JPH1082793A - 活性化合物をスクリーニングするための方法および装置、ならびに該装置に使用するための多重試料ホルダー - Google Patents
活性化合物をスクリーニングするための方法および装置、ならびに該装置に使用するための多重試料ホルダーInfo
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- JPH1082793A JPH1082793A JP9205949A JP20594997A JPH1082793A JP H1082793 A JPH1082793 A JP H1082793A JP 9205949 A JP9205949 A JP 9205949A JP 20594997 A JP20594997 A JP 20594997A JP H1082793 A JPH1082793 A JP H1082793A
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- G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
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- G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
- G01Q60/38—Probes, their manufacture, or their related instrumentation, e.g. holders
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 多数の試料を極めて短時間に分析することが
できるような活性化合物をスクリーニングする方法を提
供する。 【解決手段】 活性化合物をスクリーニングするための
方法の場合、走査原子力鏡検法用機器（ＳＡＦＭ機器）
を用いて観察することができる信号［Ｓ］の変化により
活性化合物を検出し、この場合ＳＡＦＭ機器は、必要に
応じて圧電片持ばりを有している。 【効果】 この方法は、時間を節約するだけでなく、で
きるだけ僅かな努力が必要とされればよい。
できるような活性化合物をスクリーニングする方法を提
供する。 【解決手段】 活性化合物をスクリーニングするための
方法の場合、走査原子力鏡検法用機器（ＳＡＦＭ機器）
を用いて観察することができる信号［Ｓ］の変化により
活性化合物を検出し、この場合ＳＡＦＭ機器は、必要に
応じて圧電片持ばりを有している。 【効果】 この方法は、時間を節約するだけでなく、で
きるだけ僅かな努力が必要とされればよい。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、活性化合物をスク
リーニングするための方法、殊に活性化合物の分野にお
いて質量スクリーニングするための方法に関する。更
に、本発明は、活性化合物をスクリーニングするための
走査原子力鏡検法用機器（ＳＡＦＭ機器）、およびこの
走査原子力鏡検法用機器と制御装置とからなる装置に関
する。また、本発明は、該装置に使用するための多重試
料ホルダーにも関する。
リーニングするための方法、殊に活性化合物の分野にお
いて質量スクリーニングするための方法に関する。更
に、本発明は、活性化合物をスクリーニングするための
走査原子力鏡検法用機器（ＳＡＦＭ機器）、およびこの
走査原子力鏡検法用機器と制御装置とからなる装置に関
する。また、本発明は、該装置に使用するための多重試
料ホルダーにも関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素または受容体または同様の巨大分子
に対する作用に関連して最適化されている新規の塩基性
構造、即ち分子構造、例えばリガンド、アゴニストまた
は活性化合物を見い出すことは、今日でさえなお多数の
分野において可能性のある１つのプロセスである。それ
というのも、約１０００００〜１００００００という極
めて数の多い物質は、標的蛋白質に抗する活性物質が見
い出されるまで走査されなければならないからである。
数多くの物質の研究については、例えば細胞または酵素
を用いての活性試験が考えられるとしても長時間を要す
るものである。それ故に、このような数多くの物質は、
試験が高度に敏感であり、ひいては極めて迅速である場
合に限り迅速に試験されかつ研究されることができるに
すぎない。例えば、現在のＥＬＩＳＡ法において常用さ
れているような試験で９６穴の微量滴定量の形式を使用
することによって１つの促進を達成することができる。
に対する作用に関連して最適化されている新規の塩基性
構造、即ち分子構造、例えばリガンド、アゴニストまた
は活性化合物を見い出すことは、今日でさえなお多数の
分野において可能性のある１つのプロセスである。それ
というのも、約１０００００〜１００００００という極
めて数の多い物質は、標的蛋白質に抗する活性物質が見
い出されるまで走査されなければならないからである。
数多くの物質の研究については、例えば細胞または酵素
を用いての活性試験が考えられるとしても長時間を要す
るものである。それ故に、このような数多くの物質は、
試験が高度に敏感であり、ひいては極めて迅速である場
合に限り迅速に試験されかつ研究されることができるに
すぎない。例えば、現在のＥＬＩＳＡ法において常用さ
れているような試験で９６穴の微量滴定量の形式を使用
することによって１つの促進を達成することができる。
【０００３】最近、走査トンネル鏡検法（ＳＴＭ）［G.
