JPH10511078A

JPH10511078A - 免疫刺激剤

Info

Publication number: JPH10511078A
Application number: JP8508973A
Authority: JP
Inventors: エイチ．リッチ，ダニエル; マルコフスキー，ミロスラフ; エム．アンゲル，イヴォンヌ
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1994-09-01
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 1998-10-27
Also published as: WO1996006857A1; US5639852A; EP0778847A4; EP0778847A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規シクロスポリンＡ類似体の合成、およびこれらの類似体の免疫刺激剤としての使用のための、組成物および方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】免疫刺激剤発明の分野本発明はヒト白血球の活性および増殖を増大させるための薬剤として使用するシクロスポリン誘導体に関する。発明の背景分子免疫学の最近の進歩によって、研究者は、病原体の感染に対するヒトの免疫応答中に生じる細胞および分子の現象について、詳細な見解を得ることができるようになった。研究者は、免疫応答中の各種リンパ球の役割を決定することに加えて、リンパ球の作用と機能とを調整するための化学シグナルとして作用すると考えられる巨大分子が関与するものも含めて、これらの生化学的相互作用についての詳細図を作ることにおいてかなりの成果をもあげた。当今の免疫学の見解によれば、身体の特異的防御機構において、Ｔ細胞が中心的な物質とされている。Ｔ細胞の２つの特定のクラス、ヘルパーＴ細胞(Ｔ_H)および細胞障害性Ｔ細胞(Ｔ_C)は、体液性および細胞性免疫応答のいずれにおいても重要な役割を演じている。これとは対照的に、Ｂリンパ球は体液性免疫応答のみに関与する。体液性の応答は、通常、遊離の循環病原体またはそれらの抗原に対するものである。マクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は消化された抗原の断片を外膜上に、しばしばクラスII−ＭＨＣ（主要組織適合性）タンパク質と組み合わせて、発現する。これらのクラスIIＭＨＣ類および外来抗原の認識が、Ｔ_H細胞の増殖のひきがねとなる。次に、これによってＢ細胞の抗体の分泌が誘発され、この抗体が結果的に病原体を不活性化する。細胞性応答には、Ｔ_HおよびＴ_Cの両者の関与が含まれる。この場合、病原体が感染した身体の細胞はクラスＩ−ＭＨＣタンパク質と組み合わされた病原体抗原を表示し、これがＴ_H細胞を刺激してＴ_C細胞を活性化し、感染細胞が溶解する［ Biology(3rd.ed.)Campbell,Benjamin Cummings Publishing Company,Inc．（199 3）参照］。生体防御機構においてＴ細胞は重要な役割を演じるので、ＡＩＤＳウイルスによって特定のＴ細胞集団が破壊されると、生体自身による防御能力が著しく失われる。したがって、ＡＩＤＳ治療はＴ細胞の破壊の抑止および／またはＴ細胞機能の再生方法に焦点を合わせてきた。これらの努力は、可溶性伝達物質、すなわちサイトカインの複雑な関与を含むＴ細胞生化学の完全な理解がなされていなかったために、なかなか成果を見なかった。生体のＴ細胞を刺激して増殖をさせる原因となる、生化学的伝達物質および細胞の相互作用の両者について、多数の研究がなされてきた。この作業の大部分は直接応答する化学シグナルと膜受容体の両者の本体を発見することを中心としてきた［Lanier“Distribution and Function of Lymphocyte Surface Antigens” Ann.N.Y.Acad.Sci.677:86(1993)参照］。Ｔ細胞の活性化には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が特異的抗原／ＭＨＣタンパク質結合物に結合する以上のものが必要であることは、一般的に容認されている［ Biology(3rd.ed.)Campbell,Benjamin Cummings Publishing Company,Inc.(1993) 参照］。特に、事実上、“補助刺激(costimulatory)”シグナルとしての、別の分子の結合現象の存在について、多くの研究が行なわれてきた。これらの補助刺激シグナルは抗原特異的ではないが、Ｔ細胞の発生、活性化および増殖の多くの段階において重要であることがわかっている［Mizel“Characterization of Lym phocyte Activating Factor(LAF) Produced by Macropharge Cell Line”J.Immu nol．120:1504(1978)］。最近の免疫学の研究は２つのタイプの補助刺激シグナルに焦点を合わせてきた。補助刺激シグナルの第１のクラスは細胞間媒体中を介して自由に拡散する巨大分子であり、これがＴ細胞の外膜上の受容体に結合して、所望の代謝の変化を起こさせる。これらの遊離の補助刺激物質自体は典型的には別のリンパ球から分泌される。Shawらの文献は、ある因子を“補助刺激物質”という用語で称して記述した最初のグループの中の一つである。この分子は、抗原である最初のシグナルに続いて、Ｔ細胞の増殖を誘導する非特異的な第２のシグナルのような行動をとった［"Effects of Costimulator on Immune Responses IN VITRO"J.Immun.120: 1974(1978)参照］。Teh らは、抗原によって最初に刺激される細胞障害性Ｔ細胞を活性化するモデルシステムにおける、同一の“補助刺激物質”の使用について記載している［"Direct Evidence for a Two-Signal Mechanism of Cytotoxic T -Lymphocyte Activation",Nature 285:163(1980)参照］。このことは Shaw らによっても確証された［“Cellular Origins of Co-stimulator(IL2)and Its Acti vity in Cytotoxic TLymphocyte Responses”,J.Immun.124:2231(1980)参照］。 “補助刺激物質”およびその他の関連化合物は普通、“インターロイキン”の一般カテゴリーに属するペプチドである。インターロイキンファミリー以外の化合物も同様にＴ細胞の代謝の変化を誘発するかどうかは、現在のところはっきりしていない。Chouaib の最近の文献には、細胞障害性細胞の分化の補助刺激における、精製した腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の使用について記載されている［“Tumo r Necrosis Factor α：a Costimulator for Cytotoxic Cell Differentiation, ”Nouv.Rev.Fr.Hematol.33:471(1991)参照］。しかし、この化合物は、別の非特異的分子が関与しなくてもＴ細胞を刺激する能力を有する、インターロイキン２との組合せのみにおいてしか作用しない。研究中の第２のクラスの補助刺激シグナルは、典型的には別のＡＰＣ類上に存在する膜結合リガンドであり、これはＴ細胞表面の受容体タンパク質に結合する。特に、Ｔ細胞の外膜上に存在するＣＤ28受容体に焦点を合わせて、相当数の研究が行なわれてきている［Jenkins ら、“CD28 Delivers a Costimulatory Sign al Involved in Antigen-Specific IL-2 Production By Human T Cells,”J.Imm un.147:2461(1991)および Fraser ら、“Regulation of T-cell Lymphokine Gen e Transcription by the Accessory Molecule CD28,”Mol.& Cell.Bio.10:4357( 1992)参照］。この受容体およびＢリンパ球上に存在する活性化リガンド、“Ｂ７／ＢＢ１”、はサイトカインの遺伝子転写の調節を通じて、Ｔ細胞の活性化における中枢の役割を演じるものと考えられる［Koulova ら、“The CD28 Ligand B7/BB1 Provides Costimulatory Signal for Alloactivation of CD4+ TCells, ”J. Exp.Med.173:759(1991)，Gross ら、“Identification and Distribution of the Costimulatory receptor CD28 in the Mouse,”J.Immun.149:380(1992) ，および Larsen ら、“Functional Expression of the Costimulatory Molecul e B7/BB1,on Murine Dendritic Cell Populations,”J.Exp.Med.176:1215(1992) 参照］。