JPH10503009A - イムノアッセイのためのパラセタモールホスフェート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ４−アセトアミドフェニルホスフェートおよびＮ−ヒドロキシ−４−アセトアミドフェニルホスフェートを基質として使用する、ホスフェート活性の電気化学的検出の新規方法が開示されている。この基質は、容易に調製され、粉末としてかまたは溶液として良好な安定性を提供する。加水分解生成物が測定電極の表面活性を損なうことなく、従って、アッセイ／イムノアッセイの適用の際に拡大された分析範囲を提供するという事実は特に有利である。

Description

【発明の詳細な説明】 イムノアッセイのためのパラセタモールホスフェート 技術的分野 本発明は、ホスファターゼ活性の電気化学的検出のための新規方法に関する。 発明の背景 電気化学的技術によって提供された優れた検出限度は、電気化学を、イムノア ッセイの選択性と組み合わせる有用な方法にしている。酵素イムノアッセイ（EL ISA）の場合、アルカリホスファターゼおよびセイヨウワサビ・ペルオキシダー ゼのような酵素は、２部位アッセイの場合に分折物かまたは抗体に結合され、そ の結果、酵素の活性度から抗体が決定される。酵素イムノアッセイにおける酵素 活性の検出は、通常、色素源基質もしくは蛍光源基質の分光分析測定によって実 施される。しかしながら、ワイドダイナミックレンジ（wide dynamic range）、 感度および電気化学的装置の低い費用は、択一的な有用性を代表している。 多くの迅速で簡単な酵素電極が、臨床的な重要性を帯びた物質の測定のために 開発されている。アルカリホスファターゼは、臨床化学および分析化学における 重要な酵素である。更に、多くの生化学的測定は、検 出および増幅のためにアルカリホスファターゼに依存している。アルカリホスフ ァターゼを用いる異種イムノアッセイおよび同種イムノアッセイは記述されてお り、かつアルカリホスファターゼとの抗体接合体または抗原接合体は、生物分析 化学の中で慣用になった。アルカリホスファターゼには、その高い代謝回転並び に幅広い特異性範囲の双方の意味で、多くの他の酵素標識を上回る利点がある。 最近まで、アルカリホスファターゼを基礎とするイムノアッセイは、主として比 色基質および特に４−ニトロフェニルホスフェートに関連していた。 多数のアルカリホスファターゼ基質のための電気化学的検出の使用が報告され たが、しかし、大部分の早い時期の研究は、フェニルホスフェートの使用に関連 している［Heineman他、Anal.Chem.、５７（１９８５年）１３２１Ａ］。この基 質の酵素的加水分解により、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して＋８００ｍＶの過剰量の電 位で容易に酸化させることができるフェノールを生産する。このシステムは、分 離段階および洗浄段階を含むアッセイの場合に使用することができる。この方法 は、一般に前記の高い電位で酸化する成分を組み込んでいるシステムに対しては 適用できない。 また、４−アミノフェニルホスフェートおよび１−ナフチルホスフェートは、 酵素的加水分解の生成物、４−アミノフェノールおよび１−ナフトールのレドッ クス電位が、フェノールよりも低いので、アルカリホスファターゼのための電気 化学的基質として使用された。しかしながら、４−アミノフェニルホスフェート の加水分解生成物、４−アミノフェノールは、極端に不安定であり、室温で極め て迅速に酸化しかつ重合し、電極の上に高分子量の沈殿物を残す。前記化合物は 、アルカリホスファターゼの延長された恒温保持に、基質として使用することが できなかった。他方、１−ナフチルホスフェートは、比較的安定性であるが、こ の生成物１−ナフトールは、電極表面が電気化学的に酸化される場合に電極表面 上で重合し、この場合、電極が測定を繰り返すために使用されている場合には、 前記の１−ナフチルホスフェートは不安定な基質にされる。 