【発明の詳細な説明】
Ｏ−グリコシル化真正ＩＧＦ−Ｉおよびその
切断変種、その製造方法、並びに医薬組成物
本発明は、ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個もしくは
それ以上のマンノース残基を有する或いは切断(truncate)された切断(truncated
)ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２個のマンノース残基を
有するＯ−グリコシル化された真正ＩＧＦ−Ｉに関するものである。本発明によ
るＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉは実質的にインシュリンリセプタ親和性を持たず
、治療処置に使用するのに価値がある。さらに本発明は、酵母細胞にてＩＧＦ−
Ｉを発現させると共に培地から本発明のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉを分離する
ことにより上記ＩＧＦ−Ｉを得る方法、およびこれらＩＧＦ−Ｉを医薬上許容し
うるキャリヤ、希釈剤もしくは賦形薬と共に含有する医薬組成物に関するもので
ある。さらに本発明は、たとえば成長不全およびインシュリン耐性状態を処置す
る薬剤を製造する際のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉの使用にも関するものである
。序文
インシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は、プロインシュリンに対し比較
的高い相同性を示す７０個のアミノ酸を単一ポリペプチド鎖として含む成長因子
である。細胞成長および分化を促進すると共にインシュリン様の性質をも示して
、成長ホルモンの作用を部分的に媒介することが知られている。内生ヒト型は非
グリコシル化されていない。
組換ヒトインシュリン様成長因子Ｉ（ｒｈＩＧＦ−Ｉ）は酵母Ｓ．セレビシで
発現させて産生され、分泌システムにより発酵培地中に移される。酵母における
外来蛋白質の発現は翻訳後の修飾をもたらす。酵母にて産生される蛋白質におい
て観察された修飾の一つはグリコシル化である。
酵母における蛋白質グリコシル化はＮ−およびＯ−結合の両者が生じうるが、
ＩＧＦ−ＩはＮ−グリコシル化のための認識部位（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔ
ｈｒ）を欠くので、ＩＧＦ−Ｉでは新たな（de novo）Ｏ−グリコシル化のみが
予想される。Ｔｈｒ２９におけるＯ−グリコシル化のための１部位が決定されて
いる（ＷＯ ９０／０２１９８号、Ｇｅｌｌｅｒｆｏｒｓ，Ｐら（１９８９）、
Isolation and Characterization
of a glycosylated vaariant of human insulin-like growth factor I produce
d in Saccharomyces cerevisiae，J.Biol.，Chem.，264，11444-11449およびEll
iott,S.ら(1990)，Yeast-derived recombinant human insulin-like growth fac
tor I：Production, purification,and structural Characterization，J. Prot
. Chem,, 9, 95-104)。
酵母はカルボキシペプチダーゼを含有することが知られている（Jones, E. W.
, (1990), Tackling the protease problem in Saccharomyces cerevisiae，Met
hods Enzymol., 194, 428-453）。したがって、酵母における外来蛋白質の発現
はＣ−末端切断変種の産生をもたらしうる。
ＩＧＦ−Ｉポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に２個もしくはそれ以上のマ
ンノース残基を付着させたＩＧＦ−Ｉのグリコシル化ＩＧＦ−Ｉ変種がＷＯ ９
０／０２１９８号により公知である。このＩＧＦ−Ｉのグリコシル化変種は、真
正ＩＧＦ−Ｉよりも顕著に血中グルコースを低下させる作用を有することが示唆
されている。
ＩＧＦ−Ｉの切断変種がＷＯ ９１／１８６２１号により従来知られており、
これはｄｅｓ（１−３−）−ＩＧＦ−Ｉが糖
尿病の処置に有用であることを開示している。切断変種ｄｅｓ（１−３−）ＩＧ
Ｆ−ＩがＣＮＳ損傷の程度を減少させることも知られている（ＷＯ ９３／０２
６９５号）。
ＷＯ ９３／０８８２６号は（４−７０）ＩＧＦ−Ｉおよび（５４−６７）Ｉ
ＧＦ−Ｉを開示しており、これら切断変種は眼薬組成物にて網膜神経細胞の生存
を促進する。
ＷＯ ８７／０１０３８号は、１−５個のアミノ酸残基がＮ−末端から欠損し
ているＩＧＦ−Ｉのペプチド類似体を開示している。これらは、たとえば成長不
全および異化作用状態を処置するのに有用である向上した生物学的能力を有する
といわれる。位置３におけるグルタミン酸が他のアミノ酸により置換され或いは
欠失している真正ＩＧＦ−Ｉも知られている（ＷＯ ９１／１０３４８号参照）
。
本明細書においては、グリコシル化された真正ＩＧＦ−Ｉ（ｇＩＧＦ−Ｉ）の
２種の他の変種および分離されると共に特性化されたＣ−末端切断ＩＧＦ−Ｉの
新規な２種の変種の分離および特性化につき説明する。本発明者等は、ＩＧＦ−
ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し４個もしくは５個のマンノース残基
を有する真正Ｏ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉおよび
ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個のマンノース残基を有
するＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉを分離した。さらに本発明者等は、Ｃ−末端Ａ
ｌａ７０残基を欠如すると共にＴｈｒ２９にてグリコシル化された変種をも分離
した。他の変種はＣ−末端トリペプチドＬｙｓ６８Ｓｅｒ６９Ａｌａ７０を欠如
すると共にＴｈｒ２９にてグリコシル化されている。
ＩＧＦ−Ｉのこれら新規なＯ−グリコシル化変種は、正常なＩＧＦ−Ｉ作用を
有すると予想される一方、特にたとえばインシュリン様作用減少のような悪影響
が少い点で、治療剤として有望である。したがって、これらは成長障害の処置に
ヒト真正ＩＧＦ−Ｉよりも高い投与量にて与えることができ、しかも低血糖症に
伴う問題を生ぜしめない。さらにこれらは、ＩＧＦ結合性蛋白質１（ＩＧＦＢＰ
−１）に対する結合能が低下しているので、たとえば外傷、インシュリンリセプ
タ抗体産生、貧弱に制御された糖尿病または子宮内成長遅延（ＩＵＧＲ）の後の
、インシュリン耐性を有する患者の処置に使用することができる。
第１〜６図は本発明を示す。
第１図はＳ．アウレウスＶ８プロテアーゼ（ＳＡＰ−Ｖ８）
で消化した後のＩＧＦ−Ｉペプチドを示す。得られたペプチドはその一次構造に
おける形状によりラベルされる。
第２図はｒｈＩＧＦ−Ｉの疎水性相互作用に基づく精製工程を示す。フラクシ
ョン８を回収して特性化された新規なＩＧＦ−Ｉ変種を分離した。
第３図はコンカナバリンＡカラムにおける「フラクション８」の親和性クロマ
トグラフィーの溶出プロフィルを示す。２種のプール（ｘおよびｚ）を反復調製
物から回収した。
第４図は第３図のフラクション×プールの逆層クロマトグラフィー（ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ）の溶出プロフィルを示す。
第５図は真正ｒｈＩＧＦ−Ｉ（ＤＳＱ９３）と比較した２種の主たる変種ｚお
よびｘ２のＳＡＰ Ｖ８消化物のペプチド マップを示す。
第６図は真正ｒｈＩＧＦ−Ｉ（ＤＳＱ９３）と比較したｘ３、ｘ４およびｘ５
変種のＳＡＰ Ｖ８消化物のペプチド マップを示す。
本発明はＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個もしくはそ
れ以上のマンノース残基を有する或いは切断された切断ＩＧＦ−ポリペプチド鎖
のＴｈｒ２９アミノ酸に対
し２個のマンノース残基を有するＯ−グリコシル化された真正ＩＧＦ−Ｉに関す
るものである。本発明によるＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉは実質的にインシュリ
ンリセプタ親和性を持たず、治療処置に使用するのに貴重である。
本発明は特にＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し４個および
／または５個のマンノース残基を有する或いはＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個の
マンノース残基を有するものに関する。
さらに本発明は、特にＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２
個のマンノース残基を有するＯ−グリコシル化（１−６７）ＩＧＦ−Ｉ、または
ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２個のマンノース残基を有
するＯ−グリコシル化（１−６９）ＩＧＦ−ＩであるＯ−グリコシル化ＩＧＦ−
Ｉの切断変種に関するものである。
さらに本発明は、酵母細胞にてＩＧＦ−Ｉを発現させると共に本発明のＯ−グ
リコシル化ＩＧＦ−Ｉを培地から分離することにより上記ＩＧＦ−Ｉを得る方法
に関するものである。
さらに本発明は、これらＩＧＦ−Ｉを医薬上許容しうるキャリヤ、希釈剤もし
くは賦形薬と共に含有する医薬組成物、およ
び本発明のＩＧＦ−Ｉ変種を医薬上許容しうるキャリヤ、希釈剤もしくは賦形薬
と混合することによる医薬組成物の製造方法にも関するものである。本発明のＩ