Binnig, H. Rohrer, C. Gerber, E. Weibel; Phys. Re
v. Lett. 49 (1982) 57］の発見は、極めて敏感な走査
プローブ法の分野における急速な開発と時を同じくする
ものであった。また、この走査プローブ法は、走査原子
力鏡検法（ＳＡＦＭ）［G. Binnig, C.F. Quate, C.Ger
ber; Phys. Rev. Lett. 56 (1986) 930］および走査光
検波鏡検法（ＳＯＤＭ）［E. Betzig, J.K. Trautman;
Science 257 (1992) 189］をも包含する。走査原子力鏡
検法の場合には、片持ばり上に位置したチップは、研究
すべき試料に亘って一列ずつ移動し、片持ばりのふれ
は、光プリンター（light printer）の型により試料の
位相の１つの関数として測定される。
Binnig, H. Rohrer, C. Gerber, E. Weibel; Phys. Re
v. Lett. 49 (1982) 57］の発見は、極めて敏感な走査
プローブ法の分野における急速な開発と時を同じくする
ものであった。また、この走査プローブ法は、走査原子
力鏡検法（ＳＡＦＭ）［G. Binnig, C.F. Quate, C.Ger
ber; Phys. Rev. Lett. 56 (1986) 930］および走査光
検波鏡検法（ＳＯＤＭ）［E. Betzig, J.K. Trautman;
Science 257 (1992) 189］をも包含する。走査原子力鏡
検法の場合には、片持ばり上に位置したチップは、研究
すべき試料に亘って一列ずつ移動し、片持ばりのふれ
は、光プリンター（light printer）の型により試料の
位相の１つの関数として測定される。
【０００４】試料の対象および性質に依存して、研究す
べき物質の特異的性質を検出することができる種々の操
作モードが存在する［S.N. Margonov, M.-H. Whangbo:
Surface Analysis with STM and AFM, VCH Verlagsgese
llschaft mbH, Weinheim 1996］。例えば、弾性および
摩擦抵抗の差、また化学構造の差を検出することができ
る［S. Akari, D. Horn, H. Keller, W. Schrepp; Adv.
Mater. 7 (1995) 549］。原子力鏡検法は、環境条件下
および水の下であっても使用することができ、幾つかの
研究は、生物学的対象について実施された［C. Bustama
nte, D. Keller; Physics Today, December 1995, 2
3］。測定試料を或る一定の方法で調製する場合には、
生物学的モデル系の間の相互作用は、直接的に検出する
こともできる［E.-L. Florin, V. Moy, H. Gaub; Scien
ce 264 (1994) 415］。この刊行物の中に記載された研
究のためには、ビオチン／アビジン系が選択された。ビ
オチンは、血清蛋白質ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に
結合された。更に、この血清蛋白質ＢＳＡは、原子力顕
微鏡の窒化珪素チップに非特異的に結合されていた。使
用される試料は、アビジンが結合されたビオチニル化さ
れたアガロースビーズであった。アビジンは、ビオチン
のために４つの結合部位を有している。こうして、２つ
の種の間の結合力を測定することが可能であった。即
ち、リガンド／受容体の相互作用は、直接に検出するこ
とができる。免疫検定法の分野における使用は、ＷＯ
９２／１５７０に示唆されていた。
べき物質の特異的性質を検出することができる種々の操
作モードが存在する［S.N. Margonov, M.-H. Whangbo:
Surface Analysis with STM and AFM, VCH Verlagsgese
llschaft mbH, Weinheim 1996］。例えば、弾性および
摩擦抵抗の差、また化学構造の差を検出することができ
る［S. Akari, D. Horn, H. Keller, W. Schrepp; Adv.
Mater. 7 (1995) 549］。原子力鏡検法は、環境条件下
および水の下であっても使用することができ、幾つかの
研究は、生物学的対象について実施された［C. Bustama
nte, D. Keller; Physics Today, December 1995, 2
3］。測定試料を或る一定の方法で調製する場合には、
生物学的モデル系の間の相互作用は、直接的に検出する
こともできる［E.-L. Florin, V. Moy, H. Gaub; Scien
ce 264 (1994) 415］。この刊行物の中に記載された研
究のためには、ビオチン／アビジン系が選択された。ビ
オチンは、血清蛋白質ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に
結合された。更に、この血清蛋白質ＢＳＡは、原子力顕
微鏡の窒化珪素チップに非特異的に結合されていた。使
用される試料は、アビジンが結合されたビオチニル化さ
れたアガロースビーズであった。アビジンは、ビオチン
のために４つの結合部位を有している。こうして、２つ
の種の間の結合力を測定することが可能であった。即
ち、リガンド／受容体の相互作用は、直接に検出するこ
とができる。免疫検定法の分野における使用は、ＷＯ
９２／１５７０に示唆されていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記の記載を考慮に入
れた場合、本発明の課題は、多数の試料を極めて短時間
に分析することができるような活性化合物をスクリーニ
ングする方法を提供することである。この方法は、時間
を節約するだけでなく、できるだけ僅かな努力が必要と
されればよいはずである。
