JPH10512681A

JPH10512681A - キャピラリー分離システムにおけるマイクロリザーバ電極からの電気移動注入

Info

Publication number: JPH10512681A
Application number: JP10508138A
Authority: JP
Inventors: パーネンデュケイダスグプタ; カジミエルススロウィエク
Original assignee: ダイオネックスコーポレイション
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 1998-12-02
Anticipated expiration: 2017-08-01
Also published as: CA2233711C; DE69721473T2; AU3906297A; ATE239225T1; AU709730B2; WO1998005950A1; DE69721473D1; EP0858598A4; EP0858598A1; EP0858598B1; JP3065358B2; US6086736A; CA2233711A1

Abstract

(57)【要約】キャピラリー電気泳動システム(10)が以下を含む。すなわち、第１末端部(30)と第２末端部(140)とをもつ分離キャピラリー(20)；溶液(40)を含むソース容器(50); ワイヤループを含むマイクロリザーバ電極(59); ワイヤ(57)によってマイクロリザーバ電極に接続する電源(60); 制御システム(200); 検出器(90); および電解液(150)とアース電極(155)を含む最終仕向先容器(160)。

Description

【発明の詳細な説明】キャピラリー分離システムにおけるマイクロリザーバ電極からの電気移動注入他の特許出願との関連本出願は、出願人の米国仮出願番号60/023,074(1996年 8月 2日出願)、名称「キャピラリー電気泳動法での小ループからの電気移動注入」の継続出願である。発明の背景キャピラリー電気泳動("CE")およびこれに関連するキャピラリースケール技術は、大きな生体分子の分離および定量を行うための非常に重要な分析技術を提供している。このような技術は小イオンの分離、検出に有用なものであるが、イオンクロマトグラフィ法が従来支配的な技術として用いられてきた。最近より効力のあるイオンクロマトグラフィ検出技術が発見され、これをキャピラリー電気泳動法に適用できるようになった。その一つの結果がいわゆる抑制電導度検出キャピラリー電気泳動分離システム ("SuCCESS")である。"SuCCESS”技術を用いることによって、予備濃縮のために特別の労をかけずに、様々な小イオンの低いμg/L検出限界値を迅速に出すことができる。（Dasgupta and Baoの米国特許出願番号5,358,612 および5,433,838 参照）しかしながら、キャピラリー電気泳動法を用いる場合には、図１に示すように、紫外・可視部吸収検出を利用するのがもっとも一般的である。（例えば、“キャピラリー電気泳動法”S.F.Y．Li，Elsevier，NY 1992参照）。図１に示すように、CE分析システム10には分離キャピラリー20が含まれる。そしてこのキャピラリーの末端30は、検体試料Ａおよび一般的には他の物質Ｘをも含む溶液40に最初のうちは流体接続されている。溶液40はソース容器50に入っており、電極55に電気的に接続されている。電極55は高電圧("HV")（一般に数十キロボルト）電位V1 の電源60に電線57で接続されている。第２の電位、すなわちアース電極155 はしばしば最終仕向先容器160 中に設置される。図１のように、キャピラリー20は最終仕向先容器160 に至る前に紫外・可視部検出器90の中を通過する。図１に示すように高電圧電源60をキャピラリー20に接続することによって、検体Ａが右方向矢印で示すようにキャピラリー内で左から右方向へ移動する。このような移動は電源60を作動させると数秒以内に始まる。その後電源60のスイッチを切り、キャピラリー20の先端30を移動電解液80を含む第２容器70中へ移す。電源60は電極55を介して溶液80とつながっているが、この構成は容器50に関連して記載した電極55と同じ（まったく同一）であってもよい。電源60を再び作動させると、試料検体の下流移動が継続する。この種の電場誘導による検体注入は、電気移動注入あるいは界面導電注入("EI ")と命名されている。キャピラリー140 の末端は、終端電解液リザーバ150 に入った電解液150 と流体接続している。電解液150 は、移動電解液80と同じものであることが望ましく、また図示の実施例ではアース電位に設定されている。上述したように、EIを行う間、バックグラウンド電解液(BGE)を満たしたキャピラリーを試料バイアル瓶に浸した状態で高電圧を印加する。典型的な状況では、電気浸透と電気泳動運動が同時に機能し、所望のクラスの検体イオンがキャピラリー中へ導入される。一般に、電気浸透移動度（μ_eo）が電気泳動移動度（μ_eo ）に対して小さい場合に、電気移動予備濃縮を行う条件としてこの手法はもっとも適している。これらの条件下では、かなり大量の液体が同時に入り込むことを回避しつつ十分大量の検体を導入することができる。EIは、微量分析に広く利用されている。この手法は紫外・可視部検出と併用すると特に有効である。なせなら、検出器90のようなCEで一般に用いるオンカラム紫外・可視部吸収検出器は、分析に必要な十分な試料濃度の検出限界値が比較的低いためである。小イオンの定量には一般的に間接検出法を利用するが、これは直接検出法に比べると条件はずっと不利である。 EIを行う際に、試料のイオン強度が非常に低い場合には、検体全体の濃度に対して高い濃度になるように低移動度イオンを適宜試料に添加した場合に最もよい結果が得られる。ここで言う“低移動度”とは、分析対象の検体イオンのいずれよりも低い移動度をもつイオンを意味する。このような場合、添加イオンは終末 (terminating)電解液のように挙動し、電気移動予備濃縮は等速電気泳動に非常によく似ている。スルフォン酸塩染料中の残留硫酸塩を定量するときのように、状況によっては高移動度イオンが分析対象の検体であり、低移動度イオンがすでに多量に存在している場合もある。このような場合には、終末電解液を添加する必要はない。有意なイオン強度をもつ試料中に分析対象の検体が低い濃度で存在する場合には、十分な終末電解液を添加して後者を優勢な電流担体にしようとすることは実際的ではない。残念ながら、試料検体濃度と器具設定とが同一の場合であっても、EIシステム中へ導入される検体の量は試料導電率によって大きく左右される。このようなことが生じるのは導電率が電気浸透導入速度に影響を及ぼすためである。上記ほど直接的ではないが、導電率はまた、試料にかかる電場の強さの変化によって電気泳動の移動速度にも影響を与える。さらに、EIは検体自体の移動度にも依存し、高い移動度をもつイオンに有利なバイアスを生みだす。ここで“バイアス”が生じるということは、注入された試料が元の試料と異なることを意味する。この違いは、元々試料中に存在していた試料に対して、分別注入部分により動きの遅い移動イオンが相対的に不足したり、より動きの速い移動イオンが相対的に過剰になるためである。Lee とYeung らの研究者(Anal．Chem．1992，64，1226-1231) は、システムに流れる電流をモニターするという単純なアプローチを押し進めることによって、EIを用いて精密な結果が得られるように改善したが、彼らの手法は注入に伴いバイアスが生じるという問題についてはほとんど何も解決していない。試料導電率がバイアスに依存するという上述の問題に対処するために、他の試みが先行技術の中で行われてきた。