精製したＢ７／ＢＢ１は生存可能なＴ細胞刺激物質であると考えられるが、これは高分子量の複合タンパク質であり、組換えＤＮＡ技術によってのみ、大量に製造することができる。化学的に合成し得るもっと単純な補助刺激物質があれば有用であることは明らかである。発明の要約本発明は、ヒト白血球細胞の活性および増殖を増大させる薬剤として使用する、シクロスポリン誘導体に関する。１つの実施態様において、本発明は、非免疫抑制性と免疫刺激剤、すなわち、 in vitro でリンパ球の増殖および活性を増大させるのに有用な薬剤、の両方の特性を併せて有する修飾シクロスポリン誘導体に関する。シクロスポリン“誘導体”または“類似体”とは、特定の位置にアミノ酸置換基を有する、シクロスポリンＡ、すなわち環状ウンデカペプチドの基本構造を有するものである。本発明によれば、新規なシクロスポリン誘導体のクラスの１種を、１またはそれ以上の抗原とともにリンパ球と混合する。１実施態様において、この物質は、化学的、酵素的または生物学的手段によって、１，４または６位のいずれか、またはこれらの任意の組合せ位置において修飾されたシクロスポリン誘導体である。類似体が免疫細胞（例えばリンパ球）を刺激する（例えば増殖によって測定される）原因となるならば、この類似体は“免疫刺激性”である。したがって、“ 補助刺激性”は免疫刺激性である。１実施態様において、本発明は図１のシクロスポリンの免疫刺激性類似体を意図とする。好ましい１実施態様において、本発明は図３に示す構造を有する類似体を意図とする。固相合成は特定の固体粒子のみに限定されるものではない。１実施態様において、粒子は使用したすべての溶媒に不溶性で、そのまま濾過することができる安定な物理的形態を有している。またこの粒子は第１の保護アミノ酸を共有結合によって堅固にカップリングすることができる官能基を有している。多くのポリマーおよび付着様式があり得る。あり得るポリマーの中で、本発明は、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレートおよびスルホン化ポリスチレンを意図している。好ましいポリマーはメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）ポリスチレン樹脂である。本発明は、図１の免疫刺激性シクロスポリン類似体に免疫細胞をin vitroで接触させることを含む、該免疫細胞の刺激方法を目的とする。１実施態様において、この方法はさらに、免疫細胞をマイトジェン（例えばＰＨＡ）で前処理する工程を含む。本発明は免疫細胞の性質によって限定されるものではない。１実施態様において、免疫細胞はリンパ球である。図面の説明図１は未修飾のシクロスポリンＡの構造である。図２は先行技術ですでに修飾されているシクロスポリンの構造を示す。図３は本発明の好ましいシクロスポリン類似体の構造を示す。図４はシクロスポリン類似体（配列番号１）を合成するために使用する合成戦略の概要の模式図である。図５は(±)−トレオ−β−ヒドロキシ−Ｎ−メチルロイシンの合成を示す。図６はエバンス(Evans)法による(２Ｓ，３Ｒ)−３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルロイシンの合成を示す。図７Ａはオキサゾリジノンエピマーの一方の¹ＨＮＭＲスペクトルを示す。図７Ｂはもう一方のオキサゾリジノンエピマーの¹ＨＮＭＲスペクトルを示す。図８はβ−ヒドロキシ−Ｎ−メチルロイシンの¹ＨＮＭＲスペクトルを示す。図９は［MeLeu(3-ＯＨ)¹］ＣｓＡ類似体（配列番号２）の合成を示す。図10はＣｓＡ類似体２−７断片（配列番号３および４）の合成を示す。図11はＣｓＡ類似体８−11断片（配列番号４−７）の合成を示す。図12はPyBroPによって仲介される４＋７のカップリング反応（配列番号２，８，９）を示す。図13は４＋７カップリングにおける反転変換の Wenger の報告を示す（配列番号2，10，11）。図14は［MeLeu¹］ＣｓＡ（配列番号12−20）の固相合成を示す。図15は固相法によって合成された［MeLeu¹］ＣｓＡのＮＭＲスペクトルを示す。図16は固相法によって合成された［MeLeu¹］ＣｓＡのＦＡＢＭＳスペクトルを示す。図17は好ましいＣｓＡ類似体、［MeLeu(3-ＯＨ)¹，MeAla^4,6］ＣｓＡのＮＭＲスペクトルを示す。発明の説明本発明はヒト白血球の活性および増殖を高めるための薬剤として使用するシクロスポリン誘導体に関する。本発明の説明は以下の項目から成っている。（Ｉ）未修飾シクロスポリンの性質（先行技術）；（II）既存の修飾されたシクロスポリン類似体の性質（先行技術）；(III)本発明の修飾シクロスポリン類似体の性質；および（IV）新規シクロスポリン類似体の合成。Ｉ．未修飾シクロスポリンの性質シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、真菌類の２つの菌株、Tolypocladium inflat umおよびCylindrocarpon lucidumの代謝産物として、Sandoz Inc．の研究者によって、1970年に初めて発見された。その強い in vivo免疫抑制効果は、最初にマウスを使用した試験において発見され、それに続いて臨床試験で好結果が得られ、現在は臓器移植などの処置に対する免疫応答を抑制するために、常套的に使用されている。シクロスポリンＡの魅力的な性質の１つは、それ以前の他の免疫抑制薬剤とは異なって、細胞増殖の全般的な阻害を示さないことである。リンパ球のみが阻害され、またこの薬剤はこれらのリンパ球に対して細胞障害性ではない。強い疎水性のウンデカペプチド（図１参照）であるＣｓＡは体液性および細胞性免疫の両方を抑制する。現在は、ＣｓＡはＤＮＡ合成が開始する前の、リンパ球増殖の比較的初期の段階を阻害し、そしてすでにインターロイキン−２に感作されているＴまたはＢ細胞の細胞障害性または応答を阻害しないことが一般的に信じられている。ＣｓＡの明確な作用機作は、現状では完全には明らかになっていないが、以下の点では一致している：１）ＣｓＡは細胞中の多量にある細胞質タンパク質であるシクロフィリンに主として結合する；２）ＣｓＡは内部細胞のＣａ²⁺感受性に影響を与える；および３）これらの性質とその他の未知の段階が組み合わせられて、インターロイキンおよび細胞中のその他のサイトカインの産生が減少し、それによってリンパ球の活性化および増殖が低下することになると考えられる（Cyclosporin,Mode of Action and Clinical Application,Thomson: Kluwer Academic Publishers,1989;Cyclosporine,Biological Activity and Cli nical Applications,Kahan:Elsevier Biomedical Press,1982;およびCyclospori n A,White:Grune & Stratton,1984参照）。免疫抑制剤としての明確で試験済みの有用性の他に、最近 Andrieuによって、ＣｓＡが抗ＡＩＤＳ薬としての有用であるという可能性を有することが発見された（そしてその後特許が認められた）。すなわち、ＣｓＡがＨＩＶウイルスの増殖を低下させることが示された（U.S.特許 4,814,323参照）。 II．既存の修飾されたシクロスポリン類似体の性質修飾されたシクロスポリン誘導体の生物学的および医学的効果についても、多数の研究が行なわれて来ている。これらのシクロスポリン誘導体の多くは新規な性質を示し、実際に特許にもなっている。シクロスポリン類似体の命名の規定には、未修飾のシクロスポリンＡに対して修飾したアミノ酸とその位置を提示することが含まれる。例えば、５番目のアミノ酸として、通常のバリンの代わりにセリンを有するシクロスポリン類似体であれば、（Ser⁵）−ＣｓＡという称になる。ＣｓＡ類似体はすでに合成されている。これらの類似体の生物学的活性の範囲は、未修飾のＣｓＡに等しい免疫抑制特性を有するものから、これよりも低いか、または免疫抑制活性を全く有しないものまでもある。別の新規なクラスのＣｓＡ誘導体が本発明者によって開示された［Rich,D.,Dhaon,M.,Dunlap,B.and Mill er, S.,J.Med.Chem.29:978(1986)参照］。これらのＣｓＡ類似体はすべて１位に修飾されたアミノ酸を含んでいるものであった。この他、Sandozによって開発された、(アリルgly²)-ＣｓＡ，([D]-Ser⁸)-ＣｓＡ，および(Ｏ−(2- ヒドロキシエチル)(D)Ser⁸)-ＣｓＡを含む、数種の特許されたＣｓＡ誘導体があり、これらは強い免疫抑制性、抗炎症活性、および抗寄生活性を有する（U.S.特許 4,384,9 96，4,771,122 および5,284,826 参照）。しかし、最近になって、免疫抑制剤としてではなく抗ＡＩＤＳ薬としての有用性のため、免疫抑制活性をほとんどまたは全く有していないＣｓＡの発見に重点が置かれるようになった。上述のように、最近発行されたある特許に、ＨＩＶウイルスの拡散と戦うために、未修飾のＣｓＡを使用することが記載されている。明らかに、ＣｓＡのような、免疫系は抑制しないで、ＨＩＶウイルスを不活性化することができる化合物をＡＩＤＳの治療に使用するのは好都合である。このような理由から、研究者たちはこうした特性の両方を備えたＣｓＡ類似体の研究をするようになった。これもまたSandozによる欧州特許（# 0484281A2 ）には、実際にＨＩＶの複製に対して活性であるが免疫抑制活性は有しないＣｓＡ誘導体が開示されている。 