れた場合、本発明の課題は、多数の試料を極めて短時間
に分析することができるような活性化合物をスクリーニ
ングする方法を提供することである。この方法は、時間
を節約するだけでなく、できるだけ僅かな努力が必要と
されればよいはずである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この課題は、走査原子力
鏡検法用機器（ＳＡＦＭ機器）を用いて観察することが
できる信号［Ｓ］の変化により活性化合物を検出するこ
とにより、活性化合物をスクリーニングするための方法
によって解決される。
鏡検法用機器（ＳＡＦＭ機器）を用いて観察することが
できる信号［Ｓ］の変化により活性化合物を検出するこ
とにより、活性化合物をスクリーニングするための方法
によって解決される。
【０００７】また、本発明は、前記スクリーニング法に
おける走査原子力鏡検法用機器の使用、ならびに走査原
子力鏡検法用機器、個別または多重の試料ホルダーおよ
び個別または多重の試料ホルダーの個々の区画をアドレ
ス化するための制御装置からなる装置にも関する。更
に、本発明は、支持体と複数の試料調節領域とからなる
多重試料ホルダーにも関する。
おける走査原子力鏡検法用機器の使用、ならびに走査原
子力鏡検法用機器、個別または多重の試料ホルダーおよ
び個別または多重の試料ホルダーの個々の区画をアドレ
ス化するための制御装置からなる装置にも関する。更
に、本発明は、支持体と複数の試料調節領域とからなる
多重試料ホルダーにも関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の好ましい実施態様は、請
求項２から６までのいずれか１項、請求項８または９、
または請求項１１に記載されている。
求項２から６までのいずれか１項、請求項８または９、
または請求項１１に記載されている。
【０００９】上記したように、本発明は、殊に質量スク
リーニングの分野において活性化合物をスクリーニング
する方法にも関連し、この場合には、走査原子力鏡検法
または適当な走査原子力鏡検法用機器が使用される。１
つの試料は、参照活性化合物、研究すべき物質またはリ
ガンド等を原子力顕微鏡の測定チップに結合させること
によって製薬学的な栽培植物の保護分野において活性化
合物をスクリーニングするために調製される。試料は、
試料と例えば受容体との間の当該相互作用を力／分離曲
線により検出するために使用される。本方法（図１〜図
３参照）において、変性されたチップは、支持体上の受
容体を用いて研究されるべき支持体に向かって移動さ
れ；力は、片持ばりのふれにより測定される。このこと
は、試料からの分離ｄ［ｎｍ］に対する力Ｆ［任意の単
位（arbitrary units）、ａ．ｕ．］として図にプロッ
トされている（図４および図５参照）。目盛が定められ
たチップを使用する場合には、絶対的な用語で示されて
いてもよい。こうして定められた力／分離曲線は、常に
下降曲線部分および上昇曲線部分を有している（図４参
照）。このことは、測定サイクルに関して以下に記載さ
れている：試料からの分離が極めて小さい場合には、チ
ップは、試料の化学的および電気的な組成に依存する引
付け力を経験する（図４および図５中の曲線の右手部
分）。更に、チップが試料表面に到達した場合には、こ
のチップは、反発力を受け；このことは、図４および図
５中の曲線の左手部分に示されている。従って、チップ
を引き込めた場合には、反発力は減少する。更に引き込
めた場合には、このチップは、引きつける相互作用の力
により支持体に或る程度結合されているように留まる。
更に、分離が十分に大きい場合には、この片持ばりは、
再び安定状態を占める。引き付ける力の相互作用に使用
される尺度は、零の力線の下での曲線の面積、より正確
には、測定された曲線と横座標に平行で縦座標の零値を
通る線との交差点の面積である。
リーニングの分野において活性化合物をスクリーニング
する方法にも関連し、この場合には、走査原子力鏡検法
または適当な走査原子力鏡検法用機器が使用される。１
つの試料は、参照活性化合物、研究すべき物質またはリ
ガンド等を原子力顕微鏡の測定チップに結合させること
によって製薬学的な栽培植物の保護分野において活性化
合物をスクリーニングするために調製される。試料は、
試料と例えば受容体との間の当該相互作用を力／分離曲
線により検出するために使用される。本方法（図１〜図
３参照）において、変性されたチップは、支持体上の受
容体を用いて研究されるべき支持体に向かって移動さ
れ；力は、片持ばりのふれにより測定される。このこと
は、試料からの分離ｄ［ｎｍ］に対する力Ｆ［任意の単
位（arbitrary units）、ａ．ｕ．］として図にプロッ
トされている（図４および図５参照）。目盛が定められ
たチップを使用する場合には、絶対的な用語で示されて
いてもよい。こうして定められた力／分離曲線は、常に
下降曲線部分および上昇曲線部分を有している（図４参
照）。このことは、測定サイクルに関して以下に記載さ
れている：試料からの分離が極めて小さい場合には、チ
ップは、試料の化学的および電気的な組成に依存する引
付け力を経験する（図４および図５中の曲線の右手部
分）。更に、チップが試料表面に到達した場合には、こ
のチップは、反発力を受け；このことは、図４および図
５中の曲線の左手部分に示されている。従って、チップ
を引き込めた場合には、反発力は減少する。更に引き込
めた場合には、このチップは、引きつける相互作用の力
により支持体に或る程度結合されているように留まる。
更に、分離が十分に大きい場合には、この片持ばりは、
再び安定状態を占める。引き付ける力の相互作用に使用
される尺度は、零の力線の下での曲線の面積、より正確
には、測定された曲線と横座標に平行で縦座標の零値を
通る線との交差点の面積である。
【００１０】力／分離曲線の最大の差は、試料表面から
片持ばりを引き出す際に記録される。しかし、特殊に設
計された片持ばり、例えば極めて低い力定数を有する極