例えば、分析対象のすべての検体を標準的に添加するような、分析対象の検体移動度の全範囲をカバーする２種類の別の内標準を使用することが提案された。これらのアプローチは満足のいくものではなく、また実際、煩瑣な作業となりかねない。最後に、先行技術では、キャピラリー中へ試料イオンを入れるEIという方法が究極的には局所的な電場に依存するという根本的な事実が見過ごされがちであった。形状の変化及び／若しくはHV電極とキャピラリーの先端との間の物理的距離のちょっとした変化がEIに大きく影響を及ぼす場合もある。残念なから、先行技術では信頼性のある真に左右対照な電場をつくりだすことは困難であった。先行技術では、検体イオンがキャピラリー中へEIによって導入される元となる試料の部分標本中の検体の総量は、実際に導入される検体の総量に対して非常に大きい。もし本当に少量の試料から十分に長い時間をかけてEIを行うことが可能であれば、分析対象の検体イオンを実際にすべてキャピラリー中に悉皆的に（即ち、余すこと無く）導入することは原理的には可能であろう。処理の過程で、試料が脱イオン化されることはなく、また導電性を失うこともないであろう。電場で発生したH⁺またはOH^-と、すでに試料中に存在する適当な対イオン、また、EOF にさからって移動しキャピラリーから試料中に流入するイオンなどが試料の導電状態を維持するので、脱イオン化あるいは導電率の低下は生じないであろう。実際、EIを十分に長い時間をかけて行うことができれば、かなりの量のH⁺あるいはOH^-が導入されるであろう。残念なから、先行技術を用いて悉皆的な電気移動を効果的に実行することは不可能である。従って、簡単に製造でき、好適には１μＬ未満の液体容量を持ち、悉皆的な電気移動と電気泳動に利用できるマイクロリザーバが必要とされる。好適には、このようなマイクロリザーバは内部の全試料を容易に対称電場にかけることができるものであることが望ましい。さらに、このマイクロリザーバは、試料が入る部分の対称の中心に分離キャピラリーの入口先端を配置することができるものであることが望ましい。これらの特徴および手法を取り入れたシステムは、電気移動注入キャピラリー電気泳動における導電率の影響を低減するという好ましい結果を生じる。本発明はそのような方法及び装置を提供するものである。発明の要約試料中の所望の極性をもつ検体イオンを分離キャピラリー中へ悉皆的に導入することができるマイクロリザーバ電極を利用することにより、電気移動注入("EI ")を用いた分離システムにおけるバイアスによる望ましくない影響を低減できる（この分離システムは、電気泳動あるいは通電クロマトグラフィーシステムであってもよい。）。金属化された基体中に形成されたワイヤループまたは半球体によって有限容積のマイクロリザーバが画定される。悉皆的な導入に要する時間を短縮するにはマイクロリザーバは対称形とするのが望ましい。また分離キャピラリーの入口端をマイクロリザーバの中心に配置することが望ましく、これによって悉皆的な導入に要する時間を有利に短縮することができる。マイクロリザーバは導電体であるので、高電圧電源端子に接続されており、この分離システムの高電圧電極の一つを構成している。高電圧が印加されると分析試料はマイクロリザーバ内で電場にかけられ、分離システムによって検体の悉皆的な注入が行われる。この分離システムにおいて悉皆的な電気的注入を実施すれば、試料中の高速移動イオンが、同じ極性をもつが低速移動のイオンよりも早くキャピラリー内に入ってくることに起因するバイアスの影響を実質的に低減できるという好ましい結果が得られる。電気移動を用いる悉皆的な注入により試料の定量的な注入を実質的な結果として得ることができる。この注入方法は試料の導電率に実質的に依存せず、また、同じ極性をもつ様々な検体イオンのイオン移動度にも実質的に依存せずに行われる。悉皆的電気注入は、好適には以下のように行う。再現性があり、かつ、微量（例えば２μL 未満）の体積をもつ、好適に対称のマイクロリザーバ電極を用いて、少量の部分標本すなわち試料の一部を分取する。この部分試料は、ループ型マイクロリザーバ電極を試料の入った容器中に浸して取り出すことにより得られる薄膜であってもよい。マイクロリザーバ電極を一つの電極として用い所望の時間 (例えば30秒から60秒間)EI 電位を印加する。この時間中に試料中に存在する所望の極性をもつすべてのイオンが分離キャピラリーの始端部中へ実質的に定量的に注入される。最初、高速移動イオンが注入され、これらのイオンが枯渇するにつれて、低速移動イオンがキャピラリー中へ注入される。このような結果が得られるのはリザーバ容積が比較的小さいことに起因する。その結果、高速移動イオンに加えて、より低速で移動するイオンをより忠実に再現したものを注入された試料が含むことになるという点でバイアスの影響が低減される。本発明の他の特徴及び有利な諸点を以下に記載し、図面と共に推奨実施例を詳細に明らかにする。図面の簡単な説明図１は、先行技術による従来の分離システムを描いたものである。図２は、本発明によるEI分離システムを描いたものである。図3Aは、本発明による傾斜ループ形状およびそれに関連する支持ワイヤを用いたマイクロリザーバ電極を開示する第１実施例を描いたものである。図3Bは、本発明による、キャピラリー縦軸とループ半径とが共通平面上にある、平面ルーブ形状を用いたマイクロリザーバ電極を開示する第２実施例を描いたものである。図3Cは、本発明による、導電基体上に形成された半球体を含むマイクロリザーバ電極を開示する第3実施例を描いたものである。図４は、本発明による、十分に混合した薄膜から得られた数値シミュレーションEIデータを描いたものである。図５は、本発明による、他の条件は図４と同一にした、混合を行わなかった場合に薄膜から得られるEI数値シミュレーションを描いたものである。図６は、本発明による、他の条件は図５と同一にした、薄膜中の塩化物、酢酸塩および水酸化物の空間分布をEI時間の関数として描いたものである。図７は、本発明による、他の条件は図５と同一にした、モデルが拡散混合物を含む場合の薄膜から得られるEIの数値シミュレーションデータを描いたものである。図８は、本発明による、モデルが拡散混合物を含む場合の薄膜中の塩化物、酢酸塩および水酸化物の空間分布をEI時間の関数として描いたものである。図９は、本発明による、注入された塩化物と酢酸塩の分画をループ半径とEI時間との関数として描いたものである。図10A および図10B は、それぞれ従来のEIおよび本発明によるループから得られるEIを描いたものである。図11A は、本発明による小ループからのEIを描いたもので、一定の硝酸塩濃度条件下における酢酸塩の変動を３桁におよぶ非常に広い動的範囲で示したものである。図11B は、本発明による、一定の酢酸塩濃度条件下における硝酸塩の変動を３桁の範囲で描いたものである。図12は、本発明による、塩化物の酢酸塩に対するピーク面積比率を正規化したループEIのデータを、HVとEI時間の関数として描いたものである。図13A は、本発明による、ループ−EIで注入された当量を、EIの関数として描いたものである。図13B は、本発明による、塩化物に対するループ−EIバイアスをEIの関数として描いたものである。図14は、本発明による、ループの EI での遅延によって生ずる水酸化物の導入を描いたものである。推奨実施例の詳細な説明図２に、マイクロリザーバ電極59を備えた、いくぶん改変したCEシステム10' を示す。本明細書に記載するように、マイクロリザーバ電極は、約１μL 以下の容積保持収容力を持つものとして画定することが望ましく、この電極は先行技術を示す図１の電極55の代わりに、電極として有利に機能する。このマイクロリザーバ電極の形状は対称であり、好適には、導電ワイヤで形成されたループ（図3A 、3B参照）、あるいは金属基体または導電基体で画定された半球体であることが望ましい（図3C参照）。