JPH10513061A

JPH10513061A - １α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物含有低リン動物用飼料

Info

Publication number: JPH10513061A
Application number: JP8524284A
Authority: JP
Inventors: デルカ，ヘクター・エフ; ベイカー，デーヴィッド・エイチ
Original assignee: ウイスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション
Priority date: 1995-02-06
Filing date: 1996-01-29
Publication date: 1998-12-15
Also published as: WO1996024258A1; MX9705994A; EP0808111A1; DK0808111T3; ES2135208T3; ATE183888T1; KR19980701956A; NZ302098A; CA2210988C; DE69604053D1; CA2210988A1; BR9607124A; AU714412B2; AU4768496A; GR3031653T3; EP0808111B1; DE69604053T2

Abstract

(57)【要約】 1-α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物を含む動物用飼料。ビタミンD 化合物は動物用飼料におけるリン、カルシウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄およびマンガンの利用を向上させこれにより動物用飼料におけるこれら無機物の補給量の対する必要性を最小にするかまたは多分排除する。さらに、低リン含有動物用飼料は、その後に土壌散布される動物の排泄物中にリンが少なく排泄されるので、環境における汚染作用を低下する。

Description

【発明の詳細な説明】１α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物含有低リン動物用飼料発明の背景および概略肥料および飼料に存在するリン( P )は、その80% までが以後フィテートというフィチン酸（ミオイノシトールヘキサホスフェート）の複合体として存在する。フィテートは構造的に以下の式で表される：フィテート中のリンは、ヒトを含む単胃性動物により完全に消化されることができず、したがって胃腸(GI)管を通って排泄物中に排出される。動物の栄養において、これが飼料配合物において無機リン酸供給源の 1.5 - 2.0% を動物の最低 P 要求値を満たすために補給することの説明である。家禽類、豚、愛玩動物および魚の飼料への無機P の添加は高価である。これらの種へのP の補給は、エネルギーおよびたんぱく質に次いで三番目に高価な飼料成分であるとしばしば言われている。身体は、骨および歯の形成のために、リン脂質（細胞膜構成物）および核酸( RNA 、DNA )合成のために、ATP および他の高エネルギーP 化合物の合成のために、そして身体における適切な酸- 塩基バランスのためにP を必要とする。体内P のほぼ85% が骨にある。骨は、有機マトリックス（コラーゲンの形成におけるたんぱく質、および脂質）50% および無機物（殆どはCa-P塩、すなわちヒドロキシアパタイト）50% からなる。補給される無機P は、三つの飼料グレード形( feedgrade forms)の一つ、すなわちリン酸二カルシウム(18.5% P)、リン酸一カルシウム(21.5% P)、脱フッ素化リン酸塩(18.0% P)で動物飼料に提供される。これらの製品に対する市場を全部合わせると、アメリカ、カナダ、メキシコ、西ヨーロッパおよび日本において一年で6 億7500万ドルになると推定される。南アメリカ、東ヨーロッパ、アジア、アフリカ、中国、インドおよび東南アジアを含めると、（これらの市場データは入手が困難である）、飼料グレードのリン酸塩に対する全市場は毎年10億ドルを超えることが容易に予想される。北アメリカでは、消費される飼料グレードのリン酸塩の50% は、家禽類の飼料のために使用される。生物学的に活性な1-α-OH ビタミンD 化合物を使用すると、補給P に対する必要性を40% まで低下させ、そして酵素フィターゼと組み合わせれば必要性を50%-60% まで低下させることができることが見いだされた。植物性の食品および飼料（たとえば、穀類粒および副製品、豆類）におけるフィテート複合体はまた、以下に模式的に示すように、陽イオンたとえばカルシウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄およびマンガンと結合する( エルドマン (Erdman)、1979）：フィテートからのP の利用を起こさせる生物学的に活性な飼料添加物はまたこれらの元素の利用をも増やす。本発明は、1-α-OH ビタミンD 化合物、好ましくは 1,25- ジヒドロキシコレカルシフェロールおよび1-α-OH コレカルシフェロールがP だけでなく亜鉛、鉄およびマンガンの利用を増加することを立証した。すなわち、これらの三つの微量元素は補給形で常に豚、家禽類および愛玩動物のための飼料に添加(飼料グレード ZnO または ZnSO₄．H₂O；FeSO₄.H₂O；MnO またはM nSO₄.H₂O）されているので、生物学的に活性な1-α-OH ビタミンD 化合物を使用することにより、実用的タイプの穀類- 脂肪種子粉末(grain- oilseed meal)飼料においてこれらの無機塩の補給量の必要性が低下するかまたはたぶん省略されるであろう。 P 補給物として飼料の0.75% までおよび微量無機塩として0.10% までを代えることにより、残りの飼料は利用可能なエネルギーをさらに含むことになる。すなわち、穀類- 脂肪種子粉末飼料は、一般に飼料1 kgにつき約3,200kcal の代謝性エネルギーを含み、無機塩は代謝性エネルギーを補給しない。