めて薄手の片持ばりまたは圧電に基づく片持ばりの場合
には、片持ばりのふれを引きつける力の相互作用の結果
として検出されるものと推測することもできる。
片持ばりを引き出す際に記録される。しかし、特殊に設
計された片持ばり、例えば極めて低い力定数を有する極
めて薄手の片持ばりまたは圧電に基づく片持ばりの場合
には、片持ばりのふれを引きつける力の相互作用の結果
として検出されるものと推測することもできる。
【００１１】活性化合物をスクリーニングするために
は、有利に例えば次のようにして走査原子力鏡検法を使
用することができる：まず、受容体５（図１、図２およ
び図３）は、支持体４の適当な表面上に固定化される。
この固定化すべき物質は、以下、分子Ａとも呼称され
る。支持体は、有利に蒸着金被膜を備えたシリコーンウ
ェファーであることができるか、または別の支持体、殊
に雲母、黒鉛、前処理、例えばプラズマまたはコロナ放
電処理または吸着によって変性されたポリマーまたは支
持体であることができる。
は、有利に例えば次のようにして走査原子力鏡検法を使
用することができる：まず、受容体５（図１、図２およ
び図３）は、支持体４の適当な表面上に固定化される。
この固定化すべき物質は、以下、分子Ａとも呼称され
る。支持体は、有利に蒸着金被膜を備えたシリコーンウ
ェファーであることができるか、または別の支持体、殊
に雲母、黒鉛、前処理、例えばプラズマまたはコロナ放
電処理または吸着によって変性されたポリマーまたは支
持体であることができる。
【００１２】支持体上の受容体または分子Ａの固定化
は、吸着によって直接に行なうことができる。しかし、
研究すべき分子をスペーサー２′を用いて支持体表面上
に固定化することも好ましい。好ましいスペーサーは、
アミノヘキサン酸またはスペルミジンであるかまたは研
究すべき分子Ａの他のリガンドである。このスペーサー
は、直接に支持体表面上に吸着させることができる。し
かし、まず、メルカプトカルボン酸、例えば１０−メル
カプトデカン酸を支持体表面、例えば蒸着金被膜を備え
たシリコーンウェファーの表面に結合させることは、好
ましい。分子は、チオール基により金表面に結合し、準
モノ分子層を形成させる。こうして変性された支持体表
面は、その後に上記のスペーサー、有利にアミノヘキサ
ン酸またはスペルミジンにより誘導体化される。最終的
に、メルカプトカルボン酸のカルボキシル基は、まず公
知方法によって活性化され、その後にスペーサーと反応
されるかまたはスペーサーで誘導体化される。
は、吸着によって直接に行なうことができる。しかし、
研究すべき分子をスペーサー２′を用いて支持体表面上
に固定化することも好ましい。好ましいスペーサーは、
アミノヘキサン酸またはスペルミジンであるかまたは研
究すべき分子Ａの他のリガンドである。このスペーサー
は、直接に支持体表面上に吸着させることができる。し
かし、まず、メルカプトカルボン酸、例えば１０−メル
カプトデカン酸を支持体表面、例えば蒸着金被膜を備え
たシリコーンウェファーの表面に結合させることは、好
ましい。分子は、チオール基により金表面に結合し、準
モノ分子層を形成させる。こうして変性された支持体表
面は、その後に上記のスペーサー、有利にアミノヘキサ
ン酸またはスペルミジンにより誘導体化される。最終的
に、メルカプトカルボン酸のカルボキシル基は、まず公
知方法によって活性化され、その後にスペーサーと反応
されるかまたはスペーサーで誘導体化される。
【００１３】カルボキシル基は、例えばペプチド合成に
より公知であるような常法を使用することにより反応前
に活性化させることができる。例えば、メルカプトカル
ボン酸のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（Ｃ４Ｈ５ＮＯ３）またはＮ−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド（塩酸塩）
（Ｃ８Ｈ１８ＣｌＮ３）と５分間スペーサー、例えばア
ミノヘキサン酸またはスペルミジンの存在下に反応させ
ることが可能である。必要に応じて、この方法は、スペ
ーサーの長さを増大させるために数回繰り返すこともで
きる。選択されたスペーサーがスペルミジンである場合
には、スペルミジンの遊離アミノ基は、リガンドの活性
されたカルボキシル基と反応させることもできる。更
に、リガンドのカルボキシル基は、上記のようにＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドを用いて活性させることができ
る。こうして、支持体表面４とスペーサー２′に結合す
べき受容体５との間の分離は、所望の値に調節すること
ができる。
より公知であるような常法を使用することにより反応前
に活性化させることができる。例えば、メルカプトカル
ボン酸のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（Ｃ４Ｈ５ＮＯ３）またはＮ−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド（塩酸塩）
（Ｃ８Ｈ１８ＣｌＮ３）と５分間スペーサー、例えばア
ミノヘキサン酸またはスペルミジンの存在下に反応させ
ることが可能である。必要に応じて、この方法は、スペ
ーサーの長さを増大させるために数回繰り返すこともで
きる。選択されたスペーサーがスペルミジンである場合
には、スペルミジンの遊離アミノ基は、リガンドの活性
されたカルボキシル基と反応させることもできる。更
に、リガンドのカルボキシル基は、上記のようにＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドを用いて活性させることができ
る。こうして、支持体表面４とスペーサー２′に結合す
べき受容体５との間の分離は、所望の値に調節すること
ができる。
【００１４】受容体５を支持体表面４上に固定化させる
ことができる方法と同様にして、活性化合物３は、有利