出願人は、内径74μm 、外径360 μm 、長さ60cmの溶融石英キャピラリー20を用いる、完全自動化した特注CEシステムとして、システム10' を使用した。このようなキャピラリーは、アリゾナ州、フェニックスのポリマイクロ・テクノロジー(Polymicro Technologies，Phoenix，AZ.)で入手することができる。高電圧( “HV”)電源60は、プログラム制御可能なHV電源、モデルCZE 2000によって設けることができ、ニューヨーク州プレインビューのスペルマンハイボルテージ(Spe llman High Voltage，Plainview，NY.)から入手できる。可変波長紫外・可視部オンカラム吸収検出器120 あるいは130(LINEAR model 206 PHDサーモセパレーションシステムズ(Thermo Separation Systems)から入手可能)を、80386 クラスのパーソナルコンピュータ（不図示）で動くW-206 データ収集ソフトウェア(LINEA R)と組み合わせて使用した。言うまでもなく、別の装置や異なるサイズのキャピラリーを使用することもできる。当業者であれば、システム10に実際にキャピラリー通電クロマトグラフィーシステムが含まれることを認めるであろう。このような場合には、キャピラリー20は中空管ではなく充填カラムとなるであろう。本発明を実施するに際して、キャピラリーの標本ヘッドを試料からの引き出す過程を正確に制御する自動化システムが特に重要である。図3A及び図3Bに示されたマイクロリザーバ電極ループ59様の、ワイヤループに付着した薄膜のような再現性のある液量を容器50から引き出すことが望ましい。薄膜中に保持される液量を再現性よく確保するには、この操作をゆっくり行わなければならない。出願人の実験では、改変したフラクションコレクター(model 2110，BIO-RAD，Richmond ，CA)をオートサンプラーとして使用することにより、システムの自動化を達成した。キャピラリーヘッドを水平及び垂直方向に動かすために、電動式エアソレノイド弁で作動するいくつかの空圧式リニアアクチュエータを使用した。プログラム制御可能なマイクロコントローラ（カリフォルニア州ロスアンジェルスのミナリック電気(Minarik Electric)から入手可能なMicro Master LS 装置)によってシステムオペレーションを制御した。他の制御システムを代わりに採用することもできる。これらの構成部分およびサブシステムを集合的に200 として図２に一般的に示す。図２が煩雑になることをさけるために、マイクロリザーバ電極59 の物理的な動きは示していない。キャピラリーの始端部でワイヤループをつくる一般的手法が出願人の刊行物(A nal．Chem．1996，68，1164-1168)に開示された。これと対比すると図3Aおよび図3Bに示した本発明の実施例で使用したループは実質的に大きく、そのためにかなり製造し易い。手短に言えば，直径135 μm のステンレス鋼のワイヤを適当なサイズのドリル・ビットの周りに巻き付けることにより直径5/64から1/8 インチのループを最初に作り、その後これを１乃至２回撚り合わせて保持する。図3Aと3Bに示すように、ワイヤループを取り入れたマイクロリザーバ電極(略して“ループ”)を２つの異なる形状で使用した。図3Aでは、ループ59のなす平面は分離キャピラリー20の縦軸に対して45°から90°の角度φで傾斜している。キャピラリー20に平行な垂直支持ワイヤ64によってループ59が所定位置に保持される。このループが対称形で始端部30の中心が中央部で対称位置に配置されていることに注目されたい。下部キャピラリー始端部30の上方数センチのところで、66 として描かれている小さなプレキシガラスジグによって支持ワイヤとキャピラリーを保持する。ワイヤループによって高電圧電源50に導電ワイヤ57が接続される結果、分離システム10' においてループ59が一つの電極を形成する。ループマイクロリザーバ電極を用いる一つの利点は、真に対称な電場が電極全体に作り出されることである。図3Aの実施例では、液体からパルプを引き出したときループ中に保持される液量はループ平面角がより垂直になるにつれて減少する。図3Bの実施例では、ループ59は、キャピラリー始端部30の周りに形成され、キャピラリーの軸線はループの平面に対して平行になる。終端ワイヤ68をキャピラリーの始端部の周りに巻きつけ、接着用エポキシ樹脂によってそこに接着する。図3Aおよび図3Bの実施例では、ループにつながっている突出ワイヤ(すなわち支持ワイヤ)64 またはワイヤ57に対して高電圧の接続を行う。上述したように、結果的にループ59が図１の電極55の代わりに高電圧電極として機能する。本実験は逆極性（−HV）に限定して行ったのでループ電極59を製造するにはステンレス鋼材が適当であった。上述したようにシステム10' で使用するときは、マイクロリザーバ電極59は一定の液量（例えば１μL 以下）を保持し、マイクロリザーバ全体に均一な電場が与えられることが望ましい。図3Aと図3Bに示すような対称ループはこのような目的に合致している。図3Cの実施例では、マイクロリザーバ電極59は半球体の窪み 68を形成する面をもつ導電基体（例えば金属のような）から構成される。わかり易い例図としてこの基体を矩形で示したが、円形の基体を代わりに用いてもよい。円形の基体を用いれば対称性を保つのにさらに役立つであろう。半球体の窪みは所望の液量（例えば１μL 未満）を保持するサイズとし、それによって一定容量の収容力を持つマイクロリザーバとして機能する。一定容量を保持するためには、このようなリザーバに自己サイホン作用を持たせてもよい。マイクロリザーバは導電材で作られているので、ワイヤ57をマイクロリザーバ電極59の基体に接続し、これを電極として機能させてもよい。再言するが、キャピラリー20の始端部30はマイクロリザーバ半球体68の中心に対称に配置される。この結果、半球体68に保持される試料は対称の電場にかけられることになる。システム10' で使用する試薬は、16M Ωcm以上の特定の電気抵抗を持つ、脱イオン化した蒸留水（例えばBarnstead Nanopure）を用いてあらゆる種類の溶液を調製した。クロム酸ナトリウム水溶液(5mM)は、クロム酸ナトリウム4 水和物(Na₂ CrO₄4H₂O，A.R．Grade，Mallinckrodt)から調製した、硫酸(H₂SO₄)0.1M を用いてpH8.0 に調整した50mMのストックから毎日新しく調製した。セチルトリメチルアンモニウム水酸化物(CTAOH)は、セチルトリメチルアンモニウム塩化物溶液をO H^-型200-400 メッシュ Dowex 1x8陰イオン交換カラムクロマトグラフィーでイオン交換して調製し、20mMのストックから使用した。（−HVに印加したアース電極への流れをつくるために）電気浸透流("EOF")調節剤としてCTAOH を使用し、クロム酸塩電解液に添加し、最終的に濃度0.5mM の溶液を得た。システム10' を操作する際に、まずキャピラリー20をBGE で満たし、その後ループ59を洗浄するために始端部30を下げて１つの試料バイアル瓶に入れ、そこから引き出す。そして、キャピラリーを２番目の同じ試料バイアル瓶に入れ、ゆっくりと引き出してループ上に試料薄膜を形成する。次に、キャピラリーを水平に移動し、例えば、図２の容器160 のような仕向先側の液面と同じ高さの位置に置く。この位置で、ループの周りの領域が円筒状に閉じ、弱い窒素流( 20〜25cm³/ min)によりCO₂の過度の侵入が阻止される。高電圧電源60から電気移動電圧(明示されていない場合、−3kV)を印加した。上述したように、マイクロリザーバ59はシステム10' の一方の電極として機能した。もう一方の電極は電極155 に（または、システムの別の10' 場所に）接続した。