JPH1095798A - ヒト・レクイエム - Google Patents

ヒト・レクイエム

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JPH1095798A
JPH1095798A JP9208286A JP20828697A JPH1095798A JP H1095798 A JPH1095798 A JP H1095798A JP 9208286 A JP9208286 A JP 9208286A JP 20828697 A JP20828697 A JP 20828697A JP H1095798 A JPH1095798 A JP H1095798A
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JP
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polynucleotide
requiem
dna
cells
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JP9208286A
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Mitchell S Gross
ミッチェル・エス・グロス
Mark R Hurle
マーク・アール・ハール
Kristine K Kikly
クリスティン・ケイ・キクリー
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Original Assignee
SmithKline Beecham Corp
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 アポトーシスに関与するアミノ酸配列および
それを同定する方法が望まれている。 【解決手段】 本発明はヒトＲＥＱＵＩＥＭポリペプチ
ド、およびかかるＲＥＱＵＩＥＭをコードするＤＮＡ
（ＲＮＡ）、および組換え法によってかかるポリペプチ
ドを製造する方法を開示する。さらに、ウイルス感染、
癌化ならびに胚発生および組織恒常性の制御における疾
病および欠陥に対する感受性の治療のために、かかるＲ
ＥＱＵＩＥＭを用いる方法を開示する。配列番号：２の
核酸配列をかかる感受性を確認するためのアッセイに用
いてもよい。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一部分、新規同定
されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；そのポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；
そのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、および、そ
の変種および誘導体の製造方法；そのポリペプチドのア
ゴニストおよびアンタゴニスト；および、そのポリヌク
レオチド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストお
よびアンタゴニストの使用に関する。特に、これらおよ
び他の点において、本発明は、マウス・レクイエム遺伝
子のヒト相同物（以下、「ＲＥＱＵＩＥＭ」という）の
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来技術および発明が解決しようとする課題】造血幹
細胞の増殖、分化、およびアポトーシスは、様々な成長
因子およびサイトカインによって調節されている（Metc
alf, D., Science 254,529-531(1992),およびVauxら, N
ature 335,440-442(1988)）。骨髄分化系統に関わるか
かる細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ１およびＩＬ−３の高親和性
受容体を発現する（Miyajimaら,Blood 82, 1960-1973(1
993)）。さらに、かかる細胞は、生存するためにＧＭ−
ＣＳＦまたはＩＬ−３を必要とし、ＧＭ−ＣＳＦまたは
ＩＬ−３の欠乏に応答してアポトーシスが生じる（Will
iamsら, Nature 343,76-79(1990)）。
【０００３】生存するための成長因子の要件において、
造血細胞が唯一のものというわけではない。発達を通し
てずっと、すべての分化系統の細胞は生育および分化を
するために適当なシグナルを必要とする。これらのシグ
ナルを受け取り損ねたら、しばしば細胞はアポトーシス
によって死滅する。大人の生物においてさえ、成長因子
およびサイトカインを必要とする、細胞の絶え間ない新
生および／または維持が起こっている。これらの成長因
子からのシグナルが不当に停止すると、アポトーシスが
生じ、それによって機能障害または疾病がおこるかもし
れない。
【０００４】いくつかのアポトーシス遺伝子が多細胞生
物において保存されているようである。例えば、セノル
ハブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegan
s）のｃｅｄ−３遺伝子は、インターロイキン−１β−
転換酵素（ＩＣＥ）、Ｉｃｈ−１、ＣＰＰ３２、ＴＸ、
ＩＣＥｒｅｌＩＩＩおよびＬＡＰ３を包含する（Yuan
ら, Cell 75,641-652(1993）およびMiuraら, Cell 75,6
53-660(1993);Wangら, Cell 78,739-750(1994), Fernan
des-Alnemriら, JBC 269,30761-30764(1994), Faucheu
ら, EMBO J 14,1914-1922(1995), Mundayら, JBC 270,1
5870-15876(1995)およびDuanら, JBC 271, 35013-35035
(1996)）一連の哺乳動物の相同体であるシステインプロ
テアーゼを有する。アポトーシスのアンタゴニストも、
例えば、シー・エレガンス（C. elegans）のｃｅｄ−９
および哺乳動物の相同体ｂｃｌ−２のごとく、保存され
ている。開始の分子制御はほとんど解明されていない。
【０００５】ＩＬ−３に応答して増殖し、ＩＬ−３の欠
乏によりプログラムされた細胞死が速やかにおこる細胞
系は、発現クローニングシステムのために用いることが
できる。かかるシステムを使用して、アポトーシスを拮
抗阻害する遺伝子が見いだされるかもしれない。マウス
の細胞はこの目的のために有用であることが示されてい
る。生存因子が骨髄細胞から消失することに引き続いて
起こる、アポトーシス応答に必要な転写因子をコードす
ると考えられる、マウス・レクイエム遺伝子が記載され
ている（Gabigら, JBC 269,29515-29519(1994)）。
【０００６】本発明は、レクイエム遺伝子のヒト相同体
およびそのコードするポリペプチドを提供する（本明細
書中「ＲＥＱＵＩＥＭ」）。ヒトの配列は、マウスレク
イエム配列よりも長い５'配列を含有し、正確な開始部
位であると考えられているより大きい５'開始部位を有
する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】これらおよび他の目的の
ために、特に、図１に示したアミノ酸配列と図２に示し
た配列のごとき他のタンパク質の既知のアミノ酸配列の
間の相同性によって、新規ＲＥＱＵＩＥＭとして同定さ
れたポリペプチドを提供することが本発明の目的であ
る。
【０００８】さらに、ＲＥＱＵＩＥＭをコードするポリ
ヌクレオチド、特に、本願中ＲＥＱＵＩＥＭとして示さ
れるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
することが、本発明のさらなる目的である。本発明のこ
の態様の特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチ
ドは、図１に示したごときヒト・ＲＥＱＵＩＥＭをコー
ドする領域を有してなる。本発明のこの態様に従って、
図１のポリペプチドをコードする図１のヒトｃＤＮＡに
よって発現される成熟ポリペプチドをコードする単離さ
れた核酸分子を提供する。
【０００９】本発明のこの態様に従って、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および本発明のこの態様のさら
なる具体例において、生物学的、診断学的、臨床的、ま
たは治療的に有用なその変種、アナログまたは誘導体、
または変種、アナログおよび誘導体の断片を包含するそ
れの断片を含む、ヒトＲＥＱＵＩＥＭをコードする単離
された核酸分子を提供する。
【００１０】ヒト・ＲＥＱＵＩＥＭの天然の対立遺伝子
変種は本発明のこの態様の特に好ましい具体例である。
治療目的、例えば、ウイルス感染を治療するために、抗
腫瘍因子として、および、胚分化および組織の恒常性を
制御するために用いてもよい、ＲＥＱＵＩＥＭポリペプ
チド、特にヒト・ＲＥＱＵＩＥＭポリペプチドを提供す
ることも本発明の目的である。
【００１１】本発明のこの態様に従って、本明細書中、
ＲＥＱＵＩＥＭと称されるヒト起源の新規ポリぺプチド
ならびにその生物学的、診断学的、臨床的、または治療
的に有用な断片、変種、アナログまたは誘導体、断片の
変種および誘導体、およびこれらのアナログを提供す
る。
【００１２】ヒトＲＥＱＵＩＥＭ遺伝子の天然の対立遺
伝子によってコードされるヒトＲＥＱＵＩＥＭの変種
は、本発明のこの態様の特に好ましい具体例である。前
述したポリペプチド、ポリペプチド断片、変種および誘
導体、変種および誘導体の断片、およびこれらのアナロ
グの製造方法を提供することが本発明のもう一つの目的
である。
【００１３】本発明のこの態様の特に好ましい具体例に
おいて、宿主におけるヒトＲＥＱＵＩＥＭの発現のため
の条件下で、宿主細胞中に外来性ヒトＲＥＱＵＩＥＭを
コードするポリヌクレオチドを発現可能に組み込んでい
る宿主細胞を培養し、次いで、発現したポリペプチドを
回収することからなる前述のＲＥＱＵＩＥＭポリペプチ
ドを製造する方法を提供する。ＲＥＱＵＩＥＭは、多く
のよく知られた技術のいくつかを用いて天然の材料から
精製してもよい。
【００１４】本発明のもう一つの目的に従って、産物、
組成物、プロセス、および、特に、研究、生物学的、臨
床的、診断、または治療目的に前述のポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドを使用する方法を提供する。
【００１５】本発明のこの態様のある好ましい具体例に
従って、特に、とりわけ：ＲＥＱＵＩＥＭポリペプチ
ド、またはＲＥＱＵＩＥＭをコードするｍＲＮＡを測定
することによって細胞における発現を評価し；抗ウイル
ス剤、抗腫瘍剤として、および、本願中に開示されるご
とく、細胞をＲＥＱＵＩＥＭポリペプチドまたはポリヌ
クレオチドに曝露することによるインビトロ、エクスビ
ボまたはインビボでの胚分化および組織恒常性を制御
し；ＲＥＱＵＩＥＭ遺伝子における欠失のごとき遺伝的
変異および変型をアッセイし；および、ＲＥＱＵＩＥＭ
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生物に投与し、
ＲＥＱＵＩＥＭの機能を増大させるか、またはＲＥＱＵ
ＩＥＭ機能不全を治療する、産物、組成物および方法を
提供する。例えば、癌細胞および充実性腫瘍細胞を包含
する、細胞増殖の欠陥に対して標的とされたアゴニスト
をこれらの疾病の治療に使用してもよい。かかる標的化
は抗体融合を使用した遺伝子治療によって達成すること
ができる。さらに、アゴニストを用いて、濾胞性リンパ
腫、ｐ５３変異を伴う癌腫、例えば、ＳＬＥ、免疫原性
糸球体腎炎のごとき自己免疫疾患、例えば、乳癌、前立
腺癌および子宮癌のごときホルモン依存性腫瘍、およ
び、例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ア
デノウイルスのごときウイルス感染を治療してもよい。
【００１６】本発明のこのおよび他の態様のある好まし
い具体例に従って、ヒト・ＲＥＱＵＩＥＭ配列にハイブ
リダイゼーションするプローブを提供する。本発明のこ
の態様のさらに好ましいある具体例において、ＲＥＱＵ
ＩＥＭポリペプチドに対する抗体を提供する。この点に
おいて特に好ましいある具体例において、抗体はヒトＲ
ＥＱＵＩＥＭに対して高度に選択的である。
【００１７】本発明のもう一つの態様に従って、ＲＥＱ
ＵＩＥＭアゴニストを提供する。ＲＥＱＵＩＥＭを模倣
した分子、ＲＥＱＵＩＥＭ結合分子または受容体分子に
結合する分子、およびＲＥＱＵＩＥＭが引き起こす応答
を促進または増大させる分子は好ましいアゴニストであ
る。ＲＥＱＵＩＥＭまたはＲＥＱＵＩＥＭポリペプチド
と相互作用するか、またはＲＥＱＵＩＥＭ活性および／
または遺伝子発現の他のモジュレーターと相互作用し、
それによってＲＥＱＵＩＥＭの効果またはＲＥＱＵＩＥ
Ｍの１つ以上の効果を増強または増大させる分子もま
た、好ましいアゴニストである。
【００１８】本発明のさらにもう一つの態様に従って、
ＲＥＱＵＩＥＭアンタゴニストを提供する。ＲＥＱＵＩ
ＥＭ受容体または結合分子に結合するが、ＲＥＱＵＩＥ
Ｍ誘発の応答または一以上のＲＥＱＵＩＥＭ誘発の応答
を惹起しないようにＲＥＱＵＩＥＭを模倣する分子は、
好ましいアンタゴニストである。ＲＥＱＵＩＥＭの効果
または一以上のＲＥＱＵＩＥＭの効果を阻害するように
ＲＥＱＵＩＥＭと結合または相互作用するか、またはＲ
ＥＱＵＩＥＭの発現を妨害する分子も好ましいアンタゴ
ニストである。
【００１９】本発明のさらなる態様において、ＲＥＱＵ
ＩＥＭポリペプチドを含んでなる組成物、または、イン
ビトロ、エクスビボおよびインビボで細胞に投与、また
は多細胞生物に投与するためのＲＥＱＵＩＥＭポリペプ
チドを提供する。本発明のこの態様の特に好ましいある
具体例において、組成物は、疾病を治療するための宿主
生物におけるＲＥＱＵＩＥＭポリペプチドの発現のため
のＲＥＱＵＩＥＭポリヌクレオチドを含んでなる。この
点において特に好ましくは、ＲＥＱＵＩＥＭの異常な内
在活性に伴う機能障害を治療するために、ヒト患者にて
該ポリぺプチドを発現させることである。
【００２０】本発明の他の目的、特徴、利点および態様
は、以下の記載から当業者には明白になるであろう。し
かしながら、以下の記載および実施例は本発明の好まし
い具体例を示すものであって、単に説明しているにすぎ
ないことを理解すべきである。開示された発明の精神お
よび範囲内の様々な変形および修飾は、以下の記載を読
むこと、および、本開示物の他の部分を読むことから、
当業者に容易に明らかとなるであろう。
【００２１】用語解説 以下に示す説明は、本明細書、特に実施例において頻繁
に用いられるある用語の理解を容易にするために提供さ
れるものである。説明は簡便性のために提供するのであ
って、本発明を限定しない。
【００２２】ＤＮＡの消化は、ＤＮＡのある配列でのみ
作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒分解をいう。本明
細書中の様々な制限酵素は市販されており、それらの反
応条件、補因子、および使用のための他の要件は知られ
ており、当業者にとっては慣用的である。
【００２３】解析目的には、典型的には、約２０μｌの
反応緩衝液中で１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片を
約２ユニットの酵素で消化する。プラスミド構築のため
にＤＮＡ断片を単離する目的には、典型的には５ないし
５０μｇのＤＮＡをそれに比例した大きな体積中で２０
ないし２５０ユニットの酵素で消化する。個々の制限酵
素について適当な緩衝液および基質量は、以下に述べる
ごとき標準的な研究室マニュアルに記載されており、そ
れらはメーカーによって明記されている。
【００２４】３７℃で約１時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、条件は、標準的方法、供給者の
指示および反応事項に従って多様であってもよい。消化
後、当業者にとって慣用的な周知の方法を用いて反応物
を解析し、断片をアガロースまたはポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって精製してもよい。
【００２５】遺伝性エレメントは、一般に、ポリペプチ
ドをコードする領域、または、転写または翻訳または宿
主細胞におけるポリペプチドの発現に重要な他のプロセ
スを調節する領域を含んでなるポリヌクレオチド、また
はポリペプチドをコードする領域、およびそれに作動可
能に連結された発現を調節する領域の両方を含んでなる
ポリヌクレオチドを意味する。
【００２６】遺伝性エレメントは、エピソーム・エレメ
ントとして、即ち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立し
た分子として複製されるベクターを包含してもよい。そ
れらは、真核細胞において、メソトレキセート選択によ
るトランスフェクトされたＤＮＡの増幅の間に生じるミ
ニ染色体のごときものを包含してもよい。遺伝性エレメ
ントはまた、宿主細胞ゲノムを包含してもよいが、それ
は天然の状態ではなく、むしろ以下の、単離、クローニ
ングおよび精製ＤＮＡの形態で、または、ベクターでの
宿主細胞への導入といった操作を受けている。
【００２７】同一性または類似性は、当該分野に置いて
知られているごとく、一つのポリペプチドのアミノ酸配
列およびその保存的アミノ酸置換を別のポリペプチドの
配列と比較することによって決定されるごとき２つのポ
リペプチド間の関係である。さらに、当該分野において
知られるごとく、「同一性」はかかる配列の２つの鎖の
間の一致の同一性によって決定されるごとき、２つのポ
リペプチドまたは２つのポリヌクレオチド間の配列の関
連性の度合いを意味する。同一性も類似性も容易に計算
できる（Computational Molecular Biology, Lesk, A.