にスペーサー２により走査原子力顕微鏡のチップ１上に
固定化させることもできる。反対の配置も考えられ、即
ち活性化合物は、支持体表面上に固定化され、かつ受容
体は、顕微鏡チップ上に固定化される。
ことができる方法と同様にして、活性化合物３は、有利
にスペーサー２により走査原子力顕微鏡のチップ１上に
固定化させることもできる。反対の配置も考えられ、即
ち活性化合物は、支持体表面上に固定化され、かつ受容
体は、顕微鏡チップ上に固定化される。
【００１５】最終的に、チップ１は、まず付着促進剤と
してのクロムの、例えば約５ｎｍの厚さを有する蒸着層
で被覆され、かつその後に金で約５０ｎｍの厚さに被覆
される。金で被覆されたチップは、まず、支持体につい
ての上記の同様の記載と同様にしてメルカプトカルボン
酸で被覆し、このチップ上にスペーサー２を懸吊させ
る。付着促進剤としてのクロムの代わりに、他の金属を
付着促進剤として使用することもできる。金の代わり
に、別の層を付着促進層に塗布することもできる。唯一
の本質的な点は、これが本質的に親水性である材料から
の層であることにある。さもなければ、水溶液中での研
究は、なおいっそう困難にするからである。
してのクロムの、例えば約５ｎｍの厚さを有する蒸着層
で被覆され、かつその後に金で約５０ｎｍの厚さに被覆
される。金で被覆されたチップは、まず、支持体につい
ての上記の同様の記載と同様にしてメルカプトカルボン
酸で被覆し、このチップ上にスペーサー２を懸吊させ
る。付着促進剤としてのクロムの代わりに、他の金属を
付着促進剤として使用することもできる。金の代わり
に、別の層を付着促進層に塗布することもできる。唯一
の本質的な点は、これが本質的に親水性である材料から
の層であることにある。さもなければ、水溶液中での研
究は、なおいっそう困難にするからである。
【００１６】測定の原理により、方法の並列化が可能で
あることは、特に有利である。走査原子力鏡検法の１つ
のプローブの代わりに、複数のプローブを同時に使用す
ることが可能である。このことにより、多重試料ホルダ
ー、例えばＥＬＩＳＡプレートを並列的に評価すること
が可能になる。並列的な評価の場合には、走査原子力鏡
検法機器に圧電片持ばりを使用することが特に有利であ
る。このことにより、設計を著しく簡素化することが可
能になる。それというのも、片持ばりのふれの光学的な
検出は不必要であるからである。
あることは、特に有利である。走査原子力鏡検法の１つ
のプローブの代わりに、複数のプローブを同時に使用す
ることが可能である。このことにより、多重試料ホルダ
ー、例えばＥＬＩＳＡプレートを並列的に評価すること
が可能になる。並列的な評価の場合には、走査原子力鏡
検法機器に圧電片持ばりを使用することが特に有利であ
る。このことにより、設計を著しく簡素化することが可
能になる。それというのも、片持ばりのふれの光学的な
検出は不必要であるからである。
【００１７】多重試料ホルダーは、有利に新規の活性化
合物のスクリーニング法の速度を増大させるために最小
化された寸法を有している。この場合、個々の区画の寸
法（直径）の下限は、単にチップの寸法によって定めら
れる。従って、この下限は約１０ｎｍである。
合物のスクリーニング法の速度を増大させるために最小
化された寸法を有している。この場合、個々の区画の寸
法（直径）の下限は、単にチップの寸法によって定めら
れる。従って、この下限は約１０ｎｍである。
【００１８】原理的に上限は存在しない。しかし、スク
リーニング法の速度を最適化することに関連して、最小
化された機器において区画の寸法が数百μｍ、殊に５０
０μｍを超えることはあまり効果的ではない。好ましい
上限は、１５０μｍである。
リーニング法の速度を最適化することに関連して、最小
化された機器において区画の寸法が数百μｍ、殊に５０
０μｍを超えることはあまり効果的ではない。好ましい
上限は、１５０μｍである。
【００１９】こうして最小化されたホルダーの場合に
は、速度の最適化のために、試料を含有する個々の区画
が常用の微量滴定プレートから公知であるようなウェル
の形状を有することももはや必要である。適当な構造
は、例えば珪素または他の材料、例えばプラスチックま
たはガラス中またはこれらの表面上の凹所、カップ状部
または例えばリソグラフィーおよび／またはエッチング
または型押し法によって生じた金属性突起である。ま
た、蒸着された構造体または自動組立法によって製造さ
れたものを使用することも考えられる。また、ＬＩＧＡ
法によって製造された微小構造体を使用することもでき
る。こうして形成された試料ホルダーは、ｎｍの範囲内
に減少された寸法を有している。
は、速度の最適化のために、試料を含有する個々の区画
が常用の微量滴定プレートから公知であるようなウェル
の形状を有することももはや必要である。適当な構造
は、例えば珪素または他の材料、例えばプラスチックま
たはガラス中またはこれらの表面上の凹所、カップ状部
または例えばリソグラフィーおよび／またはエッチング
または型押し法によって生じた金属性突起である。ま
た、蒸着された構造体または自動組立法によって製造さ
れたものを使用することも考えられる。また、ＬＩＧＡ
法によって製造された微小構造体を使用することもでき
る。こうして形成された試料ホルダーは、ｎｍの範囲内
に減少された寸法を有している。
【００２０】区画の走査を十分に迅速に行なうために、
この区画は、カップ、トラフまたは平らな凹所の形状を
有することで十分である。新規方法または新規装置で使
用される多重試料ホルダーに関連して最適な設計は、簡
単に極めて平らな平面状ディスクから構成されており、
このディスクの上には、研究すべき試料が小さな液滴の
形で置かれている。使用される支持体が蒸着によって金
で被覆された領域を有するＳｉウェファーである場合に
は、個々の区画は金ベースを有するのが好ましく、他
方、疎水性のシリコーンは、個々の区画を互いに分離し
ている。
この区画は、カップ、トラフまたは平らな凹所の形状を
有することで十分である。新規方法または新規装置で使
