JPH10512594A

JPH10512594A - Pure 3R-3'R stereoisomers of zeaxanthin for treating macular degeneration in humans

Info

Publication number: JPH10512594A
Application number: JP9517583A
Authority: JP
Inventors: ガーネット，ケビン・エム; ギアハート，デニス・エル; ガラサントス，ルイス・エイチ
Original assignee: アプライド・フード・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド
Priority date: 1995-10-31
Filing date: 1996-10-30
Publication date: 1998-12-02
Also published as: MX9605248A; AR004245A1; AU710634B2; FI980947A0; CZ130998A3; HU223208B1; ZA969139B; CZ297575B6; KR19990067180A; HUP9802314A3; NO981698D0; PL326558A1; HUP9802314A2; CN1104235C; FI980947A; AU7050196A; BR9611488A; KR100570251B1; NO981698L; CN1201388A

Abstract

(57)【要約】ヒト、特に黄斑変性患者により薬剤またはビタミン類として用いられる、ゼアキサンチンの唯一の検出可能な異性体として３Ｒ−３Ｒ'立体異性体を製造および精製するための方法および処方を開示する。望ましい３Ｒ−３Ｒ'立体異性体のみを含有するゼアキサンチン製剤は、Ｆ.multivorum株（ＡＴＣＣ寄託番号５５２３８）から製造される。細菌醗酵により合成された後、ゼアキサンチンは、溶媒抽出などの簡単で安価な手段により５−２０％（重量）まで濃縮される。所望なら、他の方法により、さらに高濃度にまで精製することができる。 Abstract: Methods and formulations for making and purifying the 3R-3R 'stereoisomer as the only detectable isomer of zeaxanthin for use as drugs or vitamins by humans, especially macular degeneration patients, are disclosed. I do. A zeaxanthin formulation containing only the desired 3R-3R 'stereoisomer is produced from F. multivorum strain (ATCC Deposit No. 55238). After being synthesized by bacterial fermentation, zeaxanthin is concentrated to 5-20% (weight) by simple and inexpensive means such as solvent extraction. If desired, it can be further purified to higher concentrations by other methods.

Description

【発明の詳細な説明】ヒトの黄斑変性を治療するための純粋なゼアキサンチンの３Ｒ−３'Ｒ立体異性体発明の背景本発明は、生化学の分野に属し、そしてゼアキサンチン（ＺＸと略す）と呼ばれる黄色ピグメントのある種の異性体に関する。医薬又はビタミンとしてヒトに投与したとき、このピグメントは、網膜を損ない、老人の失明の主な原因となる黄斑変性と呼ばれる病気を治療し又は予防することができる。網膜は眼球の奥に存在する組織である。網膜は極端に複雑であって、１ダースの異なった層を有する。これについては、Gittinger 1988,and Vaughn and As bury 1992（完全引用は末尾参照）などの多くの医学教科書に記載されている。黄斑と呼ばれる特殊な円形の領域が網膜の中心に存在し、ヒトで直径が約１− １.５ｍｍである。黄斑は網膜の他の部分と異なる２つの特徴がある。第一に、黄斑は桿体が比較的少なく、その光受容体の大部分は錐体形をしている（斑点の中心そのものに存在する窩（fovea）には、桿体は全く存在しない）。第二に、黄斑は、ルテインおよびゼアキサンチンと呼ばれる２種のピグメントに因る顕著な黄色を有している。両者は“カロテノイド”と呼ばれる分子群に属している。これらのカロテノイドピグメントの化学は、黄斑変性の概要の次に後記する。黄斑変性 “黄斑変性”は、網膜の中心部における黄色斑領域での網膜細胞または光受容錐体に対する進行性障害を含む状態を意味する。これについては、Taylor 1993, Gittinger 1988，and Vaughan and Asbury 1992などの文献および教科書に記載されている。黄斑変性には数種のタイプがある。最も普通のタイプは、“年齢関連黄斑変性 ”と言われるもので、通常ＡＭＤ（いくつかの文献ではＡＲＭＤ）と略号される。ＡＭＤは視力障害を引き起こすことがあり、それは僅かな視力低下から盲目にまで至る。２種のＡＭＤがあり、しばしば“ウエット”型および“ドライ”型と称せられる。ウエット型は毛細管および他の血管が網膜で攻撃的な成長をなすことを含み、血管が網膜層の固有の組織を崩壊あるいは破壊するまでに至る。この型のＡＭＤは、新たに形成する血管を切除するレーザーの使用により治療できるが、レーザー処置は暫時、血管の成長を遅らすに過ぎないし、ほぼ全視力の終局的喪失を通常は阻止できない。ウエットＡＭＤはほとんど常に最後には全盲またはほぼ全盲に導く。ウエット型はただ、ＡＭＤ患者の約５−１０％である。いま一つの型は“ドライ”ＡＭＤと呼ばれる。これは全例の少なくとも９０％で起きるので、しばしば単にＡＭＤと言われる。この型のＡＭＤは通常、全盲にまで至らないが、患者の視力に重い障害をもたらし、よく知ったもの、例えば友人あるいは親戚の顔が分からなく、または識別できなくする。このように、このＡＭＤは、しばしば機能的盲目をもたらし、運転あるいは公の場所の歩行をできなくし、また通常の活動を不可能にする。症候の一つとして黄斑変性を有する種々の疾患もある。それには、スターガルツ（Stargardt）病、ベスト（Best）病、バッテン（Batten）病、スジョグレン −ラルソン（Sjogren-Larsson）症候群、錐体−桿体ジストロフィー、羊セロイド・リポフスチン症が挙げられる。これらについて記載した文献としてDorey et al 1993 がある。さらに、リソソーム貯蔵問題（タイ−サッシュ（Tay-Sach）病など）または進行性神経細胞変性（アルツハイマー病など）を有する他の疾患も黄斑変性に相関する。これらの疾患の多くは、家族継承があることから明らかなように、遺伝素因を有している。これらの疾患を起こす遺伝子のいくつかは単離されており、遺伝子スクリーニング試験で欠陥遺伝子の保持者が分かる。遺伝子試験または家族歴から、かかる遺伝子を有し、あるいは有すると思われる者は、黄斑変性になる高い危険性がある。視力を徐々に奪うことで、ＡＭＤは患者に非常な苦痛をもたらしている。これは、生産性の喪失および関係者の重い負担において年に数十億ドルを費やしている。関係者には、その家族、保険業者、社会福祉機関はもちろんのこと、盲目あるいは重い視力障害に苦しむ者に医療介護および他の援助を提供すべき、あるいは手助けをする関係者が含まれる。ＡＭＤに因る問題からして、科学者および医師は、数十年にわたって、黄斑変性による盲目および他の視力消失を治療あるいは予防する方法を探し求めて来た。しかし、半世紀以上に及ぶすべての努力にもかかわらず、今日でも有効な治療法が見つかっていない。診断：ドルセンおよびリポフスチン黄斑変性は網膜の特殊な撮影により通常診断される。ひとつの診断方法では、医師が患者に蛍光剤を注射し、体内を循環する時間をおいて、アンギオグラムと言う網膜の拡大撮影を行う。次いで、映像を解析して、２種の細胞破片のいずれか、あるいは両者の存在および濃度を測定する。細胞破片の一つはドルセンとよばれ、数十年にわたって知られ、研究されてきた。それには二つの異なる型がある。少量のハード・ドルセン（直径６３μｍ以下の小粒子）が４０歳以上のすべての者の眼に常に存在している。異常なレベルで存在しない限り、ハード・ドルセンは網膜の障害を示さない。一方、多量の大きいソフト・ドルセン（ウエット・ドルセンとも言う）の沈着は、実質的な網膜障害が生じているか、始まっていることを示している。なぜなら、ソフト・ドルセンの大きい斑点群は、網膜層の破壊あるいは組織崩壊を起こし、そして網膜細胞が血液から適当な栄養を摂取するのを阻害し得るからである。網膜に顕著な量のソフト・ドルセンを含有する患者は黄斑変性に罹患していると、通常考えられる。黄斑変性の患者に通常存在する他の型の網膜破片は、リポフスチンと称せられる。リポフスチンとＡＭＤとの相関関係はやっと最近に明らかになった（すなわち、Weiter et al 1988,and Dorey et al 1993）。カロテノイド化学「カロテノイド」の用語は大きなクラスの分子群に関し；６００以上の天然のカロテノイドが同定されている。これらの分子は、以下に示す幾つかの特長を持っている：１．カロテノイドは、５個炭素の分子であるイソプレン分子を連結することにより産生される。この建造ブロックが５個の炭素原子を含んでいるので、大概のカロテノイドは５個の炭素原子の多量体を含んでいる。２．カロテノイドは多数の不飽和結合を有する。これは、それらにスペクトルの青色及びほぼ紫外領域で高エネルギー光波を吸収させる。３．カロテノイドはスペクトルの青色及びほとんど紫外領域の波長を吸収するが、スペクトルの他の領域の長い波長は吸収しないので、カロテノイドは通常、黄色、オレンジ色、褐色又は赤色を有する。「カロテノイド」の名称はニンジンに由来する；初めて知られたカロテノイドはニンジンにオレンジ色を与えるピグメントとして同定された。溶液中のカロテノイドによって生じる色彩は、濃度および他の化合物の存在などの様々な因子に依存する。４．カロテノイドは“共役”二重結合を有する。この用語は、二重結合が一重結合と互い違いになっており、鎖中の各炭素原子は１個の他の炭素原子と二重結合するが、いずれの炭素も２個の他の炭素原子と二重結合しないことを示す。この配置は、β−カロテン、ＺＸおよびルテインの構造を表す図１を見れば理解できる。異なるカロテノイドは異なった程度の共役を有し、一般的により高い共役の分子は高エネルギー光線照射による“光毒性”障害に対して大きい保護を提供する。例えば、図１に示される３種のカロテノイドにおいて、各分子の完全直鎖部分は交互に二重結合及び単結合と共役する。β−カロテノイドおよびＺＸでは、共役は両端環の第一結合にまで伸びる。対照的に、ルテインの一方の末端の環における二重結合は完全な共役のための適当な配置を持たないので、ルテインはより低い共役程度である。ＺＸとルテインの唯一の差異は、末端環の一方（だが両方でない）における二重結合の位置である。カロテノイドは青色及びほぼ紫外光線の潜在的に有害なエネルギーを吸収するように設計され、選択されている（進化を通じて）ので、自然界で保護ピグメントとして使用される。大概の植物の機能の目標の一つは、青色、紫外、ほぼ紫外光線の照射によって引き起こされる細胞及びDNAの障害を最小にしながら、出来るだけ多くの日光を吸収する必要があるので、カロテノイドは植物に広範に存在している。紫外線照射の植物に対する障害は大きな問題であって、カロテノイドはそれを最小にするのを助ける。カロテノイド分子は光毒性に対して細胞及びDNAを保護するのに理想的であるので、動物も又カロテノイドを光保護ピグメントとして利用すべく経路（進化を通じて）を獲得している。動物はその体内でカロテノイドを合成出来ないので、植物源からカロテノイド（もしくはカロテノイド先駆体）を摂取しなければならない。β−カロテンは一例である；ほ乳類の細胞はそれを合成できないので、それを植物源すなわち食物から取得しなければならない。ほ乳類の体内に入ると、 β−カロテンは、それを二等分することによって得られるビタミンA（レチノール）などの他の分子に変換される。カロテノイドは二つの主なクラス、カロテンとキサントフィルに分けられる。カロテンは酸素分子を含んでいない；炭素及び水素のみから形成される真の炭化水素である。一方、キサントフイル(ＺＸやルテインなど)は酸素原子を含む。図１は、ＺＸの左右の末端環における炭素原子の番号づけを示す。慣習により、左末端環の炭素原子は１から６までの番号がつくが、右末端環の炭素原子は３ '炭素（「３プライム」と発音される）など「プライム」番号によって言及される。ＺＸは左右の末端に関して完全にシンメトリーであるので、「左」及び「右」の用語は単に慣習であり、議論を単純化するために用いられる。しかしながら、注意すべきは、ルテインはシンメトリーでない；「左」環の二重結合の位置は「右」環の二重結合の配置と同じではない。ＺＸは、その両端の＃３の炭化水素に２個のヒドロキシ（−０Ｈ）基を加えることによって形成されるので、化学名はジヒドロキシ−カロテンである；をカロテン−ジオールと呼ぶ化学者もいる。この分子は、トウモロコシにその黄色を与えるピグメントとして同定されたので、名称“ゼアキサンチン”が与えられた；トウモロコシの科学名はゼア・メイズ（Ｚea mays）である。上で示したように、６００個以上の天然カロテノイドが同定されている。数十種は生化学及び商業で重要である。ＺＸ及びルテインは、ほ乳類及び大概の他の動物の網膜に存在するので、本発明において特に重要である。ルテインは、買物客や消費者の嗜好にあわせて、チキンの皮膚や卵黄に黄色を一層与えるために、チキンへの餌に広く入れられるので（主にマリーゴールドからの植物抽出物の形態で）、商業的に重要である。ＺＸは、同じ効果を有し、ルテインよりも強力であるが、ＺＸ源は家禽飼料の用途には高価過ぎる。米国特許５,３０８,７５９及び５,４２７,７８３号（ギアハルト(Ｇierhardt)よりの譲受人アップライド・フード・バイオテクノロジー；本件の出願人）は、ＺＸが動物飼料の用途のためには高価過ぎるという問題に取り組むことを意図していた。これらの特許は、着色の目的のために家禽及び魚にＺＸを与えることができるように、商業的な量でゼオキサンチンを生産するために細菌を用いることに関する。いくつかのカロテノイドは、植物以外に、ある種のバクテリアによっても合成される。これらのバクテリアは、直接日光に晒される場所において生育し、そのカロテノイドは植物におけると同様の光線保護の役割を果たす。バクテリアのカルチノイドについて記載した文献及び特許としては、マックダモットら(ＭcＤer mott et al)１９７２年及び米国特許５,４２９,９３９(Ｍisawa et al)があり、さらに両者に引用された他の文献がある。米国特許５,４２９,９３９(Ｍisawa et al)は、ＺＸを含む種々のカロテノイドの生合成に関与する酵素をコードする多数の遺伝子の DNA 配列を記載する。ＺＸの創造における各主要遺伝子（ｃｒｔＥ，ｃｒｔＢ，ｃｒｔＩ，ｃｒｔＹおよびｃｒｔＺを含む）の役割についても記載されている。これらの遺伝子含有プラスミドを含む細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（エルウイニア・ウレドボラ(Ｅrwinia uredovora)ＡＴＣＣ１９３２１やエルウイニア・ヘルビコラ(Ｅrwinia herbicola)ＡＴＣＣ３９３６８など）及び微工研（例えば、イー・コーリ(Ｅ.coli)ＦＥＲＭＢＰ２３７７）に寄託されている。ゼアキサンチン立体化学及び異性体カロテノイド化学の重要な一面は「立体化学」及び「立体異性体」である。この事項は、有機化学に関する大学教科書のすべてに説明されている。有機分子が４個の相違する原子または分子基と結合した炭素原子を有していると、この炭素原子は“キラル”炭素原子と呼ばれる。キラル炭素原子が有機分子中に存在するときはいつでも、そのキラル炭素原子に結合する４個の異なった基は、２種の空間配置のいずれにも配置され得る。この相違する配置を立体異性体と言う。これら立体異性体の一つが「右手の方法」で偏光を回転させ、一方、今一つの立体異性体は「左手の方法」で偏光を回転させる。右手の回転を引き起こす異性体は、Ｒ立体異性体とよばれる（Ｄ立体異性体とも呼ばれる）。左手の回転を引き起こす異性体は、Ｓ立体異性体と呼ばれる（Ｌ立体異性体とも呼ばれる）。ＺＸには＃３および＃３'炭素原子の二つがキラルであるので、ＺＸは４個の可能な立体異性体を有する。３Ｒ−３Ｒ'異性体において、＃３及び＃３'キラル炭素原子の両者はＲ立体配置をとる。３Ｓ−３'Ｓ異性体において、＃３及び＃３'キラル炭素原子の両者はＬ立体配置をとる。便宜的に、これらの両立体異性体は、ここではＲ−Ｒ異性体及びＳ−Ｓ異性体と称する。第３及び第４の異性体は二つの「混合」又は「メソ」（一方はＲ、他方はＳ）の異性体である：３Ｒ−３'Ｓ異性体及び３Ｓ−３'Ｒ異性体である。ＺＸは中点について完全にシンメトリであるので、これらの両異性体は全ての点で同一であり；もし紙面上で３Ｒ−３'Ｓ異性体を描き、単に紙面を回転させれば、３Ｓ− ３'Ｒ異性体となる。実際に、単一の「メソ」異性体は、Ｓ−ＲおよびＲ−Ｓ異性体の両方により形成される。ＺＸを合成するために標準的な化学手法を用いると、４種の可能な異性体はそれぞれ全体の約２５％存在する。しかし、Ｓ−ＲとＲ−Ｓ異性体は実際には同じであるので、その“メソ”異性体は全体の５０％であり、一方、Ｒ−ＲおよびＳ −Ｓ異性体はそれぞれ約２５％存在する。３種の立体異性体すべての混合物は“ ラセミ”混合物と呼ばれる。しかし、網膜組織におけるカロテノイドの細胞及び酵素の特異性は極めて厳密であり、相違する異性体および立体異性体で互換性はない。ルテインとＺＸとは、通常の化学用語においては互いに異性体であると見なされうるものであるが（それらは同数の炭素、水素、及び酸素原子を有しているので）、完全に相違する独特の分子として網膜細胞により扱われる。生物学的要因からして、ここで関連する唯一の異性体は立体異性体である。ここで用いられるＺＸの「異性体」は、特定のＺＸの立体異性体を意味し、ルテインを含まない。ルテインとＺＸは、まったく相違するカロテノイドと考える。カロテノイドにおける立体異性体上の差異は、小さくて、微妙で、ほとんどとるに足りないと見られるかもしれないが、網膜組織に達するときには、事実上極めて重要である。明らかに、ヒトの網膜細胞によって適当に取り込まれ、用いられる唯一のＺＸ立体異性体は、Ｒ−Ｒ異性体（すなわち、３Ｒ−３'Ｒ立体異性体）である。網膜組織中に微量のメソ異性体が見つけられたと言う報告がある。しかしながら、この微量は、ルテイン先駆体からメソ−ゼアキサンチンの生成を導く、何らかの条件下に同時に生じうる、ある分子転換に恐らく由来するものであろう（ボン、ランドラム、ら(Bone，Landrum，et al)、１９９３年及び１９９４年）。研究室において、キラル・カラム・クロマトグラフィー（参照、例えば、ボーン、ランドラムら(Bone，Landrum，et al)、１９９３年）又はサーキュラー二色性分析（参照、例えば、ブリトン(Ｂritton)、１９９４年）などの方法を用いて、ＺＸの異性体をそれぞれ識別できる。黄斑におけるＺＸ及びルテイン１９７０年までに光毒性に対する植物の保護におけるカロテノイドの役割は、よく知られていた。また、カロテノイドが動物組織中に存在すること、及び動物はカロテノイドを合成することができないので、動物組織中の全てのカロテノイドは本来植物源に由来することも、知られていた。その情報に基づき、種々の文献で、動物及び植物のカロテノイドの類似性が指摘され、カロテノイドは動物における光毒性に対して保護すると、結論されている。動物におけるカロテノイドの光保護の役割が認められた後に、研究者は網膜におけるカロテノイドの化学及び役割を研究し始めた。研究の一つの方向は、カロテノイドを含まない穀物や種子（マイロ種子など）から調製されたカロテノイドを全く含まない餌を実験動物に与える試験を行った。その結果、カロテノイドが与えられない実験動物の網膜では黄色の黄斑領域が成長しないで、これらの網膜に異常に高い量のソフト・ドルセンが含まれ、網膜障害を示すことが明らかになった。（マリナウら(Malinow et al)１９８０年、キルシュフェルド(Kirschfeld )１９８２年、ハムら(Ham et al)１９８４年及びスノダリら(Snodderly et al) １９８４年）。これらの知見から、研究者は、カロテノイドが健全な網膜に必須と思われることを示唆した。これらの研究者は実際に、人参や葉の多い緑色野菜が目によいものを含んでいるとの古くからの知恵を支持する分子を探し始めた。しかしながら、科学者達は、網膜中の黄色ピグメントが最終の形で直接摂取しなければならないかどうか、又はそれらがβ−カロテンもしくはリコペンなどの他の前駆体を用いて動物細胞中に合成できるかどうかを、なお知らなかった。ルテインは黄斑中の黄色ピグメントの一つとして同定された（ウオルド(Wald) １９４９年）。ＺＸは相当のちまで他の黄斑ピグメントとしては同定されなかった(Bone et al、1985)。１９８０年代中頃および後期までに黄斑について知られていることをまとめた文献として、Handelman and Dratz 1986，Werner et al 1 987，Pease et al 1987，Haegerstrom-Portnoy 1988,and Handelman et al 1988 がある。とりわけ、これらの文献は、ＺＸ（それは十分に共役し、それ故に、光エネルギーによって引き起こされる損傷に対して、ルテインよりも何らかの優れた保護を提供する）が黄斑の中心での小さな領域の窩(fovea)における優勢なピグメントであることを、確立した。窩から同心的に離れ黄斑の外周に向かうに従って、ＺＸの量は徐々に減少し、ルテインの量が増加し、黄斑外周末梢ではルテインが圧倒的な黄色ピグメントである。網膜の老化及び損傷の様々な局面に向けて、さらに網膜における保護剤としてカロテノイドに特に焦点を合わせている最近の文献としては、スペルダトら(Sperduto et al)１９９０年、ゲルスタ(Gerst er)１９９１年、シャルフ(Schalch)１９９２年及びセドンら(Seddon et al)１９９４年が挙げられる。要約すると、ルテイン及びＺＸが黄斑におけるピグメントであることは１０年以上前から知られており、これら二つのピグメントが光毒性による障害に対して黄斑を保護することは科学者により推測されていた。しかしながら、これらの発見及び示唆が全て１０年以上前になされていたと言う事実にもかかわらず、未だ誰も、黄斑変性の段階的な進行を有意義に予防又は遅滞させる（単に逆戻りさせる）ことに有効である、どの様な型の医薬も、どの様な栄養剤も、ダイエット補助剤も、その他の型の治療形態も開発していない。 β−カロテン、ビタミンＡ、及びビタミンＥは全て、網膜組織の保護を助けるにつき、何らかの程度の有効な効果を持つことが知られているので、前の文は幾分条件をつける必要がある（参照、例えば、米国特許5,310,764、バラノウイツら(Baranowitz et al)１９９４年及び以下に引用する眼病ケース制御研究グループによる二つの論文）。これらの特許及び論文は、β−カロテン、ビタミンＡ、及びビタミンＥが、黄斑変性に関連した障害を予防もしくは減少せしめるのに検出できる作用を持ち得ることを主張または示唆してきた。その様な主張は、カロテノイド、ビタミンＡ及びビタミンＥの一般的な酸化作用からして正しいであろう。しかしながら、網膜においてβ−カロテン、ビタミンＡ、及びビタミンＥによりもたらされた利益は極めて制限的であって、本当に有効な治療の程度に達していないことも、残念ながら真実である。全ての実際的な目的において、黄斑変性は、予防できない、阻止できない、回復できないものである。また広範なスペクトルの抗酸化剤（β−カロテン、ビタミンＡ、及びビタミンＥなど）は単なる緩和策である。本当に有効であるものは何も入手出来ないので、これらのビタミン類は、黄斑変性により引き起こされた容赦のない障害を遅くする試みのために用いられてきた(極めて限定的な、不満足な成功である) 。先行技術の問題として、同じく注意すべきは、多くの健康食品店が目及び視力に有益であるとラベルしたカロテノイド製剤を販売していることである。β−カロテン及びビタミンＡが一般的な抗酸化剤として目に有益であると知られている（上記の通り）ので、カロテノイド合剤についての該ラベルは理にかなっているのかもしれない。しかしながら、市販されているカロテノイド合剤は極端に少量の“痕跡”以上にはＺＸを含んでいない。健康食品店で販売されているカロテノイド合剤中の大部分のカロテノイドは非ＺＸカロテノイド（主にβ−カロテン及びビタミンＡ）である。幾つかの主要な政府機関及び研究財団の現状および研究目標にも注意を払うべき価値がある。米国において、ＮＩＨ（ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス）（ＮＥＩ（ナショナル・アイ・インスティテュート）及びナショナル・アドバイザリー・カウンスルを経由して行動）は、最新の二つのレポートを発行した。これら二つのレポートは「視力研究：国家計画１９９４−１９９８」，ＮＩＨＰublication Ｎo.93-3186 （1994; 特に５５−６５頁参照）及び「年齢に関連した眼病研究」ＮＩＨＰublication No．93-2910(1993)である。両出版及びそこに記載された研究プロジェクトは、ＡＭＤを治療するために最も期待できる化合物として、（ＺＸよりもむしろ）β−カロテンに焦点を当てている。出願人の知る限りでは、そのテーマについてＮＥＩの職員と議論がなされた後に、ＮＥＩもナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルスと親密な関係にある他の機関も、ＡＭＤの潜在的な治療法としてＺＸに関するいかなる研究にも資金を出す気はないし、また最近に資金を出したことはなかった。一方、ＮＩＨ及び税金が使われている他の機関は、ＡＭＤを治療し、予防するため、最も有望な候補薬剤としてβ−カロテンについての研究を行うために数百万ドルを当てている。注目に値する他の研究グループは、「眼疾患症例コントロール試験グループ」である。このグループは、「抗酸化剤事情及び新生血管の年齢に関連した黄斑変性」、Ａrch．Ｏphthalmol.11：104-109(1993)及び「新生血管の年齢に関連した黄斑変性の危険因子」、Ａrch．Ｏphthalmol.10：1701-1708(1992)と言う表題の二つの論文を最近発表した。公式のＮＩＨレポートにおけるように、これらの論文は、いづれもＡＭＤを治療するための薬剤としてＺＸの使用を教示または示唆していない。この財団もまた、ＡＭＤを治療あるいは予防するための潜在的な薬剤としてのＺＸの研究に基金を出していないし、あるいは出すのを拒絶してきた。同じく注目すべきことに、カロテノイドが特にガンを治療または予防する点(P eto et al、１９８１)およびコレステロール生成を阻害し、さらに動脈内のプラーク沈着を減少する点(Jialal et al 1991)に大きい興味がある。カロテノイドの種々の生物学的活性を扱った膨大な科学文献があり、ルテイン及びＺＸを含む、多数の重要なカロテノイドを合成する方法に大きな興味があった。しかしながら、過去数十年の全てのカロテノイド研究及び合成努力にもかかわらず、黄斑変性を治療もしくは予防する有効な方法を誰も未だ報告していない。黄斑変性の社会や犠牲者に与える巨大な費用および苦痛を考慮すると、それは、対処しなければならない大きな課題である。従って、本発明の主題は、（１）黄斑変性に罹患していると診断された患者を治療するための安全かつ有効な薬剤、及び（２）中年以降に黄斑変性になる危険性を減少せしめることを願うすべての者により摂取され得る、ビタミン剤に匹敵するような栄養補助剤を提供することであり、非常に重要な躍進をもたらす。ルテイン及びゼアキサンチンの合成：先行技術先行技術にＺＸを製造する様々な方法が記載されている。これらの項目は二つの種類に分けられる：微生物が製造方法において重要な役割を演ずる発酵法；及び純粋に化学反応が用いられる非発酵合成法。先行技術のほとんどは、ＺＸが、肉の色を薄黒くして、肉をより魅力的なものにするために、家禽や魚のおける添加物などとして、既知の目的のため用いられることを示唆している。しかしながら、これらの努力はいずれも、商業的な量のＺＸを現実に製造したり、販売することにまで至らなかった。１９９５年１０月現在で、精製した形で、又はＺＸを製剤重量の５％以上を含む、半濃縮の形で、ＺＸを購入する唯一の方法は、ミリグラム量のＺＸを、アトメルジック・ケミカルズ・コーポレイション（ニュウヨーク・ファルミングダール）、スペクトラム・ケミカル・マニュファクチャリング・カンパニー（カルフォルニア、ガーデナ）などの専門化学会社からの購入することを必要とする。所望でないＳ−Ｓ異性体及びＳ−Ｒ異性体を含む合成ラセミ混合物として、これらの専門メーカーから精製ＺＸの１９９５年の購入価格はmg当たり約＄９０〜約＄１２５であり、それはラセミ混合物のＺＸｇ当たり、約＄１００,０００に相当する。明らかに、これらのものは、その価格および望ましくなく、かつ危険なＳ − Ｓおよびメソ異性体からして、薬剤または栄養補助剤として使用する現実的価値はなかった。本発明以前には、精製または半精製ゼアキサンチンはいかなる形態においても一般に利用できなかった。微生物発酵によるＺＸの製造を記載する先行技術の項目は、次の通りである：（１）カーリントン及びグドウィン(Courington and Goodwin)１９５５年は、フラボバクター属の微生物によるＺＸの製造を記載した最も早い既知文献である。（２）米国特許３,８９１,５０４（ショチャー及びウイス(Ｓchocher & Ｗiss)、１９７５年、ホフマン・ラロッシュへ譲渡）。この特許もフラボバクター細胞によるＺＸの製造を記載する。ＺＸを含む細胞はニワトリに与えられ、適当な着色がもたらされた。（３）米国特許３,８４１,９６７(ダセクら(Dasek et al)１９７４年、ネッスルへ譲渡)および米国特許３,９５１,７４３（シェファードら(Shepherd et al)１９７６年、同じくネッスルへ譲渡）。細菌によって製造されるＺＸの量を増やすために使用できる方法及び栄養培地を記載。（４）最近二つのさらなる特許（米国特許5,308,759及び5,427,783、ともにギアハートにより発明され、本出願と同一譲受人であるアップライド・フード・バイオテクノロジー・インク．へ譲渡）は、ミズーリ河から単離した細菌の菌種（フラボバクテリウム・マルチボラム(Flavobacterium multivorum)）を記載する。これらのバクテリアは、相当量の他のカロテノイドを製造せずに、ＺＸを製造することが発見された。このことは、家禽や魚の肉をより薄黒くするために、重要である。なぜなら、カロテノイド類は互いに、動物が食した後に血中への取り込みにおいて競合するからである。Gierhart により同定された F．multivo rum 株からは他のカロテノイドが存在しないので、動物組織のためのピグメントとしてＺＸをより利用でき、従って、その効力および効果が増大する。 ’７５９特許は、ＡＦＢのエフ・マルチフォルム(F．multivorum)菌を用いて、ＺＸを製造する方法をクレームする。’７８３特許は、分割出願であるが、餌混合物をクレームする。これらの両特許は家禽や魚の餌にＺＸを用いることに限定されており、ヒトを治療するためにＺＸを用いることについては、一言もふれていない。ふたつのＧierhart特許はいずれも、ＺＸの特殊な立体異性体に言及していない。その理由は、（１）出願時の１９８９年には、AFBの F．multivorum 細胞からつくられるＺＸ異性体の状態が分かっていなかった、（２）家禽または魚の餌としてＺＸを使用することに特許の関心があったので、相違する異性体に気をつけねばならない明白な理由はなかったことである。ＡＦＢのＦ．multivorum 野生種はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号５５２３８を受けた。これらの細菌は、スフィンゴリピドと呼ばれる脂質の一種を生成するので、ＡＴＣＣは、これらの細菌をSpingobacterium multivorumとして再分類し、この名前でカタログに掲載している。このカタログでの名称は、微生物組織学の公式の指針であるBergy's Manual of Systematic Bacteriology（Int ernational Journal of Systematic Bacteriology により追加され最新のものにされる）引用として現れていない。標準的化学手段（微生物発酵を使用しないで）によりＺＸを合成するための様々な努力が、過去２０年にわたって報告されてきた（例えば、米国特許4,153,61 5，Saucy，1979; 4,952,716，Lukac et al，1990; 5,227,507，Lukac et al，19 93）。しかしながら、非発酵法には重大な欠点がある。それは、典型的に多数の反応工程を要し、それぞれの工程は１００％に達しない収率を示すので、多数工程プロセスの終わりのＺＸの最終収率は比較的低い。さらに、化学合成は、通常、酸化されたゼアキサンチン及び直鎖部分及び／又は末端環における１もしくは２個以上の二重結合を失ったゼアキサンチン分子などの様々な転換生成物および分解生成物と同様に、望ましくないＳ−Ｓ及びＳ−Ｒ立体異性体を生成する。要約すると、本発明以前には、薬剤または栄養補助剤としてヒトに用いるのに適した精製Ｒ−Ｒゼアキサンチン源は知られていなかった。従って、本発明の一つの目的は、ＡＦＢのエフ・マルチヴォラム(F.multivoru m)株(ＡＴＣＣアクセス番号５５２３８)及びその突然変異株が、検出できる量の望ましくないＳ−ＳおよびＳ−Ｒ異性体なしに、唯一の検出できる異性体としてＺＸのＲ−Ｒ立体異性体を製造することを、開示することにある。本発明の他の目的は、黄斑変性、とりわけ年齢と関連した黄斑変性を患っていると診断された患者を治療する薬剤の製造に、ＡＦＢのエフ・マルチヴォラム(F .multivoraum)(ＡＴＣＣアクセス番号５５２３８)からの細胞を利用する方法を開示することである。本発明の他の目的は、中高年における黄斑変性のおそれを減少させるため、ビタミン類に類似した形で、あるいはマーガリンなど食品への添加剤として、栄養補助剤の製造に、ＡＦＢのエフ・マルチヴォラム(F.multivorum)株(ＡＴＣＣアクセス番号５５２３８)からの細胞を利用する方法を開示することである。本発明の第３の目的は、唯一もしくは極めて優勢な異性体としてＲ−Ｒ立体異性体を含有するゼアキサンチン製剤を開示することであり、その処方は、網膜疾患または変性を治療する薬剤として、あるいは老人における視力喪失の危険性を減少せしめる栄養補助剤として、ヒトの経口摂取に適している。これらの及び他の目的は、下記の発明の要約及び発明の説明において一層明らかになるであろう。発明の要約本発明は、薬剤もしくは栄養補助剤としてヒトが摂取するのために、唯一もしくは極めて優勢な立体異性体として、３Ｒ−３'Ｒ立体異性体(あるいはＲ−Ｒ異性体またはＲ−Ｒゼアキサンチンともいう)を含むＺＸ製剤を製造する方法を開示する。ヒトの網膜の中心の黄斑細胞中に天然に存在する黄色ピグメントであるＺＸは、青色及び近接した紫外の光線照射を吸収し、それにより光毒性障害から黄斑細胞を保護する。望ましいＲ−Ｒ異性体のみを含むＺＸ製剤は、フラヴォバクテリウム・マルチヴォラム(Flavobacterium multivorum)細胞の菌種(ＡＴＣＣアクセス番号５５２３８)により生産される。これらの微生物は、検出できる量の望ましくないＳ−Ｓ及びＳ−Ｒ立体異性体を生産しないし、またそれらは、経口摂取後、栄養の吸収においてＺＸと競合するおそれのあるβ−カロテンやルテインなどの他のカロテノイドを、いかなる有意義な量でも生産しない。これらの細菌による生産後、ＺＸは、溶媒抽出などの方法により精製され、さらに黄斑変性の患者のための医療薬剤として、あるいは凡そ５０歳あるいは６０歳を越える人々に多い年齢に関連した黄斑変性に罹患する危険性を減らしたいと思う者は誰でも栄養補助剤として、経口で服用できる。簡便に摂取できる組成物として、( １)植物性オイルなどの担体に混合したＲ−Ｒゼアキサンチンを含む防水性カプセル；（２）添加剤としてＲ−ＲＺＸを含む、様々な食品（例えば、マーガリン、乳製品、シロップ、クッキーねり粉、激しい調理を要しない肉製品）；及び（３）スープ、サラダ、飲料、その他の食品に添加される粒状組成物などが開示される。