JPH10508482A

JPH10508482A - Body

Info

Publication number: JPH10508482A
Application number: JP8515138A
Authority: JP
Inventors: クル・ジュニア、フレドリック・チャールズ; フライング、メアリ・エリザベス; スティメル、ジュリー・ベス
Original assignee: ザ・ウエルカム・ファウンデーション・リミテッド
Priority date: 1994-11-05
Filing date: 1995-11-03
Publication date: 1998-08-25
Also published as: AU3811495A; GB9422383D0; WO1996014339A1; ZA959336B; EP0789713A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、特異的部位で結合できる抗体、このような抗体の部位特異的結合方法、特異的部位で結合している抗体、および治療と診断におけるこのような抗体の使用に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to antibodies capable of binding at specific sites, methods of site-specific binding of such antibodies, antibodies binding at specific sites, and the use of such antibodies in therapy and diagnosis.

Description

【発明の詳細な説明】抗体本発明は、特異的部位で結合できる抗体、このような抗体の部位特異的結合方法、特異的部位で結合している抗体、および治療と診断におけるこのような抗体の使用に関する。抗体は、疾患を誘発する外来性物質に対する哺乳動物の免疫応答の重要な成分である。抗体は、多くの方法のいずれかを用いて生体外で製造され、そのような抗体、特にモノクローナル抗体やその断片は、診断および治療用物質として有用であることがわかった。抗体の有用性は、そのユニークな抗原特異性、すなわち病原性抗原または腫瘍関連抗原のような独立した化学的分子を認識しこれに結合する能力に由来する。その有用性の別の側面は、その多様性、すなわち非常に多種類の独立した遺伝的に規定された抗体（モノクローナル抗体）を作成する哺乳動物の能力（および、現在はファージディスプレイ（phage display）のような過程）である。抗体の有用性の最後の側面は、その「定常」領域を介して相互作用する能力である。この最後の側面は、他のセットの性質、例えばエフェクター細胞、補体または他の結合分子（例えばプロテインＡ）との相互作用のようなイソタイプに共通の性質を決定する。抗体または断片の有用性は、成分単独では自然には存在しない性質を結合体（ conjugate）に持ち込む１以上の追加の分子的残基(molecular moieties)（以後、物質と呼ぶ）を、直接または間接に化学的に結合することによって増強される。そのような性質には、色素や放射性核種のようなレポーター機能、酵素的機能、第２の結合機能（例えば、ビオチン−アビジン）、薬物（例えば、アドリアマイシン）、細胞毒性機能（例えば、リシン）、キレート物質、または広範な分子的残基のいずれかと抗体が反応できるようにする化学的結合残基(chemical link age moiety)がある。すなわち、抗体結合体は、抗体と、該抗体に直接または間接に抗体に結合した活性物質（物質）を含んでなる。例えば、活性物質が放射性核種の時、放射性核種は抗体に直接結合するか、または例えばＴＭＴのようなキレート物質または例えばブロモアセチルのようなさらなるタンパク反応性基（架橋物質）により抗体に結合するキレート物質を介して、抗体に間接的に結合してもよい。同様に、活性物質は、酵素−プロドラッグ治療に使用するための分子的キメラでもよく、そのようなキメラは、癌細胞のような哺乳動物細胞中で活性化される転写制御ＤＮＡ配列、転写制御ＤＮＡ配列に機能的に結合しており、投与されるプロドラッグの癌細胞に毒性のある物質への変換を触媒することができる異種酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでなる。この分子的キメラは、抗体に直接結合しているが、またはウイルスベクターまたはリポソーム内に含有され、そのウイルスベクターまたはリポソームが次に抗体に結合してもよい（例えば、ヨーロッパ特許出願第９０３０９４３０．８号を参照）。抗体やその断片への分子の化学的付加または架橋について多くの方法が記載されており、そのような反応は一般に結合反応（conjutgation reaction）と呼ばれる。結合反応は、抗体中に天然に存在する化学的官能基を利用する。例えば、共通のアプローチの１つは、一級アミン（主に、リジン残基のεアミノ基）を標的にする。このアプローチの他の共通の例は、チロシン残基のヨード化（例えば、¹²⁵Ｉ）である。このアプローチの欠点は、ランダムであることである。すなわち、リジンまたはチロシン残基は、分子構造の全体に存在するため、これらの残基が伝達を補助すべき天然の性質（例えば、抗原認識、補体反応性またはエフェクター細胞相互作用）が犠牲になることがある。結合体の挙動は、個別のユニークな成分（そのいくつかは、全く無効であるかまたは有害である）の挙動の平均である。このランダムなアプローチは、抗原認識に影響することも知られている。部位特異的結合（すなわち、抗体構造内の特異的アミノ酸残基への結合）は、得られる結合体は異なる生成物の混合物ではないという利点を導く。抗体が結合体に導入する性質（例えば、抗原反応性または薬物動態安定性）は、明確な化学的構造に帰因する。さらに、抗原結合性を有する領域から空間的に離れているような部位を選択できる。例えば、抗体の可変領域には抗原結合部位を含まれ、重鎖のＣＨ２ドメインにはエフェクター（ＦｃＲ）および補体（Ｃ１ｑ）相互作用残基が含まれることが知られている。従って、重鎖のＣＨ３ドメインへの付加を選択することにより、これらの機能を犠牲にすることを避けることができる。部位特異的結合方法の２つの例が記載されている。抗体の糖鎖部分(carbohyd rate portion)に対する抗体の結合が詳述されている（O'Shannessy and Quarles ，J．Immunol．Met 99:153-161，1987）。ヒトのＩｇＧ抗体は、ＣＨ２ドメインのａｓｎ２９７に１つの共通のグリコシル化部位を有する。（なお、本明細書に記載のアミノ酸はすべて、ＥＵ指数に従って番号が付けられていることに留意されたい。Kabatら、「免疫学的興味のあるタンパクの配列」（Sequences of prot eins of immunological interest）、第５版、ＮＩＨ publication No．91-3242 ，1991。共通のイソタイプを、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ４などと呼ぶ）。グリコシル化結合方法は、抗原またはエフェクター相互作用に必要となるかも知れない糖鎖を変化させる危険性を有する（Lundら、Molec．Immunol 27: 1145，1990；Isaacsら、J．Immunol．1-18: 3062，1992）。抗体への部位特異的結合の他の例では、部位特異的突然変異誘発による抗体上の遊離チオールの形成が関与する。抗体は天然のシステイン残基を有し、そのチオール基はジスルフィド結合により結合している。天然に存在するシステイン残基の位置は種間で高度に保存されており、これらの残基が、抗体の構造と機能にとって必須であることを示している。抗体は、遊離のスルフヒドリル基を天然には含有しない。そのチオール基が酸化されないか、または天然のスルフヒドリル結合が犠牲にならないシステインを含有するように、抗体を作成することは理論的に魅力的である。システイン残基のスルフヒドリル基は、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびアリール、α−ハロアシルおよびピリジルジスルフィドのようなスルフヒドリルに特異的な、多くの結合化学による結合のために使用することができる。しかし、天然にはないシステイン残基を有するように設計されている変種モノクローナル抗体は、結合のために利用できる遊離のチオール基を事実上有するということはない。（抗体は２つの同じ重鎖と２つの同じ軽鎖から構成され、遺伝子の作成方法および発現方法に依存して、１つの鎖の残基の遺伝子的置換により、完全なＨ２−Ｌ２構造に２つの新しい残基をできることがあるため；さらに、２つの残基は、その空間的配置と近傍の状況のため化学的に同一ではないため）。作成されたチオールの１つの既知の例では（Bodmerら、米国特許第５，２１９，９９６号、およびLyonsら、Protein Eng．3: 703，1990）、抗体構造内の別個の「凹型」分子ポケット（直径０．１３〜０．５mmの小分子のみが近づくことができ、同じかまたは異なる抗体鎖内にジスルフィド結合を形成することができないポケット）にシステイン残基が導入された時のみ、利用可能な遊離のチオールが観察された。モノクローナル抗体の「凸型の」または「平面的な」表面に導入されたシステイン残基は、遊離のチオールを有さないことがわかった。従って当業者は、表面システイン残基は、同じおよび／または別の抗体鎖内にジスルフィド結合を形成し、そのため抗体の巨大分子構造や機能をゆがめると結論できるであろう。公表されている文献は、作成した表面チオールは抗体の構造と機能を変化させることを示している。例えば、ｓｅｒ４４４→ｃｙｓ変種の抗体産生細胞の粗上清中にモノマーとダイマー（ＩｇＧ−ＩｇＧ）の両方とも観察された（Shopes， J．Immunol．148: 2918，1992）。これに関連して、ｓｅｒ４４４→ｃｙｓ変種を利用して、ダイマー抗体の産生方法が記載された（Caronら、J．Exp．Med．17 6: 1191-1195，1992）。これらの例の両方のダイマーＩｇＧが、インビトロでエフェクター機能が増強していることがわかった。これらの実験および前述のBdom erらの実験において、ダイマーが操作した部位で形成したか、またはどの程度正常なジスルフィド結合が修飾されているかを示す、生理学的証拠は提供されていない。最後に、ｓｅｒ１１９→ｃｙｓ変種を作成することによる「つながれた」抗体が記載されている（Shopes，Mol．Immunol．30: 603，1993）。この変種は、ダイマーおよび鎖間構造変種すなわち「つながれた」抗体を生成したと報告されている。構造異常物の混合物は、規定された化学的物質を得るという目的を犠牲にする。従って、抗体の表面に露出したシステイン残基を含有するモノクローナル抗体（特に、ｓｅｒ４４２→ｃｙｓ重鎖変種を含有するもの）が、部位特異的結合を受けることを見いだしたことは、驚きであり予想外であった。従って本発明は、システイン残基が物質に結合できるように、抗体の表面に露出しているシステイン残基を含んでなるモノクローナル抗体を提供する。ここで、該抗体は免疫化学的機能を有し、また免疫化学的機能の用語は、主に抗体の結合能力を意味するが、エフェクター機能（もし存在するなら）をも包含する。抗体の可変領域が抗原結合部位を含有することを考えると、結合の好適な部位は、抗原結合に関与しない可変領域の表面上の表面残基（例えばｓＳｖ重鎖−軽鎖リンカーペプチド）、並びに軽鎖の定常領域、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを包含する抗体の定常領域の表面残基であり、ヒンジ領域も含まれる。すなわち、抗原結合に関与しない抗体表面のすべての残基、特にＣＤＲの一部でないものが、物質への結合に適している。抗体がエフェクター機能を有する場合は、結合の好適な部位は、エフェクター機能を含むことが知られているＣＨ２ドメイン以外は同じである。システイン残基は実質的に還元型である。より好ましくは、還元システイン残基は、重鎖のＣＨ３ドメインにあり、好ましくはＣＨ３ドメイン内の４４２位にある。還元システイン残基の別の好適な位置は、重鎖 −軽鎖リンカーペプチドである。新規のｃｙｓ４４２抗体は、その産生細胞により、モノマーＩｇＧ型と凝集型の両方を示すように発現されることが可能である。凝集の存在は、BodmerらとShopesの研究で観察されたように、ｃｙｓ４２２変種が表面変種であることを示唆するが、驚くべきことにほとんどの抗体は凝集型ではなかった。モノマーＩｇＧは、例えばゲル濾過クロマトグラフィーにより容易に精製可能であり、モノマー型は長期間の保存でも安定であった。モノマーＩｇＧは、遊離のチオールを有さないことがわかった（表１）。理論に拘泥するつもりはないが、チオールはまず、天然に存在する付加物（例えば、グルタチオン）により阻止（すなわち、保護）されると我々は考えている。我々は、加工されたチオール(engineered thiol)は、天然のジスルフィド結合を還元しない制御された条件下で還元されることを発見した。例えば、天然のジスルフィド結合を還元することができない低濃度の還元剤のような穏やかな条件が、加工されたチオールの還元に適していることがわかっている。還元抗体は、ｐＨ８で長期間保存された時でもモノマー型を維持する。（ｐＨと酸素をうまく操作することによりチオールは反応性になることは公知である）。すなわち、制御された還元により、加工された抗体は、特に加工されたチオールで特異的に部位特異的化学的付加が可能になるようにできる。従って本発明はまた、抗体の表面に露出したシステイン残基を含んでなるモノクローナル抗体であって、制御された還元により物質への部位特異的化学的結合が可能になり、システイン残基は抗体の免疫化学的機能を妨害しない部位に導入される抗体に向けられている。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体またはその断片であり、抗体という用語は、抗体と抗体断片の両方を包含する。本発明の抗体は任意の種から得られる。抗体は、可変領域が１つの抗体から得られ、定常領域は別の抗体（例えば、ヒトの抗体）から得られるキメラ抗体でもよい。すなわち、キメラ抗体は、種／種キメラまたはクラス／クラスキメラでもよい。このようなキメラ抗体は、抗原結合性を改善するために、またはエフェクター機能を改善するために、１つまたはそれ以上のさらなる修飾を受けても良い。改変抗体の別の型は、定常領域とＣＤＲ以外の可変領域がヒトのフレームワークに移される複合抗体を包含するヒト化抗体である。結合能を回復するために必要であれば、フレームワークまたはこのような抗体の定常領域内の追加のアミノ酸を修飾してもよい。すなわち、本発明で使用される抗体は、アミノ酸配列が天然に存在するものではない任意の改変抗体を包含する。しかし、ＣＤＲを移植された抗体が最も好ましい。本発明の抗体は、例えばＧ１、Ｇ２、Ｇ４のような異なるイソタイプを含む。抗体の例は、J．Cell Biol 125(2)437-446，1994年４月、およびProc．Natl．Acad．Sc i．87，3542-3546，1990年５月、に記載の４０ＫＤ抗体（ＣＯ／１７．１．Ａ）であり、好ましくはヒト化抗−４０ＫＤ抗体であり、特にＧ４イソタイプのヒト化抗−４０ＫＤである。抗−４０ＫＤ抗体の具体例は、３２３／Ａ３であり、好ましくはヒト化３２３／Ａ３であり、特に好ましくは３２３／Ａ３ＩｇＧ４である。抗体の別の例は、A．Tomasettiら、ヨーロッパ生化学会連合（Federation of European Biochemical Societies）第３１７巻、143-146、1993年２月、に開示されている抗−葉酸受容体抗体であり、好ましくはヒト化抗−葉酸抗体および特にＧ１イソタイプのヒト化抗−葉酸抗体である。抗−葉酸抗体の具体例は、ＭＯＶ１８であり、好ましくはヒト化ＭＯＶ１８ＩｇＧ１である。抗体のさらなる例には、抗−ＣＥＡ、抗−ムチン（mucin）、抗−２０／２００ＫＤ、抗−ガングリオシド、抗−ジゴキシン、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ２３、抗−ＣＤｗ５２、およびより具体的には、ヒト化抗−ＣＤｗ５２抗体であるＣａｍｐａｔｈ−１Ｈがある。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（登録商標）のＣＤＲを含む抗体鎖ＤＮＡ配列は、ＥＰＯ３２８４０４に開示されており、その開示内容は参考のため本明細書に引用される。（Page，M.J.，and Sydernham，M.A.，チャイニーズハムスター卵巣細胞でのヒト化モノクローナル抗体Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈの高レベル発現、Biot ech．9: 64-68，1991）。本発明で使用される抗体断片には、Ｆab、Ｆ(ab)2、Ｆv、および組換えＤＮＡ技術で得られるような合成ペプチド配列からなる断片がある。本発明で使用されるモノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の方法で調製されるか、またはさらに詳しくはＧＢ９０２２５４７．５に記載のものがある。精製は、ＥＰ−Ａ−９１９１７８９１に記載のように行われる。断片は、文献、例えば「抗体、実験室マニュアル（Antibodies，a laboratory manual）」、E．Harlow and D．Lane編、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1988に記載のような任意の方法、または分子遺伝学的方法により調製される。本発明はまた、システインが直接または間接的に物質に結合している抗体を提供する。物質が抗体に間接的に結合している時、それは、例えばキレート物質のような１つまたはそれ以上の結合残基を介して、抗体に結合される。１つまたはそれ以上の結合残基を介して抗体に結合されるそのような物質は、「２官能性物質」として知られている。そのような結合残基は、例えば、抗体のようなタンパク内のチオール官能基に共有結合することができるマレイミドまたはブロモアセチルのような官能性化学的残基でもよい。結合残基はまた、物質と抗体結合残基の間の橋として機能する化学的スペーサー（例えば、ｐ−ベンジル基）を利用してもよい。結合物質の例には、色素、放射性核種、酵素、薬物、細胞毒、およびビオチン／アビジンがある。薬物や細胞毒の具体的な例は、それぞれアドリアマイシンおよびリシンである。キレート物質の具体的な例には、以下のものが含まれる：・ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ'' ，Ｎ'''−四酢酸）；・ＰＡ−ＤＯＴＡ（α−［２−（ｐ−ニトロフェニル）エチル］−１，４，７，１０−１−酢酸−４，７，１０−トリス（メチル酢酸））；・ＴＭＴ（６，６''−ビス［Ｎ，Ｎ''，Ｎ'''−テトラ（カルボキシメチル）アミノメチル）−４’−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−２，２'：６' ，２''−テルピリジン）；・ＩＢ４Ｍ−ＤＴＰＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ペンタキス（カルボキシメチル）−２−［（４−アミノフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミン）；・ＣＨＸ−Ａ−ＤＴＰＡ（Ｎ−［２−アミノ−３−（ｐ−アミノベンジル）プロピル］−トランス−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ'' ，Ｎ''−五酢酸）；・ＴＲＩＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''−四酢酸）；および・ＴＥＴＡ１，４，８、１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ' '，Ｎ'''−四酢酸。