III.本発明のシクロスポリン類似体の性質新規なＣｓＡ類似体を調製する過程において、免疫刺激性のＣｓＡ類似体もまた合成し得ることが発見された。特に、［MeLeu(3-ＯＨ)¹，MeAla^4,6］ＣｓＡ（図３）および［(D)-MeVal¹¹，MeLeu(3-ＯＨ)¹]ＣｓＡ類似体が、試験したすべての濃度（例えば0.001μg/ml〜10μg/ml）において、in vitroでのヒト末梢血単球類（ＰＢＭＣ）の、マイトジェンで誘導されたＤＮＡ合成応答を増強させた（表５〜６参照）。この新規な性質はどのシクロスポリン類似体についても、これまでは述べられていない。ＣｓＡは第１に免疫抑制剤として知られているものなので、反対の効果を有するＣｓＡ誘導体の発見は全く予想されなかった。 IV．本発明のシクロスポリン誘導体の合成本発明は１，４，または６位、またはこれらのいずれかを組み合わせた位置においてアミノ酸が置換されているＣｓＡ類似体の合成に関する。これらの類似体を２つの規準：１）免疫刺激剤としての作用能力；および２）ＨＩＶウイルスの感染による細胞変性作用を阻害する能力、に基づいて試験した。２つの類似体、 [D-MeVal¹¹，L-MeLeu(3-ＯＨ)¹]ＣｓＡおよび［MeLeu(3-ＯＨ)¹，MeAla^4,6］ＣｓＡが、ＰＨＡによって誘導されるＰＢＭＣのＤＮＡ合成応答を増加させる能力によって示される、免疫刺激剤として機能することができた。さらに、後者の類似体はＨＩＶウィルスの感染による細胞変性作用を阻害することができ、したがって抗ＡＩＤＳ治療薬としての有用性を示した。本発明のこの好ましい類似体を以下の一般的な操作にしたがって合成した。１．新規なアミノ酸、L-MeLeu(3-ＯＨ)を合成し（後述）、続いてアセトンと縮合させて修飾型とした。２．ｔ−ブトキシカルボニル基（Boc ）によってＮ−保護されたメチルアラニンアミノ酸（MeAla ）を、（ビス(2- オキソ-3- オキサゾリジニル）ホスホニッククロライド）（ＢＯＰ−Ｃｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）とともに、ベンジルエステル基（ＯBzI ）によってＣ−保護されたアラニンアミノ酸（Ala ）と反応させて、ＮおよびＣ−保護MeAla-Ala ジペプチドを形成させた。３．トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）との反応によって、ＮおよびＣ−保護MeAla- Ala ジペプチドをＮ−脱保護した。４．Ｃ−保護MeAla-Ala ジペプチドを、ＢＯＰ−ＣｌおよびＤＩＥＡとともに、Boc によってＮ−保護されたバリンアミノ酸（Val ）と反応させて、ＮおよびＣ−保護Val-MeAla-Ala トリペプチドを形成させた。５．ＴＦＡとの反応によって、ＮおよびＣ−保護Val-MeAla-Ala トリペプチドをＮ−脱保護した。６．Ｃ−保護Val-MeAla-Ala トリペプチドを、ＢＯＰ−ＣｌおよびＤＩＥＡとともに、Boc によってＮ−保護されたMeAla アミノ酸と反応させて、ＮおよびＣ −保護MeAla-Val-MeAla-Ala テトラペプチド（配列番号３）を形成させた。７．ＴＦＡとの反応によって、ＮおよびＣ−保護MeAla-Val-MeAla-Ala テトラペプチド（配列番号３）をＮ−脱保護した。８．Ｃ−保護MeAla-Val-MeAla-Ala テトラペプチド（配列番号３）を、ＢＯＰ −ＣｌおよびＤＩＥＡとともに、Boc によってＮ−保護されたα−アミノ酪酸− サルコシンジペプチド（Abu-Sar ）と反応させて、ＮおよびＣ−保護Abu-Sar-Me Ala-Val-MeAla-Ala ヘキサペプチド（配列番号４）を形成させた。９．ＴＦＡとの反応によって、ＮおよびＣ−保護Abu-Sar-MeAla-Val-MeAla-Al a ヘキサペプチト（配列番号４）をＮ−脱保護した。 10．Ｃ−保護Abu-Sar-MeAla-Val-MeAla-Ala ヘキサペプチド（配列番号４）を、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯBt）、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）、およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とともに、工程１の修飾MeLeu(3-ＯＨ)アミノ酸と反応させて、ＮおよびＣ−保護MeLeu(3-ＯＨ)-Abu-S ar-MeAla-Val-MeAla-Ala ヘプタペプチド（配列番号５）を形成させた。 11．水性塩酸およびメタノールとの反応によって、ＮおよびＣ−保護ヘプタペプチド（配列番号５）をＮ−脱保護した。 12．Boc 基によってＣ−保護されたメチルバリンアミノ酸（MeVal ）を、ＢＯＰ−ＣｌおよびＤＩＥＡとともに、Cbz 基によってＮ−保護されたメチルロイシンアミノ酸（MeLeu ）と反応させて、ＮおよびＣ−保護 MeLeu-MeValジペプチドを形成させた。 13．触媒による水素化によって、ＮおよびＣ−保護ジペプチドをＮ−脱保護した。 14．このＣ−保護ジペプチドを、ＢＯＰ−ＣｌおよびＤＩＥＡとともに、Cbz 基によってＮ−保護されたメチルロイシンアミノ酸（MeLeu ）と反応させて、ＮおよびＣ−保護 MeLeu-MeLeu-MeValトリペプチドを形成させた。 15．触媒による水素化によって、ＮおよびＣ−保護トリペプチドをＮ−脱保護した。 16．このＣ−保護トリペプチドを、ＢＯＰ−ＣｌおよびＤＩＥＡとともに、Fm oc基によってＮ−保護されたＤ−アラニンアミノ酸と反応させて、ＮおよびＣ− 保護 D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeValテトラペプチド（配列番号２）を形成させた。 17．トリフルオロ酢酸との反応によって、ＮおよびＣ−保護テトラペプチド（配列番号２）をＣ−脱保護した。 18．工程11のＣ−保護ヘプタペプチド（配列番号５）を、ＢＯＰ−ＣｌおよびＮＭＭとともに、工程17の９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）によってＮ−保護された（Ｄ）−アラニン−メチルロイシン−メチルロイシン−メチルバリンテトラペプチド（配列番号２）（D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal ）と反応させて、ＮおよびＣ−保護 D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu(3-ＯＨ)-Abu-Sar-MeAla -Val-MeAla-Alaウンデカペプチド（配列番号６）を形成させた。 19．水性水酸化ナトリウム、エタノール、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）およびプロピルホスホン酸無水物（Pr−ＰＯ₂）₃と反応させることによって、ＮおよびＣ−保護 D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu(3-ＯＨ)-Abu-Sar-MeAla -Val-MeAla-Alaウンデカペプチド（配列番号６）を環化させ、シクロスポリン類似体（配列番号21）を形成させた。実験以下の例は本発明の好ましい態様と特長のいくつかを説明するために示すのであって、これらの範囲を限定するものと解釈されるべきではない。以下の実験の開示において、次の略語を使用する：MeBmt([(4R)-Ｎ−メチル-4 - ブテニル-４-メチル-Ｌ-トレオニン])；Abu（α−アミノ酪酸）；MeLeu(3-ＯＨ）（3-ヒドロキシ-Ｎ-メチルロイシン）；Sar(サルコシン)；MeAla(Ｎ−メチルアラニン)；Gly(グリシン)；Ala(アラニン)；Val(バリン)；Leu(ロイシン)；I le(イソロイシン)；Met(メチオニン)；Pro(プロリン)；Phe(フェニルアラニン) ；Trp(トリプトファン)；Ser(セリン)；Thr(トレオニン)；Cys(システイン)；Ty r(チロシン)；Asp(アスパラギン)；Gln(グルタミン)；Asp(アスパラギン酸)；Gl u(グルタミン酸)；Lys(リジン)；Arg(アルギニン)；His（ヒスチジン）；Fmoc（ 9-フルオレニルメトキシカルボニル）；ＨＯBt（1-ヒドロキシベンゾトリアゾール）；ＢＯＰ−Ｃｌ（ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル）ホスホニッククロライド）；ＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）；ＤＣＵ（ジシクロウレア）；ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）；ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）；ＤＭＡＰ（4-ジメチルアミノピリジン）；(Pr-ＰＯ₂)₃(プロピル−ホスホン酸無水物)；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；ＯBzl（ベンジルエステル）；PyBro Ｐ（ブロモトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）；EtＯ Ac（酢酸エチル）；ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）；ＨＡＴＵ［Ｏ-(7-アザベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,2,2,- テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート］；ＮＭＲ（核磁気共鳴分光法）；ＦＡＢＭＳ（高速原子衝撃質量分析）；hsp70(熱ショックタンパク質)；MeVal(Ｎ−メチルバリン)；Boc(t-ブトキシカルボニル)；ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）；ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）；MeLeu(Ｎ−メチルロイシン)；MeＯＨ（メタノール）；ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）。