不必要な無機塩を除去し穀類に代えることにより、飼料における利用可能なエネルギーが増加するであろう。現在、フィターゼはP 汚染を低下させるためにヨーロッパおよびアジアの多くで使用されている。しかしながら、使用レベルは飼料1kg 当たり600 単位であり、このレベルは酵素のコストのために選択されたもので、600 単位がフィテートの利用を最大にするためではない。対照的に、本研究を介して、少なくとも飼料の1200単位/ kgがトウモロコシ- 大豆穀粉飼料を与えられたニワトリにおいてフィテート利用を最大にするために必要であることが見いだされた(表1）。しかしながら、本発明による生物学的に活性な1-α-OH ビタミンD 化合物を使用すると高価なフィターゼを与える必要が低下する(表5)。動物生産者は、飼料のフィテート含有のために必然的に高いP の飼料を与える。これにより排泄される廃棄物（糞および尿の両方）においてP が増加する。動物、ならびにヒトの排泄物からの過剰のP は一般に土壌に広がり、ここでその一部が地下水へ流れ込み、次いで池、小川、川、湖および海へ流れ込む。水にP が多量にあると藻の成長を刺激し、藻がかなりの酸素を吸収する。これにより、成長し、再生しそして繁殖するために酸素が必要な海洋生物の命が奪われる。ヨーロッパおよびアジアの多くの地域で、P 汚染は、余りにも多くのP を含んだコヤシを土壌に散布する家畜生産者に厳しい罰金の形で不利益を課するように問題化しそして関心を集めている。このため、ヨーロッパの多くでは現在微生物性フィターゼ製品(BASF)を使用しているが、この製品（これはまたフィテートを加水分解する）は非常に高価であり、実際、現時点でアメリカにおいて飼料添加物としてコスト効率（飼料1kg につき600 単位で）があまりにも高すぎる。多くのアメリカの土壌は、“Pで飽和されいてる”と記載されており、その結果土壌から滲み出す水におけるP 濃度が高くなる。たとえばチェサピーク湾のような地域における高濃度P の滲出水は、湾の水において藻が過剰に成長しおよび魚が多量に死ぬことについて非難されている( ワード( Ward)、1993)。ヨーロッパでは、飼料工業グループ FEFANA が、1991年に“環境の改善(Improvement of the En viroment)”という題で声明を出している。彼らは家畜生産からの肥料におけるP は30% 減少されるべきであると提案している（ワード、1993）。ヨーロッパの土壌に適用されうるP の限界はシュワルツ(Schwarz)(1994)により検討された。したがって、本発明によるリンの利用の向上において活性である1 α- OHビタミン D 化合物を使用することにより、動物の排泄物のP 含有率を40% までカットすることができると推定される。微生物性フィターゼ(BASF)1200単位の存在または不存在下に1,25- ジヒドロキシコレカルシフェロール(1,25-(OH)₂D₃)を使用することに焦点を合わせた最初の研究（エドワード(1993)）によれば、1,25-(0H)₂D₃がフィテート結合P からのP の利用を向上することに有効であることが示され、ビエルら(Biehl et al.)(199 5)はこの結果を確認した。さらに、両方の研究は1,25-(OH)₂D₃がさらに飼料フィテート複合体からP を離すことにおいて微生物性フィターゼとともに働くことを示した。多分、1,25-(0H)₂D₃は二つの方法で効果を発揮するようであり：（a）1 ,25化合物がフィテートを加水分解する胃腸管フィターゼまたはホスファターゼの活性を強化するらしい（ピレッギら(Pileggi et al.）、1955; マダイアら（ Maddaiah et al．）、1964）こと、および(b)1,25化合物はリンの輸送を刺激（タンカおよびデルカ（Tanka and DeLuca）、1974）し、胃腸管（GI管）から血漿およびしたがって骨へのP の輸送を促進することが知られている。通常の飼料環境下で、飼料へ添加されるコレカルシフェロール（ビタミンD₃）はGI管から吸収され、血液を介して肝臓へ運ばれ、ここで肝臓酵素25- ヒドロキシラーゼがこの化合物に作用して25-OHD₃を形成する。この化合物はコレカルシフェロールの通常の血液代謝産物である。腎臓で25-OHD₃の一部がさらに1-α位でヒドロキシル化工程を受け、これによりカルシウム作用性(calciotropic)ホルモン1,25-(OH)₂D₃の合成が起こる。1,25-(OH)₂D₃は合成するには高価で、そして経口摂取による25- OH D3はリン酸塩吸収において活性形ではないので、1-α- O H D₃がリン酸塩利用を向上するための有効な化合物であろうと提案された。1-α ヒドロキシル化ビタミンD 化合物および特に1-α- OH D₃がGI管から吸収され肝臓へ運ばれ、ここで25- ヒドロキシラーゼが作用して1,25- ジヒドロキシル化化合物および特に1,25-(OH)₂D₃の合成を行うことが見いだされた。これらの化合物の一部はGI管に戻され、ここで腸内リン酸塩吸収を活性化するであろう。本当の効果はフィテート複合体からのP （また亜鉛、鉄、マンガンおよびカルシウム）の利用向上である。概略すると、本発明の有力な利点は、(1)動物（魚を含む）用飼料へ無機P の補給をする必要性の低下；(2)環境のP 汚染の低下；(3)動物（魚を含む）用飼料におけるZn、MnおよびFeの補給の必要性の低下または場合によっては排除；および(4)飼料からのP の最大利用に必要なフィターゼの量の低下、を含む。好ましい実施態様の詳細な説明この説明およびクレームに使用されているように、用語ヒドロキシ保護基はヒドロキシ官能基を一時的に保護するために通常使用される基、たとえばアルコキシカルボニル、アシル、アルキルシリル、およびアルコキシアルキル基であり、保護されたヒドロキシ基はこのような保護基により誘導化されたヒドロキシ官能基である。