用される多重試料ホルダーに関連して最適な設計は、簡
単に極めて平らな平面状ディスクから構成されており、
このディスクの上には、研究すべき試料が小さな液滴の
形で置かれている。使用される支持体が蒸着によって金
で被覆された領域を有するＳｉウェファーである場合に
は、個々の区画は金ベースを有するのが好ましく、他
方、疎水性のシリコーンは、個々の区画を互いに分離し
ている。
【００２１】一般に、この型の多重試料ホルダーの個々
の区画は、任意の所望の方法で配置されることができる
が、しかし、殊に矩形または円形の構造体として配置さ
れることができる。
の区画は、任意の所望の方法で配置されることができる
が、しかし、殊に矩形または円形の構造体として配置さ
れることができる。
【００２２】こうして、処理の速度はさらに増大させる
ことができる。それというのも、この場合には、走査原
子力鏡検法機器を定常状態に留めることが可能であるか
らである。この場合、常用の光学顕微鏡中の対物レンズ
それ自体が移動されるのではなく、その代わりに標本用
スライドを有する標本ステージが対物レンズの下に移動
されるような方法と同様にして、この試料は、多重試料
ホルダーを走査原子力鏡検法機器の測定プローブの下に
移動させることによって走査される。
ことができる。それというのも、この場合には、走査原
子力鏡検法機器を定常状態に留めることが可能であるか
らである。この場合、常用の光学顕微鏡中の対物レンズ
それ自体が移動されるのではなく、その代わりに標本用
スライドを有する標本ステージが対物レンズの下に移動
されるような方法と同様にして、この試料は、多重試料
ホルダーを走査原子力鏡検法機器の測定プローブの下に
移動させることによって走査される。
【００２３】本発明を下記の実施例によりいっそう詳細
に記載することにする：
に記載することにする：
【００２４】
例１ アビジンが受容体を表わしかつビオチンがリガンドを表
わすような公知のビオチン／アビジン系を使用した。ビ
オチンをチップ上に固定化し、アビジンを適当に前処理
されたシリコーンウェファー表面上に固定化した（図１
〜図３参照）。固定化の間の２つの物質の濃度は１００
μｇ／ｍｌであった。こうして得られた系を走査原子力
顕微鏡を用いて研究した（Topometrix, Darmstadt; Exp
lorer measurement head）。ビオチンとアビジンとの間
の相互作用を図４に示した力／分離曲線により測定し
た。相互作用の特殊性を示すために、支持体上に固定化
されたアビジンを対照（図４、上部曲線ｍ）としてビオ
チン含有溶液中への浸漬によって飽和した。次に、こう
してビオチン走査原子力鏡検法プローブで飽和された受
容体の相互作用を測定した。図４の上部曲線ｍで示され
ているように、ビオチン走査原子力鏡検法プローブとビ
オチン飽和アビジンとの間には、特異的な相互作用は、
存在しない。占有されていないアビジン表面との特定的
な相互作用は、よりいっそう強力である（図４、下部曲
線、ｎ）。
わすような公知のビオチン／アビジン系を使用した。ビ
オチンをチップ上に固定化し、アビジンを適当に前処理
されたシリコーンウェファー表面上に固定化した（図１
〜図３参照）。固定化の間の２つの物質の濃度は１００
μｇ／ｍｌであった。こうして得られた系を走査原子力
顕微鏡を用いて研究した（Topometrix, Darmstadt; Exp
lorer measurement head）。ビオチンとアビジンとの間
の相互作用を図４に示した力／分離曲線により測定し
た。相互作用の特殊性を示すために、支持体上に固定化
されたアビジンを対照（図４、上部曲線ｍ）としてビオ
チン含有溶液中への浸漬によって飽和した。次に、こう
してビオチン走査原子力鏡検法プローブで飽和された受
容体の相互作用を測定した。図４の上部曲線ｍで示され
ているように、ビオチン走査原子力鏡検法プローブとビ
オチン飽和アビジンとの間には、特異的な相互作用は、
存在しない。占有されていないアビジン表面との特定的
な相互作用は、よりいっそう強力である（図４、下部曲
線、ｎ）。
【００２５】例２ もう１つの系（図５）として、トロンビン／トロンビン
インヒビター系を走査原子力鏡検法機器を用いて研究し
た。最終的に、トロンビンをまず上記方法で支持体上に
固定化した。使用された走査原子力鏡検法プローブは、
走査原子力顕微鏡のチップ上に固定化されたトロンビン
インヒビターであった。支持体（トロンビン）とチップ
（トロンビンインヒビター）との間の相互作用の特異性
を比較するために、トロンビンを対照（図５、上部曲
線、ｏ）として、測定前にトロンビンインヒビターで飽
和させた。飽和されたトロンビンは、走査原子力鏡検法
チップ上に固定化されたトロンビンインヒビターとの特
異的な相互作用を示さなかった。トロンビンインヒビタ
ーの特異的な相互作用は、図５から明らかである［下部
の測定曲線、ｐ］。
インヒビター系を走査原子力鏡検法機器を用いて研究し
た。最終的に、トロンビンをまず上記方法で支持体上に
固定化した。使用された走査原子力鏡検法プローブは、
走査原子力顕微鏡のチップ上に固定化されたトロンビン
インヒビターであった。支持体（トロンビン）とチップ
（トロンビンインヒビター）との間の相互作用の特異性
を比較するために、トロンビンを対照（図５、上部曲
線、ｏ）として、測定前にトロンビンインヒビターで飽
和させた。飽和されたトロンビンは、走査原子力鏡検法
チップ上に固定化されたトロンビンインヒビターとの特
異的な相互作用を示さなかった。トロンビンインヒビタ
ーの特異的な相互作用は、図５から明らかである［下部
の測定曲線、ｐ］。
【図１】相互作用を測定するために使用される系であ
り、活性化合物３により変性されかつ固定化された受容
体５上に位置しているチップ１を示す略図。
り、活性化合物３により変性されかつ固定化された受容
体５上に位置しているチップ１を示す略図。
【図２】相互作用を測定するために使用される系であ