実施例１：ＣｓＡ類似体の合成ＣｓＡの全合成については、Wengerによって最初に報告された（上述）。その戦略は、図４における矢印の方向にＣｓＡを組み立てて行く経路をとる（配列番号１）。環化の位置としては、以下の２つの理由により、Ala⁷と(D)-Ala⁸の間のペプチド結合の位置を選択した：１）両方のアミノ酸がＮ−メチル基を有していないので、Ｎ−メチルアミノ酸に比較して結合の形成が容易である；２）直鎖状ウンデカペプチド内に分子内水素結合が存在すると考えられ、これによって折畳まれたコンフォメーションでの直鎖状ウンデカペプチドを安定化するので閉環が助長される。直鎖状ウンデカペプチドの合成のためには、テトラペプチド（残基８−11）（配列番号２）とヘプタペプチド（残基１−７）（配列番号10）の断片カップリングの手法を選択した。ヘプタペプチド断片（配列番号10）は、ジペプチド（残基２−３）とテトラペプチド（残基４−７）の断片カップリングと、それに続いて合成の最後にアミノ酸MeBmt を導入することによって調製した（好ましい類似体において、このアミノ酸が新規アミノ酸MeLeu(3-ＯＨ)に置換されたことに注意されたい）。この配列は２つの明白な利点を有する：１）サルコシン（残基３）への断片カップリングでラセミ化の可能性が防止された；２）重要な１−位置のアミノ酸の導入後の工程数が最少となった。このウンデカペプチドはＮ−およびＣ−末端保護基を除去した後、環化してＣｓＡにすることができた。残基３−８において修飾された［MeLeu(3-ＯＨ)¹］ＣｓＡ類似体の合成は、最初の記載にしたがって実施した［Colucci,W.J.,Tung,R.D.,Petri,J.A.and Rich, D.H.,J.Org.Chem.55:2895(1990)参照］。Ｈ-Ala-ＯBzlから出発し、一連のカップリング脱保護操作において適切なアミノ酸を順番に添加することによって、ＣｓＡ２−７を構築した（図10）（配列番号３および４）。Ｎ−末端Boc 基を脱保護した後、ＢＯＰ−Ｃｌ／ＤＩＥＡ法を使用して、合成されたテトラペプチドと Boc-AbuSar−ＯＨを縮合させ、ヘキサペプチドを生成させた。ＴＦＡによってＮ −Boc 基を除去した後、対応するアミノ−ヘキサペプチドが得られ、次の反応に即時に使用した。ＢＯＰ−Ｃｌ仲介カップリングおよびＮ−脱保護のためのペプチド断片の旋光性および収率を表１および２にまとめて示す（配列番号３：22− 26）。その後、図９に示すように、ＤＣＣ／ＨＯBt法を使用して、利用するヘキサペプチドをアセトン化で保護したMeLeu(3-ＯＨ)によってアシル化し、所望の保護ヘプタペプチドを生成させた（82−90％）（配列番号２）。これらのヘプタペプチドは、ＮＭＲによると、ＣＤＣｌ₃中で、Ｎ−メチルアミドの配座異性体による２つの主要な配座異性体として表される。ヘプタペプチドのアセトン化保護基の除去をメタノール中 1M ＨＣｌを使用して、15時間実施した。生成したアミノ−ヘプタペプチドをフラッシュクロマトグラフィーによって精製した（85− 90％）。Ｈ-MeVal-Bocから出発し、一連のカップリング−脱保護操作において適切なアミノ酸を順番に添加することによって、ＣｓＡ８−11を構築した（図11）（配列番号５−７）。［より詳細な操作については、Tung,R.D.,Dhaon,M.K.and Rich,D.H.,J.Org.Chem.51:3350(1986)を参照されたい］。ＣｓＡ８−11テトラペプチドとヘプタペプチドのカップリングについては、この連鎖を達成するために、CastroのＢＯＰ−Ｃｌ試薬およびＮ−メチルモルホリンを使用した。生成したウンデカペプチドは通常、ＣｓＡの場合についてWengerによって報告された73％に比較して、45−62％と相対的に低い収率であった［Wenger,R.M.,Helv.Chim.Ac ta. 67:501(1984)参照］。線（−）は酸−アミンカップリングによって形成された新しいペプチド結合の位置を示している。最近、ペプチド合成のためのカップリング試薬として、PyBroＰ（ブロモトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、PyCloＰ,およびPy BoＰの略語で示されるあるタイプのピロリジノホスホニウム錯体が報告された［ Coste,J.,Frerot,E.,Joulin,P.and Castro,B.,Tetrahedron Lett.32:1967(1991) 参照］。Castroの報告によると、PyBroＰ/ＤＩＥＡを使用することによって、Ｎ −メチルアミノ酸を効果的にカップリングさせることができた。ウンデカペプチドの合成に関して、４＋７のカップリングが低収率であるので、図12に示すように、ＤＩＥＡ（４当量）の存在下でテトラペプチド（1.5 当量）とヘプタペプチドをカップリングさせるのに、PyBroＰ（1.5当量）を使用してみた。期待したように、PyBroＰはカップリング反応をすすめ、４時間で完結させた。しかし、PyBro Ｐを使用しても、ＴＬＣにおいて複数のスポットがあらわれ、生成物の収率は改善されなかった（わずかに32％）。この予期しなかった結果は、主要生成物として（MeVal 残基における(Ｄ)立体配置を有する）エピマー化したウンデカペプチドが得られたためである。ラセミ化はPyBroＰでのテトラペプチドのカルボキシル基の活性化の間に生じる臭化水素の形成によるもので、これが原因でＣ−末端残基[MeVal¹¹]がエピマー化したものと推測された。［The Pepti des:Analysis,Synthesis,Biology(Vol.1)Academic Press,Inc.(1979)］。同様の結果がWengerによって報告されている（上述）（図13参照）。この場合、混合ピバール酸無水物法（ピバロイルクロライド／Ｎ−メチルモルホリンを使用）によると、テトラペプチド（配列番号２）Boc-(D)-Ala-MeLeu-MelLeu-L-MeV al−ＯＨと対応するヘプタペプチドを結合させたとき、（MeVal 位置において）立体配置が逆転されたウンデカペプチド（配列番号11）Boc-(D)-Ala-MeLeu-MeLe u-(D)-MeVal-MeBmt-Abu-Sar-Meleu-Val-MeLeu-MeLeu-Ala-ＯBzl が得られた。どちらの場合も、エピマー化は、反応溶媒中の高濃度のハロゲン化物によるものと考えられる。カップリング反応を完結させるのに３日間を要したけれども、MeVal のラセミ化が最少となることから、ＣｓＡの合成における４＋７断片カップリングには、ＢＯＰ−Ｃｌ試薬の方がやはり好ましい。最終の環化を完結させるため、エタノール中の0.2 N の水性ＮａＯＨと５−12時間反応させることによって、ウンデカペプチドのＮ−FmocおよびＣ−Bzl 保護基を同時に除去した（図11参照）。完成後、プロピルホスホン酸無水物（1.5 当量）およびＤＭＡＰ（６当量）を用いて希釈溶液（〜２×10^-4M ）中で２日間、完全に脱保護した粗ウンデカペプチド（配列番号５−７）を環化し、ＣｓＡ類似体が37−60％の収率で得られた。これらのＣｓＡ類似体およびその直鎖状ウンデカペプチド中間体の物理特性を表３に要約した。実施例２：一般的合成操作一般的操作Ａ：β−ヒドロキシ−Ｎメチルロイシン(MeLeu(ＯＨ))の合成［U.Angew.Chem.Int.Ed.16:339(1977)参照］を適用した、MeLeu(3-ＯＨ)の合成図式が報告されている［Rich,D.H.,Dhaon,M.K.,Dunlap,B.and Miller,S.P.F,J.M ed.Chem.29:978(1986)参照］（図５）。ＮａＣＮの存在下でイソシアノアセテートをイソブチルアルデヒドと反応させて、主要生成物として熱力学的に安定なトランス−オキサゾリンを得た。このトランス−オキサゾリンを室温においてメチルトリフレートで処理し、Ｎ−メチルイミデートを生成させた。このＮ−メチルイミデートを希釈ＨＣｌで加水分解し、次にこのアミノ酸をイオン交換クロマトグラフィーにかけて、(±)−トレオ-β-ヒドロキシ-Ｎ-メチルロイシンを得た。同時期に、MeBmt および他のキラルアミノ酸の合成について、Evans およびWe ber によって、巧妙な不斉グリシンエノラート反応が開発された［Evans,D.A.an d Weber,A.E.,J.Am.Chem.Soc.108:6757(1986)］。MeLeu(ＯＨ)を調製するため、この合成法をも適用した［図６参照］。