物質が放射性核種の場合、これは直接または間接的な方法で抗体の遊離のチオールに結合される。例えば、Schawartz法（Schawartz，A.，and Steinstrasser ， A.，J．Nucl．Med．18:721，1987）に類似の方法を修飾して、⁹⁹ｍＴｃを抗体に結合させる（ここでは、天然のジスルフィドを還元する必要はないであろう）。金属性放射性核種（⁹⁰Ｙ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹¹¹Ｉｎおよび⁶⁷Ｃｕ）は、間接的プレラベル法により結合される（ここで放射性核種をまず２官能基キレート物質に付加し、次に抗体に結合させる）か、または間接的ポストラベル法により結合させる（ここではあらかじめ形成したキレート物質−抗体結合体に放射性核種を結合させる）。本発明のキレート物質は、キレート物質を抗体のチオール基に結合させることができる任意のヘテロ−またはホモ−２官能性架橋リンカー（すなわち、化学的スペーサー）（M．McCallら、Bioconjutate Chem．1，222-236， 1990）、またはPierce「免疫技術のカタログとハンドブック」（″Immuno Techn ology Catalog and Handbook″）、1992、E8〜E39頁およびParker、Chem．Soc. Rev．［1990］，19，271-291に記載の架橋物質とそこに記載の方法を用いて、抗体に結合させてもよい。架橋リンカーと組合せるキレート物質の例としては、以下のものがある：・ブロモアセチル−ＤＯＴＡ（２−［ｐ−（ブロモアセトアミド）ベンジル− １，４，７，１０−テトラアザシクロードデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''−四酢酸）；・ブロモアセチル−ＴＲＩＴＡ（２−［ｐ−（ブロモアセトアミド）ベンジル］−１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''− 四酢酸）；・ブロモアセチル−ＴＭＴ（２−［ｐ−（ブロモアセトアミド）ベンジル］− ６，６''−ビス［Ｎ，Ｎ''，Ｎ''−テトラ（カルボキシメチル）アミノメチル） −４’−（３−アミノ−４’−メトキシフェニル）−２，２’：６’，２''−テルピリジン）。２官能性キレート物質架橋リンカーの組合せであるブロモアセチル−ＤＯＴＡ（ＢＡＤとも呼ぶ）は、M.J．McCall，H．Diril．and C.F．Meares，Bioconjuga te Chem．1:222-226，1990）に記載されている。さらに詳しくは、本発明で使用されるキレート物質は、ＤＯＴＡまたはＴＭＴであり、タンパク反応性基（架橋リンカー）は、ブロモアセチルまたはマレイミドであり、最も好ましくはブロモアセチルである。本発明で使用されるキレート物質は、任意の既知の方法により調製される（例えば、M．McCallら、前述）。本発明において使用される放射性核種には、インビボの放射免疫療法および／または標的細胞または標的組織のイメージングに適したものがある。放射免疫療法のためには、細胞性ＤＮＡを破壊するために高線量のエネルギーを標的部位に与える必要がある。αおよびβ放射性放射性核種は、適当なエネルギー範囲の放射線を出す。しかし、α−放射性物質は、短命であるか、または崩壊して有害な娘産物になる。従って放射免疫療法に最適の放射性核種は、普通β−放射性物質である。イメージングのためには、放射線は、体組織との相互作用ができるだけ少なく、外部から検出できるように強いシグナルを出す必要がある。従って、イメージングにはガンマ放射線放出性放射性核種が最も適している。イメージングと放射免疫療法の両方のために、放射性核種は、投与と標的部位への結合の間の経過時間後に活性を有し検出するのに適当な半減期を有していなければならない。放射能標識抗体は、血流中から内皮孔を介して標的の細胞外液に移動する必要がある。大きな抗体または抗体／キレート物質複合体は、拡散が遅く、放射性核種の半減期は数時間〜数日が好ましい。本発明の特定の側面において、放射性核種は、¹⁹⁵ｍＰｔ、⁵⁷Ｎｉ、⁵⁷Ｃｏ、¹⁰⁵Ａｇ、⁶⁸Ｃｕ、⁵²Ｍｎ、⁵²Ｆｅ、¹¹¹Ｉｎ、^113mＩｎ、^99mＴＣ、⁶⁷Ｇａ、¹⁶⁹Ｙｂ、¹⁶⁶Ｔｍ、¹⁶⁷Ｔｍ、¹⁴⁶Ｇｄ、¹⁵⁷Ｄｙ、⁹⁵mＮｂ、¹⁰³Ｒｕ、⁹⁷Ｒｕ、⁹⁹Ｒｕ、^101mＲｈ、²⁰¹Ｔｌ、²⁰³Ｈｇ、¹⁹⁷Ｈｇ、²⁰³Ｐｂ、⁹⁹Ｒｈ、⁴⁸Ｃｒ、⁵⁷Ｃｏ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁵³Ｓｍ、⁸⁸Ｙ、⁹⁰ Ｙ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、²¹¹Ａｔ、²¹²Ｂｉ、²¹²Ｐｂおよび¹⁷⁷Ｌｕよりなる群から選択される。本発明のより具体的な例では、放射性核種は、¹¹¹Ｉｎ、⁶⁷Ｃｕ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸ ⁸ Ｒｅ、¹⁷⁷Ｌｕ、⁹⁹ｍＴｃ、¹³¹Ｉ、88Ｙ、⁹⁰Ｙ、²¹¹Ａｔ、²¹²Ｂｉ、²¹²Ｐｂ、⁵⁷ Ｃｏ、¹⁵³Ｓｍ、⁸⁸Ｙ⁹⁰Ｙおよび¹⁷⁷Ｌｕよりなる群から選択される。本発明のより具体的な例では、放射性核種は、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁵³Ｓｍ、⁹⁰Ｙおよび¹¹¹ Ｉｎである。本発明はまた、直接または間接に放射性核種に結合した本発明の抗体を含んでなる放射標識抗体、特にＤＯＴＡまたはＴＭＴを介して⁹⁰Ｙまたは¹⁷⁷Ｌｕで標識されたキレート物質−抗体結合体を提供する。本発明はまた、特異的部位で結合されることができる抗体の産生方法、および本発明の抗体の部位特異的結合方法を提供する。本発明の別の側面において、治療と診断における本発明の結合した抗体の使用が提供される。特に、色素、放射性核種酵素、薬物および細胞毒を用いて検出できるか、或いは治療できる症状の診断および／または治療のための、本発明の抗体の使用を提供する。これらの抗体複合体は、リンパ腫や白血病、特に小細胞肺癌や非小細胞肺癌、前立腺癌ならびに卵巣癌のような癌の治療に有用である。本発明の最も好適な側面において、癌や関連する転移のイメージングおよび／または治療に使用される本発明の抗体複合体を提供する。これらはまた、免疫抑制物質として使用され、および特に重症の血管炎、リウマチ様関節炎、全身性ループス、また多発性硬化症、移植片対宿主疾患、乾癬、若年性糖尿病、シェーグレン症候群、甲状腺疾患、重症筋無力症、移植拒絶および喘息などの自己免疫疾患などのＴ細胞介在性疾患の治療に、使用される。本発明はまた、前記のいずれかの疾患の治療またはイメージングのための薬剤の製造における前記結合した抗体の使用を提供する。本発明の別の側面によれば、本発明の結合した抗体複合体を用いた治療および診断ができる症状の治療法であって、治療的有効量の抗体複合体をそのような治療の必要な哺乳動物に投与することを具備した方法を提供する。特に、リンパ腫や白血病、特に小細胞肺癌や非小細胞肺癌、前立腺癌ならびに卵巣癌のような癌の治療法、および特に癌や関連疾患の治療法が提供される。これらはまた、重症の血管炎、リウマチ様関節炎、全身性ループス、また多発性硬化症、移植片対宿主疾患、乾癬、若年性糖尿病、シェーグレン症候群、甲状腺疾患、重症筋無力症、移植拒絶および喘息などの自己免疫疾患などのＴ細胞介在性疾患の治療方法に使用される。また本発明において、結合したモノクローナル抗体またはその断片および１つまたはそれ以上の薬剤学的に許容される賦形剤とからなる、本発明の結合した抗体を含有する薬剤学的に許容される組成物が提供される。このような組成物は、結合した抗体以外に、おそらくは他の抗体もしくは抗生物質のような他の物質との混合物である、生理学的に許容される希釈物または担体を含む。適当な担体には、リン酸緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水グルコースおよび緩衝化生理食塩水などがあるが、これらに限定されない。投与経路は、通常静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内注射または送達などの非経口投与である。放射免疫療法の点から、本発明の放射性核種に結合した抗体を含有する組成物の投与量は、治療される症状および治療の受容者により異なるが、成人患者では約１〜１００mgの範囲であり、好ましくは１〜１０mg、最も好ましくは５mgが、通常注入物として投与される。１日１０mg投与した数週間後または数ケ月後に第２回目の繰り返し投与が好ましい。放射免疫療法の点から、このような組成物の投与量は、治療される症状および治療の受容者により異なるが、成人患者では１〜約１００mgの範囲であり、好ましくは１〜１０mg、最も好ましくは５mgである。また、細胞活性もしくは選択された抗原の存在に対する防御もしくはその検出において、本発明の結合した抗体を用いて使用するためのキットが提供される。すなわち、本発明の結合したモノクローナル抗体が、容器中で通常凍結乾燥型で、単独または目的の型の細胞に特異的な追加の抗体とともに提供される。色素、放射性核種、酵素、薬物、細胞毒、キレート物質およびビオチン／アビジンに結合した抗体は、緩衝液（例えば、トリス、リン酸塩、炭酸塩など）、安定剤、殺菌剤、不活性タンパク（例えば、血清アルブミン）などおよび使用説明書のセットとともにキット内に含まれる。一般にこれらの物質は、活性な抗体の総量に基づき約５％未満、そして通常活性な抗体の濃度に基づき少なくとも約０．００１重量％の総量で存在する。しばしば、不活性の増量剤または賦形剤を含有させて活性成分を希釈することが好ましく、この場合賦形剤は組成物全体の約１〜９９重量％で存在する。キメラ抗体に結合することができる第２の抗体が測定に使用される場合、これは通常別のバイアル中に存在する。第２抗体は、典型的には標識物に結合し、前述の抗体調製物と同様に調製される。一般にキットは使用説明書のセットを含む。図面の説明図１．変種抗体の免疫反応性ａ）Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ抗原特異性を有する５つの別個の抗体調製物（２つの天然のイソタイプ（Ｇ１とＧ４）および３つの変種（Ｇ４ｍ、Ｇ４ｃおよびＧ４ｍｃ）（Ｇ４ｃとＧ４ｍｃはｓｅｒ４４２→ｃｙｓ置換を含有する））を作製し、実施例１に記載のようにＮＳＯ細胞中で発現させた。抗体を³⁵Ｓでｉｎｓｉｔｕで標識し、下記の方法で精製した。２×１０⁷個の洗浄した産生細胞を、５mlのメチオニンシスチンを含まないＤＭＥＭ（アイシーエヌ・バイオメディカルズ（ICN Biomedicals）、コスタメサ、カリホルニア州）（６μg/mlシスチン、３μg/mlメチオニン、および８〜１０mCiの³⁵Ｓメチオニン（例えば、Tran³⁵S -label（ICN））含有）中で、３７℃で４８〜７２時間インキュベートした。遠心分離して上清を採取し、透析し、濃縮（セントリコン（Centricon）、アミコン（Amicon）、ビバリー、マサチューセッツ州）した。抗体をプロテインＡクロマトグラフィー（ＨＰＬＣダイナマックスハイドロポア−プロテインＡ（HPLCDy namax Hydropore-protein A）ミニカラム［ライニン（Rainin）、ウォボーン（W oburn）、マサチューセッツ州］）で精製し、１Ｍ酢酸で溶出し、限外ろ過（例えば、ＰＭ３０膜（アミコン（Amicon）））し、さらにＨＰＬＣゲル濾過（例えば、Ｓ−５２００Ａジオール、ＹＭＣ、ウィルミントン、ノースカロライナ州）した。プロテインＡ溶出液を、非標識抗体と一緒にゲル濾過で分析すると、比活性約２μCi/μgを有していた。免疫反応性は、Lindmoらの方法（J．Immunol．Me th．72:77-84，1984）を用いて、Fixed Wein 133 Cl細胞で測定した。ｙ切片（この逆数は、免疫反応性の尺度である）は、すべての調製物について同等であったことに注意されたい。（傾きは、比活性の関数であり、免疫反応性の関数ではない）。ｂ）固定Wein 133 Cl細胞でのＣａｍｐａｔｈ−１ＨＧ１およびＧ４ｍｃに対する平衡特異的結合競合。２つの抗体を、³⁵Ｓでｉｎｓｉｔｕで生合成的に同じ比活性（０．３mCi/nmole）まで標識し、前記のように精製した（³⁵Ｓ−リガンド）。平衡競合は平行して行い、ここで各リガンドは、それぞれの非標識型により競合させた。結合は、５×１０⁴固定 Wein 133 C1細胞、約０．１ｎＭの記載のＣ１Ｈの放射標識型と記載の濃度の競合物質を含有する０．２ml中で行なった。結合緩衝液は、リン酸緩衝化生理食塩水、２％子ウシ血清、０．０１％トリトンＸ−１００、および０．０２％アジ化ナトリウム（結合緩衝液）であり、４℃で一晩行なった。細胞を遠心分離し、冷結合緩衝液で３回洗浄し、放射能を測定した。点は、３重測定の平均±標準誤差（棒）を示す。２つの抗体は、³⁵Ｓでｉｎｓｉｔｕで生合成的に同じ比活性（０．３mCi/nmole）まで標識し、前記のように精製した（³⁵Ｓ−リガンド）。平衡競合は平行して行い、ここで各リガンドは、それぞれの非標識型により競合させた。２つのプロフィールは、抗体が同じ抗原結合能力を有することを示す。部位特異的結合のより明確な証拠は、実施例３に記載のように調製したモノクローナル抗体キレート物質結合体を放射標識して得た。ペプチドマッビング（ペプチドの酵素的消化、分画、およびペプチドアミノ酸配列の解析）により、すべての放射能ピークは、ｃｙｓ４４２−キレート物質付加物を含有する重鎖Ｃ−末端ペプチド断片から構成されることが確定した。図２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示される部位特異的結合ｓｅｒ４４２→ｃｙｓ変種であるＣａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃを、実施例２に記載のように特異的に還元した。比較のために、McCallら、Bioconjugate C hem．1:222-226，1990に記載の方法を用いて、チオール基を非還元抗体に導入した（この方法は、２−イミノチアランを用いてリジン残基のεアミノ基にチオール基を導入する、ランダム結合方法である）。次に、両方のチオール含有抗体調製物を、実施例２に記載のように結合させた。等量の標識結合体に、還元ＳＤＳ −ＰＡＧＥを行い、ここで抗体重鎖および軽鎖サブユニットを、そのサイズにより分離した。ゲルを、タンパク（左側）と、オートラジオグラフィーにより放射能（右側）について染色した。レーンは左から右に：ランダム、タンパク染色；特異的、タンパク染色；ランダム、オートラジオグラフィー；特異的、オートラジオグラフィー、である。図は、結合体の付加は、特異的標識法について重鎖に局在しており、ランダム法については両方のサブユニットが標識されたことを示す。図３． ⁹⁰Ｙ−ＴＭＴ−Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃ結合体の生体分布。還元Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃを、ブロモアセチル−ＴＭＴに結合させ、⁹⁰ＹＣｌ₃ で放射標識し、ブロモアセチルＤＯＴＡについて記載したように担癌マウスで、生体分布を測定した。棒は、５匹のマウスで放射能崩壊について補正した平均注入投与％／ｇ組織（%ID/g）を示す。以下の実施例により本発明を例示するが、これらは本発明を限定するものではない。実施例１．ｃｙｓ置換による変種モノクローナル抗体の産生（ａ）Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈと抗−ジゴキシン変種。従来法の分子遺伝学的方法により、種々のイソタイプの重鎖にｃｙｓ４４２を導入した。例えば、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ４、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈおよび抗−ジゴキシン（いずれもＩｇＧ１）の遺伝的作製体は、ウェルカムラボラトリーズ（Wellcome Laboratorie s）内で得た。ＣＨ３領域の末端部分を、制限酵素Ｎｓｉｌ（５’）およびＥｃｏＲＩ（３’）で切断し、各切断部位で連結したアニーリングした２本鎖オリゴヌクレオチドで置換した。抗原の特異性は、可変領域とＣＨ１領域の各置換により、定常領域に導入した。Pinkら、Biochem．J．117:33-47，1970が最初に報告したＧ４配列に一致するようにするため、ｓｅｒ２２８→ｐｒｏをＩｇＧ４に導入した。Ｇ４ｍｃと呼ぶＩｇＧ４ｃｙｓ４４２変種を、ＣＨ２領域中のこれらの残基を変化させることによりさらに修飾した：ｌｅｕ２３５→ａｌａ、ｇｌｙ２３７→ａｌａ、およびｇｌｕ３１８→ａｌａ。これらの後者の変化は、このような変化がＦｃガンマ受容体と補体Ｃ１ｑとの抗体の相互作用を低下させるように、Winterらの理論に基づき導入した（Duncanら、Nature 332: 563-564，1988; Duncan and Winter，Nature 332: 738-740，1988）。（ｂ）３２３／Ａ３変種。マウス抗体３２３／Ａ３は、腺腫の治療の同定に有用なヒト上皮組織上のエピトープと反応する（Edwardsら、Cancer Res．46: 1 306-1317，1986）。３２３／Ａ３の可変領域内の相補性決定領域をまず「ヒト化」し、ヒトＩｇＧ１イソタイプに移植した。ｃｙｓ変種を調製するために、ｃＤＮＡ発現作製体を、Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨＩｇＧ４ｃｙｓ４４２変種の定常領域をコードするｃＤＮＡにフレーム内に連結した。ヒト化３２３／Ａ３ＩｇＧ４ｃｙｓ４４２変種を、ＮＳＯ細胞中で発現し、常法に従って精製した。（ｃ）３２３／Ａ３ｓＦｖ断片。ヒト化した３２３／Ａ３の単一鎖のｓＦｖ断片を、通常のＰＣＲ法とクローニング法により作製した。ｃｙｓ残基置換をリンカー領域に導入して、ｃｙｓ変種作製体を作成した。例えば、通常のリンカー領域（ｇｌｙ４ｓｅｒ３つの繰り返し）を、部位特異的突然変異誘発によりｇｌｙ４ｓｅｒｇｌｙ２ｃｙｓ２ｓｅｒｇｌｙ４ｓｅｒを含有するように修飾した。変種を大腸菌（E．coli）中で発現し、親和性クロマトグラフィーにより精製した。（ｄ）Ｍｏｖ−１８変種。Ｍｏｖ−１８は、主に卵巣癌組織上で発現される葉酸結合タンパクと反応する（Miottiら、Intl．J．Cancer 39，297-303，1987 ））。ヒトＩｇＧ１イソタイプcＤＮＡを、逆転写酵素を用いて公共の供給源のｍＲＮＡライブラリーからクローン化した。Ｍｏｖ−１８の可変領域をヒト化し、ヒトＧ１定常領域に連結させた。ｃｙｓ４４２を部位特異的突然変異誘発により、重鎖ｃＤＮＡに導入した。ヒト化Ｍｏｖ−１８ＩｇＧ１ｃｙｓ４４２をＮＳＯ細胞中で発現させ、常法に従って精製した。実施例２．変種モノクローナル抗体の還元抗体溶液を、脱気した緩衝液（例えば、１００mMリン酸ナトリウムまたはリン酸トリメチルアンモニウム、ｐＨ＞８．０、好ましくはｐＨ８．０〜８．５、濃度は例えば１００μＭ（１５mg/ml））中で調製した。ある量の還元剤を抗体溶液と混合して、所望の程度の還元を達成する。例えば、Reduce-Imm（登録商標）（ピアス（Perce））のような固相還元剤の５０％ゲルスラリー５部を、抗体溶液中に撹拌して入れる。