JPH10500127A - Glucan binding protein and use thereof - Google Patents

Glucan binding protein and use thereof

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JPH10500127A
JPH10500127A JP7529437A JP52943795A JPH10500127A JP H10500127 A JPH10500127 A JP H10500127A JP 7529437 A JP7529437 A JP 7529437A JP 52943795 A JP52943795 A JP 52943795A JP H10500127 A JPH10500127 A JP H10500127A
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Abstract

(57)【要約】 グルカンに対して特異的結合親和性を有するポリペプチド、特にグリコシルトランスフェラーゼ酵素のグルカン結合ドメインを口内ケアー用組成物に使用する。該ポリペプチドは、歯垢中においてグリコシルトランスフェラーゼが結合して歯垢を生成する結合部位を遮断することができるか、又は、抗歯垢剤若しくは抗着色剤と結合して標的部位にそれらを送達することができる。   (57) [Summary] Polypeptides having specific binding affinity for glucan, particularly the glucan binding domain of a glycosyltransferase enzyme, are used in oral care compositions. The polypeptides can block the binding site where glycosyltransferase binds in plaque to form plaque, or bind the anti-plaque or anti-colorant to deliver them to the target site can do.

Description

【発明の詳細な説明】 グルカン結合タンパク質及びその使用 発明の技術分野 本発明はグルカン結合特性をもつポリペプチド、該ポリペプヂドを含むハイブ リッド材料、並びに該ポリペプチドを含む新規歯垢標的活性系及びオーラルケア 組成物に関する。発明の背景 歯垢の発生及び蓄積は細菌及び細菌産物が歯に付着することによって生じる。 多数の歯垢菌の付着は、食物蔗糖からの粘着性細胞外多糖類の生産によって媒介 される。歯垢中で蔗糖から合成される主要な２種類のこのような多糖類はグルカ ンとフルクタンである［Ｈａｍａｄａ ＳとＳｌａｄｅ Ｈ Ｄ １９８０ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃａｒｉｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅ ｖ． ４４：３３１−３８４］。これらの粘着性多糖類は、立体化学的に特異的な 結合部位の提供と細菌の非立体特異的捕捉により歯垢細菌の付 着を増大させることが知られている。グルカンとフルクタンを合成する細菌性酵 素はそれぞれグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）及びフルクトシルトラン スフェラーゼ（ＦＴＦ）と呼ばれ、多数の歯垢細菌により分泌される。これらの 酵素は細菌表面に結合しており、口腔を潤す唾液に混じって歯の表向に吸着され る［Ｒｏｌｌａ Ｇ，Ｃｉａｒｄｉ Ｊ Ｅ，Ｅｇｇｅｎ Ｋ，Ｂｏｗｅｎ Ｗ Ｈ及びＡｆｓｅｔｈ Ｊ （１９８３） Ｆｒｅｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌ− ａ ｎｄ ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓａｌ ｉｖａ ａｎｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅｅｎｚｙｍｅｓ ｔ ｏ ｔｅｅｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｉｎ： Ｒ Ｊ ＤｏｙｌｅとＪ Ｅ Ｃｉ ａｒｉｄ（編） Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ｇｌｕｃａｎｓ， ｓｕｃｒｏｓｅ ａｎｄ ｄｅｎｔａｌ ｃａｒｉｅｓ．Ｓｐｅｃ．Ｓｕｐｐｌ ．Ｃｈｅｍ．ｓｅｎｓｅｓ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ ｐ２１−３０］。 歯垢中のグルカンはα１，６結合及びα１，３結合グルコース残基から主に構 成される。 多糖類により媒介される細菌の付着は病原性歯垢の蓄積に極 めて重要であると考えられる［ＨａｍａｄａとＳｌａｄｅ，１９８０］。数種の 口内細菌はグルカンを認識してこれに結合するタンパク質を産生する。これらの タンパク質には、歯垢の形成に関与するグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ ）や非酵素性グルカン結合タンパク質（ＧＢＰ）が含まれる。ＧＴＦとＧＢＰは α１，６結合グルコース残基を含むグルカンを認識し、細菌か細胞外歯垢基質に 結合するのを媒介する［Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ Ｋ ＭとＢｏｗｅｎ Ｗ Ｈ １ ９９２ Ｇｌｕｃａｎｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｉｎ ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓａｌｉｖａｒｙ ｐｅｌｌｉｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉ ｏｎ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ Ｓｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：２８ ４−２９５］。 口内連鎖球菌からのＧＢＰと数種のＧＴＦの分子分析の結果、これらのタンパ ク質はグルカンとの立体特異的結合に関与する特徴的領域（ＧＢＤ）をもつこと が判明した［Ｗｏｎｇ Ｃ，Ｈｅｆｔａ Ｓ Ａ，Ｐａｘｔｏｎ Ｒ Ｊ，Ｓｈ ｉｖｅｌｙ Ｊ Ｅ及びＭｏｏｓｅｒ Ｇ（１９９０） Ｓｉｚｅ ａｎ ｄ ｓｕｂｄｏｍａｉｎ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｃ ａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ； ３α−Ｄ ｇ ｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｍ．５８：２１６５−２１７０ ；Ｆｅｒｒｅｔｔｉ Ｊ Ｊ，Ｇｉｌｐｉｎ Ｍ ＬとＲｕｓｓｅｌｌ Ｒ Ｂ （１９８７） Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｇｌｕｃ ｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ ｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ ＭＥＦ２８，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂａｃｔ．１６９， ４２７１−４２７８；Ｋａｔｏ ＣとＫｕｒａｍｉｔｓｕ Ｈ Ｋ（１９９０） Ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ ｅｎｚｙｍｅ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ ７２，２９９−３０２］。グルカン結合領域に関する研究の結果、こ れらの領域は無傷のＧＴＦに認められると同様の親和性でグルカンと結合するこ とが判明した。 他の多糖類結合領域も公知であり、組換え発酵産物の下流プロセッシングを助 長するために他のタンパク質及びペプチドと結合されている。例えば、研究者ら は澱粉及びセルロース樹脂上でタンパク質を精製する目的で、澱粉結合領域［Ｃ ｈｅｎ Ｌ，Ｆｏｒｄ Ｃ及びＮｉｋｏｌｏｖ Ｚ（１９９１） Ａｄｓｏｒｐ ｔｉｏｎ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｏｆ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｕ ｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ−ｂ ｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌｕｃｏａｍ ｙｌａｓｅ Ｇｅｎｅ ９９１，１２１−１２６］とセルロース結合領域［Ｏｎ ｇ Ｅ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ Ｊ Ｍ，Ｇｉｌｋｅｓ Ｎ Ｒ，Ｋｉｌｂｕｒｎ Ｄ Ｇ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｒ Ｃ及びＷａｒｒｅｎ Ｒ Ａ Ｊ（１９８９） Ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｃｅｌ ｌｕｌａｓｅｓ；ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＴＩＢＴ ｅｃｈ ７：２３９−２４３］を含む融合タンパク質を作成している。 オーラルケア効果に有効な活性系の開発に関連する重要な技術的問題の１つは 、口内の所望部位（例えば歯垢）への薬剤の 実体的送達を得ることである。現在使用されている実体的歯垢防止剤の大半は、 静電相互作用を介して口内表面に結合するビスビグアニド及び第４級アンモニウ ム化合物等の正電荷殺微生物剤である。 しかし、カチオン性殺微生物剤の結合は実際に（そのままでは疎水性物質に対 しても）非特異的であり、これらの殺微生物剤は全口内組織に結合する。更に、 歯磨剤や口内リンス剤でクロルヘキシシンや塩化セチルビリジニウム等のカチオ ン性分子を使用すると、歯が汚れたり、製品の味が望ましくないという問題があ った。発明の要約 本発明は、歯垢基質に含まれるか又は細菌表面に結合しているグルカンを標的 にしてこれと結合するグルカン結合ポリペプチドを使用する。グルカン結合ポリ ペプチドは歯垢防止剤又は他の物質と結合することができ、これらの物質を歯垢 に送達するのに使用し、実体的送達を実現すると共に、多くの場合には物質の必 要量を減らすことができる。前記ポリペプチドは、カチオン性物質及び他の非特 異的オーラルケア活性物質に伴うマイナスの側面を避けることができる。化学的 手段又は分子生物 学ツール（即ち融合タンパク質）により種々の材料と複合体を形成することがで きる。 広義には、第１の側面において本発明はグルカンに対して特異的結合親和性を もつポリペプチドを提供するものであり、該ポリペプチドはグリコシルトランス フェラーゼ酵素に取り込まれず、望ましくはグリコシルトランスフェラーゼ酵素 活性を示さない別の材料と化学的に共有結合している。 本発明はグルカン結合ポリペプチドを別の部分と結合して使用するものであり 、いくつかの点で特筆される。まず第１に、本発明の複合体はα１，６結合グル カンを含む認識系から誘導される。第２に、本発明の複合体は口内環境で効果を 生じるために使用される。第３に、従来記載されている他の多糖類結合領域融合 体は単純なクロマトグラフィー樹脂に生体外で結合するために使用されているが 、これに対してグルカン結合複合体は生体膜を標的とし、生化学的に好ましくな い環境で二次的生理的効果をもたらす。 