることが
疑われていた。しかし、環境水試料からの検出方法は確
立されていたが、固形試料表面などに形成されたフロッ
クの検出例は少なく、フロック中のレジオネラ菌を検出
することができなかった。本発明により、各試料の表面
に形成したフロック中のレジオネラ菌の定量的解析が可
能となった。Hitherto, it has been suspected that Legionella bacteria live in flocks more than in water in an artificial water environment. However, although detection methods from environmental water samples have been established, there are few examples of detection of flocs formed on the surface of solid samples and the like, and Legionella bacteria in flocs could not be detected. According to the present invention, it has become possible to quantitatively analyze Legionella bacteria in flocs formed on the surface of each sample.
【００２０】[0020]
【発明の効果】本発明によれば、フロック中のレジオネ
ラ菌を検出することができる。According to the present invention, Legionella bacteria in flocs can be detected.
Claims (1)
程、（ｂ）分離されたフロックを滅菌処理する工程、
（ｃ）滅菌処理したフロックを培地上で培養する工程、
を含んでなることを特徴とする、フロック中のレジオネ
ラ菌の検出方法。1. The following steps: (a) separating flocs from a sample containing flocs; (b) sterilizing the separated flocs;
(C) culturing the sterilized floc on a medium,
A method for detecting Legionella bacteria in flocs, characterized by comprising:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9335892A JPH11164698A (en) | 1997-12-05 | 1997-12-05 | Detection of legionella in floc |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9335892A JPH11164698A (en) | 1997-12-05 | 1997-12-05 | Detection of legionella in floc |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11164698A true JPH11164698A (en) | 1999-06-22 |
Family
ID=18293546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9335892A Pending JPH11164698A (en) | 1997-12-05 | 1997-12-05 | Detection of legionella in floc |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11164698A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2850756A1 (en) * | 2003-01-30 | 2004-08-06 | Sciences And Technologies Vent | Method of sampling air circulation systems for detecting bacteria, useful particularly for Legionella in air-conditioning systems, comprises taking a sample from a region of pipe where condensation can occur |
-
1997
- 1997-12-05 JP JP9335892A patent/JPH11164698A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2850756A1 (en) * | 2003-01-30 | 2004-08-06 | Sciences And Technologies Vent | Method of sampling air circulation systems for detecting bacteria, useful particularly for Legionella in air-conditioning systems, comprises taking a sample from a region of pipe where condensation can occur |
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