ＧＦ−Ｉの変種は成長不全の処置または同化作用のための薬物を製造する際に有
用である。さらに、ＩＧＦ結合性蛋白質１（ＩＧＦＢＰ−１）に対する結合能が
低下しているので、これらはたとえば外傷、インシュリンリセプタ機能における
遺伝子欠損、インシュリンリセプタに対する自己抗体産生および子宮内成長遅延
（ＩＵＧＲ）の後のインシュリン耐性状態を有する患者の処置、並びに異常上昇
したＩＧＦＢＰレベル（特にＩＧＦＢＰＩ）を有する患者の処置にも使用するこ
とができる。
新規なグリコシル化ＩＧＦ変種は２０μｇから１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２０
から２５０μｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与することができる。グリコシル化変種の分離および特性化
α−交配因子リーダーペプチド−ＩＧＦ−１発現プラスミド、すなわちｐ５３
９／１２を用いて、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子をサッカロミセス・セレビシエで発現させ
た。この方法はＷＯ ９０／０２１９８号、第６頁（実施例）から第７頁まで詳
細に記載さ
れている。酵母発酵培地は真正ヒトＩＧＦ−Ｉおよびその変種を含有していた。
真正ヒトＩＧＦ−ＩからのＩＧＦ−変種の最初の分離は疎水性相互作用クロマト
グラフィー（ＨＩ−ＨＰＬＣ）により行った。真正ｒＩＧＦ−Ｉのピークの前フ
ラクション（フラクション８）を回収して、グリコシル化変種を分離した。第２
図参照。
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）親和性カラムにおけるクロマトグラフィーが、
天然型からグリコシル化ＩＧＦ−Ｉを分離する効果的方法であった。第３図は、
コンカナバリンＡカラムにおける「フラクション８」の親和性クロマトグラフィ
ーの溶出プロフィルを示す。２つの部分分割されたフラクションを２種のプール
、すなわちｘおよびｚとして回収した。これらプールを反復調製物から回収した
。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）に続くＣｏｎＡブロッチングは、ｚが比較的均質であるのに対しｘが２種の
主たるバンドで構成されていることを示した。
ＧＣ−ＭＳを用いる精製された変種の炭水化物分析(KENNE,
sis of hexoses in glycoproteins, Carbohydr. Res., 198,
173-179)は、両変種ｘおよびｚが１種のみの糖（すなわちマンノース）を含有す
るが、相対量が異なることを示した（データ示さず）。
ｘフラクションをさらにＲＰＶ−ＨＰＬＣにて精製し、主ピークをさらに特性
化した。第４図はピークｘ２、ｘ３、ｘ４およびｘ５を示す。
ＩＧＦ−ＩのＣ−末端に対し特異的な抗体による免疫ブロッチングは、これら
変種間における相違点をさらに示した。すなわち、Ｃ−末端における修飾が予想
された。グリコシル化ＩＧＦ−Ｉ変種間の構造上の相違点をさらに、ＳＡＰ Ｖ
８酵素マッピング法により明かにした。これにより、天然ペプチドとの比較にお
ける特定ペプチドに与えた変化を示した。第５図は真正ｒｈＩＧＦ−Ｉ（ＤＳＱ
９３）と比較した２種の主たる変種ｚおよびｘ２のＳＡＰ Ｖ８消化物のペプチ
ドマップを示し、第６図は真正ｒｈＩＧＦ−Ｉ（ＤＳＱ９３）と比較したｘ３、
ｘ４およびｘ５変種のＳＡＰ Ｖ８消化物のペプチドマップを示す。ＳＡＰ Ｖ
８マップにおいて、ｚの唯一の修飾断片はＣ−末端ＳＡＰ９であった（命名につ
き第１図）。ＳＡＰ９断片のアミノ酸組成は正確であると判明（第Ｉ表：この表
は問題
とするＳＡＰペプチドのアミノ酸分析の結果を示す）したのに対し、質量分析は
理論値１２７９．６よりも４８４．１単位高い分子量を示した（第ＩＩ表：この
表は問題とするＳＡＰペプチドの質量分析の結果を示す）。マンノースの分子量
は１６２．１であり、質量におけるこの差は３個の追加マンノース残基の示唆と
良好に一致した。インタクトポリペプチドの質量分析（第ＩＩＩ表）は、非消化
ＩＧＦ−Ｉ変種の質量分析の結果を示し、前記示唆を裏付ける。
変種ｚの場合と同様に、ｘ２の唯一の修飾ＳＡＰ断片はＳＡＰ９であった（第
５図参照）。さらに、断片は純粋でないことも観察された。アミノ酸組成はｘ２
の場合にも不変であった（第Ｉ表）。ｘ２のＳＡＰ９断片につき、質量分析は理
論値１２７９．６よりも６４５．９単位高い分子量を与えた（第ＩＩＩ表）。し
たがって、この場合は追加マンノース残基の示唆される個数は４である。他方、
未消化ポリペプチドの質量分析は５個のマンノース残基を示したが（第ＩＩＩ表
）、この数値は完全には正確でない。その説明は、ｘ２がテトラ−およびペンタ
−置換ＩＧＦ−Ｉの混合物であったからであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＡＰ
９ピークにおけるショルダー（第５図）
の両者によっても不均一性が示される。かくして、異なる調製物は異なる相対量
の２種の変種を含有していると思われる。
ＳＡＰ９断片のアミノ酸配列に関し、Ｏ−グリコシル化を可能にすることが知
られた唯一の残基はＳｅｒ６９であり、したがってこれが提案されるグリコシル
化部位であった。
ＳＡＰ Ｖ８マップにおいて、ｘ３、ｘ４およびｘ５に共通の修飾ＳＡＰ５断
片（第６図）は、Ｔｈｒ２９におけるジマンノース−グリコシル化により生じた
。ｘ４およびｘ５ＳＡＰ９断片の各Ｃ−末端も修飾されていた。
変種ｘ４のＳＡＰ Ｖ８マップは、ＳＡＰ９断片の２種の修飾物、すなわちラ
ベルされたＳＡＰ９：１およびＳＡＰ９：２を示した（第１図）。アミノ酸配列
分析（第Ｉ表）によれば、１個のＡｌａ残基（恐らくＣ−末端Ａｌａ７０）が両
断片において喪失していた。断片ＳＡＰ９：１の質量分析はこの修飾を裏付けた
。ＳＡＰ９：２断片については、質量分析は追加２６．６単位を与えた（第ＩＩ
表）。この相違は、未消化ペプチドにつき質量分析を行った場合と一致した（第
ＩＩＩ表）。分子量におけるこの差については合理的説明が見出されなかった。
変種ｘ５のＳＡＰ９に対応する断片は、ｘ４ ＳＡＰ９：２よりも若干長い保
持時間を有した（第４図参照）。この断片のアミノ酸分析（第Ｉ表）は、１個の
リジンと１個のセリンと１個のアラニン残基との欠如を示し、Ｃ−末端トリペプ
チドＬｙｓ６８−Ｓｅｒ６９−Ａｌａ７０の切断を提案した。この示唆された修
飾は、ＳＡＰ９断片（第ＩＩ表）および未消化ポリペプチド（第ＩＩＩ表）の両
者の質量分析により確認された。
かくして、次のことが確認された：
ｘ２はＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し４個もしくは５個
のマンノース残基を有するＯ−グリコシル化された真正ＩＧＦ−Ｉを意味する。
ｚはＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個のマンノース残基
を有するＯ−グリコシル化された真正ＩＧＦ−Ｉを意味する。
ｘ４はＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２個のマンノース
残基を有するＯ−グリコシル化（１−６９）ＩＧＦ−Ｉを意味する。
ｘ５はＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２個のマンノース
残基を有するＯ−グリコシル化（１−６７）ＩＧＦ−Ｉを意味する。
生物学的活性
核磁気共鳴データは、ＩＧＦ−Ｉのコアがインシュリンに構造上極めて類似す
ることを示す。この領域におけるインシュリンおよびタイプＩリセプタに対する
ＩＧＦ−Ｉの結合に関する構造決定因子は重なり合う。したがって、ＩＧＦ−Ｉ
は、それ自身のリセプタに結合する他にインシュリンリセプタとも交差
反応するが、大抵の場合親和性は低い。
ＩＧＦ−Ｉリセプタの構造−機能の関係もインシュリンリセプタに類似する。
それらの各リガンドに対する結合親和性が異なるものの、インシュリンリセプタ
およびＩＧＦ−Ｉリセプタは少なくともリガンド結合後のシグナル転送における
初期ステップが同一であると思われる。これは、ＩＧＦ−Ｉとインシュリンとの
間の生物作用の相違点が主として異なる標的細胞におけるこれらのリセプタ発現
とシグナル経路の相異に基づくことを示唆する。したがって、ＩＧＦ−Ｉもしく
はＩＧＦ−Ｉ変種の標的器官の生物作用に関する重要な決定因子は、２種のリセ
プタ種類に対する親和性であって、生物作用はこれら２種のリセプタ種類への結
合により媒介される。
ＩＧＦの生物学的利用性および作用は、特定結合性蛋白質（ＩＧＦ ＢＰ１〜
６）群との結合によっても影響を受ける。ＩＧＦ ＢＰ３は成人における主たる
循環ＩＧＦ ＢＰ型であり、一般に１５０ｋＤａ三成分複合体にて血清中のＩＧ
Ｆ−Ｉの９５％以上を結合する。三成分複合体は比較的長い半減期を有し、イン
タクトで循環し続けることができない。遊離した非複合化型のＩＧＦのみが生物
学上活性であると思われるので、
リセプタとの結合のために、ＩＧＦを標的細胞まで循環系からシャトルさせうる
特定メカニズムを与える必要がある。ＩＧＦ ＢＰ１は標的細胞へのＩＧＦ−Ｉ
の輸送および標的細胞のＩＧＦ反応性の調節の両者につき重要であると思われる
。幾つかの研究が、グルコース恒常性につきＩＧＦ利用性を調節する際のＩＧＦ
ＢＰ１の生理学的役割を裏づけている。ＩＧＦＢＰ−１はインビトロおよびイ
ンビボの両者にてＩＧＦ−Ｉのインシュリン様活性を抑制することが示されてい
る。ＩＧＦＢＰ−１はグルコース反対制御（counterregulators）に特徴的な所
定の制御パターンを示し、顕著な日周期を以って血清中で急速な変動を示す唯一
のＩＧＦＢＰである。循環インシュリンとＩＧＦＢＰ−１との間には逆の関係が
存在し、インシュリンは肝臓ＩＧＦＢＰ−１の産生を調節することが知られてい
る。ＩＧＦＢＰ−１は血糖調節（および他のインシュリン様作用）に関しＩＧＦ