Reduce-Imm（登録商標）ゲルの還元能力は、製造業者の情報から３０μgモル/ml充填ゲルであると仮定した。５０％スラリーの２５０μ ｌを、１００μM抗体溶液１mlに添加して、３０倍以上過剰の還元剤を有する混合物を作成した（完全剤モル数／抗体モル数）。抗体−還元剤混合物を、室温で１時間攪拌し、遠心分離し、溶液に、実施例３に記載のようにチオール測定、ｐＨ低下、精製または結合のような追加の操作を行なった。あるいは抗体タンパクを、メルカプトエチルアミンのような可溶性還元剤で還元した。例えばタンパクを、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５mMＥＤＴＡ中で２００〜３００μＭに濃縮した。メルカプトエチルアミンを、最終的にタンパク濃度の１０倍過剰になるように加え、室温で１時間静かに攪拌した。次に還元タンパクを還元剤から分離し、ゲル濾過のような従来法により結合のために調製した。タンパク溶液は通常、０．１Ｍリン酸テトラメチルアンモニウム（ｐＨ８．２）、２５μＭＤＴＰＡ中で１５０×ｇで２分間プレ平衡化させた Bio Spin 30 カラム（バイオラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories））でゲル濾過した。実施例３．還元変種抗体の部位特異的結合還元ｓｅｒ４４２→ｃｙｓ変種。Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃを、２−［ｐ−（ブロモアセトアミド）ベンジル］−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''−四酢酸（ブロモアセチル−ＤＯＴＡ）に結合させた。ブロモアセチル−ＤＯＴＡは、２官能性残基であり、第一の側面は⁵⁷Ｃｏであらかじめ標識されたキレート物質であり、第２の側面は遊離のスルフヒドリルに共有結合できる反応性基である。２官能性キレート物質とそれを⁵⁷Ｃｏで標識する方法は、既に記載されている（Mearsら、Analytical Biochem．142: 68 -78，1984）。簡単に説明すると、ブロモアセチルＤＯＴＡの溶液を、⁵⁷Ｃｏでトレース標識し、次に１０倍モル過剰を抗体溶液に加えた。結合反応は、37℃で２時間行い、製造業者の薦める方法に従ってBio Spin 30 カラム（バイオラッド（Bio-Rad））でゲル濾過により、反応物を分離して反応を停止させた。２官能性キレート物質（例えば、ブロモアセチルＴＭＴ）はまた、放射標識の前に使用した。結合反応の温度と時間は、最大の部位特異的結合が得られるように変化させた。例えば、リン酸テトラメチルアンモニウム（ｐＨ８．２）、２５μM ＤＴＰＡ中１５０〜２５０μＭの濃度の還元タンパクを、金属を含まない反応バイアル中で１０倍過剰のブロモアセチルＴＭＴに加えた。反応を室温で２４時間行い、結合体は前記のようにゲル濾過で単離した。実施例４．結合体のマウス生体分布還元ｓｅｒ４４２→ｃｙｓ変種であるＣａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃを、プレ標識することなく、前述のように部位特異的方法によりブロモアセチルＤＯＴＡに結合させた。比較のために、Ｌｙｍ−１について既に記載されている（この方法は、McCallら、Bioconjugate Chem．1: 222-226，1990の方法に従い、２− イミノチアランを用いて、リジン残基のεアミノ基にチオール基をランダムに導入する）ように非還元Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃにチオール基を導入して、ランダム結合体を調製した。イミノチオール化したＣａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃを、部位特異的結合体と同程度（抗体当たりのキレート物質）にブロモアセチル−ＤＯＴＡに結合させた。プラスチック容器中の⁹⁰ＹＣｌ₃を以下の試薬と混合して、結合体を放射性にした：８倍量のモノクローナル抗体結合体（＞２５mg/ml、０．１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．７）、２倍量の⁹⁰Ｙ、および最終濃度１０μＭの非放射性イットリウム。まず、非放射性イットリウムを加え、次に⁹⁰Ｙと結合体を加えた。キレート化は、室温で９０分間行なった。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ抗原を発現する皮下の癌を有するマウス（ＣＨＯ−１０／Ｄ４）に、１０μｇ（２μCi）を静脈内注射した。所定の時間にマウスを屠殺し、組織を切り出し、重量を測定し、放射能を測定した。結果を下記表IIに示し、組織１ｇ当たりの注射量の％として表した（１群５匹のマウスの平均±標準誤差）。ランダム群に対する部位特異的（直接）結合体群の、正常組織定着の減少と癌定着の増加に注目されたい。図３は、⁹⁰Ｙ−ＴＭＴ−Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃの生体分布を示す。実施例５還元ｓｅｒ４４２→ｃｙｓ変種であるＣａｍｐａｔｈ−１ＨをＴＭＴに結合させ、これを図４に示すように重鎖中のｃｙｓ４４２残基に置換基を介して共有結合させた。反応を制御して、抗体１分子当たり平均１〜２キレート物質を含有する結合体を産生させてもよい。結合体を、金属のない条件下でゲル濾過により未反応の２官能性キレート物質を含まないように精製すると、緩衝化した金属のない環境で安定である。免疫結合体キレート化．入手できる最高の金属のない試薬を用いて、金属のないプラスチック中で結合体を放射標識した。担体を含まない⁹⁰ＹＣｌ₃を、デュポン／ニューイングランドヌクレア（Dupont/New England Nuclear）、アマーシャム（Amersham）および他の供給源から購入した。比活性は典型的には、１０〜３０μｌの０．０５ＮＨＣｌ中５mCi、比活性５．６×１０⁵Ci/gであった。使用前に、⁹⁰ＹＣｌ₃を０．１部の６Ｍ酢酸アンモニウムでｐＨを約５．８に緩衝化した。キレート化は、以下の試薬を連続的に加えて、室温で最高９０分間インキュベートして行なった：１部の非放射性イットリウム（０．１Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．８、中１００μＭ）、２倍量の酢酸⁹⁰Ｙ、および８倍量のモノクローナル抗体結合体（０．１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５、中２５mg/ml ）。キレート化しなかった放射性金属は、最終濃度５００μＭのＤＴＰＡと１０培量の０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）を加えて、「捕捉（scavenge）」させた。混合物を室温で３０分間インキュベートして、「スピンカラムゲル濾過」により分画した。すなわち、リン酸緩衝化生理食塩水であらかじめ平衡化し、１５０×ｇで２分間遠心分離した１mlのBio Spin 30 カラム（バイオラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories））に加えた。スピンカラムゲル濾過は、２回の遠心分離について繰り返した。キレート化の効率（すべての放射性金属をキレートする能力）と捕捉の効率（放射標識結合体から非キレート化放射能を除去する能力）は、Mearesら、Anal． Biochem．142: 68-78，1984に記載のように薄層クロマトグラフィーにより追跡した。９０％を超える放射性金属がルーチンにキレート化された。（キレート化の程度は、酸と提供された物質の金属含量に依存する）。捕捉後、結合体に強固に結合した⁹⁰Ｙの画分はＨＰＬＣゲル濾過、薄層クロマトグラフィーまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析すると典型的には＞９８％であった。 ⁹⁰Ｙでポストラベルした結合体は、比活性が最高１０mCi/mgまで、すなわち理論的能力の３０倍下まで調製されている。すべてのキレート物質は放射性金属を受け取ることができるが、高比活性は、放射能崩壊を引き起こし（時間と濃度の関数）、これはアスコルビン酸のような抗酸化剤を含有させることにより還元することができる。原理上、キレート化は、一貫した高品質の放射性金属が供給されると完全な効率について最適化され、捕捉の必要性を排除する。実施例６．変種モノクローナル抗体の大規模還元限外濾過したＩｇＧ産物を５０mg/ml（±１mg/ml）に希釈し、容量Ｖを測定する。Ｖ／１０の新たに調製したストック溶液（５０mMリン酸塩および５mMＥＤＴＡ、ｐＨ７．０、中１３mg/mlのＭＥＡ）を加え、添加の間還元剤の均一な分布を確保するために充分攪拌する。周囲温度に６０分間放置する。試料を、例えばセファデックスＧ２５またはスーパーデックス７５または３０のようなゲル濾過カラムに添加する。ＩｇＧピークを吸光度２８０nmで追跡し、ピークを集め、さらに、実施例３に記載のようにチオール測定、ｐＨ調整、精製または結合を行う。実施例７．還元した変種抗体の大規摸部位特異的結合０．１Ｍヘペス＋２５μＭＤＴＰＡ（ｐＨ８．４）中で作成した１０mMストックとして、１０倍モル過剰のブロモアセチル−ＴＭＴを加える。充分混合し、周囲温度で少なくとも２１時間、最大３７時間放置する。次に結合した抗体をスーパーデックス２００カラムにかける。ＩｇＧピークを吸光度２８０nmで追跡し、モノマーのピークを集め、結合の推定、タンパク含量の測定などの標準的分析を行う。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION antibody The present invention relates to an antibody capable of binding at a specific site, and a method of site-specific binding of such an antibody. Methods, antibodies binding at specific sites, and such antibodies in therapy and diagnosis Regarding the use of Antibodies are a key component of a mammal's immune response to foreign substances that cause disease It is. Antibodies can be produced in vitro using any of a number of methods, and such Antibodies, especially monoclonal antibodies and fragments thereof, are useful as diagnostic and therapeutic agents It turned out to be. The utility of antibodies is their unique antigen specificity, Recognizes and binds to independent chemical molecules such as pathogenic or tumor-associated antigens Derived from the ability to. Another aspect of its usefulness is its diversity, i.e. Breeding to create independent genetically defined antibodies (monoclonal antibodies) Animal abilities (and now like phage display) Process). The last aspect of antibody utility is that it interacts through its "constant" region. Ability to use. This last aspect is the nature of other sets, such as effectors Such as interaction with cells, complement or other binding molecules (eg, protein A). Determine the properties common to the sotypes. The usefulness of antibodies or fragments is due to their conjugate ( one or more additional molecular moieties (hereinafter , Called substances) by direct or indirect chemical bonding . Such properties include reporter functions such as dyes and radionuclides, enzymatic functions , A second binding function (eg, biotin-avidin), a drug (eg, Adriama) Isine), cytotoxic function (eg, lysine), chelator, or broad molecule Chemical linking residues that allow the antibody to react with any of the age moiety). That is, the antibody conjugate is directly or interposed between the antibody and the antibody. It comprises an active substance (substance) immediately bound to the antibody. For example, if the active substance is radioactive When nuclide, the radionuclide binds directly to the antibody or can be a key such as TMT. Rate substances or additional protein reactive groups such as, for example, bromoacetyl (Crosslinking substance) indirectly binds to the antibody through a chelating substance that binds to the antibody May be. Similarly, the active substance may be used for enzyme-prodrug therapy. The chimera may be active in a mammalian cell, such as a cancer cell. A transcription control DNA sequence to be rendered functional, It can catalyze the conversion of administered prodrugs to substances toxic to cancer cells. A DNA sequence encoding a heterologous enzyme. This molecular chimera is an antibody Or directly contained in a viral vector or liposome The viral vector or liposome may then bind to the antibody (eg, , European Patent Application No. 90309430.8). Many methods have been described for chemically adding or cross-linking molecules to antibodies or their fragments. And such reactions are commonly referred to as conjutgation reactions. It is. The conjugation reaction makes use of naturally occurring chemical functional groups in the antibody. For example, One common approach is to label primary amines (primarily the ε-amino group of lysine residues). Make Other common examples of this approach are iodination of tyrosine residues (eg, ,¹²⁵I). The disadvantage of this approach is that it is random. sand That is, since lysine or tyrosine residues are present throughout the molecular structure, The nature in which the residue should assist in transduction (eg, antigen recognition, complement reactivity, or EFF) Effector cell interaction). The behavior of the conjugate is Of the behavior of dangerous components, some of which are completely ineffective or harmful Average. This random approach is also known to affect antigen recognition You. Site-specific binding (ie, binding to a specific amino acid residue in the antibody structure) The resulting conjugate leads to the advantage that it is not a mixture of different products. Antibody bound The nature of the introduction into the body (eg, antigen reactivity or pharmacokinetic stability) Attributed to the structural structure. Furthermore, they are spatially separated from the antigen-binding region. Can be selected. For example, the variable region of an antibody contains an antigen-binding Effector (FcR) and complement (C1q) interactions in the CH2 domain of the chain It is known that residues are involved. Therefore, the addition of the heavy chain to the CH3 domain By choosing, one can avoid sacrificing these functions. Two examples of site-specific binding methods have been described. Carbohydrate portion of the antibody (carbohyd rate portion) is described in detail (O'Shannessy and Quarles , J. et al. Immunol. Met 99: 153-161, 1987). The human IgG antibody has a CH2 domain Has one common glycosylation site at asn297. (In this specification, Note that all listed amino acids are numbered according to the EU index. I want to be. Kabat et al., “Sequences of proteins of immunological interest” (Sequences of prot. eins of immunological interest), 5th edition, NIH publication No. 91-3242 , 1991. Common isotypes are referred to as G1, G2, G4, etc.). Glycosylation Synthetic methods alter sugar chains that may be required for antigen or effector interactions. (Lund et al., Molec. Immunol 27: 1145, 1990; Isaacs et al.). J. Immunol. 