アルコキシカルボニル保護基は、たとえばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、tert- ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはアリルオキシカルボニルのような基である。用語“アシル ”とは、炭素原子1-6 個のアルカノイル基、その異性形のすべて、または炭素原子1-6 個のカルボキシアルカノイル基たとえばオキザリル、アムロニル、スクシニル、グルタリル基、または芳香族アシル基たとえばベンゾイル、またはハロゲン、ニトロ、またはベンゾイル基により置換されたアルキル基を意味する。この説明または請求の範囲で使用されている用語“アルキル”とは、炭素原子1-10個の直鎖または枝分かれ鎖アルキル基、その異性形のすべてを意味する。アルコキシアルキル保護基はたとえばメトキシメチル、エトキシエチル、メトキシエトキシメチルまたはテトラヒドロフラニルおよびテトラヒドロピラニルのような基である。好ましいアルキルシリル保護基は、トリメチルシリル、トリエチルシリル、t-ブチルジメチルシリル、および類似のアルキル化シリル基である。この処理において有用なビタミンD 化合物は、1 α- ヒドロキシル化ビタミン D 化合物、好ましくは1 α- ヒドロキシコレカルシフェロールおよび1 α,25-ジヒドロキシコレカルシフェロールである。このタイプのビタミンD 化合物は次の一般式により特徴づけられる：（式中、X₁は水素またはヒドロキシ保護基でよく、X₂はヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ基でよく、X₃は水素またはメチルでよく、X₄およびX₅は各々水素を表すかまたは一緒になってX₄およびX₅はメチレン基を表し、Z はY 、-OY 、-C H₂OY、-C≡CYおよび-CH=CHY から選択され、その際二重結合はシスまたはトランス立体化学的配置を有し、そしてY は水素、メチル、-CR₅O および次の構造式：の基から選択され、その際m およびn は独立して、0-5 の整数であり、R¹は水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、および直鎖または枝分かれ鎖の場合によりヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ置換基を有するC_1-5- アルキルから選択され、R²、R³およびR⁴の各々は独立して水素、フルオロ、トリフルオロメチル、および直鎖または枝分かれ鎖の場合によりヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ置換基を有するC_1-5-アルキルから選択され、そしてR¹およびR²は一緒になってオキソ基またはアルキリデン基、=CR₂R₃ 、または基-(CH₂)p- を表し、その際p は2-5 の整数であり、R³およびR⁴は一緒になってオキソ基または-(CH₂)_q- であり、その際q は2-5 の整数であり、そしてR⁵は水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシまたはC_1-5アルキルを表す）。前記化合物は単独または他の飼料添加剤と組み合わせて投与されうる。前記ビタミンD 化合物またはその組合せはこれらを直接動物飼料へ混入するかまたは独立した経口投与により飼料とは別に投与されるか、または注射もしくは経皮投与により、または他の1 α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物と組み合わせて投与され、処理される特定の問題および所望の反応の程度に応じたその組合せにおける化合物の各々の割合が、本発明を実施するのに概して有効である。家禽類において、一日約10μg を越える量または当該化合物と他の1 α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物との組合せは一般的には所望の結果を得るのに不必要であり、高カルシウム血症を起こすかもしれず、経済的にも妥当でないかもしれない。所定のケースのいずれにおいても特定の投与量は、投与される特定化合物、処理されるべき問題、対象者の症状、および化合物の活性もしくは対象者の反応を変えるかもしれない他の関連要因にしたがって調節されるであろし、これは当業者に良く知られているものである。一般に、一日一回または何回かに分けた投与が当業者に良く知られているように使用される。動物用飼料とは別に投与する場合、当業者に良く知られているように、様々な化合物の投与形態は、非毒性の薬剤上許容されうる担体とこれらを組み合わせることにより即時放出性または遅延放出性の製剤のいずれかに調製することができる。このような担体は固体または液体のいずれでもよく、たとえばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油およびプロピレングリコール等である。固体担体を使用する場合、化合物の投与形態は錠剤、カプセル剤、粉末、トローチもしくは薬用ドロップ（ロゼンジ）または微小分散形としての粉衣剤(top dressing)である。液状担体を使用する場合、軟質ゼラチンカプセルまたはシロップもしくは液状懸濁液、エマルジョンまたは溶液が投与形態である。投与形態はまた助剤、たとえば保存剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤などを含む。これらはまた他の治療上価値ある物質を含んでもよい。本発明はまた動物用飼料におけるリンの栄養上の要求値を低下させるために1 α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物を利用した動物用飼料組成物および動物用飼料の配合方法に関する。この使用に適する1 α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物は既に記載されている。飼料とともに混入されうるリン補給物(18.5% P)の量は、乾燥重量に基づいて約1.9%から約0.9%にまで低下しうる。