JPH10503935A - 核レセプターファミリーに属するオーファンレセプター上のｏｒ−１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、図１のアミノ酸配列または図１に示されるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列またはその配列に機能的に類似のアミノ酸配列を有する単離された核レセプター、おそのようなレセプターをコードするDNA配列を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 核レセプターファミリーに属する オーファンレセプター上のＯＲ−１ 本発明は、細胞核レセプターに関する。 細胞に、レチノイン酸、ビタミンD3、ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモ ンのような分子に対する応答性を付与する、核レセプターの大きなファミリーが 同定されている。広範な研究により、核レセプターのこのスーパーファミリーの メンバーが、「ホルモン応答エレメント（hormone response elements：HRE）」 と呼ばれる個々別々のcis-作用エレメントへの直接的結合を介して遺伝子転写を 活性化および／または抑制していることが示されている。これらのHREは、コン センサスのパリンドローム性６ヌクレオチドのDNAモチーフの繰返しを含むこと が示されている。HREの特異性は、ハーフサイト（Halfsite）（即ち、パリンド ローム配列の半分）の配向、およびその間のスペーシングによって決定される（ ウメネソノ ケー．（Umenesono K.）ら、1991 Cell 65、1255-1266）。 特異的DNA結合は、２つの亜鉛フィンガーを含む異なるDNA結合ドメインによっ て仲介され、該亜鉛フィンガーは、全てのこのような発見された核レセプターの 間で保存さ れている。最初の亜鉛フィンガーのC-末端塩基での３個のアミノ酸（「P-ボック ス」として公知）は、ハーフサイトのヌクレオチド配列の認識に重要である。核 レセプター・スーパーファミリーのメンバーは、Pボックス内のアミノ酸配列に 基づいて、種々のグループに分類されている。 核レセプターであると考えられる分子は、それに対するリガンドは同定されて いないが、それらは特徴付けされたレセプターに構造的に関連しているので、「 オーファン・レセプター（orphan receptor）」と呼ばれている。多くのそのよ うなオーファン・レセプターが、同定されている（例えば、エヴァンス アール ．エム．（Evans R.M.）、（1988）Science 240、889-895およびオマリー，ビー ．（O'Malley，B.）、（1990）Mol．Endocrinol．4 363-369を参照のこと）。 本発明の１つの局面に従えば、図１のアミノ酸配列または図１に示されるアミ ノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列またはその配列に機能的に類似するアミノ 酸配列を有し、これ以降「OR-1」と称する、新規な核レセプターが提供される。 図１に示される配列と約90%より多く同一である、好ましくは95%より多く同一 であるアミノ酸配列は、本出願の 目的のためには、実質的に同じアミノ酸配列である。 本発明の他の局面に従えば、本発明の最初の局面に従う核レセプターをコード するDNA配列が提供される。好ましくは、DNA配列は、図２に示されるもの、また はOR-1の機能を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするDNA配列であ る。 本発明の核レセプターは、レチノイン酸レセプター（RAR）、ビタミンDレセプ ター（VDR）、および甲状腺ホルモンレセプター（TR）と類似のP-ボックス・コ ンフィギュレーションを有し、それらのレセプターと同じサブファミリーに含め ることができる。 好ましくは、レセプターは、RXRとヘテロ二量体化して、複合体を形成する。 好ましくは、レセプターは、RXRと相互作用し、DNA配列-AGGTCA-の少なくとも １個の繰返しを含むDNA配列に結合する。好ましくは、その配列は、AGTCAGGTCAC TCGAGGTCAGTCAである。 好ましくは、レセプターは、9-cisレチノイン酸のシグナリングを調整する。 本発明の核レセプターであるOR-1、およびその産生方法は、実施例のみにより 、添付の図面である図１〜５を参照して説明される。