発明の概要 本発明の対象は、サンドイッチアッセイまたは競合アッセイまたは他のイムノ アッセイのタイプの間に、任意の適当な酵素、電極表面で迅速に酸化する電気化 学的に活性な種の使用によって発生する、電気化学的イムノアッセイのための新 規基質を提供することである。 本発明には、ホスファターゼ酵素活性の検出のための新規方法が記載されてい る。４−アセトアミドフェニルホスフェート（パラセタモールホスフェート）お よびＮ−ヒドロキシ−４−アセトアミドフェニルホス フェートの使用により、利点を驚異的に増大させることが見出された。基質４− アセトアミドフェニルホスフェートおよびＮ−ヒドロキシ−４−アセトアミドフ ェニルホスフェートは、調製するのが容易であり、粉末および溶液の双方として 良好な安定性を提供し、かつその加水分解生成物、４−アセトアミドフェノール およびＮ−ヒドロキシ−４−アセトアミドフェノールは、それぞれ、測定電極の 表面活性を損なうことはない。 本発明の１つの実施態様は、ホスファターゼ活性の電気化学的検出のための基 質としての４−アセトアミドフェニルホスフェートおよびＮ−ヒドロキシ−４− アセトアミドフェニルホスフェートの使用である。本発明のもう１つの実施態様 は、４−アセトアミドフェニルホスフェートまたはＮ−ヒドロキシ−４−アセト アミドフェニルホスフェートが基質として使用されていることによって特徴付け られる、ホスファターゼ活性の電気化学的検出法である。基質としての４−アセ トアミドフェニルホスフェートの使用は、本発明の有利な実施態様である。アル カリホスフェートの検出は、本発明の別の有利な実施態様である。 本発明の他の実施態様は、請求項から明らかである。 ４−アセトアミドフェノールおよびＮ−ヒドロキシ−４−アセトアミドフェノ ールは、２個の電子を生じ る電極表面で酸化する。図１の反応式は、４−アセトアミドフェノールの酸化の 化学的過程を記載している。 本発明による電気化学的基質は、当業者に公知である多くの異なるフォーマッ トで使用することができる。それぞれ、アルカリホスファターゼの加水分解から 生じた生成物、４−アセトアミドフェノールおよびＮ−ヒドロキシ−４−アセト アミドフェノールの量は、結合標識の量に比例し、かつ多孔性グラファイトまた は平面状のカーボンのような適当に極性化された電極での電流滴定によって数量 化される。 図面の説明 本発明は、図１〜７によって説明される： 図１は、４−アセトアミドフェニルホスフェートとアルカリ性ホスホターゼとの 反応式を示している。 図２は、４−アセトアミドフェノールおよび１−ナフトールについての線形掃引 ボルタンメトリーを示している。 図３は、アルカリホスファターゼにさらす前後の４−アセトアミドフェニルホス フェートの環式ボルタモグラム（cyclic voltammogram）を示している。 図４は、４−アセトアミドフェノールおよび１−ナフトールについての電気化学 的較正曲線を示している。 図５は、アルカリホスファターゼの検出の限界を示している。 図６は、基質４−アセトアミドフェニルホスフェートについてのミカエリス−メ ンテン運動プロットを示している。 図７は、電気化学的全Ｔ４イムノアッセイ標準曲線を示している。 実施例 例１ ４−アセトアミドフェニルホスフェートの製造 無水酢酸１５０ｍｌに、ジソジウム４−アミノフェニルホスフェート１１．０ ｇを添加する。３０分間の撹拌後に、エーテル４００ｍｌを添加し、かつ撹拌を 更に３０分間継続する。沈殿物を減圧下での濾過によって捕集し、かつアセトン １８０ｍｌおよび水７ｍｌの混合物中に懸濁させる。１５分間の撹拌後に、この 沈殿物を減圧下での濾過によって捕集し、かつアセトンおよびエタノールで洗浄 する。残分を、熱水１００ｍｌ中に溶解する。残留溶液を、活性炭の添加後に濾 過する。冷却により、若干の赤色の物質が沈殿する。清澄な溶液を、前記沈殿物 から傾瀉し、十分に濃縮し、かつ氷で冷却しながら３０分間撹拌する。この沈殿 物を減圧下での濾過によって捕集し、室温で撹拌しながら１時間、１Ｎの塩酸５ ０ｍｌで処理する。次に、この反応混合物を約半分の容量に濃縮し、氷浴中で冷 却しながら３０分間撹拌する。目的化合物の残留一水和物を、濾過によって捕集 し、かつ減圧下で乾燥させ る（収量６．