これは、動物用飼料組成物に混入されるリン補給物の通常量約1.5% -約2.5%よりも有意に減少している。リンにおけるこの都合のよい減少は動物用飼料に1 α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物を混入する直接の結果である。動物用飼料は、動物の栄養上の要求を満たすために通常使用されるたんぱく質含有の有機粉末(Organic meal)のいずれでもよい。このようなたんぱく質含有粉末の多くは代表的には主にトウモロコシ、大豆穀粉またはトウモロコシ/ 大豆穀粉混合物からなる。たとえば、家禽類へ与えられる代表的な市販の製品は、ランドオーレイクスエージーサービス(Land O'Lakes AG Services)の家禽類用飼料製品であるエッグメーカーコンプリート(Egg Maker Complete)、ならびにアグア社(Agwa Inc.)の製品であるカントリーゲームアンドターキーグロウワー(Country Game & Turky Grower))である。これらの市販の製品の両方とも動物用飼料の代表的例であり、本発明の1 α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物を混入するとこのような組成物に必要な補給リン、亜鉛、マンガンおよび鉄の摂取量を減少するであろう。したがって、いずれの型のたんぱく質含有有機粉末も、本発明の1 α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物および補給リン、亜鉛、マンガンおよび鉄の減少した量を混入することができる基本混合物として利用される。本発明は、ここで哺乳動物、家禽類および魚を含むことが定義される多数の動物の飼料へ適用することができる。特に、飼料は商業上重要な哺乳動物、たとえばブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、実験用囓歯動物（ラット、マウス、ハムスターおよびアレチネズミ）、毛皮を有する動物たとえばミンクおよびキツネ、および動物園の動物たとえばサルおよびエイプ、ならびに家庭用哺乳動物たとえばネコおよびイヌに使用される。代表的な商業上重要な家禽類は、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、キジおよびウズラを含む。商業上生産される魚たとえば鱒もまたここに開示した飼料から利益を得る。本発明にしたがって動物用飼料を配合する方法において、利用される1 α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物は、乾燥重量に基づいて約5 μg / kgから約40μ g / kg（飼料）の量で動物用飼料に混入される。飼料混合物は次いでマッシュとして与えられるかまたはさらに加工し包装するために所望の非連続形状に形成されて与えられる。一般に、これらの非連続の形状は、公知の押出しおよび／または圧縮技術により形成されるペレット、ブロックまたは固まり（ブリケット）でよい。利用される特定の加工技術は、動物用飼料混合物における1 α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物の性能に影響を与えない。本発明は以下の実施例によりさらに詳しく記載されるが、これらは単に説明のためのものである。ニワトリ効果試験 A．方法： P 欠乏飼料を与えられた動物におけるP（またはCa）活性の最良の指標は骨灰分の合計である。この生物検定システムにおいて、若いニワトリ（８日齢）に、 Ca 0.6% および全P 0.43% であるがしかし生物利用可能なP 0.10% を含むトウモロコシ- 大豆穀粉飼料を与える。この日齢のニワトリに必要なCaおよび Pのレベルは、Ca 1.0% および利用可能P( すなわち、非フィテートP)0.45% である。カルシウムは、利用できるP が非常に欠乏している状態でカルシウムが過剰であると食欲不振を起こすので、我々の飼料では1.0% の代わりに0.6% に維持される。概略すれば、ニワトリ3 または4 羽を入れたおり3 または4 個をそれぞれの規定飼料処置下に置く。常に（蛍光）照明を当てている環境をコントロールした動物小屋に置いた針金製スクリーンを付けたバタリー式おりにおいて、実験用の飼料を12日間自由に与える。検定の最後で購化後20日目に、頸部脱臼によりニワトリを屠殺し、左頸骨を計量のため摘出した。骨に結合している組織を剥がし、24 時間100 ℃で乾燥し、秤量しそして24時間600 ℃で乾式灰化（マッフル炉）する。灰化した後に残った部分は完全に無機質である。乾燥骨重量に対するパーセントとしての灰分（鉱物質）の重量は、骨における灰分（鉱物、殆どはCaおよびP ）のパーセントである。乾燥骨重量に灰分の割合を掛けると、骨の灰分の全量が mgで得られる。脛骨の灰分は全骨格における灰分（すなわち骨の鉱物化）の程度を反映する。CaおよびP が概ね適切である飼料を与えられた我々の20日齢の異種交配したニワトリ（ニューハンプシャー×コロンビアン）は、45% の骨灰分値を有している。 ZnおよびMnの生物利用可能性の評価において、ZnおよびMnの骨中の含有率が確立された標準であるが、しかし成長反応もまたZn生物利用可能性の評価に使用される（ウェデキングら(Wedeking et al.)、1992；ハルピンおよびベーカー(Ha lpin and Baker)、1986）。ZnまたはMnの生物利用可能性の評価のために、脛骨を100 ℃で24時間乾燥し、秤量し、次いでさらに24時間600 ℃で乾式灰化する。乾燥した灰分をHNO₃およびH₂O₂で湿潤する。亜鉛およびマンガンを、原子吸収分光分析を用いて定量化する( ウェデキンドら、1992)。Zn、MnまたはFe(ヘモグロビン分析)の生物利用可能性に関する研究において、ニワトリにZn、MnまたはFe が欠乏している予備試験用の飼料を与える（孵化後 0 - 8日）。これによりこれらの微量元素の貯蔵が減る。次いで実験をステンレススチール製のフィーダーおよび水飲み器を備えたステンレススチール製ニワトリバタリーにおいて行う。