図面に関しては： 図１は、本発明の核レセプターのアミノ酸配列を示す； 図２は、本発明の核レセプターのDNA配列を示す； 図３は、本発明の核レセプターの一次アミノ酸配列と核レセプター・スーパー ファミリーの他のメンバーのものとの比較を示す； 図４は in situハイブリダイゼーションによる、ラット組織でのOR-1 mRNA産 生細胞の局在化； 図５Ａは、７個の可能（potential）なHREであるDR-0〜DR-6のDNA配列を示す ； 図５Ｂは、OR-1またはレチノイドＸレセプター（RXR）と可能なHREであるDR-2 及びDR-4との相互作用を描いている；および 図６は、OR-1が、DR-4含有プロモーターに、RXRの9-cisレチノイン酸応答性を 付与することを示す実験を描いている。 ＯＲ−１のクローニングおよび発現 ラットのOR-1を、Sprague Dawleyラットの肝臓のcDNAライブラリーから、販売 されているλZAPベクター（ストラタジーン（Stratagene）、米国）に、ゲット リヒャー， Sci．USA 89、4653-4657に記載される技術を用いてクロ ーニングした。 屠殺の後、胎児および成熟ラットの組織を切り出し、ドライアイス上で凍結さ せた。低温維持された切片を、ダガーリンド，エー（Dagerlind，Å）ら、（199 2）Histochemistry 98 34-49に記載されるような、OR-1 mRNAの100〜151位およ び850〜900位に相補的な48量体のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。 幾つかの無関係のオリゴヌクレオチドも、コントロールとして使用した。それ ぞれの標識されていないコントロールのオリゴヌクレオチドを100倍添加すると 、OR-1プローブで観察される全ての標識が無くなった。 プラスミド OR-1 cDNAをEco RIフラグメントとして、pGEM-3Z（プロメガ（Promega））に サブクローニングしてプラスミドpR OR-1-Sp6を作製するか、または、pCMV5の多 重クローニング部位（アンダーソン，エス．（Andersson，S.）ら、1989 J．Bio l．Chem.、264、8222-8229に記載）にサブクローニングしてプラスミドpCMV-OR- 1を作製した。レポーター構築物pDR4-AFは、ゲアリング，ケー．エル．（Gearin g，K.L.）ら、1993、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、90、1440-1444に記載される ように、DR4-TK含有プロモーター の制御下に、（バーガー，ジェイ．（Berger，J.）ら、1988 Gene 66、1-10に記 載される）ヒトPAP（胎盤アルカリ性ホスファターゼ）の分泌形態に関するcDNA のSphI-XhoIフラグメント、pRRXR-T7およびpCMV-RXRを含む。 ＤＮＡ結合の研究 ゲル・シフトを、販売されているTNT^TM-にカップリングされた網状赤血球ライ ゼート・システム（プロメガ、マディソン（Madison）、米国）を用いて、イン ビトロで翻訳されたOR-1およびRXRを使用しながら行なった。タンパク質を、４ μgのポリ（dI-dC）および非標識の競合DNAを用いて、氷上で15分間インキュベ ートした。そこでは、0.5ngの³²P末端標識したオリゴヌクレオチド・プローブの 添加前に100mM KCl；10mM Hepes，pH7.6；1mMジチオスレイトール；1mM EDTA；1 0%（wt./vol）グリセロールを含む溶液で表示される。反応混合物を、200Vにて ４℃で電気泳動する前に、プレーランの4%ポリアクリルアミドゲル／0.25 TBE（ 0.089m トリス−ホウ酸塩 pH 8.3，0.025 EDTA）ゲル中で、さらに10分間22℃に てインキュベートした。 下記のオリゴヌクレオチドおよびそれらの相補体を、 プローブとして使用した： 細胞およびトランスフェクション 胎生期癌P19EC細胞を、10%ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ペニシリン（100 単位／ml）およびストレプトマイシン（100mg／ml）を補足したダルベッコ変法 イーグル培地で培養した。チャンニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞を、10%ウ シ胎児血清、ペニシリン（100単位／ml）およびストレプトマイシン（100mg／ml ）を補足したハムF-12培地（Ham's F-12 medium）で培養した。