JPH10512566A - 短核酸の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 陰イオン交換基を有する親水性吸着剤に対して、保護水溶性形態で所期オリゴヌクレオチドを含む試料を、前記オリゴヌクレオチドが前記吸着剤に結合することを可能にする条件下で接触させることと、その後で、吸着されたオリゴヌクレオチドを脱保護し、欠陥配列から分離させることを含む、欠陥配列からの合成オリゴヌクレオチドの精製方法。この方法の特徴は、高及び低イオン強度条件下で保護オリゴヌクレオチドに結合する陰イオン交換吸着剤を使用することである。

Description

【発明の詳細な説明】 短核酸の精製方法 技術分野 所期のオリゴヌクレオチドが疎水性保護基を含む、混合物からの合成オリゴヌ クレオチドの精製。 合成オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド残基の個数は、原則的に、１より大 きいいずれかの整数であり得る。現在使用されているオリゴヌクレオチド合成経 路では、このヌクレオチド残基数は、２００個未満であることが多く、一般的に は１００個未満である。 合成オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び、修飾塩基と修飾糖と修飾 リン酸基を含む類似体を含む。特定の修飾を、ヌクレオチド残基の１個、２個以 上、又は、全てにおいて繰り返すことが可能である。典型的な修飾は、その骨格 におけるチオレーションであり、例えば、リン酸基の１個の酸素原子が硫黄で置 き換えられる（ホスホロチオアートオリゴマー）ことと、リン酸基の２個の酸素 原子が硫黄で置き換えられる（ホスホロジチオアートオリゴマー）こととが可能 である。別の典型的な修飾は、特定の塩基におけるアルキル化（例えば、メチル 化） である。技術的背景と従来の技術 薬剤としてオリゴヌクレオチドを使用することによって、高度に精製された合 成オリゴヌクレオチドの大規模生産の必要性が著しく増大するだろう。今日では 、典型的には、その各々のリン酸基において活性化した５′−保護ヌクレオチド を、固体支持体に固着させた成長オリゴヌクレオチド鎖の末端ヌクレオチド残基 内の脱保護５位と段階的に且つ予め決められた順序で反応させることによって、 オリゴヌクレオチドを合成する。５′位の最も一般的な保護基は強疎水性であり 、好ましくは４，４′−ジメトキシフェニルメチル（ジメトキシトリチル＝ＤＭ Ｔｒ）である。別のこうした保護基は、９−フェニルキサンテン−９−イル（ピ クシル＝Ｐｘ）である。典型的には、結果として得られる５−末端保護オリゴヌ クレオチドを、強疎水性マトリックス上でのクロマトグラフィー（逆相クロマト グラフィー＝ＲＰＣ）を陰イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）と組み合わ せることによって精製してきた。現在まで使用されてきた、ＲＰＣを基礎とする 精製手順の全てに共通しているのは、吸着されたオリゴヌクレオチドを溶離させ るために水溶性有機 溶媒（例えば、アセトニトリル）を使用することである。 オリゴヌクレオチド精製のための典型的手順は、少なくとも次の諸段階を含む ことだろう。 （１）合成中に使用した固体支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂(cleavag e)。この開裂を、高濃度（２５％）のアンモニアを高温度で数時間加えることに よって行うことが一般的である。 （２）アンモニアの除去。 （３）末端ヌクレオチド残基の５位の保護基が欠如した欠陥配列を除去するた めのＲＰＣ。 （４）所期の全長オリゴヌクレオチドがＲＰＣ樹脂上に吸着されているままで ある間の、又は、樹脂からの溶離の後における、脱保護。一般的には、弱酸によ る処理によって脱保護を行う。 （５）次第に増大する濃度の有機溶媒（例えば、アセトニトリル）を加えるこ とによる、ＲＰＣカラムからのオリゴヌクレオチドの溶離。 （６）前に溶離させたオリゴヌクレオチドの陰イオン交換カラム上へのローデ ィング、及び、その後での、次第に増大する 濃度の無機塩を加えることによるオリゴヌクレオチドの溶離。 （７）所期生成物の濃縮と調合。 オリゴヌクレオチド及びその類似体の合成と精製に関しては、例えば、Ｍｅｔ ｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０ （１９９３）（ Ａｇｒａｗａｌ Ｓ 編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を参照されたい。 粒子状の強疎水性マトリックスと粒子状の陰イオン交換マトリックスとを均質 に混合したカラムの中で、上記ＲＰＣ段階を行うことが示唆されている（米国特 許第４，９９７，９２７号）。このアプローチは、アセトニトリル及びジクロロ メタンのような有機溶媒を使用することを必要とする。従来技術の欠点 こうした従来の公知の方法は、大規模プロセスの設計を困難で高コストなもの にする幾つかの欠点を有する。大量の有機溶媒を取り扱うためには、爆発の危険 がない装置と、毒性に対する予防措置とが必要である。有機溶媒の回収と廃棄の ために、及び、多段階プロセスを行うための労力とクロマトグラフィー装置とに 関連した追加コストのために、その生産コストは更に増大する。発明の目的 本発明の目的は、合成オリゴヌクレオチドの精製のための、単純化された、よ り安全で、より低コストの方法を提供することである。発明 こうした目的は、水溶性形態の所期の保護オリゴヌクレオチドを含む試料を、 陰イオン交換基で置換されており且つ高及び低イオン強度（例えば、０Ｍから３ Ｍまでの範囲内のＮａＣｌ濃度に相当する）の条件下でそのオリゴヌクレオチド に結合する親水性クロマトグラフィー媒質（吸着剤）の上に、その吸着剤に上記 保護オリゴヌクレオチドが吸着されることを可能にする条件下で適用することに よって実現される。 高及び低イオン強度の条件下で保護オリゴヌクレオチドに結合する性質は、そ の吸着剤が、その親水性にも係わらず、僅かであるが測定可能な非イオン結合（ 実際、粗水性であると思われる）を示すことを意味する。 後続の段階では、吸着された保護オリゴヌクレオチドを脱保護し、所期の全長 オリゴヌクレオチドを、適切な緩衝成分を含む水性溶媒（好ましくは、水）を使 用して溶離させる。 こうした各々の段階のための適切な条件は、精製すべきオリゴヌクレオチドの 望ましくない劣化を著しく生じさせるものであってはならない。試料 試料は、疎水性保護基を有する所期のオリゴヌクレオチドを含むあらゆる試料 であることが可能である。こうした試料は、固相マトリックスから取り外した後 の、オリゴヌクレオチドの合成から得られる粗材料であることが可能である。従 って、この試料は、所期のオリゴヌクレオチドと、上記固相マトリックスから取 り外すために加える試薬との他に、合成中の不要な反応又は不完全な反応によっ て形成される欠陥オリゴヌクレオチド（欠陥配列）の水溶性形態も含む。こうし た欠陥オリゴヌクレオチドは、保護形態及び／又は非保護形態であることが可能 である。段階 吸着剤への保護オリゴヌクレオチドの吸着 重要な問題は、保護オリゴヌクレオチドと吸着剤との間の非イオン結合を可能 にする条件を与えることである。このことは、保護オリゴヌクレオチドの選択的 吸着の条件（即ち、より高い塩濃度）の方が明らかに有利であるけれども、低イ オン濃度に おいて、保護オリゴヌクレオチドと非保護オリゴヌクレオチドの両方をこの段階 で吸着することが可能であることを意味する。このことは、一方では、こうした 条件が臨界的ではなく、粗試料を、程度の差はあっても、全く予精製段階なしに 直接的にそのまま使用することが可能であることを意味している。吸着後には、 未吸着試料成分、及び（存在する場合は）合成中に使用した支持体からのオリゴ ヌクレオチドの開裂に由来する過剰量の薬剤を取り除くために、洗浄段階を行う ことが好ましい。保護オリゴヌクレオチドと非保護オリゴヌクレオチドのどちら が吸着された場合においても、疎水性保護基を持たないオリゴヌクレオチドの選 択的脱着を可能にする条件（即ち、塩濃度の増大）を適用することが有利である 。 