脱イオン水は自由に飲める。環境、装置および飲料水からのZn、MnまたはFeの汚染を避けるためにこれらの工程を行う。 B．結果最初の実験のための基本飼料は、利用可能なP（ほとんどがフィテート結合P からくるもの）がかなり欠乏するが、ビタミンD₃は適切ないし過剰であるように、そしてZnおよびMnの両方は臨界的（すなわち、飼料にZnまたはMnの補給なし）であるようにした。骨灰分の増加はP の強化されたGI吸収を示し、そして骨のZn およびMnの両方における増加はZnおよびMnの強化されたGI吸収を示す（チャンおよびベーカー(Chung and Baker)、1990；ウェデキンドら（Wedekind et al．）、1992；ハルピンおよびベーカー、1986；ベーカーら、1986）。表1 に示すように、成長速度はP 0.10% 添加により17%（P＜0.05）増加し、フィターゼ1200U 添加により20% 、1,25-(OH)₂D₃添加により15.5%、フィターゼ(1200U)および1,25 -(OH)₂D₃10.0μg /kg の組合せにより25% 増加した。しかしながら、骨灰分がP の生物利用可能性の最良の指標である。骨灰分の合計(mg)は、P 0.10% 添加（ただしP は飼料においてかなり欠乏の場合）により56％(P<0.01)増加し、フィターゼ1200U で64% 、1,25-(OH)₂D₃で60% 、そしてフィターゼおよび1,25-(OH)₂D₃の組合せにより98% 増加した。脛骨Zn（μg）は、フィターゼ1200U または1,25-(0 H)₂D₃ 10.0μg /kg のいずれかにより55%(P<0.01)増加したが、しかしフィターゼとジ-OH D₃との組合せにより86% 増加した。脛骨Mn（μg）は、フィターゼにより63%(P<0.01)増加し、ジ- OH D₃により85% 、そしてフィターゼとジ- OH D₃ との組合せにより123%増加した。表2 のデータは第二の効果試験の結果を示す。この試験の基本飼料は、Caにおいて適切であるように作られ、これはまたZnおよびMnの通常（安全因子）のレベルの添加により栄養強化したものである。したがって、これは利用可能なリンが欠乏しているだけである。骨灰分はP - 欠乏の陰性対照飼料を与えられたニワトリにおいて著しく低下した。事実、骨灰分パーセントはこれらのニワトリにおいて約5%低く(実験1 では30.4% であり、実験2 では25.5%)、これは利用可能なP に対するCaの高い比の反映である。効果はここでもまたフィターゼおよび1,25-( OH)₂D₃の両方に対して示された。さらに、フィターゼおよび1,25-(0H)₂D₃の両方を含む飼料は、P が適切な飼料( 飼料5)で達成されるものとそれほど違わない骨灰分値の両方を生じた。表3 におけるデータは典型的Zn効果試験の結果を示す。基本飼料は単にZn欠乏（NRC 1994 Zn 要求値は40ppm である）なだけであり、このため10ppm Znを添加してもまだZn欠乏であった。フィターゼおよび1,25-(OH)₂D₃の両方について著しい効果が観察され、相乗的効果はさらにここでも組合せに対して明白であった。 1,25-(OH)₂D₃がP,ZnおよびMnの利用に著しく効果があることが最終的に示されたので、次に1-α- OH D₃の効果の試験を行った。これらの結果を表4 に示す。0 -20 μg / kgの間の1-α- OH D₃投与量が補給された場合、直線状(P <0.01)成長反応が生じた。脛骨灰分は同様に1-α- OH D₃を飼料に添加すると著しく増加した(P <0.01)。全脛骨灰分(mg)は、補給していない基本飼料を与えられたものより1-α- OH D₃20 μg / kgを添加した飼料を与えられたニワトリにおいて69% 高かった。1-α- OH D₃40 μg / kgの投与量は有効であり、確かに非毒性であるが、しかし20μg / kgの投与量でフィターゼからのP 放出に起因する反応が最大になった。表5 におけるデータは微生物性フィターゼおよび1,25-(0H)₂D₃の組合せの間の相乗効果を証明する。また、この結果は、フィターゼの投与量（600 単位と 120 0 単位）を10μg / kgの1,25-(0H)₂D₃の存在下に比較すると、フィテート- P の利用の向上においてフィターゼ600 単位が1200単位と同じくらいに効果的であることを示す。この知見は、実験1(表1)のデータと比較した場合、最大反応に必要なフィターゼ補給レベルは、補給する生物学的活性1-α- OHビタミンD 化合物が飼料に含まれる場合には半分にカットされうることを示す。事実、わずか300 単位のフィターゼが1,25-(0H)₂D₃の存在下に著しい反応を生じた。表6 におけるデータは、1-α- OH D₃とフィターゼの間に相乗効果が存在することを示す。すなわち、フィターゼ1200単位と組み合わせた20μg / kgの1-α-O H D₃は、基本的非補給トウモロコシ- 大豆粉飼料について観察されるより107% 以上に全骨灰分を増加させた。補給1-α- OH D₃単独では骨灰分が74% 、補給フィターゼ単独では骨灰分が65% 増加した。表1 の脚注を次頁に付ける。表1 の脚注¹ データは、4 羽の雌のニワトリが入った4 個の反復するおりのニワトリの孵化後8-20日間の平均である；平均初期体重は82g であった。² 基本のトウモロコシ- 大豆粉飼料(23% CP)は、0.10% の利用可能なP および0 .60% のCaを含むものであった。MnおよびZnのいずれも、この基本飼料へ補給されなかった。飼料はビタミンD₃に関して適切ないし過剰であり、飼料1 kgにつき補給コレカルシフェロール1000IUを含む(25 μg / kg)。³ 乾燥重量に基づく。⁴ KH₂PO₄からのP の段階的投与量⁵ ニュージャージィー州 07054、パルシッパニーのBASF社から入手可能なフィターゼ。フィターゼ1 単位(U)は、pH5.5 および37℃で1.5mmol/L ナトリウムフィターゼから1 分当たり無機 P 1μモルを遊離するのに必要な酵素の量として定義される。