作用を急激に調節するだけでなく、長期にわたり成長を調節する点でも極めて重
要であると思われる。臨床的観察は、循環ＩＧＦＢＰ−１レベルと各種の成長パ
ラメータとの間の逆相関を指摘している。最高ＩＧＦ−Ｉレベルおよび加速成長
を伴う思春期にて低レベルが見られる。逆に、貧弱に制御
された糖尿病の成長阻害はＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦ−Ｉの低下を伴う一方、
ＩＧＦＢＰ−１血清レベルが高い。さらにＩＧＦＢＰ−１は胎児成長を調節する
と思われ、高いレベルは出産時における低い体重と相関する。
したがって、各種のＩＧＦＢＰ型の間におけるＩＧＦの分布は、ＩＧＦのクリ
アランス、組織分布および生物活性につき重要な決定因子であることは明かであ
る。その結果、リセプタへの結合の変化を伴うＩＧＦＢＰに対する変化した結合
親和性を有するＩＧＦ変種は著しく異なるバイオプロフィルを示しうる。
グリコシル化ＩＧＦ−Ｉ変種のＩＧＦ−Ｉリセプタ結合能を、ヒト胎盤膜調製
物を用いてリセプタ結合分析で試験した（Hall Kら、A．J．Clin. Endocrinol.
Metabol. 39：973-976, 1974）。ｚおよびｘ２変種の両者は、非グリコシル化真
正ＩＧＦ−Ｉ調製物と比較して、ＩＧＦ−Ｉリセプタ結合能が６０〜７０％低下
していた。１−６９ジマンノシルＴｈｒ２９変種（ｘ４）は、真正ヒトＩＧＦ−
Ｉと比較して、５０％の能力を示すと共に、１−６７ジマンノシルＴｈｒ２９変
種（ｘ５）は３０％の能力を示した（第ＩＶ表参照）。したがって、タイプＩリ
セプタ結合はｐｏｓＴＨＲ２９におけるグリコシル化に
より顕著には低下しなかったが、さらにＣ−末端トランケーションと組合せれば
リセプタ結合能力の徐々に変化する顕著な喪失をもたらした。
グリコシル化ｒｈＩＧＦ−Ｉ変種のインビトロ骨成長刺激作用を胎児雛大腿骨
分析（Endo Hら、Nalure(London)、286:262-264, 1980）にて試験した。このモ
デルにおけるＩＧＦ−Ｉの刺激作用は主として雛ＩＧＦ−Ｉリセプタにより媒介
される。全てのグリコシル化ｒｈＩＧＦ−Ｉ変種は、骨成長刺激に関し非グリコ
シル化真正ＩＧＦ−Ｉと同等の能力であると判明した（第ＩＶ表参照）。これは
、雛ＩＧＦ−Ｉリセプタを結合する能力がインタクトであるか或いはこのリセプ
タに対する結合能力がヒトＩＧＦ−Ｉリセプタの場合と同様に僅かに影響を受け
るが、この作用はたとえばＩＧＦ−Ｉ結合性蛋白質に対する親和性変化によって
補償されていることを示唆する。骨におけるＩＧＦ−Ｉ局在結合性蛋白質が確認
される。グリコシル化された変種の成長促進作用は多かれ少なかれ変化はなかっ
た。
ＩＧＦ−Ｉ変種のインシュリン様特性をラット一次脂肪細胞を用いる脂質生成
分析（Small J.ら、J. Biol. Chem. 262：1107-79、1987）にて試験したところ
、脂質生成活性の大きい
低下が示された。全変種の脂質生成能力は非グリコシル化真正ｒｈＩＧＦ−Ｉと
比較して３０％もしくはそれ以下まで低下していた（第ＩＶ表参照）。これは、
これらＩＧＦ−Ｉ同族体のインシュリンリセプタへの結合能が著しく低下してい
ることを示す。ラット一次脂肪細胞は僅かながら機能的ＩＧＦ−Ｉリセプタを有
することが知られているので、Ｏ−グリコシル化はインシュリンリセプタ結合の
低下、したがって低下したインシュリン様能力をもたらすことが示唆される。こ
れは成長作用につきＩＧＦ−Ｉを必要とする患者に有利である。
大型ＢＰ３（ＢＰ＝結合性蛋白質）および小分子量ＢＰ１に対する親和性をビ
アコア（商標）法にて試験した。この方法は
Techniques 11：5、1991）によりバイオセンサチップ表面に固定化されたＩＧ
ＦＢＰに対するＩＧＦの結合を測定する。zおよびｘ２変種は低下したＩＧＦＢ
ＰＩ結合能を示した（非グリコシル化真正ＩＧＦ−Ｉの約６０％）のに対し、こ
の２種の変種のＩＧＦＢＰ３への親和性は不変であった（第ＩＶ表参照）。
これらの結果は、投与されたＳｅｒ６９変種が真正ＩＧＦ−
Ｉと類似するＢＰ複合体を形成するのに対し、従来特性化されている１−７０Ｔ
ｈｒ２９変種は形成しないことを示唆する。全変種について、減少したＩＧＦＢ
Ｐ１結合性はより高い生物利用能およびより低い生物活性の阻害を示唆する。
結論として、インビトロのデータは、位置Ｓｅｒ６９におけるＯ−グリコシル
化および切断物の位置Ｔｈｒ２９におけるＯ−グリコシル化により、薬理学的プ
ロフィルが変化することを示す。インシュリン様活性低下は、変化したＩＧＦＢ
Ｐ１親和性と共に、生物作用選択性および利用能における変化をもたらし、この
変化は臨床にて有利に使用しうると予想される。
結論
ｒｈＩＧＦ−ＩのＯ−グリコシル化の第２番目の部位が断片ＳＡＰ９の残基Ｓ
ｅｒ６９に存在している。グリコシル化の程度は３〜５個のマンノース残基の範
囲であると判明した。特性化されたマンノシル化（Ｓｅｒ６９）ｒｈＩＧＦ−Ｉ
変種は他
の部位ではグリコシル化されなかった。
生物学的結果は、すべての変種が、ＩＧＦ−Ｉリセプタへの結合が真正ＩＧＦ
−Ｉに類似する（１−７０ Ｔｈｒ２９ＩＧＦ）が或いは減少する（ｚ、ｘ２、
ｘ４、ｘ５変種）にも拘らず、雛胎児大腿骨のインビトロ成長に対し正常な予想
されたＩＧＦ−Ｉ作用を有することを示している。これは予想外であったが、リ
セプタ結合能の損失が各変種の他の本質的性質（たとえばＩＧＦＢＰ結合変化）
により補償されうることを示すので極めて興味がある。各変種は脂質生成分析に
より示されるようにＩＧＦ−Ｉリセプタに対しインシュリンリセプタよりも増大
した選択性を有する。この分析は、各変種が骨および筋肉につき選択性であるが
脂肪もしくは肝臓には選択性でないことを示す。何故なら、後者の組織はＩＧＦ
−Ｉにつき低濃度のリセプタと顕著な濃度のインシュリンリセプタとを含有する
ことが知られているからである。インシュリン様作用が低下するにつれ、たとえ
ば低血糖症のような悪作用が低くなると予想され、投与量をより多量にすること
ができる。
全変種は、
１． 細胞増殖および分化に対する従来のＩＧＦ−Ｉ作用の選
択的強化を達成するために、インシュリンリセプタ媒介の「インシュリン様」作
用の負担にて使用しうる段階的リセプタ選択性を提供し、
２． グリコシル化の存在もしくは不存在のいずれかの結果として、さらにＩＧ
Ｆ結合性蛋白質（ＩＧＦＢＰｓ）に対する親和性変化による、動態および生物利
用性における相違を示すと思われる
ので臨床的に極めて興味がある。
Ｃ−末端切断およびグリコシル化の両者が重要である。脂質生成の低下と真正
ＩＧＦ−Ｉとの関係が全変種につき示された。ＩＧＦＢＰ１結合は真正ＩＧＦ−
Ｉの場合よりも低いが、Ｔｈｒ２９にマンノースを有するグリコシル化変種の場
合ほど低くない。ＩＧＦＢＰ３結合はＩＧＦ−Ｉの場合と同じであって、半減期
が同等であることを示す。Ｔｈｒ２９にマンノースを有する従来同定されたグリ
コシル化変種はずっと低いＩＧＦＢＰ３結合能を有する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION O-Glycosylated authentic IGF-I and truncated variants thereof, methods for their preparation, and pharmaceutical compositions The present invention provides for three or more mannose residues per Ser69 amino acid of an IGF-polypeptide chain. The present invention relates to O-glycosylated authentic IGF-I having two mannose residues to the Thr29 amino acid of the truncated IGF-polypeptide chain having a group or truncated. The O-glycosylated IGF-I according to the invention has substantially no insulin receptor affinity and is valuable for use in therapeutic treatment. Further, the present invention provides a method for obtaining the above-mentioned IGF-I by expressing IGF-I in yeast cells and separating the O-glycosylated IGF-I of the present invention from the medium, and pharmaceutically acceptable IGF-I. And a pharmaceutical composition containing a carrier, diluent or excipient. The invention further relates to the use of O-glycosylated IGF-I, for example, in the manufacture of a medicament for treating growth deficiency and insulin resistant conditions. INTRODUCTION Insulin-like growth factor-I (IGF-I) is a growth factor containing as a single polypeptide chain 70 amino acids with relatively high homology to proinsulin. It is known to promote cell growth and differentiation and also to exhibit