吸着段階とその後に続く洗浄段階に関しては、一般的に、これらの段階の間に 次の条件が選択される。 イオン強度： 洗浄溶液において高イオン強度を使用する洗浄段階が最終生成 物の高純度を得るために好適であるが、原則的には、イオン強度が広い範囲内で 様々であってよい。０Ｍから４Ｍまで、好ましくは０．１Ｍから３Ｍまで、又は 、０．５Ｍから３ＭまでのＮａＣｌ濃度に相当するイオン強度が一般的 に効率が良い。適切な塩はＮａＣｌ又は他の無機水溶性塩である。 温度： 一般的には０℃から５０℃までであり、好ましくは１０℃から４０℃ までである。 ｐＨ： アルカリ性、即ち、一般的には７から１４までのｐＨ値、好ましくは ８から１２までのｐＨ値である。 より高い塩濃度が非保護オリゴヌクレオチドを溶離させるだろう。脱保護 保護オリゴヌクレオチドが吸着された状態にある間に脱保護を生じさせること が好ましい。この条件は、一般的に各々の保護基に対して適用される条件と同一 であるが、形成される脱保護オリゴヌクレオチドが（陰イオン交換を経て）吸着 状態のままであることが可能であるように条件を維持することが好ましい。この ことは、一般的に、保護基が疎水性化合物に変換される場合に、この疎水性化合 物も吸着された状態のまま残る可能性があることを意味する。典型的には、脱保 護が生じるように、保護基に適合した開裂剤溶液(cleavage solution)と共に吸 着剤をインキュベーションする。例えばＤＭＴｒのような加水分解によって遊離 可能な基の場合には、この開裂剤溶液が、比較 的強い有機カルボン酸（例えば、トリフルオロ酢酸）を開裂剤として含むことが 多い。ジクロロ酢酸とトリクロロ酢酸を使用することも可能である。脱保護オリ ゴヌクレオチドが吸着状態のまま残ることを確実なものとするために、イオン強 度は、一般的に、可能な限り低く保たれる（多くの場合には、０．５Ｍ未満）。 典型的には、温度が低ければ低いほど長いインキュベーション時間が必要となる ことを考慮しながら、温度を０℃から４０℃までの範囲内で選択し、インキュベ ーション時間を１分間から６０分間までの範囲内で選択する。脱保護オリゴヌクレオチドの溶離 この段階を、親水性陰イオン交換体からオリゴヌクレオチドを溶離させるため の一般的方法を使用して行う。溶液は水性であり、最も好ましくは水であり、適 切な塩（一般的には、ＮａＣｌのような無機水溶性塩）と緩衝成分を含む。長さ に従ってオリゴヌクレオチドを溶離させるために、塩勾配を使用して溶離を行う ことが最も好ましい。開始濃度、最終濃度、及び、勾配の大きさは、分離させる べきオリゴマーの量と長さとに応じて決まるだろう。イオン強度を変化させなが ら溶離を段階的に行うことも可能である。一般的には、イオン強度は０Ｍから３ Ｍの範囲内であり、勾配の大きさは５カラム体積から４０カラ ム体積までの範囲内である。 保護基由来の疎水性化合物は、オリゴヌクレオチドの溶離後も、吸着剤上に残 ったままだろう。この化合物を、疎水性水溶性共溶媒（例えば、イソプロパノー ルとエタノールのような低級アルコール）を含む水性溶液を使用して吸着剤から 溶離させることが可能である。 上記のように、吸着と脱保護と溶離の適切な順序を使用することによって、選 択された親水性陰イオン交換吸着剤上で高度の精製を行うことが可能となるだろ う。吸着された保護オリゴヌクレオチドを脱保護の前に脱着させるプロトコルを 選択する場合には、このプロトコルでは、より短い形のオリゴヌクレオチドから 所期の全長オリゴヌクレオチドを分離させるために、追加のイオン交換段階が必 要になるだろう。吸着剤 適切な吸着剤は、明らかに親水性であるが、１つ以上の疎水基を有する修飾オ リゴヌクレオチドに対して非イオン的に結合する能力を僅かではあるが測定可能 な度合いで有する吸着剤である。この吸着剤は、タンパク質及びペプチド（例え ば、シトクロムＣ、卵アルブミン、及び、アンギオテンシン）の非特異 的吸着を全く示さないか又は極めて僅かしか示さないと同時に、高イオン強度（ 例えば、０．５Ｍから３ＭまでのＮａＣｌ濃度に相当するイオン強度）において ＤＭＴｒ保護オリゴヌクレオチドに結合する能力を依然として有することが必要 である。