フィターゼを、フィターゼ活性5,000U/gを含む予備混合物（ナチュホス ⁶ ニュージャージィー州、ナットリーのホフマン- ラロッシュ社(Hoffman - La Roche，Inc.)から得られるジヒドロキシコレカルシフェロール( DiOH-D₃)をプロピレングリコールに溶かして10μg / mlの溶液を作った。関連する各々の基本飼料に対してDiOH-D₃溶液の所望の容量を石油エーテルに溶かし、これを次いで基本飼料と予備混合し、次いで混合のために完全飼料へ添加した。 ¹ データは、３羽のニワトリの入った4 個の反復物（おり）のニワトリの孵化後8-20日間の平均である；平均初期体重は83g であった。² 完全な左脛骨（乾燥に基づく）。³ 基本のトウモロコシ- 大豆粉飼料(23% CP)は、0.10% の利用可能なP および1 .0 % のCaを含むものであった。MnおよびZnの両方は、この基本飼料への補給物（各々 50mg/kg）として提供され、このため基本飼料は利用可能なP のみが欠乏していた。⁴ 表1 の脚注5 を参照。⁵ 表1 の脚注6 を参照。⁶ KH₂PO₄から提供。 ¹ データは、孵化後8 日目の体重84.5g の雄のニワトリ4 羽を各々含む4 個のおりの平均である；脱イオン水を摂取するニワトリをステンレススチール製バタリで12日間飼育する。8 日間の予備試験の間、ニワトリには低濃度Znの大豆粉飼料を与えた。² 大豆濃厚- デキストロース飼料はZn 13ppmを含む。 ¹ 孵化後8-20日の期間の間に4 羽のニワトリの入った3 個のおりの平均。² 適切なビタミンD - 3 、0.60% Caおよび0.43% P(利用可能なP は0.10% と推定)を含むトウモロコシ- 大豆粉飼料(23% CP)へ添加。³ 異なった上付き文字を有するカラムにおける平均は有意差( P〈0.5)を有する。 ¹ データは、孵化後8-20日の間に実験用飼料を与えた4 羽の雌のニワトリの入った4 個のおりの平均である；平均初期体重は93g であった。異なった上付き文字を有するカラムの平向は有意差があった( P<0.05)。² 基本飼料（表 1）は、分析により、0.43% のP(利用可能なP は0.10% と推定) 、0.63% のヒおよび23% の粗たんぱく質を含むものであった。³ 乾燥重量に基づく。 ¹ データは、孵化後8-20日の間に実験用飼料を与えた4 羽の雌のニワトリの入った3 個のおりの平均である；平均初期体重は88g であった。異なった上付き文字を有するカラムの平均は有意差がある（P<0.05）。² 基本のトウモロコシ- 大豆粉飼料は、分析により、0.43g P/100g（非フィテートP は0.10g/100g と推定）、0.63g Ca/100g および23.9g CP/100g を含むものであった。³ 乾燥重量に基づく。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程：無機リン補給物として飼料の約0.5-1.9%を含む飼料からなる動物用飼料を用意し；前記飼料に1-α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物の有効量を混入して飼料混合物を作り；前記飼料混合物を非連続形状に形成することからなる動物用飼料を配合する方法。２．前記非連続形状が前記混合物を押し出すことにより作られる請求項1 の方法。３．前記非連続形状が前記混合物を圧縮することにより作られる請求項1 の方法。４．前記1-α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物の有効量が飼料の約5 μg /k gから約40μg / kgからなる請求項1 の方法。５．さらにフィターゼの有効量を前記飼料に混入する工程を含む請求項1 の方法。６．前記フィターゼの有効量が約300 単位- 約1,200 単位からなる請求項5 の方法。７．前記フィターゼの有効量が飼料1kg 当たり約600 単位からなる請求項1 の方法。８．前記1-α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物が以下の一般式：（式中、X₁は水素またはヒドロキシ保護基でよく、X₂はヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ基でよく、X₃は水素またはメチルでよく、X₄およびX₅は各々水素であるかまたは一緒になってX₄およびX₅はメチレン基を表し、Z はY 、-OY 、-C H₂OY、-C≡CYおよび-CH=CHY から選択され、その際二重結合はシスまたはトランス立体化学配置を有し、そしてY は水素、メチル、-CR₅O および次の構造式：の基から選択され、その際m およびn は独立して、0-5 の整数であり、R¹は水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、および直鎖または枝分かれ鎖の場合によりヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ置換基を有するC_1-5- アルキルから選択され、R²、R³およびR⁴の各々は独立して水素、フルオロ、トリフルオロメチル、および直鎖または枝分かれ鎖の場合によりヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ置換基を有するC_1-5-アルキルから選択され、そしてR¹およびR²は一緒になってオキソ基、またはアルキリデン基、=CR₂R₃ または基-(CH₂)p- を表し、その際p は2-5 の整数であり、R³およびR⁴は一緒になってオキソ基または-(CH²)_q- であり、その際q は2-5 の整数であり、R⁵は水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシまたはC_1-5アルキルを表す）で表される請求項１の方法。９．ビタミンD 化合物が1-α- ヒドロキシビタミンD₃である請求項１の方法。 