JPH10508003A - 腫瘍および感染部位に指向させるためのビオチン化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インビボで感染部位および腫瘍に治療用試薬およびイメージング試薬を指向させるために有用な新規なビオチンアミドアナログが開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍および感染部位に指向させるためのビオチン化合物政府の支援 本明細書に開示される発明は、エネルギー省交付番号DE-FG02-86ER60460（DOE grant DE-FG02-86ER60460）の下でエネルギー省から資金援助により一部支援を 受けた。発明の背景 腫瘍の高コントラストイメージングは、放射標識されていない抗体を、局在化 させ、プレ指向化させたその抗体と高親和性を有する放射標識された低分子を投 与する前に循環系から排除することによって達成できる（Paganelli，G．et al. ，J．Nucl．Med．Comm．12: 211-234（1991）；Green，NM Biochem．J.89:585-9 1(1963)；Hnatowich DJ et al.，J.Nucl．Med．28: 1294-1302(1987)参照）。こ のような方法の一つは、卵白に含まれるカチオン性糖タンパク質であるアビジン の、天然ビタミンであるビオチンに対する高親和性を利用する。アビジンは、4 個のビオチン分子と結合して非常に高い親和性（Kd＝10^-15M）のアビジン−ビオ チン複合体を形成する能力がある。 アビジン−ビオチン系を用いて腫瘍を標的とするために、二通りの方法が患者 および動物で用いられている。第1の方法では、アビジン（またはストレプトア ビジン）結合抗体を注入し、何日か後、抗体−腫脇結合が最大に達した時点で放 射性ビオチン誘導体を、その腫瘍に局所注入する。残念ながら、未結合の抗体が 血液循環系から完全に排除されないために、この標的部位の可視化は不鮮明にな ってしまうことがある。第2の方法では、ビオチン化抗体を注入してから3日後に 非放射性アビジンを注入することによって血液中のバックグラウンドを減少させ る。その結果生じるビオチン化抗体−アビジン複合体が、肝臓によって血液から 取り除かれる。次に放射性のビオチンを注入すると、そのビオチンは、すでに腫 瘍に局在している抗体−ビオチン−アビジン複合体に結合する。しかしながら「 プレ指向化（pretargetting）」段階を行なうため、腫瘍を標的とするためのい ずれの方法においても、患者は数日間にわたって複数の処置を受けることができ る状態になければならない。 モレル（Morrel）らによる研究では、大腸菌を感染させたラットモデルにおけ るIn-111で標識したIgGおよびヒト血清アルブミン（HSA）の取り込みについて報 告した。これらの標識されたタンパク質の蓄積はいずれも、感染部位の鮮明なイ メージを生じさせるために充分であることが判明した（Morrel，EM et al.，J.N ucl．Med．30: 1538-1545(1989)参照）。 治療用試薬またはイメージング試薬をインビボでより特異的に、腫瘍および感 染部位に指向させるための簡便かつ迅速な方法が必要とされている。発明の概要 一つの観点からすると本発明は、インビボで患者に投与された際に標的部位に 対して高特異性を有するビオチン化合物を特徴とする。好ましいビオチン化合物 はビオチンアミドアナログであり、好ましい標的部位としては腫瘍、および細菌 、ウイルスまたは菌類の感染部位が含まれる。特に好ましいビオチン化合物は、 少なくとも5：1の標的部位対非標的部位の比率を示し、インビボで安定であって 、投与後1時間以内に実質的に標的に局在するものである。特に好ましいビオチ ンアミドアナログは［3aS-（3aα,4β,6aα）］-ヘキサヒドロ-2-オキソ-1H-チ エノ［3,4d］イミダゾール-4-（N-3-（1-フルオロプロピル））ペンタンアミド である。 他の観点からすると本発明は、ビオチン化合物を含む薬学的組成物を特徴とす る。好ましい薬学的組成物は、R₆位に治療用試薬を結合したビオチンアミドアナ ログである。更に他の観点において本発明は、腫瘍または感染部位（例えば、病 原性の細菌、ウイルス、または菌類による）の発生および生長を治療または抑制 するためのビオチン化合物の新規な使用を特徴とする。 更に他の観点からすると本発明は、イメージング試薬をさらに含むビオチン化 合物、および被検者における腫瘍または感染部位を検出および／またはモニター するための該化合物の使用を特徴とする。一態様ではイメージング試薬であるビ オチン化合物をインビボで投与して、その標識にとって適当な方法を用いてモニ ターする。インビボでイメージング試薬のビオチン化合物を検出および／または モニターするための好ましい方法には、陽電子放射断層撮影法（PET）、単一光 子放射コンピュータ断層撮影法（SPECT）、または磁気共鳴イメージング（MRI） な どがある。 腫瘍または感染部位に治療用試薬またはイメージング試薬を指向させるための 本発明のビオチン化合物およびインビボの方法では、プレ指向化の段階を最初に 行う必要がない。また局在時間も一般的に1時間以下である。したがって治療ま たはイメージングを、一回の短時間の操作で達成することができる。さらにビオ チン化合物は、インビボで急速に排出される体内に本来存在する低分子であるた め、治療またはイメージングに必要なレベルでは毒性のある副反応を起こす可能 性は低い。 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲よりさら に明らかとなろう。発明の詳細な説明 本明細書で用いられているように、次の用語および熟語は下記に記載のような 意味を持つ。 「ビオチン化合物」とは、以下の二つの構造式のうちのいずれかを有する、イ メージング試薬もしくは治療用試薬と結合した244ダルトンのビタミン「ビオチ ン」（ヘキサヒドロ-2-オキソ-1H-チエノ［3,4-d］-イミダゾリン-4-吉草酸（he xahydro-2-oxo-1H-thieno[3,4-d]-imidazoline-4-valeric acid））、または「 ビオチンアミドアナログ」である。 