り、変性されたチップ１が支持体４に接近した場合に、
力／分離（Ｆ／ｄ）曲線により検出することができる相
互作用が生じることを示す略図。
り、変性されたチップ１が支持体４に接近した場合に、
力／分離（Ｆ／ｄ）曲線により検出することができる相
互作用が生じることを示す略図。
【図３】相互作用を測定するために使用される系であ
り、受容体５の結合部位をチップ１の接近前に受容体と
相互作用しかつ化合物３と同一であるかまたは同一では
ない活性化合物３′で占有させ場合には、特殊な相互作
用は起こらず、唯一考えられる副作用は、非特異的相互
作用であることを示す略図。
り、受容体５の結合部位をチップ１の接近前に受容体と
相互作用しかつ化合物３と同一であるかまたは同一では
ない活性化合物３′で占有させ場合には、特殊な相互作
用は起こらず、唯一考えられる副作用は、非特異的相互
作用であることを示す略図。
【図４】ビオチニン／アビジン系に対する力／分離曲線
（力、 Ｆ［任意の単位（arbitrary units）、ａ．
ｕ．］対分離ｄ［ｎｍ］）を示し；支持体からのチップ
の除去の際に生じるそれぞれの曲線部分を示し、その際
上部曲線（ｍ）は、アビジン表面をビオチニンによって
飽和した場合を示し、この場合小さな相互作用が検出さ
れ、また、下部曲線（ｎ）は、占有されていないアビジ
ン表面との著しく強い特異的な相互作用を示す線図。
（力、 Ｆ［任意の単位（arbitrary units）、ａ．
ｕ．］対分離ｄ［ｎｍ］）を示し；支持体からのチップ
の除去の際に生じるそれぞれの曲線部分を示し、その際
上部曲線（ｍ）は、アビジン表面をビオチニンによって
飽和した場合を示し、この場合小さな相互作用が検出さ
れ、また、下部曲線（ｎ）は、占有されていないアビジ
ン表面との著しく強い特異的な相互作用を示す線図。
【図５】もう１つの例としてのトロンビン系の力／分離
曲線Ｆ／ｄを示し、その際上部の力／分離曲線（ｏ）
は、飽和系の存在下に測定されたものであり、かつ下部
曲線（ｐ）は、トロンビンインヒビターとトロンビンと
の間の特異的な相互作用を示す線図。
曲線Ｆ／ｄを示し、その際上部の力／分離曲線（ｏ）
は、飽和系の存在下に測定されたものであり、かつ下部
曲線（ｐ）は、トロンビンインヒビターとトロンビンと
の間の特異的な相互作用を示す線図。
１ チップ、 ２，２´ スペーサー ３ 活性化合物 ４ 支持体 ５ 受容体 Ｆ 力［任意の単位（arbitrary units）、ａ．ｕ．］ ｄ 分離［ｎｍ］ ｍ ビオチン−アビジン上のビオチニル化されたチップ ｎ ビオチン上のビオチニル化されたチップ ｏ トロンビン−トロンビンインヒビター上のトロンビ
ンインヒビターチップ ｐ トロンビン上のトロンビンインヒビター
ンインヒビターチップ ｐ トロンビン上のトロンビンインヒビター
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ザブリ アカリ ドイツ連邦共和国 ベルリン フラナガン シュトラーセ 39
Claims (11)
- 【請求項１】 活性化合物をスクリーニングするための
方法において、走査原子力鏡検法用機器（ＳＡＦＭ機
器）を用いて観察することができる信号［Ｓ］の変化に
より活性化合物を検出し、この場合ＳＡＦＭ機器は、必
要に応じて圧電片持ばりを有していることを特徴とす
る、活性化合物をスクリーニングするための方法。 - 【請求項２】 ａ）受容体（５）の分子Ａを直接的また
は間接的に共有によるかまたは共有によらずに支持体
（４）に結合させ、 ｂ）走査原子力鏡検法用機器を用いて信号［Ｓ］の変化
により検出することができる活性化合物（３）を共有に
よるかまたは共有によらずに受容体（５）に結合させ、 ｃ）活性化合物（３´）を含有する溶液を添加し、この
活性化合物（３´）の存在を受容体（５）への活性化合
物（３）の結合の際の変化により検出し、この場合この
変化は、走査原子力鏡検法用機器、ひいては信号［Ｓ］
を用いて測定され、かつ ｄ）過程ａ）〜ｃ）を連続的または並列的に多重試料ホ
ルダーの個々の区画に対して繰り返すことにより活性化
合物をスクリーニングする、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 信号［Ｓ］を力／分離曲線の形でかまた
は力／分離曲線の一部のみの形で記録する、請求項１ま
たは２に記載の方法。 - 【請求項４】 支持体（４）への受容体（５）の結合を
直接に吸着によって行なうかまたは間接的にスペーサー
（２´）、殊にスペルミジンまたはアミノヘキサン酸を
介して行ない、この場合有利にスペーサー（２´）それ
自体は、支持体上に吸着された化合物、殊にメルカプト
カルボン酸に結合されている、請求項１から３までのい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 並列の測定装置を活性化合物のスクリー
ニングの際に複数の測定点を検出するために使用する、
請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 支持体（４）は、必要に応じて蒸着され
たＡｕ被膜、多重試料ホルダー、雲母、黒鉛または有利
に膜に固定化された受容体を有するセル構造体、または
これらの組合せ物を備えたＳｉウェファーである、請求
項１から５までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 活性化合物をスクリーニングするための
装置において、走査原子力鏡検法用機器、個別または多
重の試料ホルダーおよび個別または多重の試料ホルダー
の個々の区画をアドレス化するための制御装置からなる
ことを特徴とする、活性化合物をスクリーニングするた
めの装置。 - 【請求項８】 個別または多重の試料ホルダーの個々の
区画が走査原子力鏡検法用機器を用いて、有利に並列処
理された形でアドレス化されている、請求項７記載の装
置。 - 【請求項９】 個別または多重の試料ホルダーの個々の