insulin-like properties, partially mediating the action of growth hormone. Endogenous humans are not non-glycosylated. Recombinant human insulin-like growth factor I (rhIGF-I) was obtained from yeast S. cerevisiae. It is produced by expression in S. cerevisiae and transferred into the fermentation medium by a secretion system. Expression of foreign proteins in yeast results in post-translational modifications. One of the modifications observed in proteins produced in yeast is glycosylation. Although protein glycosylation in yeast can result in both N- and O-linkages, IGF-I lacks a recognition site for N-glycosylation (Asn-Xaa-Ser / Thr), so IGF-I Only de novo O-glycosylation is expected. One site for O-glycosylation at Thr29 has been determined (WO 90/02198, Gellerfors, P et al. (1989), Isolation and Characterization of a glycosylated vaariant of human insulin-like growth factor I produce d in Saccharomyces). cerevisiae, J. Biol., Chem., 264 , 11444-11449 and Elliot, S. et al. (1990), Yeast-derived recombinant human insulin-like growth factor I: Production, purification, and structural Characterization, J. Prot. Chem ,, 9 , 95-104). Yeast is known to contain carboxypeptidase (Jones, EW, (1990), Tackling the protease problem in Saccharomyces cerevisiae, Met hods Enzymol., 194 , 428-453). Thus, expression of a foreign protein in yeast can result in the production of a C-terminally truncated variant. Glycosylated IGF-I variants of IGF-I with two or more mannose residues attached to the Thr29 amino acid of the IGF-I polypeptide chain are known from WO 90/02198. It has been suggested that this glycosylated variant of IGF-I has a markedly lower blood glucose action than authentic IGF-I. Truncated variants of IGF-I are previously known from WO 91/18621, which discloses that des (1-3-)-IGF-I is useful for treating diabetes. It is also known that truncated variant des (1-3-) IG FI reduces the extent of CNS damage (WO 93/02695). WO 93/08826 discloses (4-70) IGF-I and (54-67) IGF-I, which truncated variants promote retinal neuronal survival in ophthalmic compositions. WO 87/01038 discloses peptide analogs of IGF-I in which 1-5 amino acid residues have been deleted from the N-terminus. They are said to have improved biological capacity which is useful, for example, in treating growth deficiencies and catabolic conditions. Authentic IGF-I in which glutamic acid at position 3 has been replaced or deleted by another amino acid is also known (see WO 91/10348). Herein, two other variants of glycosylated authentic IGF-I (gIGF-I) and two novel variants of C-terminally truncated IGF-I that have been isolated and characterized Separation and characterization will now be described. We have identified a genuine O-glycosylated IGF-I having four or five mannose residues per Ser69 amino acid in the IGF-polypeptide chain and three mannose amino acids per Ser69 amino acid in the IGF-polypeptide chain. O-glycosylated IGF-I with residues was separated. In addition, we have isolated variants that lack the C-terminal Ala70 residue and are also glycosylated at Thr29. Another variant lacks the C-terminal tripeptide Lys68Ser69Ala70 and is glycosylated at Thr29. While these novel O-glycosylated variants of IGF-I are expected to have normal IGF-I effects, they are promising therapeutic agents, especially in that they have less adverse effects such as reduced insulin-like effects. . Thus, they can be given at higher doses than human genuine IGF-I for the treatment of growth disorders and do not create the problems associated with hypoglycemia. Furthermore, they have a reduced ability to bind to IGF binding protein 1 (IGFBP-1), such as after trauma, insulin receptor antibody production, poorly controlled diabetes or delayed intrauterine growth (IUGR). It can be used to treat patients with insulin resistance. 