所望のEI時間の後、キャピラリーを最初のBGE バイアル瓶中に洗浄のため入れ、それを下げて２番目の新しいBGE バイアル瓶に作業を行うために入れる。電気泳動のために−18kVの作業電圧を使用した。従来の試料バイアル瓶からEIを行うときと同様の方法でほぼ同じ手順を用いた。陰イオンの定量を行い、特に記載がなければ試料はすべてナトリウム塩として塩化物(200 μg/L)、硝酸塩(400μg/L )、蟻酸塩(400μg/L)および酢酸塩(400μg/L)の混合物で構成した。次に、本発明を実施する際に基礎となる原理について考察する。EIにおいて、電圧V が印加されたとき、長さL、内径r_eのキャピラリー中に時間t の間に導入されるイオンi の量Qiは次式で与えられる。Ｑ_i（μ_i＋μ_eo）πr_c ²ＶＣ_it/L (1) ただし、μ_iおよびμ_eoはそれぞれ電気泳動および電気浸透移動度であり、Ｃ_i はイオン種 iの濃度である。この分析では、キャピラリー先端の電場E はキャピラリー内部の電場と同一であると仮定されており、従ってこの値はv/L で与えられている。この流束はキャピラリー入口域断面中に生じる。検体i のバルクリザーバが非常に大きいので、c'の値はEIの実行中本質的に不変である。従って、キャピラリー内の検体イオンの移動速度がキャピラリー先端での検体導入速度に影響を与えないかぎり、(1)式のより一般的な公式は以下のようになる。Ｍ_i＝dQi/dt＝(Ｅμ_i＋U_eo)ａＣ_i (2) ただし、Ｍ_iはキャピラリー始端部の周りの面積a の中を通る、キャピラリーの方へのイオンi の質量輸送速度(eq/s)であり、イオン種 iの濃度はＣ_iである。実際には、電場Eがキャピラリーの内部と外部で同じであることはあり得ない。それにもかかわらず、電気浸透によって導入されたEIの成分は、キャピラリー中に発生したEOF に支配される。従ってEOF が支配するEIの成分は、キャピラリーに発生するバルク流体速度μ_eoという項によって直接的によりよく特定される。Ｅμ_iに対してμ_eoが非常に小さい場合には、式(2)は明らかに以下のように単純化される。Ｍ_i＝Ｅμ_iａＣ_i (3) 次に、キャピラリー先端部における電場の形状および薄膜抵抗について考察する。単純化された代表的な例として、試料が半径ｒ_out厚さｈの薄い円形ディスクで構成され、キャピラリー始端部がディスクの中心に置かれた場合のことを考察してみる。ｒ_outに対してｈが小さいかぎり、垂直方向の拡散輸送は律速過程ではないと仮定できる。ディスクの周囲面積２πｒ_outｈが一方の電極を構成する。薄膜／ディスクがループを構成するワイヤの直径より厚い場合でも電極面積は薄いディスクの全周囲面積に正確に接近するであろうことに注目されたい。キャピラリー断面πｒ_c ² は、実際上の２番目の電極を表す。ほとんどの場合、ｒ_cは、ｒ_outに比べて非常に小さい。従って、平面形状の代わりにキャピラリー断面と等しい面積の半径ｒ_e円筒形状を中心電極が持つように近似してもよい。これより、ｒ_e＝ｒ_c ²/２ｈ (4) 従って、結果的に、最初は環形を満たす均一な抵抗ρの媒質を持つ環状電極システムとなる。ここで、 ρ＝1/（Σλ_jＣ_j） (5) であり、λ_jは、（S cm²eq^-1中の）イオンj の当量導電率であり、また、Ｃ_j は、1cm³当たりのその濃度である。これは、Ωcm中に抵抗ρを与える。イオンj には、対象の検体陰イオン（イオンi 、例えば塩化物）だけでなく、電気的中性を維持するために媒質中に存在する等しい濃度の対イオン（例えばナトリウムイオン）も含まれる。この分析において、出願人は分析対象の律速過程をキャピラリー中へのイオン i の移動であると仮定した。このような場合、（対イオンが薄膜中の検体イオン濃度に対して非常に大きな濃度で存在する）キャピラリーから出る対イオンの逆移動は律速段階ではない。EIを行うと負電位に維持されるループ電極にOH^-という電解生成物が発生することにも留意しなければならない。ループ薄膜中の抵抗 ρが増加するNaOHの影響を受けるだけでなく、EI時間に相関して試料イオンの量が増加するにつれOH^-もまたそれゆえに導入されてゆく。次に、ループの電気抵抗の与える影響について考察する。内部電極が半径r および厚さh を持ち、かつ第２電極が無限小の距離drの位置にあるならば、内部電極抵抗dRは次式で与えられる。 dR＝ρdr/2πrh (6) これよりＲ＝(ρ/2πh)logｒ (7) 従って、半径ｒ_outおよび内径r_cループを持つ分析対象の実施例に上記の式をあてはめると、ループの抵抗R_loopは次式で与えられる。 R_loop＝(ρ/2πh)log(r_out/r_e) (8) 次に、キャピラリー中への質量転移について説明する。式(3)において、電場E をつぎのように表現することもできる。 E＝dV/dr (9) システム内を流れる電流Iは、全印加電圧V と、キャピラリーの電気抵抗(R_cap )ループの抵抗(R_loop)との和との関数である。従って、電流の関係式は以下のようになる。 I＝V/(R_loop＋R_cap) (10) EIを行っている間、総印加電圧は一定のままであり、また実際のほとんどの印加において、キャピラリーの電気抵抗(R_cap)は本質的に不変であり、R_loopよりはるかに大きい。従って、電流I は本質的に一定のままである。これより、式 (9)は以下のようになる。 E＝I dR/dr (11) キャピラリー始端部において、式(3)から導かれ、質量転移が生じる面積a は、内部円筒形電極の表面積であり、また、キャピラリーの断面積に等しい。面積 a は次のように書くことができよう。 A＝2πr_eh (12) キャピラリー先端でr＝r_cおけば、式(6)から次式が産み出される。 dR/dr＝ρ/2πr_eh (13) 式3、11、12、および13を組み合わせることにより、次の単純な結果が得られる。すなわち M_i＝Iρμ_iC_i (14) 本発明の試料薄膜は空間的に十分に混合され均質である。薄膜全体はいつでも十分に混合されていると仮定する。水酸化物以外のすべての陰イオンについて、 −dC_i/dt ＝M_i/V_f ＝Iρμ_iC_i/V_f (15) ただしV_f、πr_out ²h与えられるループ薄膜の体積である。 OH^-もI/F eq/sの速度で薄膜中に生成される。ただし、F はファラデー定数である。この結果以下の式が導かれる。 −dC_OH/dt＝I(ρμ_OHC_OH−1/F)/V_f (16) 式(5)を展開すると次式となる。 ρ＝ΣC_iλ_i＋C_OHλ_OH＋λ_Na(C_OH＋ΣC_i) (17) 式15、16および17は、連立二階微分方程式の組からなり、その一般解は存在しない。しかしながら、この連立方程式は、数値解法により容易に解くことができる。別段の記述がない限り、以下のシステム特性が仮定されている。すなわち、ループ半径1mm、試料容量１μL 、試料組成Cl(200μg/L)、NO₃ ^-(400μg/L)、HCOO^-(4 00μg/L)、CH₃COO^-(400μg/L)、EI電圧−3kV 、キャピラリー内径75μm 、BGE5m M Na₂CrO₄。60cmのキャピラリー長に対して、計算されたR_capは、1.008GΩで、これは実験によって得られた電流値−3μAと高い近似的一致を示している。 133MHzで作動するペンティアムプロセッサPC上でターボベイシック(Borland I nternational 製)で書いたコードを用いて計算を行った。反復ステップの時間幅を短くとることにより溶液の収斂をチェックした。一般に、反復ステップが100 μs 以下では、有意の変化は得られなかった。本明細書に記載されたデータのすべては、このような時間的な反復ステップに基づいたものである。