M., ed., Oxford University Press, New York, 1988;
Biocomputing:Informatics and GenomeProjects, Smit
h, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Com
puter Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin,
A. M.,およびGriffin H. G., eds., Humana Press, New
Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biol
ogy, von Heinje, G., Academic Press, 1987; およびS
equence Analysis Primer,Gribskov, M. およびDevereu
x, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991）。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同
一性および類似性を測定する多くの方法が存在する一
方、「同一性」および「類似性」という語は当業者によ
く知られている（Sequence Analysis in Molecular Bio
logy, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequen
ce Analysis Primer, Gribskov, M. およびDevereux,
J., eds., M Stockton Press, New York, 1991；および
CarilloH., およびLipman, D., SIAM J. Applied Mat
h., 48:1073(1988)）。２つの配列間の同一性および類
似性を決定するために一般に用いられる方法は、Carill
o, H., およびLipman, D., SIAM J. Applied Math., 4
8:1073(1988)に開示されるものに包含されるが、これに
限定されない。同一性を決定する好ましい方法は、試験
した２つの配列間のもっとも大きな一致を与えるように
デザインされている。同一性および類似性を決定する方
法はコンピュータープログラムに書き込まれている。２
つの配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコ
ンピュータープログラムの方法は、ＧＣＧプログラムパ
ッケージ（Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research 1
2(1):387(1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡ
ＳＴＡ（Atschul. S. F.ら J. Molec. Biol. 215:403(1
990)）を包含するが、これに限定されない。
【００２８】単離とは、「人工的に」天然状態から変化
させられていること、すなわち、天然にある場合には、
その原環境から変化させられ、あるいはその原環境から
取り出されていること、あるいはその両方を意味する。
例えば、天然状態の生きた動物中に存在する天然のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていな
いが、天然状態における共存物質から分離されている同
じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その語が本
明細書で用いられる場合、「単離」されている。例え
ば、ポリヌクレオチドに関しては、単離という語は、そ
れが天然に存在している染色体および細胞から分離され
ていることを意味する。
【００２９】単離の一部として、あるいは単離後に、例
えば、突然変異誘発し、融合タンパク質を形成するため
に、および宿主中での増殖または発現のために、かかる
ポリヌクレオチドをＤＮＡのごとき他のポリヌクレオチ
ドに結合させることができる。単離ポリヌクレオチド
は、単独またはベクターのごとき他のポリヌクレオチド
と結合して、培養中または生物そのものにおける宿主細
胞に導入することができる。培養または生物そのものに
おける宿主細胞へ導入された場合、その語が本明細書に
おいて用いられる場合、かかるＤＮＡはやはり単離され
ている。というのも、それらは天然に存在する形態でな
く、あるいは天然環境に存在するものではないからであ
る。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、
培地処方、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、例
えば細胞への導入のための溶液、化学反応または酵素反
応のための組成物または溶液のごとき組成物の中に存在
してもよく、例えば、それらは天然には存在しない組成
物であり、その中で単離ポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドは本明細書にいう単離された状態のままである。
【００３０】連結とは、大抵２本鎖ＤＮＡである２個ま
たはそれ以上のポリヌクレオチド間のホスホジエステル
結合形成プロセスをいう。連結方法は当該分野において
よく知られており、連結方法は標準的な研究室のマニュ
アル、および、例えば、Sambrookら,MOLECULAR CLONIN
G,A LABORATORY MANUAL,2nd Ed;Cold Spring Harbor La
boratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)
（「Sambrook」）および以下に引用するManiatis et a
l.,の１４６頁のごとき文献に記載されている。
【００３１】オリゴヌクレオチドとは比較的短いポリヌ
クレオチドをいう。しばしば、その用語は１本鎖デオキ
シリボヌクレオチドをいうが、よく１本鎖または２本鎖
リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび
とりわけ２本鎖ＤＮＡをいうことがある。
【００３２】１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド
のごときオリゴヌクレオチドは、しばしば、自動オリゴ
ヌクレオチド合成機の使用のごとき、化学的方法により
合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは他の
様々な方法により製造することができ、それらはインビ
トロ組換えＤＮＡによる方法、および、細胞および生物
におけるＤＮＡ発現による方法を包含する。
【００３３】最初に、化学合成されたＤＮＡは、典型的
には５'リン酸を欠く状態で得られる。かかるオリゴヌ
クレオチドの５'末端は、組換えＤＮＡ分子を得るため
に典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用する連結反
応によるホスホジエステル結合形成の基質ではない。か
かるオリゴヌクレオチドの連結が所望の場合には、キナ
ーゼおよびＡＴＰを用いるごとき標準的方法によりリン
酸を付加することができる。
【００３４】化学合成されたオリゴヌクレオチドの３'
末端は、一般に、有利のヒドロキシル基を有し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼのごときリガーゼの存在下、もう一つのオ
リゴヌクレオチドのごとき、もう一つのポリヌクレオチ
ドの５'リン酸とホスホジエステル結合を容易に形成す
るであろう。よく知られているごとく、所望により、連
結の前に他のポリヌクレオチドの５'リン酸を除去する
ことによって、この反応を選択的に阻害できる。
【００３５】本明細書中一般に、プラスミドは、当業者
によく知られた慣用的命名法により、大文字および／ま
たは数字が前および／または後に続く小文字のｐにより
命名される。本明細書に開示の開始プラスミドは市販の
もの、制限なく公的に利用可能なものであるか、また
は、よく知られた公表された方法を用いて利用可能なプ
ラスミドから日常的に構築可能なもののいずれかであ
る。本発明により使用可能な多くのプラスミドならびに
他のクローニングおよび発現ベクターはよく知られてお
り、当業者が容易に入手できるものである。さらに、当
業者は、本発明における使用に適する数多くのプラスミ
ドを容易に構築することができる。本発明におけるかか
るプラスミド同様他のベクターの性質、構築および使用
は、本開示から当業者に容易に明らかとなろう。
【００３６】一般的には、ポリヌクレオチドとは、ポリ
リボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド
をいい、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾ＲＮＡ
またはＤＮＡであってよい。かくして、例えば、本明細
書の用語ポリヌクレオチドは、特に、１本鎖および２本
鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域の混ざったＤＮＡ、
１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、および１本鎖および２本鎖
領域の混ざったＲＮＡ、１本鎖であるＤＮＡおよびＲＮ
Ａを含んでなるハイブリッド分子をいい、より典型的に
は、２本鎖のものまたは１本鎖および２本鎖領域の混ざ
ったものをいう。
【００３７】さらに、本明細書の用語ポリヌクレオチド
は、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの
両方を含んでなる３本鎖領域をいう。かかる領域中の鎖
は同じ分子由来であってもよく、また異なる分子由来で
あってもよい。その領域は１つまたはそれ以上の分子の
全体を含んでいてもよいが、より典型的には、分子のい
くつかの領域のみを含む。３本鎖らせん領域の分子の１
つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。
【００３８】本明細書の用語ポリヌクレオチドは、１個
またはそれ以上の修飾塩基を含む上記ＤＮＡまたはＲＮ
Ａを包含する。かくして、安定性または他の理由のため
に修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明
細書にいう「ポリヌクレオチド」である。さらに、例え
ばイノシンまたはトリチウム化されたような修飾塩基の
ごとき、異常塩基を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡも本
明細書にいうポリヌクレオチドである。
【００３９】非常に様々な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに
ついて行われて、当業者に知られた多くの有用な目的を
果たしていることが認識されるであろう。本明細書用語
ポリヌクレオチドは、かかる化学的、酵素的、または代
謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、同様に、特
に、ウイルス、および、単一および複合細胞を包含する
細胞の特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含
する。
【００４０】本明細書の用語「ポリペプチド」は以下に
説明するごときすべてのポリペプチドを包含する。ポリ
ペプチドの基本的構造はよく知られており、当該分野の
多数の教科書および他の刊行物に記載されている。この
点からすると、この用語は、ペプチド結合により互いに
直鎖状に結合した２個またはそれ以上のアミノ酸を含ん
でなるペプチドまたはタンパク質をいう。本明細書にお
いて該用語は、例えば、当該分野において通常ペプチ
ド、オリゴペプチドおよびオリゴマーともいわれる短い
鎖、および、当該分野において一般に、多くのタイプが
存在するタンパク質といわれる長い鎖の両方をいう。
【００４１】ポリペプチドは、しばしば、一般に２０個
の天然アミノ酸といわれるもの以外のアミノ酸を含んで
いること、および、プロセッシングおよび他の翻訳後修
飾のごとき天然プロセスのみならず当該分野でよく知ら
れた化学的修飾法によっても、末端アミノ酸を包含する
多くのアミノ酸を一定のポリペプチド中で修飾してもよ
いことが理解されよう。ポリペプチドにおいて自然に起
こる普通の修飾でさえも膨大すぎてここに列挙できない
が、それらは基本的な教科書およびさらに詳細な研究論
文、同様に、膨大な研究文献にも記載されており、それ
らは当業者によく知られている。
【００４２】本発明ポリペプチド中に存在してもよい既
知の修飾のうち少し例を挙げると、アセチル化、アシル
化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結
合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオ
チド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結
合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環
化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合に
よる架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの
形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシ
レーション、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨ
ウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質
分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ
化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のごとき転移
−ＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸付
加、および、ユビキチン化がある。
【００４３】かかる修飾は当業者によく知られており、
科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつかの特
によく行われる修飾、例えばグリコシレーション、脂質
付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシ
ル化、ヒドロキシル化、および、ＡＤＰ−リボシル化
は、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,2n
d Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freemen and Company,New Yo
rk(1993)のごとき最も基本的な教科書に記載されてい
る。多くの報文がこの問題について利用できル。例え
ば、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PRO
TEINS,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York(198
3)中、Wold,F.,Posttranslational Protein Modificati
ons:Prespectives and Prospects,pgs.1-12；Seifter
ら、Analysis forprotein modifications and nonprote
in cofactors,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)およびR
attmanら、Protein Synthesis:Posttranslational Modi
ficationsおよびAging.Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(19
92)によって提供される。
【００４４】よく知られ、上記したごとく、ポリペプチ
ドは常に全体が直鎖状であるとは限らないことが理解さ
れよう。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果分
枝し、および、一般に、天然に起こるプロセッシングお
よび自然には起こらないヒトによる操作を包含する翻訳
後の出来事の結果として、それらは分枝ありまたはなし
で環状であってもよい。同様に、非翻訳的天然プロセス
および全くの合成法によっても、環状、分枝および分枝
環状のポリペプチドが合成されてもよい。
【００４５】ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ
末端またはカルボキシル末端を包含する、ポリペプチド
のいずれの場所においても修飾が起こり得る。実際、ポ
リペプチド中のアミノまたはカルボキシル基、あるいは
それら両方の共有結合の修飾によるブロックは、一般に
天然および合成ポリペプチドにおいて起こるものであ
り、同様にかかる修飾が本発明ポリペプチド中に存在し
てもよい。例えば、タンパク質分解プロセッシングの前
にE.coliにおいて作られるポリペプチドのアミノ末端残
基は、ほとんど例外なくＮ−ホルミルメチオニンであ
る。
【００４６】ポリペプチドにおいて生じる修飾は、しば
しば、それがいかにして作られるのかということに関係
しているであろう。例えば、宿主中でクローン化された
遺伝子を発現することにより作られるポリペプチドに関
して、修飾の性質および程度の大部分は、宿主細胞での
翻訳後修飾能およびポリペプチドのアミノ酸配列に存在
する修飾シグナルによって決定されるであろう。例え
ば、よく知られているように、グリコシレーションは、
しばしばE.coliのごとき細菌宿主では起こらない。従っ
て、グリコシレーションが所望される場合には、ポリペ
プチドを、グリコシレーションする宿主、一般には真核
細胞中で発現させるべきである。昆虫細胞は、しばしば
哺乳動物と同じ翻訳後グリコシレーションを行うので、
昆虫細胞発現系は、特に元来のグリコシレーションパタ
ーンを有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現するた
めに開発された。
【００４７】同じタイプの修飾が、一定のポリペプチド
においていくつかの部位において同じまたは様々な程度
に存在してもよいことが理解されよう。また、一定のポ
リペプチドは多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。
一般的には本明細書の用語ポリペプチドはかかる修飾す
べてを包含し、詳細には、宿主細胞中でポリヌクレオチ
ドを発現させることにより合成されるポリペプチド中に
存在する修飾を包含する。
【００４８】本明細書の用語、ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドの変種とは、各々もとのポリヌクレオチド
またはポリペプチドとは異なる、ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドをいう。この意味における変種は、本開
示の以下の部分およびいずれかの部分においてより詳細
に説明される。
【００４９】（１）もう一つのもの、即ち、もとのポリ
ヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なるポリヌクレ
オチド。一般に、相違は、もとのヌクレオチド配列と変
種ヌクレオチド配列が全体的に極めて類似し、多くの領
域において同一であるようなものに限られる。
【００５０】下記のごとく、変種におけるヌクレオチド
配列の変化がサイレントであってもよい。すなわち、そ
れらは、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸
を変化させなくてもよい。変化がこのタイプのサイレン
ト変化に限定される場合、変種はもとのポリペプチドと
同じアミノ酸配列をコードしているであろう。また、下
記のごとく、変種のヌクレオチド配列における変化が、
もとのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列を変化させたものであってもよい。下
記のごとく、かかるヌクレオチド変化は、結果としても
との配列によりコードされるポリペプチド中のアミノ酸
置換、付加、欠失、融合および切断を引き起こしてもよ
い。
【００５１】（２）もう一つのもの、即ち、もとのポリ
ペプチドとはアミノ酸配列が異なるポリペプチド。一般
に、相違は、もとのアミノ酸配列と変種アミノ酸配列が
全体的に極めて類似し、多くの領域において同一である
ようなものに限られる。変種およびもとのポリペプチド
とは、１個またはそれ以上の置換、付加、欠失、融合お
よび切断によりアミノ酸配列が異なっていてもよく、そ
れらはいずれの組み合わせにおいて存在してもよい。
【００５２】本明細書の用語、受容体分子とは、本発明
のＲＥＱＵＩＥＭポリペプチドと特異的に結合または相
互作用する分子をいい、古典的受容体のみを包含するの
ではなく、好ましくは、本発明ポリペプチドと特異的に
結合または相互作用する他の分子も包含する（それらを
それぞれ「結合分子」および「相互作用分子」、「ＲＥ
ＱＵＩＥＭ結合分子」および「ＲＥＱＵＩＥＭ相互作用
分子」といってもよい）。本発明ポリペプチドと受容
体、または、結合もしくは相互作用分子を包含するかか
る分子との間の結合は、非常に高度に好ましくは、本発
明ポリペプチドに対して独占的であってもよく、あるい
は非常に好ましくは、本発明ポリペプチドに高度に特異
的であってもよく、好ましくは、本発明ポリペプチドを
包含するタンパク質のグループに非常に特異的であって
もよく、または、本発明ポリペプチドがその一つに含ま
れる、いくつかのタンパク質のグループに特異的であっ
てもよい。