細胞を、35 mmの ペトリ皿に二重に（in duplicate）プレートし、リポフェクチン試薬（ベセサダ リサーチラボラトリーズ（Bethesada Research Laboratories）、米国）を製造 者の推奨に従って用いて、30%コンフルエンシーでトランスフェクトした。12時 間後、培地を変え、場合によって、指示され るように100nM 9-cisレチノイン酸（ホフマン−ラロッシェ（Hoffman-LaRoche） からの提供物）で補足または補足せずに、さらに36時間インキュベートした。次 に、細胞培養上清を、65℃に30分間加熱した。PAP活性を、0.75mlの上清、200nM Tris（pH8.8）、275mM NaCl、0.5mM MgCl₂および5mM p-ニトロフェニルホスフ ェートを含む1 ml反応混合物中で、30℃でA₄₀₅の増大として決定した。 トランスフェクションを、異なるプラスミド調製物で６回繰返し、代表的実験 からのデータをここに示す。 結果 OR-1クローンは、55bpの長さのポリＡテイルを含む1940bpに亘り、予測分子量 50kDを有する446アミノ酸のタンパク質に対応する、ATGで開始するオープンリー ディングフレームを含む。OR-1の完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は 、図１および図２それぞれに示す。OR-1は、核レセプター・スーパーファミリー の公知のメンバーとの顕著なホモロジーを示さない：最大のホモロジーは、図３ に示されるように、N-末端ドメインにおいて10%未満、DNA結合ドメインにおいて 約50%、および推定されるリガンド結合ドメインにおいて20〜30%、を示す。 OR-1のアミノ末端ドメイン（図１の下線）は、77アミ ノ酸の長さであり、それがプロリン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、およ びアスパラギン酸の残基に富むアミノ酸配列であることを意味する、いわゆる「 ペスト（PEST）」配列をかなりの程度含む。DNA結合ドメインは、核レセプター ・スーパーファミリーのメンバーに特徴的な９個の不変の（invariable）システ インを含む68アミノ酸、並びに、このタンパク質ファミリーの全メンバーに保存 されていることが見出されている他のアミノ酸から構成される。 ゲノムのクローニング ラットのゲノム・フラグメントを単離した。それは、DNA結合ドメインまたはO R1および、その下流の全てのエクソンにまたがっている。そのゲノム構造が決定 されている殆どの核レセプターは、離れたエクソンにコードされているDNA結合 ドメインの２個の亜鉛「フィンガー」を有する。我々は、DNA結合ドメイン全体 が、OR1中の１エクソンによってコードされることを見出している。我々はさら に、これが、RLD-1（Mol．Endocrinol．下記）、「ノックアウト」マウスの非常 に関連するレセプターOR1およびRLD-1の場合にも当てはまることを見出している 。 ＯＲ−１の組織分布 OR-1転写物の組織分布を分析するために、胎児および成熟ラットの組織でin s ituハイブリダイゼーションを行なった。OR-1に関する標識は、胎児および成熟 ラットの双方の幾つかの組織で見出された。下記で検討されるように、顕著な発 現は、肝臓、肺、胸腺、褐色脂肪、唾液腺、甲状腺、下垂体および網膜で観察さ れたが、中程度のレベルは、発生する大脳および小脳、発生する骨の周囲の軟骨 膜、心臓および皮膚で見られた。低レベルのOR-1 mRNAは、図４に示されるよう に、骨格筋に存在した。成熟ラットでは、強い標識は、リンパ節、前立腺、副腎 皮質および下垂体の中葉で見出された。中程度レベルは、肝臓、精巣、唾液腺、 甲状腺および副甲状腺、副腎髄質、前部下垂体および腎臓で見られた。脳では、 中程度のシグナルが、小脳および海馬の顆粒細胞層中のニューロンで観察された 。 １）免疫系 OR-1 mRNAの顕著な発現は、胸腺の皮質で見られ、髄質では低レベルであった 。浸漬した切片では、粒子（grains）は、殆どの胸腺細胞で皮質部に見られた。 有意な発現は、リンパ節でも見られたが、脾臓では低レベルが観察 された。骨髄の幾つかの細胞は、OR-1 mRNAを発現した。 ２）内分泌系 OR-1の有意な発現は、下垂体の前葉および中葉で見られた。浸漬切片では、粒 子は、中葉の殆どの細胞および前葉の大多数の細胞にわたって見ることができた 。後葉は、実質的に標識されないように見えた。OR-1の顕著な発現は、副甲状腺 で検出され、そこでは細胞の殆どがOR-1 mRNAを発現した。甲状腺では、中程度 の発現が観察され、OR-1 mRNAは異なる細胞タイプに不均一に分布していた。