上記の十分に混合した薄膜を試料として用いる場合には、その演算時間は特に要求されるものではないことに留意されたい。しかし、（本明細書に記載する） EIを行う間、薄膜組成が同心円状に変化するようなより現実的な条件の場合には、50μs の反復ステップで30秒のEIのシミュレーションを行うために、14時間以上の演算時間を必要とする。この14時間という演算時間がPCを利用した演算の許容可能な上限の時間を表していることはおそらく理解できよう。出願人の分析は以下のアルゴリズムに従って行った。１．初期試料組成から、ρの初期値(式 17)、R_loop(式8)、およびＩ(式 10)を計算する。２．選択した反復時間間隔（式14）内に注入された検体イオンとOH^- の質量（累積質量）を計算する。３．試料薄膜の組成の変化（検体イオンとNaOHについての変化（式 15と16）、および新しい組成に対する変化の両方の変化）を計算する。４．この新しい組成を用いて、上記ステップ１と同じ計算を行う。５．所望の全EI時間シミュレーションが完了するまで、ステップ２、３、および４を循環して行う。成分を十分に混合した薄膜についてのこのようなEI数値シミュレーションを行った結果を図４に示す。EI時間の増加に伴い、注入されてゆく各検体の総量は、ほぼ指数関数的にそれぞれの限界値に達する。しかしながら、注入されたOH^-の量（＊で示す）の方はEI時間の増大につれて直線的に増加する。このような条件下では、定量的に注入される検体はないが、EIの最後の頃には、移動速度の速い塩化物と硝酸塩はほとんど完全に(それぞれ96% および95%)注入される。しかしながら、４つの検体中もっとも移動速度が遅い酢酸塩は約81% 程度までしか注入されない。塩化物対酢酸塩の相対バイアスは、1.183 である。これは言い換えれば、実際に注入された塩化物の酢酸塩に対する注入量の比率が試料中に元々入っていたそれぞれのイオンの比率よりも大きいことを意味する。これと対照的に、試料バイアル瓶から行った従来のEIの同じ相対バイアスを式 (1)から計算すると、得られる値は２つの移動度の比の1.866 となる。実際に、出願人もデータとして示してはいないが実験的にこれを観察した。従って、本発明に従ってもしEIを一定の限られた量の試料で行えば非常に著しいバイアスの減少を期待できる。空間的濃度勾配はEIを行っている間に生じる。上記の概略的方法論は教育的なものではあるが、いくぶん単純化しすぎている。現実にはループサイズは有限である。さらに、各イオンはキャピラリー入口へそれぞれ異なる速度で比較的速く移動するが、このことによって、薄膜の組成が時間的にだけでなく空間的にもEI 処理の間一定にならないことが確かめられる傾向にある。 EIを行う間は、キャピラリーの入口近傍でイオンが枯渇するために補充しなければならない。一方単純なモデルでは、OH^-が実際に薄膜の外周縁近辺で相当量生じている間は、OH^-は薄膜中で即座に混合されるため、このことが計算上の薄膜抵抗を低下させると考えられる。その結果、ループ全体の電場およびEIの速度もこの効果がないときの期待値に比べて低下する。いくつかのレベルの洗練された手法をモデルに含んでこれらの現象を説明することはできるものの、基本モデルに関係する式を分析的に解くことができない限り数値的解決法に頼らざるを得ない。出願人が採った基本的近似は、薄膜が個々に均一な組成からなるいくつかの薄いセグメントに同心円状に分割されていると仮定することである。最内側のゾーンはRINZONE の半径を持つ。ループの残りは、r_outに到達するまで、厚さΔr のセグメントに外向きに分割される。明記されていない場合、本明細書でのシミュレーションでは、RINZONE を50μm と仮定しており、キャピラリーの内径37.5 μm よりわずかに大きい。ΔR 値＝10μm を本明細書全体を通じて用いる。r_out ＝0.1cm に対して、ｎ＝96の分離ゾーンが生じる。これらのn 個のゾーンを、その半径(cm)という観点からr₁、r₂、・・・ r₉₅、r₉₆、と名付ける。ただし、r₁＝RI NZONE、r₂＝r₁＋0.001 、r_k=r₁＋(k −1)・0.001、r₉₆＝r_out r₀＝０とする。このような命名法を採用すると、各ゾーンすなわちシェルの体積V_kは、次式で与えられる。 V_k＝π(r_k ²−r_k-1 ²)h (18) 各シェルの電気抵抗R_kは式(7)に類似の方法で与えられる。すなわち R_k＝(ρ/2πh)log(r_k/r_k-1) (19) ただし、この場合、r₀は0 ではなく、仮定の円筒状中心電極の半径r_cとする。それにより、R_loopを次式(20)から計算する。次に、式(10)を用いて電流を計算する。最初のステップの間、ゾーンA_i,kとA_O _H.k の各々における、検体とOH^-のそれぞれの量を以下のように計算することができる。 A_i,k＝C_i,kV_k (21a) A_OH,K＝C_OH,kV_k (21b) 0H^-および検体を表す式は一般に同じであり、差がない限りコピーする必要はない。従って、検体を表すすべての式（この式に対して、OH^-を表す対応式が存在する）を参照番号の後ろにつけた‘a’によって示し、本明細書では明示されていない水酸化物に適用される同一の対応式‘b’を表すものとする。次に以下の手順ステップを行う。６．反復時間Δt の間にゾーンk からゾーンk −1 まで転移された検体量i 、ΔA_i,kを式(14)によって計算する。 ΔA_i,k＝Iρ_kμ_iC_i,kΔt (22a) ７．各ゾーンの新しい量を次に計算する。 A_i,k(new)＝A_i,k(old)−ΔA_i,k＋ΔA_i,k (23a) すべての検体に対して、最外側のゾーンnにおいて、ΔA_i,k+1をゼロにする。しかしながら、水酸化物がこのゾーンで発生するので、 ΔA_OH,n+1＝IΔt/F (24) となる。８．キャピラリー内に導入された検体量ΔA_i,1、検体量の累積総量を保持する。９．各ゾーンkについて、ρ_kの値を式17に従って計算し、電流I を式19、20、および 10を用いて計算する。 10．手順ステップ6、7、8、および 9を所望のEI時間に達するまで繰り返す。図５は、上記の方法を用いて、EIシミュレーションを描いたものであり、あるモデルによって、５秒間での塩化物の注入量を予測し、また10秒以内の酢酸塩の注入量さえも予測した。図６は、EIタイマーの関数としての同心円中の検体の分布を描いたものである。図６において、EI時間の経過に伴う検体の半径方向の分布に注目していただきたい。塩化物と酢酸塩の双方が外側ゾーンからまず枯渇し、その後ループの中心（すなわち、一方の有限マイクロリザーバ電極）に接近するにつれて実際のプラトーに到達する。塩化物は、低速移動する酢酸塩よりずっと速く姿を消す。外側電極にOH^-が発生し、このOH^-は外側ゾーンに接近するにつれてほぼ指数関数的に増加する濃度分布を各時点で示す。この増加は、EIを行う時間の増加とともに増し、検体イオンとは本質的に逆の挙動である。最外側のゾーンの検体の残留濃度は本明細書に記載されているように人為的に高い。出願人のモデルは、拡散を説明しようと企図するものである。最初一見すると、液相拡散は小さく思われ、電場支配によるイオンの輸送に対して無視できるように思われるかもしれない。EIの最初の段階ではこれは事実である。しかし一方で、ほとんど悉皆的な検体導入を行う場合には拡散輸送には２つの重要な効果がある。まず第一に、拡散混合は一方向の電気移動に支配される輸送とは対立するものであり、従って、任意の検体を半定量的に導入するのに必要な時間を長引かせる。第２に、最外側のゾーンでEIが行われる後半時間中にNaOH濃度が十分に高くなるのでゾーンが非常に導電性を持つようになり、局所的電位が低くなる。この場合、拡散は最外側のゾーンから中心部への（特にOH^-の）輸送を大いに助長する。