【００５３】また、受容体は、本発明ポリペプチドに特
異的に結合する抗体および抗体由来物質のごとき非天然
のものであってもよい。
【００５４】
【発明の実施の形態】本発明は、新規ＲＥＱＵＩＥＭポ
リペプチドおよびポリヌクレオチド、特に以下に詳細に
記載するものに関する。詳細には、本発明は、新規ヒト
・ＲＥＱＵＩＥＭのポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドに関し、それはマウス・レクイエムポリペプチドに相
同的アミノ酸配列により関係している。本発明は、特
に、図１ないし３に示すヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を有するＲＥＱＵＩＥＭに関する。図１ないし３
に示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ヒト・
小脳から作られたヒト・ｃＤＮＡライブラリーから得ら
れたｃＤＮＡの配列決定を行うことにより得られたこと
が理解されるであろう。
【００５５】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図１ないし３の推定アミ
ノ酸配列を有するＲＥＱＵＩＥＭポリペプチドをコード
する単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明のもう一
つの態様によれば、図１ないし３の推定アミノ酸配列を
有するＲＥＱＵＩＥＭポリペプチドをコードする単離ポ
リヌクレオチドを提供する。
【００５６】図１ないし３に示すポリヌクレオチドプラ
イマー配列のごとき本明細書の情報を用いて、毛細血管
内皮組織由来の細胞を出発物質として得られるｍＲＮＡ
を用いるｃＤＮＡクローニングのための方法のごとき、
標準的クローニングおよびスクリーニング法を用いて、
ヒト・ＲＥＱＵＩＥＭポリペプチドをコードしている本
発明ポリヌクレオチドを得ることができる。本発明の説
明として、本発明ポリヌクレオチドは実施例１において
記載されるごとく発見された。ＲＥＱＵＩＥＭは、他の
組織およびｃＤＮＡライブラリー、例えば、ヒトの組織
の細胞、および、内皮細胞およびＣＥＭ細胞のごとき細
胞系由来のライブラリーからも得ることができる。
【００５７】本発明ヒト・ＲＥＱＵＩＥＭは、図１ない
し３のヒト・ＲＥＱＵＩＥＭをコードするｃＤＮＡの配
列決定を行った結果によって示されるごとく、レクイエ
ムファミリーの他のタンパク質と構造的に関係してい
る。実施例１に示されるプライマーを用いて作られたｃ
ＤＮＡが、実施例１に記載されるごとく得られた。図１
ないし３のポリペプチドは、推定で約４５ｋＤａの分子
量を有するタンパク質である。
【００５８】本発明ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡのご
ときＲＮＡの形態であってもよく、または、例えばクロ
ーニングまたは化学合成法またはそれらの組み合わせに
より得られるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを包含するＤ
ＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは２本鎖または１本
鎖であってよい。１本鎖ＤＮＡはセンス鎖としても知ら
れる、コーディング鎖であってもよく、または、アンチ
−センス鎖としても知られる、非コーディング鎖であっ
てもよい。
【００５９】ポリペプチドをコードしているコーディン
グ鎖は、図１ないし３のポリヌクレオチドのコーディン
グ鎖と同じであってもよい。コーディング鎖は、別の配
列を有するポリヌクレオチドであってもよく、それは、
遺伝コードの重複（縮重）の結果として図１ないし３の
ＤＮＡのポリペプチドをコードしているものであっても
よい。
【００６０】図１ないし３のポリペプチドをコードして
いる本発明ポリヌクレオチドは、それにより示される成
熟ポリペプチドに関するコーディング配列；成熟ポリペ
プチドのコーディング配列、および、プレ−またはプロ
−またはプレプロ−タンパク質配列のごとき、リーダー
配列または分泌配列をコードするごとき、付加的コーデ
ィング配列；例えば、転写、スプライシングおよびポリ
アデニル化シグナルを包含するｍＲＮＡプロセッシン
グ、例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡ安定性にお
いて役割を果たす、転写されるが翻訳されない、イント
ロンおよび非コーディング５’および３’配列を包含す
るが、これに限定されない付加的、非コーディング配列
を有する、前述の付加的コーディング配列ありまたはな
しの成熟ポリペプチドのコーディング配列；付加的官能
基を提供するごとき付加的アミノ酸をコードしている付
加的コーディング配列、を包含してもよいが、これに限
定されない。自己触媒的または他の酵素によって、２つ
のサブユニットを作るように前駆体分子からもプロセッ
シングにより成熟ＲＥＱＵＩＥＭが提供され、それは、
活性ヘテロ２量体（両サブユニット）または４量体（２
セットのヘテロ２量体）を形成する。かくして、例え
ば、ポリペプチドが、融合ポリペプチドの精製を促進す
る、ペプチドのごときマーカー配列に融合していてもよ
い。本発明のこの態様のある好ましい具体例において、
マーカー配列は、特にｐＱＥベクター（Qiagen,Inc）中
のタグのごときヘキサヒスチジンペプチドであり、それ
らの多くが市販されている。例えば、Gentz et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA 86,821-824(1989)に記載のごと
く、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の精製を便利に
する。ＨＡタグはインフルエンザ・赤血球凝集素タンパ
ク質由来のエピトープに対応するものであり、例えば、
Wilson et al.,Cell 37:767(1984)に記載されている。
【００６１】上記によれば、本明細書の用語「ポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポ
リペプチド、詳細には、図１ないし３に示すアミノ酸配
列を有するヒト・ＲＥＱＵＩＥＭをコードしている配列
を含むポリヌクレオチドを包含する。該用語は、コーデ
ィングおよび／または非コーディング配列を含んでいて
もよい、さらなる領域を伴ったポリペプチド（例えば、
イントロンにより分断されている）をコードしている単
一の連続領域または不連続領域を含むポリヌクレオチド
を包含する。
【００６２】さらに本発明は、図１ないし３の推定アミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの断片、アナログおよび
誘導体をコードする、上記ポリヌクレオチドの変形に関
する。ポリヌクレオチドの変形は、天然に存在する対立
遺伝子変形のごとき天然に存在する変形であってもよ
く、あるいは、天然に存在することが知られていない変
形であってもよい。かかるポリヌクレオチドの非天然変
形を、ポリヌクレオチド、細胞または生物に適用される
突然変異法を包含する突然変異法により作成してもよ
い。
【００６３】この点における変形の中には、ヌクレオチ
ド置換、欠失または付加による前述のポリヌクレオチド
と異なる変形がある。置換、欠失または付加には１個ま
たはそれ以上のヌクレオチドが関与しているかもしれな
い。変形は、コーディング配列または非コーディング配
列あるいはそれらの両方において変化していてもよい。
コーディング配列の変化により、保存的または非保存的
アミノ酸置換、欠失または付加を生じてもよい。
【００６４】この点において本発明の特に好ましい具体
例は、図１ないし３に示すＲＥＱＵＩＥＭのアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
チド；その変形、アナログ、誘導体および断片、およ
び、その変形、アナログおよび誘導体の断片である。
【００６５】さらに、この点において、図１ないし３の
ＲＥＱＵＩＥＭポリペプチドのアミノ酸配列を有する、
ＲＥＱＵＩＥＭ変形、アナログ、誘導体および断片、な
らびに、その断片の変形、アナログおよび誘導体をコー
ドしているポリヌクレオチドが特に好ましく、該アミノ
酸中、いくつかの、少数の、５ないし１０個、１ないし
５個、１ないし３、２、１個または０個のアミノ酸残基
が置換、欠失または付加されており、あるいはそれらが
組み合わされている。これらのうち特に好ましいのは、
ＲＥＱＵＩＥＭの特性および活性を変化させない置換、
付加および欠失である。また、この点において、保存的
置換が特に好ましい。置換を有しない図１ないし３のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドが最も好ましい。
【００６６】本発明のさらに好ましい具体例は、図１な
いし３に示すアミノ酸配列を有するＲＥＱＵＩＥＭポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
とも７０％同一であるポリヌクレオチド、および、かか
るポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであ
る。あるいはまた、ヒト・ｃＤＮＡのＲＥＱＵＩＥＭポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少な
くとも８０％同一である領域を含んでなるポリヌクレオ
チド、および、それに相補的なポリヌクレオチドがもっ
とも高度に好ましい。この点において、同じポリペプチ
ドに対して少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチ
ドが特に好ましく、これらのうちでも特に好ましいの
は、少なくとも９５％同一のものである。さらに、少な
くとも９５％同一のものの中でも少なくとも９７％同一
のものが非常に好ましく、その中でも少なくとも９８％
同一のものおよび少なくとも９９％同一のものが特に非
常に好ましく、少なくとも９９％のものがより好まし
い。
【００６７】さらに、この点において特に好ましい具体
例は、図１ないし３のｃＤＮＡによりコードされる成熟
ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を
保持しているポリペプチドをコードしているポリヌクレ
オチドである。
【００６８】さらに本発明は、本明細書において上で述
べた配列とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチ
ドに関する。この点において本発明は、特に、厳密な条
件下で本明細書において上で述べた配列とハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチドに関する。本明細書の
用語「厳密な条件」とは、配列間に少なくとも９５％、
好ましくは少なくとも９７％同一性がある場合にのみハ
イブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００６９】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てさらに本明細書で議論するように、例えば、上記本発
明ポリヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用の
ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ＲＥＱ
ＵＩＥＭをコードしている完全長のｃＤＮＡおよびゲノ
ムクローンを単離、および、ヒト・ＲＥＱＵＩＥＭ遺伝
子に対して高度の配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤ
ＮＡおよびゲノムクローンを単離してもよい。一般的に
は、かかるプローブは少なくとも１５個の塩基を含んで
なるであろう。好ましくは、かかるプローブは少なくと
も３０個の塩基を有し、少なくとも５０個の塩基を有し
ていてもよい。特に好ましいプローブは少なくとも３０
個の塩基を有し、５０個またはそれ以下の塩基を有する
であろう。
【００７０】例えば、オリゴヌクレオチドプローブを合
成するための既知ＤＮＡ配列を用いた配列決定によっ
て、ＲＥＱＵＩＥＭ受容体遺伝子の暗号領域を単離する
ことができる。次いで、本発明遺伝子配列に相補的な配
列を有するラベルされたオリゴヌクレオチドを用いて、
ヒト・ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラ
リーをスクリーニングして、ライブラリーのどのメンバ
ーがプローブにハイブリダイゼーションするのかを決定
する。
【００７１】本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドを、特に、ポリヌクレオチドアッセイに関して本明細
書でさらに議論するごとく、ヒトの疾病の治療および診
断の発見のための研究試薬および材料として用いてもよ
い。
【００７２】ポリヌクレオチドは、当該成熟タンパク質
およびさらなるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ
酸、あるいは成熟ポリペプチドに対する内部アミノ酸
（例えば、成熟形態が１種よりも多いポリペプチド鎖を
有する場合）であるポリペプチドをコードしていてもよ
い。かかる配列は、前駆体から成熟形態へのタンパク質
のプロセッシングにおいて役割を果たしており、タンパ
ク質輸送を促進し、タンパク質半減期を延長または短縮
し、あるいは特に、アッセイまたは製造のためにタンパ
ク質の取り扱いを容易にするかもしれない。in situに
おける一般的な場合には、細胞酵素により、さらなるア
ミノ酸がプロセッシングにより成熟タンパク質から除去
されてもよい。
【００７３】１つまたはそれ以上のプロ配列に融合した
成熟形態のポリペプチドを有する前駆体タンパク質は、
そのポリペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配
列が除去されると、一般的にはかかる不活性前駆体が活
性化される。プロ配列のいくつかまたはすべてが活性化
前に除去されるかもしれない。一般的にはかかる前駆体
はプロタンパク質と呼ばれる。
【００７４】まとめると、本発明ポリヌクレオチドは、
成熟タンパク質、成熟タンパク質＋リーダー配列（プレ
タンパク質と呼んでもよい）、プレタンパク質のリーダ
ー配列でない１個またはそれ以上のプロ配列を有する成
熟タンパク質の前駆体、あるいは、一般にポリペプチド
の活性および成熟形態を生じるプロセッシング工程の間
に除去されるリーダー配列および１個またはそれ以上の
プロ配列を有する、プロタンパク質に対する前駆体であ
るプレプロタンパク質をコードしていてもよい。
【００７５】ポリペプチド さらに、本発明は、図１ないし３の推定アミノ酸配列を
有するヒトＲＥＱＵＩＥＭポリペプチドに関する。
【００７６】本発明は、これらのポリペプチドの断片、
アナログおよび誘導体にも関する。「断片」、「誘導
体」および「アナログ」なる用語は、図１ないし３のポ
リペプチドについていう場合、かかるポリペプチドと本
質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリ
ペプチドを意味する。かくして、アナログは、プロタン
パク質部分の開裂により活性化されて活性成熟ポリペプ
チドを生じうるプロタンパク質を包含する。
【００７７】本発明ポリペプチドは、組換えポリペプチ
ド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであって
もよい。特定の好ましい具体例において、本発明ポリペ
プチドは組換えポリペプチドである。
【００７８】図１ないし３のポリペプチドの断片、誘導
体またはアナログは、（ｉ）１個またはそれ以上のアミ
ノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好まし
くは、保存的アミノ酸残基）で置換されており、かかる
置換アミノ酸残基は遺伝コードによりコードされている
ものであっても、なくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）
１個またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むも
の、あるいは（ｉｉｉ）ポリペプチドの半減期を延長さ
せる化合物のごときもう一つの化合物に成熟ポリペプチ
ドが融合しているもの、あるいは（ｉｖ）リーダーまた
は分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に用いられ
る配列、またはプロタンパク質配列のごとき、さらなる
アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであっ
てもよい。かかる断片、誘導体およびアナログは、本明
細書の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【００７９】この点において、図１ないし３に示すＲＥ
ＱＵＩＥＭのアミノ酸配列を有するポリペプチド、その
変形、アナログ、誘導体および断片、ならびに該断片の
変形、アナログおよび誘導体は、本発明の特に好ましい
具体例に属する。あるいはまた、この点において、本発
明の特に好ましい具体例は、ＲＥＱＵＩＥＭのアミノ酸
配列を有するポリペプチド、その変形、アナログ、誘導
体および断片、ならびに該断片の変形、アナログおよび
誘導体である。
【００８０】保存的アミノ酸置換によって元のものから
変化した変形も好ましい変形に属する。かかる置換は、
ポリペプチド中のあるアミノ酸を同様の特性の別のアミ
ノ酸で置換したものである。保存的置換として典型的に
見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
およびＩｌｅ間での相互置換；水酸基を有するＳｅｒお
よびＴｈｒの相互置換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの
相互置換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩
基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの置換、ならびに芳香族残
基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間の置換である。
【００８１】さらに、この点において特に好ましいの
は、いくつかの、少数の、５ないし１０個の、１ないし
５個の、１ないし３、２、１個の、または０個のアミノ
酸残基が置換、欠失または付加されているか、それらの
いずれかの組み合わせを有する、図１ないし３のＲＥＱ
ＵＩＥＭポリペプチドのアミノ酸配列を有する変形、ア
ナログ、誘導体および断片、ならびに該断片の変形、ア
ナログおよび誘導体である。ＲＥＱＵＩＥＭの性質およ
び活性を変化させない置換、付加および欠失がこれらの
うちで特に好ましい。またこの点において、保存的置換
が特に好ましい。もっとも高度に好ましいのは、置換の
ない図１ないし３のアミノ酸配列を有するポリペプチド
である。
【００８２】好ましくは、本発明ポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドは単離形態で提供され、好ましくは均一
に精製されている。本発明ポリペプチドは、図１ないし
３のポリペプチド（詳細には成熟ポリペプチド）同様に
図１ないし３のポリペプチドに対して少なくとも８０％
同一性を有し、より好ましくは図１ないし３のポリペプ
チドに対して少なくとも９０％の類似性（より好ましく
は少なくとも９０％の同一性）を有し、さらにより好ま
しくは図１ないし３のポリペプチドに対して少なくとも
９５％の類似性（より好ましくは少なくとも９５％の同
一性）を有するポリペプチドを包含し、また、一般に少
なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも
５０個のアミノ酸を含むかかるポリペプチドの部分を有
するかかるポリペプチドの部分も包含する。
【００８３】本発明ポリペプチドの断片または部分を、
ペプチド合成による対応する完全長のポリペプチドの合
成に使用してもよく；従って、断片を完全長のポリペプ
チドの製造のための中間体として使用してもよい。本発
明ポリヌクレオチドの断片または部分を用いて本発明の
完全長のポリヌクレオチドを合成してもよい。
【００８４】断片 ＲＥＱＵＩＥＭの断片、最も詳細には図１ないし３に示
すアミノ酸配列を有するＲＥＱＵＩＥＭの断片を含んで
なるポリペプチド、および、図１ないし３のＲＥＱＵＩ
ＥＭの変形および誘導体の断片を含んでなるポリペプチ
ドも、本発明のこの態様の好ましい具体例に含まれる。
【００８５】この点において、断片は、上記ＲＥＱＵＩ
ＥＭポリペプチドおよびその変形または誘導体のアミノ
酸配列の一部であって全部ではないものと完全に同じア
ミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００８６】かかる断片は、「フリー−スタンディング
（free-standing）」、すなわち、他のアミノ酸または
ポリペプチドの一部でなく、または、それらに融合して
おらず、あるいは、かかる断片が大きなポリペプチド中
に含まれていてその一部分または領域となっていてもよ
い。大きなポリペプチド中に含まれている場合、現在議
論中の断片は、最も好ましくは単一の連続した領域を形
成する。しかしながら、いくつかの断片が、単一のより
大きなポリペプチド中に含まれていてもよい。例えば、
特定の好ましい具体例は、宿主中での発現のためにデザ
インされた前駆体ポリペプチド中に含まれていて、ＲＥ
ＱＵＩＥＭ断片のアミノ末端に融合した異種プレおよび
プロ−ポリペプチド領域、および、該断片のカルボキシ
ル末端に融合したさらなる領域を有している、本発明Ｒ
ＥＱＵＩＥＭポリペプチド断片に関する。従って、本明
細書における意味の１つの態様において、断片は、ＲＥ
ＱＵＩＥＭ由来の融合ポリペプチドまたは融合タンパク
質の一部または部分をいう。