殆 どの小胞周辺細胞がOR-1を発現したが、小胞細胞の一部分しか標識されなかった 。 副腎での高い発現は、皮質の全ての層で観察されたが、髄質中ではより低いレ ベルが見られた。OR-1の発現は、球状帯で、皮質の残りよりも僅かに高かった。 副腎髄質では、標識は不均一で、クロム親和性細胞および神経節細胞の一部分は OR-1を発現した。松果体では、幾つかの細胞がOR-1 mRNAを含んでいた。 ３）生殖系 OR-1は、雄および雌の両方の生殖器で検出できた。精巣では、OR-1 mRNAは、 輸精管の全ての横断面に存在した。 標識は、精上皮の基底区画に局在し、粒子は主として一次精母細胞に見ることが できたが、精原細胞および生殖細胞は後期の発生段階では標識されなかった。セ ルトーリ細胞およびライディヒ細胞は、OR-1 mRNAを発現しなかった。OR-1に関 する強いシグナルは前立腺の上皮および精巣上体にも明らかであったが、精嚢の 上皮には低レベルが見られた。卵巣では、卵母細胞が発生の種々の段階でOR-1 m RNAを発現したが、他の細胞は標識されていないように見えた。子宮では、上皮 は強く標識され、より低いレベルのOR-1 mRNAが子宮筋層で見られた。 ４）泌尿器系 中程度のOR-1発現が、腎臓の髄質外側部で検出できたが、皮質および髄質内側 部では標識は非常に低いか検出されなかった。浸漬切片では、粒子は、ヘンレわ なの種々の部分にわたって見られた。糸球体の遠位および近位の曲尿細管および 集合管はOR-1を検出可能なレベルで発現しなかった。腎孟の移行上皮は、OR-1を 発現した。 ５）消化器系 唾液腺では、分泌腺房および唾液腺管は、中レベルのOR-1 mRNAを発現した。 肝臓では、OR-1 mRNAは肝臓を通 して均一に分布し、全部でないにしても殆どの肝細胞が標識された。腸管では、 OR-1は、胃および小腸および大腸の上皮で発現されていた。 ６）神経系 OR-1の有意な発現が、交感神経および知覚神経の神経節で見られた。上頸神経 節では、殆どの交感神経ニューロンは、OR-1を高レベルで発現し、衛星細胞も標 識された。脊髄神経節では、標識は不均一で、個々のニューロン間で様々であっ た。末梢神経のシュワン細胞は、ORー1を発現したが、視神経の稀突起膠細胞は標 識されなかった。網膜では、両極細胞はOR-1を発現した。中枢神経系では、OR-1 mRNAは、海馬および小脳を含む幾つかの領域で見られた。 ７）呼吸器系 OR-1の中程度の発現が、気管支の上皮および肺胞で見られた。 ８）他の組織 低レベルまたは検出されないレベルのOR-1が、骨格筋および心臓で見られた。 白色脂肪組織でも、OR-1発現は、 検出限度を下回った。皮膚では、はっきりとしたシグナルが、表皮の基底部分の ケラチノサイトで観察された。強いシグナルは、気管の軟骨周囲の軟骨膜で見ら れた。OR-1の低い発現が、眼窩内および眼窩外の涙液腺で見ることができた。 OR-1の発現は、このように遍在するように見え、このレセプターが、ハウスキ ーピング機能を有し、および／または、種々の遺伝子の転写物を調節することに よって、多くの効果を仲介するかもしれないことを示唆する。OR-1の組織分布は 、RLD-1の組織分布（Mol Endocrinol 9、72-85、1995）と異なり、これら２つの イソ型が異なる機能を有するかもしれないことを示唆する。OR-1は、免疫系に関 連する組織で特に良く発現する。9-cisレチノイン酸は、胸腺細胞の発生に役割 を果たし、活性化誘導Ｔ細胞アポトーシスの強力な負の調節物であることが記載 されている。OR-1はRXRと二量体化し、胎児段階で胸腺において高レベルで発現 されるので、それはＴ細胞発生の調節に役割を果たしているかもしれない。OR-1 はまた、末梢の内分泌腺、雄および雌の生殖器および神経系で良く発現される。 このように、OR-1の組織分布は、肝臓、腎臓、肺、脳、心臓、腸および精巣のよ うな内臓組織に顕著に豊富であると記載されているRXRαのものとは異なる。 我々は先に、9-cisレチノイン酸の効果を仲介するのに、OR-1がRXRαのヘルパー として作用し得ることを示唆した。にもかかわらず、我々は、OR-1が、単量体と して、ホモ二量体として、或いはRXRα以外の他のタンパク質とのヘテロ二量体 としても作用し得たかどうかを知らない。例えば、OR-1が、散在性および恐らく 遍在性の発現を示すRXRβの作用、およびより特異的分布を有するRXRγの作用を 調整することが可能である。 