図面の簡単な説明図１は、β−カロテン、ルテイン及びゼアキサンチンの分子構造を描き、３種のカロテノイド全ての構造及び末端環の番号付けシステムを示す。これらの構造は先行技術によって知られている。図２は、立体異性体として純粋な３Ｒ−３'Ｒゼアキサンチンを合成する微生物により生産されるＺＸを発酵し、精製する主要な工程を描くフローチャートを含む。好ましい態様についての説明本発明は、黄斑変性すなわち視力障害をもたらし、失明に至るかも知れない疾患症状を予防あるいは軽減するために、ヒトに投与される薬剤または栄養補助剤を製造するための方法を開示する。ヒトに摂取されるゼアキサンチン製剤は、“ 極めて圧倒的な”異性体としてＺＸの３Ｒ−３'Ｒ立体異性体を含有する。ここに定義するように、“極めて圧倒的な異性体”とは、製剤中に全ゼアキサンチン製剤に対し少なくとも９０％以上のＲ−Ｒ異性体を含有し、望ましくないＳ−ＳまたはＳ−Ｒ−異性体は１０％以下であることを意味する。望ましくは、ヒトに用いられる製剤は唯一の検出されるＺＸの異性体としてはＲ−Ｒ異性体のみを含み、望ましくないＳ−ＳまたはＳ−Ｒ異性体は含有しないことである。かかる製剤をここに開示する。キラル・カラム・クロマトグラフィー解析（Bone et al.,1993に記載）を用いて、Applied Food Biotechnology(AFB)により分離されたF.multivorum菌種（ATC C accession number 55238）が、実施例のように醗酵せしめたときに、唯一の検出できるＺＸ異性体としてＲ−Ｒ異性体のみを産生することが最近に発見された。実施例４に記載するように、Landrum教授の分析によると、この下F.multivorm 株からの細胞の醗酵によって産生されるＺＸ製剤中には、Ｓ−Ｓ異性体もＲ−Ｓメソ異性体も検出されなかった。ゼアキサンチンのＲ−Ｒ、Ｒ−ＳまたはＳ−Ｓ−異性体間における相違は、ＺＸ製剤が薬剤あるいは栄養補助剤としてヒトに投与される際には、非常に重要である。なぜなら、ヒト網膜に天然に存在する唯一のＺＸ異性体はＲ−Ｒ異性体であるからである。Ｒ−５およびＳ−Ｓ異性体の有意な量の摂取は、医学的観点から非常に望ましくなくかつ危険であると考えられる。その理由は、（１）Ｒ−ＳおよびＳ−Ｓ異性体はヒト網膜には天然には生起しない。ただ例外的にルテインが網膜細胞中で変性したときに副産物として極めて少量で形成されるのみである。（２）Ｒ−ＳおよびＳ−Ｓ異性体は網膜組織中で望ましいＲ−Ｒ異性体と競合的に置き換わることがあり、重大な長期の細胞障害および医学的合併症をもたらしかねない。 F.multivorum菌種の醗酵により製造されるＺＸ製剤が立体異性的に純粋であることは、ＺＸを化学的に合成した後に立体異性体を分離することが非常に困難かつ費用のかかるので、非常に価値がある。立体異性体の分離は小規模な実験室で可能であるが、商業的な量については費用の点から避けるべきことである。ＡＭＤ患者への処方薬としての使用本発明の第１点は、開示のＲ−Ｒゼアキサンチン製剤を、黄斑変性であると診断された患者あるいは症候または状態として黄斑変性をおこし得る疾患、例えばスターガルツ病、ベスト病、バッテン病、ジョグレン−ラーソンシンドローム、錐体−桿体ヂストロフィー、羊セロイド・リポフスチン沈着症、あるいはタイ− ザッファ病などのリソソーム貯蔵病に罹患している患者を治療するために医師が処方できる薬剤として調剤し、投与することである。かかる治療において、ＺＸ製剤は治療的レベルに達するのに充分な量のＺＸのＲ−Ｒ異性体を下記するようにヒトへの投与に適した担体中および形態（カプセルなど）で、含有すべきである。望ましい実施態様において、医学的処置のためのＺＸは、カプセルまたは錠剤などの単位含量形態中に包装される。各用量は、望ましくは少なくとも約１ｍｇのＲ−Ｒゼアキサンチン製剤を含むべきであり、よりよい医療効果のためには約３−１０ｍｇの範囲のゼアキサンチン製剤を含有する。本発明の第２点は、開示のＲ−Ｒゼアキサンチン製剤を予防薬として、上記した疾患のいずれかについて家族歴あるいは遺伝子診断によって、黄斑変性になる可能性が高いと診断された患者に、調剤し投与することである。ＡＭＤの危険性は高いが、まだ実際にはＡＭＤになっていないような患者に対する投与においては、その製剤単位含量は、例えば約０.１−２ｍｇとより少ない含量である。これらの含量は、ここでの開示を利用して商業的に合理的な費用で提供される。油性液状担体中に２５ｍｇ（またはそれ以下）を含有するカプセルは、溶媒抽出工程と結合した微生物醗酵を用いて、商業的方法で製造される。高量を含有する粉末製剤は、実施例４記載の方法などの拡大精製を用いて、製造することができる。ビタミンまたは栄養補助剤としての使用本発明の第３の観点において、黄斑変性に現在は罹患していないが、後半に黄斑変性になる危険性を低減しようとする者に用いるために、ＺＸはビタミンまたは栄養補助剤または食品添加剤の形態で製造され、包装される。この目的のために摂取されるときは、適当な用量は、健康食品の店で通常的に販売されている粉末中の量よりも実質的に多くなければならないが、ＡＭＤと診断された者に薬剤としてＺＸが用いられるときよりも少量である。かかる用量は、毎日摂取される用量として、約０.０５−５ｍｇの範囲であろう。例えば、０.０５−１.０の用量がＲ−Ｒゼアキサンチンが多種ビタミン錠またはカプセルの多くの有効成分の１つであるときには、０.０５−１.０の用量が適当であり、一方、より高用量を望む者への店頭での販売には１−５ｍｇの用量が提供され得る。治療剤あるいは栄養補助剤のいずれで用いられても、ヒト用のＺＸ製剤はＺＸの唯一または“極めて圧倒的な立体異性体”としてＲ−Ｒ異性体を含有していなければならない。用語“極めて圧倒的な立体異性体”は混合物中に全ゼアキサンチン製剤に対し少なくとも９０％以上のＲ−Ｒ異性体を含有し、望ましくないＳ −ＳまたはＳＲ−異性体は１０％以下の製剤について用いられる。望ましくは、すべてヒト用の製剤においてＲ−Ｒ異性体が唯一の検出可能な異性体であるべきである。このことは、本発明により、Ｆ.multivorum細菌ラインがＺＸの唯一の検出可能な立体異性体としてＲ−Ｒ異性体のみを産出するので商業的な量および合理的な費用において可能である。精製後に醗酵混合物中にＳ− ＳまたはＳ−Ｒ異性体が存在していても、その量は少なくて、実施例４の方法により検出されない。加うるに、多くの菌種と異なり、ここに記載のＦ.multivorum細胞はカロテノイドの混合物を産生しない。該細胞は唯一の検出可能なカロテノイドとしてＲ− Ｒゼアキサンチンを産生する。このことは、食物の取り込みおよび組織沈着においてＺＸが他のカロテノイドと競合するので、経口摂取後のＺＸ取り込みおよび網膜沈着を増大さすために、特に、黄斑変性と診断された病気の治療にＺＸを薬剤として用いる際に、有用である。細菌醗酵による商業規模での製造当業者がよく承知しているように、実験室で用いられた醗酵法を大きい製造操作にすることは、費用がかかり、難しい。従って、出願人は、Ｆ.multivorum細胞の商業的使用のための栄養素および方法を改善してきた。この改善された栄養素および方法は、米国特許第５,３０８,７５９および５,４２７,７８３に記載された培地および条件に比して操作が簡単であり、ＺＸのｇ当たりで費用が非常に低い。望ましい栄養素および条件は実施例１に記載される。醗酵後、精製中のＺＸの変性を防止するために１以上の安定剤を細胞に加えることができる。細胞がまだ醗酵容器中にあり、殺菌または他の処置を始める前に、安定剤を添加することができる。種々の可能と考えられる安定剤が出願人によって試験された。今日までに得られた最良の結果は実施例２に掲げる安定剤の併用である。安定剤を加えた後、ＺＸに影響を与えずに細菌を殺すために５５℃まで２５分間で加熱して殺菌する。次いで、培養物を室温に冷し、十字流精密濾過などの機械的手段により細胞液体を除去する。これによって細胞および固体の濃度が容量で最初の約１０％から約６０−８０％の濾過濃度に増加する。Ｆ.multivorum細胞をそのままおよび生存状態で、生存または殺−しかし−損傷微生物細胞を含む他の食品（チーズ、ヨーグルト、ビール等）と同様に、ヒトの直接の摂取に供することも可能である。Ｆ.multivorum細胞には病原性は知られていない。この細胞は冷水から分離されるものであり、冷水中で生存するのに適しているので、人体内の温度ではうまく生存また繁殖できない。さらに、該細胞はいかなる既知毒性成分も有していない。グラム陰性であり、グラム−陽性菌を特徴ずける細胞壁構造を有していない。魚や鳥に細胞ペーストの形態で直接与えたとき、細菌細胞は運搬体として非常に適しているようである。細胞が動物により消化されると、ＺＸが放出され、血流に吸収され、そして種々の組織（網膜を含む）の適当な部位に沈着する。従って、Ｒ−Ｒゼアキサンチンを含む無傷のＦ.multivorum細胞は、次の３形態のいずれでも直接的なヒトの摂取に適し得る。（１）無傷の生存形態、（２）殺菌または他の適当な処置後の無傷の死滅形態、（３）細菌細胞を殺し、その壁を破壊して、細胞をむきだしにしてＺＸにより接近しやすくした製剤。これは、超音波（高周波音波を用いて）、高圧、または粉砕の手段でなし得る。別法として、細胞壁を破棄するような溶媒抽出方法を用いたときは、この手段は省略できる。所望により、細胞製造手順に細胞水洗手順が含まれ、醗酵が完了した後に、安定剤、保存剤、芳香剤などの望ましい成分を含有する溶液で細胞を流洗することにより、残りの栄養素および無駄な代謝物を除去する。精製所望により、細胞ペスト（無傷または破壊細胞のいずれか）は、細胞の濃度を上げそして乾燥塊（マス）のＺＸ濃度を増すために、乾燥できる。これは、噴霧乾燥（熱を用いて）または凍結乾燥（真空下での凍結−乾燥）などの機械的手段によりなされる。乾燥を用いたときは、得られた固体残留物は通常、乾燥バイオマスと呼ぶ。これは、約１−１０重量％のＺＸを含み、他の細胞固形物、醗酵培地からの固形残査および上述の安定剤をも含む。破壊または乾燥の前または後（またはそれに代わって）に、主に細胞壁に蓄積しているＺＸの濃度を上げるために抽出工程を実施することができる。抽出のための適当な溶媒は一般的に極性有機溶媒である。現在までに確認されている最善の溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）であり、これは細胞壁をよく攻撃し、分離膜破壊を不必要とする。ＴＨＦを実験室で用いるときは、撹拌は不必要であるが、商業ベースでの製造においては、溶媒混合工程中の撹拌がおそらく必要であろう。他の溶媒も試験したが、また試験しているが、今日までのところＴＨＦほどのものは見つかっていない。試験した非環状有機溶媒（アセトンおよびジエチルエーテルなど）はＺＸ溶解度が低く、他方、メタノール、エタノールおよびヘキサンなどの他の溶媒はより低いＺＸ溶解度である。溶媒は、溶媒がゼアキサンチンをできるだけ多く溶解するような条件で、細胞ペストまたは乾燥バイオマスと混合される。次いで、遠心分離または濾過などの機械的手段を用いて、溶解液体分画を固体から分離する。固体は捨てるか、または他の製法工程の材料とする（所望により、溶媒抽出サイクルを繰り返す）。液体分画は、通常、蒸発によって、溶媒を除去するよう処置する。Ｒ−Ｒゼアキサンチンを含む粘稠な油分と、溶媒により細胞ペストから取り出された他の溶解成分が残留する。ＴＨＦを１−３重量％のＺＸを含む細胞について単一抽出方法で用い、次いでＴＨＦを蒸発で除去すると、得た液体は約５−約２０重量％のＺＸを含有していた。予備的によい結果が得られた他のタイプの溶媒抽出に、超−臨界液体(すなわち、大気圧では通常は気体であるが、加圧下では溶媒として作用する液体になる )の使用がある。二酸化炭素が超臨界抽出で最も広く用いられている溶媒であり、商業的規模のＣＯ₂抽出システムは利用可能である。このようなシステムにおいて、液化二酸化炭素は、高圧反応器中で細胞ペストまたは乾燥バイオマスと混合する。次いで液体を、段階的に圧を減じた一連の室に通す。ＺＸは、かなりの高圧において溶液から沈殿し、初期の減圧段階で寄せ集めることができ、一方、不純物の大半は、二酸化炭素に溶けたままであり、そして圧をさらに減じた他の反応室に移す。超臨界溶媒抽出の効率は、共沸剤（エタノール、プロピレングリコール、エチルアセテートなど）を用いることによりさらに増大せしめ得る。これらの共沸剤のいくつかは、予備的試験で用いられ、超臨界二酸化炭素中のゼアキサンチンの溶解性を増大することが示された。二酸化炭素は最も広く使用されている超臨界剤であるが、種々の他の化合物（種々の窒素またはクロロフルオロ炭素化合物を含む）も商業的規模のシステムにおいて同じ目的で用いられる。圧によって気体および液体相の両者となるような化合物は、ここに記した微生物からゼアキサンチンを精製するのに適しているか試みることができる。所望により、溶媒または超臨界抽出により生じたＺＸを含む油状の流体は、親油性担体物質（植物油など）と混合し、次いでゼアキサンチンをさらに精製することなく、直接ヒト用のカプセルに封入できる。これは、Ｒ−Ｒゼアキサンチンの半精製消化型をつくるのに適した経済的な方法を提供するものであり、黄斑変性の患者に対する薬剤として、あるいは高齢期に黄斑変性になる恐れを減らそうとする者に対する栄養補助剤として用いることができる。また、半精製型のＲ−Ｒゼアキサンチンは、ＺＸ濃度を増大し、不純物を除去するために、さらに精製することができる。これは、（１）２選択溶媒の併用による２−溶媒システム、（２）ＺＸの結晶化をもたらす基質（織編フィルター床など）上での吸収、または（３）向流クロマトグラフィー。ＺＸを約９８％の純度に精製するのに用いたクロマトグラフィー法は、実施例４に記載する。他のカノチノイドについての他の精製方法は、特許第５,３８２,７１４号（Kh achik 1995）および米国特許４,８５１,３３９（Hills 1989）に開示されている。投与方法経口摂取が網膜保護のためヒトにＺＸを投与するのに最も望ましい方法であり、下記するように毎日または週ごとのカプセルあるいはゼアキサンチン−補強食品または食品添加物として用いられる。このような摂取は、（毎日または週ごとピルのような）一定間隔で定期的になされることは要しないで、不定期断続的な摂取でもって黄斑組織に少量のゼアキサンチンを適当にかつ徐々に蓄積するように、服用間隔をあける合理的な期間（１日またはそれ以上、望ましくは１週間以内）が適している。ビタミン補助として一回服用でも、有益であろうが、適当な少量服用を１年以上なすほどには有益でない。ヒトおよび試験動物におけるカロテノイド摂取の薬力学的研究によれば、血液濃度に示される“積み”因子により、毎日摂取が週または他の間隔での摂取よりも好ましいことが指摘されている。経口摂取後のカロテノイドの取り込みは比較的少ないので、重い黄斑変性の患者に対しては他の投与形態、例えば筋注、静注または徐放植込みなどを利用することが望まれる。注射用の基剤の処方は、水、緩衝液およびプロピレングリコール、デキストラン、シクロデキストラン化合物のような水酸基を複数有する有機化合物を含む。酸化からＺＸを保護し、またＺＸの油状性を保持し得る限り、経口摂取につき種々の包装形態が用いられる。経口接種のための適切な組成物の例は次のものを含む。（ａ）消化できる防水性カプセルおよびその中に含有される液体からなり、カプセルおよび液は飲み込みやすい大きさおよび形状であり、薬理学的に許容されるものであり、液体はＲ−Ｒゼアキサンチンを植物油などの適当な担体または希釈剤と共に含む。所望により、液体化ＺＸは、実施例９また１０に記載のようにミクロカプセル化すなわちミセル中に封入されて、胃中での変性からＺＸを保護する。該カプセルは、比較的硬く造ることができるが、ビタミンＥ含有カプセルに通常用いられている硬質材料または軟質材料からなる。カプセルが胃酸に対し耐容性があり、腸内で酵素により消化されるときは、ＺＸは胃中での変性から保護され、ＺＸの生物学的利用性は増大する。しかし、少なくとも、咀嚼された植物マスの成分として胃に入ったＺＸの部分は作用を受けずに胃を通過できる。従って、胃酸からＺＸを保護することは必須ではなく、カプセル材料の選択は、科学的な要請よりも経済的観点からなされるであろう。（ｂ）ヒトに経口摂取される錠剤はＲ−Ｒゼアキサンチンと加圧結合剤を含む。この結合剤は、適当な圧力で圧縮した後に錠剤が形を保ちうるためであり、錠剤は、薬理学的に許容され、支障なく飲み込むのに適した大きさである。所望により錠剤はコーティングされて、胃酸からＺＸが保護される。（ｃ）ヒト用の食材を含む組成物で、栄養学的に許容され、味も優れ、ゼアキサンチンの基質として適当であり、添加物としてＲ−Ｒゼアキサンチンを含有する。ＺＸは、黄−オレンジ色のピグメントであって、植物油、ショートニング、チキン脂などと一般的に同一の疎水性である。ＺＸはまた、β−カロテンなどの他のカロテノイド食品色素と類似である。従って、ＺＸは、マーガリン、乳製品、シロップ、焼食品材、クッキーダウ、ブラウニー、苛酷な調理をなさない肉類およびスープ成分などの種々の食品材料に添加し得る。他の適当な食品材料には顆粒化処方のもので、スープ、サラダ、ベーキングなどの添加物に用いる塩、香、味などをつけた混合物などである。所望によって、顆粒化処方において保護コーティングをして、ＺＸの胃酸により変性を低下することができる。β−カロテンおよび他のカロテノイドの食品色素および栄養添加剤としての処方および利用に関連する多数の文献がある。その文献には、例えばＫlaui et al 1970；Ｋlaui and Ｂauernfeind 1981；Ｃolombo and Ｇerber 1991，が含まれ、一方、関連する米国には米国特許第４,５２２,７４３(Ｈorn et al 1985)、５,１８０,７４７（Ｍatsuda et al 1993）、５,３５０,７７３（Ｓchweikert et al 1994）および５,３５６,６３６（Ｓchneider et al 1994）が含まれる。その非常に近い化学的類似性および物理的性質により、ヒトの摂取を意図したいかなるタイプの食品におけるβ−カロテンまたはルテインを添加する技術、付加、他の方法は、Ｒ −Ｒゼアキサンチンに直接的に適用可能でもある。ｄ）ヒト経口摂取用の食材を含む組成物で、その食材はヒトに無毒で、ゼアキサンチンのＲ−Ｒ異性体を含有する細菌細胞を含む。該食材は、チーズ、ヨーグルト、ミルクおよびビールから選択し得る。細菌細胞は、生きていてもよいし、所望によって殺菌またはフラグメンテーションにより殺されていてもよい。他の形態の包装も容易であり、種々の使用に好ましいであろう。動物におけるＲ−Ｒゼアキサンチンの試験ＡＴＣＣ５５２３８株からのフラボバクテリウム・マルチボラム細胞を用いて合成したＺＸを、通常は日本ウズラと呼ばれているＣoturnix coturnix japon icaを選択して、網膜保護について、試験した。この種は、下記のようないくつかの理由によってヒトの黄斑変性について有用な動物モデルを提供する。（１）日本ウズラの全網膜はいくつかの重要な点においてヒト網膜の斑領域に似ている。例えば、ウズラの網膜はＺＸとルテインの両方を含み、ヒトの斑のように光線レセプターの錐体に杆体よりも豊富である。（２）日本ウズラの網膜はヒトの網膜といくつかの同じ病理を表す。例えば、日本ウズラの網膜は、ヒトにおけるＡＭＤの発生と大きく相関するソフト結晶腔およびリポフシンを蓄積する。（３）ウズラの網膜は、ヒトの網膜よりも非常に小さいが、ＺＸおよびルテインの存在により黄色である。このことは、ヒト網膜の中心の小さい斑領域のモデルとして役立つことを可能にし、解析および観測をより容易にする。（４）日本ウズラの網膜は、駆血的であり、ヒト網膜の窩領域に類似した構造を有する。（５）日本ウズラは、おおまかに雌で１−１.５年、雄で３−４年の寿命を有する。このことは、より長く生きる他の種では非常に難しいであろう加齢過程についての“長さ”の研究を可能にする。これらの理由については、より詳細にＦite et al 1991およびＦite et al 19 93に述べられている。これらの試験は実施例５−８に記載されている。結果は、優れており、Ｆ.mul tivorumによりつくられたＲ−Ｒゼアキサンチンが、（１）経口摂取後、適切に黄斑に蓄積し、（２）光毒性損傷に対して網膜細胞を保護するのに非常に効果的であること、を明白に示している。さらに、実施例８で論じるように、予備的な結果は、光毒性損傷から網膜を保護するのにＲ−ＲのＺＸがβ−カロテンよりもはるかに強力で効果的であることを示している。β−カロテンを試験動物に高用量与えたとき、β−カロテンによる小さい保護利点も統計的有意のレベルに達しなかった。これと対照的に、同量のＲ−ＲのＺＸを動物に与えたとき、測定した網膜細胞損傷の指標と死亡の指標を完全に阻止し、予防した。Ｒ−Ｒゼアキサンチンの微生物源ここで開示したフラボバクテリウム・マルチボラム細胞は、ＡＴＣＣに寄託されている（ＡＴＣＣ５５２３８；上記のようにＡＴＣＣカタログではＳphingoba cterium multivorumと書かれているが、Ｂergy's Ｍanualでは変わっていない）。この細胞ラインは、異性体的に純Ｒ−ＲのＺＸを微生物学的につくるため、いくつかの選択を当業者に提供する。最初に、これらの細胞の直接的かつ非修飾の子孫を、他の望ましくない立体異性の測定可能な量には有していない、Ｒ−Ｒゼアキサンチンをつくるために、用いることができる。これらの細胞により生じる全カロテノイドは９０％以上のＺＸ、求めるカロテノイドを含んでいる。第２に、ＡＴＣＣ５５２３８株の子孫をＺＸのＲ−Ｒ異性体の生産レベルが増加するように修飾した後に使用することができる。かかる突然変異および他の変種は、無作為または半−無作為によるいくつかの方法のいずれかでつくられ、増加したＺＸ産生系を有するコロニーを同定するためのスクリーニングテストを行う。無作為または半−無作為の発生を用いる技術は、（１）野生タイプＡＴＣＣ５５２３８子孫を紫外線またはＸ線の照射などの無作為的作用突然変更源またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの種々の既知化学的突然変異源で処理すること、（２）フラボバクテリウム・マルチボラム細胞を、微生物間において接合およびＤＮＡ交換を促進する他のタイプの微生物と混合することにより性的組合せをおこさせること、（３）フラボバクテリウム・マルチボラム細胞を、比較的大量のＤＮＡの再配列をおこし得る微生物トランスポゾンまたはウイルスで処理すること、を含む。これらおよび他の当業者に知られた技術は、子孫細胞の何千あるいは何百万の夫々に突然変異あるいは他の変化した遺伝子を有する制御不能で無作為な変化を効果的に導入する。従って、これらの技術は、望ましいゼアキサンチンの産生の増大した系を有する子孫の少量分画を同定し、分離するために、クローニングおよびスクリーニング技術と共に接合において使用されなければならない。スクリーニング試験は、ＺＸを産生する生合成経路に含まれる１以上の酵素を阻害する化学物質（ジフェニルアミン、ニコチンまたはロバスタチンなど）を用いることにより、容易に実施することができる。layman'sの用語において、これらの阻害剤は、異常に多量のＺＸを産生する突然変更細胞系によってのみ克服されうるハードルまたは障害を形成する。都合のよいことに、多量生産突然変更株を同定するのに用いられる分析試験は簡単、迅速そして容易である。ＺＸが黄色ピグメントであるので、望ましい系を有する突然変更コロニーを同定するのに、培養プレートの簡単な視覚観察が用い得る。望ましいのは、（１）よい細胞生長速度（２）黄色ピグメントを異常に多量に産生する能力を有するものである。所望により、自動装置（４８−ウエルまたは９６−ウエルのプレート読み器、サイトメーターに接続した細胞選別器）も突然変異段階後のスクリーニング試験に用いられ得る。これらの突然変異およびスクリーニング技術は、この技術分野で通常かつ周知のものである。無作為または半作為を突然変異子孫細胞に導入すべく用いた特殊な方法または試薬にもかかわらず、ＡＴＣＣ５５２３８株から直接由来するすべて細胞は、たとえ修飾され、突然変異をうけ、また他の細胞系と性的組合せられていても、上記したいかなる方法において、野生タイプＡＴＣＣ５５２３８細胞の子孫とみられる。３番目の別の試みとして、非子孫微生物細胞が、所望のゼアキサンチンのＲ− Ｒ異性体の合成を行い、ＡＴＣＣ５５２３８細胞系単離されたか、またはそうでなければ由来のものである遺伝子を含むものを製造できる。このような遺伝子は既知の技術を用いて、分離および同定し得る。ハイブリダイゼーション・プローブとして例えば、米国特許第５,４２９,９３９号（Ｍisawa et al，1995、上記）に列記のカロテノイド−産生“crt”遺伝子配列から得たＤＮＡ配列は、ＡＴＣＣ５５２３８細胞系のゲノムと相同のＤＮＡ配列を有するカロテノイド−産生遺伝子を研究するためにハイブリダイゼーション・プローブとして用いられる。これらの細胞から単離されたカロテノイド−産生遺伝子は、プラスミド、コスミド、ファージまたは所望の型の宿主細胞、例えばエシェリキア・コリ細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞への遺伝子的形質転換に使用できる他の好適なベクターに挿入できる。この型の制御可能遺伝子工学は、ＡＴＣＣ５５２３８細胞から得られる遺伝子を用いて、形質転換細胞がＲ−Ｒゼアキサンチンを産生するのを可能にする。加えて、ＡＴＣＣ５５２３８細胞由来のゼアキサンチン−産生遺伝子のタンパク質−コード部分（すなわち、メッセンジャーＲＮＡに転写され、続いてＺＸ合成に関与する酵素への翻訳をする遺伝子の部分）は、非常に強力および／または誘導可能遺伝子プロモーターの制御下に置くことができる。異なる遺伝子から得たこのような遺伝子プロモーターを伴う“キメラ”遺伝子は、種々の目的、例えば（１）ＺＸ−産生遺伝子の細胞生育相の間の抑制および次いで醗酵中の細胞によるＺＸ産生の大きい増加および（２）商業的使用に好適な宿主細胞の新しい型、例えば非常に確立された高度に最適化された発酵、操作および生成技術により有利である、広く使用される細胞型であるエシェリキア・コリ細胞または酵母細胞に遺伝子を挿入するために、使用できる。ＡＴＣＣ５５２３８細胞系から単離されたＺＸ−産生遺伝子はまた、当業者に既知の他の遺伝子工学技術により促進できる。一例として、細菌細胞はしばしばmＲＮＡコード配列中の“非好適”コドンを使用し、mＲＮＡ分子から翻訳されるタンパク質の量を制御する。この天然制御機構の回避のために、ＡＴＣＣ５５２３８細胞系から単離したＺＸ−産生遺伝子のmＲＮＡコード配列の非好適コドンを、選択した型の宿主細胞におけるＺＸ−産生酵素の発現を増加させるであろう“好適”コドンに置換できる。他の例として、システイン残基は酵素の活性または安定性を、同じまたは他のタンパク質分子中の他のシステイン残基と望ましくないジスルフィド結合を形成することにより、抑制できる。したがって、酵素の活性または安定性は、一個またはそれ以上のシステイン残基を、活性の少ないアミノ酸残基に置換することにより増加できることがある(例えば、米国特許第４,７３７,４６２号、Ｍark)。加えて、タンパク質の発現は、しばしばグリシンのような一般的アミノ酸のコドンを、あまり一般的でなく、タンパク質のmＲＮＡからの発現を遅延または減少させる傾向にあるメチオニンおよびトリフトファンに置換することにより増加できる。この性質のアミノ酸置換をもたらす合成遺伝子の製造後、修飾タンパク質を、より多い量または安定形で発現し、所望の酵素活性を残すかどうか測定するために試験できる。これらは、修飾が所望の型の細菌、酵母または他の宿主細胞によるＺＸの産生を促進できるか測定するために、ＡＴＣＣ５５２３８細胞系から単離されたＺＸ−産生遺伝子の評価をできる遺伝子工学技術の例である。 “フラボバクテリウム・マルチホルの菌株ＡＴＣＣ寄託番号５５２３８由来の細胞から得たＤＮＡ配列を含有する、少なくとも一つのゼアキサンチン合成遺伝子を含むように、遺伝子学的に構築される細胞”と言う特許請求の範囲中の文言は、ＡＴＣＣ５５２３８細胞系またはその子孫により測定されたＤＮＡまたはm ＲＮＡ配列を使用して化学的合成されたＤＮＡ配列含有遺伝子を含む細胞を含む。自動ＤＮＡ合成機械は既知であり、既知の選択遺伝子配列を、元の宿主細胞の複製の必要なしに２倍にするために使用できる。“ゼアキサンチン合成遺伝子” は、ゼアキサンチン生物構成経路に関与する酵素または他のタンパク質を発現し、好適な宿主細胞中に挿入した場合、ゼアキサンチン合成の増加に使用できる遺伝子を含み、遺伝子がコードするＺＸ生合成経路の特定の酵素を考慮していない。実施例実施例１：商業規模発酵フラボバクテリウム・マルチボラムの最初の小規模研究室試験のために、出願人に好適な培地は、米国特許第５,３０８,７５９号（Ｇierhart 1994）および第５,４２７,７８３号（Ｇierhart 1995）の実施例３の栄養培地Ｅであると同定された。この栄養培地は高価で処理が難しい幾つかの成分を含んでいた。高い値段および不便さを減少させるため、良い商業規模の栄養培地を製造するための実質的な研究が、これらの出願の最初の出願日以後に行われた。商業規模の発酵に現在のところ好ましい栄養培地は、トウモロコシ粉および他の幾つかの成分を除外している。これらの好ましい培地は、１から１０％w／vの濃度でトウモロコシを浸けた酒０.５から４％w／vと共に高マルトースコーンシロップまたはサトウダイコン糖蜜のいずれか；硫酸アンモニウム七水和物０.５％w／v；塩化ナトリウム０.５％w／v；硫酸マグネシウム七水和物０．１％w／v；酢酸ナトリウム０.１％w／v;硫酸第１鉄０.００１％w／v;酵母抽出液０.２％w／v；チアミン−ＨＣｌ０.０１％w／v；加水分解カゼイン（ＮＺＡmine ＨＤ、Ｓheffield Ｐroduc ts，Ｄivision of Ｑuest Ｉnternational，Ｎorwich，ＮＹ販売のような）１から６％w／vの間；および植物油１％v／vを含む。これらの成分を互いに混合した後、充分なＮaＯＨを添加し、pＨを６.５に上昇させる；対照的に、米国特許第５,３０８,７５９号および第５,４２７,７８３号に記載のように栄養培地をpＨ７.５に調節した場合、多すぎる固体がトウモロコシを浸けた酒から沈殿する。培養培地を１２１℃、３０分オートクレーブで滅菌し、次いで２７℃に冷却し、Ｓ−ＳまたはＳ−Ｒ立体異性体の産生なしにＲ−Ｒゼアキサンチンを製造するフラボバクテリウム・マルチボラムの株を含む“液体前培養”を、５から１０％ v／v接種する。液体前培養の製造に使用する細胞を平板計数寒天（plate count agar）の斜面管に維持する。これらの斜面培養に、出願人がＡＴＣＣに寄託した（ＡＴＣＣ受託番号５５２３８）株の子孫のフラボバクテリウム・マルチボラムのクローンコロニーを接種する。４８時間、２８℃でのインキュベーションの後、貯蔵斜面を、液体培地の接種物として使用するまで４℃に冷却する。生存細胞はまた慣用の冷凍庫、ドライアイスまたは液体窒素を使用して長い貯蔵のために凍結できる。液体前培養を寒天斜面から取った細胞を使用して製造し、３００mＬ隔壁フラスコ内の上記のように製造した液体培地３０mＬに接種する。成育条件は、２８ ℃、pＨ７.２から７.６、２５０rpmの撹拌による酸素補給および２４時間の培養である。最初の２４時間のインキュベーションの後、１個またはそれ以上の３０ mＬ前培養フラスコに含まれる細胞を、好適な大きさの発酵容器中の１０倍量の栄養培地への接種に使用する。次いで、細胞を４８から７２時間、２８℃でインキュベートする。pＨを６.８０から７.２０の間にＮaＯＨおよび／またはリン酸を使用して維持する。溶解酸素濃度を、容器を４００から１０００rpmで撹拌しながら、容器を通した濾過空気を空気１容量／液体１容量／分の速度でバブリングすることにより、飽和の３０から４０％に保つ。定期的サンプリングおよび高速液体クロマトグラフィーを使用した試験は、細胞をこれらの条件で発酵させた場合、ＺＸの最大量が通常約７２時間以内に産生されることを示した。実施例２：安定化剤の添加実施例１に記載の発酵方法により産生されたＺＸは、続く精製および製剤を容易にするためおよび純度を確実にするために安定化する必要がある。製造または精製工程の間に、安定化化合物をフラボバクテリウム・マルチボラム細胞（またはＺＸ含有細胞抽出物）に添加できる；一般に、細胞が発酵容器中にある間に、１種またはそれ以上の最初の安定化剤を細胞に添加すべきである。種々の安定化剤候補を出願人は試験した。現在まで、最も良い結果が、安定化剤の混合物を使用した場合に得られ、それは少量の好適な溶媒（２０リットルの発酵容器について約２ミリリットルのエタノールのような）中で、細胞に添加する前に混合する。好ましい安定化剤混合物は、第３級ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱと略称；２−(１,１−ジメチル)−１,４−ベンゼンジオールとも呼ばれる）を、細胞と混合した後、最終濃度約２５０μｇ／Ｌ(マイクログラム／リットル) から約５０mg／Ｌの範囲になるような量；混合後濃度が約２５０μg／Ｌから約２５０mg／Ｌの範囲のエトキシキン；約２５０μg／Ｌから約２５０mg／Ｌの濃度範囲のα−トコフェロール；および約５００μg／Ｌから約５００mg／Ｌの濃度範囲のＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含む。好適な濃度は広範囲で変化でき、続く精製工程および包装および摂取の意図される形に依存する。これらの安定化剤の好ましい濃度は、一回通過ＴＨＦ抽出、続く植物油との混合およびビタミン型丸薬への防水カプセル包含に使用するために、約２５から５０mg ／ＬのＴＢＨＱ；２５０から５００μg／Ｌのエトキシキン、２５０から５００ μg／Ｌのα−トコフェロール；および５００から１０００μg／ＬのＥＤＴＡである。安定化剤添加後、細胞培養を５５℃、２５から５０分加熱することにより、低温殺菌する。これは、細菌を、それらが産生したＺＸに障害を与えることなく殺す。次いで、培養物を室温に冷却し、ＺＸ含有細胞および培養ブロスに存在する他の固体を液体相から、細胞／固体濃度を最初の値から約１０から１５％増加させる交差流動微小濾過系で分離し、濾過した濃度を約６０から８０容量％にする。この工程は、栄養培地の残余固体をまた幾つか含む細胞ペーストをもたらす。実施例５−７に記載のように、網膜試験における日本ウズラ(Ｊapanese quail )食べさせるＺＸ製剤のために、細胞を−７０℃で凍結し、次いで完全真空で２５℃で凍結乾燥により乾燥させ、約２から１０重量％ＺＸを含む乾燥バイオマスを製造する。過去の試験において、各バッチのＺＸ量を個々に測定し、異なる濃度のバッチを組み合わせ、互いに混合し、ウズラ試験のための一貫した濃度を確保した。ヒト摂取のためのＺＸを製造するために、実施例３記載のように、溶媒抽出物を使用し、粘性油状液体を産生する。実施例３：油状液体への半精製実施例２記載のように細胞ペーストを製造した後、種々の方法で処理できる。上記のように、望ましい場合、超音波(高頻度音波)、高圧または挽くような手段で、細胞の温度を約３０℃以下に保ち、酸化を防ぎながら、細胞膜を破壊し、細胞を開け、ＺＸをより近付き易くする。しかしながら、この工程は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）が機械的補助なしに細胞膜を破壊するのに非常に有効であるため、溶媒抽出好適にＴＨＦを使用する場合、必要ではない。撹拌は、ＴＨＦを研究室規模操作に使用する場合は必要ではない；しかしながら、溶媒混合工程中の撹拌は、商業的製造操作においては恐らく有利であろう。今日まで行われた試験において、ＴＨＦ抽出物は、約８から２０容量の精製濾過ＴＨＦと６０−８０％固体を含む細胞ペースト１容量を、２５℃以下の温度で２から２４時間混合することを含む。ＴＨＦは積極的に細胞を攻撃し、綿状沈殿固体の懸濁液の液体を産生する。２０,０００重力までの数分の遠心後、ほとんどのＴＨＦはデカントにより回収できる。残ったＴＨＦは真空下で蒸発させ、粘性油状物を残す。１から３％ＺＸ含有細胞ペーストをＴＨＦ抽出物で一回通過操作により処理した場合、得られる油状物は通常約５から２０重量％のＺＸを含んでいた。実施例４：１００％純粋Ｒ−Ｒ異性体の高度に精製したゼアキサンチンの乾燥粉末形での製造乾燥粉末形の高度に精製したＺＸ製剤は、実施例３に記載のＴＨＦ抽出油状液体を以下のような液体クロマトグラフィーで処理することにより製造した。油状ＺＸ−含有液体をヘキサンに溶解し、次いで中性アルミナ粉末含有クロマトグラフィーカラムを通過させる。２カラム容量のヘキサンをカラムの洗浄に使用し、 β−カロテンおよびリコペンのようなようなカロテノイド不純物および液体および他の汚染物を除去した、ヘキサン：アセトン８０：２０の混合物を次いでカラムを通し、ＺＸを遊離させた。出てきた溶解ＺＸを真空で乾燥させた。クロマトグラフィー分析は、少なくとも９８％純粋ＺＸを示唆した；痕跡量の不純物のみが検出可能であった。