1 to 6 show the present invention. FIG. Figure 3 shows the IGF-I peptide after digestion with Aureus V8 protease (SAP-V8). The resulting peptide is labeled by its shape in its primary structure. FIG. 2 shows a purification process based on the hydrophobic interaction of rhIGF-I. Fraction 8 was collected to isolate a novel, characterized IGF-I variant. FIG. 3 shows the elution profile of affinity chromatography of "fraction 8" on a concanavalin A column. Two pools (x and z) were collected from the repeat preparation. FIG. 4 shows the elution profile of the fraction × pool of FIG. 3 by reverse phase chromatography (RP-H PLC). FIG. 5 shows the peptide map of the SAP V8 digest of the two major variants z and x2 compared to authentic rhIGF-I (DSQ93). FIG. 6 shows a peptide map of the SAP V8 digest of x3, x4 and x5 variants compared to authentic rhIGF-I (DSQ93). The present invention relates to O-glycosyl having three or more mannose residues for the Ser69 amino acid of the IGF-polypeptide chain or two mannose residues for the Thr29 amino acid of the truncated truncated IGF-polypeptide chain. This is for the authenticized IGF-I. The O-glycosylated IGF-I according to the present invention has substantially no insulin receptor affinity and is valuable for use in therapeutic treatment. The invention particularly relates to those having 4 and / or 5 mannose residues for Ser69 amino acids or 3 mannose residues for Ser69 amino acids of the IGF-polypeptide chain. In addition, the present invention is particularly directed to O-glycosylated (1-67) IGF-I having two mannose residues for the Thr29 amino acid of the IGF-polypeptide chain, or two for the Thr29 amino acid of the IGF-polypeptide chain. O-glycosylated (1-69) IGF-I having the following mannose residue: O-glycosylated IGF-I. Furthermore, the present invention relates to a method for obtaining IGF-I by expressing IGF-I in a yeast cell and separating the O-glycosylated IGF-I of the present invention from a medium. The present invention further provides pharmaceutical compositions containing these IGF-Is together with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient, and pharmaceutically acceptable carriers, diluents or excipients of the IGF-I variants of the present invention. The present invention also relates to a method for producing a pharmaceutical composition by mixing with a form. Variants of IGF-I of the present invention are useful in the manufacture of a medicament for the treatment or anabolic effects of growth failure. In addition, because of their reduced ability to bind to IGF binding protein 1 (IGFBP-1), they may be associated with, for example, trauma, gene deficiencies in insulin receptor function, production of autoantibodies to insulin receptors and delayed intrauterine growth (IUGR). As well as patients with abnormally elevated IGFBP levels (especially IGFBPI). The novel glycosylated IGF variant can be administered at a dose ranging from 20 μg to 1 mg / kg, preferably from 20 to 250 μg / kg. Isolation and Characterization of Glycosylated Variants The IGF-I gene was expressed in Saccharomyces cerevisiae using the α-mating factor leader peptide-IGF-I expression plasmid, p53 9/12. This method is described in detail in WO 90/02198, p. 6 (Examples) to p. The yeast fermentation medium contained authentic human IGF-I and its variants. Initial separation of IGF-variants from authentic human IGF-I was performed by hydrophobic interaction chromatography (HI-HPLC). The pre-fraction of the peak of authentic rIGF-I (fraction 8) was collected to isolate glycosylated variants. See FIG. Chromatography on a Concanavalin A (ConA) affinity column was an effective method of separating glycosylated IGF-I from the native form. FIG. 3 shows the elution profile of affinity chromatography of "fraction 8" on a concanavalin A column. The two partially split fractions were collected as two pools, x and z. These pools were collected from replicate preparations. ConA blotting following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) showed that z was relatively homogeneous while x consisted of two major bands. Carbohydrate analysis of purified variants using GC-MS (KENNE, sis of hexoses in glycoproteins, Carbohydr. Res., 198 , 173-179) showed that both variants x and z contain only one sugar (ie, mannose) but differ in relative amounts (data shown). Zu). The x fraction was further purified by RPV-HPLC and the main peak was further characterized. FIG. 4 shows peaks x2, x3, x4 and x5. Immunoblotting with antibodies specific for the C-terminus of IGF-I further showed differences between these variants. That is, modification at the C-terminus was expected. Structural differences between glycosylated IGF-I variants were further revealed by SAP V8 enzyme mapping. This showed the change given to the particular peptide in comparison with the native peptide. FIG. 5 shows a peptide map of the SAP V8 digest of two major variants, z and x2, compared to authentic rhIGF-I (DSQ93), and FIG. 