構造的に見た場合に、このことは、吸着剤が、疎水基に比較して過多な 親水基（例えば、アルコール性ＯＨ−、陰イオン交換基、オリゴ−及びポリエチ レンオキシド基他）をその表面上に露出させなければならないことを意味する。 存在することが可能な疎水基の例は、芳香環を含むヒドロカルビル、及び／又 は、直鎖、枝分れ、もしくは、環状アルキル基もしくは鎖である。 陰イオン交換基の例はアミノ基であり、特に、ジエチルアミノエチル基のよう な第三級アミノ基、並びに、トリアルキルアンモニウムアルキル基（例えば、ト リメチルアンモニウムアルキル基、トリエチルアンモニウムアルキル基、及び、 ２−ヒドロキシエチルジエチルアンモニウムアルキル基）、ジアルキルアリール アンモニウム−アルキル基（例えば、ジメチルアニリニウムアルキル基）、及び 、環含有アンモニウム基（例えば、Ｎ−メチル（ピペリジニウム）−及びピリジ ニウムアルキル基） のような第四級アミノ基である。窒素を吸着剤に結合するアルキル基は、エチレ ンのような短アルキレン鎖であることが可能である。吸着剤の陰イオン交換基の 個数は、本発明の方法にとって臨界的ではない。適切な度合いの非特異的吸着を 有し、且つ、媒質１ｍＬ当たり１μｍｏｌから１，０００μｍｏｌまでの、好ま しくは媒質１ｍＬ当たり５０μｍｏｌから１，０００μｍｏｌまでの陰イオン交 換基を有する陰イオン交換体を使用することが可能である。本発明に関する上記 の一般ルールを考慮しながら、イオン交換能力と試料体積と吸着／脱保護／溶離 条件との適切な組合せを見い出すことは、当業者にとって困難なことではないだ ろう。 有効である可能性がある幾つかの吸着剤を、科学文献と特許文献に基づいて想 定することが可能である。例えば、適切な陰イオン交換基及び疎水基がその上に 付着させられている、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキ シアルキルメタクリラート）及び他のポリメタクリラート、並びに、セルロース 等を主成分とする水不溶性ポリマーから調製するクロマトグラフィー吸着剤であ る。場合によっては、こうした基体ポリマーが充分な疎水性を与える可能性もあ る。 こうした吸着剤は、上記親水性と陰イオン交換基を有するように上記ポリマー のいずれかで被覆することによって又はその表面上で誘導体化することによって 親水性にしてある強疎水性基体マトリックス（例えば、ポリジビニルベンゼン及 びポリスチレン（随意に、互いのコポリマーとして）、ポリエチレン、ポリプロ ピレン等）で構成されることも可能である。この場合には、適切な非イオン的結 合能力が、上記基体マトリックス自身又は上記誘導体化に由来することが可能で ある。 吸着剤は一般的に多孔性であり、粒子形態（例えば、ビーズ）であるか又は連 続している（モノリス状）であることが可能である。粒子形態の吸着剤をを充填 床又は流動床（膨張床(expanded beds)）の形で使用することが可能である。最適形態 優先日において最も好ましい吸着剤は、ＳＯＵＲＣＥ^TM３０Ｑ（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の名称で市販 入手可能だった。この製造者によれば、この媒質は、剛性で、多孔性で、球形の 単分散陰イオン交換体である。基体マトリックスは、ヒドロキシル基を含む架橋 アルキルエーテルの層で被覆してあるポリスチレン／ ジビニルベンゼンビーズで作られている。この陰イオン交換基は第四級タイプ（ トリメチルアンモニウム）であり、親水性スペーサーアームを介して被覆に付着 している。保護オリゴヌクレオチド（特に、その５末端位置に疎水基を有するオ リゴヌクレオチド）に結合する能力は、塩基性ポリスチレン／ジビニルベンゼン 基体マトリックスから、又は、親水性化の際に導入される基（例えば、アルキル エーテル基）から得られるだろう。 本発明の最適な形態では、そのリン酸基中の少なくとも１つの酸素が硫黄によ って置き換えられているオリゴヌクレオチド類似体を精製する（ホスホロチオア ート及びホスホロジチオアート）。 