相対的に非保護状態（通常、正常冷蔵庫で、サンプリングのために適度な頻度で除去して、抗酸化剤含有なしにおよび空気中酸素との接触を妨げるために気を付けることなく）でおおよそ６カ月貯蔵した後、このＺＸ製剤のサンプルをＦlo rida，ＭaiamiのＦlorida Ｉnternational ＵniversityのＪohn Ｌandrum教授（Ｂone，Ｌandrum et al紙の共著者）に送った。ジカルバメート誘導体のキラルカラムクロマトグラフィーを使用した彼の分析は、６カ月たった非保護製剤が９２％ＺＸを含有することを示唆した。不純物は主に、ＺＸ前に前溶出するケト− カロテノイド類であることが明らかになった；ケト−カロテノイド類は、カロテノイドのどこかに結合した余分の酸素原子を有し、カロテノイドを酸化に対して保護せずに貯蔵した場合の通常の副産物である。Ｌandrum博士のキラル分析は、製剤中のＺＸの１００％が所望のＲ−Ｒ異性体であることを示唆した。望ましくないＺＸのＳ−ＳまたはＳ−Ｒ立体異性体は検出可能量はなかった。上記のようなクロマトグラフィー精製が、完全に実行でき、非常に有効であるが、商業量で高度に精製されたＺＸを産生するのに理想的に適してはいないことは認識されている。米国特許第５,３８２,７１４号（Ｋhachik 1995；またＫhac hik et al，1991も参照）に記載され、冷エタノール−水混合物を２溶媒抽出系で使用し、凍結乾燥する、ルテインの精製のために開発された別法が、商業生産使用のための評価のために良好な候補方法を提供する。実施例５：異なる食餌群を使用した日本ウズラにおけるＺＸの試験ウズラを含むすべての試験は、Ａpplied Ｆood Ｂiotechnology，Ｉnc.（本出願の譲受人）との契約の下、Ｈarvard Ｍedical Ｓchool（Ｂoston，Ｍassachus etts）のＳchepens Ｅye Ｒesearch Ｉnstituteで行った。すべての処置または対照群は統計的に有意な数の鳥を含んだ。ほとんどの場合、対照群は処置群と同じ数であった。カロテノイド欠損鳥餌をＰurina Ｍills（Ｓt．Ｌouis，Ｍissouri）から得た。これらの鳥餌は実験用のみに売られており、天然にカロテノイド類を含まない通常の穀物（ミロ種子のような）を使用して得る。ウズラに食べさせるすべてのＺＸ製剤は、発酵させ、実施例２に記載の試薬で安定化し、細胞を殺すために低温殺菌し、凍結乾燥を使用して乾燥したフラボバクテリウム・マルチボラム細胞由来の乾燥バイオマスの形であった。これらの発酵および製造工程は、Ａpplied Ｆood Ｂiotechnology，Ｉnc.のＯ'Ｆallon，Ｍ issouriの施設で行った。すべての試験動物は、カロテノイド欠損卵から孵化した。これらは鳥が成熟した後、親世代（Ｐ１鳥と呼ぶ）にカロテノイド欠損餌のみを食べさせて作った。その卵を破壊して開け、卵がカロテノイド欠損になるまでカロテノイドを分析した。完全にカロテノイド欠損親鳥から続けて生まれた卵を、すべての試験および対照鳥を孵化させるのに、使用した。試験および対照鳥を、異なった餌を与える大きい４群に分けた。これらの群は、餌でどのカロテノイド類を摂取するかに依存して、Ｃ＋群、Ｃ−群、ＢＣ＋群、ＺＸ(＋５)群およびＺＸ(＋５０)群と命名した。Ｃ＋群の鳥は、幾つかのカロテノイドを含む標準商品餌を食べた；この餌はまた合成α−トコフェロール（ビタミンＥ）を添加剤として含む。Ｃ−群の鳥は、上記のように実質的にすべてのカロテノイド類が欠損している餌を食べた。しかしながら、この餌は他のすべての必須栄養素を含み、また合成ビタミンＡおよびＥを添加剤として含む。ＢＣ＋群の鳥は、高用量ＺＸ群に使用したのと同量（すなわちβ−カロテン５０mgを餌kg当たりに添加）の添加剤としてのβ−カロテン以外のすべてのカロテノイド類が欠損している餌を食べた。ＢＣ＋群の鳥は、β−カロテンを含む餌に、光障害工程開始７日前に移した。この群は、β−カロテンと、同様に光障害７日前にまたは欠損餌からＺＸ添加餌に移されたＺＸ補給鳥の一つのサブグループとの直接の比較を可能にする。実施例８に記載のように、この直接の比較は、ＺＸが光毒性障害予防に非常に有効であるが、一方β−カロテンの保護効果は非常に弱く、統計的に有意な濃度に到達しないことを示す。ＺＸ＋群の鳥は、すべての他のカロテノイドを欠くが、ＡＦＢのフラボバクテリウム・マルチボラム細胞由来のＲ−ＲＺＸを含む乾燥バオマスを含む、２つの異なる用量のＺＸを鳥に食べさせ、網膜障害の種々の指標に関して評価および関連すべき用量および効果関係を可能にする。ＺＸ(＋５)群の鳥は、相対的に少量のＺＸ、平均餌キログラム当たり５mgのゼアキサンチンを添加したものを食べた。ウズラは一日当たり約２５から３５ｇの餌を食べるため、約０.１２５から０. １７５ミリグラムのＺＸが、低用量群で鳥当たり一日当たり摂取された。ＺＸ( ＋５０)群は、１０倍量(５０mgＺＸ／kg餌)を食べ、鳥当たり一日当たり平均１. ２５から１.７５ミリグラムのＺＸの消費をもたらす。対照、欠損およびＺＸ餌におけるカロテノイド濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で、Ｓtacewicz−Ｓapuntzakis et al 1993に記載の方法を使用して分析した。結果を表１に示す。すべての鳥は、正常ひな保育籠で成育および保持した。下記する以外、正常の広範囲スペクトルの１日当たり１０から１４時間照明の下に保持した。実施例６：経口摂取ゼアキサンチンの網膜堆積化学的分析を行い、実施例５に記載の種々の食餌群の鳥の網膜に堆積したＺＸ（および他のカロテノイド）の濃度を測定した。これらの分析を行うために、カロテノイド欠損卵から孵化し、少なくとも６カ月間、それぞれの餌で飼育した鳥を頸椎脱臼により殺した。網膜組織を核出眼の切開により回収し、一個の網膜由来の組織を蒸留脱イオン水２５０μＬ中で、ガラスまたはポリテトラフルオロエチレン(テフロン(商標))乳棒を使用してほとんど均一まで挽いた。均質物１０μＬを回収し、種々の網膜サンプルの結果を標準化するために、均質物のタンパク質の分析に使用した。２％w／vピロガロール含有メタノール２５０μＬおよび６０％w／v水酸化カリウム５０μＬを、残っている網膜組織懸濁液２４０μＬに添加した。混合物を水浴で７０℃に１時間加熱し、次いで５０％v／vエタノール５００μＬ、続いてヘキサン２mＬを添加した。混合物をボルテックスにかけ、激しく混合し、次いで分離が起きるまで５℃で放置した。ヘキサンおよび抽出カロテノイド類、トコフェロール類、およびレチノール類を含む上相(すなわち、残った液体の上に浮いている軽い相)を回収した。更なるヘキサン２mＬを組織均質物に添加し、混合物をボルテックスにかけ、再び分離させた。この上相を回収し、最初のものと合わせた。この工程を更に１回繰り返し、３回目の抽出サイクルにおいて、完全なカロテノイド類、トコフェロール類およびレチノイド類の抽出を確実にした。次いで、合わせたヘキサン抽出物を水１mＬで洗浄し、残った水酸化カリウムを回収した。更なるヘキサンをヘキサン−水混合物に添加し、次いでヘキサン相（上相）を注意深くピペットで回収した。次いでヘキサンを窒素ガスの一定の流れの下で蒸発させた。残った残渣は、カロテノイド類、トコフェロール類、レチノール類および他の未同定ヘキサン−抽出可能物質が含まれていた。この残渣を次いで溶媒（メタノール：クロロホルム：トリエチルアミン）に溶解し、上記のようにＨＰＬＣで分析した。高強度光暴露後の損傷レベルをまた示す結果を下記表２に列記する。 β−カロテンが記載した餌の鳥から取った網膜から検出されなかったことは注目すべきである。表２に列記したこれらの網膜濃度は、フラボバクテリウム・マルチボラム（ＡＴＣＣ受託番号５５２３８）に由来する細胞の発酵により製造した経口摂取ゼアキサンチンは、実際、餌添加剤として、食物添加物としてＲ−Ｒゼアキサンチンを投与された試験動物の網膜に堆積した。ＺＸは、通常の方法で消化され、腸障壁を通過し、血流に入り、鳥の眼の網膜細胞に、網膜細胞を光毒性障害から防護するために充分な濃度で取り込まれなければならないため、これらは重要な発見である。これらの障害のすべては、本明細書に記載の細菌発酵性Ｒ−Ｒゼアキサンチン製剤により克服された。実施例７：Ｒ−Ｒゼアキサンチンによる網膜の保護各食餌群の鳥の数匹を、１時間の光、続く２時間のほとんど真っ暗のサイクルを使用した２,０００から３,０００luxの高強度可視光に２８時間付した。光サイクル期間に続き、鳥を殺す前にほとんど真っ暗に１４時間おいた。この量の高強度光暴露は、予備試験でカロテノイド欠損群の鳥において一貫してひどい障害をもたらし、対照(通常の餌)群の鳥において緩和な障害をもたらすことが測定されている。予備試験において、光暴露後の１４時間の時間は、非保護(カロテノイド欠損)鳥における枯死円錐核の最大数を測定するために必要であることがまた測定されていた。対照餌を食べる鳥は、最大枯死を暴露後約２４時間で示すが、一方ＺＸ添加餌を食べる鳥は、２４時間より長い時間に最大枯死を示した。障害前の時間の長さは、それ自体およびそれ自体のためにＺＸの保護効果の強い指標として測定できる。これらの鳥の網膜は、微小解剖により単離し、キシレンに固定し、エタノールで脱水しパラプラスト（オックスフォート、５６℃）に埋め込んだ。次いで、パラプラスト中の網膜組織を分画し、Ｇallyas 1990の方法にしたがってまたはヨウ化プロピジウムで染色し、枯死を特徴付ける核濃縮核を可視化する。４００× （直線）倍の単一顕微鏡視野で見られる核濃縮核の数を計数した。各処置群について少なくとも６から８の別の領域の核を計数し、値を平均化した。表２の結果は、網膜細胞死亡および障害は：（１）通常対照餌を与えられた鳥と比較して、低ＺＸ(＋５)濃度でさえ、細菌合成Ｒ−Ｒゼアキサンチンにより、非常に減少および／または遅延された；（２）高いＺＸ(＋５０)用量により更に減少された。ＺＸ(＋５０)処置群の網膜における核濃縮核の完全な欠損は、フラボバクテリウム・マルチボラム細胞系（ＡＴＣＣ受託番号５５２３８７）由来のＲ−Ｒゼアキサンチンは、光毒性障害に対する網膜細胞の保護の劇的および並外れた飛躍を提供するという注目すべき証拠を提供する。出願人の知識および信念の限りでは、現在まで試験した他の医薬は、このレベルの保護に到達または近付きさえしなかった。実施例８：網膜組織保護におけるＲ−Ｒゼアキサンチン対β−カロテンの直接の比較上記のように、ＢＣ＋食餌群の鳥は、ＺＸ(＋５０)群のゼアキサンチンの用量と同じのβ−カロテン（５０mg／餌kg）の用量を食べていた。これは、光毒性障害に対する網膜細胞の保護の、β−カロテン対ＺＸの直接の比較を可能にした。結果は、ＢＣ＋群の光毒性障害は非常に少ない差であった(平均で約１０％またはそれ以下)。対照群における標準分布と比較して、この減少は統計的に有意ではない；少ない減少が単に無作為変動によるものであるという確率は０.１２から０.１４であった。網膜組織における光毒性障害に対する良好な保護を付与するためのβ−カロテンの失敗、一方Ｒ−Ｒゼアキサンチンが細胞障害および死の同じ指標で全１００％の減少を付与することは、本発見の重要性を完全に証明する。微生物発酵により合成したＲ−Ｒゼアキサンチンは、先に既知の試薬を遥かに上回る大きな飛躍を付与する。実施例９：吸収を高めるための製剤ゼアキサンチン含有“ミセル”は、直径が１ミクロン以下であり、望ましいゼアキサンチンのＲ−Ｒ異性体のみを含有し、Olson 1994記載のように、ある種の胆汁塩を用いて、実施例３記載のようなバイオマス溶媒抽出物または油状液体のいずれかから得られる。Ｒ−Ｒゼアキサンチン含有の油状液体は、Marcor Devel opment Company of Hackensack,New Jerseyにより販売されているグリコ−またはタウロチコレートのリン酸塩などの適当な胆汁塩と共に、あるいはSalzman Co rporation of Davenport,Iowa販売の胆汁塩の混合物を含有する胆のう抽出物の使用により混合できる。この胆汁物は溶媒抽出または油状マスのいずれかと共に、および塩化ナトリウム、塩化カルシウムあるいは塩化カリウムなどの一定の他の塩と共に混合できる。この混合物は、回転柄などの混合器を有する機械的ホモゲナイザーに、通常の実験で最適とされる回転速度および回転時間で、かける。柄の大きさ、形状、回転速度および時間の様々な複合によってミセルの大きさが変わってくる。得たミセルから溶媒を除き、必要とあれば、植物油などの担体または希釈液体を用いて、望む濃度に希釈する。この混合物は、服用するのに役立ち、また胃酸による変性からミセルを保護するカプセルなどに封入される。小さい粒子径の乳剤を形成するのに、他の乳化剤およリピドを用いることができる。ツインおよびスパンなどの非イオン性の洗剤がOlson 1994記載のように用いることができる。また、ホスフォリヒドおよびスフィンゴリピドなどのリピド類も用いられ、小さい径（１ミクロン以下）のリピド小胞を形成する。実施例９：ミクロ−カプセル化ゼアキサンチンこの実施例はミクロカプセル化形態におけるゼアキサンチン製剤について記載する。ミクロカプセルは核材（Ｒ−Ｒゼアキサンチンなど）からなる１０−１０００μｍの範囲の固体粒子でコーティング物質すなわち外被によってカプセル化され、ゼラチン、アラビアゴム、でんぷん、ゼイン（トウモロコシからの１種のタンパク質）などの種々の物質からつくることができる。外被材の製造中に、形状柔軟性、安定性あるいは得る製剤についての望ましい特性を保有するために、他の化合物を添加し得る。かかる物質には、乳化剤、ソルビトール、ＴＢＨＱまたは２−［１,１−ジメチル］−１,４−ベンゼンジオールなどの抗酸化剤およびカラゲーナンなどのゲル化剤がある。純粋または部分的精製のゼアキサンチンを適当な溶媒、例えばエタノール、アセトンまたはＴＨＦに溶解する。溶解したＺＸを水に加えることにより溶液中において、直径１０ミクロン以下のミクロ結晶が形成する。この工程は、溶媒中でゼアキサンチンが結晶化した水をツイン８０などの乳化剤の存在下に高頻度で超音波処理すると、改善される。ミクロ結晶が形成されると、外被材を水、ゼアキサンチンおよび溶媒の混合物に加える。ゼラチンなどの外被材と共に、混合物を６０℃の温度に２時間まで保持することを要する。外被材が完全に溶けると、結晶を再−乳化するために、全混合物を５−１０分間超音波器にかける。ミクロカプセルの形成は、噴霧乾燥、米国特許第４,６７５,１４０のような、Ｓparks et al法による回転ディスク法などの適当な方法で核および外被材の混合物を乾燥することにより完了する。噴霧乾燥剤は食品およびえさの工業において広く用いられている。回転ディスクは、コントロール条件下である温度で保持できるディスク（約４”径）からなる機器である。これは、１分間１,０００− １０,０００回転（ｒｐｍ）の範囲の種々な速度で操作される。核と外被材の混合物は、ディスクが例えば４０００ｒｐｍの速度で回転しているときに、ディスクの中心に加えられる。液体が加熱されている回転ディスクに接触したときに、ミクロカプセルが形成される。ミクロカプセルは、遠心力によりディスクの中心から放出され、疎水性でんぷんまたはデキストリンなどの“収集剤”または“捕獲剤”であらかじめコートされた平たい面に収集される。ミクロカプセルは、光および空気から保護する容器に入れられて、経口摂取用のカプセルに詰められるまで冷蔵状態で保管される。ヒト用のＲ−Ｒゼアキサンチンを含有する薬剤を製造する方法、微生物学的に合成されたＲ−Ｒゼアキサンチンを含有する処方、および黄斑変性の予防および治療への使用についての新しい有用な手段を記載してきた。本発明はある具体的実施態様を参考にして、説明および記載の目的で例示されているが、当業者には説明実施例の多くの変化、置換および類似物が可能であることが明白であろう。本明細書の教示に直接由来し、本発明の精神および範囲から逸脱しないこのような変更は、本発明によりカバーされている。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Pure zeaxanthin for treating macular degeneration in humans 3R-3'R stereoisomerBackground of the Invention The present invention belongs to the field of biochemistry and refers to zeaxanthin (abbreviated as ZX) To certain isomers of yellow pigments. For humans as medicines or vitamins When administered, this pigment damages the retina and is a major cause of blindness in the elderly A disease called macular degeneration can be treated or prevented. The retina is a tissue that exists behind the eyeball. The retina is extremely complex, With different layers of metal. See Gittinger 1988, and Vaughn and As It is described in many medical textbooks, such as bury 1992 (see the end for a full citation). A special circular area called the macula is located in the center of the retina and is approximately 1- 1.5 mm. The macula has two features that are different from the rest of the retina. Primarily, The macula has relatively few rods, and most of its photoreceptors are cone-shaped ( There are no rods in the fovea that exists in the center itself). Secondly, The macula is prominent due to two pigments called lutein and zeaxanthin It has a nice yellow color. Both belong to a group of molecules called "carotenoids". The chemistry of these carotenoid pigments is described below following a summary of macular degeneration.Macular degeneration "Macular degeneration" refers to retinal cells or photoreception in the macula area in the center of the retina It refers to a condition involving progressive damage to the cone. For this, see Taylor 1993, Described in literature and textbooks such as Gittinger 1988, and Vaughan and Asbury 1992 Have been. There are several types of macular degeneration. The most common type is “age-related macular degeneration And is usually abbreviated as AMD (ARMD in some literature) . AMD can cause visual impairment, which is blind from slight loss of vision Ma At There are two types of AMD, often referred to as "wet" and "dry" types You. Wet forms include capillaries and other blood vessels that grow aggressively in the retina. To the point where the blood vessels collapse or destroy the native tissue of the retinal layer. AM of this type D can be treated by using a laser to ablate newly formed blood vessels, The procedure only temporarily slows the growth of blood vessels and results in the eventual loss of almost total vision. Usually cannot be stopped. Wet AMD is almost always completely blind or almost complete Lead blind. The wet form is only about 5-10% of AMD patients. Another type is called "dry" AMD. This is at least 90% of all cases So it is often referred to simply as AMD. This type of AMD is usually blind Although it does not lead to severe damage to the patient's vision, Make the faces of people or relatives invisible or indistinguishable. Thus, this AMD often leads to functional blindness and makes it impossible to drive or walk in public places. Eliminate and make normal activities impossible. There are also various diseases that have macular degeneration as one of the symptoms. To do that, Stargal Stargardt's disease, Best's disease, Batten's disease, Sjogren's disease -Sjogren-Larsson syndrome, cone-rod dystrophy, sheep celloy De lipofuscinosis. Dorey et. al 1993. Furthermore, the lysosomal storage problem (Tay-Sach) Disease) or other diseases with progressive neuronal degeneration (such as Alzheimer's disease) Also correlates with macular degeneration. Many of these diseases have a genetic predisposition, as evidenced by family inheritance. Have. Some of the genes that cause these diseases have been isolated and Screening tests show who has the defective gene. Genetic testing or family history Those who have, or are thought to have, such a gene, have high macular degeneration There is a risk. With gradual loss of vision, AMD has caused significant pain for patients. this Spends billions of dollars a year on lost productivity and heavy burdens on stakeholders. You. Stakeholders are blind, as well as their families, insurers and social services. Or provide medical care and other assistance to persons suffering from severe visual impairment Includes stakeholders to help. Due to the problems associated with AMD, scientists and physicians have Have sought ways to treat or prevent gender blindness and other vision loss . But despite all efforts for more than half a century, treatments still work today Law has not been found.Diagnosis: dolsen and lipofuscin Macular degeneration is usually diagnosed by special imaging of the retina. In one diagnostic method, A doctor injects a fluorescent agent into the patient and allows time for the patient to circulate through the body. Perform the magnified photography of the retina. The video was then analyzed to determine which of the two cell debris Or the presence and concentration of both. One type of cell debris, called dolsen, has been known and studied for decades. Was. There are two different types. A small amount of hard Dorsen (diameter less than 63 μm) (Lower small particles) are always present in the eyes of anyone over the age of 40. Abnormal levels Unless present, Haard-Dolsen does not show retinal damage. On the other hand, a large amount of large soft dolsen (also called wet dolsen) is deposited Indicates that substantial retinal damage has occurred or has begun. Why The large group of soft Dorsen spots can cause destruction of the retinal layer or tissue collapse. And prevent retinal cells from getting proper nutrition from the blood . Patients with significant amounts of soft dolsen in the retina suffer from macular degeneration It is usually considered. Another type of retinal debris commonly present in patients with macular degeneration is called lipofuscin. You. The correlation between lipofuscin and AMD has only recently been revealed. Weiter et al 1988, and Dorey et al 1993).Carotenoid chemistry The term "carotenoid" relates to a large class of molecules; more than 600 naturally occurring Carotenoids have been identified. These molecules have several features, including: Tsu ing: 1. Carotenoids link the isoprene molecule, a five-carbon molecule It is produced by Because this building block contains 5 carbon atoms Most carotenoids contain multimers of five carbon atoms. 2. Carotenoids have a large number of unsaturated bonds. This gives them Absorbs high energy light waves in the blue and near ultraviolet regions of the spectrum. 3. Carotenoids emit light in the blue and almost ultraviolet regions of the spectrum. Absorbs but does not absorb long wavelengths in other regions of the spectrum, so carotenoids Usually has a yellow, orange, brown or red color. The name of "carotenoid" is Derived from carrots; the first known carotenoid gives carrots an orange color Pigment. The color produced by carotenoids in solution is , Concentration and the presence of other compounds. 