式中、 n＝ 2〜10； R₁〜R₅＝ H、アシル基、アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニ レン基、アルケニル基、またはアルキニル基 R₆＝ H、アシル基、アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン 基、アルケニル基、もしくはアルキニル基、または結合した治療用試薬もしくは イメージング試薬、かつ X＝ C＝O、S＝O、またはC＝NH-、 および 式中、 n＝ 2〜10 R₁〜R₅＝ H、アシル基、アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニ レン基、アルケニル基、またはアルキニル基、 R₆＝ N、アシル基、アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン 基、アルケニル基、もしくはアルキニル基、または結合した治療用試薬もしくは イメージング試薬、 X＝ C＝O、S＝O、またはC＝NH-、かつ 2位、3位、または4位＝ O、S、またはN。 ビオチンアミドアナログには、ラセミ化合物およびとりうるすべてのエナンチ オマーが含まれる。R基を構成するアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレ ン基、アルケニル基、およびアルキニル基（以下、炭化水素基と記載する）は、 直鎖状であっても分岐状であってもよく、また飽和であっても不飽和であっても よい。不飽和置換基は一箇所だけの不飽和部位を有していてもよいし、または複 数箇所に不飽和部位を有していてもよい。炭化水素基は、約10個までの炭素を有 することが好ましく、約6個までの炭素を有すると更に好ましく、最も好ましい のは約3個までの炭素を有するものである。3個の炭素原子またはそれ以下の炭素 原子を有する炭化水素基は、低級炭化水素基とされている。例えば3個の炭素原 子またはそれ以下の炭素原子を有するアルキル基は低級アルキル基である。本発 明で用いることのできる低級炭化水素基の例としては、メチル基、メチレン基、 エチル 基、エチレン基、エテニル基、エテニレン基、エチニル基、エチニレン基、プロ ピル基、プロピレン基、プロペニル基、プロペニレン基、プロピニル基、および プロピニレン基がある。高級炭化水素基（4個〜約10個の炭素からなる基）の例 としては、ブチル基、t-ブチル基、ブテニル基、ブテニレン基、およびブチニル 基、ブチニレン基、ノニル基、ノニレン基、ノネニル基、ノネニレン基、ノニニ ル基、およびノニニレン基がある。 アルキル基またはアルキレン基は、一個またはそれ以上の酸素原子、またはハ ロゲン原子で置換することによって、アルコキシ基、ハロアルキル基、アルコキ シレン基、およびハロアルキレン基を形成してもよい。アルコキシ基およびハロ アルキル基も直鎖状であっても分岐状であってもよく、好ましくは約10個までの 原子（炭素原子、水素原子、またはハロゲン原子を含む）で構成されており、好 ましくは6個までの原子で構成され、最も好ましくは約3個までの原子で構成され ている。ハロゲンという用語は技術用語として認められており、塩素、フッ素、 臭素、アスタチン（astatine）、およびヨウ素などを含む。本発明で用いられる 置換型の炭化水素基の例は、一個または複数個の酸素、または一個または複数個 のハロゲンをその炭化水素基の中に組み入れたことを除いては上記に列挙した炭 化水素基と同じである。より親油性の高いビオチン化合物が得られるような置換 を行うことは、脳および脊髄中の腫瘍および感染部位への指向化に好ましい。 特に好ましいビオチン化合物物は、インビボで投与した場合、非標的部位に対 して高い割合で標的部位に存在するものである。好ましくはその比率は＞5：1で ある。ビオチン化合物には、標的に対して特異的なレセプターによって認識され 化合物の標的特異性をさらに増加させることができる糖（例えば、グルコース、 フコース、ガラクトース、マンノース）が付加していてもよい。例えば、ビオチ ン化合物にマンノース残基を付加させ（例えば、遊離の窒素にC−グリコシド結 合させ）、それによりマンノースレセプターを発現する腫瘍（例えば、膠芽腫お よび神経節細胞腫）およびマンノースレセプターを発現することが知られている 細菌（Bertozzi，CR and MD Bednarski Carbohydrate Research 223: 243（1992 ）、J．Am．Chem．Soc．114: 2242，5543(1992)参照）に対して、さらにその他 の感染源に対してもおそらく高親和性で結合することができるビオチン化合物を 得るこ とができる。 「結合した」とは、イオン結合でまたは共有結合（例えば架橋剤を介して）で 結合していることを意味する。 「イメージング試薬」とは、標的と結合して検出可能なイメージを生じること のできる組成物を意味し、陽電子放射断層撮影法（PET）および単一光子放射コ ンピュータ断層撮影法（SPECT）のための放射性核種（例えば、In-111、Tc-99m 、Ｉ-123、I-125 F-18、Ga-67、Ga-68）、不対スピン原子およびフリーラジカ ル（例えば、Fe、ランタイド類（lanthides）、およびGd）、ならびに磁気共鳴 イメージング（MRI）のためのコントラスト試薬（例えば、キレート化した（DTP A）マンガン）を含む。 「治療用試薬」とは宿主に対して生物学的な効果を奏することのできる薬物を 意味する。好ましい治療用試薬は、腫瘍もしくは感染が発生したり生長したり（ 全身性または局所性）するのを阻止することができるものである。