この反応連鎖において、対応するクロロアセテートからアジド置換によって、キラルグリシンシントンイソチオシアネートが56％の収率で得られた。スズ（II）トリフレート仲介アルドール反応（-7 8 ℃で４時間）によって、このイソチオシアネートキラル補助物質をイソブチルアルデヒドと縮合させ、アルドール付加物を63％の収率で得た（＞90％e.e ）。メタノール中のマグネシウムメトキシド溶液によって、室温で３分間エステル交換反応させて、メチルエステルを78−82％の収率で得た。ビス−メチル化の収率は、MeBmt 合成におけるEvans の76％に比較して低く、52％であった。通常２つのエピマーが１：５の比率で得られるが、これについては、MeBmt 合成において、Evans は認知していない。表４および図７に示すように、これらのエピマーの¹ ＨＮＭＲスペクトルを比較した。所望のトランス−オキサゾリジノンを２N ＫＯＨによって還流下で加水分解し、Sephadex LH-20上でのクロマトグラフィー精製の後、純β−ヒドロキシ-Ｎ-メチルロイシンを得た（図８の¹ＨＮＭＲスペクトル参照）。一般的操作Ｂ：ＣｓＡテトラペプチド断片８−11（配列番号２）の合成ジオキサン20 mL 中の11番目のアミノ酸（3.01 g,13 mmol）溶液をｐ−トルエンスルホン酸１水和物 4.95 g（26 mmol）と反応させ、還流下で40分（ＣａＣｏ₃ 乾燥管中）加熱した。混合物を氷／水浴中で冷却し、その後、厚手の耐圧フラスコに移し、78℃であらかじめ濃縮したイソブチレン 25 mLで処理した。このフラスコに蓋をし、室温で19時間激しく撹拌し、冷却後、蓋をはずし、内容物を低温希釈水性ＮａＯＨ中に注いだ。混合物をｐＨ＝10に調整し、その後エーテルで抽出した（２×25 mL ）。有機層を１つにまとめ、乾燥および蒸発させて、残渣を蒸留することによって、Boc でＣ−保護された11番目のアミノ酸を得た。 Boc でＣ−保護された11番目のアミノ酸（2.28 g ,15mmol ）の溶液を、ＣＨ₂ Ｃｌ₂200 mL中で、Ｎ−保護された10番目のアミノ酸 4.19 g(15.1 mmol)と反応させ、不活性雰囲気下で氷／水浴中で撹拌しながら冷却した。冷却混合物をＤＩＥＡ（5.75 mL，32.3 mmol）で、その後ＢＯＰ−Ｃｌ（4.19 g ,16.5 mmol ）で処理した。混合物を低温で２時間撹拌し、真空濃縮した。残渣を水および酢酸エチル間に分配し、有機層を分離して、ＫＨＳＯ₄，Ｈ₂Ｏ，1 N ＮａＨＣＯ₃,50％ブライン、およびブラインで洗浄した。Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥した後、真空濃縮して黄色油を得、シリカゲル 300 gのフラッシュクロマトグラフィーで精製し、7. 5％アセトン／ヘキサンで溶離させて、ＮおよびＣ−保護された10−11ジペプチドが得られた。２−プロパノール 40 mL中のＮおよびＣ−保護された10−11ジペプチド（4.65 g,10.4 mmol）の溶液にＮ₂を送り込み、炭素上10％Pd 500 mg で処理した。混合物を水素雰囲気下に置き、14時間撹拌し、その後窒素を送り、セライトパッドを通して濾過し、真空濃縮した。次に、残渣を0.5 N ＨＣｌ 150 mL で処理し、その後これを 5％水酸化アンモニウムでｐＨ＝９の塩基性としたエーテル（２ｘ）で洗浄し、再びエーテル（３ｘ）で洗浄した。これらの最後の抽出物を１つにし、50％ブラインおよびブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥した。その後化合物を真空濃縮し、Ｃ−保護された10−11ジペプチドが得られた。ＣＨ₂Ｃｌ₂120 mL中のＣ−保護ジペプチド（2.75 g，8.75mmol ）およびＤＩＥＡ（3.2 mL,18.4 mmol）の溶液を不活性雰囲気下で氷／水浴中で撹拌しながら冷却した。冷却混合物をＮ−保護された９番目のアミノ酸 2.57 g(9.2 mmol)およびＢＯＰ−Ｃｌ 2.34 g(9.2 mmol)で同時に処理した。混合物を徐々に10℃まで加熱しながら24時間撹拌した。Ｈ₂Ｏ，10％ＫＨＳＯ₄，1 N ＮａＨＣＯ₃,50％ブライン、およびブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、真空濃縮して黄色油を得た。シリカゲル 250 g上で精製し、7.5 ％アセトン／ヘキサンで溶離させて、ＮおよびＣ−保護された９−10−11トリペプチドが得られた。上記のＣおよびＮ−保護10−11ジペプチドと同様に、２−プロパノール 30 mL および炭素上10％Ｐｄ 300 mg を使用して、ＣおよびＮ−保護９−10−11トリペプチドの水素添加を実施した。しかし、この場合は、水素添加混合物からの残渣を水性ＨＣｌで処理すると塩化水素塩が形成され、これを５％ＮＨ₄ＯＨで処理し、混合物をエーテル（３ｘ）で抽出した。有機層を１つにし、水およびブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、濃縮して、Ｃ−保護された９−10−11トリペプチドが得られた。ＣＨ₂Ｃｌ₂75 mL中のＣ−保護９−10−11トリペプチド（2.33 g，5.44 mmol）およびＤＩＥＡ 1.99 mL(11.1 mmol)の溶液を不活性雰囲気下で氷／水浴中で撹拌しながら冷却した。冷却混合物をＮ−保護された８番目のアミノ酸(1.78 g,5. 72 mmol )およびＢＯＰ−Ｃｌ(1.46 g，5.74 mmol)で同時に処理した。混合物を４−６℃の低温室に移し、17時間反応させた。得られた生成物を上記のＣおよびＮ−保護された９−10−11トリペプチドと同様に操作し、シリカゲル 200 g上でクロマトグラフィーにかけ、15％アセトン／ヘキサンで溶離させて、ＮおよびＣ −保護された８−９−10−11テトラペプチド断片（配列番号２）が得られた。一般的操作Ｃ：ＣｓＡヘキサペプチド断片２−７（配列番号26）の合成ＣＨ₂Ｃｌ₂250 mL中Boc 基によりＮ−保護された６番目のアミノ酸（10.31 g, 42.02mmol）およびＤＩＥＡ（7.67 mL,44.0 mmol）の溶液をＮ₂下で氷／水浴中で撹拌しながら冷却し、ＢＯＰ−Ｃｌ 11.21 g(44.02 mmol)で処理し、懸濁物を 2.5 時間激しく撹拌した。この混合物に、ＣＨ₂Ｃｌ₂6 mL中ＯBzl 基によりＣ− 保護された７番目のアミノ酸（7.298 g,40.72 mmol）およびＤＩＥＡ（7.67 mL, 44.0 mmol）の溶液を分割せずに添加した。混合物をＣａＳＯ₄乾燥管下に置き、５℃の低温室で一晩撹拌した。次に、この溶液をエーテル（３ｘ容量）および水（２ｘ容量）中に注ぎ入れた。有機層を分離し、10％水性ＫＨＳＯ₄，Ｈ₂Ｏ，1 N ＮａＨＣＯ₃,50％ブライン、およびブラインで洗浄した。ＭｇＳＯ₄上で乾燥した後、真空濃縮し、シリカゲル 400 g上のクロマトグラフィーによって精製し、10％アセトン／ヘキサンで溶離させて、ＮおよびＣ−保護された６−７ジペプチドが得られた。ＮおよびＣ−保護された６−７ジペプチド 8.946 g(22 mmol)をメチレンクロライド中50％ＴＦＡによって脱保護し、中和、メチレンクロライドへの抽出、および蒸発の後、定量収率のＣ−保護された６−７ジペプチドが得られた。Ｃ−保護された６−７ジペプチド 1.9 g(6.2 mmol)およびＢＯＰ−Ｃｌ 2.21 g(8.68 mmol)をメチレンクロライド 30 mLに添加した。懸濁液を不活性雰囲気下で０℃に冷却し、高速で撹拌した懸濁液に、メチレンクロライド 30 mL中のＮ− 保護された５番目のアミノ酸（2.44 g,8.68 mmol）およびＤＩＥＡ（3.0 mL,17m mol）の混合物を６時間かけて滴下した。反応物をさらに５℃で14時間撹拌し、その後濃縮して濃い油状の残渣とし、これを直接シリカゲル 180 gに適用し、20 −30％ EtＯAc/ヘキサンで溶離させて、ＮおよびＣ−保護された５−６−７トリペプチドを得た。ＮおよびＣ−保護された５−６−７トリペプチド 5.7 g(10 mmol)をアニソール 1.52 mL(14 mmol)およびジオキサン 7.8 mL に添加し、不活性雰囲気下で０ ℃に冷却し、０℃に予冷した 5.8M ＨＣｌ−ジオキサン（17.2 mL,ＨＣｌ 100 m mol ）溶液で処理した。０℃で２時間、さらに５℃で12時間撹拌した後、混合物を減圧下で回転蒸発（rotovaped ）させた。さらに真空乾燥して、Ｃ−保護された５−６−７トリペプチドを単離し、そのまま次の工程で使用した。メチレンクロライド 120 mL 中Fmoc基でＮ−保護された４番目のアミノ酸（ 4 .41 g,12 mmol ）を不活性雰囲気下で０℃に冷却した。この溶液にオキザリルクロライド（2.3 mL,26.4 mmol）を分割せずに添加し、数分後、触媒量のＤＭＦ（ 120μl）を添加した。２時間後、前節に記載したように、混合物をロータリーエバポレーター上で濃縮し、次のカップリング操作で使用した。メチレンクロライド 30 mL中のＣ−保護された５−６−７トリペプチド（10.0 mmol ）を不活性雰囲気下で０℃に冷却し、メチレンクロライド 30 mL溶液としてFmoc−４番目アミノ酸の全収量（12.0 mmol ）で処理した。撹拌した溶液に、メチレンクロライド 30 mL中のＤＩＥＡ（4.2 mL,24 mmol）を１時間かけて滴下した。０℃で３時間後、反応物をメチレンクロライド 90 mLで希釈し、1 M ＫＨＳＯ₄および50％ブラインで洗浄した。