4. Carotenoids have "conjugated" double bonds. This term is Is staggered with a single bond, and each carbon atom in the chain is replaced by one other carbon atom That no carbon is double-bonded to two other carbon atoms. Show. This configuration can be seen in FIG. 1 which represents the structures of β-carotene, ZX and lutein. Can understand. Different carotenoids have different degrees of conjugation and generally have a higher degree of conjugation. Offspring Provide Great Protection Against "Phototoxicity" Damage from High Energy Light Irradiation . For example, in the three carotenoids shown in FIG. Is alternately conjugated to a double bond and a single bond. For β-carotenoids and ZX, The role extends to the first bond of both end rings. In contrast, one end of the lutein ring Lutein is more suitable because the double bond in Low conjugate degree. The only difference between ZX and Lutein is that one of the terminal rings (but both Not) is the position of the double bond. Carotenoids absorb the potentially harmful energy of blue and near-ultraviolet light Designed and selected (through evolution), so protected pigments in nature Used as One of the goals of most plant functions is blue, ultraviolet, or almost ultraviolet Minimize cell and DNA damage caused by exposure to light Carotenoids are widespread in plants because they need to absorb as much sunlight as possible doing. Damage to plants by UV irradiation is a major problem, and carotenoids Helps minimize it. Carotenoid molecules are ideal for protecting cells and DNA against phototoxicity Therefore, animals are also seeking to use carotenoids as photoprotective pigments (evolution Through). Since animals cannot synthesize carotenoids in their bodies, Must take carotenoids (or carotenoid precursors) from plant sources Absent. β-carotene is an example; mammalian cells cannot synthesize it, so It must be obtained from plant sources, ie food. When you enter the body of a mammal, β-carotene is vitamin A (retinol) obtained by bisecting it. To other molecules. Carotenoids are divided into two main classes, carotenes and xanthophylls. Carotene does not contain molecular oxygen; true carbonization formed only from carbon and hydrogen Hydrogen. On the other hand, xanthofile (such as ZX and lutein) contains an oxygen atom. FIG. 1 shows the numbering of carbon atoms in the left and right terminal rings of ZX. By convention , The carbon atom of the left terminal ring is numbered from 1 to 6, while the carbon atom of the right terminal ring is 3 'Carbon (pronounced "3 prime") is referred to by the "prime" number You. Since ZX is completely symmetrical with respect to the left and right ends, the “left” and “right” The term "" is merely convention and is used to simplify discussion. However Note that lutein is not symmetric; the position of the double bond on the "left" ring is Not the same as the arrangement of the double bonds in the "right" ring. ZX adds two hydroxy (-0H) groups to # 3 hydrocarbons at both ends The chemical name is dihydroxy-carotene; Some chemists call them ten-diols. This molecule gives corn its yellow color Pigment was given the name "zeaxanthin"; The scientific name for corn is Zea mays. As indicated above, more than 600 natural carotenoids have been identified. dozens Species are important in biochemistry and commerce. ZX and lutein are found in mammals and most other Of particular importance in the present invention as they are present in the retina of animals. Lutein has a yellow color on chicken skin and egg yolk to match the tastes of shoppers and consumers. For better feeding, it is widely used in chicken feed (mainly marigold or (In the form of their plant extracts) are of commercial importance. ZX has the same effect and is more potent than lutein, but the source of ZX is Too expensive for use. U.S. Pat. Nos. 5,308,759 and 5,427,783 (gears) Assignee Applied Food Biotechnology from Gierhardt; Applicant of the present application has addressed the problem that ZX is too expensive for animal feed applications. Was intended to work together. These patents cover poultry and fish for coloring purposes. To produce zeoxanthin in commercial quantities so that ZX can be provided Related to the use of bacteria. Some carotenoids are synthesized not only by plants but also by certain bacteria Is done. These bacteria grow in places exposed to direct sunlight, Carotenoids play a similar role in light protection as in plants. Bacterial mosquito References and patents describing rutinoids include McDamotte et al. (McDer). mott et al) in 1972 and U.S. Patent 5,429,939 (Misawa et al) There are other references cited by both. U.S. Pat. No. 5,429,939 (Misawa et al.) Discloses various carotenoids including ZX. The DNA sequences of a number of genes encoding enzymes involved in the biosynthesis of cysteine are described. Each of the main genes (crtE, crtB, crtI, crtY, etc.) in the creation of ZX And crtZ) are also described. These gene-containing programs Rasmid-containing cells are from the American Type Culture Collection (L Erwinia uredovora (ATCC 19321) and Erwini A Herbicola (Erwinia herbicola) ATCC 39368, etc.) For example, it has been deposited with E. coli FERM BP2377).Zeaxanthin stereochemistry and isomers An important aspect of carotenoid chemistry is "stereochemistry" and "stereoisomers". This Are described in all university textbooks on organic chemistry. Organic molecule has carbon atoms bonded to four different atoms or molecular groups And this carbon atom is called a "chiral" carbon atom. Whenever a chiral carbon atom is present in an organic molecule, that chiral carbon atom The four different groups attached to can be arranged in any of the two spatial arrangements. This Are called stereoisomers. One of these stereoisomers is the "right hand method" Rotate the polarization, while the other stereoisomer rotates the polarization in a “left-handed way”. Let The isomer that causes rotation of the right hand is called the R stereoisomer (D stereoisomer). Also called body). The isomer that causes left hand rotation is called the S stereoisomer (Also called the L stereoisomer). Since two of the # 3 and # 3 'carbon atoms are chiral in ZX, ZX has four Has possible stereoisomers. In the 3R-3R 'isomer, # 3 and # 3' chiral Both carbon atoms assume the R configuration. In the 3S-3'S isomer, # 3 and # Both 3 'chiral carbon atoms adopt the L configuration. For convenience, these two stereoisomers The isomers are referred to herein as the RR isomer and the SS isomer. The third and fourth isomers are two “mixed” or “meso” (one R, the other S) Are the 3R-3'S and 3S-3'R isomers. ZX is the midpoint Both areomers are identical in all respects because they are completely symmetric for If you draw the 3R-3'S isomer on the paper and simply rotate the paper, It becomes 3'R isomer. Indeed, a single “meso” isomer is an S—R and R—S variant. It is formed by both sexes. Using standard chemistry to synthesize ZX, the four possible isomers are Each is present at about 25% of the total. However, the SR and the RS isomers are actually the same So that its “meso” isomer is 50% of the total, while RR and S The -S isomer is present at about 25% each. The mixture of all three stereoisomers is " It is called a "racemic" mixture. However, the specificity of carotenoid cells and enzymes in retinal tissue is extremely strict And the different isomers and stereoisomers are not interchangeable. What is Lutein and ZX , Although in normal chemical terms they can be considered to be isomers of each other ( They have the same number of carbon, hydrogen and oxygen atoms), and It is handled by retinal cells as a special molecule. Due to biological factors, the only isomers of interest here are the stereoisomers. This As used herein, “isomer” of ZX means a stereoisomer of a specific ZX, Not included. Lutein and ZX are considered quite different carotenoids. The stereoisomeric differences in carotenoids are small, subtle and almost It may seem trivial, but when it reaches the retinal tissue, Important. Clearly, it is properly taken up by human retinal cells and used. The only ZX stereoisomer that is present is the RR isomer (ie, the 3R-3′R stereoisomer). Body). There are reports that trace amounts of meso isomers were found in retinal tissue. But These traces lead to the production of meso-zeaxanthin from lutein precursors, It is probably derived from certain molecular transformations that can occur simultaneously under certain conditions (both Bone, Landrum, et al., 1993 and 1994). In the laboratory, chiral column chromatography (see, for example, (Bone, Landrum, et al, 1993) or circular two colors Using methods such as sex analysis (see, eg, Britton, 1994). , ZX can be distinguished from each other.ZX and lutein in the macula By 1970, the role of carotenoids in protecting plants against phototoxicity was Well known. In addition, the presence of carotenoids in animal tissues Is unable to synthesize carotenoids, so all carotenoids in animal tissues It was also known that de is originally derived from plant sources. Based on that information, various sentences The study pointed out the similarities between carotenoids in animals and plants. To protect against phototoxicity in After the carotenoid's photoprotective role in animals was recognized, researchers Began to study the chemistry and role of carotenoids in One direction of research is caro Carotenoids prepared from grains and seeds (such as mylo seeds) that do not contain tenoids A test was conducted in which the experimental animals were fed a diet that did not contain any. As a result, carotenoids In the experimental animal retinas that were not fed, yellow macular areas did not grow and these retinas Contains abnormally high amounts of soft Dorsen and is evidently indicative of retinal damage. Was. (Malinow et al, 1980, Kirschfeld 1982, Ham et al. 1984 and Snodderly et al. 1984). These findings suggest that carotenoids are essential for a healthy retina Suggested that it seems. These researchers are actually green vegetables with carrots and leaves Have begun to look for molecules that support the ancient wisdom that they contain something good. However, scientists believe that yellow pigment in the retina is not directly consumed in its final form. Whether they must be, or if they are other, such as β-carotene or lycopene. It was not yet known whether the precursor could be synthesized in animal cells. Lutein was identified as one of the yellow pigments in the macula (Wald) 1949). ZX is not identified as another macular pigment to a considerable extent (Bone et al, 1985). Known about the macula in the mid and late 1980s For a summary of what is being done, see Handelman and Dratz 1986, Werner et al 1 987, Pease et al 1987, Haegerstrom-Portnoy 1988, and Handelman et al 1988 There is. Among other things, these documents disclose that ZX (which is fully conjugated, Somewhat better than lutein for damage caused by energy Predominantly in a small area fovea at the center of the macula It has been established that Concentrically away from the fovea toward the periphery of the macula Therefore, the amount of ZX gradually decreases, the amount of lutein increases, and lutein Inn is an overwhelming yellow pigment. Towards various aspects of retinal aging and damage And further focuses on carotenoids as further protective agents in the retina A recent reference is Sperduto et al., 1990, Gerst. er) 1991, Schalch 1992 and Seddon et al. 1994. In summary, lutein and ZX are pigments in the macula for 10 years It has been known for a long time that these two pigments Protecting the macula was speculated by scientists. However, it was stated that all of these findings and suggestions were made more than 10 years ago. Despite the fact, no one has yet been able to significantly prevent or Any type of medication that is effective in delaying (just reversing) No nutritional supplements, no dietary supplements or other forms of treatment have been developed. β-carotene, vitamin A and vitamin E all help protect retinal tissue Is known to have some degree of effective effect, (See, eg, US Pat. No. 5,310,764, Baranowitz) (Baranowitz et al) Eye Disease Case Control Study Group 1994 and cited below. Two papers). These patents and articles disclose β-carotene, vitamin A, And Vitamin E to prevent or reduce macular degeneration-related disorders It has been claimed or suggested that it can have an effect. Such claims are based on the general oxidation of carotenoids, vitamin A and vitamin E. It would be correct for your business. However, in the retina, β-carotene, The benefits provided by vitamin A and vitamin E are extremely restrictive and It is also unfortunately true that effective treatment has not been reached. All practical Macular degeneration is irreversible, unpreventable, or irreversible for any purpose It is. It also has a broad spectrum of antioxidants (β-carotene, vitamin A, and Tamin E, etc.) is merely a mitigation measure. Nothing is available that really works Therefore, these vitamins are an inexorable disorder caused by macular degeneration Has been used for attempts to slow down (very limited, unsatisfactory success) . As a problem of the prior art, it should also be noted that many health food stores have poor eye and eyesight And selling carotenoid preparations that are labeled as beneficial to β-f Rotene and Vitamin A are known to be beneficial to the eye as common antioxidants (As described above), so the label for carotenoid combinations makes sense Maybe. However, commercially available carotenoid combinations are extremely small Does not contain ZX. Caroteno sold at health food stores Most carotenoids in the id combination are non-ZX carotenoids (mainly β-carotene and And vitamin A). Attention should also be paid to the current status and research goals of some major government agencies and research foundations. Worth it. In the United States, NIH (National Institute of ・ Health) (NEI (National Eye Institute) and National ・ Acting via the Advisory Council) issued two latest reports Done. These two reports are described in "Visibility Research: National Plan 1994-1998",NIH Publication No. 93-3186 (1994; see especially pages 55-65) and "Age Eye Disease Research Related To "NIH Publication No. 93-2910(1993). Both publications And the research projects described there are the most promising for treating AMD As a viable compound, we focus on β-carotene (rather than ZX). Out To the best of the applicant's knowledge, after the subject was discussed with NEI officials, NEI also has close relationship with the National Institute of Health Agencies also fund any research on ZX as a potential treatment for AMD I didn't want to, and I didn't raise any money recently. Meanwhile, NIH and tax Other agencies where money is being spent are the most promising candidates to treat and prevent AMD Millions of dollars have been devoted to conducting research on β-carotene as a drug. Another notable research group is the Eye Disease Case Control Study Group It is. This group included “macular degeneration related to antioxidant conditions and neovascular age. sex",Arch. Ophthalmol.11:104-109 (1993) and `` Related to the age of neovascularization Risk factors for macular degeneration ",Arch. Ophthalmol.10:1701-1708 (1992) I have recently published two papers. As in the official NIH report, Any statement teaches or suggests the use of ZX as a drug to treat AMD I haven't. The foundation also has potential drugs to treat or prevent AMD Have not funded or have refused to fund ZX research as a drug . Also noteworthy is that carotenoids particularly treat or prevent cancer (P eto et al., 1981) and cholesterol production, There is great interest in reducing Lark deposition (Jialal et al 1991). Karotenoy There is a vast scientific literature dealing with the various biological activities of cadmium, including lutein and ZX. Well, there was great interest in methods of synthesizing a number of important carotenoids. But In spite of all carotenoid research and synthetic efforts in the past decades, No one has yet reported an effective way to treat or prevent degeneration. Macular degeneration Given the enormous costs and suffering of society and victims, it must be addressed. This is a major issue that must be addressed. Accordingly, the subject of the present invention is to provide (1) patients diagnosed as having macular degeneration Safe and effective drug to treat, and (2) risk of macular degeneration after middle age Comparable to vitamins, which can be taken by anyone wishing to reduce sex Is to provide nutritional supplements that bring about a very important breakthrough.Synthesis of Lutein and Zeaxanthin: Prior Art Various methods of manufacturing ZX are described in the prior art. These items are two Fermentation processes in which microorganisms play an important role in the production process; and Non-fermentative synthesis method using pure and chemical reactions. Most of the prior art has ZX Add poultry or fish sauce to darken the meat and make the meat more attractive It is suggested to be used for known purposes, such as as an additive. But Either of these efforts will actually produce or sell commercial quantities of ZX. It didn't happen. As of October 1995, purified form or ZX containing more than 5% of the formulation weight The only way to purchase ZX in semi-concentrated form is to add milligram quantities of ZX Merzic Chemicals Corporation (New York Farmingda) Le), Spectrum Chemical Manufacturing Company (Calph) Need to purchase from specialized chemical companies such as Ornia, Gardena). Place As synthetic racemic mixtures containing the undesired SS and SR isomers, these The purchase price of purified ZX from a specialized manufacturer in 1995 is about $ 90 to about $ 90 per mg. 125, which is about $ 100,000 per ZXg of the racemic mixture I do. Obviously, these are expensive and undesired and dangerous S − Real value for use as a drug or nutritional supplement from S and meso isomers There was no. Prior to the present invention, purified or semi-purified zeaxanthin was in any form Was not generally available. Prior art items describing the production of ZX by microbial fermentation are as follows: (1) Carrington and Goodwin (1955) Is the earliest known document describing the production of ZX by microorganisms of the genus Flavobacter. is there. (2) U.S. Pat. No. 3,891,504 (Schocher & Wis) Wiss), transferred to Hoffman La Roche in 1975). This patent is also Flavobacter -Describes the production of ZX by cells. Cells containing ZX are fed to chickens and Proper coloring was provided. (3) U.S. Pat. No. 3,841,967 (Dasek et al. U.S. Patent No. 3,951,743 (Shepherd et al.). al) Transferred to Nestle in 1976). The amount of ZX produced by bacteria Describes methods and nutrient media that can be used to increase. (4) Recently two additional patents (US Pat. Nos. 5,308,759 and 5,427,783) Applied Hood, invented by Gearheart, Inc. and the same assignee as the present application ・ Biotechnology, Inc. Transferred to the Missouri River) Species (Flavobacterium multivorum) described I do. These bacteria produce ZX without producing significant amounts of other carotenoids. It was found to be manufactured. This is to make poultry and fish meat darker ,is important. Because carotenoids, when eaten by animals, This is because they compete in uptake. F. identified by Gierhart multivo Since no other carotenoids are present from the rum strain, pigments for animal tissues ZX is more available, thus increasing its potency and efficacy. The '759 patent uses the AFB F. multivorum bacteria. , ZX. The '783 patent is a divisional application, Claim the mixture. Both of these patents are limited to using ZX for poultry and fish feed. Set And the use of ZX to treat humans Not in. Neither of the two Gierhart patents mentions a particular stereoisomer of ZX. No. The reasons are as follows: (1) In 1989 at the time of filing, AFB multivorum cells (2) Poultry or fish diet Was interested in the use of ZX as a catalyst, so be aware of the different isomers There was no obvious reason to have to go. AFB. multivorum wild species has been deposited with the ATCC and has ATCC deposit no. 5238 was received. These bacteria produce a type of lipid called sphingolipids. The ATCC has identified these bacteria as Spingobacterium multivorum. Reclassified and listed in the catalog under this name. The name in this catalog is Bergy's Manual of Systematic Bacteriology (Int Updated by the ernational Journal of Systematic Bacteriology Does not appear as a quote). For synthesis of ZX by standard chemical means (without using microbial fermentation) Efforts have been reported over the past two decades (eg, US Pat. No. 4,153,61). 