治療用試薬の 例には、薬物（例えば、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬）、毒物（例えば、 リシン）、放射性核種（例えば、I-131、Re-186、Re-188、Y-90、Bi-212、At-21 1、Sr-89、Ho-166、Sm-153、Cu-67、およびCu-64）、ホルモン拮抗剤（例えば、 タモキシフェン）、重金属錯体（例えば、シスプラチン）、オリゴヌクレオチド （例えば、標的の核酸配列に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば 、mRNA配列)）、化学療法用ヌクレオチド、ペプチド、非特異的（非抗体）タン パク質（例えば、糖オリゴマー）、ホウ素含有化合物（例えば、カルボラン）、 光力学的試薬（ロダミン123）、エネジン（enediynes）（例えば、カリケアミシ ン（calicheamicins）、エスペラミシン（esperamicins）、ダイネミシン（dyne micin）、ネオカルジノスタチン（neocarzinostatin）発色団、およびケダルシ ジン（kedarcidine）発色団）、および転写に基づく薬剤などがある。腫瘍の発 生または生長を治療または抑制するための好ましい態様において、この治療用試 薬は放射性核種、毒物、ホルモン拮抗薬、重金属錯体、オリゴヌクレオチド、化 学療法用ヌクレオチド、ペプチド、非特異的（非抗体）タンパク質、ホウ素化合 物、またはエネジンである。細菌感染の発生または生長を治療または抑制するた めの好ましい態様において、この治療用試薬は抗生作用の放射性核種またはオリ ゴヌクレ オチドである。真菌感染の発生または生長を治療または抑制するための好ましい 態様において、この治療用試薬は抗真菌化合物の放射性核種またはオリゴヌクレ オチドである。 「標的」とは、インビボでビオチン化合物が結合する部位を意味する。好まし い標的は、腫瘍（例えば、脳、肺（小細胞および非小細胞）、卵巣、前立腺、乳 房、および結腸の腫瘍、ならびにその他の癌および肉腫など）である。他の好ま しい標的には、感染部位（例えば、細菌、ウイルス（例えば、HIV、ヘルペス、 肝炎）による感染の部位、および病原菌（カンジダ種（Candida sp.）による感 染部位）がある。特に好ましい標的となる感染生物は、薬物耐性の微生物である （例えば、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、エンテロコッカス（Enterococc us）、ヘマトフィラス・インフルエンザ（Haemophilus influenza）、ミコバク テリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ナイセリア（Ne isseria）、ゴノロエ（gonorrhoeae）、プラスモディウム・ファルシパルム（Pl asmodium falciparum）、シュードモナス・エルギノサ（Pseudomonas aeruginos a）、シゲラ・ディセンテリエ（Shigella dysenteriae）、スタフィロコッカス ・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ストレプトコッカス・ニューモニエ （Streptococcus pneumoniae））。感染部位におけるビオチンの局在化は、ビオ チンが多くの細菌、ウイルス、および真菌の必須栄養素であるという事実に関連 しているのであろう。 「被検者」とは、ヒトまたは動物（例えば、ラット、マウス、ウシ、ブタ、ウ マ、ヒツジ、サル、ネコ、イヌ、ヤギなど）を意味する。 ビオチン化合物の作製法 プロテインA、カルボイイミド(carboiimide)、ジマレイミド(dimaleimide)、 ジチオ-ビス-ニトロ安息香酸（dithio-bis-nitrobenzoic acid/DTNB）、N-サク シニミジル-S-アセチル-チオ酢酸（N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate/SATA ）、およびN-サクシニミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート（N-succi nimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate/SPDP）、6-ヒドラジノニコチマイド（ 6-hydrazinonicotimide/HYNIC）、N₃S、およびN₂S₂などのさまざまなカップリン グ試薬または架橋試薬を、ビオチンアミドアナログ、またはビオチン化合物を合 成す る周知の手法において用いることができる。例えばビオチンは、「Hnatowich et al Int．J．Appl．Radiat．Isotop．33: 327(1982)」に記載された二環性無水 物法を用い、DTPAを介して複合化することができる。 スルホサクシニミジル6-（ビオチンアミド）ヘキサノエート（sulfosuccinimi dyl 6-(biotinamido)hexanoate）（NHS-LC-ビオチン：Pierce Chemical Co．Roc kford，ILより購入することができる）に加えて、「ビオシチン（biocytin）」 、即ちビオチンのリジン複合体も、その一級アミンの利用可能性のためにビオチ ン化合物を作る際に有用である。さらに対応するビオチン酸塩化物または酸前駆 体を、既知の方法によって治療用試薬のアミノ誘導体と結合させてもよい（例え ば、実施例1および2に記載された方法を参照のこと）。 合成したビオチン化合物およびビオチンアミドアナログは、高磁場NMRスペク トルの標準法、ならびにIR、MS、および旋光度を用いてその特性を明らかにする ことができる。元素分析、TLC、および／またはHPLCを純度の測定のために用い ることができる。98％以上の純度であると好ましい。TLCおよび／またはHPLCは 、より親油性の高い化合物の特性を明らかにするためにも用いられる。 合成後、候補となるビオチン誘導体を、アビジン結合能について（例えば後述 の実施例3に記載されているように）、インビボでの感染部位への結合性につい て（例えば実施例４に記載されているように）、またはインビトロもしくはイン ビボでの腫瘍への結合性についてスクリーニングすることができる。