10．ビタミンD 化合物が1 α,25-ジヒドロキシビタミンD₃である請求項１の方法。 11．以下の成分：無機リン補給物約0.5%-1.9% を含む飼料；および前記飼料中のフィテート複合体からリンを利用するための1 α-ヒドロキシル化ビタミン D化合物の有効量からなる動物用飼料組成物。 12．１α- ヒドロキシル化ビタミン D化合物の前記有効量が飼料の約5 μg /k g- 約40μg / kgからなる請求項11の組成物。 13．さらに、前記飼料に約300 単位から約 1,200単位のフィターゼを含む請求項11の組成物。 14．さらに、飼料1kg 当たり約600 単位のフィターゼを含む請求項11の組成物。 15．前記1 α- ヒドロキシル化ビタミン D化合物が以下の一般式：（式中、X₁は水素またはヒドロキシ保護基でよく、X₂はヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ基でよく、X₃は水素またはメチルでよく、X₄およびX₅は各々水素であるかまたは一緒になってX₄およびX₅はメチレン基を表し、Z はY 、-OY 、-C H₂OY、-C≡CYおよび-CH=CHY から選択され、その際二重結合はシスまたはトランス立体化学配置を有し、そしてY は水素、メチル、-CR₅O および次の構造式：の基から選択され、その際m およびn は独立して、0-5 の整数であり、R¹は水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、および直鎖または枝分かれ鎖の場合によりヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ置換基を有するC_1-5- アルキルから選択され、R²、R³およびR⁴の各々は独立して水素、フルオロ、トリフルオロメチル、および直鎖または枝分かれ鎖の場合によりヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ置換基を有するC_1-5-アルキルから選択され、そしてR¹およびR²は一緒になってオキソ基またはアルキリデン基、=CR₂R₃、または基 -(CH₂)p- を表し、その際p は2-5 の整数であり、R³およびR⁴は一緒になってオキソ基または-(CH₂)_q- であり、その際q は2-5 の整数であり、R⁵は水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシまたはC_1-5 アルキルを表す）で表されることを特徴とする請求項11の組成物。 16．ビタミンD 化合物が1-α- ヒドロキシビタミンD₃ である請求項11の組成物。 17．ビタミンD 化合物が1 α,25-ジヒドロキシビタミンD₃である請求項11の組成物。 18．以下の工程：無機リン補給物約0.5%-1.9% を含む飼料を動物へ与え；および前記飼料とともに前記飼料中のフィテート複合体からリンを利用するための1 α- ヒドロキシル化ビタミン D化合物の有効量を与えることからなる動物におけるリンの摂取上の必要値を最小化する方法。 19．前記1 α- ヒドロキシル化ビタミン D化合物が前記飼料において粉衣剤(t op dressing)として与えられる請求項18の方法。 20．１α- ヒドロキシル化ビタミン D化合物の前記有効量が飼料の約5 μg /k g- 約40μg / kgを含む請求項18の方法。 21．さらに前記飼料にフィターゼの有効量を混入する工程を含む請求項18の方法。 22．フィターゼの前記有効量が前記飼料において約300 単位から約 1,200単位からなる請求項18の方法。 23．フィターゼの前記有効量が飼料1kg 当たり約600 単位からなる請求項18の方法。 24．前記1 α- ヒドロキシル化ビタミン D化合物が以下の一般式：（式中、X₁は水素またはヒドロキシ保護基でよく、X₂はヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ基でよく、X₃は水素またはメチルでよく、X₄およびX₅は各々水素であるかまたは一緒になってX₄およびX₅はメチレン基を表し、Z はY 、-OY 、-C H₂OY、-C≡CYおよび-CH=CHY から選択され、その際二重結合はシスまたはトランス立体化学配置を有し、そしてY は水素、メチル、-CR₅O および次の構造式：の基から選択され、その際m およびn は独立して、0-5 の整数であり、R¹は水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、および直鎖または枝分かれ鎖の場合によりヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ置換基を有するC_1-5- アルキルから選択され、R²R³およびR⁴の各々は独立して水素、フルオロ、トリフルオロメチル、および直鎖または枝分かれ鎖の場合によりヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ置換基を有するC_1-5-アルキルから選択され、そしてR¹およびR²は一緒になってオキソ基またはアルキリデン基、=CR₂R₃または基-(CH₂)p- を表し、その際p は2-5 の整数であり、R³およびR⁴は一緒になってオキソ基または-(CH₂)q- であり、その際q は2-5 の整数であり、そしてR⁵は水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシまたはC_1-5アルキルを表す）で表されることを特徴とする請求項18の方法。 25．ビタミンD 化合物が1-α- ヒドロキシビタミンD₃である請求項18の方法。 26．ビタミンD 化合物が1 α,25-ジヒドロキシビタミンD₃である請求項18の方法。 27．以下の工程：無機リン補給物約 0.5%-1.9%を含む飼料を動物へ与え；および前記飼料とともに前記飼料中のフィテート複合体からリンを利用するための1 α- ヒドロキシル化ビタミン D化合物の有効量を与え；動物により生じる低下したリンレベルを含む排泄物を集め；前記排泄物を土壌に散布することからなる環境におけるリンの有害な汚染を低下する方法。 