本発明によると、既存のグルカン上の結合部位をブロックするためにグルカン 結合ポリペプチドを使用することも可能である。ＧＴＦによるポリマー合成には 、酵素によるグルカン結合 が必要である。グルカン結合ポリペプチドはＧＴＦと結合部位を競合するので、 歯垢中でＧＴＦに触媒されるグルカン合成の立体特異的阻害剤として作用する。 この結果、歯垢の蓄積とテナシティーが減少する。同様に、グルカン結合ポリペ プチドは口内細菌が結合している歯垢基質の部位をブロックし、こうして歯垢の 蓄積を阻止することも可能である。しかし、このように特定の他の物質の標的手 段としてよりもむしろ競合的阻害剤としてグルカン結合ポリペプチドを使用する 場合には、グルカン結合ポリペプチドが合成段階に必要とされた特定の他のペプ チド残基と融合することも考えられる。 第２の側面では、本発明はグルカンに対して特異的結合親和性をもつポリペプ チドを口内使用に許容可能なキャリヤービヒクル中に含む口内局所投与用組成物 を提供する。発明の詳細な説明 本発明の１つの目的は、オーラルケア活性物質、特に歯垢防止剤及び汚染防止 剤をヒトの歯垢に実体的に送達するために、ＧＢＤ又は他のグルカン結合ポリペ プチドをターゲッティング基として利用することである。グルカン結合ポリペプ チドは、エステル、スルフヒドリル、ペプチド、イソペプチド、アミド 及び他の型の化学的結合により多数の物質と化学的結合を介して複合体を形成す ることができる。各方法で結合可能な物質としては、有機化合物、無機錯体、タ ンパク質、酵素、ペプチド、抗体及び種々の配位子を挙げることができる。複合 体は組換えＤＮＡ技術により製造された融合又はハイブリッドタンパク質でもよ い。 グルカン結合ポリペプチドと結合する酵素の非限定的な例としては、オキシダ ーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、エステラ ーゼ、アミダーゼ、デアミナーゼ、ウレアーゼ及び多糖ヒドロラーゼを挙げるこ とができる。特に、オキシダーセは歯垢中の微生物種に対して作用する細胞毒性 物質として機能することができる。グルコース及びガラクトースオキシダーゼは 細胞毒性の過酸化水素を生成する。ペルオキシダーゼはこの過酸化水素をより毒 性のハイポハライトに変換することができる。過酸化水素とハイポハライトはい ずれも生体内寿命が短く、本発明により実現されるように所期作用点で生成する ことによって一層効果を増す。 このような酵素はその産物が漂白種であることから汚染防止剤としても機能す ることができる。抗体、抗体フラグメント、 ヒスタチン、ラクトフェリン、デフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）、マゲイニ ン、セクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎｓ）、他のカチオン性のアンチバクテリオシ ン及びバクテリオシン等の非酵素抗微生物タンパク質及びペプチドも、グルカン 結合ポリペプチドと結合することができる。非限定的な例としてトリクロサン（ ｔｒｉｃｌｏｓａｎ）、クロルヘキシジン、第４級アンモニウム化合物、クロル オキシレノール、クロルオキシエタノール（ｃｈｌｏｒｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ） 、チモール及びフッ化物等の殺微生物剤もグルカン結合ポリペプチドと化学的に 結合することができる。Ｚｎ、Ｓｎ、Ｃｕ等の抗微生物カチオンは、（ポリ）カ ルボン酸、アミノ酸等の適当なキレート化剤と複合体を形成することによってグ ルカン結合ポリペプチドと結合することができる。ビオチン−アビジン複合体に よりターゲッティング系を製造することもできる。例えばビオチンをＧＢＤと化 学的に結合して歯垢を標的とし、アビジン複合体に対する特異的結合部位として ビオチンを作用させることができる。また、ビオチン複合体に対する歯垢特異的 結合部位としてアビジン−ＧＢＤ複合体を使用することもできる。 本発明では、ヒドロラーゼ、ｐＨ又は酸化／還元に感受性の結合を介して歯垢 防止剤又は他のオーラルケア活性物質をグルカン結合ポリペプチドと結合するこ とにより、グルカン結合ポ リペプチドを標的遊離物質として使用することも可能である。歯垢中で内在又は 外来プロテアーゼにより加水分解されるプロテアーゼ感受性リンカーペプチドに より、タンパク質をグルカン結合ポリペプチドと融合することができる。非タン パク性殺微生物剤はエステラーゼ、アミダーゼ、リパーゼ又は他のヒドロラーゼ 感受性結合により結合することができる。遊離はｐＨ感受性結合を使用しても可 能であるし、歯垢中のレドックス電位の低下又は還元剤の蓄積に伴って化学的還 元に感受性となるＳ−Ｓ結合を介してタンパク質、ペプチド又は他の物質を結合 することによっても可能である。 グルカン結合ポリペプチドを含むオーラルケア製品は、練り歯磨き、ジェル、 マウスウォッシュ、粉末、漱剤、溶液、トローチ剤、チューインガム及びデンタ ルフロス等の種々の形態をとり得る。 口腔用組成物は更に、澱粉、蔗糖、ポリオール、界面活性剤、水又は水／アル コール系等の医薬的に許容可能なキャリヤーをはじめとする慣用成分を含有し得 る。歯磨剤に調剤する場合には、このような製剤は通常の歯磨剤成分を含み得る 。即ち、通常は５〜６０重量％の割合でシリカ、アルミナ、炭酸カルシウ ム、リン酸二カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ピロリン酸カルシウム、トリ メタホスフェート、不溶性ヘキサメタホスフェート等の粒状研磨剤を含有し得る 。 更に、歯磨剤はグリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール、ラクチ トール等の湿潤剤を含有し得る。 アニオン、非イオン、両性及び両性イオン合成洗剤等の界面活性剤も配合し得 る。このような界面活性剤の例はナトリウムラウリルスルフェート、ナトリウム ドデシルベンゼンスルホネート、ナトリウムモノ及びジオクチルホスフェート、 ナトリウムラウロイルサルコシネート、コカミドプロピルベタインである。 ナトリウムカルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム等の 結合剤及び増粘剤、ポリアクリレート等の合成ポリマー、並びにＣａｒｂｏｐｏ ｌ（登録商標）等のカルボキシビニルポリマーも配合し得る。 ペパーミント油及びスペアミント油等のフレーバーや、保存剤、不透明剤、着 色剤、ｐＨ調節剤、甘味剤等も配合し得る。 トリクロサン、クロルヘキシジン、銅塩、亜鉛塩及び第１錫塩（例えば硫酸銅 、クエン酸亜鉛及びピロリン酸第１錫）、サ ンギナリン抽出物、メトロニダゾール等の付加的抗菌剤も配合し得る。付加的抗 菌剤の例としては更に、第４級アンモニウム化合物（例えば塩化セチルピリジニ ウム）、ビスグアニド（例えばジグルコン酸クロルヘキシジン、ヘキセチジン、 オクテニジン、アレキシジン）、ハロゲン化ビスフェノール化合物（例えば２， ２’−メチレンビス−（４−クロロ−６−ブロモフェノール））が挙げられる。 抗菌剤等の活性成分の送達を強化することができるポリマー化合物も配合し得 る。このようなポリマーの例はポリビニルメチルエーテルと無水マレイン酸のコ ポリマーや、ＤＥ−Ａ−３，９４２，６４３（Ｃｏｌｇａｔｅ）に記載されてい るような他の類似送達強化ポリマーである。 更に、イブプロフェン、フルルビプロフェン、アスピリン、インドメタシン等 の抗炎症剤も配合し得る。 フッ化ナトリウム、フッ化第１錫、アミンフッ化物、モノフルオロリン酸ナト リウム、乳酸カルシウム及び／又はグリセロリン酸カルシウム、ストロンチウム 塩及びストロンチウムポリアクリレート、カゼイン及びカゼイン消化物、並びに リンタンバク質等の抗齲蝕剤も配合し得る。 他の任意成分としては、ビタミン類（例えばビタミンＣ）、植物エキス、カリ ウム塩（例えばクエン酸カリウム、塩化カリウム及び硝酸カリウム）が挙げられ る。 他の任意成分としては、酵素（デキストラーゼ及び／又はムタナーゼ、アミロ グルコシダーゼ、グルコース−オキシダーゼとラクトペルオキシダーゼ、ノイラ ミニダーゼ）及び過酸化水素発生化合物（例えばカリウムペルオキシジホスフェ ート）が挙げられる。 更に、口腔用組成物はアルカリ金属ピロリン酸塩、次亜リン酸塩含有ポリマー 、有機ホスホン酸塩、リンクエン酸塩等の抗結石剤も含有し得る。 この他に配合し得る他の任意成分としては例えばバクテリオシン、バクテリオ ファージ、組織呼吸因子、抗体、漂白剤（例えばペルオキン化合物）、起泡系（ 例えば重炭酸ナトリウム／クエン酸系）、変色系等が挙げられる。図面の簡単な説明 図１は、プラスミドｐＵＣ１８ ３８Ｈｉｎｄと該プラスミドから構築された 誘導体の構造を概略的に示す。本図及び他の図面では次の略号を用いて制限部位 （該当する場合）を示す。 Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｂｇｌ＝ＢｇｌII、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、Ｈ＝ＨｉｎｄIII、Ｋ＝ ＫｐｎＩ、Ｐ＝ＰｓｔＩ、Ｐｖｕ＝ＰｖｕII、Ｓ＝ＳｏａＩ及びＸ＝ＸｂａＩ。 略号のない制限部位はＢａｍＨＩ／ＢｇｌII連結後に生成された２つのＤＮＡフ ラグメントのＢｓｔＹＩ境界部位を示す。 図２は、形質転換用中間体を作成するために使用した［ヘテロダイマー」系の 一般ストラテジーを示す。 図３は、組込みアンカー部位をＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ染色体に導入するために 使用したプラスミドの構造を示す。制限部位は図１で説明した略号で示し、その 他にＢｓ＝ＢｓｔＢＩ、Ｃ＝ＣｌａＩ及びＸｈ＝ＸｈｏＩも使用した。 図４は、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ染色体へのハイブリッドＧＢＤ遺伝子の組込み を示す一連の制限地図である。最上段の地図はＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉにおけるｇ ｔｆＧ遺伝子の周囲の染色体構造を示す。他の地図は縮尺を拡大し、野生型（Ａ ）、一次（Ｃ）、二次（Ｅ）及びＧＢＤ+（Ｇ）組込体の染色体構造を示す。Ｄ ＮＡフラグメント（Ｂ）及び（Ｄ）は図３Ｅ及び３Ｈのヘテロダイマープラスミ ドをそれぞれＨｉｎｄIII及びＮｏｒＩで消化することにより調製した。制限フ ラグメント（Ｆ）は 図１Ｃのプラスミド３８ＨＧＢＤＥｍrのＰｖｕII消化産物であった。 図５は、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉへの常在性プラスミド組込みを立証する予備実 験の図である。制限部位は図１及び３と同様の略号で示す。更に、Ｎ＝ＮｃｏＩ 及びＲＶ＝ＥｃｏＲＶである。 図６Ａ、Ｂ及びＣはプラスミドの構造を示し、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ細胞内の 常在性プラスミドへのハイブリッドＧＢＤ遺伝子の組込みを示す。 図６Ｄは、組換えＤＮＡ配列をより詳細に示す。 図６Ｅは、アガロースゲル電気泳動の結果を示し、各レーンは、ＭはλＤＮＡ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII二重消化物とλＤＮＡ ＨｉｎｄIII消化物の混合物 、１は初期常在性プラスミドｐＰＩＯＺ’１８Ｓｐｅｃr、２と３及び４と５は それぞれ一次及び二次形質転換体、２と４及び３と５はそれぞれ陽性及び陰性対 照組込体を示す。 図７は、（連続線上に）ｇｔｆＤ遺伝子、ｇｔｆＤ遺伝子（プローブＤＮＡと して使用）並びにｇｔｆＤ遺伝子の５’及び３’フランキング領域を含むＳ．ｍ ｕｔａｎｓ ＧＳ−５染 色体構造の制限地図を示す。