５０ｇ［５５％］、分解を伴う融点２２９℃）。 例２ 線形掃引ボルタンメトリーを、４−アセトアミドフェニルホスフェートおよび その加水分解生成物の電気化学を試験するために使用した。フロースルー・クー ロメトリックセル（flow-through coulometric cell）を、多孔性グラファイト のディスク、直径５ｍｍ、厚さ１．７ｍｍ（Toray Industries、Japan）と一緒 に動作電極として使用した。電極と液体との接触直径は、３ｍｍであった。トリ ス緩衝液ｐＨ９．６中の１−ナフトール、４−アセトアミドフェノールおよび４ −アセトアミドフェニルホスフェートの試料を、毎分３００μｌでセルに貫流さ せた。電位は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して、１ｍＶ／ｓの割合で０Ｖから１Ｖで掃 引した。４−アセトアミドフェノールについての酸化電位は、＋５００ｍＶであ り、１−ナフトールについては＋３００ｍＶであり、また、電極表面を汚染する ことになる前記の掃引率でのピークを示した（図２）。 図３による４−アセトアミドフェニルホスフェート基質溶液の第二の環式ボル タモグラムは、２μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ２００μｌにさらした後 の電気化学における重要な変化を示す（Biozyme、Newport）。アルカリホスファ ターゼにさらした後の酸化 ピークは、４−アセトアミドフェノール酸化ピークに相応する。 例３ １−ナフトールおよび４−アセトアミドフェノールについての較正曲線を、ア ルカリホスファターゼ加水分解生成物のダイナミックレンジを示すために準備し た。フロースルークーロメトリックセルを、多孔性グラファイトのディスク、直 径５ｍｍ、厚さ１．７ｍｍ（Toray Industries、Japan）と一緒に動作電極とし て使用した。電極と液体との接触直径は、３ｍｍであった。トリス緩衝液ｐＨ９ ．６中の１−ナフトール、４−アセトアミドフェノールおよび４−アセトアミド フェニルホスフェートの試料を、４−アセトアミドフェノールについては、Ａｇ ／ＡｇＣｌ基準電極に対して＋５００ｍＶで均衡された電極を用い、かつ１−ナ フトールについては＋３００ｍＶで均衡された電極を用いて毎分３００μｌでセ ルに貫流させた。それぞれ２００μｌについての結果として生じるピーク電流お よび４−アセトアミドフェノールについてのピーク領域を記録した。図４は、１ −ナフトールおよび４−アセトアミドフェノールについての典型的な較正曲線を 示す。４−アセトアミドフェノールの全体の酸化は、ファラデーの法則にピーク 領域データを当てはめることから証明された。 例４ 前記の方法を用いて達成されうる感応性の限界を評価するために、アルカリホ スファターゼによる４−アセトアミドフェニルホスフェートの加水分解を試験し た。 アルカリホスファターゼの種々の希釈液を、ＭｇＣｌ²１ミリモル／ｌを含有 する５０ｍＭのジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．６）中で製造した。次に前 記希釈液を、４−アセトアミドフェニルホスファターゼまたは１−ナフチルホス ファターゼの溶液１ミリモル／ｌと一緒に５分間恒温保持してから、フロースル ーセルを用いて酸化電流を測定した。 検出の下限は、空試験の応答に対して平均プラス２の標準偏差に相応するアル カリホスファターゼの濃度として定義された。 基質としての４−アセトアミドフェニルホスフェートまたは１−ナフチルホス フェートを有するアルカリホスファターゼについての検出の下限は、０．９ｎｇ ／ｍｌ（７×１０^-10モル／ｌ）である。 例５ 酵素運動の定数、ＫｍおよびＶｍａｘを、３つのアルカリホスファターゼ基質 、４−アセトアミドフェニルホスフェート、１−ナフチルホスフェートおよびフ ェニルホスフェートについて測定した。それぞれの原液１０ミリモル／ｌを、５ ０ミリモル／ｌのトリス緩衝液ｐＨ１０ １０ｍｌ中で調製した。 