5, Saucy, 1979; 4,952,716, Lukac et al, 1990; 5,227,507, Lukac et al, 19 93). However, non-fermentation methods have significant disadvantages. It typically has many A reaction step is required, and each step shows a yield of less than 100%. The final yield of ZX at the end of the process is relatively low. In addition, chemical synthesis is usually Oxidized zeaxanthin and one or more in the linear moiety and / or terminal ring Various conversion products such as zeaxanthin molecules that have lost two or more double bonds and Like the decomposition products, it produces undesirable SS and SR stereoisomers. In summary, prior to the present invention, it was not suitable for use in humans as a drug or nutritional supplement. No suitable purified RR zeaxanthin source was known. Accordingly, one object of the present invention is to provide an AFB F. multivorum. m) strain (ATCC accession number 55238) and its mutants The only detectable isomer without the undesired SS and SR isomers To produce the RR stereoisomer of ZX. Another object of the present invention is to treat macular degeneration, especially age-related macular degeneration. AFB's F. Multivolam (F.C.) manufactures drugs to treat patients diagnosed with .multivoraum) (ATCC access number 55238) It is to disclose. Another object of the invention is to reduce the risk of macular degeneration in Nutrition in a form similar to Tamines or as an additive to food such as margarine For the manufacture of adjuvants, the AFB F. multivorum strain (ATCC Accession number 55238). The third object of the present invention is to provide an RR stereoisomer as the sole or very predominant isomer. An object of the present invention is to disclose a zeaxanthin preparation containing a sexually active substance, wherein the prescription is a retinal disease. As a drug to treat illness or degeneration, or at risk of vision loss in the elderly As a dietary supplement to reduce, it is suitable for human oral intake. These and Other objects will become more apparent in the following summary of the invention and description of the invention. U. Summary of the Invention The present invention is intended solely for human consumption as a drug or nutritional supplement. Or as the very predominant stereoisomer, the 3R-3′R stereoisomer (or the RR A method for producing a ZX preparation containing an active substance or RR zeaxanthin). Show. A naturally occurring yellow pigment in the central macular cells of the human retina ZX absorbs blue and near-ultraviolet radiation, thereby preventing phototoxic damage Protects macular cells. A ZX formulation containing only the desired RR isomer is known as Flavova Species of cells of Flavobacterium multivorum (ATCC Access number 55238). These microorganisms are present in detectable amounts Does not produce the undesired SS and SR stereoisomers of Β-carotene and lute, which may compete with ZX for nutrient absorption after ingestion It does not produce other carotenoids such as quince in any significant amount. these After bacterial production, ZX is purified by methods such as solvent extraction and As a medical drug for sexual patients or about 50 or 60 years old Who wants to reduce the risk of people suffering from age-related macular degeneration But it can be taken orally as a nutritional supplement. As a composition that can be easily taken, 1) Waterproof cap containing RR zeaxanthin mixed with a carrier such as vegetable oil Cell; (2) Various foods (for example, margarine) containing R-RZX as an additive , Dairy products, syrups, cookie batter, meat products that do not require heavy cooking); and ( 3) Disclosed is a granular composition added to soups, salads, beverages, and other foods. It is.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 depicts the molecular structures of β-carotene, lutein and zeaxanthin, 1 shows the structure and terminal ring numbering system of all carotenoids. These structures Are known from the prior art. Figure 2 shows the microbial synthesis of pure 3R-3'R zeaxanthin as a stereoisomer. Flow chart depicting the main steps of fermenting and purifying ZX produced by products Including.Description of the preferred embodiment The present invention relates to a disease that causes macular degeneration or impaired vision and may lead to blindness. Drugs or nutritional supplements administered to humans to prevent or reduce the symptoms A method for producing is disclosed. Zeaxanthin preparations taken by humans are It contains the 3R-3'R stereoisomer of ZX as a very overwhelming "isomer. "Extremely overwhelming isomers," as defined in Contains at least 90% or more of the RR isomer with respect to the formulation, Alternatively, it means that the SR isomer is 10% or less. Desirably to humans The formulation used contains only the RR isomer as the only isomer of ZX detected. Only the undesirable SS or SR isomers. Made The agent is disclosed herein. Using chiral column chromatography analysis (described in Bone et al., 1993) F. multivorum strain (ATC) isolated by Applied Food Biotechnology (AFB) C accession number 55238), when fermented as in the examples, It has recently been discovered to produce only the RR isomer as a possible ZX isomer . As described in Example 4, according to the analysis of Professor Landrum, In the ZX formulation produced by fermentation of cells from the strain, the SS isomer is also RS No meso isomer was detected. The difference between the RR, RS or SS-isomer of zeaxanthin is X is very important when it is administered to humans as a drug or nutritional supplement. is there. The only ZX isomer naturally present in the human retina is the RR isomer Because there is. Ingestion of significant amounts of R-5 and SS isomers from a medical perspective? Are considered very undesirable and dangerous. The reason is (1) RS And the SS isomer do not occur naturally in the human retina. Just exceptionally lutein Is only formed in very small amounts as a byproduct when denatured in retinal cells . (2) RS and SS isomers compete with the desired RR isomer in retinal tissue May cause serious long-term cellular damage and medical complications It could be. ZX preparation produced by fermentation of F. multivorum species is stereoisomerically pure Is it very difficult to separate the stereoisomers after chemically synthesizing ZX? It is very valuable because it is expensive. Separation of stereoisomers in small laboratories Although possible, commercial quantities should be avoided in terms of cost.Use as prescription drug for AMD patients The first point of the present invention is to diagnose the disclosed RR zeaxanthin preparation as macular degeneration. Disordered patients or diseases that can cause macular degeneration as symptoms or conditions, such as Stargartz disease, Best disease, Batten disease, Jogren-Larsson syndrome, Cone-rod ヂ trophy, sheep celloid lipofuscinosis, or Doctors to treat patients with lysosomal storage diseases such as Zaffa disease Dispensing and administering as a prescriptionable drug. In such treatment, the ZX formulation may contain a sufficient amount of ZX to reach a therapeutic level. The RR isomer may be in a carrier and in a form suitable for human administration as described below (capsule). And so on). In a preferred embodiment, for medical treatment ZX is packaged in a unit content form such as a capsule or tablet. Each dose is Desirably it should contain at least about 1 mg of the RR zeaxanthin formulation, Contains zeaxanthin preparation in the range of about 3-10mg for better medical effect I do. The second aspect of the present invention is to use the disclosed RR zeaxanthin preparation as a prophylactic agent, Macular degeneration due to family history or genetic diagnosis of any of the diseases Dispensing and administering to patients diagnosed as likely. The danger of AMD Is high, but in patients who do not yet have AMD Is a smaller content of the formulation unit, for example, about 0.1 to 2 mg. These contents are provided at commercially reasonable cost using the disclosure herein . Capsules containing 25 mg (or less) in an oily liquid carrier should be Manufactured in a commercial manner using microbial fermentation coupled with the output process. Contains a high amount Powder formulation can be manufactured using extended purification, such as the method described in Example 4. Wear.Use as a vitamin or nutritional supplement In a third aspect of the invention, macular degeneration is not currently afflicted, but ZX is a vitamin or vitamin for use in those seeking to reduce the risk of developing macular degeneration. Is manufactured and packaged in the form of a nutritional supplement or food additive. For this purpose When ingested, the appropriate dose is the powder normally sold in health food stores. It must be substantially higher than the amount in powder, but may be Is smaller than when ZX is used. Such doses are taken daily Dosages will range from about 0.05-5 mg. For example, for 0.05-1.0 The amount of RR zeaxanthin is the amount of many active ingredients in multivitamin tablets or capsules. When one, a dose of 0.05-1.0 is appropriate, while a higher dose is Over-the-counter sales to those wishing may be offered a dose of 1-5 mg. Whether used as a therapeutic or nutritional supplement, human ZX formulations are ZX Does not contain the RR isomer as the sole or "extremely overwhelming stereoisomer" I have to. The term "extremely overwhelming stereoisomer" refers to all zeaxane in a mixture Containing at least 90% or more of the RR isomer with respect to the The -S or SR-isomer is used for up to 10% of the formulation. Desirably, the RR isomer is the only detectable variant in all human preparations. Should be sexual. This means that according to the invention, the F. multivorum bacterial line Produces only the RR isomer as the only detectable stereoisomer of ZX, It is possible in industrial quantities and at reasonable costs. After purification, S- Even if the S or SR isomer is present, the amount is small and the method of Example 4 Less detected. In addition, unlike many bacterial species, the F. multivorum cells described herein are caroteno Does not produce a mixture of ids. The cell has R- as the only detectable carotenoid. Produces R zeaxanthin. This can lead to food uptake and tissue deposition. And ZX competes with other carotenoids, so ZX uptake after oral ingestion and The use of ZX to increase retinal deposition, especially for the treatment of diseases diagnosed as macular degeneration It is useful when used as an agent.Production on a commercial scale by bacterial fermentation As those skilled in the art are well aware, the fermentation methods used in the laboratory are subject to large manufacturing operations. Making it work is expensive and difficult. Therefore, the applicant has filed the F. multivorum Nutrients and methods for commercial use of vesicles have been improved. This improved nutrition Elements and methods are described in U.S. Patent Nos. 5,308,759 and 5,427,783. Operation is simple compared to the used culture medium and conditions, and the cost per g of ZX is very high. Low. Desirable nutrients and conditions are described in Example 1. After fermentation, add one or more stabilizers to the cells to prevent denaturation of ZX during purification be able to. Cells are still in the fermentation vessel and before starting sterilization or other treatment , A stabilizer can be added. Various possible stabilizers have been determined by the applicant. Was tested. The best results obtained to date are the combination of the stabilizers listed in Example 2. It is for. After adding the stabilizer, 25 minutes to 55 ° C. to kill the bacteria without affecting ZX Sterilize by heating between. The culture is then cooled to room temperature and filtered by a cross-flow microfiltration machine. The cell liquid is removed by mechanical means. This increases the concentration of cells and solids by volume Increases the filtration concentration from about 10% initially to about 60-80%. F. multivorum cells survived or killed-but not-intact and viable Like other foods containing wound microbial cells (cheese, yogurt, beer, etc.), It is also possible to provide for direct ingestion. F. multivorum cells are known to be pathogenic Not. These cells are separated from the cold water and are not able to survive in the cold water. Because it is suitable, it cannot survive or reproduce well at temperatures within the human body. Further, the fine The vesicle does not have any known toxic components. Gram-negative, Gram-positive bacteria It does not have a cell wall structure characterized by Direct application to fish and birds in the form of cell paste When obtained, bacterial cells appear to be very suitable as carriers. Cells to animals Upon more digestion, ZX is released, absorbed into the bloodstream, and used in various tissues (the retina ) At a suitable site. Therefore, intact F. multivorum cells containing RR zeaxanthin are of the following three types: Any of the forms may be suitable for direct human consumption. (1) intact survival form, (2) Intact killed form after sterilization or other appropriate treatment, (3) killing bacterial cells and their walls A formulation that destroys and exposes cells to make them more accessible to ZX. this is, It can be done by means of ultrasound (using high frequency sound waves), high pressure, or grinding. Otherwise Therefore, when using a solvent extraction method that destroys the cell wall, this means can be omitted. You. If desired, the cell manufacturing procedure may include a cell rinsing procedure, and after fermentation is complete, Rinse cells with a solution containing desired ingredients such as detergents, preservatives, and fragrances Removes residual nutrients and useless metabolites.Purification If desired, cell plague (either intact or disrupted cells) can increase the