6 shows x3, compared to authentic rhIGF-I (DSQ93). Figure 4 shows peptide maps of SAP V8 digests of x4 and x5 variants. In the SAP V8 map, the only modified fragment of z was the C-terminal SAP9 (FIG. 1 for naming). The amino acid composition of the SAP9 fragment was found to be accurate (Table I: this table shows the results of the amino acid analysis of the SAP peptide in question), whereas mass spectrometry was 484.1 rather than the theoretical 1277.9 The unit showed a high molecular weight (Table II: this table shows the results of mass spectrometry of the SAP peptide in question). The molecular weight of mannose was 162.1, and this difference in mass was in good agreement with the suggestion of three additional mannose residues. Mass spectrometry of the intact polypeptide (Table III) shows the results of mass spectrometry of the undigested IGF-I variant, supporting the suggestion. As in variant z, the only modified SAP fragment of x2 was SAP9 (see FIG. 5). In addition, the fragments were observed to be impure. The amino acid composition was unchanged in the case of x2 (Table I). For the x2 SAP9 fragment, mass spectrometry gave a molecular weight 645.9 units higher than the theoretical value of 1279.6 (Table III). Thus, in this case, the suggested number of additional mannose residues is four. On the other hand, mass analysis of the undigested polypeptide showed five mannose residues (Table III), but this number is not completely accurate. The explanation is that x2 was a mixture of tetra- and penta-substituted IGF-I, and both SDS-PAGE and the shoulder at the SAP 9 peak (Figure 5) also show heterogeneity. Thus, different preparations are likely to contain different relative amounts of the two variants. With respect to the amino acid sequence of the SAP9 fragment, the only residue known to allow O-glycosylation was Ser69, thus this was the proposed glycosylation site. In the SAP V8 map, a modified SAP5 fragment common to x3, x4 and x5 (FIG. 6) was generated by dimannose-glycosylation at Thr29. Each C-terminus of the x4 and x5SAP9 fragments was also modified. The SAP V8 map of variant x4 showed two modifications of the SAP9 fragment, labeled SAP 9: 1 and SAP 9: 2 (FIG. 1). Amino acid sequence analysis (Table I) revealed that one Ala residue (probably the C-terminal Ala70) was missing in both fragments. Mass spectrometry of fragment SAP 9: 1 confirmed this modification. For the SAP9: 2 fragment, mass spectrometry gave an additional 26.6 units (Table II). This difference was consistent with mass spectrometry performed on the undigested peptide (Table III). No rational explanation was found for this difference in molecular weight. The fragment corresponding to SAP9 of variant x5 had a slightly longer retention time than x4 SAP9: 2 (see FIG. 4). Amino acid analysis of this fragment (Table I) showed the lack of one lysine, one serine and one alanine residue, suggesting cleavage of the C-terminal tripeptide Lys68-Ser69-Ala70. This suggested modification was confirmed by mass spectrometry of both the SAP9 fragment (Table II) and the undigested polypeptide (Table III). Thus, the following has been confirmed: x2 means O-glycosylated authentic IGF-I having 4 or 5 mannose residues to Ser69 amino acid of the IGF-polypeptide chain. z means O-glycosylated authentic IGF-I with three mannose residues to Ser69 amino acids of the IGF-polypeptide chain. x4 refers to O-glycosylated (1-69) IGF-I having two mannose residues for the Thr29 amino acid of the IGF-polypeptide chain. x5 refers to O-glycosylated (1-67) IGF-I having two mannose residues for the Thr29 amino acid of the IGF-polypeptide chain. Biological activity Nuclear magnetic resonance data indicate that the core of IGF-I is structurally very similar to insulin. The structural determinants for binding of IGF-I to insulin and type I receptors in this region overlap. Thus, IGF-I not only binds its own receptor but also cross-reacts with the insulin receptor, but in most cases has low affinity. The structure-function relationship of the IGF-I receptor is also similar to the insulin receptor. Although the binding affinities for their respective ligands are different, the insulin receptor and the IGF-I receptor appear to have at least the same initial steps in signal transfer after ligand binding. This suggests that the differences in biological effects between IGF-I and insulin are primarily based on differences