有機層を濃縮し、ジエチルエーテル／酢酸エチル混合物で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ₃，50％ブライン、ブラインで洗浄した。ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、真空濃縮した後、生成したＣおよびＮ−保護された４−５−６−７テトラペプチド（配列番号23）をシリカゲル700 g 上でクロマトグラフィーにかけた。ＣＨ₃ＣＮ 30 ml中のＣおよびＮ−保護された４−５−６−７テトラペプチド（配列番号23）（3.2 g,6 mmol）溶液を、不活性雰囲気下氷上で冷却しながら、同容量のＤＩＥＡで処理した。０℃で３時間撹拌した後、溶液を真空で濃縮し、残渣をＣＨ₃ＣＮ 20 mLで処理し、再び濃縮した。これをメチレンクロライド60m LおよびＤＩＥＡ 2.31 mL(13.2 mmol)で処理し、その後不活性雰囲気下で０℃に冷却した。氷冷撹拌溶液に、ＢＯＰ−Ｃｌ（1.83 g,7.2 mmol ）とともに２−３ジペプチド（1.81 g,6.6 mmol ）を添加した。０℃で５時間後、反応混合物を真空で濃縮し、残渣をジエチルエーテル／酢酸エチル混合物に溶解した。有機層を分離し、10％水性ＫＨＳＯ₄，Ｈ₂Ｏ，1 N ＮａＨＣＯ₃,50％ブライン、およびブラインで洗浄した。ＭｇＳＯ₄上で乾燥した後、真空濃縮し、シリカゲル 400 g 上のクロマトグラフィーによって精製し、30％アセトン／ヘキサンで溶離させて、ＮおよびＣ−保護された２−３−４−５−６−７ヘキサペプチドが得られた。ヘキサペプチド 868 mg(1.1 mmol)をメチレンクロライド 1.5 mL 中ＴＦＡ 5. 5 mL と -15℃で14時間反応させることによって、ＮおよびＣ−保護された２− ３−４−５−６−７ヘキサペプチド（配列番号26）をＮ−脱保護し、操作後、Ｃ −保護された２−３−４−５−６−７ヘキサペプチド（配列番号26）が得られた。一般的操作Ｄ：ＣｓＡヘプタペプチド断片１−７の合成蒸留直後のアセトン（60ml ）中のMeBmt またはMeLeu(3-ＯＨ)（0.2 mmol,1当量）の懸濁液を、ほぼ透明な溶液になるまで、Ｎ₂下で24時間加熱して還流させた。MeBmt またはMeLeu(3-ＯＨ)のアセトン化物溶液を真空濃縮して1.5 mlとし、それ以上精製せずにそのまま次の連結反応に使用した。アセトン（1.5 ml）中の調製直後のアセトン化保護アミノ酸（0.2 mmol,1当量）に、ＴＨＦ 3 ml 、Ｎ−メチルモルホリン（0.22 mmol，1.1当量）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.44 mmol，2.2当量）、およびヘキサペプチドアミン（0.22mmol，1.1当量）を添加した。調製した混合物を０℃に冷却し、ＤＣＣ（0 .22 mmol，1.1当量）を添加した。混合物を室温まで昇温させ、Ｎ₂下で20時間撹拌し、その後、沈殿したジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）を濾過によって除去し、少量のＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。一つにした濾液を飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥した。真空で濃縮し、残渣をEtＯAcに溶解し、さらにＤＣＵを得た。２回目の濾過および真空乾燥後に残った残渣を、蒸留直後のｎ −ヘキサン中の10−40％アセトンでのクロマトグラフィーによって精製し、Ｎ，Ｏ−イソプロピリデン保護されたヘプタペプチド１−７を得た。ＭｅＯＨ 3 ml 中のＮ，Ｏ−イソプロピリデンヘプタペプチド（0.156 mmol）溶液を、 1N ＨＣｌ水性溶液（0.6 mmol,4当量）とともに室温で15時間撹拌した。反応混合物をＮａＨＣＯ₃（2 mmol）で処理し、真空濃縮して白色固体とした。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂中２％MeＯＨに入れて、ＣＨ₂Ｃｌ₂中２〜４％MeＯＨを使用してフラッシュクロマトグラフィーにかけ、１−７ヘプタペプチド（配列番号10 ）を得た。一般的操作Ｅ：直鎖状非環化ＣｓＡ類似体の合成ＣＨ₂Ｃｌ₂（2 ml）中Ｎ−保護されたヘプタペプチド（残基１−７）（配列番号：10）（0.1 mmol）およびテトラペプチドアミン（残基８−11）（配列番号２）（0.15 mmol，1.5当量）溶液を、Ｎ−メチルモルホリン（0.2 mmol）で、そして次にＢＯＰ−Ｃｌ試薬で処理した。反応混合物を密封し、Ｎ₂下、室温で３日間撹拌した。その後、混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂（15 ml ）および水（10 ml ）で希釈した。水性層からさらにＣＨ₂Ｃｌ₂（3×10 ml）で抽出し、一つにまとめた有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、真空濃縮した。生成残渣を、シリカゲル上で蒸留直後のｎ−ヘキサン中10−40％アセトンを使用したフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、完全に保護された純ウンデカペプチド（配列番号27）を得た。もう一方のウンデカペプチドエピマーまたは未反応物質と考えられる、より高いＲ_f値の不純物類は、通常はクロマトグラフィー操作で分離された。一般的操作Ｆ：環化ＣｓＡ類似体の合成 EtＯＨ（2 ml）中の保護されたウンデカペプチド（0.05 mmol ）溶液にＮ₂を送り込み、０℃に冷却した。混合物を0.2 N ＮａＯＨ溶液（0.5 ml）で処理し、 1.5 時間撹拌した。さらに0.2 N ＮａＯＨ溶液（0.25 ml）を追加し、０℃で 3. 5−12時間撹拌し続けた。その後、反応混合物を 0.2N ＨＣｌ溶液（0.75 ml ）でｐＨ６に中和し、ブライン（10ml ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂（20 ml ）で洗浄した。水性層からさらにＣＨ₂Ｃｌ₂（4×10 ml）で抽出した。一つにまとめた有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、真空濃縮して乾燥し、透明な油状物を得て、これをそのまま次の反応に使用した。この油状の残渣（0.05 mmol ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（200 ml）に溶解し、ＤＭＡＰ（ 0.25 mmol ）およびプロピルホスホン酸無水物（Fluka 製のＣＨ₂Ｃｌ₂中 50％w /v溶液）で順次処理した。反応混合物をＮ₂下、室温で２日間撹拌し、1−2 mlに濃縮し、直接シリカゲルカラムに適用した。蒸留直後のｎ−ヘキサン中10−40％アセトンを使用したフラッシュクロマトグラフィーによって、純環状ウンデカペプチド化合物が得られた。実施例３：好ましいＣｓＡ類似体、［Me(3-ＯＨ)Leu⁽¹⁾,MeAla⁽⁴⁾,MeAla⁽⁶⁾］ＣｓＡのための、特定の実験的合成操作特定の実験操作Ａ：β−ヒドロキシ-Ｎ-メチルロイシン(MeLeu(3-ＯＨ))の合成イソブチルアルデヒド(0.3 ml,3.2 mmol)とイソチオシアネートキラル補助物質（1.3 g,4.8 mmol）を縮合させて、泡状固体の(４Ｓ)-3-((4'Ｓ,5'Ｒ)-5'- イソプロピル-2'-チオキソ-4'-オキサゾリジニルカルボニル)-4-( フェニルメチル )-2-オキサゾリジノン 0.6 g（54％）が得られた。このアルドール付加物（550 mg,1.58 mmol）を加水分解して、透明油状のメチル(4Ｓ,5Ｒ)-5-イソプロピル-2- チオキソ-4- オキサゾリジン-4- カルボキシレート（240 mg(75％)）が得られた。このカルボキシレート（700 mg,3.45 mmol）を Meerwein 試薬（トリメトキソニウムテトラフルオロボレート）で処理し、透明油状のメチル(4Ｓ,5Ｒ)-5-イソプロピル-3- メチル-2- オキサゾリジノン-4- カルボキシレート 246 mg(35％) が得られた。(４Ｒ)-エピマーは泡状固体（104 mg，14％）として得られた。このメチルエステル（150 mg,0.75 mmol）を0.2 N ＫＯＨで加水分解し、Seph adex LH-20で精製して、白色固体の(2Ｓ,3Ｒ)-3-ヒドロキシ-Ｎ-メチルロイシンが得られた。特定の実験操作Ｂ：ＣｓＡテトラペプチド断片８−11，(D)-Ala-MeLeu-MeLeu- MeVal （配列番号２）の合成一般的操作Ｂにしたがって、［[(9-フルオレニルメチル)オキシ]カルボニル］ -Ｄ-アラニル-Ｎ-メチル-Ｌ-ロイシル-Ｎ-メチル-Ｌ-ロイシル-Ｎ-メチル-Ｌ-バリン t−ブトキシエステル（Fmoc-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-Boc）を合成し、85 ％の収率で、泡状固体として得られた。特定の実験操作Ｃ：ＣｓＡヘキサペプチド断片２−７，Abu-Sar-MeAla-Val-Me Ala-Ala （配列番号26）の合成一般的操作Ｃにしたがって、Ｌ−2-アミノブチリル−サルコシル-Ｎ-メチル- Ｌ- アラニル-Ｌ-バリル-Ｎ-メチル-Ｌ-アラニル-Ｌ-アラニンベンジルエステルＨ Leu-Abu-Sar-MeAla-Val-MeAla-Ala-OBzl ）を合成し、65％の収率で、泡状固体として得られた。