concentration of cells. Raised and dried to increase the ZX concentration of the dry mass (mass). This is a spray Mechanical means such as drying (using heat) or freeze-drying (freeze-drying under vacuum) Made by When drying is used, the solid residue obtained is usually We call mass. It contains about 1-10% by weight of ZX and contains other cell solids, fermentation media. Also includes solid residue from the ground and the stabilizers described above. Predominantly accumulates in the cell wall before or after (or instead of) disruption or drying An extraction step can be performed to increase the concentration of ZX being performed. Extraction Suitable solvents for this are generally polar organic solvents. The best known to date Solvent is tetrahydrofuran (THF), which attacks the cell wall well and No delamination is required. No stirring is required when using THF in the laboratory However, commercial production probably requires stirring during the solvent mixing step. Would. Other solvents have been tested, and have been tested, but to date, to the extent of THF. Nothing has been found. Tested acyclic organic solvents (acetone and diethyl ether) Have low ZX solubility, while methanol, ethanol and hexa Other solvents, such as butane, have a lower ZX solubility. Solvents should be used under conditions that allow the solvent to dissolve as much zeaxanthin as possible. Mixed with pesto or dried biomass. Then, such as centrifugation or filtration The dissolved liquid fraction is separated from the solid using mechanical means. Discard solids or Is the material for the other process steps (repeat the solvent extraction cycle if desired). liquid The body fraction is treated to remove the solvent, usually by evaporation. RR Zeaxa Viscous oil and other dissolved components removed from the cell plague by the solvent. Minutes remain. In a single extraction method for cells containing 1-3% by weight of THF with ZX When used and then the THF is removed by evaporation, the liquid obtained is about 5 to about 20% by weight of ZX Was contained. Supercritical fluids (i.e., It is usually a gas at atmospheric pressure, but becomes a liquid that acts as a solvent under pressure ) Is used. Carbon dioxide is the most widely used solvent in supercritical extraction , Commercial scale CO_TwoAn extraction system is available. In such a system Liquefied carbon dioxide is mixed with cellular plague or dried biomass in a high pressure reactor. Combine. The liquid is then passed through a series of chambers with progressively reduced pressure. ZX is quite Precipitates out of solution at high pressure and can be collected at an early decompression stage, while Unfortunate Most of the pure remains dissolved in carbon dioxide, and other substances that further reduce pressure Move to the office. The efficiency of supercritical solvent extraction depends on the azeotropic agent (ethanol, propylene glycol). , Ethyl acetate, etc.). this Some of these azeotropic agents have been used in preliminary tests and have It has been shown to increase the solubility of santin. Carbon dioxide is the most widely used supercritical agent, but various other compounds ( Various nitrogen or chlorofluorocarbon compounds) can also be used in commercial scale systems Used for the same purpose. Pressure can be both gas and liquid phase Is the compound suitable for purifying zeaxanthin from the microorganisms described here? You can try. If desired, the oily fluid containing solvent or ZX produced by supercritical extraction may be Mix with oily carrier substances (such as vegetable oils) and then further purify zeaxanthin It can be directly encapsulated in human capsules without the need. This is RR zeaxanthin Provides an economical method suitable for making semi-purified digested forms of As a drug for gynecological patients or to reduce the risk of macular degeneration at an older age It can be used as a nutritional supplement for those who do. In addition, semi-purified RR zeaxanthin increases ZX concentration and removes impurities. Can be further purified. This is because (1) the combination of two selective solvents 2-solvent system, (2) Substrate that causes crystallization of ZX (woven knitted filter bed) Or (3) countercurrent chromatography. 98% pure ZX The chromatographic method used to purify each batch is described in Example 4. Other purification methods for other canotinoids are described in US Pat. No. 5,382,714 (Kh achik 1995) and U.S. Patent 4,851,339 (Hills 1989). .Administration method Ingestion is the most desirable way to administer ZX to humans for retinal protection Daily or weekly capsules or zeaxanthin-fortified diet as described below Used as food or food additive. Such intakes (daily or weekly Need not be done regularly at regular intervals (like the pill), Setting To properly and gradually accumulate a small amount of zeaxanthin in macular tissue , A reasonable period of time between doses (1 day or more, preferably within 1 week ) Is suitable. A single dose as a vitamin supplement may be beneficial, but may It is not as beneficial as taking a large dose for more than a year. Carotes in humans and test animals According to a pharmacodynamic study of the uptake of noids, the "build-up" factor indicated in blood concentration It has been pointed out that daily intake is preferred over intake at weekly or other intervals. Patients with severe macular degeneration due to relatively low carotenoid uptake after ingestion Use other forms of administration for patients, such as intramuscular, intravenous or sustained release implants It is desired. Base formulations for injections consist of water, buffer and propylene glycol. Organic compounds having multiple hydroxyl groups such as dextran, cyclodextran compounds Including compounds. As long as it protects ZX from oxidation and retains the oiliness of ZX, Various packaging forms are used. Examples of suitable compositions for oral inoculation include: (A) a digestible waterproof capsule and a liquid contained therein; Cells and fluids are sized and shaped for easy swallowing and are pharmacologically acceptable The liquid is RR zeaxanthin in a suitable carrier such as vegetable oil or diluted. Including with the agent. If desired, the liquefied ZX can be mixed as described in Examples 9 and 10. Cross-encapsulation, ie, encapsulated in micelles, protects ZX from denaturation in the stomach You. Although the capsules can be made relatively hard, they are It is made of a commonly used hard or soft material. Capsule resistant to stomach acid ZX protects against stomach degeneration when tolerated and digested by enzymes in the intestine Thus, the bioavailability of ZX is increased. But at least, chewed plants The portion of ZX that has entered the stomach as a component of the trout can pass through the stomach without being affected. Follow Therefore, it is not essential to protect ZX from stomach acid, and the choice of capsule material depends on the science. It will be done from an economic point of view rather than an economic request. (B) Tablets for oral ingestion by humans contain RR zeaxanthin and a pressure binder. This binder is because the tablet can keep its shape after being compressed at an appropriate pressure. Is pharmacologically acceptable and of a size suitable for swallowing. On demand The tablet is coated to protect ZX from gastric acid. (C) A composition containing foodstuffs for human use, nutritionally acceptable, excellent in taste, and Zeaxa Is suitable as a substrate for tintin, and contains RR zeaxanthin as an additive . ZX is a yellow-orange pigment which is a vegetable oil, shortening, It is generally the same hydrophobicity as kin fat. ZX is also available from other sources such as β-carotene. Similar to carotenoid food pigments. Thus, ZX is a product of margarine, dairy, Syrup, baked food ingredients, cookie dow, brownies, meats that do not cook severely And various food materials such as soup ingredients. Condyles for other suitable food ingredients It is a granulation formula, used for soups, salads, baking and other additives, It is a mixture with a taste and the like. If desired, a protective coating may be included in the granulation formulation. The denaturation can be reduced by gastric acid of ZX. β-carotene And use of carotenoids and other carotenoids as food pigments and nutritional additives There are a number of relevant documents. The literature includes, for example, Klaui et al 1970; and Bauernfeind 1981; Colombo and Gerber 1991, while the related US Patent No. 4,522,743 (Horn et al 1985), 5,180,747. (Matsuda et al 1993), 5,350,773 (Schweikert et al 1994) and And 5,356,636 (Schneider et al 1994). Its very close Due to chemical similarities and physical properties, any type of diet intended for human consumption Techniques, additions, and other methods for adding β-carotene or lutein in a product are described in It is also directly applicable to -R zeaxanthin. d) a composition comprising foodstuffs for human ingestion, wherein the foodstuffs are non-toxic to humans and Zeaxa Bacterial cells containing the RR isomer of carcinine. The ingredients are cheese, yogurt , Milk and beer. Bacterial cells can be alive or It may have been killed by sterilization or fragmentation if desired. Other forms of packaging are also easy and may be preferred for various uses.Testing RR Zeaxanthin in Animals Using Flavobacterium multiborum cells from ATCC 55238 strain Coturnix coturnix japon, usually called Japanese quail, ica was selected and tested for retinal protection. This species has several For this reason, a useful animal model for human macular degeneration is provided. (1) The whole retina of Japanese quail is located in the plaque area of the human retina in several important respects. Similar. For example, the quail's retina contains both ZX and lutein and is more likely than human plaques. Thus, the cones of photoreceptors are more abundant than rods. (2) The Japanese quail retina exhibits some of the same pathologies as the human retina. For example, Japanese quail retina has a soft crystal cavity that is highly correlated with the occurrence of AMD in humans And accumulate lipofuscin. (3) The quail retina is much smaller than the human retina, but ZX and Yellow due to the presence of This is a model of the small plaque area in the center of the human retina. And make analysis and observation easier. (4) The retina of Japanese quail is cardiovascular and has a structure similar to the fossa region of the human retina Having. (5) Japanese quail generally has a lifespan of 1-1.5 years for females and 3-4 years for males. I do. This can lead to an aging process that may be very difficult for other species that live longer. Enables research on the “length” of For more details on these reasons, see Fite et al 1991 and Fite et al 19 93. These tests are described in Examples 5-8. The results are excellent, F.mul RR zeaxanthin produced by tivorum is (1) properly taken after oral ingestion Accumulates in the macula and is (2) very effective in protecting retinal cells against phototoxic damage Is clearly shown. Further, as discussed in Example 8, preliminary results indicate that the retina is protected from phototoxic damage. That RR ZX is much more potent and effective than β-carotene to protect Is shown. When a high dose of β-carotene was given to test animals, Even small protective benefits did not reach the level of statistical significance. In contrast, the same amount When RR ZX was given to animals, the measured index of retinal cell damage and the index of death were measured. Was completely prevented and prevented.Microbial sources of RR zeaxanthin The Flavobacterium multiborum cells disclosed herein have been deposited with the ATCC. (ATCC 55238; as described above, the Sphingoba (It is written as cterium multivorum, but it has not changed in Bergy's Manual) . This cell line is used to microbiologically produce isomerically pure RR ZX. Several choices are provided to those skilled in the art. First, the direct and unmodified progeny of these cells are transformed into other unwanted steric variants. To produce RR zeaxanthin, which has no measurable amount of sex Can be. Total carotenoids produced by these cells are greater than 90% Z X contains the desired carotenoid. Second, the progeny of the ATCC 55238 strain were transformed with the production level of the RR isomer of ZX. It can be used after being modified to increase. Such mutations and other Variants are created in any of several ways, either randomly or semi-randomly, Screening test to identify colonies with increased ZX production system Do. Techniques using random or semi-random development include (1) wild-type ATC C 55238 progeny may be exposed to random effects such as ultraviolet or X-ray irradiation Or various known chemicals such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (2) treating Flavobacterium multiborum cells Mixed with other types of microorganisms that promote conjugation and DNA exchange between microorganisms (3) Flavobacterium mar Tybolum cells are transformed into a microbial transposon capable of rearranging relatively large amounts of DNA. Treatment with virus or virus. These and other known to those skilled in the art Technology has mutated or otherwise altered each of thousands or millions of progeny cells Effectively introduce uncontrolled and random changes with genes. Therefore, these The technique involves the production of small fractions of progeny with lines that have increased production of the desired zeaxanthin. Conjugate with cloning and screening techniques to identify and isolate Must be used in Screening tests involve screening one or more enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces ZX. Use blocking chemicals (such as diphenylamine, nicotine or lovastatin) , It can be easily implemented. In layman's terminology, this These inhibitors are only overcome by suddenly altered cell lines that produce abnormally high amounts of ZX. Form hurdles or obstacles that can be overcome. Conveniently, mass-producing suddenly changed strains Analytical tests used to identify are simple, fast and easy. ZX is yellow Pigment, to identify suddenly changed colonies with the desired system, A simple visual observation of the culture plate can be used. Desirable are (1) good cell growth Speed (2) It has the ability to produce abnormally large amounts of yellow pigment. Place Automatic equipment (48-well or 96-well plate reader, size Cell sorter connected to a tomometer) for screening tests after the mutation stage You can be. These mutation and screening techniques are common and well known in the art. belongs to. Special used to introduce random or semi-random into mutant progeny cells Despite direct methods or reagents, the direct All cells are modified, mutated, and sexually combined with other cell lines. The wild-type ATCC 55238 in any of the ways described above. It appears to be a progeny of the cell. In a third alternative, the non-progeny microbial cells are transformed with the desired zeaxanthin R- The synthesis of the R isomer was performed and the ATCC 55238 cell line was isolated or If not, one containing the gene of origin can be produced. Such a gene It can be separated and identified using known techniques. Hybridization probe For example, US Pat. No. 5,429,939 (Misawa et al., 1995, supra) The DNA sequence obtained from the carotenoid-producing "crt" gene sequence listed in Carotenoid production with a DNA sequence homologous to the genome of the CC55238 cell line Used as a hybridization probe to study genes. Carotenoid-producing genes isolated from these cells were , Phage or host cells of the desired type, such as Escherichia coli cells, yeast cell, Other suitable vectors that can be used for genetic transformation into insect or mammalian cells Can be inserted. This type of controllable genetic engineering is available from ATCC 55238 cells. Using the resulting gene, transformants can produce RR zeaxanthin. to enable. In addition, the zeaxanthin-producing gene protein derived from ATCC 55238 cells Protein-coding portion (ie, transcribed into messenger