セグメントkからセグメントk-1 まで拡散によって輸送したイオン種iの量ΔADi, ｋが次式で与えられ、これによって２つの隣接セグメント間のフィックの拡散輸送を仮定できる。 ΔA_Di,k＝D_i(C_i,k−C_i,k-1)a/Δr (25a) ただし、D_iは拡散係数（μ_iRT/Fにも等しい）、ａは２π_k-1hで与えられる輸送界面面積、そして、Δr は拡散距離、すなわち、(r_k−r_k-2)/2で与えられる２つの隣接セグメント間の平均半径距離である。Rは、気体定数で、Tは絶対温度を示す。拡散輸送を考慮に入れて式(22)を修正した形は、次式のようになる。 ΔA_i,k＝μΔt(Iρ_kiC_i,k＋４πRTr_k-1h(C_i,k−C_i,k-1)/(F(r_k−r_k-2))) (26A ) 本明細書に以上記載したものと同じ方法に従って反復計算を行う。図７および図８は、図５と図６に対応する出力を描いたものであるが、拡散を考慮に入れている。拡散混合を考慮に入れることにより、EIによる検体導入の速度を減速することに著しい効果が現れている点に注目されたい。水酸化物が最外側のゾーンからより多く混入する点も顕著に認められる。同じ理由により、最外側のゾーンの人為的残留検体濃度はもはや確認されない。図７と図８およびそれに対応する図４と図５との間の違いは、単に拡散効果から生じるもののように思われる。検体の電気的移動度は拡散係数に対し直線性を示す。しかし一方、電気移動が電場に依存する過程であるのに対して、拡散は異なる。従って拡散の相対的な重要性は、より低いEI電圧が印加されたとき増大する。この２組の結果の違いは、印加EI電圧の違いがどのようにこの過程に影響するかという観点から説明できる。印加電圧を変更した場合の効果を数値モデルで考察する。式(1)と対照的に、定電圧条件下における単位時間当たりの生成物量では、EIをより高い印加電圧で行う方がより効率的である。例えば、酢酸塩については、94.59%（−６kVで５秒間）対91.33%（−３kVで10秒間）の試料を導入し、また、99.87%(18kV で５秒間）対99.62%(9kVで10秒間）の試料を導入する。出願人はまた、非拡散混合と電気浸透流という観点から効果を説明することを企図した。確かに、薄膜全体が十分に混合したポット(pot)であるという仮定は過度に単純化されている。しかしながら、単なる混合プロセスを拡散として仮定することも不正確な過程となり得る。出願人の反復演算手順では、すべての10μm 厚のセグメントの内容は100 μ秒毎に均質化されると仮定しており、この仮定は、拡散混合のみを考えた場合よりも実質的に効果的な過程を表している。しかしながら、各反復ステップでは、計算結果は100 μ秒以下で収斂するので、このように仮定しても支障は生じない。現実の系では、より効果的な混合手段が、特に円盤の最内側部および最外側部に存在すると信じるにたる理由がある。第一（最内側部）の場合、キャピラリー始端部の存在が非拡散混合を引き起す可能性があり、第二（最外側部）の場合、電解ガスの発生が結果的に有意な混合となる可能性がある。最内側および最外側のゾーンを画定する半径距離を選択することによりこれらの現象を説明することができる。なぜなら、このような選択によって反復ステップで均質化される体積が効果的に変わるからである。出願人のモデルでは、RINZ ONE を50μm と150 μm の間で変化させても、（最外側のゾーン幅とループの半径がそれぞれ10μm と1000μm で一定に保たれている限り）結果にほとんど影響はなかった。例えば、10秒間に注入した塩化物のフラクションは、RINZONE をこの範囲内で増加させても99.4790%から99.4786%まで減少し、酢酸塩に対する変化も非常に僅か(91.1068% 〜91.1009%)である。最外側のゾーン幅を変更した場合の効果はもっと顕著に表れる。この場合、注入された全イオンのフラクションは、ゾーン幅が増すにつれて減少する。最外側のゾーン幅を、10、50、100 、200 および350 μm として、RINZONE とループ半径をそれぞれ50μm と1000μm に保った。10秒間に注入した塩化物のフラクションは、それぞれ 99.48% 、99,40%、99.04%、97.56%、および94.40%で、酢酸塩のフラクションは、91.11%、90.82%、89.72%、86.01%、および79.52%であった。最外側のゾーン幅を変更したときに生じる大きな効果はより理解しやすい。NaOHがこのゾーンに生成されて有効電磁場の大きな変化を来し、もしこの変化がより大きな体積全体に生じれば、それによって、より大きな体積に影響を与える可能性がある。本システムでEIが行われる間の電気浸透流Q_eoは、極めて小さく、0.500nL/s である。電気浸透流を説明するために、所定の反復時間内にEOF によって導入された検体量は最内側のゾーンの成分と同一の成分に対応するという仮定に立っている。従って、（式(24)の直後の）ステップ８を修正した形は次のように定式化される。 m_i,inj（new）＝m_i,inj（old）＋ΔA_i,k＋Q_eoΔtC_t,1 (27) ただし、m_i,injは、キャピラリー中へ注入される検体ｉの量であり、ΔA_i,kは式(26)によって与えられる。EOF による薄膜の体積変化は、薄膜厚さh の相当する変化によって説明できる。しかしながら、垂直方向への輸送を限定要因として考えていないので、これはいくぶん外面的なステップである。より重要な点として、薄膜中の検体量の変化および濃度変化を説明する必要がある。現実の系を描写する正確な代替手段がないので、各ゾーンの検体濃度に比例するように、薄膜全体の検体濃度の変化がキャピラリー中に注入される検体を反映していると仮定すると C_i,k（new）＝C_i,k（old）・(m_i,rem−Q_eoΔtC_i,1/m_i,rem・(h/(h−Δh)) (28) ただしm_i,remは、薄膜中の検体i の量で、Δh は次式で与えられる。 Δh＝Q_eoΔt/（πr_out ²） (30) ただし、h は薄膜の現在の厚さである。式(28)の右辺において、初項は量的変化を、第２項は薄膜の厚さを変えることによって生じる体積の変化を説明している点に留意されたい。出願人の実験システムではEOF が非常に遅かったので、Q_eoは、3kV 、30秒間のEI時間という条件での薄膜体積のわずか1.5%を説明するにすぎない。このため、出願人のモデルのこの改善は注目に値する変化にはほとんどつながらない（例えば酢酸塩を添加した10秒のEI時間に対して、導入フラクションが91.11%から91 .33%まで増加するというような）。しかしながら、より高いEOF ではより大きな変化が観察される。例えば、EOF が10倍大きいとき、上記と同じ標品を用いて導入されたフラクションは93.42%であった。上述したように、一定の小さな（好適には体積が約１μL 以下の）マイクロリザーバを保持することが望ましい。出願人のワイヤループは、図3Aと3Bに描かれているように、そのようなマイクロリザーバを好適に提供するものである。さらに、そのようなマイクロリザーバは、高電圧電極としてマイクロリザーバ用金属製ループを用いることにより、内部の試料全体を均一の電場にかける機能も有する。図3Cに関連して記載した導電半球体状の他のマイクロリザーバの構成について出願人は検証した。ワイヤーループあるいは半球状のマイクロリザーバの半径の大きさの影響を考察する。半径が変化すると試料体積が効果的にに変化することは理解できよう。所定の印加電圧に対して“悉皆的な”EIを行うには相当の長時間を要する。図９は、注入した塩化物と酢酸塩のフラクションに対する数値シミュレーションの結果をマイクロリザーバのループ半径とEI時間との関数として描いたものである。