特定の実験操作Ｄ：ＣｓＡヘプタペプチド断片１−７，MeLeu(3-ＯＨ)-Abu-Sa r-MeAla-Val-MeAla-Ala （配列番号５）の合成一般的操作Ｄにしたがって、(4Ｓ,5Ｒ)-2,2,3-トリメチル-5-イソプロピル-4- （オキサゾリジニル）−カルボニル]-L-2-アミノブチリル−サルコシル-Ｎ-メチル-Ｌ-アラニル-Ｌ-バリル-Ｎ-メチル-Ｌ-アラニル-Ｌ-アラニンベンジルエステル（Ｎ,Ｏ-イソプロピリデン-Me(3-ＯＨ)Leu-Abu-Sar-MeAla-Val-MeAla-Ala-OBz l ）を合成し、55％の収率で、泡状固体として得られた。一般的操作Ｄにしたがって、(2Ｓ,3Ｒ)-3-ヒドロキシ-Ｎ-メチル−ロイシル- Ｌ−2-アミノブチリル−サルコシル-Ｎ-メチル-Ｌ-アラニル-Ｌ-バリル-Ｎ-メチル-Ｌ-アラニル-Ｌ-アラニンベンジルエステル（Ｈ-Me(3-ＯＨ)Leu-Abu-Sar-MeA la-Val-MeAla-Ala-OBzl ）を合成し、62％の収率で、泡状ガラス体として得られた。特定の実験操作Ｅ：直鎖状非環化ＣｓＡ類似体（配列番号６）の合成一般的操作Ｅにしたがって、［[(9-フルオレニルメチル)オキシ]カルボニル］ -Ｄ-アラニル-Ｎ-メチル-L- ロイシル-Ｎ-メチル-Ｌ-ロイシル-Ｎ-メチル-Ｌ-バリル-[(2Ｓ,3Ｒ)-3-ヒドロキシ-Ｎ-メチル−ロイシル]-Ｌ-2-アミノブチリル− サルコシル-Ｎ-メチル-Ｌ-アラニル-Ｌ-バリル-Ｎ-メチル-Ｌ-アラニル-Ｌ-アラニンベンジルエステル（Fmoc-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-Me(3-ＯＨ)Leu-Abu-S ar-MeAla-Val-MeAla-Ala-OBzl ）を合成し、34％の収率で、泡状固体として得られた。実施例５：ＣｓＡ類似体の免疫刺激特性以下の操作によって、本請求の範囲のＣｓＡ類似体の新規な免疫刺激特性を測定した。最初に、健康なドナーからのＰＢＭＣをヒストパック(histopaque)(Sigma)上の密度遠心分離によって単離した。このＰＢＭＣを１μg/mlのＰＨＡで活性化し、いずれも連続希釈したＣｓＡまたはＣｓＡ類似体を存在させて、1 x10⁵細胞／ウェルでプレートに播いた。細胞を３日間インキュベートした後、³Ｈ-チミジンでパルスし、翌日採取した。シンチレーション計数によって放射活性の量を測定した。結果を表５に示す。その後、研究を発展させて、さらに８人のヒトドナーから得られたＰＢＭＣに前記の操作を実施することによって、本請求の範囲のＣｓＡ類似体の免疫刺激特性を試験した。結果は個体間で免疫刺激性にわずかな程度の差異を示しているが、免疫刺激効果の実質的な性質は一定である。このデータを表６に示す。実施例６：ＣｓＡ類似体の固相合成ＣｓＡの免疫抑制以外の他の生物学的活性に関する、構造と活性の関係については全く未知である。先行文献によれば、今のところ、可能なＣｓＡ誘導体の中のわずかな部分しか合成されていない。その上、いくつかのＣｓＡ置換体が共同して作用するので、大部分が１つのアミノ酸の置換体から得られた、現存のデータベースからは、多重置換ＣｓＡ誘導体の活性を予測することはできない。ＣｓＡ誘導体に関して構造と機能の関係を演繹する唯一の論理的操作は、多数の誘導体を合成し、続いてこれらを生物学的活性についてスクリーニングするものである。この操作には、ＣｓＡ誘導体の合成の新規な方法、特に固相技術が必要である。新規なＣｓＡ類似体を合成する過程において、出願人は固相法によってＣｓＡ類似体の前駆体を合成する方法を発見した。溶液中においてＣｓＡおよび類似体を全合成するための有効な方法は数年間利用されているが、固相合成法によるＣｓＡの合成は成功していない。その理由の一端は、立体的に束縛された、またはＮ−メチル化アミノ酸の従来のカップリング操作では、固相合成条件下では不完全な連結が生じることがよくある結果、欠陥がある配列となるためである。その後、出願人は以下のような固相合成操作にしたがって、完全な環状ＣｓＡ誘導体を合成することができた。図14に概略を示す（配列番号12−20）。１）ＭＢＨＡ（メチルベンズヒドリルアミン）ポリスチレン樹脂に延長させるペプチド鎖を連結するのに、ＰＡＣ（ｐ−アルコキシベンジルアルコール）基を利用して、シクロスポリン類似体を合成した。２）樹脂の膨潤および洗浄のために、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）を使用した。３）支持体に連結させた１番目のアミノ酸は、３倍過剰のＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）を90分以上反応させて樹脂に連結させた３倍過剰の Fmoc−アミノ保護アミノ酸である。４）ピペリジン／ＤＭＦ（v:v 3:7 ）を反応させることによって、１番目のアミノ酸からFmoc基を除去した。５）ペプチドに連結させた２番目のアミノ酸は、３倍過剰のＢＯＰ／ＤＩＥＡを３時間以上反応させて樹脂に連結させた３倍過剰のFmoc−アミノ保護アミノ酸である。６）３倍過剰のピペリジン／ＤＭＦ（v:v 3:7 ）を反応させることによって、末端のアミノ酸からFmoc基を除去した。７）ペプチドに連結させた３番目のアミノ酸は、３倍過剰のＨＡＴＵ［Ｏ-(7- アザベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,2,2,- テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート］／ＤＩＥＡを２番目のカップリング（３時間）のダブルカップリングのプロトコールを使用して反応させることによって、樹脂に連結させた３倍過剰のFmoc−アミノ保護アミノ酸である。８）ピペリジン／ＤＭＦ（v:v 3:7 ）を反応させることによって、末端のアミノ酸からFmoc基を除去した。９）ペプチドが11アミノ酸の長さになるまで、工程７および８を順次繰り返した。 10）ＴＦＡ：Ｈ₂Ｏ（v:v 95:5）を４時間使用して脱保護ウンデカペプチドを樹脂から切断し、エーテルで洗浄し、乾燥し、そして逆相高性能液体クロマトグラフィーによって精製した。 11）ＣＨ₂Ｃｌ₂中、高度に希釈した条件下における（PrＰＯ₂）₃とＤＭＡＰとの反応によって、ウンデカペプチドを環化した。 12）環化ペプチドが10−15％の収率で得られ、カラムクロマトグラフィーによって精製し、そしてＮＭＲおよびＦＡＢＭＳによって特性決定した。この操作を使用して、ＣｓＡ類似体、[MeLeu¹]-ＣｓＡを合成した。ＮＭＲおよびＦＡＢＭＳスペクトルをそれぞれ図15および16に添付する。ここに述べた固相技術を使用することによって、文献記載の方法の組合せを使用したＣｓＡ類似体のライブラリーを製造することが可能である［a）Gallop,M.A.;Barrett,R.W.; Dower,J.J.;Fodor,S.P.A.and Gordon,E.M.;J.Med.Chem.37:1233 および b）Gord on,E.M.;Barrett,R.W.;Dower,W.J.;Fodor,S.P.A.;and Gallop,M.A.;J.Med.Chem. 37:1385参照］。実施例７：生物学的活性に関するＣｓＡ誘導体のスクリーニング前記したように、好ましいＣｓＡ誘導体は抗ＨＩＶ性であるとともに非免疫抑制性でもある。以下の節では、利用可能な生物学的活性について新規なＣｓＡ誘導体をスクリーニングすることができる、操作を概説する。このスクリーニングモードは以下の生物学的検定で構成される。モードI ：対象のＣｓＡ類似体がカルシニューリンを阻害し、したがって免疫抑制性であるかどうかを決定する。モードII：対象の非免疫抑制性ＣｓＡ類似体がシクロフィリンとともにシクロフィリン媒介ＨＩＶ複製を阻害するかどうかを決定する。モートIII ：対象のＣｓＡ類似体が熱ショックタンパク質(hsp70)を阻害するかどうかを決定し、その阻害剤のウイルス集合に対する効果を評価する。モードIV：対象のＣｓＡ類似体が他のプロテアーゼとともにＨＩＶプロテアーゼを阻害するかどうかを決定する。表７に概説する操作を使用して、ある新しいＣｓＡ類似体（“Ｘ”）の生物学的活性を評価することができる。シクロスポリンへの結合、免疫抑制能力、hsp70結合へのＨＩＶ−プロテアーゼ阻害の可能性についてのシクロスポリン類似体の能力評価のため、いくつかの結合検定が必要である。実施例５に記載した固相合成によって製造した多数のＣｓＡ類似体を処理するために、繊細で労力を要する検定が必要とされる。ＣｓＡ類似体ライブラリーをスクリーニングするために、下記の結合検定を使用する。この検定は、過去20年にわたってＥＬＩＳＡシステムおよび組織化学のために開発された技術を応用している。これらのシステムは本来不均一系であるので、ビーズに結合した類似体のスクリーニングには理想的に適合している。最初のスクリーニングでの最良の候補物質を、生物学的効果を精査するためのより特異的な検定を使用してさらに試験する。例えば、モードＩにおいて免疫抑制性でなかった化合物を、免疫刺激性の可能性があるＣｓＡ類似体として、上記実施例５のようなマイトジェン検定において試験することができる。類似体のスクリーニングは、検定の必要性に応じて、合成された際のビーズに付着した、または溶液中の類似体のいずれかで実施することができる。