本発明のこの最適形態を、次の実験セクションで更に詳細に説明する。実験セクション 試料 ：経路長１ｃｍ、２６０ｎｍで測定した場合に４４６０光学密度単位（ＯＤ Ｕ）を有する２５％アンモニア溶液３５ｍＬ。処理したオリゴヌクレオチドは、 ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（Ｒ） ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ上で合 成したホス ホロチオアート２５−ｍｅｒだった。全長生成物に相当する２５−ｍｅｒの量は 、粗材料の吸光度測定と毛管電気泳動とから推定した場合に２３５９ ＯＤＵで あった。カラムと吸着剤 ：媒質ＳＯＵＲＣＥ^TM３０Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ ｃｈ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）をＨＲ１６カラム（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）の中に充填し、その結果として１６ｘ１１０ｍ ｍの充填床を得た。クロマトグラフィー手順の全てを、ＢｉｏＰｉｌｏｔ（Ｒ） （クロマトグラフィーシステム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ） 上で行った。次の諸段階を次に示す順序で行った。 （１）試料を上記カラム上に適用させ、その後で、カラムを２カラム体積（Ｃ ｖ）の１０ｍｍ ＮａＯＨで洗浄し、更に、２ｘＣｖの３．０Ｍ ＮａＣｌ（ｐ Ｈ １２）で洗浄し、その後で、再び２ｘＣｖの１０ｍＭ ＮａＯＨで洗浄した 。この段階では、非ジメトキシトリチル化欠陥配列を洗浄除去した。 （２）溶離液が酸性ｐＨとなるまで約３ｘＣｖの０．４％トリフルオロ酢酸で 上記カラムを洗浄した後、そのカラムを２０分間そのままにし、２５−ｍｅｒか ら完全にＤＭＴｒ基を開裂 させた。その後で、１０ｍＭ ＮａＯＨを使用してカラムを塩基性ｐＨに再平衡 化した。 （３）２５−ｍｅｒを溶離させ、２５ｘＣｖに亙って１２の定ｐＨ値において ０．８Ｍ−１．９Ｍ ＮａＣｌの直線ＮａＣｌ勾配を使用することによって、よ り短い配列から更に精製した。各々１０ｍＬのフラクションを集め、毛管電気泳 動で分析した。全長生成物がそのオリゴヌクレオチド全体の９２％を越える割合 を占めるフラクションをプールした。 （４）最後に、イソプロパノール中の２Ｍ ＮａＣｌ（３０％ （ｗ／ｗ）） を２ｘＣｖ使用することによって、カラムを清浄化した。 毛管電気泳動によって測定した時に９８％の純度を有する生成物を収量６６． ３７ｍｇで得たことが、上記プールの分析から明らかになった。全収率は７６％ だった。クロマトグラフィープロセスの完了に要した時間は３時間未満だった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 陰イオン交換基を有する親水性吸着剤に対して、保護水溶性形態で所期オ リゴヌクレオチドを含む試料を、前記オリゴヌクレオチドが前記吸着剤に結合す ることを可能にする条件下で接触させることと、その後で、吸着された前記オリ ゴヌクレオチドを脱保護し、欠陥配列から分離させることを含む、欠陥配列から の合成オリゴヌクレオチドの精製方法であって、高及び低イオン強度条件下で前 記吸着剤が前記保護オリゴヌクレオチドに結合することを特徴とする前記方法。 ２． 前記所期オリゴヌクレオチドの吸着後に、 （ａ）前記保護基を開裂するための脱保護剤を含み、且つ、 （ｂ）前記吸着剤に吸着された状態に脱保護オリゴヌクレオチドを維持するイオ ン強度を有する溶液と共に、前記吸着剤をインキュベーションし、且つ、このイ ンキュベーションを、脱保護を得るために充分な時間に亙って行うことを特徴と する請求項１に記載の方法。 ３． 前記所期オリゴヌクレオチドを脱保護後に前記吸着剤から脱着させること を特徴とする請求項２に記載の方法。 ４． 前記所期オリゴヌクレオチドの脱着を塩勾配を使用して行うことを特徴と する請求項３に記載の方法。