1-18: 3062, 1992). Another example of site-specific binding to an antibody is on an antibody by site-directed mutagenesis. Involves the formation of free thiols. Antibodies have natural cysteine residues and All groups are linked by disulfide bonds. Naturally occurring cysteine residue The positions of the groups are highly conserved among species, and these residues are important in the structure and function of the antibody. It indicates that it is essential. Antibodies naturally produce free sulfhydryl groups. Is not contained. The thiol group is not oxidized or the natural sulfhydryl It is the theory that antibodies are made to contain cysteines that do not sacrifice binding Attractive. The sulfhydryl group of the cysteine residue is maleimide, halogen Alkyl and aryl halides, α-haloacyl and pyridyl disulfide Can be used for conjugation by a number of conjugation chemistries specific for such sulfhydryls. Can be. However, they are designed to have non-natural cysteine residues. Variant monoclonal antibodies actually have free thiol groups available for conjugation. There is no way to have it. (Antibodies are composed of two identical heavy chains and two identical light chains And depending on the method of gene construction and expression, Because substitutions can result in two new residues in the complete H2-L2 structure Furthermore, the two residues are not chemically identical due to their spatial arrangement and nearby circumstances. No). One known example of a thiol made (Bodmer et al., US Pat. 5,219,996, and Lyons et al., Protein Eng. 3: 703, 1990), antibody structure Separate “concave” molecular pockets within the structure (only small molecules 0.13-0.5 mm in diameter are nearby Can form disulfide bonds within the same or different antibody chains. Available only when a cysteine residue is introduced into the Of thiol was observed. "Convex" or "flat" monoclonal antibodies Cysteine residues introduced to the surface were found to have no free thiols . Thus, one of skill in the art will recognize that surface cysteine residues may be present in the same and / or different antibody chains. They form disulfide bonds, which can distort the macromolecular structure and function of the antibody. I can argue. Published literature states that the surface thiols created alter the structure and function of the antibody. Which indicates that. For example, rough production of ser444 → cys variant antibody-producing cells Both monomers and dimers (IgG-IgG) were observed during the rinsing (Shopes, J. Immunol. 148: 2918, 1992). In connection with this, ser444 → cys variant The method for producing dimer antibodies was described (Caron et al., J. Exp. Med. 17). 6: 1191-1195, 1992). Both dimeric IgGs in these examples were produced in vitro. The effector function was found to be enhanced. These experiments and the aforementioned Bdom In the experiments of er and colleagues, the dimer formed at the manipulated site or No physiological evidence has been provided to indicate whether the normal disulfide bond has been modified. Absent. Finally, “connected” by creating a ser119 → cys variant Antibodies have been described (Shopes, Mol. Immunol. 30: 603, 1993). This variant is Reported to have produced dimers and interchain structural variants or "tethered" antibodies Have been. Mixtures of structural anomalies sacrifice the goal of obtaining defined chemicals. Sacrifice. Therefore, monoclonal antibodies containing cysteine residues exposed on the surface of the antibody (Especially those containing a ser442 → cys heavy chain variant) It was surprising and unexpected to find it. Thus, the present invention provides a method for exposing a cysteine residue to an A monoclonal antibody comprising a cysteine residue is provided. here , The antibody has an immunochemical function, and the term immunochemical function mainly refers to the binding of the antibody. Synthetic ability, but also includes effector functions (if present). Anti Given that the variable region of the body contains an antigen binding site, a preferred site for binding is Surface residues on the surface of the variable region not involved in antigen binding (eg, sSv heavy chain-light chain And the constant regions of the light chains, CH1, CH2, and CH of the heavy chains. Surface residues of the constant region of the antibody, including the three domains, including the hinge region . That is, all residues on the antibody surface that are not involved in antigen binding, especially a part of CDRs Are not suitable for binding to substances. If the antibody has an effector function If so, the preferred site of binding is CH2, which is known to contain effector functions It is the same except for the domain. Cysteine residues are substantially reduced. More preferred Alternatively, the reduced cysteine residue is in the CH3 domain of the heavy chain, preferably It is at position 442 in three domains. Another preferred position for the reduced cysteine residue is the heavy chain -A light chain linker peptide. The novel cys442 antibody is dependent on its producing cells. It can be expressed to show both monomeric IgG type and aggregated type . The presence of aggregation was due to the modification of cys422, as observed in the study of Bodmer et al. And Shopes. Suggests that the species is a surface variant, but surprisingly most antibodies are aggregated Was not. Monomeric IgG can be purified by gel filtration chromatography, for example. It can be easily purified, and the monomer form was stable even after long-term storage. Monomer I gG was found to have no free thiol (Table 1). Stick to theory Although not intended, thiols are first used as naturally occurring adducts (eg, glutathione ) Are believed to be blocked (ie, protected) by We use engineered thiol to bind to natural disulfide bonds Was found to be reduced under controlled conditions without reduction. For example, natural di Mild conditions such as low concentrations of reducing agents that cannot reduce sulfide bonds Have been found to be suitable for the reduction of processed thiols. Reducing antibodies are Maintains monomeric form even when stored at pH 8 for long periods. (Good pH and oxygen It is known that manipulations make thiols reactive.) That is, With controlled reduction, the engineered antibody is specifically bound by the engineered thiol. Site-specific chemical additions can be made possible. Accordingly, the present invention also relates to a monoclonal antibody comprising a cysteine residue exposed on the surface of an antibody. Clonal antibodies, site-specific chemical binding to substances by controlled reduction Cysteine residues introduced at sites that do not interfere with the immunochemical function of the antibody Antibodies directed against The antibody of the present invention is preferably a monoclonal antibody or a fragment thereof, The term encompasses both antibodies and antibody fragments. Antibodies of the invention can be derived from any species can get. Antibodies have variable regions derived from one antibody and constant regions derived from another antibody (eg, For example, a chimeric antibody obtained from a human antibody) may be used. That is, a chimeric antibody is , Species / species chimera or class / class chimera. Such a chimeric antibody , To improve antigen binding, or to improve effector function, One or more further modifications may be made. Another type of engineered antibody is a constant region Region and variable regions other than the CDRs are transferred to the human framework. Humanized antibody. If necessary to restore binding capacity, the framework or Alternatively, additional