【００８７】本発明ポリペプチド断片の典型例として、
長さが約５ないし１５個、１０ないし２０個、１５ない
し４０個、３０ないし５５個、４１ないし６５個、４１
ないし８０個、４１ないし９０個、５０ないし１００
個、７５ないし１００個、９０ないし１１５個、１００
ないし１２５個、および１１０ないし１１３個のアミノ
酸のものを挙げることができる。
【００８８】本明細書中、約とは、特に列挙した範囲、
ならびに数個、少数、５、４、３、２、１個のアミノ酸
の分だけ大きいまたは小さい範囲であって、上限または
下限、あるいはそれらの両方の範囲を包含する。例え
ば、本明細書中、約４０ないし９０個のアミノ酸は、４
０プラスマイナス数個、少数、５、４、３、２、１個の
アミノ酸残基から、９０プラスマイナス数個、少数、
５、４、３、２、１個のアミノ酸残基までのポリペプチ
ド断片を意味し、すなわち、広くは４０マイナス数個の
アミノ酸から９０プラス数個のアミノ酸、狭くは４０プ
ラス数個のアミノ酸から９０マイナス数個のアミノ酸の
範囲である。
【００８９】この点において、高度に好ましくは、上限
または下限、あるいはそれらの両方の範囲において、列
挙した範囲プラスまたはマイナス５個程度のアミノ酸で
ある。上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲に
おいて、列挙した範囲プラスまたはマイナス３個程度の
アミノ酸が特に非常に好ましい。上限または下限、ある
いはそれらの両方の範囲において、列挙した範囲プラス
またはマイナス１個程度のアミノ酸、または列挙した範
囲に付加または欠失のないものが特に非常に好ましい。
この点において、約５ないし１５個、１０ないし２０
個、１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし
６５個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０な
いし１００個、７５ないし１００個、９０ないし１１５
個、１００ないし１２５個、および１１０ないし１１３
個のアミノ酸の長さの断片が、すべてのうちで最も好ま
しい。
【００９０】ＲＥＱＵＩＥＭの切断された変異種は本発
明の特に好ましい断片に含まれる。切断された変異種
は、図１ないし３のアミノ酸配列を有するＲＥＱＵＩＥ
Ｍポリペプチド、または、その変形または誘導体を包含
するが、アミノ末端を含む連続した一連の残基（すなわ
ち、連続した領域、部分または一部分）の欠失、また
は、カルボキシル末端を含む連続した一連の残基の欠
失、あるいは、１つはアミノ末端を含み、もう１つはカ
ルボキシル末端を含む、二重切断変異種中にあるような
２つの連続した残基の欠失は除く。おおよそ示したサイ
ズ範囲の断片も切断された断片の好ましい具体例であ
り、一般に、それらは断片のなかでも特に好ましいもの
である。
【００９１】本発明のこの態様において、ＲＥＱＵＩＥ
Ｍの構造的または機能的属性によって特徴づけられる断
片も好ましい。この点において本発明の好ましい具体例
は、ＲＥＱＵＩＥＭのアルファ−ヘリックスおよびアル
ファ−ヘリックス形成領域（「アルファ−領域」）、ベ
ータ−シートおよびベータ−シート形成領域（「ベータ
−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領
域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル−領
域」）、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領
域、ベータ両親媒性領域、可動性領域、表面形成領域お
よび高抗原性インデックス領域を含んでなる断片を包含
する。
【００９２】これらの点において、上に示すいくつかの
特徴のごとき、いくつかの構造的特徴を組み合わせたＲ
ＥＱＵＩＥＭの領域を含んでなる断片が高度に好まし
い。この点において、図１ないし３の約１０ないし約２
０個、約４０ないし約５０個、約７０ないし約９０個、
および約１１０ないし約１１３個の残基によって定義さ
れる領域が特に高度に好ましい領域であり、それらはす
べて、ターン領域、親水性領域、可動性領域、表面形成
領域および高抗原性インデックス領域の高度に特徴的な
アミノ酸組成物によって特徴づけられる。かかる領域は
大きなポリペプチド中に含まれていてもよく、あるいは
上記のごとくそれら自体本発明の好ましい断片でありう
る。この段落の用語「約」は、一般的な断片に関して上
で説明した意味を有することが理解されよう。
【００９３】さらに好ましい領域はＲＥＱＵＩＥＭの活
性を媒介する領域である。この点において、ＲＥＱＵＩ
ＥＭの化学的、生物学的活性または他の活性を有し、類
似活性または改善された活性を包含、望ましくない活性
は減じられている断片が最も好ましい。この点におい
て、マウス・レクイエムポリペプチドを包含する、図４
に示す関連ポリペプチドのごとき関連ポリペプチドの活
性領域に対して配列または位置、あるいは両方が相同的
である領域を含む断片が非常に好ましい。これらの点に
おいて、上記の切断された変異種は特に好ましい断片に
含まれる。
【００９４】さらに本発明は、特に、上記断片をコード
しているポリヌクレオチド、該断片をコードしているポ
リヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌク
レオチド、詳細には厳密な条件下でハイブリダイゼーシ
ョンするもの、および該断片をコードしているポリペプ
チドを増幅するためのＰＣＲプライマーのごときポリヌ
クレオチドにも関することが理解されよう。これらの点
において、好ましいポリヌクレオチドは、上記のような
好ましい断片に対応するポリヌクレオチドである。好ま
しいポリヌクレオチド断片は、図１ないし３の配列由来
であってもよい。
【００９５】ベクター、宿主細胞、発現 本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクター、本
発明ベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞および
組換え法による本発明ポリペプチドの製造にも関する。
【００９６】宿主細胞を遺伝子操作して、ポリヌクレオ
チドを取り込ませ、本発明ポリペプチドを発現させるこ
とができる。例えば、感染、形質導入、トランスフェク
ション、トランスベクションおよび形質転換といったよ
く知られた方法を用いて、ポリヌクレオチドを宿主細胞
中に導入してもよい。ポリヌクレオチドを単独または他
のポリヌクレオチドとともに導入してもよい。かかる他
のポリヌクレオチドを本発明ポリヌクレオチドとは別個
に、同時に、あるいは本発明ポリヌクレオチドと結合さ
せて導入してもよい。
【００９７】かくして、例えば、哺乳動物細胞において
同時トランスフェクションおよび選択のための標準的方
法を用いて、例えば、本発明ポリヌクレオチドを選択可
能マーカーをコードしているもう１つの別個のポリペプ
チドとともに宿主細胞中にトランスフェクションしても
よい。この場合、一般に、ポリヌクレオチドは宿主細胞
ゲノム中に安定に取り込まれるであろう。
【００９８】別法として、宿主中での増殖についての選
択可能マーカーを含むベクターにポリヌクレオチドを結
合させてもよい。上記方法により、ベクター構築物を宿
主細胞中に導入してもよい。一般に、プラスミドベクタ
ーは、リン酸カルシウム沈殿のごとき沈殿中、あるいは
荷電脂質との複合体中のＤＮＡとして導入される。エレ
クトロポレーションを用いてポリヌクレオチドを宿主に
導入してもよい。ベクターがウイルスである場合、それ
をインビトロでパッケージングし、または、パッケージ
ング細胞中に導入することができ、パッケージングされ
たウイルスを細胞中に導入し、パッケージングされたウ
イルスを細胞中に形質導入してもよい。本発明のこの態
様によるポリヌクレオチドの製造および細胞中へのポリ
ヌクレオチドの導入に適した広範囲の方法は、当業者に
よく知られており、日常的なものである。かかる方法
は、上記Sambrook et al.において総説してあり、その
文献はこれらの方法を詳述する多くの研究室マニュアル
の説明である。
【００９９】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えばプラスミドベクター、１本鎖または２本鎖のファ
ージベクター、１本鎖または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮ
Ａウイルスベクターであってもよい。かかるベクター
は、細胞中へのＤＮＡおよびＲＮＡ導入のためのよく知
られた方法によって、ポリヌクレオチドとして、好まし
くはＤＮＡとして細胞中に導入してもよい。ファージお
よびウイルスベクターの場合、感染および形質導入のた
めのよく知られた方法によって、ベクターを、好ましく
はパッケージングされ、または、封入されたウイルスと
して細胞中に導入してもよい。ウイルスベクターは複製
可能であってもよく、複製欠損であってもよい。後者の
場合、一般に、ウイルス増殖は相補的宿主細胞において
のみ起こるであろう。
【０１００】特定の態様において、本発明ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの発現用ベクターが好ましい。
一般に、かかるベクターは、発現されるべきポリヌクレ
オチドに作動可能に連結された宿主中での発現に効果的
なシス−作用性制御領域を含んでなる。適当なトランス
−作用性因子は、宿主、または、相補的ベクター、また
は、宿主中への導入によりベクター自身のいずれかによ
って提供される。
【０１０１】この点において、特定の好ましい具体例に
おいて、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異
的発現は誘導可能な発現であってもよく、またはある種
のタイプの細胞においてのみ起こる発現であってもよ
く、または誘導可能および細胞特異的の両方であっても
よい。温度および栄養添加物のごとき操作容易な環境因
子によって発現のために誘導されうるベクターが、特に
好ましい誘導可能ベクターである。原核細胞および真核
細胞宿主において使用される構成的発現ベクターおよび
誘導可能発現ベクターを包含する、本発明のこの態様に
適した種々のベクターは当業者によく知られており、日
常的に使用されている。
【０１０２】遺伝子操作された宿主細胞を慣用的な栄養
培地で培養することができ、特にプロモーターの活性
化、形質転換体の選択または遺伝子の増幅に関して、適
宜、培地を修飾してもよい。発現用に選択された宿主細
胞と共にあらかじめ使用される温度、ｐＨ等の培養条件
は、一般に、当業者に明らかであるように、本発明ポリ
ペプチドの発現に適するであろう。
【０１０３】非常に多種にわたる発現ベクターを用い
て、本発明ポリペプチドを発現させることができる。か
かるベクターは、染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリ
オファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体エレ
メント由来のベクター、バキュロウイルスのごときウイ
ルス、類人猿ウイルス４０（「ＳＶ４０」）のごときパ
ポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイル
ス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよ
びレトロウイルス、ならびに、コスミドおよびファージ
ミドのごときプラスミドおよびバクテリオファージの遺
伝エレメント由来のベクターのごときそれらの組み合わ
せ由来のベクターを包含し、それらすべてを本発明のこ
の態様による発現に使用してもよい。この点において、
一般に、宿主中でポリペプチドを発現するためのポリヌ
クレオチドを維持、増殖または発現するのに適したベク
ターを発現に用いることができる。
【０１０４】種々のよく知られた日常的方法のいずれに
よっても、適当なＤＮＡ配列をベクター中に挿入するこ
とができる。一般に、ＤＮＡ配列および発現ベクターを
１種またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで開裂さ
せ、次いで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて制限断片を
結合させることにより、発現させるＤＮＡ配列を発現ベ
クターに結合させる。この目的に用いることのできる制
限的開裂および連結の手順は当業者によく知られてお
り、日常的なものである。この点において、別法を用い
る発現ベクターの構築のための適当な手順も当業者によ
く知られており、日常的なものであり、本明細書の他の
場所で引用しているSambrook et al.の文献に非常に詳
細に説明されている。
【０１０５】発現ベクター中のＤＮＡ配列を、例えば、
ｍＲＮＡ転写を指令するプロモーターを包含する、適当
な発現制御配列に作動可能に連結する。かかるプロモー
ターの典型例は、ファージラムダＰＬプロモーター、E.
coli lac、trpおよびtacプロモーター、ＳＶ４０初期お
よび後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲｓ
のプロモーターを包含するが、それらはよく知られてい
るプロモーターのほんの例示に過ぎない。ここで述べな
かった多くのプロモーターも本発明のこの態様における
使用に適し、それらは当業者によく知られており、本明
細書の議論および実施例によって説明されるようにして
容易に使用されうることが理解されるであろう。
【０１０６】一般に、発現構築物は、転写開始部位およ
び停止部位、および、転写領域に翻訳のためのリボソー
ム結合部位を含むであろう。構築物により発現される成
熟転写物の暗号部分は、翻訳されるべきポリペプチドの
初めの部分に翻訳開始ＡＵＧを、さらに終わりの部分に
適当に位置している終止コドンを含むであろう。
【０１０７】さらに、構築物は、発現を調節ならびに発
生させる制御領域を含んでいてもよい。一般に、多くの
通常行われる手順によれば、かかる領域は、特に、リプ
レッサー結合部位およびエンハンサーのごとき転写調節
により作動するであろう。
【０１０８】一般に、増殖および発現のためのベクター
は選択可能マーカーを含むであろう。かかるマーカーも
増幅に適していてもよく、または、そのベクターはこの
目的のためにさらなるマーカーを含んでいてもよい。こ
の点において、好ましくは、発現ベクターは１個または
それ以上の選択可能マーカー遺伝子を有しており、形質
転換された宿主細胞の選択のための表現型の特徴を提供
するものである。好ましいマーカーは、真核培養細胞用
のジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、
E.coliおよび他の細菌培養用のテトラサイクリンまたは
アンピシリン耐性遺伝子を包含する。
【０１０９】所望ポリペプチドの宿主中での発現に適し
た種々の既知方法を用いて、上記のどこかに記載したご
とき、適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプロモーター、
さらに他の適当な制御配列を含むベクターを適当な宿主
中に導入してもよい。適当な宿主の代表例は、E.coli、
StreptomycesおよびSalmonella typhimurium細胞のごと
き細菌細胞；酵母細胞のごとき真菌細胞；Drosophila S
2およびSpodoptera Sf9細胞のごとき昆虫細胞；ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳおよびBowesメラノーマ細胞のごとき動物細
胞；ならびに植物細胞を包含する。多種の発現構築物用
宿主がよく知られており、当業者は本開示により本発明
のこの態様によるポリペプチドの発現のための宿主を容
易に選択することができよう。
【０１１０】より詳細には、本発明は、発現構築物のご
とき組み換え構築物も包含し、それらは１種またはそれ
以上の上記配列を含んでなる。構築物は、本発明のかか
る配列が挿入されたプラスミドまたはウイルスベクター
のごときベクターを含んでなる。その配列を順方向また
は逆方向に挿入することができる。この点において、特
定の好ましい具体例において、構築物はさらに、例え
ば、該配列に作動可能に連結されたプロモーターを包含
する調節配列を含んでなる。多数の適当なベクターおよ
びプロモーターが当業者に知られており、本発明におけ
る使用に適した多くのベクターが市販されている。
【０１１１】市販されている下記ベクターを例示する。
それらのうち、細菌での使用に適するベクターは、Qiag
enから市販されている、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０および
ｐＱＥ−９；Stratageneから市販されている、ｐＢＳベ
クター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、
ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６
Ａ；ならびに、Pharmaciaから市販されている、ｐｔｒ
ｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤ
Ｒ５４０、ｐＲＩＴ５である。好ましい真核細胞ベクタ
ーには、Stratageneから市販のｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２
ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならび
に、Pharmaciaから市販のｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭ
ＳＧおよびｐＳＶＬがある。これらのベクターは、多く
の市販ベクター、および、本発明のこの態様により使用
するために当業者によく知られたベクターを例示するた
めにのみ列挙する。例えば、宿主中における本発明ポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖ま
たは発現に適する他のプラスミドまたはベクターを本発
明のこの態様に使用してもよいことが理解されよう。
【０１１２】制限部位、または、候補プロモーター断
片；すなわち、プロモーターを含み得る断片を導入する
ための部位の下流の、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写ユニットのごとき、プ
ロモーター領域を欠くレポーター転写ユニットを含むベ
クターを用いて、プロモーター領域をいずれの所望遺伝
子からも選択できる。よく知られているごとく、プロモ
ーター含有断片をベクター中のｃａｔ遺伝子上流の制限
部位へ導入することにより、ＣＡＴ活性を生じさせ、そ
れを標準的ＣＡＴアッセイにより検出することができ
る。この目的に適するベクターはよく知られており、容
易に入手できる。２種のかかるベクターはｐＫＫ２３２
−８およびｐＣＭ７である。かくして、本発明ポリヌク
レオチドの発現用のプロモーターはよく知られていて容
易に入手できるプロモーターだけでなく、レポーター遺
伝子を用いて上記方法により容易に得ることのできるプ
ロモーターも包含する。
【０１１３】E.coli lacIおよびlacZプロモーターおよ
びT3およびT7プロモーター、gptプロモーター、ラムダP
R、PLプロモーター、ならびにtrpプロモーターは、本発
明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に
適した既知細菌プロモーターに属する。
【０１１４】この点において適する知られている真核細
胞プロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
即時初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモ
ーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、例えば
Rousサルコーマウイルス（ＲＳＶ）のごときレトロウイ
ルスＬＴＲｓのプロモーター、ならびにマウス・メタロ
チオネイン−Ｉプロモーターのごときメタロチオネイン
プロモーターがある。
【０１１５】宿主細胞中での発現に適するベクターおよ
びプロモーターの選択はよく知られた手順であり、発現
ベクターの構築、宿主中へのベクターの導入および宿主
における発現に関する精妙な方法は、当業者にとり日常
的なものである。本発明は、上記構築物を含む宿主細胞
にも関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のごとき高等真
核細胞、または、酵母細胞のごとき下等真核細胞であっ
てもよく、また、宿主細胞は細菌細胞のごとき原核細胞
であってもよい。
【０１１６】リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェ
クション、カチオン性脂質により媒介されるトランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、トランスダクシ
ョン、感染または他の方法により、宿主細胞中への構築
物の導入を行うことができる。かかる方法は多くの標準
的研究室マニュアル、例えばDavis et al.BASIC METHOD
S IN MOLECULAR BIOLOGY,(1986)に記載されている。
【０１１７】宿主中の構築物を慣用的方法で使用して、
組換え配列によりコードされた遺伝子産物を得ることが
できる。別法として、慣用的ペプチド合成装置により本
発明ポリペプチドを合成的に得ることもできる。
【０１１８】適当なプロモーターの制御下で、哺乳動物
細胞、酵母、細菌、または他の細胞において成熟蛋白を
発現させることができる。本発明ＤＮＡ構築物由来のＲ
ＮＡを用いて、かかる蛋白を得るために無細胞翻訳系を
用いることもできる。原核宿主および真核宿主とともに
使用に適するクローニングおよび発現ベクターは、上で
引用したSambrook et al.により記載されている。
【０１１９】一般に、組換え発現ベクターは、複製開始