参考のため、出願人は、本明細書に記載したものと同じシステムとループ電極とを用いてバイアル瓶から従来の流体力学的注入および従来のEI注入を行いこれを検証してみた。流体力学的注入は時間に対して直線性を示した。例えば、N,N −ジメチルホルムアミドを試料として用いた場合、10秒から90秒の実施でその高さの差は4.7cm であった。任意の単位でのピーク面積は式(27)によって以下のように与えられる。 peak area（arb.units）＝12.39 ±0.37t(sec)−(19.66±3.78); r²＝0.9867 (27) Cl^-、NO₃ ^-、HCOO^-、CH3COO^-の微量標準混合液を用いてバイアル瓶から従来のE Iを行った。−3kV の高電圧で、EI時間を１秒から30秒としたところ、EI時間に対して直線的に比例した速度で個々のイオンのすべてが導入された。個々のr2値は、0.9976（Cl^-）、0.9980（NO₃ ^-）、0.9968（HCOO^-）、および0.9904(CH₃COO^- )であった。試料中の個々の検体の濃度およびその反応因子はいずれも同じではなかった。従って、等容量試料導入速度という観点からこの結果を表現するのが都合がよい。この速度は、試料イオンの移動度とともに変動し、0.48 9 ±0.008 μL/s（Cl^-）、0.443±0.007 μL/s(NO₃ ^-)、0.338 ±0.007 μL/s（H COO^-）、および0.2373 ±0.008 μL/s(CH3COO^-)μL/s である。イオン移動度μ_iに対する注入速度dv_injdtの関係は式(28)によって次のように与えられる。（dV_inj/d_i）＝(6.69 ±0.24)・102 μ_i−(4.51 ±l.54) ・10^-2， r²＝0.9975 (28) 上記の結果は、式(1)が予測するものと高い近似的一致を示している。しかしながらこれらの結果は、このような系から期待できる最良の結果であるかもしれず、より高い電圧を印加したとき式(1)から予測される挙動から特徴的な変動が観察できる。出願人は、上記記載の−3kV での測定値に加えて、印加EI電圧−6kV で15秒まで、また、−9kV で10秒まで実験を行った。それぞれの印加電圧において、Cl^- とNO₃(r²>0.9970)に関しては、導入された試料の量とEI時間との間の関係は直線性を示した。しかしながらHCOO^-については、r²値は、−9kV で0.9829であり、また、CH₃COOについては、線形r²値は、−6kV で0.96まで、また、−9kV で0.25 まで低下した。もっと重要な点は、式(1)に基づき、試料導入速度が印加電圧に直線的に比例することが予期されることである。Cl^-とNO₃ ^-に関しては、導入速度比は予期した結果1:2:3とは異なり、−3 kV、−6 kV、および−9 kVでそれぞれ1:1.59:1.72 および1:1.45:1.50であった。実際、硝酸塩の導入速度は、−6kV と−9 kVとの間で、ほとんど変動しなかった。蟻酸塩については印加電圧の関数として観察された比は1:1.25:0.98 であった。そして実際に導入速度は−9kV で減少した。酢酸塩についてはこの効果はより顕著で、1:0.83:0.05 の比が観察された。印加電圧が最大値のとき、酢酸塩はほとんど導入されず、その量はEI時間（すなわち上記引用の低いr²）にほとんど依存しなかった。酢酸塩の電気化学的還元が上記の挙動を説明する適切な機構であるとは考えられない。そうではなく、この還元はキャピラリー始端部近傍で生じる低速移動イオンの枯渇が原因であると出願人は推定する。もしそうであれば、検体濃度の減少により状況の悪化がもたらされる（特により反応性の高いイオンにとっては）。図10A と10B は、出願人の微量分析標準混合液(図10A −(a))と図10A −(a)の溶液、および４倍希釈液(図10A −(b))の重畳エレクトロフェログラムを用いた結果を描いたものである。両溶液とも−3kV で30秒間EIを行った。蟻酸塩および酢酸塩は図10A −(b)のフェログラムにおいて識別さえできないことに注目されたい。一般にこのような挙動は少なくとも定性的には理解できるものである。キャピラリーと高電圧電極を試料バイアル瓶中に浸しEIを試みる場合、電場は主としてキャピラリー先端と電極との間に存在する。従って、試料体積のごく小部分に効果的に電場がかかる。 EIの進行につれて、導電率を増大させるために酸あるいは塩基の電解生成物がさらにこの同じ領域に電場を集中させる。一つのルーブでは、仮想的な連続する同心円状ゾーンが相互に電気的に実際上直列状態となる。しかし、従来のEIでは、キャピラリー始端部と電極との間の様々な経路は実際上並列であって直列ではない。この大きな電場で検体イオンが補充される大きな機構は拡散である。小さな拡散係数をもつイオンについてはほとんど移動が生じない。その結果、バルク溶液内に濃度勾配が発生せずこれがさらに拡散輸送を妨げ、運動が自然停止するという影響を与える。最初検体濃度を低くするかあるいは印加電場を高くすればバイアスが増加することは明らかである。次に、出願人のループのような対称のマイクロリザーバ電極からの電気移動注入(EI)、および移動度に基づくバイアスの役割について考察する。ループによる EIの特に重要な側面は、図10A −(a)と図10A −(b)に描かれたバイアスの型が理論的に予期されるものでもなければ、実験的に観察されるものでもないという点である。図10B −(c)は、図10A −(b)と同じ状況を描いたものであるが、今回は EIが、(同電圧、同時間で)1μL 体積のループから行われるという点が異なる。４つのすべての予期されたピークが観察されるだけでなく、炭酸塩に起因する一つのピークも観察される。微量分析を改善するために従来のEIではナトリウムペンタンスルフォネートのような終末電解液がしばしば添加されるが、図10B −(d)のデータについてこれを行った。ループから行うEIではこのような電解液を添加しても何も得られないことは図10B から明らかである。従来のEIで見られるこのようなバイアスは電場の形状に関連すると理論的には言われている。従って出願人は、高電圧電極としても機能する金属製のブロック（図3C参照）に入れた体積約10μL の半球形の窪みに試料を含む実験を行った。キャピラリー始端部はこの窪みの中心に置かれた。この結果はループで得られたものときわめて類似した、すなわち試料に与えられた電場の形状の重要性を強調するものとなった。図11A と図11B はループから行うEIのダイナミックレンジのさらに顕著な例を描いたものである。図11A では硝酸塩を300ppbで一定に保つ一方、酢酸塩を30pp bから30ppm の間で変動させた。図11B のデータについては酢酸塩を200ppbで一定に保ち硝酸塩を同じように変動させた。移動時間シフトについて補正したピーク面積は、出願人が本明細書で開示した手法が従来のEIで可能なものより実質的により大きなダイナミックレンジを有利に提供することを証明している。 3kV 〜18kVの範囲で印加電圧を3kV 毎に変動させ、9kV ・ｓ〜108kV ・ｓの範囲でのVt積についてループから行うEIによる試料導入の結果を検証した。ループ −EIの結果は、当明細書で以上記載したようにバイアル瓶−EIで得られた結果とは極めて異なる。理論的に予測できるように一定のVt積については、より高い電圧を印加したとき導入はより完全なものとなる。図12は、１μL ループに対して異なる電圧を印加した場合のEI時間の関数として塩化物/酢酸塩ピーク面積比の変化を描いたものである。このプロットについては、最大電圧(18kV)が最少時間(0.5秒）印加されたときの面積比を単位値として任意に割り当てた。