さらに、被 検者にその化合物を投与し、種々の時間が経過した時点（例えば、30分、1時間 、24時間経過後）で血液試料を採取し、その血液試料をビオチン化合物および／ または代謝物について分析することによって、安定性を試験することもできる。 二つの¹⁸Fビオチン誘導体、即ちアミド基を含む誘導体（ビオチン1）およびア ルキル基を含む誘導体（ビオチン2）を、実施例1および2に記載されているよう に調製した。ビオチン1は、硫酸エステルから高収率で高い特異的活性で容易に 合成することができた。ビオチン1は、ビオチンの基本的構造を保持している。 ビオチン2は、ビオチンがアビジンおよび感染部位に結合する際の側鎖の役割を 解明するために調製した。 二つのビオチン誘導体を、実施例3に記載されているように、種々の濃度の非 標 識d-ビオチンの存在下でアビジンへの結合性について評価した。ビオチン1はア ビジンに結合することが判明し、非放射性のd-ビオチンと置換することができた 。スカッチャードトランスフォーメーション置換曲線（scatchard transformati on displacement curve）は、B_maxが5.57×10^-16Mで3.12×I0^-14MのKdを示した 。これに対して化合物2は、アビジンに対して特異的な結合性を示さなかった。 続いて両方の化合物を、実施例4に記載したように、大腸菌を感染させたラッ トの感染部位における局在性について評価した。感染させたラットのうちの半数 は、¹⁸F標識したビオチンアナログを静脈内注入する24時間前に、アビジンで処 理した。アビジンの前処理を行わない場合、ビオチン1は、注入後60分後に、正 常の筋肉に比べて感染した筋肉に高い選択性（6.08±1.12）を示した。¹⁸F標識 したビオチン1を注入する24時間前にアビジンを投与することによって、その比 率はほんのわずかに増加した（6.39±0.96）。 これとは対照的にビオチン2の生体内分布は、感染した筋肉／正常の筋肉の比 率が0.58±0.07であって、正常の筋肉の方により多い結合を示した。このような 選択性の欠如は、感染部位への局在化に側鎖のアミド基が重要であることを示し ている。ビオチン1およびビオチン2の両方で、ある程度の脱フッ素がインビボで 起こった。このことは、60分後に、それぞれ2.94±0.37および1.17±0.21％（IG ／g±標準偏差）¹⁸Fの骨取り込みが増加したことから明らかである。 治療用試薬としてのビオチン化合物の使用 治療で用いる際には、有効量の適当なビオチン化合物を、その化合物が適当な 標的で取り込まれことができるような態様で被検者に投与すればよい。好ましい 投与経路は、経口投与および経皮投与（例えば貼着剤による）である。この他の 投与経路の例としては、注入（筋肉内注入、静脈注入、非経口投与、腹膜内注入 、包膜内注入など）が挙げられる。注入は一度に行ってもよいし、または点滴で 行ってもよい。投与経路によっては、治療用試薬であるビオチン化合物を、目的 とする機能を発揮する能力に決定的な影響を与える自然状態からその化合物を保 護するため、インビボでの利用度を増加させるため、または特異的な器官におけ る取り込みを増加させるために選ばれた材料（例えば、正または負の電荷を帯び たリポソームなど）で被覆するか、またはその材料中に配合すればよい。 治療用試薬のビオチン化合物は単独で投与してもよいし、または薬剤学的に許 容される担体を用いて複合剤の状態で投与してもよい。本明細書で用いられてい るように「薬剤学的に許容される担体」という語句は、化合物がその目的とする 作用を発揮できるようにする、ビオチン化合物治療用試薬とともに投与すること のできる物質を含む。このような担体の例としては、溶液、溶媒、分散媒体、遅 延剤、乳化剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質に対してこのような媒体を 用いることは、当業者には周知である。ビオチン化合物を使用する際に好適な従 来より知られたこの他の担体も、本発明の請求の範囲に含まれる。 ビオチン化合物治療用試薬の「有効量」という用語は、感染、腫瘍、またはそ の他の標的を減少させたり抑制したり維持（例えば、蔓延の抑制）したりするた めに必要な量、または充分な量のことをいう。有効量は、治療されるべき疾患も しくは症状、投与されている特定のビオチン化合物、被検者の体重、または疾患 もしくは症状の重度などの要因に依存して変化しうる。当業者の常法の一つによ り、過度の実験を要することなく、特定の化合物の有効量を経験的に決定するこ とができる。 腫瘍または感染部位を治療したり抑制したりするための好適な用量は5μg〜10 0mgの範囲内である。しかしながら正確な用量は、投与される治療用試薬の毒性 に大きく依存する。例えば被検者は、１ミリグラム以上の用量のブレオマイシン には耐えることができない。さらに、ある種の化学療法ペプチドは、マイクログ ラム単位の量を被検者に投与した場合、血友病および他の血液疾患を引き起こす 。しかしながら、本発明のビオチン化合物による治療用試薬の選択的な指向化は 、他の方法を用いた場合の正常な体細胞に対する毒性作用を減少させる。 イメージング試薬としてのビオチン化合物の使用 ビオチン化合物はさまざまなイメージング試薬で標識することができる。この イメージング試薬は当業者にとって既知であり、インビボもしくはインビトロで その化合物を検出またはモニターするために用いられる手段にある程度依存する 。陽電子放射断層撮影法（PET）および単一光子放射コンピユータ断層撮影法（S PECT）を行うための好ましいイメージング試薬には、F-18、Tc-99m、およびI-12 3が含まれる。磁気共鳴イメージング（MRI）を行う際に好ましい試薬は、不対の スピン電子、即ちフリーラジカルを有する適当な原子を含む。イメージング試薬 は、当業者に周知のさまざまな方法によって、ビオチン化合物と複合化すること ができる。好ましい態様において、このイメージング試薬は、HYNIC、DTPA、ま たは他のキレート試薬とアミン基を介して結合している。 適当なイメージング試薬で標識されたビオチン化合物を、特定の治療用試薬と しての候補であるビオチン化合物の結合親和性を試験するために、特定の腫瘍細 胞系もしくは細菌、ウイルス、または真菌が感染した組織の培養物に添加するこ とができる。 