amino acids in the constant region of such antibodies may be modified. Ie The antibody used in the present invention may be any antibody whose amino acid sequence is not naturally occurring. Of modified antibodies. However, CDR-grafted antibodies are most preferred. Departure The clear antibodies include different isotypes, for example, G1, G2, G4. Antibody Examples are described in Cell Biol 125 (2) 437-446, April 1994, and Proc. Natl. Acad. Sc i. 87, 3542-3546, May 1990, 40KD antibody (CO / 17.1.A) And preferably a humanized anti-40KD antibody, especially a human of G4 isotype. -40 KD. A specific example of an anti-40KD antibody is 323 / A3, It is preferably humanized 323 / A3, particularly preferably 323 / A3 IgG4. is there. Another example of an antibody is described in Tomasetti et al., Federation of the European Biochemical Society European Biochemical Societies) Vol. 317, 143-146, February 1993 Anti-folate receptor antibodies, preferably humanized anti-folate antibodies and And a humanized anti-folate antibody of the G1 isotype. A specific example of an anti-folate antibody is MO V18, preferably humanized MOV18 IgG1. More of antibodies Examples include anti-CEA, anti-mucin, anti-20 / 200KD, anti-cancer Glioside, anti-digoxin, anti-CD4, anti-CD23, anti-CDw52, And more specifically, the humanized anti-CDw52 antibody Campath-1H is there. The antibody chain DNA sequence containing the CDR of Campath-1H® is: EPO 328404, the disclosure of which is incorporated herein by reference. Used. (Page, M.J., and Sydernham, M.A., Chinese Hamster Ovary High level expression of humanized monoclonal antibody Campath-1H in cells, Biot ech. 9: 64-68, 1991). The antibody fragments used in the present invention include Fab, F (ab) 2, Fv, and recombinant DNA. There are fragments of synthetic peptide sequences as obtained in the art. The monoclonal antibody used in the present invention can be prepared by any method known in the art. Manufactured or, more specifically, those described in GB9022547.5 . Purification is performed as described in EP-A-91917891. Fragments can be obtained from the literature, for example, see Antibodies, a laboratory manual. manual) ", E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Lee (Cold Spring Harbor Laboratory), 1988; Or prepared by molecular genetic methods. The invention also provides antibodies in which cysteine is directly or indirectly bound to the substance. Offer. When a substance is indirectly bound to an antibody, it may The antibody is attached to the antibody via one or more such binding residues. One or Such substances that are attached to the antibody via additional binding residues are referred to as "bifunctional Known as "quality." Such binding residues may be, for example, proteins, such as antibodies. Maleimide or bromoacetate that can be covalently attached to the thiol function in the It may be a functional chemical residue such as tyl. The binding residue is also the substance and antibody binding residue Utilizing a chemical spacer (eg, p-benzyl group) that acts as a bridge between You may. Examples of binding substances include dyes, radionuclides, enzymes, drugs, cytotoxins, and biotin / There is avidin. Specific examples of drugs and cytotoxins are adriamycin and And ricin. Specific examples of chelators include the following: DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ′, N ″ , N '"-tetraacetic acid); PA-DOTA (α- [2- (p-nitrophenyl) ethyl] -1,4,7 , 10-1-acetic acid-4,7,10-tris (methyl acetic acid)); -TMT (6,6 "-bis [N, N", N "'-tetra (carboxymethyl) Aminomethyl) -4 '-(3-amino-4-methoxyphenyl) -2,2': 6 ' , 2 ''-terpyridine); IB4M-DTPA (N, N, N ', N ", N" -pentakis (carboxy Methyl) -2-[(4-aminophenyl) methyl] -6-methyldiethylenetri Amine); CHX-A-DTPA (N- [2-amino-3- (p-aminobenzyl) p Ropyl] -trans-cyclohexane-1,2-diamine-N, N ′, N ′, N ″ , N ''-pentaacetic acid); -TRITA (1,4,7,10-tetraazacyclotridecane-N, N ', N ″, N ′ ″-tetraacetic acid); and * TETA1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N, N ', N' ', N' ''-tetraacetic acid. If the substance is a radionuclide, this can be done in a direct or indirect Combined with the rules. For example, the Schawartz method (Schawartz, A., and Steinstrasser , A., J .; Nucl. Med. 18: 721, 1987).⁹⁹Anti-mTc Attached to the body (here it would not be necessary to reduce the natural disulfide ). Metallic radionuclide (⁹⁰Y,¹⁸⁶Re,¹⁷⁷Lu,¹¹¹In and⁶⁷Cu) is The radionuclide is coupled by an indirect prelabeling method (where the radionuclide is first Attached to the substrate and then bound to the antibody) or by indirect post-labeling. Connection (Here, the radionuclide is added to the preformed chelator-antibody conjugate). Are combined). The chelating substance of the present invention uses the chelating substance for the thiol group of the antibody Any hetero- or homo-bifunctional cross-linking linker that can be attached That is, a chemical spacer) (M. McCall et al., Bioconjutate Chem. 1, 222-236, 1990), or Pierce "Immuno Techn Catalogs and Handbooks" ("Immuno Techn ology Catalog and Handbook "), 1992, E8-E39 and Parker, Chem. Soc. Rev. [1990], 19, 271-291 and a method described therein. It may be attached to the body. Examples of chelators in combination with the cross-linking linker include: Bromoacetyl-DOTA (2- [p- (bromoacetamido) benzyl- 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ', N ", N"'-tetravinegar acid); ・ Bromoacetyl-TRITA (2- [p- (bromoacetamido) benzyl) ] -1,4,7,10-Tetraazacyclotridecane-N, N ', N ", N"'- Tetraacetic acid); -Bromoacetyl-TMT (2- [p- (bromoacetamido) benzyl]- 6,6 ″ -bis [N, N ″, N ″ -tetra (carboxymethyl) aminomethyl) -4 '-(3-amino-4'-methoxyphenyl) -2,2': 6 ', 2' '-te Pyridine). Bromoacetyl-DOTA, a combination of bifunctional chelator crosslinkers (Also called BAD) is described by M.J. McCall, H .; Diril. and C.F. Meares, Bioconjuga te Chem. 1: 222-226, 1990). More specifically, the chelating substance used in the present invention is DOTA or TMT. And the protein-reactive group (crosslinking linker) is bromoacetyl or maleimi. And most preferably bromoacetyl. The chelators used in the present invention are prepared by any known method (eg, For example, M. McCall et al., Supra). The radionuclide used in the present invention includes in vivo radioimmunotherapy and / or Alternatively, some are suitable for imaging target cells or target tissues. Radioimmunotherapy Method requires a high dose of energy at the target site to destroy cellular DNA. Need to give. Alpha and beta radionuclides emit in the appropriate energy range. Give a ray. However, α-radioactive materials are short-lived or Become a daughter product. Therefore, the best radionuclide for radioimmunotherapy is usually β-radioactive It is. For imaging, radiation can interact with body tissue as much as possible. It is necessary to generate a strong signal that can be detected from outside. Therefore, Gamma-emitting radionuclides are most suitable for imaging. Imaging For both radioimmunotherapy and radionuclide therapy, the radionuclide Must be active after the elapsed time and have an appropriate half-life to be detected . Radiolabeled antibodies need to move from the bloodstream to the target extracellular fluid through the endothelial pore There is. Large antibodies or antibody / chelator complexes are slow- The half-life of the species is preferably from several hours to several days. In certain aspects of the invention, a radioactive nucleus The seed is¹⁹⁵mPt,⁵⁷Ni,⁵⁷Co,¹⁰⁵Ag,⁶⁸Cu,⁵²Mn,⁵²Fe,¹¹¹I n,^113mIn,^99mTC,⁶⁷Ga,¹⁶⁹Yb,¹⁶⁶Tm,¹⁶⁷Tm,¹⁴⁶Gd,¹⁵⁷D y,⁹⁵mNb,¹⁰³Ru,⁹⁷Ru,⁹⁹Ru,^101mRh,²⁰¹Tl,²⁰³Hg,¹⁹⁷H g,²⁰³Pb,⁹⁹Rh,⁴⁸Cr,⁵⁷Co,¹²⁵I,¹³¹I,³⁵S,¹⁵³Sm,⁸⁸Y,⁹⁰ Y,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,²¹¹At,²¹²Bi,²¹²Pb and¹⁷⁷Group consisting of Lu Is selected from In a more specific example of the invention, the radionuclide is¹¹¹In,⁶⁷Cu,¹⁸⁶Re,¹⁸ ⁸ Re,¹⁷⁷Lu,⁹⁹mTc,¹³¹I, 88Y,⁹⁰Y,²¹¹At,²¹²Bi,²¹²Pb,⁵⁷ Co,¹⁵³Sm,⁸⁸Y⁹⁰Y and¹⁷⁷Selected from the group consisting of Lu. In a more specific example of the invention, the radionuclide is¹⁷⁷Lu,¹⁵³Sm,⁹⁰Y and¹¹¹ In. The present invention also relates to the present invention, wherein the present invention relates directly or indirectly to a radionuclide. Via radiolabeled antibodies, especially DOTA or TMT, comprising⁹⁰Y also Is¹⁷⁷A chelator-antibody conjugate labeled with Lu is provided. The present invention also provides Methods for producing antibodies that can be bound at specific sites, and portions of the antibodies of the invention A site-specific binding method is provided. In another aspect of the invention, the use of the conjugated antibody of the invention in therapy and diagnosis Is provided. In