28．前記1 α- ヒドロキシル化ビタミン D化合物が前記飼料における粉衣剤として与えられる請求項27の方法。 29．1 α- ヒドロキシル化ビタミン D化合物の前記有効量が飼料の約5 μg /k g- 約40μg / kgからなる請求項27の方法。 30．さらに前記飼料にフィターゼの有効量を混入する工程を含む請求項27の方法。 31．フィターゼの前記有効量が前記飼料において約300 単位から約 1,200単位からなる請求項27の方法。 32．フィターゼの前記有効量が飼料1kg 当たり約600 単位からなる請求項27の方法。 33．前記1 α- ヒドロキシル化ビタミン D化合物が以下の一般式：（式中、X₁は水素またはヒドロキシ保護基でよく、X₂はヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ基でよく、X₃は水素またはメチルでよく、X₄およびX₅ は各々水素であるかまたは一緒になってX₄およびX₅はメチレン基を表し、Z はY 、-OY 、-CH₂OY、-C≡CYおよび-CH=CHY から選択され、その際二重結合はシスまたはトランス立体化学配置を有し、そしてY は水素、メチル、-CR₅O および次の構造式：の基から選択され、その際m およびn は独立して、0-5 の整数であり、R¹は水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、および直鎖または枝分かれ鎖の場合によりヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ置換基を有するC_1-5- アルキルから選択され、R²、R³およびR⁴の各々は独立して水素、フルオロ、トリフルオロメチル、および直鎖または枝分かれ鎖の場合によりヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ置換基を有するC_1-5-アルキルから選択され、そしてR¹およびR²は一緒になってオキソ基、またはアルキリデン基、=CR₂R₃ 、または基 -(CH₂)p- を表し、その際p は2-5 の整数であり、R³およびR⁴は一緒になってオキソ基、または-(CH₂)_q- であり、その際q は2-5 の整数であり、R⁵ は水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシまたはC_1-5アルキルを表す）で表されることを特徴とする請求項27の方法。 34．ビタミンD 化合物が1-α- ヒドロキシビタミンD₃である請求項27の方法。 35．ビタミンD 化合物が1 α,25-ジヒドロキシビタミンD₃である請求項27の方法。 36．以下の工程：所望の陽イオンと結合するフィテート複合体を含む飼料からなる動物用飼料を用意し；前記飼料に1-α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物の有効量を混入して飼料混合物を形成し；前記飼料混合物を動物へ与えることからなる動物用飼料におけるフィテート複合体を分解する方法。 37．前記所望の陽イオンがカルシウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガンおよびリンから選択される請求項36の方法。 38．前記1-α- ヒドロキシル化ビタミンD 化合物が前記飼料上で粉衣剤として与えられる請求項36の方法。 39．1 α- ヒドロキシル化ビタミン D化合物の前記有効量が飼料の約5 μg /k g- 約40μg / kgからなる請求項36の方法。 40．さらに前記飼料にフィターゼの有効量を混入する工程を含む請求項36の方法。 41．フィターゼの前記有効量が前記飼料において約300 単位から約 1,200単位からなる請求項36の方法。 42．フィターゼの前記有効量が飼料1kg 当たり約600 単位からなる請求項36の組成物。 43．前記1 α- ヒドロキシル化ビタミン D化合物が以下の一般式：（式中、X₁は水素またはヒドロキシ保護基でよく、X₂はヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ基でよく、X₃は水素またはメチルでよく、X₄およびX₅は各々水素であるかまたは一緒になってX₄およびX₅はメチレン基を表し、Z はY 、-OY 、-C H₂OY、-C≡CYおよび-CH=CHY から選択され、その際二重結合はシスまたはトランス立体化学配置を有し、そしてＹは水素、メチル、-CR₅O および次の構造式：の基から選択され、その際m およびn は独立して、0-5 の整数であり、R¹は水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、および直鎖または枝分かれ鎖の場合によりヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ置換基を有するC_1-5- アルキルから選択され、R²、R³およびR⁴の各々は独立して水素、フルオロ、トリフルオロメチル、および直鎖または枝分かれ鎖でよいC_1-5-アルキルから選択され、場合によりヒドロキシまたは保護されたヒドロキシ置換基を有し、そしてR¹およびR²は一緒になってオキソ基、またはアルキリデン基、=C R₂R₃、または基 -(CH₂)p- を表し、その際p は2-5 の整数であり、そしてR³およびR⁴は一緒になってオキソ基、または-(CH₂)_q-であり、その際q は2-5 の整数であり、R⁵は水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシまたはC_1-5アルキルを表す）で表されることを特徴とする請求項36の方法。 44．ビタミンD 化合物が1-α- ヒドロキシビタミンD₃である請求項36の方法。 45．ビタミンD 化合物が1 α,25-ジヒドロキシビタミンD₃である請求項36の方法。