制限部位は上記図１、３及び５で説明した通りであ り、更に（Ｄ）は非ユニークＤｒａＩ部位、及びＮｈ＝ＮｈｅＩを示す。 図８は実施例３の結果の棒グラフである。 図９は実施例４で使用したウエルアレーのスライドを示す。 図１０はＤａｃｔｙｌｉｕｍ ｄｅｎｄｒｏｉｄｅｓのガラクトースオキシダ ーゼ遺伝子の制限地図とプラスミドへの遺伝子フラグメントの組込みを示す。 図１１及び１２は完全遺伝子を含むプラスミドを構築するためのその後の操作 を概略的に示す。 図１３及び１４はＧＢＤ遺伝子とガラクトースオキシダーゼ遺伝子の両者を組 込んだプラスミドの構築を概略的に示す。 図１５はガラクトースオキシダーゼ活性アッセイの結果を示す。 図１６はグルカン結合アッセイの結果を示す。実施例１−ＧＢＤを含む融合タンパク質の調製 図７の制限マップに示されているように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＧＳ−５の染色 体内遺伝子ｇｔｆＤは、その３′末端の近くの１．６７ｋｂのＸｂａＩ−Ｂａｍ ＨＩフラグメント内にグルコース結合ドメイン（ＧＢＤ）に対する遺伝子を含ん でいる〔Ｈｏｎｄｏ，Ｏ．，Ｋａｔｏ，Ｃ．，及びＫｕｒａｍｉｔｓｕ，Ｈ．Ｋ ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｇｔｆＤ Ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈ ｅ Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｓ Ｅｎｚｙｍｅ，Ｊ Ｇｅｎ Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ １３６：２０９９−２１０５参照〕。 （ａ）ハイブリッドＧＢＤ遺伝子の作製。ＧＴＦ−Ｉ酵素を分泌させるためのシ グナルペプチドとしてイニシエーターＭｅｔからの最初の３８アミノ酸残基を特 定するＳ．ｍｕｔａｎｓ ＧＳ−５ ｇｔｆＢ遺伝子からの分泌ドメインは既に分 離されている（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６１：３７４５）。 ｐＵＣ１８のｌａｃＺ′遺伝子とは反対の方向に配向されたこのドメイン（８ ００ｂｐのＨｉｎｄIIIフラグメン ト）を含むｐＵＣ１８ ３８Ｈｉｎｄと称されるプラスミド（図１Ａ）を構築し た。次いで、ＧＢＤ遺伝子を含むｇｔｆＤ遺伝子（５）（図７）のＸｂａＩ−Ｂ ａｍＨＩフラグメント（１．６７ｋｂ）の３′部分をＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ切断 プラスミドｐＵＣ１８ ３８Ｈｉｎｄにクローン化した。得られた３８ＨＧＢＤ と称されるプラスミド（図１Ｂ）において、シグナル配列コード領域中の３′− ＨｉｎｄIII部位と、ＧＢＤ遺伝子中の５′−ＸｂａＩ部位との読み取りフレー ムは、ｐＵＣ１８の多クローン部位（ＭＣＳ）のものと同じである。従って、Ｇ ＢＤ分子は、ＧＴＦ−Ｉタンパク質リーダー配列と融合して発現される。陰性対 照として、唯一のＸｂａＩ部位を消化し、充填、再環状化して、ＧＢＤの読み取 りフレームが該シグナル配列とのフレーム外にあるプラスミドを形成した。ウエ スターンブロット分析により、各プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ形質転換細胞 の粗抽出物中にＧＢＤタンパク質が存在するか否かを確認した（データは示さず ）。 図１Ｂのプラスミドをさらに修飾して、その唯一のＢｇｌII部位にＥｍr遺伝 子を組み込んだ（３８ＨＧＢＤＥｍr、６．３ｋｂ，図１Ｃ）。次いでこれを、 以下に記載のＳ． ｇｏｒｄｏｎｉｉの形質転換に用いた。 （ｂ）Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ染色体へのハイブリッドＧＢＤ遺伝子の組込み。ｐ ＲｅｓＥｍ７４９と称されるＥ．ｃｏｌｉ−ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓシャト ルプラスミドにハイブリッドＧＢＤ遺伝子を含むフラグメントをクローン化しよ うと試みた。これは不成功に終わり、代替えクローニング法を考案する必要があ った。採用した方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ−ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓシャトルプ ラスミドを用いずにハイブリッドＧＢＤ遺伝子を直接Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉに導 入しようとするものであった。 Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ染色体にハイブリッド遺伝子を組込むための標的部位と して、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ ｇｔｆＧ遺伝子の内部１．５ｋｂ ＨｉｎｄIIIフ ラグメントを選択した。図４に示すように、野生型Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉのｇｔ ｆＧ遺伝子は、３つのＨｉｎｄIIIフラグメントに亘っている。これらのうち真 中のものを標的フラグメントとして選択した。該フラグメント及び隣接する１つ のＨｉｎｄIIIフラグメントを既知プラスミドｐＡＭ５０１０［Ｓｕｌａｖｉｋ ，Ｍ．，Ｔａｒｄｏｆ，Ｇ．，及びＣｌｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｄ．（１９９２）Ｉｄ ｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏ ｆ ａ Ｇｅｎｅ ｒｇｇ ｗｈｉｃｈ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓ ｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ＳＰＰ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ Ｓ．Ｇｏｒｄｏｎｉｉ Ｃｈａｌｌｉ ｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７４，３５７７−３５８６〕にクローン化した 。該プラスミド ｐＡＭ−Ｓ１５は、ｐＡＭ５０１０挿入物の１．５ｋｂ Ｈｉｎ ｄIIIフラグメントの３′末端を含んでいる。 最初のステップとして、意図するＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ染色体の形質転換をす る前に、選択した標的フラグメントに適切な組込みアンカー部位（ａｎｃｈｏｒ ｓｉｔｅｓ）を導入することが必要であった。このための中間体を構築するた めに、新規な「ヘテロダイマー」系を設計した。これによって、ＤＮＡフラグメ ントを標的部位の５′及び３′フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域の間に挿 入することができる。 図２を参照して、この「ヘテロダイマー」系を一般的に説明する。「受容体」 と称されるプラスミドを図２Ａに示す。該プラスミドは、図２に部位Ａとして示 されている単一のＰｖｕII部位を有している。先ず、アンカー部位を含 む標的遺伝子（図２Ｆ）を、単一のＰｖｕII部位を適切に変換した後で受容体プ ラスミドにクローン化して、図２Ｂに示されているプラスミドを得る。次いで、 別のプラスミドのＰｖｕII部位を、リンカーＤＮＡに連結して修飾し、それによ って、得られた、図２Ｃに示されている「レスキュー」プラスミドは、受容体プ ラスミドに挿入クローン化された状態で存在する、酵素Ｂで制限するための唯一 の部位と適合する部位を有する。図２Ｂ及び図２Ｃのプラスミドを共に制限酵素 Ｂで完全に消化する。得られた２つのＤＮＡフラグメントをホスファターゼ処理 せずに連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換する。両抗生物質の組合わ せを含むＬＢ寒天プレート上で選択したこれらの形質転換細胞から精製したプラ スミドＤＮＡは、２つの同一複製領域（ｐ１５Ａｏｒｉ）並びに２つの異なる薬 剤耐性マーカーを含むダイマー（図２Ｄ）である。従って、このプラスミドは「 ヘテロダイマー」と称される。最後に、組込み用のＤＮＡフラグメントは、図２ Ｄのヘテロダイマープラスミドを制限酵素Ａで消化すると容易に作製される。こ れによって、標的遺伝子の正しい配向の５′及び３′フランキング領域の間に位 置するｐＲｅｓと称される部分が残され る。「レスキュード」プラスミド（Ｅ）を再環状化し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換 した後で分離する。レスキュードプラスミド中の挿入物の構造（図２Ｅ）は、標 的部位、５′−Ａ−Ｂ−Ａ−３′とは異なる構造、５′−Ｂ−Ａ−Ｂ−３′を有 している。 上記に一般的に述べた手順を図３に示されているように用いた。 適切な組込みアンカー部位を得るために、図２Ｂのものと類似の、ｐＲｅｓＡ ｍｐｄＢＣ（２．１ｋｂ）及びｐＲｅｓＫｍＨｉｎｄＳ−１５（３．５ｋｂ）と 称される２つのプラスミドを構築した（それぞれ、図３Ａ及び図３Ｄ）。前者の プラスミドは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ由来の、それぞれｇｔｆＢ遺伝子及びｇｔｆＣ 遺伝子からなる２５０ｂｐの５′及び３′フランキング領域を含んでいるのに対 し、後者は、Ｓ．ｇｏｒｄｉｎｌｉ（１８）由来のｇｔｆＧ遺伝子の１．５ｋｂ 内部ＨｉｎｄIIフラグメントを含んでいる。ＰｓｔＩリンカーＤＮＡを導入して 、後者プラスミド内のこの挿入物中に存在する唯一のＳｃａＩ部位をさらにＰｓ ｔＩ部位に変換した。図３Ａに示されているプラスミドｐＲｅｓＡｍｐｄＢＣの ＭＣＳ内構造は、 Ｎｏｔ−Ｂｅｌ−Ｈｉｎｄ−Ｓｐｈ−Ｐｓｔ−５′末端−Ｂｇｌ− ３′末端−Ｐｓｔ−−−Ｂａｍ／Ｂｇｌ−Ｎｏｔ であった。 挿入物の唯一のＢｇｌII部位に、ＢｇｌIIで切断したレスキュープラスミド、 ｐＲｅｓＥｍＢｇｌ（１．６ｋｂ、図３Ｂ）を連結した。得られたヘテロダイマ ープラスミドｐＲｅｓＡｍｐｄＢＣ：ｐＲｅｓＥｍＢｇｌ（３．７ｋｂ，図３Ｃ ）を、Ａｍｐ及びＥｍを追加したＬＢ寒天プレート上でコロニーの選択をした後 、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９形質転換細胞から分離した。該プラスミドのＭＣＳ 内の構造は、 Ｎｏｔ−ＢＣｌ−Ｈｉｎｄ−Ｓｐｈ−Ｐｓｔ−５′末端−Ｂｇｌ：ｐＲｅ ｓＥｍＢｇｌ：Ｂｇｌ−３′末端−Ｐｓｔ−−−Ｂａｍ／Ｂｇｌ−Ｎｏｔ であった。 このヘテロダイマープラスミドをＰｓｔＩで消化し、５′及び３′末端フラグ メントに近接する（ｆｌａｎｋｅｄ）ｐＲｅｓＥｍＢｇｌを含む２．１ｋｂフラ グメントをゲル精製した。該フラグメントをＰｓｔＩ切断プラスミド、ｐＲｅｓ ＫｍＨｉｎｄＳ−１５Ｐ（３．５ｋｂ、図３Ｄ）及びヘテロダイマープラスミド と連結し、ｐＲｅｓＫｍＨ ｉｎｄＳ−１５Ｐ：ｐＲｅｓＥｍｄＢＣ（５．６ｋｂ、図３Ｅ）を分離した。こ のヘテロダイマープラスミドをＨｉｎｄIIIで消化すると、図４Ｂに示されてい るフラグメントが得られる。 ＨｉｎｄIII消化プラスミドを用いてＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉを形質転換した。 二重交差が生じ得る染色体とＤＮＡフラグメントの共通領域は、図４Ａ及び図４ Ｂに太線で示されている、ｐＡＭ−Ｓ１５の５′及び３′フラグメントである。 ｇｔｆＧ遺伝子のＳｃａＩ部位と置き換える組込みアンカー部位を含むＳ．ｇｏ ｒｄｏｎｉｉ一次組込み体（Ｅｍr、ＧＴＦ-、図４Ｃ）を形質転換後に分離した 。 １．