また標識されたビオチン化合物を適当な被検者（例えばサル、イヌ、ブタ、ウ シ）に注入し、例えば後述の実施例4で記載したように、インビボで腫瘍または 感染部位との結合性をモニターすることもできる。 本発明は以下に記載した実施例によって更に例示されるが、実施例は決して本 発明を限定するためのものではない。本願において引用された全ての引用文献（ 論文、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含 む）の内容は、参照文献として明らかに本明細書に組み入れられる。 実施例1： 二種のF¹⁸標識されたビオチンアナログの合成 炭素および水素についての元素分析は、ガルブレイス・ラボラトリーズ（Galb raith Laboratories）（Knoxville，TN）によって行われた。融点はフィッシャ ー・ジョンズ（Fisher-Johns）装置を用いて測定したが、補正は行わなかった。 プロトンNMRスペクトル（溶媒はd₆-DMSO）はブルーカーAM500（Bruker AM 500） 装置で測定し、その化学シフトはテトラメチルシランから低磁場へのミリオン（ デルタ）あたりの割合で記録した。全ての試薬は、アルドリッチ・ケミカル社（ Aldrich Chemical Co）(Milwaukee，WI)から購入し、更に精製することなく用い た。アセトニトリルは、ピアース社（Pierce）(Rockford，IL)から購入し、溶剤 として用いた。 薄層クロマトグラフィーはシリカゲルGf250プレート（Analtech，Inc.，Newar k，DE）上で行った。放射性標識が施された化合物のクロマトグラフィーは、バ イオスキャン・システム200（Bioscan System 200）(Washington，D．C.)を用い てカウントした。高圧液相クロマトグラフィーは、リゾルベックスC18（Resolve x C18）カラム（4.6mm×25cm、Fisher Scientific Co.）上で、水／アセトニトリ ル（60：40）の溶媒系を用いて、1ml／分の流速で行った。分離は紫外線検出器 （λ＝185nm）およびNaI（Tl）放射活性測定器を用いてモニターした。 ［3aS-（3aα,4β,6aα）］-ヘキサヒドロ-2-オキソ-1H-チエノ［3,4d］ イミダゾール-4-（N-3-（1-フルオロプロピル））ペンタンアミド （ビオチン1）の合成 （＋）ビオチン（1g、4.09mmol）を、攪拌した塩化チオニルおよびベンゼンの 50/50混合溶液20mlに添加し、その混合液をN₂の気流下で2時間還流した。過剰量 の塩化チオニルを蒸留によって除去し、その残渣をN₂の気流下で室温にまで冷却 してから乾燥THF（10ml）に溶解し、それをTHF（20ml）に入れた3-アミノ-1-プ ロパノール（1g）の攪拌溶液に25℃で添加した。この溶媒を輪転エバポレーショ ンによって除去し、続いて過剰量のアミノプロパノールを120℃で減圧（1torr） にして除去した。この粗製物質を、シリカゲルカラム（30g）上でクロマトグラ フィーを行い、CH₂Cl₂／MeOH／HCO₂H（20：80：0.5）を用いて溶出することによ って精製した。MeOHから再結晶を行うことで0.80g（65％）の生成物が得られた 。この生成物は、CH₂Cl₂／MeOH／HCO₂H（20：80：0.5）を用いたTLCで単一のス ポット（Rf＝0.45）を示した。融点＝130〜132℃であった。¹H NMR（d₆-DMSO）d 2.05(t,J=6.2 Hz，2H，CH₂-O)，3.2-3.5(m，6H，N-CH₂-)，6.35(s，1H，O=CNH- 環)，6.40(s，IH，O=CNH-環)，7.75(t，J=5.6 Hz，1H，O=C)。C₁₃H₂₂N₃O₂Sに対 する計算値： C,51.80、H,7.70。実測値： C,51.69、H,7.51。 この生成物（100mg、0.33mmol）を、加熱しかつN₂気流下で攪拌しながら3mlの 無水ピリジンに溶解させた。この溶液を室温にまで冷却し、メタンスルホニルク ロライドの0.87MのCH₂Cl₂溶液、0.7mLを添加した。30分経過後、その混合液につ いてアセトン／アセトニトリル（90：10）を用いてシリカゲル上でクロマトグラ フィーを行った。生成物（86mg，69％）は、MeOH／CH₂Cl₂／HCO₂H（10：90：0.5 ）を用いたTLCで、単一のスポット（Rf＝0.49）を示した。なおそのスポットはM oO₃・H₃PO₄を用いて可視化した。 KF（48mg）、クリプトフィックス（Kryptofix）（300mg）、ビオチンメシレー ト（200mg）、および7mlのアセトニトリルを含む10mlの反応混合物を110℃で30 分 間加熱した。溶媒を輪転エバポレーションにより除去し、その残渣をCH₂Cl₂／Me OH／HCO₂H（85：15：0.5）を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーを行った 。この生成物、即ち［3aS-（3aα,4β,6aα）］-ヘキサヒドロ-2-オキソ-1H-チ エノ［3,4d］イミダゾール-4-（N-3-（1-フルオロプロピル））ペンタンアミド （ビオチン1）は同じ溶媒を用いたTLCで、単一のスポット（Rf＝0.38）を示した 。¹H NMR（d₆-DMSO）d 3.2-3.5(m，6H，N-CH₂-)，4.4(dt，J=52，6.5 Hz，2H，C H₂-F)，6.35（s，1H，O=CNH-環)，6.40(s，1H，O=CNH-環)，7.75(t，J=5.6 Hz， 1H，O=CNH)。C₁₃H₂₂N₃O₂SFに対する計算値： C,54.90、H,7.80。実測値： C,5 2.19、H,8.13。 ［3aS-（3aα,4β,6aα）］-テトラハイドロ-4-（5-（1-［¹⁸F］ フルオロ−ペンチル）-1H-チエノ-［3,4-d］イミダゾール-2（3H）-オン （ビオチン2）の合成 無水エーテル（125ml）中にリチウムアルミニウムハイドライド（LAH）（1.0g ，25.8mmol）を入れて攪拌した懸濁液に、（＋）ビオチン（1.0g，4.01mmol）の 加熱ピリジン（25ml）溶液を滴下して添加した。