この条件下では、バイアスが最大になる一方で、より高い Vt生成物での限界値0.535(酢酸塩/ 塩化物移動度比)にバイアスが接近することが予想され、実際にそれが観察される。注入とバイアス量の完全さを検証した。図13A と13B は、半径約1mm の、およそ１μL 体積の傾斜ループ（図3B参照）から得たデータを描いたものである。正確な体積を測定することは困難であったので、図13では、注入された等容量（例えば、その体積内に含まれる検体の）を縦座標として用いている。その結果は、図５に示したものと関連して記載したモデル計算と定性的に類似している。しかしながら、前述のモデルで10秒を要したものを成し遂げるのに約50秒という時間を要したという点で効率は低かった。これは現モデルが垂直方向の輸送限界値を考慮に入れていないという事実の結果であると出願人は考える。例えば320 μm 厚の薄膜は極微的には少しも薄いものではない。しかしながら広義の一般的なパターンはここで用いたモデルのパターンと同一である。図13B は、完全に除去されてはいないが、悉皆的電気移動でバイアスが大きく減少していることを描いたものである。理論的に予期できるように、より大きなループの利用は同電圧で同時間EIを行った場合、完全でない注入とより大きなバイアスを生じる結果になることを出願人は観察した。一方、垂直平面ループでは、入る液量が少ないので、同一のループ半径に対して同じEI条件ならば、これらのループからの注入はより完全になりバイアスは減少する。 EIを行った結果として水酸化物が生成し系中へ注入される。BGE は有限の緩衝容量を有し、OH^-ピークはこの容量を超過した後でのみピークとして現れる。図1 4に一例を示す。この図で、15秒間のEI時間に対する水酸化物ピークは見られないが、25秒間のEI時間でははるかに大きいピークが見られる。25秒〜60秒の範囲のEI時間に対する積分した水酸化物ピーク面積は、r²値0.9996でEI時間と直線性を示す相関関係がある。OH^-導入と時間との直線的相関関係が図４に見られた。水酸化物に起因する明確なピークがEIを開始して20秒後に最初に現れることも予測できる。以上を要約すると、試料全体を少量の限定容積から注入しそれを好適には対称に電場に曝せば、その結果CEにおけるEIが実質的に改善されることを出願人は証明した。事実、本明細書に記載したマイクロリザーバ電極を用いることにより、先行技術で現在実施されているものに比べてより便利でより有効なCEによる注入法を構成することが可能である。ミクロタイター金属製プレートに半球形のウェルを形成する発明に加えて、ワイヤループ上に形成した薄膜を用いる出願人の発明の結果を他の形状にも適用できることは理解できる。また、様々のマイクロリザーバ電極を用いたオートサンプラーの構成を利用することもできる。本発明は、CEおよび他の分離システムにおけるサンプリングと注入を改善できるのみならず、同時に従来の検出器で現在利用できる範囲以上に検出限界値を改善するものになることを出願人は予想する。もしH⁺やOH^-のような導入が重要な要因となることがあれば、薄膜構成を用いることによりH⁺やOH^-イオンの導入を阻止することが可能となるであろう。以下の請求の範囲によって定義される本発明の発明主題および精神から逸脱することなくこの開示実施例に対して改変や変形を行うことができる。主として、キャピラリー電気泳動分離システムを用いて行われる分析に関して説明してきたが、例えば、キャピラリー通電クロマトグラフィー分離システムにおいても本発明は実施可能である。

Claims

【特許請求の範囲】１．試料中の選択された極性をもつ検体イオンを、高電圧印加によって分離キャピラリーを通して移動させるキャピラリー分離システムにおいて、注入が、前記検体イオンの個々のイオンのイオン移動度に実質的に依存せず、かつ、試料導電率に実質的に依存しないように、悉皆的に前記検体イオンを電気移動によって前記キャピラリー中へ導入する方法であって、（a）前記試料の再現可能な体積を保持する、実質的に一定の有限の収容体積を画定する電気導電マイクロリザーバを提供し、（b）前記マイクロリザーバ中の前記試料の部分と接触する、前記分離キャピラリーの入口端を配置し、（c）前記高電圧の一方の導線を前記マイクロリザーバに接続し、一定時間前記高電圧を増力し、前記選択された極性の前記試料中のイオンを前記分離キャピラリーの前記始端部中へ実質的に悉皆的に導入させる段階を有する方法。２．前記システムが電気泳動分離システムである請求の範囲１の方法。３．前記システムがキャピラリー通電クロマトグラフィー分離システムである請求の範囲１の方法。４．段階(a)が、 (i) 所望のループ面積を画定するように、円形ループに形成された導電ワイヤにより製造されたマイクロリザーバと、 (ii) 所望の体積を有する対称の半球体空洞が画定されている基底部を含むマイクロリザーバからなるグループから選択されるマイクロリザーバを提供することを含む請求の範囲１の方法。５．段階(a)が、所望のループ面積を画定する円形ループであって、 (a) 前記分離キャピラリーの縦軸に対して平行な平面と、 (b) 約45°〜約90°の範囲の角度で前記分離キャピラリーの縦軸から位置がずれている平面とからなるグループから選択される平面に配向されたループ平面を画定する円形ループに形成された導電ワイヤにより製造されたマイクロリザーバを提供することを含む請求の範囲１の方法。６．前記マイクロリザーバが、対称に形成された収容体積を画定する請求の範囲１の方法。７．段階(b)が、前記マイクロリザーバの対称の中心部分に、前記試料部分と接触して前記分離キャピラリーの前記入口端を配置することを含む請求の範囲１の方法。８．段階(a)で、前記収容体積が、(a)約2 μL より小さい体積と、(b)約1 μL より小さい体積と、(c)約0.5 μL より小さい体積からなるグループから選択される体積である請求の範囲１の方法。９．試料中の選択された極性をもつ検体イオンを、高電圧の印加により分離キャピラリーを通して移動させ、前記検体イオンの個々のイオンのイオン移動度に実質的に依存せず、かつ、実質的に試料導電率に依存せずに、前記キャピラリー中に悉皆的に注入する、キャピラリー電気泳動システムにおいて、前記試料の再現可能な体積を収容するサイズを持つ電気的導電マイクロリザーバであって、実質的に一定の有限な収容体積を画定するマイクロリザーバと、前記マイクロリザーバに接続する第1導線と前記システムの下流領域に接続する第２導線とを持つ高電圧電位の電源とを有しており、前記分離キャピラリーが、前記マイクロリザーバ中の前記試料部と接触して配置可能な入口端を有し、前記高電圧の一定時間の印加によって、前記選択された極性の前記試料中のイオンが前記分離キャピラリーの前記先端中へ実質的に悉皆的に導入されることを特徴とする前記システム。 10 前記システムが電気泳動分離システムである請求の範囲９のシステム。 11．キャピラリー通電クロマトグラフィー分離システムである請求の範囲９のシステム。 12．所望のループ面積を画定するために、前記マイクロリザーバが円形ループに形成されている導電ワイヤを含む請求の範囲９のシステム。 13．前記ループが、 (a) 前記分離キャピラリーの縦軸に対して平行な平面と、 (b) 約45°〜約90°の範囲の角度で前記分離キャピラリーの縦軸から位置がずれている平面とからなるグループから選択される平面に配向されたループ平面を画定する請求の範囲12のシステム。 14．前記マイクロリザーバが、所望の体積を持つ対称の半球体の空洞を画定する基底部を含む請求の範囲9のシステム。 15．前記マイクロリザーバが対称に形作られた収容体積を画定する請求の範囲9 のシステム。 16．前記収容体積が、(a)約2 μL より小さい体積と、(b)約1 μL より小さい体積と、(c)約0.5 μL より小さい体積からなるグループから選択される体積である請求の範囲9 のシステム。