in their receptor expression and signaling pathways in different target cells. Thus, an important determinant for the biological action of the target organ of IGF-I or a variant of IGF-I is the affinity for the two receptor types, which are mediated by binding to these two receptor types. You. The bioavailability and action of IGF is also affected by binding to specific binding proteins (IGF BPs 1-6). IGF BP3 is the predominant circulating IGF BP form in adults and generally binds over 95% of IGF-I in serum in a 150 kDa ternary complex. Ternary complexes have a relatively long half-life and cannot continue to circulate intact. Since only the free, uncomplexed form of IGF appears to be biologically active, it is necessary to provide a specific mechanism by which IGF can be shuttled from the circulation to target cells for binding to the receptor. IGF BP1 appears to be important for both transport of IGF-I to target cells and regulation of IGF responsiveness of target cells. Several studies support a physiological role for IGF BP1 in regulating IGF availability for glucose homeostasis. IGFBP-1 has been shown to suppress the insulin-like activity of IGF-I both in vitro and in vivo. IGFBP-1 is the only IGFBP that exhibits a defined pattern of control characteristic of glucose counterregulators and shows rapid fluctuations in serum with a pronounced circadian cycle. An inverse relationship exists between circulating insulin and IGFBP-1, and insulin is known to regulate hepatic IGFBP-1 production. IGFBP-1 appears to be crucial in regulating blood glucose control (and other insulin-like effects), as well as in regulating IGF effects in a rapid manner, as well as in regulating growth over time. Clinical observations have indicated an inverse correlation between circulating IGFBP-1 levels and various growth parameters. High levels of IGF-I and low levels are seen in puberty with accelerated growth. Conversely, poorly controlled growth inhibition of diabetes is accompanied by a decrease in IGFBP-3 and IGF-I, while IGFBP-1 serum levels are high. In addition, IGFBP-1 appears to regulate fetal growth, with higher levels correlating with lower body weight at birth. Thus, it is clear that the distribution of IGF among the various IGFBP types is an important determinant for IGF clearance, tissue distribution and biological activity. As a result, IGF variants with altered binding affinity to IGFBP with altered binding to the receptor can exhibit significantly different bioprofiles. The ability of glycosylated IGF-I variants to bind to IGF-I receptors was tested in receptor binding assays using human placental membrane preparations (Hall K et al., AJ Clin. Endocrinol. Metabol. 39: 973-976, 1974). Both the z and x2 variants had a 60-70% reduction in IGF-I receptor binding capacity as compared to the unglycosylated authentic IGF-I preparation. The 1-69 dimannosyl Thr29 variant (x4) showed 50% potency and the 1-67 dimannosyl Thr29 variant (x5) showed 30% potency compared to authentic human IGF-I (Table IV). reference). Thus, type I receptor binding was not significantly reduced by glycosylation at posTHR29, but further combined with C-terminal truncation resulted in a gradual and significant loss of receptor binding capacity. The in vitro bone growth stimulating effect of glycosylated rhIGF-I variants was tested in fetal chick femur analysis (Endo H et al., Nalure (London), 286: 262-264, 1980). The stimulatory effect of IGF-I in this model is mainly mediated by the chick IGF-I receptor. All glycosylated rhIGF-I variants were found to be as competent as non-glycosylated authentic IGF-I in stimulating bone growth (see Table IV). This indicates that the ability to bind the chick IGF-I receptor is intact or that the ability to bind to this receptor is slightly affected, as in the case of the human IGF-I receptor, but this effect is, for example, the IGF-I binding activity. This suggests that it is compensated by the change in affinity for the protein. IGF-I localization binding protein in bone is identified. The growth promoting effect of the glycosylated varieties was more or less unchanged. The insulin-like properties of the IGF-I variant were tested in a lipogenic assay using rat primary adipocytes (Small J. et al., J. Biol. Chem. 262: 1107-79, 1987), which showed a significant decrease in lipogenic activity. It has been shown. The adipogenic capacity of all