２ｋｂ ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメント（ｇｔｆＤ遺伝子の３′部 分を含む、図７）をＨｉｎｄIII−ＢｇｌII切断プラスミドｐＲｅｓＡｍｐｄＢ Ｃ（図３Ａ）に導入して、ｐＲｅｓＡｍｐ３′ＧＢＤｄＣ（３．０ｋｂ）図３Ｆ ）を得た。このプラスミド中の挿入物の構造は、 Ｎｏｔ−Ｂｃｌ−Ｈｉｎｄ−３′ＧＢＤ−Ｂａｍ／Ｂｇｌ−３′末端−Ｐ ｓｔ−−−Ｂａｍ／Ｂｇｌ−Ｎｏｔ であった。 次いで、ｐＲｅｓＳｐｅｃＨｉｎｄ（１．８ｋｂ、図３ Ｇ）をｐＲｅｓＡｍｐ３′ＧＢＤｄＣの唯一のＨｉｎｄIII部位にクローン化し 、ヘテロダイマーｐＲｅｓＡｍｐ３′ＧＢＤｄＣ：ｐＲｅｓＳｐｅｃＨｉｎｄ（ ４．８ｋｂ、図３Ｈ）を分離した。該挿入物の周囲構造は、 Ｎｏｔ−Ｂｃｌ−Ｈｉｎｄ：ｐＲｅｓＳｐｅｃＨｉｎｄ：Ｈｉｎｄ−３′ ＧＢＤ−Ｂａｍ／Ｂｇｌ−３′末端−Ｐｓｔ−−−Ｂａｍ／Ｇｂｌ−Ｎｏｔ であった。 このプラスミドをＮｏｔＩで消化すると、図４Ｄに示されているフラグメント が得られる。 ｇｔｆＢ及びｇｔｆＣ遺伝子（図４Ｃ）の５′及び３′フランキング領域を含 むＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ一次組込み体をＮｏｔＩ消化後にこのヘテロダイマープ ラスミドで形質転換し（図３Ｄ）、二次組込み体（Ｅｍr、Ｓｐｅｃr、３′ＧＢ Ｄ、図４Ｅ）を分離した。二重交差が生じ得る染色体及びＤＮＡフラグメントの 共通領域は、ｐ１５Ａｏｒｉ及びＳ．ｍｕｔａｎｓ ｇｔｆＣ遺伝子の３′末端 である。最後に、この組込み体を、ＰｖｕII消化後に、プラスミド３８ＨＧＢＤ Ｅｍr（図ＩＣ）で形質転換して、図４Ｄに示されているフラグメントを得た。 二重交差が生じ得る染色体及びＤＮＡフラグメントの共通領域は、Ｓ．ｍｕｔａ ｎｓ ｇｔｆＢ遺伝子の５′末端とＧＢＤ遺伝子の３′末端である。形質転換後 、Ｓｐｅｃr、Ｅｍr、ＧＢＤ+形質転換細胞を分離した（図４Ｇ）。 上記と同様な方法で形成した陰性対照ハイブリッド遺伝子を用い、図１Ｂに示 されている３８ＨＧＢＤプラスミドのＸｂａＩ部位を代えて、対応ＧＢＤ形質転 換細胞を構築した。 （ｃ）常在性プラスミドの組込み。上記のような予備実験を行ったが、ハイブリ ッドＧＢＤ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉのシャトルプラスミドｐＲｅｓＥｍ７４９に クローン化できなかった。Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉは菌株であるために、形質転換 後に適切な線状ＤＮＡフラグメントを用いて染色体の組込みを容易に実施するこ とができた。この方法を、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ中で複製するプラスミド上に常 在するＤＮＡフラグメント〔組換え容易な株（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐ ｒｏｆｉｃｉｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ）である〕が組込みの後で置換し得るかどう かを測定して調べた。これは図５に示されている。Ｅｍr及びＳｐｅｃr遺伝子を （別々に）ｐＵＣタイプＫｍrベクターのプラスミドＫｍＯＺ′１８のＢａｍＨ Ｉ部位にクローン化した（Ｉｎｆｅ ｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６１：３７４５）。このプラスミドのＫｍr遺伝子はＸｈｏＩ 部位に近接しているので、この薬剤耐性遺伝子をＸｈｏＩ消化して除去し、充填 反応(ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ)後にＢｇｌIIリンカーを導入し た。このシャトルプラスミドｐＲｅｓＥｍ７４９において、ＣｌａＩとＳｃａＩ 部位の１つとをいくつかのＤＮＡ操作をした後ＢａｍＨＩ部位に変換した。ｓｔ ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ中で活性のｐＶＡ３８０−Ｉ（２．５ｋｂ ＢａｍＨＩフ ラグメント、参照番号７）からの基本レプリコンをこのｐＲｅｓＥｍ７４９誘導 体から分離し、ゲル精製して、Ｅ．ｃｏｌｉ−ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓシャ トルプラスミド、ｐＰＩＯＺ′１８Ｅｍr（４．９ｋｂ）及びｐＰＩＯＺ′１８ Ｓｐｅｃr（５．１ｋｂ）の構築に用いた（ｐＰＩ：常在プラスミドの組込み） 。次いで、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉコンピテント細胞を各シャトルプラスミドで形 質転換し、Ｅｍr及びＳｐｅｃr株を分離した。次いで、ｐＰＩＯＺ′１８Ｅｍr を有するＥｍr株をＢｇｌII線状化プラスミドｄＫｍＯＺ′１８Ｓｐｅｃrで形質 転換した。これらは、共通の２つの領域（ｐＵＣｏｒｉ及びｌａｃＺ′の下流） を有しており、二重交差は、２つの相同領 域にわたって生じ得る。その結果、Ｓｐｅｃを含むＴＳＢ上でＳ．ｇｏｒｄｏｎ ｉｉ形質転換細胞を選択した後、Ｅｍr遺伝子はＳｐｅｃr遺伝子に置き換えられ た。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を用いて既に構築されたｐＰＩＯＺ′１８Ｓｐｅｃrシャ トルプラスミドと見分けがつかないＳｐｅｃr形質転換細胞からプラスミドＤＮ Ａを分離した。ＳｐｅｃrＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉを線状ｄＫｍＯＺ′１８ＥｍrＤ ＮＡ（図５の右手に示されている）で形質転換した場合にも同様な結果が得られ た。 これらを観察すると、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ細胞の染色体上だけでなく常在プ ラスミド内でも形質転換後の組込みが、生じ得ることが示された。従って、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞中で不安定な特定のプラスミド構造を、構成成分であるＤＮＡフラ グメントを前もって連結しなくてもＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ系で直接構築し得る。 この新規な方法を実施するために、ｐＰＩＯＺ′１８Ｓｐｅｃr（図５及び図６ Ａに示されている）を有するＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ Ｓｐｅｃr形質転換細胞を、 ハイブリッドＧＢＤ遺伝子を含むＥｃｏ０１０９線状化３８ＨＧＢＤＥｍr（図 １Ｃ及び図６Ｂ）で形質転換した。常在プラスミドｐＰＩＯＺ′１８Ｓｐｅ ｃr及びＥｃｏＯ１０９線状化３８ＨＧＢＤＥｍrは、２つの相同ドメイン（ｐＵ Ｃｏｒｉ及びｌａｃＺ′の下流）を共有し、ハイブリッドＧＢＤ遺伝子は組換え 後に組み込んだ。一次Ｅｍr形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡの分析により 、単一の形質転換細胞内の２つのタイプのプラスミド：初期プラスミド及び組込 みプラスミド（レーン２及び３）の存在が示された。これらのプラスミドを用い て形質転換した二次Ｅｍr分離体により、単一のプラスミド、ｐＰＩ３８ＨＧＢ ＤＥｍr（７．５ｋｂ、レーン４及び５）の存在が示された。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ １０９を後者の形質転換細胞からの組込みプラスミドで形質転換しても、Ｅｍr コロニーは得られず、これは、このプラスミドがＥ．ｃｏｌｉ細胞には保持され 得ないことを示している。 （ｄ）ＧＢＤ融合タンパク質の調製。Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ形質転換細胞（ＧＢ Ｄ融合遺伝子のプラスミド又は染色体コピーを含む）を増殖させた後、培養上清 液をアセトン沈殿して５０倍に濃縮し、ＧＢＤの存在についてアッセイした。既 に記載（Ｇｅｎｅ ６９：１０１−１０９）の抗ＧＴＦ−Ｓ抗体を用いたウエス ターンブロット分析により、予想された大きさ（６０ｋｄ）のタンパク質バンド 並びに それより小さい分解産物の分泌が確認された。 （ｅ）Ｅ．ｃｏｌｉ中のＧＢＤハイブリッド遺伝子の発現。ＧＢＤを、他のタン パク質由来のペプチドを含む融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させる ことができる。 ｇｔｆＤ遺伝子からのＸｂａＩフラグメントをプラスミドｐＧＤ１０３Ｘへの フレームに挿入した。次いで、これを、ＧＢＤとβ−ガラクトシダーゼの最初の １３アミノ酸との融合体として発現させた。該融合タンパク質は、ビオチニル化 デキストランと融合タンパク質との結合又は融合タンパク質とデキストラン−セ ファロースビーズとの結合、その後の抗ＧＴＦ−Ｓ血清を用いたウエスターンブ ロット上での溶離・検出により測定して、グルカンと容易に結合する。この方法 は、β−ガラクトシダーゼペプチド由来の融合タンパク質にシステイン残基をも 組込む。これによって、ＧＢＤに対するビオチン又は他の検出分子の共有結合が 可能になる。 さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させるために、ＧＢＤをｐＴＯＰＥ系（Ｎｏｖ ａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＴａｇペプチドに融合させ た。得られた 融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で自然にビオチニル化され、アビジンカラム に吸収させた後容易に精製し得る。融合タンパク質をビオチンで融合した後、Ｇ ＢＤを、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ切断し、混合物を第２アビジンカラムに通過させた 後で融合タンパク質から放出させ得る。 細胞抽出物をデキストラン−セファロースカラムにかけ、１０ｍＭ 酢酸緩衝 液（ｐＨ６．０）中の勾配塩酸グアニジンで溶離して、ＧＢＤ−β−ガラクトシ ダーゼペプチド融合タンパク質を形質転換Ｅ．ｃｏｌｉから精製した。この後で 、塩酸グアニジンを含まない緩衝液に透析した。実施例２−デキストランへの６ＢＤ融合タンパク質の結合 ａ） ビオチニル化デキストランへの結合。ビオチニル化デキストラン（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）を用いてデキストラン結合活性測定のための酵素結合イムノアッ セイ（ＥＬＩＳＡ）を考案した。即ち： マイクロタイタープレートのウェルにタンパク質試料（Ｓ．Ｇｏｒｄｏｎｉｉ形 質転換体由来の培養上清５０μｌ）を添加し、これを４℃で１８時間インキュベ ートした。上清液を廃棄し、吸収されたタンパク質を水で３回洗浄した。次に、 各ウェルを２００μｌのブロッキング緩衝液（０．５％ ＢＳＡ含有酢酸塩緩衝 液；ｐＨ６）で満たし、３７℃で１時間インキュベートし、上記と同様に洗浄し た。その後のウェルは、様々な濃度のビオチニル化デキストラン（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）で満たして室温で１０分間インキュベートし得る。次に、各ウェルを緩 衝液で上記のように洗浄した。その後、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖ ｉｄｉｎ）ペルオキシダーゼを添加し、ＲＴで５分間インキュベートした。各ウ ェルの中味を取り出し、吸収された物質を上記のように洗浄した。次に、ペルオ キシダーゼ基質を添加することによって発色反応を生起させ、１０ 〜３０分間インキュベートし、１００μｌの３Ｎ硫酸の添加によって反応を停止 させた。