particular, detection using dyes, radionuclide enzymes, drugs and cytotoxins Anti-antigen of the present invention for the diagnosis and / or treatment of a condition that is Provide body use. These antibody conjugates are useful in lymphomas and leukemias, especially in small cell lungs. It is useful for treating cancers such as cancer and non-small cell lung cancer, prostate cancer and ovarian cancer. Book In a most preferred aspect of the invention, imaging and / or imaging of cancer and related metastases. Provides an antibody conjugate of the invention for use in therapy. These are also immunosuppressants Used as a quality and especially severe vasculitis, rheumatoid arthritis, systemic loop And multiple sclerosis, graft-versus-host disease, psoriasis, juvenile diabetes, Sjogren Autoimmune diseases such as syndrome, thyroid disease, myasthenia gravis, transplant rejection and asthma It is used to treat any T cell mediated disease. The present invention also relates to an agent for treating or imaging any of the aforementioned diseases. The use of said conjugated antibody in the manufacture of According to another aspect of the invention, treatment with a conjugated antibody conjugate of the invention and A method of treating a condition that can be diagnosed, wherein a therapeutically effective amount of the antibody conjugate is used for such treatment. A method comprising administering to a mammal in need of treatment. In particular, lymphoma And leukemia, especially small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer and ovarian cancer And, in particular, for the treatment of cancer and related disorders. These are also severe Vasculitis, rheumatoid arthritis, systemic lupus, and multiple sclerosis, graft versus lodging Main disease, psoriasis, juvenile diabetes, Sjogren's syndrome, thyroid disease, myasthenia gravis For treating T cell-mediated diseases such as transplant rejection and autoimmune diseases such as asthma used. Also, in the present invention, the bound monoclonal antibody or its fragment and one Or a pharmaceutically acceptable excipient, or more. Pharmaceutically acceptable compositions containing the body are provided. Such compositions may contain, in addition to the conjugated antibody, possibly other antibodies or antibiotics. A physiologically acceptable diluent or carrier that is a mixture with another substance, such as a substance. Including the body. Suitable carriers include phosphate buffered saline, phosphate buffered saline Such as, but not limited to, glucose and buffered saline. Administration Routes are usually parenteral, such as intravenous, intramuscular, subcutaneous, and intraperitoneal injection or delivery Administration. Compositions containing antibodies bound to radionuclides of the invention in terms of radioimmunotherapy Dosage varies depending on the condition being treated and the recipient of the treatment, but in adult patients In the range of about 1-100 mg, preferably 1-10 mg, most preferably 5 mg, It is usually administered as an infusion. Weeks or months after administration of 10 mg daily A second repeated administration is preferred. In terms of radioimmunotherapy, the dosage of such compositions will depend on the condition being treated and the condition to be treated. Depending on the recipient of the treatment, it may range from 1 to about 100 mg for adult patients, Or 1 to 10 mg, most preferably 5 mg. Protection against or detection of cellular activity or the presence of selected antigens , A kit for use with the conjugated antibody of the present invention is provided. That is, the bound monoclonal antibody of the present invention is usually lyophilized in a container. , Alone or with additional antibodies specific for the type of cells of interest. Pigment, Binds to radionuclides, enzymes, drugs, cytotoxins, chelators and biotin / avidin The combined antibodies are buffered (eg, Tris, phosphate, carbonate, etc.), stabilizers, Bacteria, inactive proteins (for example, serum albumin), etc. and instructions for use Included with the kit in the kit. Generally, these substances are based on the total amount of active antibodies. Less than about 5%, and usually at least about 0.001 based on the concentration of active antibody. It is present in a total amount by weight. Often containing inert bulking agents or excipients It is preferred to dilute the active ingredient, in which case the excipient may comprise from about 1 to 99% of the total composition. Present in weight percent. A second antibody capable of binding to the chimeric antibody is used for the measurement If so, this is usually in a separate vial. The second antibody is typically It binds to an object and is prepared in the same manner as the antibody preparation described above. Generally kits are instructions Including a set of books.Description of the drawings FIG. Immunoreactivity of variant antibodies a) Five separate antibody preparations with Campath-1H antigen specificity (2 The three natural isotypes (G1 and G4) and the three variants (G4m, G4c and G4mc) (G4c and G4mc contain a ser442 → cys substitution)). And expressed in NSO cells as described in Example 1. Antibodies³⁵S ins It was labeled with itu and purified by the following method. 2 × 10⁷Washed producer cells 5 ml of DMEM without methionine cystine (ICN Biomedica) Luz (ICN Biomedicals), Costa Mesa, CA (6 μg / ml cystine) , 3 μg / ml methionine, and 8-10 mCi³⁵S methionine (eg Tran³⁵S -label (ICN))) at 37 ° C for 48 to 72 hours. Far The supernatant was collected after centrifugation, dialyzed, and concentrated (Centricon, Amico (Amicon, Beverly, Mass.). Antibody to protein A Matography (HPLC Dynamax Hydropore-Protein A (HPLCDy namax Hydropore-protein A) mini column [Rainin, Woborn (W oburn), Mass.], eluting with 1M acetic acid and ultrafiltration (eg For example, PM30 membrane (Amicon)) and HPLC gel filtration (for example, (S-5200A diol, YMC, Wilmington, NC) did. When the protein A eluate was analyzed by gel filtration together with the unlabeled antibody, the specific activity was Had a sex of about 2 μCi / μg. Immunoreactivity was determined by the method of Lindmo et al. (J. Immunol. Me. th. 72: 77-84, 1984) using Fixed Wein 133 Cl cells. y intercept ( This reciprocal is a measure of immunoreactivity) was equivalent for all preparations. Please note that. (The slope is a function of specific activity, and a function of immunoreactivity. Absent). b) For Campath-1H G1 and G4mc in fixed Wein 133 Cl cells Equilibrium-specific binding competition against. Two antibodies³⁵Biosynthetic in situ with S Labeled to the same specific activity (0.3 mCi / nmole) and purified as above (³⁵S-Li Gand). Equilibrium competition was performed in parallel, where each ligand was Was made to compete. Binding is 5 × 10^FourFixed Wein 133 C1 cells, about 0.1 nM Run in 0.2 ml containing the indicated radiolabeled form of C1H and the indicated concentration of competitor. Was. Binding buffer was phosphate buffered saline, 2% calf serum, 0.01% Liton X-100, and 0.02% sodium azide (binding buffer); Performed overnight at 4 ° C. Cells are centrifuged and washed three times with cold binding buffer to remove radioactivity. It was measured. Points indicate the mean of triplicate measurements ± standard error (bar). The two antibodies are³⁵S Labeled to the same specific activity (0.3 mCi / nmole) biosynthetically in situ with Purified as³⁵S-ligand). Equilibrium competition was performed in parallel, where each rig Were competed with their respective unlabeled forms. The two profiles are It shows that they have the same antigen binding ability. More clear evidence of site-specific binding can be found in monoclonals prepared as described in Example 3. The conjugate was obtained by radiolabeling the conjugate of the conjugated antibody. Peptide mapping Peptide enzymatic digestion, fractionation, and peptide amino acid sequence analysis) All the radioactivity peaks were determined by the heavy chain C-terminal containing the cys442-chelate adduct. It was determined to be composed of terminal peptide fragments. FIG. Site-specific binding as shown by SDS-PAGE Example 1 was performed using a Ser442 → cys variant, Campath-1H G4mc. Specifically reduced as described in 2. For comparison, McCall et al., Bioconjugate C hem. 1: 222-226, 1990, a thiol group was introduced into the non-reducing antibody. (This method involves the use of 2-iminothiaran to attach a thio-amino group to the ε-amino group of a lysine residue. This is a random bonding method that introduces a hydroxyl group). Next, prepare both thiol-containing antibody preparations. The product was coupled as described in Example 2. Reduced