RNA, followed by ZX synthesis) The part of the gene that translates into enzymes involved in the synthesis) is very potent and / or It can be under the control of an inducible gene promoter. From different genes "Chimeric" genes with such gene promoters are useful for various purposes, such as (1) suppression of ZX-producing genes during the cell growth phase and then And (2) a new type of host cell suitable for commercial use For example, with very well established and highly optimized fermentation, manipulation and production technologies Escherichia coli cells or yeast cells, which are advantageous and widely used cell types Can be used to insert genes into cells. ZX-producing genes isolated from the ATCC 55238 cell line can also be obtained by those skilled in the art. And other genetic engineering techniques known in the art. As an example, bacterial cells are often For example, using the "non-preferred" codons in the mRNA coding sequence, Control the amount of protein. To circumvent this natural control mechanism, ATCC 55 Non-preferred code for mRNA coding sequence of ZX-producing gene isolated from 238 cell line Would increase ZX-producing enzyme expression in the selected type of host cell. "Preferred" codons. As another example, a cysteine residue may alter the activity or stability of an enzyme Forms undesirable disulfide bonds with other cysteine residues in protein molecules By doing so, it can be suppressed. Therefore, the activity or stability of the enzyme is Or replace more cysteine residues with less active amino acid residues. It may be possible to increase more (eg, US Pat. No. 4,737,462, Mark). In addition, protein expression is often a code for common amino acids such as glycine. Less commonly, delays or reduces expression of protein from mRNA Increase by replacing methionine and triftophan, which tend to cause Wear. After the production of a synthetic gene that produces amino acid substitutions of this nature, the modified protein Is expressed in higher amounts or in a stable form and remains to retain the desired enzymatic activity Can test for. These include the production of ZX by bacteria, yeast or other host cells of the type whose modification is desired. In order to determine whether or not Z can be promoted, Z isolated from the ATCC 55238 cell line was It is an example of a genetic engineering technique capable of evaluating an X-producing gene. "Derived from Flavobacterium maltifol strain ATCC Deposit No. 55238 At least one zeaxanthin synthetic gene comprising a DNA sequence obtained from a cell A cell that is genetically constructed to contain offspring. " Is the DNA or m as measured by the ATCC 55238 cell line or its progeny. Includes cells containing DNA sequence-containing genes chemically synthesized using RNA sequences . Automated DNA synthesis machines are known and rely on the selection of a known selection gene sequence from the original host cell. Can be used to double without the need for replication. “Zeaxanthin synthesis gene” Expresses enzymes or other proteins involved in the zeaxanthin bioconstitutive pathway Can be used to increase zeaxanthin synthesis when inserted into a suitable host cell. Contains genes and does not consider gene-encoded ZX biosynthetic pathway specific enzymes . ExampleExample 1: Commercial scale fermentation Filed for first small laboratory test of Flavobacterium multiborum Medium suitable for humans is described in US Pat. No. 5,308,759 (Gierhart 1994) and US Pat. No. 5,427,783 (Gierhart 1995) identified as nutrient medium E of Example 3. Was. This nutrient medium contained several components that were expensive and difficult to process. High price And to reduce inconvenience, to produce a good commercial scale nutrient medium Studies have been performed since the first filing date of these applications. Present for commercial scale fermentation Currently preferred nutrient media excludes corn flour and some other ingredients doing. These preferred media contain corn at a concentration of 1 to 10% w / v. High maltose corn syrup or sugar cane with soaked liquor 0.5 to 4% w / v Any of icon molasses; ammonium sulfate heptahydrate 0.5% w / v; sodium chloride 0.5% w / v; magnesium sulfate heptahydrate 0.1% w / v; sodium acetate 0.1 % W / v; ferrous sulfate 0.001% w / v; yeast extract 0.2% w / v; thiamine-HCl 0.01% w / v; hydrolyzed casein (NZ Amine HD, Sheffield Produc ts, Division of Quest International, Norwich, NY) And between 6% w / v; and 1% v / v vegetable oil. After mixing these components together, enough NaOH is added to raise the pH to 6.5. Nos. 5,308,759 and 5,427,783 When the nutrient medium was adjusted to pH 7.5 as described in paragraph no. Precipitates from the soaked sake. The culture medium is sterilized in an autoclave at 121 ° C. for 30 minutes, and then cooled to 27 ° C. Produces RR Zeaxanthin without Production of SS, SR or SR Stereoisomers 5-10% "liquid preculture" containing strains of Flavobacterium multiborum v / v inoculation. The cells used for the production of the liquid pre-culture are plated on a plate count agar slope. Keep in tube. The applicant deposited the ATCC with these slope cultures. Accession No. 55238) A clone of Flavobacterium multiborum descendant of the strain Inoculate Ronnie. After incubation at 28 ° C. for 48 hours, the storage slope was removed. Cool to 4 ° C. until used as inoculum for liquid medium. Surviving cells are also It can be frozen for long storage using a freezer, dry ice or liquid nitrogen. A liquid preculture was prepared using cells taken from the agar slope, and a 300 mL septum flask was prepared. Inoculate 30 mL of the liquid medium prepared as described above in a tray. Growth conditions are 28 C., pH 7.2 to 7.6, supplemented with oxygen by stirring at 250 rpm and cultured for 24 hours It is. After the first 24 hours of incubation, one or more 30 The cells contained in the ML preculture flask were transferred to a 10-fold volume of fermentation vessel of suitable size. Used to inoculate nutrient media. The cells are then incubated at 28 ° C. for 48 to 72 hours. Cubate. NaOH and / or phosphoric acid between pH 6.80 and 7.20 Use to maintain. The dissolved oxygen concentration was determined by stirring the vessel at 400 to 1000 rpm. While filtering the filtered air through the container at a rate of 1 volume of air / 1 volume of liquid / minute To maintain 30 to 40% of saturation. Regular sampling and high Studies using fast liquid chromatography showed that cells were fermented under these conditions. In some cases, the maximum amount of ZX was shown to be produced within about 72 hours.Example 2: Addition of stabilizer The ZX produced by the fermentation method described in Example 1 requires subsequent purification and formulation. Stabilization is needed for ease and to ensure purity. Manufacturing or During the purification process, the stabilizing compound is transferred to Flavobacterium multiborum cells (or Can be added to the ZX-containing cell extract); generally, while the cells are in a fermentation vessel, One or more initial stabilizers should be added to the cells. Applicants have tested a variety of potential stabilizers. To date, the best results have stabilized Obtained when a mixture of agents is used, which comprises a small amount of a suitable solvent (20 liters). (About 2 milliliters of ethanol for fermentation vessels) Before mixing. A preferred stabilizer mixture is tertiary butyl hydroquinone (TB HQ; abbreviated as 2- (1,1-dimethyl) -1,4-benzenediol) After mixing with the cells, a final concentration of about 250 μg / L (micrograms / liter) From about 250 mg / L to about 50 mg / L; Ethoxyquin in the range of 250 mg / L; a concentration of about 250 μg / L to about 250 mg / L. Α-tocopherol in the range of from about 500 μg / L to about 500 mg / L. In the range of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid). Suitable concentration is wide range And depends on the subsequent purification steps and the intended form of packaging and consumption. This The preferred concentration of these stabilizers is one-pass THF extraction, followed by mixing with vegetable oil. About 25 to 50 mg for use in waterproofing capsules and vitamin-type pills / L TBHQ; 250-500 μg / L ethoxyquin, 250-500 μg / L α-tocopherol; and 500 to 1000 μg / L EDTA is there. After addition of the stabilizer, the cell culture is heated at 55 ° C. for 25 to 50 minutes to reduce Sterilize by heat. This kills bacteria without damaging the ZX they produced. You. The culture is then cooled to room temperature and present in the ZX-containing cells and culture broth. Increase the other solids from the liquid phase and the cell / solids concentration by about 10 to 15% from the initial value. To a concentration of about 60 to 80% by volume. . This step results in a cell paste that also contains some residual solids of the nutrient medium. As described in Examples 5-7, Japanese quail (Japanese quail) in a retinal test )) For the ZX formulation to be fed, freeze the cells at -70 ° C. and then Dried biomass dried by freeze drying at 5 ° C. and containing about 2 to 10% by weight ZX To manufacture. In past tests, the amount of ZX in each batch was measured individually and Batches and mix them together to ensure consistent concentrations for quail testing. Kept. Solvent extract as described in Example 3 to produce ZX for human consumption To produce a viscous oily liquid.Example 3: Semi-purification to an oily liquid After preparing the cell paste as described in Example 2, it can be treated in various ways. As mentioned above, if desired, ultrasonic (high frequency sound), high pressure or means such as grinding In order to maintain the temperature of the cells at about 30 ° C or less and prevent oxidation, Open cells to make ZX more accessible. However, this step requires Lofran (THF) is very effective in breaking cell membranes without mechanical assistance Therefore, when THF is preferably used for solvent extraction, it is not necessary. Stirring the THF Not required when used for laboratory scale operation; however, during the solvent mixing process Agitation may be advantageous in commercial manufacturing operations. In tests performed to date, the THF extract contained approximately 8 to 20 volumes of purified filtration. One volume of cell paste containing excess THF and 60-80% solids is Including mixing for 2 to 24 hours. THF actively attacks cells, flocculent Produces a liquid of solid suspension. After centrifugation for several minutes to 20,000 gravity, Any THF can be recovered by decanting. The remaining THF was evaporated under vacuum, Leave a neutral oil. Single pass operation of cell paste containing 1 to 3% ZX with THF extract When processed by cropping, the resulting oil usually contains about 5 to 20% by weight of ZX. Was out.Example 4: Highly purified zeaxanthin dry powder of 100% pure RR isomer Manufacturing in end form The highly purified ZX formulation in dry powder form was prepared using the THF extracted oil described in Example 3. The body was prepared by liquid chromatography as described below. Oily Dissolve the ZX-containing liquid in hexane and then chromatographic Pass through the feed column. Using 2 column volumes of hexane to wash the column, Carotenoid impurities and liquids such as β-carotene and lycopene Hexane: acetone 80:20 mixture, freed of water and other contaminants, is then Through the system to release ZX. The resulting dissolved ZX was dried in vacuum. Chromat Chromatographic analysis indicated at least 98% pure ZX; only traces of impurities Was detectable. Relatively unprotected (usually normal refrigerator, moderate frequency for sampling) With care and without antioxidants and to prevent contact with oxygen in the air After storage for approximately 6 months), a sample of this ZX formulation was rida, Professor John Landrum of Florida International University of Miami ( Bone, co-author of Landrum et al). Chiral dicarbamate derivatives His analysis using column chromatography showed that the unprotected formulation 6 months later had 9 Suggested to contain 2% ZX. The impurities are mainly keto-eluting before ZX. Carotenoids; keto-carotenoids It has an extra oxygen atom attached somewhere on the It is a common byproduct of storage without protection. Dr. Landrum's chiral analysis It suggested that 100% of the ZX in the formulation was the desired RR isomer. Desirably No SS or SR stereoisomer of ZX had no detectable amount. Chromatographic purification as described above is completely feasible and very effective Are not ideally suited for producing highly purified ZX in commercial quantities Has been recognized. U.S. Pat. No. 5,382,714 (Khachik 1995; also Chac hik et al, 1991) and described a cold ethanol-water mixture in a two-solvent extraction system. An alternative method developed for the purification of lutein that is used in Provides a good candidate method for evaluation for use.Example 5: Testing of ZX in Japanese quail using different diet groups All tests, including quail, were performed by Applied Food Biotechnology, Inc. Harvard Medical School (Boston, Massachus) etts) at the Schepens Eye Research Institute. All treatments or The control group contained a statistically significant number of birds. In most cases, the control group is the same as the treatment group Number. Carotenoid-deficient bird food was obtained from Purina Mills (St. Louis, Missouri) . These bird foods are sold for laboratory use only and are naturally free of carotenoids Obtained using regular cereals (such as milo seeds). All ZX formulations fed to quail are fermented and with the reagents described in Example 2. Stabilize and pasteurize to kill cells and dry flavova using lyophilization It was in the form of dry biomass from C. multiborum cells. These departures The fermentation and manufacturing process is described in O'Fallon, M. of Applied Food Biotechnology, Inc. Went at the facility of issouri. All test animals hatched from carotenoid deficient eggs. These are mature birds After that, a parental generation (called P1 bird) was fed only carotenoid-deficient food. Break the egg open and analyze the carotenoids until the eggs are carotenoid deficient. Was. Eggs continually bred from carotenoid-deficient parent birds were Used to hatch control birds. Test and control birds were divided into four large groups feeding different diets. These groups Depending on which carotenoids are ingested in the diet, C + group, C− group, BC + group , ZX (+5) group and ZX (+50) group. Birds in group C + ate a standard commercial diet containing some carotenoids; Synthetic α-tocopherol (vitamin E) as an additive. Group C birds are deficient in substantially all carotenoids as described above I ate the food. However, this diet contains all other essential nutrients and Contains vitamins A and E as additives. Birds in the BC + group had the same amount (ie, β-carotene 5) as used in the high dose ZX group. 