その後、各溶液の吸光度をＥＬＩＳＡプレート読み取り装置において４ １０ｎｍで測定した。 このアッセイを用いて、ＧＢＤ融合染色体組み込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ） を保持するＳ．Ｇｏｒｄｏｎｉｉ株、及びハイブリッドタンパク質を発現する組 み込み遺伝子を有しない対照株に由来する培養上清液を互いに比較した。表１に 示した結果からは、ＧＢＤ融合タンパク質遺伝子を保持する株が用量に応じてビ オチニル化デキストランと結合するタンパク質を分泌したことが明らかに知見さ れる。これに対して、負性対照株はそのような活性は示さない。 実施例３−細菌へのＧＢＤ−ビオチン複合体の結合 ａ） グルカン結合ドメイン−ビオチン複合体の調製。他の分子に歯垢をターゲ ットとさせるのにＧＢＤを用い得ることを証明するために、ＧＢＤとビオチンと の複合体を製造して、グルカン被覆細菌への結合及び歯垢ターゲティングに関し て試験した。ＧＢＤ−ビオチンを製造するためには、アミノ酸のシステインを遺 伝子操作によってタンパク質（ＧＢＤは通常システインを欠く）の構造のＣまた はＮ末端に導入し得る。この操作はＧＢＤ遺伝子の配列に適当なコドンを付加す ることによって、またはＧＢＤと融合させるペプチド配列中にシステインコドン を付加することによって行ない得る。ここに述べる実験では、システインをＧＢ Ｄに、大腸菌において産生されるＧＢＤ融合体のβ−ガラクトシダーゼペプチド の配列の一部として付加した。 ＧＢＤ融合タンパク質にビオチンを、先に述べた方法（Ａｎａｌ．Ｂｊｏｃｈ ｅｍ．１４９，ｐ．５２９，１９８５）によって結合させた。この結合のために 、ＧＢＤ（デキストラン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上で大腸菌クローン抽出分 から精製）の溶液を０．３ｍｇのビオチン−マレイミド（Ｓｉｇｍａ）と混合し た。溶液を３７℃で ５時間インキュベートし、リン酸緩衝食塩液に対して１８時間透析して未反応の ビオチンを除去した。得られたビオチニル化ＧＢＤは、ＧＢＤをビーズまたは細 胞と混合し、混合物をＵｌｔｒａ−ｆｒｅｅ ＭＣフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏ ｒｅ）で濾過することにより、細菌細胞またはデキストランへの複合体の結合の 定量に用い得た。試料をフィルター上で直接洗浄し、かつストレプトアビジンペ ルオキシダーゼと共にインキュベートして、ＥＬＩＳＡ読み取り装置において有 色複合体の吸光度を測定して細胞または樹脂に結合したＧＢＤの量を定量するこ とができた。 ｂ） 結合の測定 細菌表面のグルカンへのＧＢＤ−ビオチンの結合を測定するために、食餌性ス クロース由来のグルカンの産生体であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａ ｎｓ ＧＳ−５を、炭水化物源としてのグルコースまたはスクロースを添加した Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈ中で増殖させた。スクロース中でのＳ．ｍ ｕｔａｎｓの増殖は細胞関連グルカンの産生を惹起する（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．４４，ｐｐ．３３１−３８４）。これに対して、グルコース中での上記 細菌の増殖はグルカン産生を惹 起しない。 ３７℃での懸濁増殖後、細菌を緩衝液で洗浄し、ＧＢＤ−ビオチン不在下また は存在下に再懸濁させた。細菌を再び緩衝液で洗浄し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ ｍＭ ＭｇＣｌ2及び０．０５％トリトンα−１００を含有する０．１Ｍトリス ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解させたストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Ｇｉ ｂｃｏ／ＢＲＬ）と共にインキュベートした。洗浄後、細胞を発色試薬溶液（１ ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミンＨＣｌ及び０．０１２％過酸化水素含有ク エン酸塩緩衝液；ｐＨ４．５）と共にインキュベートした。このようにして、Ｇ ＢＤ−ビオチンによる細胞結合を発色後の４１０ｎｍでの吸光度として測定した 。結果を図８に示す。スクロース含有培地中のＳ．ｍｕｔａｎｓのインキュベー ションが、天然のＧＢＤ結合部位である細菌性グルカンの産生によってＧＢＤ− ビオチンの結合を促進することは明らかである。グルコース存在下に増殖させた 細胞は、ＧＢＤ−ビオチンのための結合部位を有意量でもたらさなかった（即ち 、該細胞はグルカンを産生しなかった）。実施例４−ヒト歯垢へのＧＢＤ−ビオチンの結合 この実施例ではＧＢＤが歯垢に結合することを証明するが、この結合は抗ＧＴ Ｆ抗体によって検出し得、前記抗体自体は蛍光マーカーに結合した抗種（ａｎｔ ｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）抗体によって検出し得る。即ち、結合は、蛍光顕微鏡を用 いてスライド上に可視化し得る。方法 試料調製 ヒト歯垢を、歯垢試料採取の前日に１０ｍｌの５％スクロースうがい液を３回 用いた有志から取得した。前記有志はまた、歯垢試料採取前の２４時間は歯磨き をしなかった。歯垢を採取後直ちに冷凍し、使用時まで−２０℃で保存した。歯 垢を、２％のホルマリンを含有するリンゲル液中で３０秒間強度に音波処理した （１秒サイクルにおいて０．５秒オン、０．５秒オフ）。１ｍｇ／ｍｌに稀釈し た歯垢懸濁液の１０μｌアリコートをピペットで、図９に示した８試料「ウェル 」を有するスライドガラスに取った。ウェルを風乾し、その後短時間炙って固定 させた。試料処理 スライドを、１％ ＢＳＡ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸 緩衝食塩液（ｐＨ７．２；ブロッ キング緩衝液）に２０分間浸漬することによってブロックし、それによって非特 異的結合を減少させた。溶液を、二つの連続リンゲル液浴への浸漬によって濯ぎ 落とした。その後、他の試薬を含有する溶液を上記緩衝液に、同じ操作を用いて 添加した。２０μｇ／ｍｌのＧＢＤを添加し、その後図９に示したように５０〜 ２０００倍の稀釈度でウサキポリクローナル抗ＧＴＦ−Ｓ抗体を添加した。無Ｇ ＢＤウェル及びブランクウェルを対照として用いた。結合したＧＢＤの検出 調製したスライドの蛍光を、水銀灯及び表面照射（ｅｐｉｉｌｌｕｍｉｎａｔ ｉｏｎ）を用いて調べた。スライドの代表的エリアの写真を、ＨＳ−４００ Ｅ ｋｔａｃｈｒｏｍｅフィルムを用いて撮影した。結果 処理済み歯垢試料の蛍光の写真は、それらの試料に強度の蛍光が存在すること を示した。この蛍光は用いるＧＢＤ濃度に著しく依存したが、ＧＢＤがブロッキ ングタンパク質の存在下にも歯垢に結合することを示した。結論 これらの実験は、ＧＢＤが濃度に依存しつつも強度に、 かつ著しい量で歯垢に結合することを証明している。しかし、蛍光は無ＧＢＤ対 照にも幾らか存在した。この理由としては、抗ＧＴＦ−Ｓ抗体が歯垢中に天然に 存在するＧＴＦに結合したためというのが最も考えられるところである。これら の結果は、親ＧＴＦ分子の残部を欠くＧＢＤがグルカンに結合する能力及びヒト 歯垢をターゲットとする能力を保持していることの何よりの証拠である。実施例５ 歯上の歯垢の類似体である生物膜（ｂｉｏｆｉｌｍｓ）への結合を証明する実 験を行なった。操作は次のとおりであった。 （ａ） Ｓ．ｍｕｔａｎｓの一晩培養物を滅菌マイクロタイタープレートの細胞 に添加し、これを１時間インキュベートし、その後洗い出した（ｐｏｕｒｅｄ ｏｆｆ）。 （ｂ） リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で濯いだ後、プレートをスタロースの１％ ＰＢＳ溶液と共に２時間半インキュベートした。どちらの場合も細菌は膜を形 成すると考えられたが、スクロースを用いた場合の膜はグルカンを含有しない。 （ｃ） プレートを、実施例１Ｃに従い製造したＧ５Ｄを 含有する溶液と共に３０分間インキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。 （ｄ） プレートを、ＧＴＦに対するウサギポリクローナル抗体の懸濁液と共に ３０分間インキュベートし、その後ＰＢＳで濯いだ。 （ｅ） プレートを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素に結合し たヤギ抗ウサキポリクローナル抗体から成る複合体の懸濁液と共に３０分間イン キュベートし、その後蒸留脱イオン水で１０回洗浄した。 細胞上の膜がグルカンを含有していれば、このグルカンはプレート上に幾らか のＧＢＤを固定し、かつそれによってステップ（ｄ）及び（ｅ）の抗体を固定す るはずである。得られる複合体は 基質：ＧＢＤ：ウサギ抗ＧＴＦ：抗ウサギＨＲＰ となろう。 細胞に、ＨＲＰ酵素によって青色を発するように変換され得る基質を供給した 。６３０ｎｍでの吸光度が変化する速度を測定した。 ＧＢＤまたは抗ＧＴＦ抗体を除外した場合は、非常に僅かな発色しか認められ なかった。系全体が完全であった場 合の発色は６倍であった。ステップ（ｂ）においてスクロースの替わりにグルコ ースを用いた場合は、非常に僅かな発色しか認められなかった。 このことは、ＧＢＤがスクロース存在下にＳ．ｍｕｔａｎｓによって形成され た膜（歯垢モデル）に首尾よく結合したことを示している。スクロースの替わり にグルコースを用いた場合は、比較実施例が証明しているようにグルカンが生成 せず、ＧＢＤにとって結合し得る何物も生じなかった。 ステップ（ｃ）で用いるＧＢＤ溶液に１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のデキストラン を含有させた場合は該デキストランが、ＧＢＤによる結合のための代替部位とな った。その結果発色が抑えられ、このことはＧＢＤがデキストランに結合して、 後にデキストランと共に洗浄により除去されてしまったことを示している。実施例６ 真菌Ｄａｃｔｙｌｉｕｍ ｄｅｎｄｒｏｉｄｅｓ由来のガラクトースオキシダ ーゼ遺伝子をプラスミドｐＧＡＯに挿入した（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ等，Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，ｐｐ．８１４６−８１５２，１ ９９２）。図１０に拡大して示した、リーダー配列の一部を有するＢａｍＨＩ− ＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＵＣ１１８中へクローン化してプラスミドｐＵＣ ＧＡＯＥＢ（図１１）を製造した。次に、このプラスミドからＤｄｅＩ断片を取 り出し、クレノウ断片で処理して平滑末端を形成し、これを、不活性化されたｌ ａｃＺ遺伝子を有するプラスミドｐＵＣ１１８Ｎａｒ（Ｗ）のＳｍａＩ部位に挿 入した。得られたプラスミドｐＯ５は、ｌａｃＺプロモーターの制御下にガラク トースオキシダーゼ遺伝子の断片を有する。 次に、ガラクトースオキシダーゼ遺伝子からＮａｒＩ−ＸｂａＩ断片を取り出 して、図１２に示したプラスミドｐ０５の対応する部位間に挿入し、このように して、ｌａｃＺプロモーターの制御下に完全なガラクトースオキシダーゼ遺伝子 を有するプラスミドｐＲ３を構築した。このプラスミドを用いて、大腸菌におい てガラクトースオキシダーゼを発現させた。 ガラクトースオキシダーゼ遺伝子の３′末端から得たＤｄｅＩ断片をクレノウ 断片で処理して平滑末端を形成し、これを図１３に示したプラスミドｐＵＣ１１ ９のＨｉｎｃ II部位に挿入してプラスミドｐＰ４を得た。