アルカリホスファターゼの原液を、１ｍｌ当たり酵素ほぼ２８Ｕを含有する溶 液を生じさせるために、緩衝液中で１：１０００に酵素を希釈することによって 調製した。この実験を実施するために、溶液を、ほぼ２．８Ｕ／ｍｌで作用酵素 溶液を生じさせるために１：１０に希釈した。セルを次のように設置した：電極 を、（ヒドロキシエチルセルロースを、導電率を改善させかつ電極を適切な位置 に保持するために白金と炭素の間に配置した）ランクセル（rank cell）上の白 金ボタンの表面に載置し、かつ０．０５μｍのポリカーボネート膜を表面の上に 載置した。動作電極を、基質、４−アセトアミドフェニルホスフェート、１−ナ フチルホスフェートおよびフェニルホスフェートのために、Ａｇ／ＡｇＣｌに対 して＋５００ｍＶ、３５０ｍＶおよび＋６５０ｍＶで極性にした。運動実験を実 施するために、バックグラウンドを基質溶液２００μｌを用いて取得し、かつ反 応を、アルカリホスファターゼ溶液２０μｌを用いて開始した。開始時の割合を 測定し、かつ割合が得られると直ちにセルを緩衝液で十分に洗浄した。 公知技術水準との比較の場合、上記の結果は、記載された条件下でのアルカリ ホスファターゼとアセトアミドフェニルホスフェートとの間の反応についての有 利な運動特徴を示し、かつ記載されたイムノアッセイフォーマットに対するこの 基質の優れた適用可能性を示唆している。 例６ 競合イムノアッセイを、酵素標識のための基質として４−アセトアミドフェニ ルリン酸塩を用いて全血清チロキシン（Ｔ４）のために製造した。Ｔ４−アルカ リホスファターゼ（Ｔ４−ＡＬＰ）接合体を、Ｌ−チロキシンナトリウム塩から 製造し、かつジスクシンイミジル基質を用いてアルカリホスファターゼ（生物酵 素）に結合させた。抗−Ｔ４−抗体を、炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中２μｇ／ｍｌ で、ＥＬＩＦＡ膜評価システム（Pierce）を用いて０．４５μｍのニトロセルロ ース膜（Schleicher and Schuell）の上に負荷させた。膜を遮断し、かつトリス 緩衝液で処理された塩水ｐＨ８．６で洗浄した。 試料：接合体（１０：２）を、２分間膜を通過させ、かつ基質溶液にさらす前に 洗浄した。 ４−アセトアミドフェニルリン酸塩１ミリモル／ｌを基質として使用する電気 化学的評価を、膜およびフロースルーセルを２００μｌ通過させることによって 実施した。ホスファターゼ加水分解物の生成物、４−アセトアミドフェノールを 、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対して＋５００ｍＶで検出した。試料添加から評価 時間は、室温で１０分未満であった（図７）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キース ローソン イギリス国 ケンブリッジシャイア シー ビー６ １イーデー イーリー コンプト ン フィールズ 11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ホスファターゼ活性の電気化学的検出のための基質としての４−アセトアミ ドフェニルホスフェートおよびＮ−ヒドロキシ−４−アセトアミドフェニルホス フェートの使用。 ２．アルカリホスファターゼ活性の電気化学的検出のための基質としての４−ア セトアミドフェニルホスフェートおよびＮ−ヒドロキシ−４−アセトアミドフェ ニルホスフェートの使用。 ３．ホスファターゼ活性の電気化学的検出法において、４−アセトアミドフェニ ルホスフェートおよびＮ−ヒドロキシ−４−アセトアミドフェニルホスフェート を基質として使用することを特徴とする、ホスファターゼ活性の電気化学的検出 法。 ４．それぞれ、ホスファターゼによって酵素的に加水分解される４−アセトアミ ドフェニルリン酸塩およびＮ−ヒドロキシ−４−アセトアミドフェニルリン酸塩 から製造された４−アセトアミドフェノールおよびＮ−ヒドロキシ−４−アセト アミドフェノールを、適当に極性化された電極での電流滴定によって数量化する 、請求項３に記載の方法。 ５．ホスファターゼがアルカリホスファターゼである、請求項４に記載の方法。