点、下流構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来の
プロモーター、およびベクターに曝露した後のベクター
含有細胞の単離を可能にする選択可能マーカーを含むで
あろう。特に、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧ
Ｋ）のごとき糖分解酵素、ａ−ファクター、酸ホスファ
ターゼ、および熱ショックタンパク質をコードしている
遺伝子由来のプロモーターが適当なプロモーターであ
る。選択可能マーカーは、E.coliのアンピシリン耐性遺
伝子およびS.cerevisiaeのｔｒｐ１遺伝子を包含する。
【０１２０】ベクター中にエンハンサー配列を挿入する
ことにより、高等真核細胞による本発明ポリペプチドを
コードしているＤＮＡの転写を増大させることができ
る。エンハンサーは、普通、約１０ないし３００ｂｐの
ＤＮＡのシス−作用性エレメントであり、特定の宿主細
胞タイプにおけるプロモーターの転写活性を増大するよ
うに作用する。エンハンサーの例は、複製開始点の後期
側１００ないし２７０ｂｐに位置するＳＶ４０エンハン
サー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハン
サー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサ
ー、ならびにアデノウイルスエンハンサーを包含する。
【０１２１】一般に、本発明ポリペプチドの異種構造配
列をコードしている本発明ポリヌクレオチドを、発現用
プロモーターに作動可能に連結されるように標準的方法
を用いてベクター中に挿入する。転写開始部位がリボソ
ーム結合部位の５’付近に位置するようにポリヌクレオ
チドを配置する。リボソーム結合部位は、発現されるポ
リペプチドの翻訳を開始するＡＵＧの５’にある。一般
に、通常、ＡＵＧである開始コドンから始まる読み枠、
および、リボソーム結合部位と開始ＡＵＧとの間に位置
する読み枠は存在しないであろう。また、一般に、ポリ
ペプチド末端に翻訳終止コドンが存在し、転写される領
域の３’末端に適当に散在するポリアデニレーションシ
グナルおよび転写終止シグナルが存在するであろう。
【０１２２】翻訳されたタンパク質の小胞体ルーメン
中、ペリプラスム空間中または細胞外環境中への分泌の
ために、適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチド
中に取り込ませることができる。シグナルは、ポリペプ
チドに対して内在性のものであってもよく、あるいは異
種シグナルであってもよい。
【０１２３】ポリペプチドを、融合タンパク質のごとき
修飾形態で発現させてもよく、それは分泌シグナルのみ
ならずさらなる異種機能領域を含んでいてもよい。かく
して、例えば、さらなるアミノ酸の領域、詳細には荷電
アミノ酸の領域をポリペプチドのＮ末端に付加して、宿
主細胞において、精製中またはさらなる取り扱いおよび
保存中の安定性および維持を改善してもよい。また、精
製を容易にする領域をポリペプチド付加してもよい。最
終的なポリペプチドの調製の前にかかる領域を除去して
もよい。特に、分泌または外分泌を引き起こすための、
安定性を改善するための、そして精製を容易にするため
のペプチド部分のポリペプチドへの付加は当業者によく
知られている日常的方法である。
【０１２４】本発明によるポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの増殖、維持または発現に適した原核宿主は、
Escherichia coli、Bacillus subtilisおよびSalmonell
a typhimuriumを包含する。Pseudomonas、Streptomyces
およびStaphylococcusの種々の種は、この点において適
当な宿主である。さらに、この点において、当業者に知
られている他の多くの宿主も使用可能である。
【０１２５】典型的であるが限定的でない例として、細
菌用途の有用な発現ベクターは、選択可能マーカー、お
よび、よく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２
（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝学的エレメントを含んで
なる市販プラスミド由来の細菌の複製開始点を含んでな
る。かかる市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３
（Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden）および
ＧＥＭ１（Promega Biotec,Madison,WI,USA）を包含す
る。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分を適当なプロモ
ーターおよび発現すべき構造配列と結合する。
【０１２６】適当な宿主株の形質転換および適当な細胞
密度までの宿主株の増殖の後、選択したプロモーターが
誘導可能である場合には、適当な手段（例えば、温度シ
フトまたは化学誘導剤に曝露）によりそれを誘導し、さ
らに適当時間細胞を培養する。
【０１２７】次いで、典型的には、細胞を遠心分離によ
り集め、物理的または化学的手段により破壊し、得られ
た粗抽出物をさらなる精製に供する。凍結−融解繰り返
し、ソニケーション、機械的破壊を包含する慣用的方
法、または細胞溶解剤の使用により、タンパク質発現に
使用する微生物細胞を破壊することができ、かかる方法
は当業者によく知られている。
【０１２８】同様に、種々の哺乳動物細胞培養系を発現
に使用することができる。哺乳動物発現系の例は、Gluz
man et al.,Cell 23:175(1981)に記載されたサル・腎臓
線維芽細胞ＣＯＳ−６細胞系を包含する。適合するベク
ターを発現させうる他の細胞系は、例えば、Ｃ１２７、
３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、ヒト・腎臓２９３およびＢ
ＨＫ細胞系を包含する。
【０１２９】哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適
当なプロモーターおよびエンハンサー、および、必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、およ
び、発現に必要とされる５’隣接非転写配列を含んでな
るであろう。この点における特定の好ましい具体例にお
いて、ＳＶ４０スプライス部位由来のＤＮＡ配列、およ
びＳＶ４０ポリアデニル化部位が、これらのタイプの所
望の非転写遺伝学的エレメントとして用いられる。
【０１３０】硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、
酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーお
よびレクチンクロマトグラフィーを包含するよく知られ
た方法により、ＲＥＱＵＩＥＭポリペプチド組み換え細
胞培養物から回収し、精製することができる。最も好ま
しくは、高品質液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を
精製に用いる。単離または精製中にポリペプチドが変性
している場合には、タンパク質の再折り畳みのためのよ
く知られた方法を用いて活性コンフォメーションを再生
することができる。
【０１３１】本発明ポリペプチドは、天然の精製産物、
化学合成法による産物、および、例えば細菌、酵母、高
等植物、昆虫および哺乳動物細胞を包含する原核細胞ま
たは真核細胞から組換え技術により得られた産物を包含
する。組換え体製造法に使用する宿主によっては、本発
明ポリペプチドはグリコシレーションされているかもし
れないし、されていないかもしれない。さらに、本発明
ポリペプチドは、いくつかの場合、宿主によるプロセス
の結果として最初の修飾されたメチオニン残基を含みう
る。
【０１３２】本発明に従って、ＲＥＱＵＩＥＭポリヌク
レオチドおよびポリペプチドを種々の適用例、詳細には
ＲＥＱＵＩＥＭの化学的および生物学的特性を用いる適
用例に使用することができる。さらなる適用例は、細
胞、組織および器官の疾病の診断および治療に関する。
本発明のこれらの態様を以下の議論によってさらに説明
する。
【０１３３】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明は、例えば診断試薬としての相補的ポリヌクレオ
チドの検出のためのＲＥＱＵＩＥＭポリヌクレオチドの
使用にも関する。機能不全に関連した変異形態のＲＥＱ
ＵＩＥＭの検出は、ＲＥＱＵＩＥＭの発現低下、発現過
剰または変化した発現から生じる疾病の診断、または疾
病に対する感受性を付加および定義することができる診
断道具を提供するであろう。ヒト・ＲＥＱＵＩＥＭ遺伝
子において変異を有する個体を、種々の方法により、Ｄ
ＮＡレベルにおいて検出することができる。診断のため
の核酸を、血液、尿、唾液、生検および剖検材料のごと
き患者の細胞から得てもよい。ゲノムＤＮＡを検出用に
直接使用してもよく、または、分析前にＰＣＲを用いる
ことにより酵素的に増幅してもよい。ＰＣＲ（Saiki et
al.,Nature,324:163-166(1986)）。ＲＮＡまたはｃＤ
ＮＡを同じように使用してもよい。一例として、ＲＥＱ
ＵＩＥＭをコードしている核酸に相補的なＰＣＲプライ
マーを用いて、ＲＥＱＵＩＥＭの発現および変異を同定
および分析するために使用することができる。例えば、
正常遺伝子型との比較における増幅生成物のサイズの変
化により、欠失および挿入を検出することができる。増
幅したＤＮＡを放射性ラベルされたＲＥＱＵＩＥＭ Ｒ
ＮＡとハイブリダイゼーションさせることにより、ある
いは別法として放射性ラベルされたＲＥＱＵＩＥＭアン
チセンスＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションさせるこ
とにより、点突然変異を同定することができる。好まし
くは、ＲＮａｓｅ Ａ消化または融点温度の相違によ
り、マッチした配列とミスマッチ２本鎖とを識別するこ
とができる。
【０１３４】直接ＤＮＡ配列決定により、もとの遺伝子
と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明らかとな
りうる。さらに、クローン化されたＤＮＡセグメントを
プローブとして用いて特定のＤＮＡ配列を検出してもよ
い。ＰＣＲまたは他の増幅方法を適当に用いることによ
り、かかる方法の感度をおおいに向上させることができ
る。例えば、配列決定用プライマーを、２本鎖ＰＣＲ生
成物またはＰＣＲ変法により得られた１本鎖鋳型分子と
ともに使用する。放射性ラベルヌクレオチドを用いる慣
用的手順により、または、蛍光タグを用いる自動配列決
定法により配列決定を行う。
【０１３５】変性剤と共にまたは無しでゲル中のＤＮＡ
断片の電気泳動度の変化を検出することにより、ＤＮＡ
配列の相違に基づく遺伝学的試験を行うことができる。
高分解能ゲル電気泳動により、小規模な配列の欠失およ
び挿入を可視化することができる。特定の融点または部
分的に融解する温度によって、異なるＤＮＡ断片の移動
がゲル中の異なる位置において遅延される、変性ホルム
アミドグラジエントゲル上で異なる配列のＤＮＡ断片を
識別することができる（例えば、Myers et al.,Scienc
e,230:1242(1985)参照）。
【０１３６】ＲＮａｓｅおよびＳ１保護のごときヌクレ
アーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定の
位置における配列の変化も明らかとなる（例えば、Cott
on et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-44-1(198
5)）。
【０１３７】かくして、ハイブリダイゼーション、ＲＮ
ａｓｅ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制
限酵素の使用（例えば、制限断片長多型性（ＲＦＬ
Ｐ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングのご
とき方法により、特定のＤＮＡ配列の検出を行うことが
できる。より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決
定以外にも、in situ分析によっても突然変異を検出す
ることができる。
【０１３８】本発明のさらなる態様によれば、ウイルス
感染、癌化に関係した疾病を決定するための方法、およ
び、胚発生および組織恒常性を制御するための方法が提
供される。ウイルス感染、癌化に関係した疾病および胚
発生および組織恒常性を制御するために、または、ウイ
ルス感染、癌化および胚発生および組織恒常性に対する
感受性。かくして、ＲＥＱＵＩＥＭにおける変異は、ウ
イルス感染、癌化に対する感受性、ならびに胚発生およ
び組織恒常性の制御における疾病および欠陥に対する感
受性を示し、上記核酸配列をかかる感受性を確認するた
めのアッセイにおいて使用してもよい。かくして、例え
ば、本明細書中記載のヒト・ＲＥＱＵＩＥＭにおける、
欠失、切断、挿入、フレームシフト等のごとき変異を検
出するために、該アッセイを使用してもよく、かかる変
異は、ウイルス感染、癌化に対する感受性、ならびに胚
発生および組織恒常性の制御における疾病および欠陥に
対する感受性の指標となる。
【０１３９】例えば、ＤＮＡ配列決定アッセイを用いて
変異を確認することができる。血液試料に限らないがこ
れを包含する組織試料をヒト患者から得る。当該分野で
知られた方法により試料を処理してＲＮＡを捕捉する。
ｍＲＮＡに存在するポリアデノシン伸長部分にハイブリ
ダイゼーションするポリチミジン残基からなるオリゴヌ
クレオチドプライマーを添加することにより、第１鎖ｃ
ＤＮＡをＲＮＡ試料から合成する。逆転写酵素およびデ
オキシヌクレオチドを添加して、第１鎖ｃＤＮＡを合成
する。本発明ＲＥＱＵＩＥＭタンパク質のＤＮＡ配列に
基づいてプライマー配列を合成する。一般に、プライマ
ー配列は少なくとも１５個の連続した塩基を含んでな
り、少なくとも３０個またはちょうど５０個の連続した
塩基を含んでいてもよい。
【０１４０】本発明の遺伝子に変異を有する個体を、種
々の方法によってＤＮＡレベルで検出してもよい。血
液、尿、唾液を包含するが、これらに限らない、患者の
細胞、組織生検および剖検材料から診断用核酸を得ても
よい。ゲノムＤＮＡを検出用に直接用いてもよく、ある
いは分析前にＰＣＲ（Saiki et al.,Nature,324:163-16
6(1986)）を用いることにより酵素的に増幅してもよ
い。ＲＴ−ＰＣＲを用いて変異を検出することもでき
る。ＲＴ−ＰＣＲを、自動検出システム、例えば、Gene
Scanのごときシステムと組み合わせて用いることが特に
好ましい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも同じ目的、ＰＣＲま
たはＲＴ−ＰＣＲに使用してもよい。一例として、ＲＥ
ＱＵＩＥＭをコードしている核酸に相補的なＰＣＲプラ
イマーを用いて変異を同定し分析することができる。例
えば、正常遺伝子型との比較において増幅生成物の大き
さの変化により、欠失および挿入を検出することができ
る。増幅したＤＮＡを放射性ラベルされたＲＮＡ、また
は、別法として放射性標識アンセンスＤＮＡとハイブリ
ダイゼーションさせることにより点突然変異を同定する
ことができる。好ましくは、ＲＮａｓｅ Ａ消化または
融解温度の相違により、ミスマッチした２本鎖と完全に
マッチした配列とを識別することができる。
【０１４１】よく知られた方法によって選択されたプラ
イマーを、患者由来の試料より単離したＲＥＱＵＩＥＭ
ｃＤＮＡの増幅に用いてもよい。本発明は、５'および
／または３'末端から除去された１、２、３、または４
ヌクレオチドで選択されたプライマーも提供する。その
プライマーを用いて患者から単離した遺伝子を増幅し
て、次いで、遺伝子を種々の方法に供してＤＮＡ配列を
調べることができる。このようにして、ＤＮＡ配列にお
ける変異を診断することができる。
【０１４２】もとの遺伝子と変異を有する遺伝子との間
の配列の相違を、直接的ＤＮＡ配列決定法により明らか
にすることができる。さらに、クローン化されたＤＮＡ
セグメントをプローブとして用いて特定のＤＮＡセグメ
ントを検出してもよい。ＰＣＲと組み合わせた場合にこ
の方法の感度は非常に上昇する。例えば、配列決定用プ
ライマーを２本鎖ＰＣＲ生成物またはＰＣＲ変法により
得られた１本鎖鋳型分子とともに用いる。放射性ラベル
されたヌクレオチドを用いる慣用的方法または蛍光タグ
を用いる自動配列決定法により配列決定を行う。
【０１４３】変性剤と共にまたは無しにおけるゲル中の
ＤＮＡ断片の電気泳動度の変化を検出することにより、
ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝学的試験を行ってもよ
い。高分解能ゲル電気泳動により、小規模な配列の欠失
および挿入を可視化することができる。個々の融点また
は部分的に融解する温度によって、異なるＤＮＡ断片の
移動がゲル中の異なる位置において阻止される、変性ホ
ルムアミドグラジエントゲル上で異なる配列のＤＮＡ断
片を識別することができる（例えば、Myers et al.,Sci
ence,230:1242(1985)参照）。
【０１４４】ＲＮａｓｅおよびＳ１保護のごときヌクレ
アーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定の
位置における配列の変化も明らかとなる（例えば、Cott
onら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401(198
5)）。
【０１４５】かくして、ハイブリダイゼーション、ＲＮ
ａｓｅ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制
限酵素の使用（例えば、制限断片長多型性（ＲＦＬ
Ｐ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングのご
とき方法により、特定のＤＮＡ配列の検出および／また
は配列レベルの定量を行うことができる。本発明は、正
常な対照試料と比較して、図１ないし３の配列を有する
ポリヌクレオチドの発現の変化を患者由来の試料から決
定することを含んでなる、胚発達および組織恒常性の異
常な制御を検出することで、ウイルス感染および癌に対
する感受性同様に、疾患、詳細には、アルツハイマー
症、パーキンソン病、リューマチ性関節炎、敗血性ショ
ック、敗血症、発作、中枢神経系炎症性疾患、骨粗鬆
症、再潅流（reperfusion）虚血性損傷、心臓血管系疾
患に関係した細胞死、多嚢胞性腎疾患、心臓血管系疾患
における内皮細胞のアポトーシス、変性肝臓疾患、Ｍ
Ｓ、ＡＬＳ、小脳変性、虚血性損傷、心筋梗塞、ＡＩＤ
Ｓ、骨髄形成不全症候群、再生不良性貧血、男性脱毛
症、および、頭部傷害損傷の診断または検出方法を提供
する。ポリヌクレオチド定量について当該分野でよく知
られた方法、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓ
ｅ保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダ
イゼーション法を用いて、ポリヌクレオチドの発現を測
定することができる。
【０１４６】より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定以外にも、in situ分析により変異を検出するこ
とができる。拡散中期染色体に対するｃＤＮＡクローン
の蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を
用いて正確な染色体位置を知ることができる。
【０１４７】これをいかにして行うのかという一例とし
て、QIAEX II ＤＮＡ精製キット（QIAGEN,Inc.,Chastwo
rth,CA）を用いてＲＥＱＵＩＥＭ ＤＮＡを消化し、精
製し、Super CosI コスミドベクター（STRATAGENE,LaJo
lla,CA）に連結する。QiagenPlasmid Purification Kit
（QIAGEN,Inc.,Chastworth,CA）を用いてＤＮＡを精製
し、BioNick Labeling Kit（GibcoBRL,Life Technologi
es Inc.,Gauthersburg,MD）を用いてビオチン−ｄＡＴ
Ｐの存在下におけるニックトランスレーションにより１
ｍｇを標識する。GENE-TECT Detection System（CLONTE
CH Laboratories,Inc.Palo Alto,CA）を用いてビオチン
化を検出する。ONCOR Light Hybridization Kit（ONCO
R,Gaithersburg,MD）を用いてin situハイブリダイゼー
ションをスライドガラス上で行って、中期染色体上の単
一コピー配列を検出する。２０％ＦＣＳ、３％ ＰＨＡ
およびペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰ
ＭＩ １６４０中で正常ドナーの末梢血を３日間培養
し、１０-6Ｍメトトレキセートで１７時間同調させ、補
足物不含ＲＰＭＩで２回洗浄する。細胞を１０-3Ｍチミ
ジンとともに７日間インキュベーションする。コルセミ
ド（０.５ｍｇ／ｍｌ）とともに２０分のインキュベー
ション後、細胞を中期で捕捉し、次いで、７５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ中３７℃で１５分低張溶解を行う。次いで、細胞ペ
レットを遠心分離し、Carnoy'sの固定液（３：１ メタ
ノール／酢酸）中で固定する。
【０１４８】１滴の懸濁液をスライドガラス上に滴下
し、風乾することにより中期スプレッドを調製する。ブ
ロッッキング・ヒト・胎盤ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）を添