SDS is added to an equal amount of labeled conjugate Perform a PAGE where the antibody heavy and light chain subunits are Separated. Gels are radiated by protein (left) and autoradiography Stained for noh (right). Lanes from left to right: random, protein staining; Specific, protein staining; random, autoradiography; specific, autora Geography. The figure shows the addition of the conjugate to the heavy chain for the specific labeling method. Localized, indicating that both subunits were labeled for the random method You. FIG. ⁹⁰Biodistribution of Y-TMT-Campath-1H G4mc conjugate. Reduced Ca mpath-1H G4mc bound to bromoacetyl-TMT,⁹⁰YCl_Three Radiolabeled with and treated with tumor-bearing mice as described for bromoacetyl DOTA. And the biodistribution was measured. Bars are means corrected for radioactivity decay in 5 mice Injection administration% / g tissue (% ID / g) is shown. The present invention is illustrated by the following examples, which do not limit the invention. Absent. Embodiment 1 FIG. Production of variant monoclonal antibodies by cys substitution (A) Campath-1H and anti-digoxin variant. Conventional molecular genetics The method introduced cys442 into the heavy chains of various isotypes. For example, human IgG2, IgG4, Campath-1H and anti-digoxin (all of gG1) is a genetic construct of Wellcome Laboratorie s) obtained within. The terminal portion of the CH3 region was replaced with the restriction enzyme Nsil (5 ') and Ec Annealed double-stranded oligos cleaved with oRI (3 ') and ligated at each cleavage site Replaced with nucleotides. The specificity of the antigen depends on each substitution of the variable region and CH1 region. And introduced into the constant region. Pink et al., Biochem. J. 117: 33-47, 1970 first reported Ser228 → pro was transferred to IgG4 to match the G4 sequence Entered. The IgG4 cys442 variant, called G4mc, Was further modified by changing the residues: leu235 → ala, gly 237 → ala and glu318 → ala. These latter changes are Such changes may reduce antibody interaction between Fc gamma receptor and complement C1q Introduced based on the theory of Winter et al. (Duncan et al., Nature 332: 563-564, 1988; Duncan and Winter, Nature 332: 738-740, 1988). (B) 323 / A3 variant. Mouse antibody 323 / A3 is used to identify treatment for adenoma Reacts with epitopes on useful human epithelial tissues (Edwards et al., Cancer Res. 46: 1 306-1317, 1986). The complementarity determining region within the variable region of H.323 / A3 And implanted into the human IgG1 isotype. To prepare the cys variant, the cD The NA expression construct was purified using the Campath-1H IgG4 cys442 variant constant. The region encoding cDNA was ligated in frame. Humanized 323 / A3 Ig The G4 cys442 variant was expressed in NSO cells and purified according to standard methods. (C) 323 / A3 sFv fragment. Humanized 323 / A3 single chain sF The v fragment was prepared by a conventional PCR method and cloning method. cys residue substitution Cys variant constructs were created by introduction into the linker region. For example, a normal linker Region (gly4ser 3 repeats) was generated by site-directed mutagenesis. modified to contain gly4sergly2cys2sergly4ser Was. The variant is expressed in E. coli and purified by affinity chromatography. Made. (D) Mov-18 variant. Mov-18 is mainly expressed on ovarian cancer tissues Reacts with folate binding proteins (Miotti et al., Intl. J. Cancer 39, 297-303, 1987) )). Human IgG1 isotype cDNA was converted to a public source using reverse transcriptase. Cloned from an mRNA library. Humanizing the variable region of Mov-18 And the human G1 constant region. cys442 by site-directed mutagenesis And introduced into heavy chain cDNA. Humanized Mov-18 IgG1 cys442 It was expressed in NSO cells and purified according to a conventional method. Embodiment 2. FIG. Reduction of variant monoclonal antibodies The antibody solution is added to a degassed buffer (eg, 100 mM sodium phosphate or phosphate). Trimethylammonium acid, pH> 8.0, preferably pH 8.0-8.5, concentrated The degree was adjusted, for example, in 100 μM (15 mg / ml). Dissolve a certain amount of reducing agent in antibody Mix with the liquor to achieve the desired degree of reduction. For example, Reduce-Imm (registered trademark) 5 parts of a 50% gel slurry of a solid phase reducing agent such as (Pierce) was dissolved in antibody. Stir into the solution. The reducing capacity of Reduce-Imm® gels is From the information it was assumed to be a 30 μg mol / ml packed gel. 250μ of 50% slurry is added to 1 ml of the 100 μM antibody solution, and the mixture having a 30-fold or more excess reducing agent is added. A mixture was prepared (moles of complete agent / moles of antibody). The antibody-reducing agent mixture is Stir for 1 hour, centrifuge, add thiol measurement as described in Example 3, p. Additional operations such as H reduction, purification or conjugation were performed. Alternatively, the antibody protein is reduced with a soluble reducing agent such as mercaptoethylamine. I did. For example, a protein is prepared by adding 0.1 M sodium phosphate (pH 6.0), 5 mM Concentrated to 200-300 μM in DTA. Mercaptoethylamine, finally Was added so that the protein concentration became 10 times excess, and the mixture was gently stirred at room temperature for 1 hour. The reduced protein is then separated from the reducing agent and bound by conventional methods such as gel filtration. It was prepared for The protein solution is usually 0.1 M tetramethylammonium phosphate (PH 8.2), pre-equilibrated at 150 xg for 2 minutes in 25 μM DTPA Bio Spin 30 column (Bio-Rad Laboratories) Was gel filtered. Embodiment 3 FIG. Site-specific binding of reduced variant antibodies Reduced ser442 → cys variant. Campath-1H G4mc was converted to 2- [ p- (Bromoacetamido) benzyl] -1,4,7,10-tetraazacyclo Dodecane-Binds to N, N ', N ", N'"-tetraacetic acid (bromoacetyl-DOTA) I let it. Bromoacetyl-DOTA is a bifunctional residue, the first aspect of which is⁵⁷C o is a chelator previously labeled with o, the second aspect being free sulfhydrides A reactive group that can be covalently bonded to ril. Bifunctional chelate and it⁵⁷At Co Methods for labeling have been described previously (Mears et al., Analytical Biochem. 142: 68). -78, 1984). Briefly, a solution of bromoacetyl DOTA is⁵⁷At Co Trace labeling was then performed and a 10-fold molar excess was added to the antibody solution. Binding reaction at 37 ° C Run for 2 hours and follow the BioSpin 30 column (BioRad) according to the manufacturer's recommendations. (Bio-Rad)) and the reaction was stopped by separating the reactants by gel filtration. Bifunctional Sex chelators (eg, bromoacetyl TMT) are also used prior to radiolabeling. did. The temperature and time of the binding reaction are varied to obtain maximum site-specific binding. I let you. For example, tetramethylammonium phosphate (pH 8.2), 25 μM D The reduced protein at a concentration of 150-250 μM in TPA was added to the metal-free reaction A 10-fold excess of bromoacetyl TMT was added in the vial. Run the reaction at room temperature for 24 hours The conjugate was isolated by gel filtration as described above. Embodiment 4. FIG. Mouse biodistribution of the conjugate Campath-1H G4mc, a reduced ser442 → cys variant, was Without labeling, bromoacetyl DOT was obtained by the site-specific method as described above. A. For comparison, it has already been described for Lym-1 (this Methods are described in McCall et al., Bioconjugate Chem. 1: According to the method of 222-226, 1990, 2- Using iminothiaran, a thiol group was randomly introduced to the ε-amino group of a lysine residue. Thiol group introduced into non-reduced Campath-1H G4mc A random conjugate was prepared. Imatinthiolated Campath-1HG 4 mc to the same degree as the site-specific conjugate (chelate per antibody) Coupled to cetyl-DOTA. In plastic container⁹⁰YCl_ThreeThe following reagents To make the conjugate radioactive: 8 times the monoclonal antibody conjugate (> 2 5 mg / ml, 0.1 M ammonium acetate, pH 6.7)⁹⁰Y, and Non-radioactive yttrium with a final concentration of 10 μM. First, add non-radioactive yttrium, next⁹⁰Y and conjugate were added. Chelation was performed at room temperature for 90 minutes. Camp A mouse (CHO-10 / D4) having a subcutaneous cancer expressing the ath-1H antigen 10 μg (2 μCi) were injected intravenously. At predetermined times, mice are sacrificed and tissues are Cut out, weighed, and measured radioactivity. The results are shown in Table II below, where Expressed as% injection volume per unit (mean ± standard error of 5 mice per group). run Reduction of normal tissue colonization and cancer colonization of site-specific (direct) conjugate group against dam group Note the increase. FIG.