添加し終わったところでその反 応混合液を室温で30分間攪拌した。続いて、水を注意深く滴下することによって 、過剰量のLAHを分解した。水および有機溶媒を輪転エバポレーションによって 除去した。その残渣を6N HClを用いて酸性（pH2）にし、水を輪転エバポレーシ ョンによって除去した。得られた残渣をクロロホルム（5×20mL）で抽出し、ク ロロホルム層を減圧下でエバポレーションすることによって白色の固体を得た。 メタノールから再結晶をすることで0.44g（50％）の還元型生成物が得られた。 融点 164〜167℃（参照11、融点164〜169℃）。¹H NMR（d₆-DMSO）d 4.35(t，J =6 Hz．2H，O-CH₂-)，6.35(s，1H，O=CNH-環)，6.40(s，1H，O=CNH-環)。 （＋）ビオチン（100mg，0.43mmol）のピリジン（3ml）溶液に、CH₂Cl₂に入れ た塩化チオニルの0.87M溶液、0.6mLを添加した。その混合物を30分間攪拌し、続 いてアセトン／アセトニトリル90：10を用いたシリカゲル上でクロマトグラフィ ーを行った。生成物（96mg，75％）は、EtOAc／CH₂Cl₂／アセトン／HCO₂H（10： 80：10：0.5）を用いたTLCで、MoO₃・H₃PO₄を用いて可視化したところ、単一の スポット（Rf＝0.42）を示した。 ビオチン2は、上述した［3aS-（3aα,4β,6aα）］-ヘキサヒドロ-2-オキソ-1 H-チエノ［3,4d］イミダゾール-4-（N-3-（1-フルオロプロピル））ペンタンア ミドについて記載したのと同様の方法でビオチノールメシレートから合成した。 ［3aS-（3aα,4β,6aα）］-テトラハイドロ-4-（5-（1-［¹⁸F］フルオロ-ペン チル）-1H-チエノ［3,4-d］イミダゾール-2（3H）-オンは、EtOAc／CH₂Cl₂／ア セトン／HCO₂H（10：80：10：0.5）（Rf＝0.48）を用いたシリカゲル上で精製し た：融点110〜120℃。¹H NMR（d₆-DMSO）d 4.6(dt，J=55，6.5 Hz，F-CH₂-),6.3 5(s，1H，O=CNH-環)，6.40(s，1H，O=CNH-環)。C₁₀H₁₆N₂OSFに対する計算値： C,56.31、H,7.57。実測値： C,56.59、H,7.79。 ¹⁸F標識したビオチン1およびビオチン2の調製 ¹⁸F標識したビオチン1 ［¹⁸F］フロライドは、サイクロトロンを用いて核反応¹⁸ O（p,n）¹³Fを、17MeVで20mA-時間、銀プレートの標的に入れた¹⁸O-高濃度水 で行うことで製造した（Scanditronix，Sweden，MC17F）（Kilbourn MR，Jerabe k PA，Welch MJ．改良型の［¹⁸F］フロライド製造用［¹⁸O］水標的（improved［¹⁸ O］water target for［¹⁸F］fluoride production）、Int J Appl Radiat Iso t 36: 327-328（1985）参照）。 ¹⁸FのH₂ ¹⁸O溶液（50mCi,1mL）、クリプトフィックス（Kryptofix）（3mg）、K₂ CO₃（1mg）を含む5mlの反応混合物を、N₂気流下、100℃で乾燥するまでエバポ レーションした。この内容物を、N₂気流下で110℃で加熱しつつアセトニトリル （4×2mL）を添加することによって乾燥した。アセトニトリル（1mL）中のビオ チンメシレート（2mg）を添加して、その容器を密封した後110℃で10分間加熱し た。溶媒を除去してから標識された生成物を、シリカゲル（10g）の短いカラム 上でMeOH／CH₂Cl₂／HCO₂H（20：80：0.5）を用いてクロマトグラフィーすること によって精製した。この合成および精製に要する時間は90分（衝撃を終えてから ）であり、その放射化学的な収率は3.4〜5.9mCi（12〜21％、EOS）であった。最 終的な生成物のHPLC分析では、維持時間（Rt）が2.8分のところで［¹⁸F］フルオ ロ-ビオチンのピークに対応する一つの放射活性ピークを示した。［3aS-（3aα, 4β,6aα）］-ヘキサヒドロ-2-オキソ-1H-チエノ［3,4-d］イミダゾール-4-（nn N-3-（1-［¹⁸F］フルオロプロピル））ペンタンアミドの化学的純度は、＞8％で あった。 ¹⁸F標識したビオチン2 ¹⁸F標識したビオチン2は、¹⁸F-標識したビオチン1と 同様の方法で合成した。¹⁸F標識したビオチン2は、シリカゲル（10g）上でEtOAc ／CH₂Cl₂／アセトン／HCO₂H（10：80：10：0.5）を用いて精製した。この放射化 学的な収率は5.6mCi（20％、EOS）であり、放射化学的な純度は98％以上である ことが検出された。［3aS-（3aα,4β,6aα）］-テトラハイドロ-4-（5-（1-［^{1 8} F］フルオロペンチル）-1H-チエノ［3,4-d］イミダゾール-2（3H）-オンの化学 的純度は、HPLCで＞98％であった。 実施例2： アビジン対d-ビオチンに対するF-18で標識されたビオチン1および ビオチン2の競合的結合 ビオチンのフルオロアナログの結合特性について予備的な測定を行った。これ らの新規なF-18標識されたビオチンアナログのアビジンへの結合性は、種々の濃 度の非標識d-ビオチンの存在下でF-18標識されたビオチンアナログがアビジンに 結合する結合度を測定することによって評価した。d-ビオチンは、リン酸緩衝食 塩水pH7.4（PBS）で段階希釈した。担体を加えていない固定量のF-18で標識され たビオチン1または2（10〜100μCi）を、それぞれのd-ビオチン希釈液と混合し て、非放射性ビオチンの濃度の範囲が3次元以上大きくかつアビジンの濃度（10^{- 16} M）よりも小さくなるようにした。F-18ビオチン／非放射性ビオチン溶液の200 μlのアリコートを、200μlのアビジンのPBS溶液に添加した。