加した１０ｍｌのハイブリダイゼーション混合物（５０
％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％デキストラン硫酸）
中に懸濁された１００ｎｇのプローブを添加することに
よりハイブリダイゼーションを行う。プローブ混合物を
７０℃の水浴で１０分間変性させ、３７℃で１時間イン
キュベーションし、次いで、あらかじめ暖めておいた
（３７℃）スライドガラス上に置き、それは、あらかじ
め７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ中７０℃で変性さ
せ、エタノールシリーズ中で脱水し、４℃に冷却してお
いたものである。
【０１４９】スライドガラスを加湿チャンバ中３７℃で
１６時間インキュベーションする。スライドガラスを５
０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣで１０分間４１℃で洗浄
し、次いで、２ＸＳＳＣで３７℃で７分間洗浄する。製
造者のプロトコールに従ってスライドガラスをＦＩＴＣ
−アビジン（ONCOR,Gaithersburg,MD）とともにインキ
ュベーションすることによりハイブリダイゼーションプ
ローブを検出する。Leitz ORTHOPLAN 2エピ蛍光顕微鏡
を用いてスライドガラスを可視化し、Imagenetics Comp
uterおよびMacIntoshプリンターを用いて５つのコンピ
ューター映像を得る。
【０１５０】いったん、配列が正確な染色体位置にマッ
ピングされたら、遺伝学的地図のデータを用いて染色体
上の配列の物理的位置を修正することができる。かかる
データは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritan
ce in Man（コンピューターによりオンラインで利用可
能）に見いだされる。次いで、よく知られた方法を用い
た連関分析により、同じ染色体領域にマッピングされた
遺伝子と疾病との関連を同定する。特記しない限り、Gr
aham, F.およびVan der Eb, A. Virology,52:456-457(1
973)の方法に記載されたようにして形質転換を行った。
【０１５１】染色体アッセイ 本発明配列は染色体の同定にも価値がある。配列は個々
のヒト・染色体上の特定位置に特異的に対して標的化さ
れており、これとハイブリダイゼーションできる。さら
に、現在、染色体上の特定部位を同定する必要性があ
る。実際の配列データ（繰り返し多型性）に基づいて染
色体をマーキングする試薬は、現在のところ染色体のマ
ーキングにほとんど利用できない。本発明による染色体
へのＤＮＡのマッピングは、配列を疾病関連遺伝子と関
連づけることにおいて重要な最初の工程である。
【０１５２】この点において、特定の好ましい具体例に
おいて、本明細書開示のｃＤＮＡを用いてＲＥＱＵＩＥ
Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡをクローン化する。種々のよく
知られた方法および一般的に市販されているライブラリ
ーを用いてこれを行うことができる。この目的のために
よく知られた方法を用いてゲノムＤＮＡをin situ染色
体マッピングに使用する。典型的には、染色体マッピン
グのための日常的手順に従って、良好なin situハイブ
リダイゼーションシグナルを生じるゲノムプローブを同
定するためにいくつかの試行錯誤が必要であるかもしれ
ない。
【０１５３】いくつかの場合、さらに、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５ないし２５ｂｐ）を調
製することにより、配列を染色体にマッピングすること
ができる。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター分
析を用いて、ゲノムＤＮＡ中の１つよりも多いエクソン
にまたがらない、かくして、増幅を複雑化しない、プラ
イマーを迅速に選択する。次いで、これらのプライマー
を、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドの
ＰＣＲスクリーニングに用いる。プライマーに対応した
ヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメ
ントを生じるであろう。
【０１５４】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、個々のＤＮＡを個々の染色体に帰属するための迅速
な手順である。類似の方法で、同じオリゴヌクレオチド
プライマーとともに本発明を用いて、特定の染色体由来
の断片のパネルまたは大きなゲノムクローンのプールに
関して下位の位置決めを行うことができる。染色体への
マッピングに同様に用いることのできる他のマッピング
法は、in situハイブリダイゼーション、標識フロー−
ソーティド（flow-sorted）染色体でのプレスクリーニ
ングおよび染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによるプレセレクショ
ンを包含する。
【０１５５】拡散中期染色体に対するｃＤＮＡクローン
の蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を
用いて、正確な染色体位置を１工程で知ることができ
る。この方法を５０または６０ｂｐ程度の短いｃＤＮＡ
とともに用いることができる。この方法に関する総説に
ついては、Verma et al.,HUMAN CHROMOSOME:A MANUAL O
F BASIC TECHNIQUES,Pergamon Press,New York(1988)参
照。
【０１５６】いったん、配列が正確な染色体位置にマッ
ピングされたら、遺伝学的地図のデータを用いて染色体
上の配列の物理的位置を修正することができる。かかる
データは、例えば、V.McKusick,Mendelian Inheritance
in Man（コンピューターによりオンラインで利用可
能）に見いだされる。次いで、連関分析（物理的に隣接
した遺伝子の同時遺伝）により、同じ染色体領域にマッ
ピングされた遺伝子と疾病との関連を同定する。
【０１５７】次に、疾病にかかっている個体および疾病
にかかっていない個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の
相違を決定することが必要である。疾病にかかっている
個体の一部または全部において変異が観察されるが、正
常個体においては変異が観察されない場合には、その変
異がその疾病の病因である可能性がある。
【０１５８】物理的マッピングおよび遺伝学的マッピン
グ法の現在の分離能によれば、疾病に関連した染色体領
域に正確に位置決めされるｃＤＮＡは５０ないし５００
個の潜在的病因遺伝子につき１つであろう（これは１メ
ガベースのマッピング分離能、および、２０ｋｂあたり
１個の遺伝子と仮定している）。
【０１５９】ポリペプチドアッセイ 本発明は、細胞および組織中のＲＥＱＵＩＥＭタンパク
質レベルの検出のための定量および診断アッセイのごと
き診断アッセイにも関し、正常および異常なレベルの決
定を包含する。かくして、例えば、正常対照組織試料と
比較してＲＥＱＵＩＥＭタンパク質の過剰発現を検出す
るための本発明診断アッセイを用いて、例えば腫瘍の存
在を検出してもよい。宿主由来の試料中の本発明ＲＥＱ
ＵＩＥＭタンパク質のごときタンパク質のレベルを決定
するのに用いることのできるアッセイ法は当業者によく
知られている。かかるアッセイ法は、ラジオイムノアッ
セイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およ
びＥＬＩＳＡアッセイを包含する。これらのうち、ＥＬ
ＩＳＡがしばしば好ましい。ＥＬＩＳＡアッセイは、最
初にＲＥＱＵＩＥＭに対して特異的な抗体、好ましくは
モノクローナル抗体を調製することを含んでなる。さら
に、一般に、モノクローナル抗体に結合するレポーター
抗体を調製する。レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光
試薬または酵素試薬のごとき検出可能試薬に結合してい
るが、この実施例ではセイヨウワサビ・ペルオキシダー
ゼ酵素に結合している。
【０１６０】ＥＬＩＳＡを行うために試料を宿主から取
り、試料中のタンパク質を結合する固体支持体、例え
ば、ポリスチレンディッシュ上でインキュベーションす
る。次いで、ウシ・血清アルブミンのごとき非特異的タ
ンパク質とともにインキュベーションすることにより、
ディッシュ上の遊離タンパク質結合部位を被覆する。次
に、モノクローナル抗体をディッシュ中でインキュベー
ションし、その間にモノクローナル抗体は、ポリスチレ
ンディッシュに結合しているＲＥＱＵＩＥＭタンパク質
に結合する。未結合モノクローナル抗体をバッファーで
洗浄除去する。セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼに連
結されたレポーター抗体をディッシュ中に入れ、レポー
ター抗体とＲＥＱＵＩＥＭに結合しているモノクローナ
ル抗体との結合を生じさせる。次いで、未結合レポータ
ー抗体を洗浄除去する。次いで、発色基質を包含するペ
ルオキシダーゼ活性のための試薬をディッシュに添加す
る。１次抗体および２次抗体によりＲＥＱＵＩＥＭに結
合し、固定化されているペルオキシダーゼは着色反応生
成物を生じる。一定時間の発色量は試料中のＲＥＱＵＩ
ＥＭタンパク質量を示す。典型的には、標準曲線に対し
て参照することにより定量的結果が得られる。
【０１６１】固体支持体に結合したＲＥＱＵＩＥＭ特異
的抗体および標識ＲＥＱＵＩＥＭおよび宿主由来の試料
が固体支持体上に通され、固体支持体に結合した検出標
識量と試料中のＲＥＱＵＩＥＭ量とが相関関係を有する
ものである、競合アッセイを用いてもよい。
【０１６２】抗体 ポリペプチド、それの断片または他の誘導体、またはそ
れのアナログ、またはそれらを発現する細胞を、それら
に対する抗体を製造するための免疫原として使用するこ
とができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル
またはモノクローナル抗体であってよい。本発明は、キ
メラ、１本鎖およびヒト化抗体ならびにＦａｂ断片、ま
たはＦａｂ発現ライブラリーの生成物も包含する。当該
分野で知られた種々の手順をかかる抗体および断片の製
造に用いてもよい。
【０１６３】ポリペプチドを動物中に直接注射すること
により、あるいはポリペプチドを動物、好ましくは非ヒ
ト動物に投与することにより、本発明配列に対応したポ
リペプチドに対して生成した抗体を得ることができる。
次いで、そのようにして得られた抗体はポリペプチド自
体と結合するであろう。このようにして、ポリペプチド
の断片のみをコードする配列を用いて、無傷のポリペプ
チド全体に結合する抗体を得ることさえできる。次い
で、かかる抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織
からそのポリペプチドを単離することができる。
【０１６４】モノクローナル抗体の調製のために、連続
細胞培養系により製造される抗体を提供する方法を用い
ることができる。例として、ハイブリドーマ法（Kohle
r, G.and Milstein, C. Nature 256:495-497(1975)）、
トリオーマ法、ヒト・Ｂ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor
et al.,Immunology Today 4:72(1983)）およびヒト・
モノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリ
ドーマ法（Cole et al., pg.77-96 in Monoclonal Anti
bodies and Cancer Therapy.Alan R.Liss,Inc,(1985)）
を包含する。
【０１６５】１本鎖抗体の製造に関して記載された方法
（米国特許第４,９４６,７７８号）を適用して、本発明
の免疫原性ポリペプチド生成物に対する１本鎖抗体を製
造することができる。また、トランスジェニックマウ
ス、または他の哺乳動物のごとき他の生物を用いて、本
発明の免疫原性ポリペプチド生成物に対するヒト化抗体
を発現させてもよい。
【０１６６】上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現す
るクローンを単離または同定してもよく、あるいはアフ
ィニティークロマトグラフィーによる単離および／また
は精製のための固体支持体への抗体の結合により本発明
ポリペプチドを精製してもよい。
【０１６７】かくして、特にＲＥＱＵＩＥＭに対する抗
体は、かかるＲＥＱＵＩＥＭポリペプチドの作用を阻害
するように、例えば、アルツハイマー症、パーキンソン
病、リューマチ性関節炎、敗血性ショック、敗血症、発
作、中枢神経系炎症性疾患、骨粗鬆症、再還流（reperf
usion）虚血性損傷、心臓血管系疾患に関係した細胞
死、多嚢胞性腎疾患、心臓血管系疾患における内皮細胞
のアポトーシス、変性肝臓疾患、ＭＳ、ＡＬＳ、小脳変
性、虚血性損傷、心筋梗塞、ＡＩＤＳ、骨髄形成不全症
候群、再生不良性貧血、男性脱毛症、および、頭部傷害
損傷の治療において使用されてもよい。
【０１６８】ＲＥＱＵＩＥＭ結合分子およびアッセイ 本発明は、ＲＥＱＵＩＥＭに結合する受容体分子のごと
き分子の同定方法も提供する。当業者に知られた多くの
方法、例えば、パンニング（panning）およびＦＡＣＳ
ソーティングにより、受容体タンパク質のごときＲＥＱ
ＵＩＥＭに結合するタンパク質をコードしている遺伝子
を同定することができる。かかる方法は多くの研究室用
マニュアル、例えば、Coligan et al.,Current Protoco
les in Immunology 1(2)：第５章（１９９１年）に記載
されている。
【０１６９】例えば、発現クローニングをこの目的に用
いてもよい。この目的のために、ＲＥＱＵＩＥＭに応答
する細胞からポリアデニル化ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ
ライブラリーをこのＲＮＡから作成し、ライブラリーを
プールに分割し、ＲＥＱＵＩＥＭに応答しない細胞中に
各プールを別々にトランスフェクションする。次いで、
形質転換細胞を標識ＲＥＱＵＩＥＭに曝露する。（放射
性ヨウ素化または部位特異的プロテインキナーゼ認識部
位の取り込みといった標準的方法を包含する種々のよく
知られた方法によりＲＥＱＵＩＥＭを標識することがで
きる。）曝露後、細胞を固定し、ＲＥＱＵＩＥＭの結合
を測定する。簡便には、これらの手順をスライドガラス
上で行う。
【０１７０】ＲＥＱＵＩＥＭ結合細胞を生じるｃＤＮＡ
についてプールを同定する。これらの陽性物からサブ−
プール（sub-pool）を調製し、宿主細胞中にトランスフ
ェクションし、上記のごとくスクリーニングする。反復
サブ−プール化および再スクリーニングプロセスを用い
て、推定上の受容体分子のごとき結合分子をコードして
いる１種またはそれ以上の単一クローンを単離すること
ができる。
【０１７１】別法として、受容体分子のごとき結合分子
を発現する細胞から調製された膜または膜抽出物のごと
き細胞抽出物に標識リガンドを光アフィニティー結合さ
せることもできる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）により架橋材料を分離し、Ｘ線フィルムに
曝露する。リガンド−受容体を含む標識複合体を切断
し、ペプチド断片にまで分解し、タンパク質微小配列決
定に供することができる。微小配列決定から得られたア
ミノ酸配列を用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングして推定の受容体分子をコードしている遺伝子を
同定するための唯一のまたは縮重したオリゴヌクレオチ
ドプローブを設計することができる。
【０１７２】本発明ポリペプチドを用いて、細胞中また
は無細胞調製物中において、受容体分子のごときＲＥＱ
ＵＩＥＭ結合分子のＲＥＱＵＩＥＭ結合能を評価するこ
ともできる。
【０１７３】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明は、受容体分子のごときＲＥＱＵＩＥＭ結合分子
との相互作用のような、細胞に対するＲＥＱＵＩＥＭの
作用を促進または阻害する化合物を同定するための化合
物のスクリーニング法も提供する。アゴニストは、ＲＥ
ＱＵＩＥＭの本来の生物学的機能を増大させる化合物で
あるか、またはＲＥＱＵＩＥＭと同様の様式で機能する
化合物であるが、アンタゴニストはかかる機能を低下ま
たは除去する。
【０１７４】例えば、膜標品のごとき膜またはその調製
物のような細胞コンパートメントを、ＲＥＱＵＩＥＭに
より転調されたシグナリングもしくは調節経路に関する
分子のごとき、ＲＥＱＵＩＥＭに結合する分子を発現す
る細胞から調製してもよい。ＲＥＱＵＩＥＭアゴニスト
またはアンタゴニスト候補分子の存在下または不存在下
において、調製物を標識ＲＥＱＵＩＥＭとともにインキ
ュベーションする。結合分子に結合する候補分子の能力
は、標識リガンドの結合低下に反映される。不必要に、
すなわちＲＥＱＵＩＥＭ結合分子への結合に対するＲＥ
ＱＵＩＥＭの効果を誘導せずに結合する分子は、良好な
アンタゴニストである可能性が最も高い。よく結合し、
ＲＥＱＵＩＥＭと同じ効果またはＲＥＱＵＩＥＭに密接
に関連した効果を誘導する分子はアゴニストである。
【０１７５】例えば、候補分子と細胞または適当な細胞
調製物との相互作用後に第２の伝達系の活性を測定し、
ＲＥＱＵＩＥＭまたはＲＥＱＵＩＥＭと同じ効果を誘導
する分子の効果と比較することにより、潜在的アゴニス
トおよびアンタゴニストのＲＥＱＵＩＥＭ様効果を測定
することができる。この点において有用でありうる第２
の伝達系は、ＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャ
ンネルまたはホスホイノシチド加水分解第２伝達系を包
含するが、これらに限定されない。
【０１７６】ＲＥＱＵＩＥＭアンタゴニストのためのア
ッセイのもう１つの例は、拮抗的阻害アッセイに適した
条件下でＲＥＱＵＩＥＭと潜在的アゴニストを膜結合Ｒ
ＥＱＵＩＥＭ受容体分子または組換えＲＥＱＵＩＥＭ受
容体分子と結合させる競合アッセイである。受容体分子
に結合しているＲＥＱＵＩＥＭ分子数を正確に決定して
潜在的アンタゴニストの有効性を評価できるように、例
えば、放射活性によりＲＥＱＵＩＥＭを標識することが
できる。
【０１７７】潜在的アンタゴニストは、本発明ポリペプ
チドに結合し、そのことによりその活性を阻害または消
失させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび
抗体を包含する。潜在的アンタゴニストは、小型有機分
子、ペプチド、密接に関連したタンパク質のごときポリ
ペプチド、または受容体分子のごとき結合分子と同じ部
位に結合し、そのことによりＲＥＱＵＩＥＭを結合から
排除してＲＥＱＵＩＥＭの作用を防止する抗体であって
もよい。
【０１７８】潜在的アンタゴニストは、ポリペプチドの
結合部位に結合し、これを占領し、そのことにより受容
体分子のごとき細胞性結合分子の結合を防止して正常な
生物学的活性を妨げる小型分子を包含する。小型分子の
例は、小型有機分子、ペプチドまたはペプチド様分子を
包含するが、これらに限定されない。もう一つのアンタ
ゴニストは、ＲＥＱＵＩＥＭの開裂部位認識モチーフを
含んでなるオリゴペプチドである。
【０１７９】他の潜在的アンタゴニストはアンチセンス
分子を包含する。アンチセンス法を用いて、アンチセン
スＤＮＡまたはＲＮＡにより、あるいは３重ヘリックス
形成により、遺伝子発現を制御することができる。アン
チセンス法は、例えば、Okano,J.Neurochem.56:560(199
1)；OLIGONUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OFGEN
E EXPRESSION,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)において
議論されている。３重ヘリックス形成は、例えば、Lee
ら、Nucleic Acids Research 6:3073(1979)；Cooneyら,
Science 241:456(1988)；およびDervanら,Science 25
1:1360(1991)において議論されている。該方法は、相補
的ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基
づく。例えば、本発明成熟ポリペプチドをコードしてい
るポリヌクレオチドの５’暗号部分を用いて、長さ約１
０ないし４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレ
オチドを設計してもよい。転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるようにＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計
し、そのことによりＲＥＱＵＩＥＭの転写および生成を
防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、
インビボにおいてｍＲＮＡにハイブリダイゼーション
し、ｍＲＮＡ分子のＲＥＱＵＩＥＭポリペプチドへの翻
訳を阻止する。上記オリゴヌクレオチドを細胞に送達し
て、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボにおい
て発現されてＲＥＱＵＩＥＭの生成を阻害するようにす
ることもできる。
【０１８０】例えば、腫瘍細胞および固形癌細胞を包含
する異常な細胞増殖に標的化されたアゴニストをこれら
の疾病の治療に使用してもよい。かかる標的化は抗体融
合を使用した遺伝子治療を介して行われてもよい。
【０１８１】アゴニストを、小胞リンパ腫、ｐ５３に関