0 mg per kg of feed) excluding β-carotene as an additive They ate food that lacked the noids. Birds in the BC + group are fed on diets containing β-carotene 7 days before the start of the light damage process. This group is similar to β-carotene, as well as One subgroup of ZX-supplemented birds transferred to ZX-supplemented diet before or from a missing diet Allows direct comparison with As described in Example 8, this direct comparison X is very effective in preventing phototoxic damage, while the protective effect of β-carotene is very Weak and does not reach statistically significant concentrations. The birds of the ZX + group lack all other carotenoids, but the AFB flavobacte Two dried baomas containing R-RZX from L. multiborum cells Different doses of ZX were fed to birds and evaluated and related for various indicators of retinal damage. Allows for dose and effect relationships to be linked. Birds in ZX (+5) group are relatively small ZX, ate with 5 mg zeaxanthin per kilogram of average diet . Quail eats about 25 to 35 g of food per day, so it is about 0.125 to 0.25 g. 175 milligrams of ZX was taken per bird per day in the low dose group. ZX ( The +50) group ate 10 times the amount (50 mg ZX / kg diet), averaging 1.0 per bird per day. This results in a consumption of 25 to 1.75 milligrams of ZX. Carotenoid concentrations in control, deficient and ZX diets were determined by high performance liquid chromatography. The method described in Stacewicz-Sapuntzakis et al 1993 by HPLC (HPLC) And analyzed. Table 1 shows the results. All birds were grown and maintained in normal chick nurseries. Except as described below, Broad spectrum was kept under illumination for 10 to 14 hours per day.Example 6: Retinal deposition of orally ingested zeaxanthin Chemical analysis was performed and ZX deposited on the retinas of birds of various diet groups as described in Example 5. (And other carotenoids) concentrations were measured. To perform these analyses, hatch from carotenoid-deficient eggs and During the month, birds fed on each diet were killed by cervical dislocation. Retinal tissue Harvested by incision, one retinal-derived tissue was collected in 250 μL of distilled deionized water. Mostly, use a lath or polytetrafluoroethylene (TeflonTM) pestle. And ground to uniformity. Recover 10 μL of homogenate and compare results of various retinal samples to standard Was used for analysis of homogenous proteins. Contains 2% w / v pyrogallol 250 μL of methanol-containing and 50 μL of 60% w / v potassium hydroxide are left over. Of the retinal tissue suspension. Heat the mixture in a water bath to 70 ° C. for 1 hour Then, 500 μL of 50% v / v ethanol was added, followed by 2 mL of hexane. Vortex the mixture, mix vigorously, then release at 5 ° C until separation occurs. Was placed. Hexane and extracted carotenoids, tocopherols, and retino The upper phase containing the tools (ie, the lighter phase floating above the remaining liquid) was recovered. An additional 2 mL of hexane was added to the tissue homogenate and the mixture was vortexed and re- And separated. The upper phase was recovered and combined with the first one. Repeat this step one more time Repeat in the third extraction cycle, complete carotenoids, tocophero Ensured the extraction of tools and retinoids. Next, the combined hexane extract was washed with 1 mL of water, and the remaining potassium hydroxide was washed. Was recovered. Additional hexane is added to the hexane-water mixture and then the hexane phase (Upper phase) was carefully collected with a pipette. Hexane is then flushed with a constant stream of nitrogen gas. Evaporated under it. The remaining residues are carotenoids, tocopherols, Knols and other unidentified hexane-extractable materials were included. This residue Then, it is dissolved in a solvent (methanol: chloroform: triethylamine), Was analyzed by HPLC as described above. The results, which also indicate the damage level after high intensity light exposure, are listed in Table 2 below. Note that β-carotene was not detected in retinas from birds on the diet described. You have to watch. These retinal concentrations listed in Table 2 are based on Flavobacterium multivolum (A Orally Ingested Zea Produced by Fermentation of Cells Derived from TCC Accession No. 55238) Xanthine is in fact RR zeaxanthin as a feed additive and as a food additive. Was deposited on the retinas of the test animals to which the test animals were administered. ZX is digested in the usual way, Crosses the wall, enters the bloodstream, protects the retinal cells in the bird's eye and protects them from phototoxic damage These are important findings because they must be incorporated in sufficient concentration to It is. All of these disorders are characterized by the bacterial fermentable RR Zeaxa described herein. Overcomed by tintin preparation.Example 7: Protection of retina by RR zeaxanthin Several birds from each diet group were subjected to a 1 hour light, followed by a 2 hour almost dark cycle For 2,000 to 3,000 lux of high intensity visible light for 28 hours. Hikarisa Following the cycling period, he was almost completely dark for 14 hours before killing the bird. This amount high Intense light exposure consistently severely impaired carotenoid-deficient birds in preliminary studies In the control (normal diet) group of birds. Have been. In preliminary tests, 14 hours after light exposure were unprotected (Caroteno It is sometimes necessary to determine the maximum number of dead cone nuclei in birds. Had been measured. Birds eating the control diet show maximal mortality at about 24 hours post-exposure, while the ZX supplemented diet Birds that ate mortality showed maximal mortality for more than 24 hours. Length of time before failure Can be measured by itself and for itself as a strong indicator of the protective effect of ZX You. The retinas of these birds were isolated by microdissection, fixed in xylene, and ethanol And embedded in Paraplast (Oxfort, 56 ° C). Next, Fractionation of the retinal tissue in laplast was performed according to the method of Gallias 1990 or Staining with propidium iodide visualizes the pyknotic nuclei that characterize mortality. 400x The number of nucleus-enriched nuclei seen in a (linear) magnification single microscope field was counted. For each treatment group The nuclei in at least 6 to 8 separate areas were counted and the values averaged. The results in Table 2 show that retinal cell death and damage were: (1) Birds fed normal control diet Compared to, even at low ZX (+5) concentrations, bacterially synthesized RR zeaxanthin Greatly reduced and / or delayed; (2) higher ZX (+50) doses further Reduced. Complete loss of pyknotic nuclei in the retinas of the ZX (+50) treatment group was From the B. bacterium multiborum cell line (ATCC accession number 5552387) RR Zeaxanthin provides dramatic and extraordinary protection of retinal cells against phototoxic damage Provide remarkable evidence that it offers a great leap. Applicant's knowledge and beliefs To the extent that other drugs tested to date have reached or approached this level of protection. I didn't even hear.Example 8: Direct connection of RR zeaxanthin versus β-carotene in retinal tissue protection Comparison As described above, the birds in the BC + diet group receive the dose of zeaxanthin in the ZX (+50) group. He was eating the same dose of β-carotene (50 mg / kg of diet). This is a phototoxic disorder It allowed a direct comparison of β-carotene versus ZX for protection of retinal cells against harm. The results showed that the BC + group had very little difference in phototoxic damage (on average about 10%). Or less). This decrease is statistically significant compared to the standard distribution in the control group Not; the probability that the small decrease is simply due to random variation is 0.12 From 0.14. Β-Carotene to provide good protection against phototoxic damage in retinal tissue RR, while RR zeaxanthin gives 100% with the same indicators of cytotoxicity and death. Giving a% reduction fully demonstrates the importance of this finding. By microbial fermentation The newly synthesized RR zeaxanthin is a significant leap beyond the previously known reagents. Is given.Example 9: Formulation to enhance absorption Zeaxanthin-containing "micelles" are less than 1 micron in diameter and are desirable It contains only the RR isomer of axanthin and, as described by Olson 1994, Using bile salts, a biomass solvent extract or oily liquid as described in Example 3 Obtained from either. Oily liquids containing RR zeaxanthin are available from Marcor Devel. Glyco sold by the opment Company of Hackensack, New Jersey With appropriate bile salts, such as tauroticolate phosphate, or with Salzman Co. of the gall bladder extract containing a mixture of bile salts sold by rporation of Davenport, Iowa Can be mixed by use. This bile is combined with either solvent extraction or oily mass And certain other substances such as sodium chloride, calcium chloride or potassium chloride Can be mixed with the salt of This mixture is mechanically homogenized with a mixer such as a rotating handle. The generator is run at a spin speed and spin time that is optimal in routine experiments. Various combinations of pattern size, shape, rotation speed and time can result in micelle size It will change. The solvent is removed from the obtained micelles, and if necessary, a carrier such as vegetable oil. Or dilute to the desired concentration with a diluent liquid. This mixture is useful for taking In addition, it is enclosed in a capsule or the like that protects micelles from denaturation by gastric acid. Other emulsifiers and lipids can be used to form small particle size emulsions. Wear. Nonionic detergents such as twins and spans may be used as described in Olson 1994. Can be. Lipids such as phospholipids and sphingolipids Are also used to form small diameter (less than 1 micron) lipid vesicles.Example 9: Micro-encapsulated zeaxanthin This example describes a zeaxanthin formulation in microencapsulated form I do. The microcapsules are made of a core material (eg, RR zeaxanthin). Encapsulated by a coating material or envelope with solid particles in the range of 00 μm Gelatin, gum arabic, starch, zein (a kind of corn (Protein). During manufacture of the covering material, In order to retain the desired properties of the resulting formulation, Other compounds may be added. Such materials include emulsifiers, sorbitol, TBHQ and others. Or an antioxidant such as 2- [1,1-dimethyl] -1,4-benzenediol; There are gelling agents such as carrageenan. Pure or partially purified zeaxanthin is added to a suitable solvent such as ethanol, Dissolve in seton or THF. By adding the dissolved ZX to the water In this case, microcrystals having a diameter of 10 microns or less are formed. This step is performed in a solvent Zeaxanthin crystallized water frequently in the presence of an emulsifier such as Twin 80 Improve by sonication. Once the microcrystals have formed, the jacket material is mixed with water, zeaxanthin and a solvent. Add to Keep the mixture at a temperature of 60 ° C for up to 2 hours with a covering material such as gelatin. It is necessary to carry. When the jacket material is completely melted, the whole The mixture is sonicated for 5-10 minutes. The formation of microcapsules can be accomplished by spray drying, such as US Pat. No. 4,675,140. Mixing the core and shell material by any suitable method, such as the rotating disk method by Sparks et al. Complete by drying the compound. Spray desiccants are in food and food industries. Widely used. The rotating disc is kept at a certain temperature under control conditions This device consists of a disc (approximately 4 "diameter). It operates at various speeds in the range of 10,000 revolutions (rpm). Mixing of core and jacket material The compound may be disengaged when the disc is spinning at, for example, 4000 rpm. Added to the center of the When the liquid comes into contact with a heated rotating disc, Microcapsules are formed. The microcapsule is centered on the disc by centrifugal force. "Collecting agent" or "trapping agent" such as hydrophobic starch or dextrin The microcapsules are collected on a flat surface that is pre-coated with a “catch”. And packed in capsules for oral ingestion in containers protected from air Stored refrigerated until Method for producing RR zeaxanthin-containing drug for human use, microbiologically Formulation containing synthesized RR zeaxanthin, and prevention of macular degeneration and A new and useful tool for therapeutic use has been described. The present invention is a specific Although illustrated for purposes of explanation and description with reference to the embodiments, It will be apparent that many variations, permutations, and the like of the illustrative embodiments are possible. Such derivations can be made directly from the teachings herein without departing from the spirit and scope of the invention. Various modifications are covered by the present invention.

Claims

[Claims] 1. Zeaxanthin 3S- in the manufacture of a medicament for the treatment of human macular degeneration Use of the 3'R stereoisomer. 2. The drug is manufactured in a unit dosage form suitable for administration to humans, and Contains a sufficient amount of zeaxanthin to provide a medical effect to sexual patients, and Use according to claim 1, comprising a physiologically acceptable excipient, diluent or carrier. 3. The unit dosage form has at least about 1 mg of the zeaxanthin 3S-3'R stereochemistry. 3. Use according to claim 2, comprising a sex. 4. To reduce the risk of macular degeneration, a diet suitable for human Use of the 3S-3'R stereoisomer of zeaxanthin in the manufacture of a nutritional supplement. 5. Dietary supplements are Stargarz's disease, Best's disease, Batten's disease, Sujigrenral Song Syndrome, corn rod dystrophy, sheep celloid lipofuscinosis, lyso Diseases that have a problem with somal storage or are genetically likely to cause macular degeneration 5. Use according to claim 4, for the treatment of a patient. 6. Contains at least about 0.1 mg of the 3S-3'R stereoisomer of zeaxanthin Use according to claim 4 or 5, wherein the nutritional supplement is manufactured in a unit dosage form. . 7. Zeaxa at least 90% of the total carotenoids synthesized by the cell Cells that synthesize the 3S-3'R stereoisomer of anthin promote zeaxanthin synthesis Zeaxanthin is produced by a method including culturing in a liquid medium under the following conditions: 7. Use according to any of the preceding claims. 8. Without synthesis of other stereoisomers of zeaxanthin in detectable amounts The use of claim 7, wherein the cells synthesize the 3S-3'R stereoisomer of zeaxanthin. 9. The cell is a Flavobacterium multiform strain (ATCC Deposit No. 55) 238). Use according to claim 5, which is a bacterial cell from 238). 10. Strains of Flavobacterium multiform (ATCC Deposit No. 5523) 8) at least one zeaxanthi containing a DNA sequence obtained from the cell of origin; 6. The use of claim 5, wherein the cells are genetically constructed to contain a synthetic gene. 11. Contains 3S-3'R stereoisomer of zeaxanthin in medically useful amounts in humans And wherein the 3S-3'R stereoisomer of zeaxanthin in the composition is all zeaxanthin At least about 90% of the amino acids and the SS and SR stereoisomers are A composition that is no more than about 10% of the xanthine. 12. Treatment or prophylaxis of human macular degeneration in a carrier or diluent for human ingestion A composition containing a 3S-3'R stereoisomer of zeaxanthin in a medically useful amount for prevention . 13. Wherein the 3S-3'R stereoisomer of zeaxanthin in the composition is all zeaxanthin At least about 90% of the tintin and the SS and SR stereoisomers are all 13. The composition of claim 12, wherein the composition is no more than about 10% of the zeaxanthin. 14． Is substantially free of the SS and SR stereoisomers of zeaxanthin 13. The composition of claim 12. 15. Each unit dosage form comprises at least one of the 3S-3'R stereoisomers of zeaxanthin. 15. The set of any of claims 11-14 in a unit dosage form containing about 0.1 mg. Adult. 16. Each unit dosage form comprises at least one of the 3S-3'R stereoisomers of zeaxanthin. 15. A composition according to any of claims 11 to 14 in unit dosage form containing about 1 mg. . 17． 15. The set of any of claims 11-14, wherein the carrier is a food material for human consumption. Adult. 18. Zeaxanthin protects against zeaxanthin denaturation in the stomach A composition according to any of claims 11 to 17 having a protective coating. 19. Zea at a concentration of at least about 2% by weight as a fraction of the bacterial cell mass. Claims: Non-pathogenic bacterial cells containing the 3S-3'R stereoisomer of xanthine. The composition of any of 11-17. 20. Zeaki at a level of at least 90% of the total carotenoids synthesized by the cells. Cells that synthesize the 3S-3'R stereoisomer of santin promote zeaxanthin synthesis Zeaxanthin is produced by a method including culturing in a liquid medium under the following conditions: 20. The composition of any of claims 11-19 for making. 21. The cell is a Flavobacterium multiform strain (ATCC Deposit No. 5) 21. The composition of claim 20, which is a bacterial cell from 5238).