この溶液を攪拌し て1時間インキュベートした後、その溶液の5μlのアリコートを0.1M酢酸緩衝液 、pH6.0を用いて簡易の薄層クロマトグラフィー（Gelman ILTC-SG）によって分 析した。このクロマトグラフィー系では、アビジンに結合したF-18ビオチンアナ ログは移動しないが、これに対して未結合のF-18ビオチンアナログは溶媒の先端 に移動する。F-18ビオチンアナログの結合率は［（当初のカウント数／全体のカ ウント数）^*100］として計算した。それぞれのF-18-ビオチンアナログについて 、初めに潜在的に残っていた不純物を検出し、結合性の結果をそれに従って補正 した。 実施例3： ラットにおける生体内分布の研究 臨床的な大腸菌単離物は、20％のグリセロールおよび80％のデキストロースリ ン酸を含む凍結培地中で使用するまで-70度で貯蔵した。細菌のアリコートを解 凍し、BBLブルセラ（BBL Brucella）寒天プレート上で一晩生育させた段階希釈 物に ついてコロニーを計数した。コロニーの計数に基づいて新しく解凍した細菌懸濁 液を洗浄し、最終的な濃度が8×10¹⁰個の細菌／mlになるように食塩水で希釈し た。細菌懸濁液（8×10⁹個の細菌／ml）のアリコート（0.1ml）を、48匹の雄の スプラーグ・ダウレイラット（Sprague-Dawley rats）（125〜150g、Charles Ri ver Breeding Laboratories，Burlington，MD）の右腿部の筋肉内に注入した。2 4匹のラットを、標識したビオチン化合物それぞれについて使用した。注入後24 時間経過したとき右腿部には腫脹部が容易に観察され、24匹のラットそれぞれに 尻尾の静脈から1.67mgのアビジンを含む食塩水を注入した。細菌を接種してから 48時間経過した時点で80〜150mCiの¹⁸F-ビオチン1および2を投与した。注入から 5分後および60分後に、それぞれ6匹づつのラットを屠殺した。心臓を穿刺して血 液試料を採取した。注射器の重さを注入する前と後とで計量し、供給した容積を 測定した。1単位容積当りの活性を標準より求めた。全部で11の異なる組織を摘 出し、計量してカウントした。これらの組織は、血液、骨、肺、肝臓、副腎、脾 臓、腎臓、心臓、筋肉（腿部）、精巣、および感染した筋肉（腿部）である。摘 出した組織をブロットし、重さを計ってから適当なシンチレーションウェルカウ ンターで計数した。生のカウント数を崩壊補正した。得られた結果は、1グラム あたりに注入した用量のパーセント、および正常な筋肉に対する感染した筋肉の 比率（平均値±標準偏差）として表した。生体内分布の結果は、分散（一方向AN OVA）を分析することによって評価した。生体内分布に対するアビジン前処理の 効果は、スチューデントt検定によって評価した。 表1は、アビジンで前処理（24時間前）したラットとしていないラットに、注 入を行った後5分および60分経過した時点での¹⁸F標識ビオチン1の生体内分布を 示している。分散の分析は、5分後および60分後に、ビオチン1の蓄積に対する臓 器の有意な主作用（P＜0.001）を示した。5分後では腎臓におけるビオチン1の蓄 積量は、他のすべての臓器よりも多かった（血液よりも4.5倍の大きさである） （P＜0.001）。肝臓および脾臓におけるビオチン1の蓄積量は、正常の筋肉（P＜ 0.02）よりも多かった。放射能の充分な排出は、骨（P＜0.001）を除く他の全て の感染に関与した臓器において60分以内に起こった。60分後では、正常の筋肉に 比較して感染した筋肉における選択性が6.08±1.12であり（表２参照）、感染し た筋肉に おける蓄積量は腎臓（P＜0.05）、血液（P＜0.01）、脾臓（P＜O.01）、肝臓（P ＜0.001）、および正常な筋肉（P＜0.001）よりも多い。全ての臓器における、 ビオチン1の分布は、5分後ではアビジン前処理による有意な変化はなかった。前 処理後60分では、骨における蓄積（P＜0.01）がアビジン前処理をしていないも のよりも小さかった。処理をしていないラットと比較すると、アビジン処理した ラットにおけるビオチン1の蓄積は、腎臓（P＜0.02）、血液（P＜0.05）、およ び正常な筋肉（P＜0.002）において、より大きかった。 ラットの組織におけるビオチン2の生体内分布が表3に示されている。アビジン の前処理を行っていない場合の注入の5分後では、肝臓、腎臓、および副腎での ビオチン2の蓄積量が血液（P＜0.001）、心臓（P＜0.001）、脾臓（P＜0.001） 、筋肉（P＜0.001）、および骨（P＜0.001）よりも多かった。60分後では骨にお けるビオチン2の蓄積量が全ての他の臓器（P＜0.001）よりも多く、そして副腎 および肺における蓄積量が腎臓（P＜0.05）、肝臓（P＜0.02）、正常の筋肉（P ＜0.001）、および血液（P＜0.001）よりも多かった。感染した組織／正常な組 織の比率は0.58±0.07であり、これは正常の筋肉への結合性が感染した組織に対 する結合性よりも大きいことを示している（表４参照）。アビジンで前処理を行 った場合の5分後では、副腎（P＜0.01）、腎臓（P＜0.001）、脾臓（P＜0.001） 、および心臓（P＜0.05）におけるビオチン2の蓄積量が処理を行わなかったラッ トに比較して減少した。60分後では、処理を行わなかったラットに比較して血液 （P＜0.05） 、心臓（P＜0.05）、脾臓（P＜0.001）、腎臓（P＜0.01）、および正常の筋肉（ P＜0.05）における蓄積量が多かった。アビジンの前処理により、感染した組織 ／正常の組織の比率は変化しなかった。 