区画をアドレス化するために、走査原子力鏡検法用機器
が個別または多重の試料ホルダーによりアドレス化され
ている、請求項７記載の装置。 - 【請求項１０】 活性化合物をスクリーニングするため
の装置に使用するための多重試料ホルダーにおいて、支
持体と複数の試料調節領域とからなることを特徴とす
る、活性化合物をスクリーニングするための装置に使用
するための多重試料ホルダー。 - 【請求項１１】 試料調節領域が平らなカップの形であ
る、請求項１０記載の多重試料ホルダー。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19631326.0 | 1996-08-02 | ||
| DE19631326A DE19631326A1 (de) | 1996-08-02 | 1996-08-02 | Verfahren zum Wirkstoff-Screening unter Einsatz der Rasterkraft-Mikroskopie |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1082793A true JPH1082793A (ja) | 1998-03-31 |
Family
ID=7801663
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9205949A Withdrawn JPH1082793A (ja) | 1996-08-02 | 1997-07-31 | 活性化合物をスクリーニングするための方法および装置、ならびに該装置に使用するための多重試料ホルダー |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0829722A3 (ja) |
| JP (1) | JPH1082793A (ja) |
| DE (1) | DE19631326A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005033307A1 (ja) * | 2003-09-30 | 2005-04-14 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | 新規のリフォールディング方法およびその方法によって得られたタンパク質 |
| JP2010515072A (ja) * | 2007-01-05 | 2010-05-06 | テクニシエ ユニベルシテイト ミュンヘン | サブマイクロニュートン範囲の力を検出するための装置及び方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5992226A (en) * | 1998-05-08 | 1999-11-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Apparatus and method for measuring intermolecular interactions by atomic force microscopy |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2100683A1 (en) * | 1991-02-28 | 1992-08-29 | Stephen D. Stroupe | Scanning probe microscopy immunoassay |
| EP0583894A3 (en) * | 1992-07-29 | 1995-09-06 | Hybritech Inc | Method of immobilizing and orienting molecules by use of metal chelating moieties to facilitate atomic force microscopy of proteins and molecular scale manipulation |
| DE19504855A1 (de) * | 1995-02-15 | 1996-08-22 | Basf Ag | Verfahren zur chemisch differenzierenden Abbildung mittels Rasterkraftmikroskopie |
-
1996
- 1996-08-02 DE DE19631326A patent/DE19631326A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-07-31 JP JP9205949A patent/JPH1082793A/ja not_active Withdrawn
- 1997-07-31 EP EP97113255A patent/EP0829722A3/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005033307A1 (ja) * | 2003-09-30 | 2005-04-14 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | 新規のリフォールディング方法およびその方法によって得られたタンパク質 |
| JP2010515072A (ja) * | 2007-01-05 | 2010-05-06 | テクニシエ ユニベルシテイト ミュンヘン | サブマイクロニュートン範囲の力を検出するための装置及び方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0829722A2 (de) | 1998-03-18 |
| EP0829722A3 (de) | 1998-09-16 |
| DE19631326A1 (de) | 1998-02-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20041005 |