連した肉腫、例えば、ＳＬＥ、免疫性糸球体腎炎のごと
き自己免疫疾患、および例えば、乳癌、前立腺癌、およ
び卵巣癌のごときホルモン依存性腫瘍、および例えば、
ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノウ
イルスのごときウイルス感染の治療に使用してもよい。
アンタゴニストを、例えば下記のような医薬上許容され
る担体を伴った組成物中に用いてもよい。
【０１８２】アンタゴニストを、ＲＥＱＵＩＥＭポリペ
プチドの作用を阻害するように、例えば、アルツハイマ
ー症、パーキンソン病、リューマチ性関節炎、敗血性シ
ョック、敗血症、発作、中枢神経系炎症性疾患、骨粗鬆
症、再還流（reperfusion）虚血性損傷、心臓血管系疾
患に関係した細胞死、多嚢胞性腎疾患、心臓血管系疾患
における内皮細胞のアポトーシス、変性肝臓疾患、Ｍ
Ｓ、ＡＬＳ、小脳変性、虚血性損傷、心筋梗塞、ＡＩＤ
Ｓ、骨髄形成不全症候群、再生不良性貧血、男性脱毛
症、および、頭部傷害損傷の治療において使用されても
よい。アンタゴニストを、例えば下記のような医薬上許
容される担体を伴った組成物中に用いてもよい。
【０１８３】組成物 本発明は、上記ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはアゴニストまたはアンタゴニストを含んでなる
組成物にも関する。かくして、細胞、組織または生物に
ついて使用される未滅菌または滅菌担体、例えば、対象
への投与に適した医薬担体と組み合わせて本発明ポリペ
プチドを用いてもよい。かかる組成物は、例えば、媒
体、添加物または治療上有効量の本発明ポリペプチドお
よび医薬上許容される担体または賦形剤を含んでなる。
かかる担体は、セライン、緩衝化セライン、デキストロ
ース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの混
合物を包含するが、これらに制限されない。処方は投与
モードに適合すべきである。
【０１８４】キット さらに本発明は、上記本発明組成物の１種またはそれ以
上の成分を充填した１個またはそれ以上の容器を含んで
なる医薬パックおよびキットに関する。かかる容器につ
いては、医薬または生物学的製品の製造、使用または販
売を規制している政府当局により指示された形態であ
り、ヒトへの投与のための製品の製造、使用または販売
に対する当局による認可を反映したものである。
【０１８５】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物を単独で、ある
いは治療化合物のごとき他の化合物と組み合わせて使用
してよい。効果的で便利な方法、例えば、特に、局所、
経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔
内または皮内ルートによる投与を包含する方法で医薬組
成物を投与してよい。
【０１８６】一般に、医薬組成物を、個々の徴候または
徴候（複数）の治療または予防の有効な量で投与する。
一般的には、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で組
成物を投与する。大部分の場合、１日につき約８ｍｇ／
ｋｇ体重をこえない量で組成物が投与されるであろう。
好ましくは、大部分の場合、１日につき用量は約１０μ
ｇ／ｋｇ体重ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重である。症状、
重症度、投与経路、合併症等を考慮して、各治療様式に
ついての標準的方法および症状により最適用量が決定さ
れることが理解されよう。
【０１８７】遺伝子治療 インビボにおいて、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる
治療様式において、かかるポリペプチドを発現させるこ
とにより、ＲＥＱＵＩＥＭポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニ
ストを本発明に従って使用することができる。
【０１８８】かくして、例えば、患者からの細胞をポリ
ペプチドをコードしているＤＮＡまたはＲＮＡのごとき
ポリヌクレオチドでエクスビボで操作し、次いで、ポリ
ペプチドで治療すべき患者にその操作された細胞を与え
てもよい。例えば、本発明ポリペプチドをコードしてい
るＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターの使
用により細胞をエクスビボで操作してもよい。かかる方
法は当該分野においてよく知られており、本発明におけ
るそれらの使用は本明細書の教示から明らかである。
【０１８９】同様に、当該分野において知られた方法に
より、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞を
インビボで処理してもよい。例えば、上記のようにレプ
リコン欠損レトロウイルスベクター中での発現のために
本発明ポリヌクレオチドを操作してもよい。次いで、レ
トロウイルス発現構築物を単離し、パッケージング細胞
中に導入し、本発明ポリペプチドをコードしているＲＮ
Ａを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入
して、パッケージング細胞が対象遺伝子を含有する感染
性ウイルス粒子を産生するようにすることができる。イ
ンビボでの細胞の操作およびインビボでのポリペプチド
の発現のためにこれらの産生細胞を患者に投与してもよ
い。かかる方法により本発明ポリペプチドを投与するた
めのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から
当業者に明らかであるはずである。
【０１９０】本明細書において上で述べたレトロウイル
スプラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モ
ロニー・マウス・白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、
ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ・白
血病ウイルス、ギボンサル・白血病ウイルス、ヒト・免
疫不全ウイルスのごときレトロウイルス、アデノウイル
ス、ミエロプロリファレイティブ肉腫ウイルス（Myelop
roliferative Sarcomavirus）、および哺乳動物腫瘍ウ
イルスを包含するが、これらに限定されない。１つの具
体例において、レトロウイルスプラスミドベクターはモ
ロニー・マウス・白血病ウイルス由来のものである。
【０１９１】かかるベクターは、ポリペプチド発現のた
めの１個またはそれ以上のプロモーターを十分に含む。
使用可能な適切なプロモーターは、レトロウイルスＬＴ
Ｒ；ＳＶ４０プロモーター；およびMiller et al.,Biot
echniques 7:980-990(1989)に記載されたＣＭＶプロモ
ーター、または他のいずれかのプロモーター（例えば、
ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、およびβ−アク
チンプロモーターを包含するが、これに限定されない真
核細胞プロモーターのごとき細胞プロモーター）を包含
するが、これらに限定されない。使用できる他のウイル
スのプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パ
ルボウイルスプロモーターを包含するが、これらに限定
されない。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含
まれる教示から当業者に明らかであろう。
【０１９２】本発明ポリペプチドをコードしている核酸
配列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろ
う。使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス
主要後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモー
ター；またはＣＭＶプロモーターのごとき異種プロモー
ター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；
ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターの
ごとき誘導可能プロモーター；熱ショックプロモータ
ー；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモータ
ー；ヒト・グロビンプロモーター；単純ヘルペスウイル
スのチミジンキナーゼプロモーターのごときウイルスの
チミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスのＬＴ
Ｒｓ（本明細書で上で述べた修飾レトロウイルスＬＴＲ
ｓを包含）；β−アクチンプロモーター；およびヒト・
成長ホルモンプロモーターを包含するが、これらに限定
されない。プロモーターは、ポリペプチドをコードして
いる遺伝子を制御する元来のプロモーターであってもよ
い。
【０１９３】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
てパッケージング細胞系に形質導入して産生細胞系を得
る。トランスフェクションされうるパッケージング細胞
の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、
ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、
ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖ
Ａｍ１２、およびMiller,A.,Human Gene Therapy 1:5-1
4(1990)に記載されたＤＡＮ細胞系を包含するが、これ
らに限定されない。当該分野で知られたいずれかの手段
によりベクターをパッケージング細胞中に形質導入して
もよい。かかる手段は、エレクトロポレーション、リポ
ソームの使用、ＣａＰＯ4沈殿を包含するが、これらに
限定されない。１つの別法において、レトロウイルスベ
クターをリポソーム中に封入し、あるいは脂質と結合さ
せ、次いで、宿主に投与してもよい。
【０１９４】産生細胞系は感染性レトロウイルスベクタ
ー粒子を産生するであろうし、該粒子はポリペプチドを
コードする核酸配列を含んでいる。次いで、かかるレト
ロウイルスベクター粒子を用いて、インビトロまたはイ
ンビボのいずれかにおいて真核細胞に形質導入してもよ
い。形質導入された真核細胞はポリペプチドをコードし
ている核酸配列を発現するであろう。形質導入されうる
真核細胞は、胚幹細胞、胚カルシノーマ細胞、ならびに
造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノ
サイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含する
が、これらに限定されない。
【０１９５】
【実施例】本発明は、さらに以下の実施例によって記載
される。実施例は、特殊な具体例によって本発明を説明
するために提供されるにすぎない。本発明のある特殊な
態様を説明する一方、これらの例は、開示された発明の
観点を限定または制限しない。本明細書中使用されるあ
る語句は、前記した用語解説において説明されている。
すべての実施例は標準的方法を使用して行われ、その方
法はよく知られていて、当業者にとっては日常的であ
り、そうでない場合はここに詳細に記載した。以下の実
施例の日常的な分子生物学的方法は、上記引用したSamb
rooki et al.のごとき標準的な研究室マニュアルに記載
されているごとく行うことができる。
【０１９６】以下の実施例に記述されるすべての部分ま
たは量は重要性によってであり、そうでなければ別に詳
述する。以下の実施例において、別に記載しない場合
は、断片の大きさによる分離を、Sambrookおよび、例え
ば、Goeddelら, Nucleic Acids Res. 8:4057(1980)によ
るごとき多くの他の文献のアガロースおよびポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）という標準的方
法を用いて行った。別に記載しない場合は、標準緩衝
液、インキュベーション温度および時間、ほぼ等量の連
結されるべきＤＮＡ断片、および、ＤＮＡ０.５μｇあ
たり約１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（「ligas
e」）を用いて連結を行った。
【０１９７】実施例１ 細菌を用いたヒト・ＲＥＱＵＩ
ＥＭの発現および精製 ｃＤＮＡライブラリーのポリヌクレオチドにおけるヒト
・ＲＥＱＵＩＥＭをコードするＤＮＡ配列を、ヒト・Ｒ
ＥＱＵＩＥＭタンパク質のカルボキシル末端のアミノ酸
配列、および、遺伝子の３'側のベクター配列に特異的
なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅し
た。さらにクローニングを促進するために制限部位を含
有するヌクレオチドを各々５'および３'配列に付加し
た。
【０１９８】５'オリゴヌクレオチドプライマーは、下
線のＥｃｏＲＩ制限部位を含有し、開始ＡＵＧを、つづ
いて最初の暗号の最初の塩基で始まる図１ないし３に示
したヒト・ＲＥＱＵＩＥＭ暗号配列の１２２０ヌクレオ
チドをコードする、５'ＡＴＡＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡ
ＴＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴＧ３'（配
列番号：３）を有した。
【０１９９】３'プライマーは、下線のＥｃｏＲＶ制限
部位を、つづいて停止暗号を含む、図１ないし３に示し
たＲＥＱＵＩＥＭ暗号配列の最後の２０ヌクレオチドに
相補的な２０ヌクレオチドを含有する、５'ＡＣＧＴＣ
ＴＡＧＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴ
ＴＣＴＧＧ３'（配列番号：４）を有する。
【０２００】制限部位は、これらの実施例における細菌
での発現のために使用される細菌発現ベクターｐＱＥ−
９における制限酵素部位に都合がよい。（Qiagen, Inc.
Chatsworth, CA.）ｐＱＥ−９は、アンピシリン抗生物
質耐性（「Ａｍｐr」）をコードしており、細菌の複製
開始点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、
リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−ＨＩｓタグ、
および、制限酵素部位を含有する。
【０２０１】増幅されたヒト・ＲＥＱＵＩＥＭ ＤＮＡ
およびベクターｐＱＥ−９の両方をＥｃｏＲＩおよびＥ
ｃｏＲＶで消化し、次いで、消化されたＤＮＡを連結し
た。ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化したベクター中
へのＲＥＱＵＩＥＭ ＤＮＡの挿入は、下流にＲＥＱＵ
ＩＥＭ暗号領域を配置し、ベクターのＩＰＴＧ誘導性プ
ロモーターに作動可能に連結し、ＲＥＱＵＩＥＭの翻訳
のために開始ＡＵＧに読み枠を合わせて適切に配置する
ように行った。
【０２０２】連結混合物で、標準的方法を用いて、コン
ピテントE. coli細胞を形質転換した。かかる方法は上
記引用したSambrook et al.に記載されている。ｌａｃ
リプレッサーを発現し、カナマイシン耐性（「Ｋａ
ｎr」）を与える、プラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピ
ーを含有するE. coli株Ｍ１５／ｒｅｐ４を用いて、こ
こに記載説明した実施例を行った。ＲＥＱＵＩＥＭを発
現するために適している多くの株のうちの一つにすぎな
いこの株は、Qiagenから市販されている。
【０２０３】形質転換株をアンピシリン存在下のＬＢ培
地で生育する能力（Ａｍｐr表現型）によって同定し
た。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、クロ
ーン化されたＤＮＡの同一性を制限解析によって確認し
た。所望の構築物を含有するクローンを一晩（「Ｏ／
Ｎ」）、アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）およびカナ
マイシン（２５ｕｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ液体培地で
生育させた。
【０２０４】Ｏ／Ｎ培養は、約１：１００ないし１：２
５０の希釈で大量培養に植菌するために使用した。細胞
を６００ｎｍでの濁度（ＯＤ600）０.４ないし０.６ま
で生育させた。次いで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を最終濃度１ｍＭに
なるように添加して、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化
することによってｌａｃ感受性プロモーターからの転写
を誘導した。次いで、細胞をさらに３ないし４時間イン
キュベートした。次いで、標準的方法によって、細胞を
遠心によって集め、破壊した。封入体を通常の収集方法
を用いて破壊した細胞から精製し、封入体からタンパク
質を８Ｍ尿素中に可溶化した。可溶化タンパク質を含有
する８Ｍ尿素溶液を２ｘリン酸緩衝化セライン（「ＰＢ
Ｓ」）のＰＤ−１０カラムに通し、それによって尿素を
除去し、緩衝液を交換して、タンパク質を再び折り畳ま
せた。タンパク質を、内毒素を除去するためのクロマト
グラフィーのさらなる工程によって精製した。次いで、
それを滅菌濾過した。滅菌濾過されたタンパク質調製物
を９５μｇ／ｍｌの濃度にして２ＸＰＢＳ中に保存し
た。
【０２０５】実施例２ バキュロウイルス発現系におけ
るヒト・ＲＥＱＵＩＥＭのクローニングおよび発現 ｃＤＮＡライブラリークローンにおいて、完全長のヒト
・ＲＥＱＵＩＥＭタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列
を、遺伝子の５'および３'配列に相当するＰＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。
【０２０６】５'プライマーは、下線のＥｃｏＲＩ制限
酵素部位を含有する、５'ＡＴＡＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣ
ＡＴＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴＧ３'
（配列番号：５）の配列を、、つづいて図１ないし３の
ＲＥＱＵＩＥＭの配列１２２０塩基を有する。
【０２０７】３'プライマーは、下線のＥｃｏＲＶ制限
酵素部位を、つづいて停止暗号を含む図１ないし３に示
すＲＥＱＵＩＥＭの暗号配列の最後の２０塩基に相補的
なヌクレオチドを含有する、５'ＡＣＧＴＣＴＡＧＡＧ
ＡＴＡＴＣＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧ
３'（配列番号：６）の配列を有する。
【０２０８】増幅された断片を市販のキット（「Genecl
ean」BIO101 Inc., Lajolla, Ca）を用いて１％アガロ
ースゲルから単離した。次いで、その断片をＥｃｏＲＩ
およびＥｃｏＲＶで消化し、再び１％アガロースゲルで
精製した。本明細書中では、この断片をＦ２という。
【０２０９】Summersら, A MANUAL OF METHODS FOR BAC
ULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELLCULTURE PROCEDURE
S, Texas Agricultural Expermental Station Bulletin
No.1555(1987)に記載されているごとき標準的な方法を
用いて、ベクターｐＲＧ１を、バキュロウイルス発現系
においてＲＥＱＵＩＥＭタンパク質を発現させるために
用いた。この発現ベクターは、Autographa californica
の核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘド
リンプロモーターと、それに続く便利な制限部位を含有
する。Ｎ末端メチオニンを包含するＡｃＭＮＰＶ ｇｐ
６７のシグナルペプチドは、ＥｃｏＲＩ部位のすぐ上流
に位置する。ＳＶ４０のポリアデニル化部位は効果的な
ポリアデニル化のために使用される。組換えウイルスを
簡単に選択するために、E. coliからのβガラクトシダ
ーゼ遺伝子がポリヘドリンプロモーターと同じ配向性で
挿入され、その後にポリヘドリン遺伝子のポリアデニル
化シグナルが続く。ポリヘドリン配列には、クローン化
されたポリヌクレオチドを発現する生きたウイルスを生
産するための、野生型のウイルスＤＮＡとの細胞媒介相
同的組換えのためのウイルス配列が両側に存在する。
【０２１０】当業者が容易に適用するであろうごとく、
構築物が、所望により、読み枠が一致したＡＵＧおよび
シグナルペプチドのごとき、適切に配置された転写、翻
訳、トラフィッキングなどのためのシグナルを提供する
ならば、ｐＡ２−ＧＰのかわりに、ｐＡｃ３７３、ｐＶ
Ｌ９４１およびｐＡｃＩＭ１のごとき多くの他のバキュ
ロウイルスベクターが使用できるであろう。かかるベク
ターは特に、Luckow et al., Viology 170:31-39に記載
されている。
【０２１１】当該分野において知られている通常の方法
を用いて、プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＥｃ
ｏＲＶで消化し、次いで、仔牛小腸ホスファターゼを用
いて脱リン酸化する。次いで、ＤＮＡを、市販のキット
（「Geneclean」BIO 101 Inc., La Jolla, Ca）を用い
て１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮ
Ａを本明細書中では「Ｖ２」という。
【０２１２】断片Ｆ２および脱リン酸化プラスミドＶ２
をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結する。E. coli HB101細胞
を連結混合物で形質転換し、培地に塗布する。ＥｃｏＲ
ＩおよびＥｃｏＲＶを用いて個々のコロニーからのＤＮ
Ａを消化し、消化産物をゲル電気泳動によって解析する
ことによって、ヒト・ＲＥＱＵＩＥＭ遺伝子を有するプ
ラスミドを含有する細菌を同定する。クローン化された
断片の配列をＤＮＡ塩基配列決定によって確認する。こ
のプラスミドを本明細書ではｐＢａｃＲＥＱＵＩＥＭと
いう。
【０２１３】Felgnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:7413-7417(1987)によって記載されているリポフェク
ション法を用いて、５μｇのプラスミドｐＢａｃＲＥＱ
ＵＩＥＭを、１.０μｇの市販の直鎖状バキュロウイル
スＤＮＡ（「BaculoGoldTM baculovirus DNA」, Pharm
ingen, San Diego, CA.）とコトランスフェクションす
る。１μｇのBaculoGoldTM virus DNAおよび５μｇのプ
ラスミドｐＢａｃＲＥＱＵＩＥＭを、５０μｌの無血清
グレース（Grace's）培地（life Technologies inc., G
aithersburg, MD.）を含有するマイクロタイタープレー
トの滅菌ウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポ
フェクチンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混
合し、室温で１５分間インキュベートする。次いで、ト
ランスフェクション混合物を、１ｍｌの無血清グレース
培地の入った３５ｍｍ組織培養プレートにまかれたＳｆ
９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）に滴下する。
プレートを前後にゆすって新たに添加した溶液を混合す
る。次いで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベ
ートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレ
ートから除去し、１０％ウシ胎児血清を含む１ｍｌのグ
レース昆虫培地を添加する。プレートをインキュベータ
ー中に戻し、２７℃で４日間培養を継続した。
【０２１４】４日後、上清を集め、上記引用したSummer
es and Smithによって記載されたごとく、プラークアッ
セイを行う。青く染色されたプラークを形成する、gal
を発現しているクローンを容易に同定および単離でき
る、「Blue Gal」（Life Technologies Inc., Gaithers
burg）を含むアガロースゲルを用いた。（このタイプの
「プラークアッセイ」の詳細な説明は、昆虫細胞培養の
使用者用マニュアルおよびLife Technologies Inc., Ga
ithersburg, 9-10頁によるバキュロウイルス学において
も見いだされ得る）。
【０２１５】連続希釈後４日で、ウイルスを細胞に添加
する。適当なインキュベーション後、青く染色されたプ
ラークをエッペンドルフピペットのチップで拾う。次い
で、組換えウイルスを含有するアガロースを２００μｌ
のグレース培地を含有するエッペンドルフチューブ中で
再懸濁する。アガロースを簡単な遠心によって除去し、
組換えバキュロウイルスを含有する上清を用いて、３５
ｍｍディッシュ中にまかれたＳｆ９細胞を感染させる。
４日後、これら培養ディッシュの上清を集め、次いで、
４℃で保存する。好ましく挿入されたＲＥＱＵＩＥＭを
含有するクローンを、制限マッピングおよび配列決定を
包含するＤＮＡ解析によって同定する。これを本明細書
中ではＶ−ＲＥＱＵＩＥＭという。
【０２１６】Ｓｆ９細胞を１０％熱変性ＦＢＳを含むグ
レース培地で生育させる。細胞を感染の多重度（「ＭＯ
Ｉ」）約２（約１ないし約３）で組換えバキュロウイル
スＶ−ＲＥＱＵＩＥＭで感染させる。６時間後、培地を
除去し、メチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９０
０ＩＩ培地で置換する（Life Technologies Inc., Gait
hersburgから入手）。４２時間後、５μＣｉの35Ｓメチ
オニンおよび６５μＣｉの35Ｓシステイン（Amershamか
ら入手）を添加する。細胞をさらに１６時間インキュベ
ートし、次いで、遠心で集め、溶解し、ラベルされたタ
ンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフ
ィーによって視覚化する。
【０２１７】実施例３ ＣＯＳ細胞でのＲＥＱＵＩＥＭ
の発現 発現プラスミドＲＥＱＵＩＥＭ ＨＡを、発現ベクター
ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen Inc.から入手可能
である）中にＲＥＱＵＩＥＭをコードするｃＤＮＡをク
ローニングすることにより作成する。
【０２１８】発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは、
（１）E. coliおよび他の原核細胞における増殖に効果
的なE. coliの複製開始点；（２）プラスミドを含有す
る原核細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；
（３）真核細胞における増殖のためのＳＶ４０の複製開
始点；（４）ｃＤＮＡを、都合よくＣＭＶプロモーター
の発現制御下に置き、ポリリンカー中の制限部位によっ
て、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナル
と作動可能に連結できるように配置された、ＣＭＶプロ
モーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロンおよびポ
リアデニル化シグナルを含有する。
【０２１９】完全長のＲＥＱＵＩＥＭ前駆体をコードす
るＤＮＡ断片および３'末端に読み枠を一致させて融合
されたＨＡタグを、組換えタンパク質の発現がＣＭＶプ
ロモーターによって行われるようにベクターのポリリン
カー領域にクローン化する。ＨＡタグは、Wilson et a
l., Cell 37:767(1984)によって記載されたインフルエ
ンザ赤血球凝集素タンパク質から由来するエピトープに
対応する。標的タンパク質にＨＡタグを融合すると、Ｈ
Ａエピトープを認識する抗体で組換えタンパク質を容易
に検出できる。
【０２２０】プラスミドの構築方法は以下の通りであ
る。E. coliおよびS. fugiperdaにおけるＲＥＱＵＩＥ
Ｍの発現用の発現ベクターの構築に関する上記方法と同
様にして、ｃＤＮＡライブラリーからのクローンのＲＥ
ＱＵＩＥＭｃＤＮＡを簡便な制限部位を含むプライマー
を用いて増幅する。発現されたＲＥＱＵＩＥＭの検出、
精製、および特徴付けを容易にするために、プライマー
の一つは上記のごとき凝集素タグ（「ＨＡタグ」）を含
有する。
【０２２１】適切なプライマーは、以下のこの実施例で
使用されるプライマーを包含する。下線のＥｃｏＲＩ部
位、ＡＵＧ開始コドン、およびその後の６つのコドンを
含有し、６ペプチド凝集素タグを形成する５'プライマ
ーは以下の配列を有する。５'ＡＴＡＡＣＧＡＧＡＡＴ
ＴＣＡＴＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＴＧ
３'
【０２２２】下線のＥｃｏＲＶ部位、および２０ｂｐの
３'暗号配列（３'末端）を含有する３'プライマーは以
下の配列を有する。５'ＡＣＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＴ
ＣＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧ３'
【０２２３】ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片およびベク
ターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを消化し次いで、連結する。
連結混合物でE. coli株SURE（Stratagene Cloning Syst
ems,11099North Torrey Pines Road, La Jolla, CA9203
7から市販）を形質転換し、形質転換された培養液をア
ンピシリン培地にまき、次いで、アンピシリン耐性コロ
ニーが生育できるようにインキュベートする。プラスミ
ドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、ＲＥＱＵＩＥＭを
コードする断片の存在を制限解析およびゲル上で大きさ
を解析することにより調べた。
【０２２４】組換えＲＥＱＵＩＥＭの発現のために、Ｃ
ＯＳ細胞を、例えば、上記引用したSambrook et al.に
記載されているごとくＤＥＡＥ−デキストランを用い
て、上記のごとく発現ベクターでトランスフェクション
する。細胞をベクターによるＲＥＱＵＩＥＭの発現のた
めの条件下でインキュベートする。
【０２２５】ＲＥＱＵＩＥＭ ＨＡ融合タンパク質の発
現を、例えば、Harlowら、ANTIBODIES: A LABORATORY M
ANUAL, 2nd Ed.;Cold Spring Haror Laboratory Press,
ColdSpring Harbor, New York (1988)に記載の方法を
用いて、放射ラベルおよび免疫沈降によって検出する。
この目的のために、トランスフェクション２日後に細胞
を35Ｓ−システインを含有する培地で８時間インキュベ
ートすることによりラベルする。細胞および培地を集
め、細胞を洗浄し、上記引用したWilson et al.により
記載されたごとく、界面活性剤含有のＲＩＰＡ緩衝液：
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４
０、０.５％ＤＯＣ、５０ｍＭＴＲＩＳ、ｐＨ７.５で溶
解する。ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いてタンパ
ク質を細胞溶解物および培養液から沈澱させる。次い
で、沈澱したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび
オートラジオグラフィーにより解析する。予想される大
きさの発現産生物が細胞溶解物中に見いだされ、それは
ネガティブ対照には見られない。
【０２２６】実施例４ ヒト・ＲＥＱＵＩＥＭの遺伝子
治療的発現 線維芽細胞を皮膚生検により得る。得られた組織を組織
培養液中に入れ、小さく分ける。組織の小さい塊を組織
培養フラスコの湿った表面上に置き、各フラスコに約１
０個を入れる。フラスコを逆さにして密閉し、一晩室温
で放置する。室温で２４時間後、フラスコを逆転させ、
組織の塊はフラスコの底に固定されたままで、新しい培
地を添加する（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよ
びストレプトマイシンを添加したHam's F12培地）。次
いで、組織を３７℃で約１週間インキュベートする。こ
の時新しい培地を添加し、引き続き数日毎に交換する。
さらに２週間培養後、単層の線維芽細胞が現れる。その
単層をトリプシン処理し、より大きなフラスコで規模を
拡大する。
【０２２７】遺伝子治療のためのベクターを、発現させ
るべき断片をクローニングするために制限酵素で消化す
る。消化したベクターを、自己連結を阻止するためにウ
シ小腸ホスファターゼで処理する。脱リン酸化され、直
鎖状になったベクターをアガロースゲル上で分画し精製
する。
【０２２８】活性ＲＥＱＵＩＥＭを発現することができ
るＲＥＱＵＩＥＭ ｃＤＮＡを単離する。必要ならば、
ベクター中にクローニングするために断片の末端を修飾
する。例えば、５'はみ出し部分をＤＮＡポリメラーゼ
で処理して平滑末端にしてもよい。３'はみ出し末端部
分をＳ１ヌクレアーゼを用いて除去してもよい。リンカ
ーをＴ４ ＤＮＡリガーゼで平滑末端に連結してもよ
い。
【０２２９】等量のモロニーマウス白血病ウイルスの直
鎖骨格およびＲＥＱＵＩＥＭ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結する。連結混合物を用いてE. col
iを形質転換し、次いで、その細菌をカナマイシン含有
寒天培地上に塗布する。カナマシン表現型および制限解
析により、ベクターが正しい挿入遺伝子を有することを
確認する。パッケージング細胞を、１０％ウシ血清（Ｃ
Ｓ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン含有のDulb
ecco's Modified Eagles Medium（ＤＭＥＭ）中で集密
度にまで組織培養する。ＲＥＱＵＩＥＭ遺伝子を含有す
るベクターをパッケージング細胞に標準的方法で導入す
る。ＲＥＱＵＩＥＭ遺伝子を含有する感染能力のあるウ
イルス粒子をパッケージング細胞から集め、以後これを
産生細胞という。
【０２３０】新鮮な培養液を産生細胞に添加し、適当な
インキュベーション期間後、集密的産生細胞のプレート
から培養液を集める。感染能力のあるウイルス粒子を含
有する培養液をMilliporeフィルターで濾過して分離さ
れる産生細胞を除去する。次いで、濾過された培養液を
用いて線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞の亜集密プ
レートから培養液を除去し、濾過した培養液で迅速に置
換する。形質導入を促進するためにポリブレン（Aldric
h）を培地に添加してもよい。適当なインキュベーショ
ン後、培養液を除去し、新鮮な培養液で置換する。次い
で、ウイルスの力価が高ければ実質的にすべての線維芽
細胞が感染し、選択は必要ないであろう。力価が低けれ
ば形質導入細胞を選択して増殖するために、neoまたはh
isのごとき選択マーカーを有するレトロウイルスベクタ
ーを使用する必要がある。
【０２３１】次いで、操作された線維芽細胞を単独で、
または、cytodex3ビーズのごときマイクロキャリアービ
ーズ上で集密的に生育させた後、いずれかをラットに注
射してもよい。注射された線維芽細胞はＲＥＱＵＩＥＭ
産物を産生し、そのタンパク質の生物学的作用を宿主に
伝達する。
【０２３２】詳細に記載された前述の記述および実施例
とは異なるように、本発明を実施してもよいことは明ら
かである。本発明の多くの修飾および変形は、上記方法
の範囲において可能であり、従って付記した請求の範囲
の観点内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＲＥＱＵＩＥＭの核酸および推定アミノ
酸配列（配列番号：１および２）を示す。
【図２】 ヒトＲＥＱＵＩＥＭの核酸および推定アミノ
酸配列（配列番号：１および２）を示す。
【図３】 ヒトＲＥＱＵＩＥＭの核酸および推定アミノ
酸配列（配列番号：１および２）を示す。
【図４】 ヒトＲＥＱＵＩＥＭ（上）およびマウス・レ
クイエムの既知のメンバー（下）の配列の並びを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 マーク・アール・ハール アメリカ合衆国19404ペンシルベニア州ノ リスタウン、ストーニー・ブルック・ドラ イブ105番 (72)発明者 クリスティン・ケイ・キクリー アメリカ合衆国19468ペンシルベニア州リ ンフィールド、リメリック・センター・ロ ード499番

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）配列番号：２のアミノ酸１ないし４０
    ６を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
    チドと少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド； ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオ
    チド；および ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくと
    も１５塩基を含んでなるポリヌクレオチドからなる群か
    ら選択されるメンバーを有してなる単離されたポリヌク
    レオチド。
  2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
    １記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
    １記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 配列番号：１に示すヌクレオチド１ない
    し１５５５を含んでなる請求項２記載のポリヌクレオチ
    ド。
  5. 【請求項５】 配列番号：１に示すヌクレオチド２１な
    いし１２４８を含んでなる請求項２記載のポリヌクレオ
    チド。
  6. 【請求項６】 配列番号：２のアミノ酸１ないし４０６
    を含んでなるポリペプチドをコードする請求項２記載の
    ポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】ａ）配列番号：２のヒトＤＮＡによって発
    現される同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレ
    オチドと少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチ
    ド； ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオ
    チド；および ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくと
    も１５塩基を含んでなるポリヌクレオチドからなる群か
    ら選択されるメンバーを有してなる単離されたポリヌク
    レオチド。
  8. 【請求項８】 請求項２に記載のＤＮＡを含んでなるベ
    クター。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載のベクターを含んでなる
    宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 前記したＤＮＡによってコードされる
    ポリペプチドを請求項９の宿主細胞から発現させること
    からなるポリペプチドの製造方法。
  11. 【請求項１１】 ポリペプチドを発現する細胞が請求項
    ８に記載のベクター中に含まれるヒトＤＮＡによってコ
    ードされるポリぺプチドを発現するように、該細胞を該
    ベクターで形質転換またはトランスフェクションするこ
    とからなる、該細胞の製造方法。
  12. 【請求項１２】 配列番号：２のアミノ酸１ないし４０
    ６と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有して
    なるポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 配列番号：２に示すアミノ酸配列を有
    してなるポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載のポリペプチドに対
    するアゴニスト。
  15. 【請求項１５】 請求項１２に記載のポリペプチドに対
    する抗体。
  16. 【請求項１６】 請求項１２に記載のポリペプチドの活
    性を阻害するアンタゴニスト。
  17. 【請求項１７】 治療上有効量の請求項１２に記載のポ
    リペプチドを患者に投与することからなる、ＲＥＱＵＩ
    ＥＭを必要とする患者の治療方法。
  18. 【請求項１８】 治療上有効量のポリペプチドを、該ポ
    リぺプチドをコードするＤＮＡを患者に提供し、該ポリ
    ペプチドをインビボで発現させることによって、投与す
    る請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ＲＥＱＵＩＥＭポリぺプチドを阻害す
    る必要のある患者の治療方法であって、治療上有効量の
    請求項１６に記載のアンタゴニストを該患者に投与する
    ことからなる治療方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１２に記載のポリぺプチドの発
    現に関連する疾患または該疾患に対する感受性の診断方
    法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列にお
    ける変異を決定することからなる診断方法。
  21. 【請求項２１】 宿主由来の試料中の請求項１２に記載
    のポリペプチドの存在について解析することからなる診
    断方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１２に記載のポリぺプチドのた
    めの受容体に結合し、該受容体を活性化または阻害する
    化合物の同定方法であって、 ポリペプチドのための受容体（化合物の該受容体への結
    合に応答して検出可能なシグナルを提供することができ
    る第２の成分と結合している）を細胞表面上に発現して
    いる細胞を、受容体との結合を可能とする条件下で、ス
    クリーニングされる化合物と接触させ；および該化合物
    と該受容体との相互作用から生じるシグナルの有無を検
    出することによって、その化合物が受容体に結合してそ
    の受容体を活性化または阻害するかどうかを決定するこ
    とからなる同定方法。
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