variants was reduced to 30% or less compared to non-glycosylated authentic rhIGF-I (see Table IV). This indicates that the ability of these IGF-I homologues to bind to the insulin receptor is significantly reduced. Rat primary adipocytes are known to have a small but functional IGF-I receptor, suggesting that O-glycosylation results in reduced insulin receptor binding and therefore reduced insulin-like capacity. This is advantageous for patients requiring IGF-I for growth effects. Affinity for large BP3 (BP = binding protein) and small molecular weight BP1 was tested by the Biacore ™ method. This method is Techniques 11: 5, 1991) to measure the binding of IGF to IG FBP immobilized on the biosensor chip surface. The z and x2 variants exhibited reduced IGFB PI binding capacity (approximately 60% of unglycosylated authentic IGF-I), while the affinity of these two variants for IGFBP3 was unchanged (IV See table). These results suggest that the administered Ser69 variant forms a BP complex similar to authentic IGF-I, whereas the conventionally characterized 1-70T hr29 variant does not. For all variants, reduced IGFB P1 binding indicates higher bioavailability and lower inhibition of biological activity. In conclusion, in vitro data indicate that O-glycosylation at position Ser69 and O-glycosylation at position Thr29 of the truncation alter the pharmacological profile. Reduced insulin-like activity, together with altered IGFB P1 affinity, results in changes in bioactivity selectivity and availability, which are expected to be used advantageously in the clinic. Conclusion The second site for O-glycosylation of rhIGF-I is located at residue Ser69 of fragment SAP9. The degree of glycosylation was found to be in the range of 3-5 mannose residues. The characterized mannosylated (Ser69) rhIGF-I variant was not glycosylated at other sites. Biological results indicate that all variants have a similar (1-70 Thr29IGF) or reduced binding to the IGF-I receptor to authentic IGF-I (z, x2, x4, x5 variants) Have normal and expected IGF-I effects on chick fetal femur in vitro growth. This was unexpected, but of great interest because it indicates that loss of receptor binding capacity can be compensated for by other essential properties of each variant (eg, IGFBP binding changes). Each variant has an increased selectivity for the IGF-I receptor over the insulin receptor as shown by lipogenic assays. This analysis shows that each variant is selective for bone and muscle but not fat or liver. This is because the latter tissue is known to contain a low concentration of the receptor for IGF-I and a significant concentration of the insulin receptor. As the insulin-mimetic action decreases, adverse effects such as hypoglycemia are expected to decrease, and higher doses can be used. All variants are: 1. to provide a stepwise receptor selectivity that can be used at the expense of insulin receptor-mediated "insulin-like" effects to achieve selective enhancement of conventional IGF-I effects on cell proliferation and differentiation; It is of great clinical interest as it appears to show differences in kinetics and bioavailability as a result of either the presence or absence of glycosylation, as well as changes in affinity for IGF binding proteins (IGFBPs). Both C-terminal truncation and glycosylation are important. A relationship between reduced lipogenesis and authentic IGF-I was shown for all variants. IGFBP1 binding is lower than for authentic IGF-I, but not as low as for glycosylated variants with a mannose at Thr29. IGFBP3 binding is the same as for IGF-I, indicating equivalent half-life. Previously identified glycosylated variants with mannose at Thr29 have much lower IGFBP3 binding capacity.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
// Ｃ０７Ｋ 1/22 Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＢＡ
Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＰ
(72)発明者 レーンホルム，ハリエト
スウエーデン国、エス−142 61・トロン
シユンド、トーンスリンガン・８
(72)発明者 スコツトネル，アンナ
スウエーデン国、エス−178 32・エーケ
ーレ、ローブベーゲン・３
(72)発明者 ソーネツソン，カーリン
スウエーデン国、エス−122 37・エンシ
エーデ、ダーイエベーゲン・32────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Agency reference number FI // C07K 1/22 A61K 37/36 ABA C12P 21/02 ADP (72) Inventor Laneholm, Harriet Sweden, S −142 61 ・ Tron Sjünd, Tonslingen ・ 8 (72) Inventor Scottonel, Anna Sweden, S-178 32 Ekele, Loebwegen ・ 3 (72) Inventor Sonetzson, Carlin Sweden, S−122 37・ Enciede, Daiebegen ・ 32