実施例4： マラリアおよび結核を治療するためのビオチン化合物 生長に関与する遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばアス パルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate semialdehyde dehydro genase）（asu）またはアスパルタキナーゼ（aspartakinase）（ask））、また はミコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）および プ ラスモディウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）の細胞壁またはミ コール酸（mycolic acid）合成に関与する遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌ クレオチドを、上述したビオチン化合物に結合させ、結核またはマラリアを予防 または治療するために被検者に投与することができる。均等物 当業者は、本明細書に開示された発明の特定の態様の均等物を、理解し、また は通常の実験のみを用いて確認することができるであろう。該均等物は以下の請 求の範囲に包含されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 285/10 Ａ６１Ｋ 31/415 // Ａ６１Ｋ 31/415 Ｃ０７Ｄ 235/02 Ｂ Ｃ０７Ｄ 235/02 Ａ６１Ｋ 49/02 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ソープ ティモシー エム. アメリカ合衆国 ジョージア州 デ カチ ュアー カリッジ プレイス コート 616 (72)発明者 ベイビッチ ジョン ダブリュー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ノ ース シチュエイト ティルデン ロード 438

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1．以下の構造式を有するビオチンアミドアナログ化合物。 式中、 n＝ 2〜10； R₁〜R₅＝H、アシル基、アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニ レン基、アルケニル基、またはアルキニル基、 R₆＝H、アシル基、アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン 基、アルケニル基、もしくはアルキニル基；または結合した治療用試薬もしくは 診断用試薬；かつ X＝ C＝O、S＝O、またはC＝NH。 2．ビオチンアミドアナログが、［3aS-（3aα,4β,6aα）］-ヘキサヒドロ-2-オ キソ-1H-チエノ［3,4d］イミダゾール4-（N-3-（1-フルオロプロピル））ペンタ ンアミド（［3aS-（3aα,4β,6aα）］-hexahydro-2-oxo-1H-thieno［3,4d］imi dazole 4-（N-3-（1-fluoropropyl））pentanamido）である、請求の範囲1の組 成物。 3．R₆が、結合した治療用試薬、または治療用試薬に結合したビオチンの組成物 である、請求の範囲1の組成物。 4．請求の範囲3の組成物と薬剤学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。 5．治療用試薬が、薬物、毒物、放射性核種、ホルモン拮抗薬、重金属錯体、オ リゴヌクレオチド、化学療法用ヌクレオチド、ペプチド、非特異的（非抗体）タ ンパク質、ホウ素含有化合物およびエネジン（enediynes）からなる群より選択 されたものである、請求の範囲4の薬学的組成物。 6．有効量の請求の範囲5の組成物を被検者に投与することを含む、被検者におけ る腫瘍または感染部位の発生または生長を治療または抑制する方法。 7．感染が細菌感染である、請求の範囲6の方法。 8．細菌感染が大腸菌感染である、請求の範囲7の方法。 9．R₆が結合したイメージング試薬である、請求の範囲1の組成物。 10．イメージング試薬が、In-111、Tc-99m、I-123、I-125 F-18、Ga-67、Ga-68 、常磁性原子、およびコントラスト試薬からなる群より選択されたものである、 請求の範囲9の組成物。 11．請求の範囲9の組成物を被検者に投与し、適当な手段を用いて該組成物を検 出またはモニターすることを含む、被検者における腫瘍または感染部位をイメー ジングする方法。 12．以下の構造式を有するビオチン化合物。 式中、 n＝ 2〜10 R₁〜R₅＝ H、アシル基、アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニ レン基、アルケニル基またはアルキニル基、 R₆＝ H、アシル基、アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン 基、アルケニル基もしくはアルキニル基；または結合した治療用試薬もしくは診 断用試薬、 X＝ C＝O、S＝O、またはCNH、かつ 2、3、もしくは4位＝ O、S、またはN。 13．R₆が結合した治療用試薬である、請求の範囲12の組成物。 14．請求の範囲13の組成物と薬剤学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物 。 15．治療用試薬が、薬物、毒物、放射性核種、ホルモン拮抗薬、重金属錯体、オ リゴヌクレオチド、化学療法のヌクレオチド、ペプチド、非特異的（非抗体）タ ンパク質、ホウ素含有化合物、およびエネジン（enediyne）からなる群より選択 されたものである、請求の範囲14の薬学的組成物。 16．有効量の請求の範囲15の組成物を被検者に投与することを含む、被検者にお ける腫瘍または感染部位の発生または生長を治療または抑制する方法。 17．感染が、細菌、ウイルス、真菌、または原生動物の感染からなる群より選択 されたものである、請求の範囲16の方法。 18．R₆が結合したイメージング試薬である、請求の範囲12の組成物。 19．イメージング試薬が、In-111、Tc-99m、I-123、I-125 F-18、Ga-67、Ga-68 、常磁性原子、およびコントラスト試薬からなる群より選択されたものである、 請求の範囲9の組成物。 20．請求の範囲17の組成物を被検者に投与し、適当な手段を用いてその組成物を 検出またはモニターすることを含む、被検者における腫瘍または感染部位をイメ ージングするための方法。