図１Ｂのものに類似のプラスミドか ら、実施例１の（ａ）において構築したＧＢＤ遺伝子をＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断 片として切り出した。この断片をプラスミドｐＰ４に挿入し、このようにして、 ガラクトースオキシダーゼ遺伝子の３′末端に由来する配列と融合したＧＢＤ遺 伝子を有するプラスミドｐＳ２を創出した。次に、ガラクトースオキシダーゼ遺 伝子の３′末端と融合したＧＢＤ遺伝子をＢａｍＨＩ−ＥａｇＩ断片として切り 出し、これを、図１４に示したように、ＢｃｌＩ及びＥａｇＩで切断したプラス ミドｐＲ３に挿入した。その結果プラスミドｐＵ４を得、これを用いて大腸菌に おいて、ガラクトースオキシダーゼと融合したグルカン結合ドメインから成る融 合タンパク質を発現させた。 プラスミドｐＳ２、ｐＲ３及びｐＵ４をそれぞれ導入した大腸菌株を培養し、 培養上清をガラクトースオキシダーゼ活性に関してアッセイした。様々な濃度の ガラクトースオキシダーゼを含有する溶液及び緩衝液のみを含有する溶液を対照 として用意した。結果を図１５に示す。この図からは、プラスミドｐＵ４を導入 した大腸菌において発現された融合タンパク質が、１０μｇ／ｍｌのガラクトー スオ キシダーゼを含有する対照よりも高いガラクトースオキシダーゼ活性を有するこ とが知見され得る。 上記大腸菌株を、実施例２の操作によってグルカン結合活性についてもアッセ イした。 これらのアッセイの結果は、ガラクトースオキシダーゼとグルカン結合ドメイ ンとの融合体が酵素機能を示し得、かつグルカンに結合し得ることを示している 。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                 Glucan binding protein and use thereof TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION   The present invention relates to a polypeptide having glucan binding properties, and a hive comprising the polypeptide. Lid material, and novel plaque targeting active system and oral care containing the polypeptide Composition.Background of the Invention   Plaque development and accumulation is caused by the attachment of bacteria and bacterial products to teeth. Adhesion of numerous plaques is mediated by the production of sticky extracellular polysaccharides from dietary sucrose Is done. The two major types of such polysaccharides synthesized from sucrose in plaque are glucans. And Fructan [Hamada S and Slade HD 1980 B ology, immunology and cariogenicity ofStreptococcus mutans Microbiol. Re v. 44: 331-384]. These sticky polysaccharides have stereochemically specific Attachment of plaque bacteria by providing binding sites and non-stereospecific capture of bacteria It is known to increase wear. Bacterial yeast that synthesizes glucan and fructan Glucosyltransferase (GTF) and fructosyltrans It is called spherase (FTF) and is secreted by many plaque bacteria. these The enzyme binds to the bacterial surface and is adsorbed on the surface of the teeth in the saliva that moisturizes the oral cavity. [Rolla G, Ciardi JE, Egen K, Bowen W   H and Afseth J (1983) Free glycosyl-a second fructosyltransferase in human sal iva and adsorption of theseenzymes t o teethin vivo. In: RJ Doyle and JE Ci arid (ed.) Glucosyltransferase, glucans, sucrose and dental carriers. Spec. Suppl . Chem. senses. IRL Press Washington DC   p21-30].   Glucans in plaque are mainly composed of α1,6-linked and α1,3-linked glucose residues. Is done.   Bacterial adhesion mediated by polysaccharides is critical for pathogenic plaque accumulation Is considered important [Hamada and Slade, 1980]. Several Oral bacteria produce proteins that recognize and bind to glucan. these Proteins include glucosyltransferase (GTF) involved in plaque formation ) And non-enzymatic glucan binding protein (GBP). GTF and GBP Recognizes glucans containing α1,6-linked glucose residues and becomes a bacterial or extracellular plaque matrix Mediates binding [Schilling KM and Bowen W H1 992 Glucans synthesized in situ in e xperimental saliary pellitric funti on as specific binding sites forStr eptococcus mutans ,Infect. Immun.60:28 4-295].   Molecular analysis of GBP and several GTFs from oral streptococci revealed that these proteins The protein has a characteristic region (GBD) involved in stereospecific binding to glucan [Wong C, Hefta SA, Paxton RJ, Sh Ivery J E and Moser G (1990) Size an d subdomain Architecture of the gluc 3α-D g an binding domain of sucrose; lucosyltransferase fromStreptococcu s sobrinus , Infect. Imum. 58: 2165-2170 Ferretti JJ, Gilpin ML and Russell RB (1987) Nucleotide sequence of a gluc osyltransferase gene fromStreptococ cus sobrinus   MEF28,Journal Bact.169, 4271-4278; Kato C and Kuramitsu H K (1990) Carboxyl-terminal deletion analysis of theStreptococcus mutans  glucosyl transferase-I enzyme, FEMS Microbiol. Lett 72, 299-302]. As a result of research on the glucan binding region, These regions bind to glucan with similar affinity as found in intact GTF. It turned out.   Other polysaccharide binding regions are known and aid downstream processing of recombinant fermentation products. Combined with other proteins and peptides to lengthen. For example, researchers Was used to purify proteins on starch and cellulose resins, with the starch binding region [C hen L, Ford C and Nikolov Z (1991) Adsorb Tion to Starch of β-galactosidase fu Sion protein containing the search-b inding region of Aspergillus glucoam ylaseGene  991, 121-126] and the cellulose binding region [On g E, Greenwood JM, Gilkes NR, Kilbourn   DG, Miller RC and Warren RA J (1989) The cellulose-binding domains of cell luuleses; tools for biotechnologyTIBT ech   7: 239-243].   One of the key technical issues related to the development of active systems for effective oral care is The drug to the desired site in the mouth (eg plaque) To get substantive delivery. Most of the substantive antiplaque agents currently used are Bisbiguanide and quaternary ammonium binding to the oral surface via electrostatic interaction It is a positively charged microbicide such as a compound.   