ＯＲ−１はインビトロでＤＲ４モチーフ上のＲＸＲと相互作用する 3-4-5ルールにより予測され上記（ウメンソノ（Umensono）ら、上記）のDNA配 列を有する、可能なHREの１セットであるDR0〜DR6を合成し、インビトロで翻訳 されたOR-1単独で又はやはりインビトロで翻訳されたRXRと組合せて用いて、ゲ ルシフト実験でアッセイした。インビトロでのOR-1の翻訳は、50kDの予測サイズ のタンパク質を産生した。ゲルシフト・アッセイでは、OR-1は、可能なHREのい ずれにも結合できなかったが、RXRと組合せられたOR-1は、通常には甲状腺ホル モン応答エレメント（TRE）として記載されている（ウメンソノら、上記）可能 性のあるHRE DR4を認識した。 図５Ｂは、OR-1単独またはRXR単独ではDR4に結合できなかったが、一緒であれ ば、これらタンパク質は、このDNAエレメントと特異的複合体を形成し得たこと を示している。この複合体の出現は、RXRの存在に依存し、10倍過剰の特異的DNA 標的エレメントによって阻害されるが、100倍過剰の非関連DNAエレメントによっ ては阻害されない−図５Ｂ、レーン７を参照のこと）。 ＯＲ−１はＤＲ４含有プロモーターにＲＸＲの９−ｃｉｓレチノイン酸応答性を 付与する OR-1およびRXRはインビトロでDR4配列上で特異的複合体を形成したので、内因 性RXRを発現する胎生期癌（EC）細胞中のOR-1の同時発現をテストして、それがD R-4含有プロモーターの制御下にレポーター遺伝子の活性に影響し得るかどうか 決定した。RXRは、幾つかのクラスのホルモンレセプターに関する補助的レセプ ターであり、RXRとヘテロ二量体を形成するレセプターのリガンド反応をコント ロールすることが示されている（ユー，ヴィ．シー．（Yu，V.C.）ら、1991 Cel l 67、251-1266およびブッゲ，ティー．エイチ．（Bugge，T.H.）ら、1992 EMBO J．11、1409-1418）。さらに、9-cisレチノイン酸は効果的なRXRホモ二量体の 形成をもたらし、これらのホモ二量体は幾 つかのレチノイン酸応答エレメント（”RARE's”）に結合し活性化するが、天然 の甲状腺ホルモン応答エレメントには結合も活性化もしないことが示されている （ツァン，エックス．ケー．（Zhang,X.K.）ら、1992 Nature（ロンドン）358、 587-591）。他の研究者によって先に記載されているように（ハレンベック，ピ ー．エル．（Hallenbeck，P.L.）ら、1993、J．Biol．Chem．268、3825-3828） 、我々のトランスフェクション研究は、DR4含有レポーター上で9-cisレチノイン 酸によるRXRの誘導は示さなかった（図５）。OR-1の発現は、DR4含有プロモータ ー上の9-cisレチノイン酸によるRXRの活性化を可能にした。内因性RXRをEC細胞 と同じように高レベルで発現しないCHO細胞では、RXRとOR-1との同時トランスフ ェクションは、9-cisレチノイン酸による誘導を得るのに必要である。従って、R XRのヘルパーとして作用しながら、OR-1はDR4含有プロモーターに、9-cisレチノ イン酸シグナリングを付与するように見える。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 図１のアミノ酸配列または図１に示されるアミノ酸配列と実質的に同じア ミノ酸配列またはその配列に機能的に類似のアミノ酸配列を有する、単離された 核レセプター。 ２． ラット由来の請求項１に記載のレセプター。 ３． DNA配列-AGGTCA-の繰返しを少なくとも１個含むDNA配列に結合する請求項 １または２に記載のレセプター。 ４． DNA配列がAGTCAGGTCACTCGAGGTCAGTCAを含む請求項３に記載のレセプター 。 ５． RXRとヘテロ二量体化して複合体を形成する請求項１〜４のいずれか１つ に記載のレセプター。 ６． 前記請求項のいずれかに記載のレセプターおよびRXRを含む複合体。 ７． 図１のアミノ酸配列に少なくとも90%同一である請求項１に記載のレセプ ターをコードするアミノ酸配列。 ８． 図１のアミノ酸配列に少なくとも95%同一である請求項１に記載のレセプ ターをコードするアミノ酸配列。 ９． 請求項１〜５のいずれか１つに記載の核レセプターまたは機能的に類似の 核レセプターをコードするDNA配列。 １０． DNA配列が図２に示されるものであるか又はその 配列に実質的に類似のDNA配列である請求項９に記載のDNA配列。 １１． 請求項１〜５のいずれか１つに記載の核レセプター又は請求項６に記載 の複合体又はそのリガンドの医薬中での使用。 １２． インビトロ又はインビボでのレチノイン酸シグナリングを調整する請求 項１〜５のいずれか１つに記載の核レセプターの使用。