⁹⁰Y-TMT-Campath-1H G4mc 1 shows the biodistribution. Example 5 The reduced ser442 → cys variant Campath-1H was bound to TMT. This is covalently linked to the cys442 residue in the heavy chain via a substituent as shown in FIG. Combined. Control the reaction to contain an average of 1-2 chelators per antibody molecule May be produced. The conjugate was unfiltered by gel filtration under metal-free conditions. Purification of the reaction to be free of bifunctional chelates results in buffered metal It is stable in a good environment. Immunoconjugate chelation. Using the best available metal-free reagents, The conjugate was radiolabeled in fresh plastic. No carrier⁹⁰YCl_ThreeAnd du Dupont / New England Nuclear, Amarshi It was purchased from Amersham and other sources. The specific activity is typically between 10 and 5 mCi in 30 μl 0.05N HCl, specific activity 5.6 × 10^FiveIt was Ci / g. Use Before use⁹⁰YCl_ThreeBuffered to pH 5.8 with 0.1 part 6M ammonium acetate It has become. Chelation is performed by adding the following reagents sequentially and incubating at room temperature for up to 90 minutes. Cuvated and performed: 1 part non-radioactive yttrium (0.1 M ammonium acetate , PH 6.8, 100 μM in) acetic acid⁹⁰Y, and 8 times the amount of goods Clonal antibody conjugate (25 mg / ml in 0.1 M ammonium acetate, pH 6.5) ). Non-chelated radiometals were treated with a final concentration of 500 μM DTPA and 10 μM. A culture volume of 0.1 M ammonium acetate (pH 6.5) was added and "scavenge" " Incubate the mixture at room temperature for 30 minutes, Fraction ". That is, pre-equilibrate with phosphate buffered saline 1 ml Bio Spin 30 column (Bio-Radler) centrifuged at 150 xg for 2 minutes. Bio-Rad Laboratories). Spin column gel filtration Repeated for two centrifugations. Chelation efficiency (ability to chelate all radioactive metals) and capture efficiency ( Ability to remove unchelated radioactivity from radiolabeled conjugates) is described in Meares et al., Anal. Biochem. 142: Followed by thin-layer chromatography as described in 68-78, 1984 did. More than 90% of the radiometals were routinely chelated. (Chelating Depends on the acid and the metal content of the material provided). Strong after binding Joined to⁹⁰The fraction of Y is HPLC gel filtration, thin layer chromatography or SD Analysis by S-PAGE was typically> 98%. ⁹⁰Conjugates post-labeled with Y have specific activities up to 10 mCi / mg, ie It is prepared up to 30 times the theoretical capacity. All chelates use radioactive metals High specific activity can cause radioactivity decay (time and concentration Function), which is reduced by including an antioxidant such as ascorbic acid. Can be In principle, chelation is provided by consistently high quality radioactive metals Optimized for full efficiency, eliminating the need for capture. Embodiment 6 FIG. Large-scale reduction of variant monoclonal antibodies Dilute the ultrafiltered IgG product to 50 mg / ml (± 1 mg / ml) and measure volume V You. V / 10 freshly prepared stock solution (50 mM phosphate and 5 mM EDT A, pH 7.0, 13 mg / ml in MEA) and add uniform distribution of the reducing agent during the addition Stir well to ensure Leave at ambient temperature for 60 minutes. Sample, for example Gel filtration such as Sephadex G25 or Superdex 75 or 30 Add to column. The IgG peak was tracked at an absorbance of 280 nm, and the peak was collected. In addition, perform thiol measurement, pH adjustment, purification or conjugation as described in Example 3. . Embodiment 7 FIG. Large-scale site-specific binding of reduced variant antibodies. 10 mM strike made in 0.1 M Hepes + 25 μM DTPA (pH 8.4) As a check, add a 10-fold molar excess of bromoacetyl-TMT. Mix well, Leave at ambient temperature for at least 21 hours, up to 37 hours. Next, the bound antibody is -Apply to a Perdex 200 column. Trace the IgG peak at 280 nm absorbance Standard analysis, such as collecting monomer peaks, estimating binding and measuring protein content I do.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 ＡＢＣＡ６１Ｋ 39/395 ＡＣＤＡＢＪＡＣＶＨＡＣＤＡＤＡＡＣＶＡＤＰＡＤＡＡＤＶＡＤＰＣ０７Ｋ 16/00 ＡＤＶ 16/28 51/00 19/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 16/28 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 19/00 37/48 ＡＢＥＣ１２Ｐ 21/08 49/02 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フライング、メアリ・エリザベスアメリカ合衆国、ノースカロライナ州 27707、ダーハム、イートン・ロード 3712 (72)発明者スティメル、ジュリー・ベスアメリカ合衆国、ノースカロライナ州 27713、ダーハム、オーデュボン・レイク・ドライブ 600、ユニット４シー − 11──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI A61K 39/395 ABC A61K 39/395 ACD ABJ ACVH ACD ADA ACV ADP ADA ADV ADP C07K 16/00 ADV 16/28 51/00 19 / 00 C07K 16/00 C12P 21/08 16/28 A61K 37/02 ADU 19/00 37/48 ABE C12P 21/08 49/02 A (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES , FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD) , TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), AL, AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, C H, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD , MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, UG, US, UZ, VN ( 72) Inventor Flying, Mary Elizabeth, United States, 27707, North Carolina, Durham, Eaton Road 3712 (72) Inventor Stimmel, Julie Beth United States, 27713, North Carolina, Durham, Audubon Lake Drive 600, Unit 4 Sea − 11

Claims

[Claims] 1. A monoclonal antibody having an immunochemical function, comprising a cysteine residue exposed on the surface of the antibody so that the cysteine residue can bind to a substance. 2. The antibody of claim 1, wherein the cysteine residue is in the variable region of the antibody but is not part of a CDR. 3. 2. The antibody according to claim 1, wherein the cysteine residue is in a constant region. 4. 4. The antibody of claim 3, wherein the cysteine residue is in the CH3 domain of the heavy chain. 5. 5. The antibody of claim 4, wherein the cysteine residue is at position 442 of the CH3 domain. 6. The antibody according to any one of claims 1 to 5, wherein the antibody binds to a 40KD antigen or a folate receptor antigen. 7. The antibody according to any one of claims 1 to 6, wherein the antibody is humanized. 8. The antibody according to any one of claims 1 to 7, wherein the antibody is of the G1 or G4 isotype. 9. An antibody conjugate comprising the antibody according to any one of claims 1 to 8 and a substance directly or indirectly bound to a cysteine residue of the antibody. 10. The antibody conjugate according to claim 9, wherein the substance is indirectly bound via a chelating substance. 11. The antibody conjugate according to claim 9, wherein the substance is indirectly bound via a linker and a chelating substance. 12. 12. The antibody conjugate according to claim 10, wherein said chelating substance is TMT or DOTA. 13. 13. The antibody conjugate according to claim 11 or claim 12, wherein said linker is bromoacetyl. 14． The substance, ⁹⁰ Y or ¹⁷⁷ is Lu, the antibody conjugate according to item 1 in any of the time range paragraph 10 to 13 claims. 15. 10. The antibody conjugate according to claim 9, wherein said substance is a molecular chimera used in enzyme prodrug therapy. 16. 16. The antibody conjugate according to claim 15, wherein said chimera is operably linked to a transcription control DNA sequence capable of being activated in a mammalian cell and said transcription control DNA sequence. And a DNA sequence encoding a heterologous enzyme capable of catalyzing the conversion of a prodrug to a cancer cytotoxic substance. 17． 17. The antibody conjugate according to claim 16, wherein said transcription control DNA sequence is a tissue-specific or cancer-specific transcription control DNA sequence. 18. 18. The antibody conjugate according to claim 15, wherein said chimera is contained in a viral vector or liposome. 19. Use of an antibody conjugate according to any one of claims 9 to 18 for the treatment and diagnosis of cancer and related metastases. 20. Use of an antibody conjugate according to any one of claims 9 to 14 for the treatment of small and non-small cell lung cancer, prostate cancer and related metastases. 21. Use of an antibody conjugate according to any one of claims 15 to 18 for the treatment of ovarian cancer. 22. Use of an antibody conjugate according to any one of claims 10 to 14 for radioimmunotherapy. 23. A pharmaceutically acceptable composition comprising a conjugated antibody according to any one of claims 9 to 18 together with a physiologically acceptable diluent or carrier. . 24. 24. A pharmaceutically acceptable composition according to claim 23 for radioimmunotherapy, wherein the dosage is 1 to 10 mg.