However, the binding of cationic microbicides actually (as it is to hydrophobic substances) Nonspecific), these microbicides bind to all oral tissues. Furthermore, Toothpaste such as chlorhexine and cetylviridinium chloride with dentifrice and oral rinse The use of non-functional molecules can lead to tooth contamination and undesirable product taste. Was.Summary of the Invention   The present invention targets glucans contained in plaque matrix or bound to bacterial surfaces And a glucan-binding polypeptide that binds to it. Glucan binding poly Peptides can be combined with antiplaque agents or other substances, and these substances can be Used to deliver the substance and achieve substantive delivery and, in many cases, The required amount can be reduced. The polypeptide may contain cationic substances and other non-specific The negative aspects associated with heterogeneous oral care actives can be avoided. scientific Means or molecular organisms Can form a complex with various materials using chemical tools (ie fusion proteins). Wear.   Broadly, in a first aspect, the invention provides a specific binding affinity for glucan. A polypeptide having glycosyltrans. Not incorporated into the ferase enzyme, preferably a glycosyltransferase enzyme Chemically covalently bonded to another material that does not show activity.   The present invention relates to the use of a glucan-binding polypeptide in combination with another moiety. Is noteworthy in several respects. First, the conjugate of the present invention comprises an α1,6-linked glue. Derived from cognitive systems including cans. Second, the complex of the present invention is effective in the oral environment. Used to arise. Third, other previously described polysaccharide binding region fusions The body has been used to bind ex vivo to simple chromatography resins, In contrast, glucan binding complexes target biological membranes and are Produces secondary physiological effects in poor environments.   According to the present invention, glucans are used to block binding sites on existing glucans. It is also possible to use binding polypeptides. GTF for polymer synthesis Glucan binding by enzymes is required. Since glucan binding polypeptide competes with GTF for a binding site, Acts as a stereospecific inhibitor of GTF-catalyzed glucan synthesis in plaque. This results in reduced plaque accumulation and tenacity. Similarly, glucan-binding polypeptides Peptides block the site of the plaque matrix to which oral bacteria are bound, thus plaque It is also possible to prevent accumulation. However, in this way the targeting of certain other substances Use glucan-binding polypeptides as competitive inhibitors rather than as steps In some cases, glucan-binding polypeptides may require certain other peptides to be required for the synthesis step. It is also possible to fuse with a tide residue.   In a second aspect, the invention relates to a polypeptide having specific binding affinity for glucan. Composition for topical buccal administration comprising a tide in a carrier vehicle acceptable for buccal use I will provide a.Detailed description of the invention   One object of the present invention is to provide oral care actives, especially antiplaque agents and pollution control. GBD or other glucan-binding polypeptides to substantially deliver the agent to human plaque The use of peptides as targeting groups. Glucan-bound polypep Tides are esters, sulfhydryls, peptides, isopeptides, amides Form a complex through chemical bonding with multiple substances by and other types of chemical bonding Can be Substances that can be bound by each method include organic compounds, inorganic complexes, Mention may be made of proteins, enzymes, peptides, antibodies and various ligands. composite The body may be a fusion or hybrid protein produced by recombinant DNA technology. No.   Non-limiting examples of enzymes that bind to glucan binding polypeptides include oxidase Protease, peroxidase, protease, glycosidase, lipase, estella These include, but are not limited to, enzyme, amidase, deaminase, urease and polysaccharide hydrolase. Can be. In particular, oxidase is cytotoxic, acting against microbial species in plaque Can function as a substance. Glucose and galactose oxidase This produces cytotoxic hydrogen peroxide. Peroxidase makes this hydrogen peroxide more toxic Can be converted to hypohalite. Hydrogen peroxide and hypohalite yes The shift also has a short in-vivo life and is generated at the intended action point as realized by the present invention. By doing so, the effect is further increased.   Such enzymes also function as anti-pollution agents because their products are bleached species. Can be Antibodies, antibody fragments, Histatin, lactoferrin, defensins, mageini , Cecropins, and other cationic antibacterials Non-enzymatic antimicrobial proteins and peptides such as It can bind to a binding polypeptide. Non-limiting examples include triclosan ( triclosan), chlorhexidine, quaternary ammonium compound, chlor Oxylenol, chlorooxyethanol , Thymol and fluoride are also chemically compatible with glucan-binding polypeptides. Can be combined. Antimicrobial cations such as Zn, Sn, Cu By forming a complex with a suitable chelating agent such as rubonic acid or amino acid, It can bind to a lucan binding polypeptide. Biotin-avidin complex More targeting systems can also be manufactured. For example, converting biotin to GBD Binds biologically to target plaque as a specific binding site for the avidin complex Biotin can act. In addition, plaque specific for biotin complex Avidin-GBD conjugates can also be used as binding sites.   