検定において使用するタンパク質の起源本発明者は、培養物1Lあたり精製シクロフィリン 80 mgのレベルになるように、シクロフィリン（CyP ）を発現させ、精製した。入手し得る組換え体形態で、ＨＩＶプロテアーゼを入手した。hsp70 をｐＥＴ発現システムで製造し（ｐＥＴ発現システムは、Novagen,Madison,Wisconsin より市販されている）、精製した。これらの研究において、入手し得るウシカルシニューリンおよびヒトカルシニューリンサブユニットＡの両方を使用し得る。シクロフィリン−シクロスポリン２成分複合体検定ＣｓＡ類似体とシクロフィリンの結合レベルを測定する方法の一つとして、標準条件を使用した、精製シクロフィリンへのフロオロセインイソチオシアネートのカップリングが含まれる。この蛍光シクロフィリンを、一連の洗浄によって過剰のシクロフィリンを除去することができるように、固相合成ビーズに連結したシクロスポリンに結合させ、蛍光プレートリーダーまたは顕微鏡で蛍光を検出する。２番目の検定はＥＬＩＳＡ法に基づいている。この検定は、シクロフィリンをビオチン化して［Biot-CyP］誘導体を形成させることから始まる。ストレプトアビジンに連結したアルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼを使用して、シクロスポリン−ＣｓＡ複合体を定量的に測定することにより、樹脂−ＣｓＡの［Biot-CyP］への結合を検出する。この方法の変法として、樹脂結合シクロスポリン類似体に結合させるために、シクロフィリンに対する抗体を使用する。この抗体をアルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼと複合体化したIgＧ抗体によって検出する。複合体へのＣｓＡ量を調整することによって、ＣｓＡ類似体の結合を変更させることができる。ＣｓＡ濃度を上げると、弱く結合しているＣｓＡ類似体を追い出すことになる。CyP に弱く結合している可溶性のＣｓＡ類似体を使用して、活性が小さい樹脂結合ＣｓＡ誘導体と競合して追い出す。このＣｓＡ競合体の濃度および効力を調節することによって、各合成調製品における最良の阻害剤を決定することができる。シクロフィリン−シクロスポリン−カルシニューリン３成分複合体検定シクロフィリン−ＣｓＡ−カルシニューリン結合の形成の程度を測定する方法の一つは、カルシニューリンがシクロフィリン−ＣｓＡ複合体のみに結合する事実を利用する。こうして、組合せライブラリーにカルシニューリンおよびシクロフィリンを添加すると、一般に免疫抑制性ＣｓＡ類似体に関連する特性である、両方のタンパク質に結合するＣｓＡのみとの３成分複合体が形成される。過剰の試薬から３成分複合体を分離し、蛍光標識カルシニューリンまたはカルシニューリンに対する抗体のいずれかによって定量する。第２の検定は Amersham の新しいシンチレーション近接検定（Scintillation Proximity Assay ）システム（Amersham,Illinois ）を使用する。この検定において、固相ビーズにシンチラントを共有結合させる。光の発生を起こすため、放射性同位元素をビーズに隣接させる必要がある。ビオチン化シクロフィリンおよびストレプトアビジン−ＳＰＡビーズを使用し、溶液中のＣｓＡ類似体をＩ¹²⁵- カルシニューリンとともに添加すると、シンチレーションが発生する。この方法は放射性免疫検定と同様の鋭敏性を示すものである。この方法は固相ビーズへの結合における立体的相互作用があるため、可溶性ＣｓＡ類似体に限定されるが、過剰の試薬の分離の必要はない。ＨＩＶプロテアーゼおよび hsp70とＣｓＡとの２成分複合体ＣｓＡのＨＩＶプロテアーゼまたは hsp70への結合を測定するため、必要に応じてシクロフィリンに代えて、好適な抗体、蛍光標識タンパク質、またはビオチン化ＨＩＶプロテアーゼ若しくはビオチン化 hsp70を使用して、前記のシステムを使用することもできる。以上の記載によって、本発明が免疫細胞の研究において有用と考えられるシクロスポリンの免疫刺激性類似体を提供することが明らかになったはずである。特定すると、ここでそれらは補助刺激剤として作用することが示された。これらの類似体が化学的に合成し得る、より簡便な補助刺激剤を提供することは明白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マルコフスキー，ミロスラフアメリカ合衆国 53705 ウィスコンシン州マディソン，マラソンドライブ 5118番地 (72)発明者アンゲル，イヴォンヌエム. アメリカ合衆国 53703 ウィスコンシン州マディソン，ワンイーストギルマンストリート，アパートメント 302 （番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．図１の免疫刺激性シクロスポリン類似体。２．１位にβ−ヒドロキシ、Ｎ−メチルアミノ酸を含む、請求項１に記載の類似体。３．β−ヒドロキシ、Ｎ−メチルアミノ酸がβ−ヒドロキシ、Ｎ−メチルロイシンである、請求項２記載の類似体。４．４位にＮ−メチルアミノ酸をさらに含む、請求項２記載の類似体。５．前記Ｎ−メチルアミノ酸がＮ−メチルアラニンである、請求項４記載の類似体。６．６位にＮ−メチルアミノ酸をさらに含む、請求項４記載の類似体。７．前記Ｎ−メチルアミノ酸がＮ−メチルアラニンである、請求項６記載の類似体。８．図３に示す構造を有する、請求項７記載の類似体。９．以下の工程を含む、図１の免疫刺激性シクロスポリン類似体の合成方法：ａ）修飾された４個のアミノ酸ペプチドを修飾された７個のアミノ酸ペプチドおよびカップリング試薬と反応させて、修飾された11個のアミノ酸ペプチドを形成させ、ｂ）該修飾された11個のアミノ酸ペプチドを環化試薬と反応させて、前記シクロスポリン類似体を形成させる。 10．以下の工程を含む、請求項９記載の修飾された７個のアミノ酸ペプチドの合成方法：ａ）修飾された１個のアミノ酸を修飾された別のアミノ酸およびカップリング試薬と反応させて、修飾された２個のアミノ酸ペプチドを形成させ、ｂ）該修飾された２個のアミノ酸ペプチドを修飾されたアミノ酸ペプチドおよびカップリング試薬と反応させて、修飾された４個のアミノ酸ペプチドを形成させ、ｃ）該修飾された４個のアミノ酸ペプチドを修飾された１個のアミノ酸およびカップリング試薬と反応させて、修飾された５個のアミノ酸ペプチドを形成させ、ｄ）該修飾された５個のアミノ酸ペプチドを修飾された１個のアミノ酸およびカップリング試薬と反応させて、修飾された６個のアミノ酸ペプチドを形成させ、ｅ）該修飾された６個のアミノ酸ペプチドを修飾された１個のアミノ酸およびカップリング試薬と反応させて、前記修飾された７個のアミノ酸ペプチドを形成させる。 11．以下の工程を含む、図１の免疫刺激性シクロスポリン類似体の合成方法：ａ）i)樹脂、ii）架橋物質、iii)保護されたアミノ酸、iv）脱保護試薬、v)カップリング試薬、vi）切断試薬、およびvii)環化試薬を任意の順序で準備し、ｂ）前記樹脂を前記架橋物質と反応させて樹脂誘導体を形成させ、ｃ）該樹脂誘導体を保護されたアミノ酸および前記カップリング試薬と反応させて、結合した保護されたアミノ酸を形成させ、ｄ）該結合した保護されたアミノ酸を前記脱保護試薬と反応させて、結合した脱保護されたアミノ酸を形成させ、ｅ）該結合した脱保護されたアミノ酸を別の前記保護されたアミノ酸および前記カップリング試薬と反応させて、結合した保護されたペプチドを形成させ、ｆ）該結合した保護されたペプチドを前記脱保護試薬と反応させて、結合した脱保護されたペプチドを形成させ、ｇ）該脱保護されたペプチドを別の前記保護されたアミノ酸および前記カップリング試薬と反応させて、結合した保護されたペプチドを形成させ、ｈ）工程ｆおよびｇを反復して、所望の長さおよび配列の結合した脱保護されたペプチドを形成させ、ｉ）該所望の長さおよび配列の結合した脱保護されたペプチドを前記切断試薬と反応させて、遊離した所望の長さおよび配列の脱保護ペプチドを形成させ、ｊ）該遊離した所望の長さおよび配列の脱保護されたペプチドを前記環化試薬と反応させて、前記シクロスポリン類似体を形成させる。 12．前記樹脂がポリスチレン樹脂である、請求項11記載の方法。 13．前記架橋物質がｐ−アルコキシベンジルアルコール基である、請求項11記載の方法。 14．前記カップリング試薬が、第１のペプチドカップリング用としてはジイソプロピルカルボジイミド、第２のペプチドカップリング用としてビス（2-オキソ-3 - オキサゾリジニル）ホスフェート、およびその他のすべてのペプチドカップリング用としてはＯ-(7-アザベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,2,2,- テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートである、請求項11記載の方法。 15．免疫細胞をin vitroで図１の免疫刺激性シクロスポリン類似体と接触させることを含む、前記免疫細胞の刺激方法。 16．免疫細胞をマイトジェンで前処理する工程をさらに含む、請求項15記載の方法。 17．前記免疫細胞がリンパ球である、請求項15記載の方法。 18．前記免疫細胞の免疫刺激の程度を決定する工程をさらに含む、請求項15記載の方法。 19．前記決定工程が細胞の増殖測定を含む、請求項18記載の方法。 20．前記測定が放射性チミジンの添加および前記免疫細胞への取り込みの検出を含む、請求項19記載の方法。