In the present invention, plaque via a bond sensitive to hydrolase, pH or oxidation / reduction Inhibitors or other oral care actives can be linked to the glucan binding polypeptide. And the glucan binding port It is also possible to use the polypeptide as a target release substance. Inherent in plaque or Protease-sensitive linker peptide hydrolyzed by foreign protease Thus, a protein can be fused with a glucan binding polypeptide. Non-tan Parkinic microbicides are esterases, amidases, lipases or other hydrolases It can be bound by a sensitive bond. Release is possible using pH sensitive binding Chemical reduction due to the reduction of redox potential in plaque or accumulation of reducing agents. Attach proteins, peptides or other substances via the originally sensitive SS bond It is also possible by doing.   Oral care products containing glucan binding polypeptides include toothpastes, gels, Mouthwash, powder, soap, solution, troche, chewing gum and denta It can take various forms such as lufloss.   The oral composition may further comprise starch, sucrose, polyol, surfactant, water or water / alcohol. Contain conventional ingredients such as pharmaceutically acceptable carriers such as coal-based You. When formulated in a dentifrice, such preparations may contain the usual dentifrice components . That is, silica, alumina, and calcium carbonate are usually added at a ratio of 5 to 60% by weight. System, dicalcium phosphate, hydroxyapatite, calcium pyrophosphate, Can contain particulate abrasives such as metaphosphate and insoluble hexametaphosphate .   In addition, dentifrices include glycerol, sorbitol, propylene glycol, It may contain a humectant such as toll.   Surfactants such as anionic, nonionic, amphoteric and zwitterionic synthetic detergents can also be incorporated. You. Examples of such surfactants are sodium lauryl sulfate, sodium Dodecylbenzenesulfonate, sodium mono and dioctyl phosphate, Sodium lauroyl sarcosinate, cocamidopropyl betaine.   Sodium carboxymethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, etc. Binders and thickeners, synthetic polymers such as polyacrylates, and Carbopo Carboxyvinyl polymers such as 1® may also be included.   Flavors such as peppermint oil and spearmint oil, preservatives, opacifiers, Coloring agents, pH adjusters, sweeteners and the like may also be included.   Triclosan, chlorhexidine, copper salt, zinc salt and stannous salt (eg, copper sulfate , Zinc citrate and stannous pyrophosphate), sa Additional antimicrobial agents, such as ginginalin extract, metronidazole, may also be included. Additional resistance Examples of fungicides further include quaternary ammonium compounds (eg, cetylpyridinyl chloride). Um), bisguanides (eg chlorhexidine digluconate, hexetidine, Octenidine, alexidine), halogenated bisphenol compounds (for example, 2, 2'-methylenebis- (4-chloro-6-bromophenol)).   Polymer compounds that can enhance the delivery of active ingredients such as antimicrobial agents can also be formulated You. An example of such a polymer is the copolymer of polyvinyl methyl ether and maleic anhydride. Polymer and DE-A-3,942,643 (Colgate). And other similar delivery enhancing polymers.   Furthermore, ibuprofen, flurbiprofen, aspirin, indomethacin, etc. May also be included.   Sodium fluoride, stannous fluoride, amine fluoride, sodium monofluorophosphate Lium, calcium lactate and / or calcium glycerophosphate, strontium Salt and strontium polyacrylate, casein and casein digest, and An anti-caries agent such as a phosphoprotein may also be included.   Other optional ingredients include vitamins (eg, vitamin C), plant extracts, potash Salts such as potassium citrate, potassium chloride and potassium nitrate. You.   Other optional components include enzymes (dextranase and / or mutanase, amylo, Glucosidase, glucose-oxidase and lactoperoxidase, neura Minidase) and a hydrogen peroxide generating compound (for example, potassium peroxydiphospho ).   Further, the oral composition may be an alkali metal pyrophosphate or a hypophosphite-containing polymer. , Organic phosphonates, linkuates and the like.   Other optional components that may be added include, for example, bacteriocin, Phage, tissue respiratory factor, antibody, bleach (eg perokin compound), foaming system ( For example, sodium bicarbonate / citric acid type), discoloration type and the like.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 shows plasmid pUC18 38 Hind and constructed from this plasmid. 1 schematically shows the structure of the derivative. In this drawing and other drawings, the following abbreviations are used to restrict (If applicable). B = BamHI, Bgl = BglII, E = EcoRI, H = HindIII, K = KpnI, P = PstI, Pvu = PvuII, S = SoaI and X = XbaI. Unrestricted restriction sites represent the two DNA fragments generated after the BamHI / BglII ligation. The BstYI boundary site of the fragment is shown.   FIG. 2 shows the [heterodimer] system used to make the transformation intermediates. Shows the general strategy.   FIG. To transfer to the Gordonii chromosome The structure of the plasmid used is shown. The restriction sites are indicated by the abbreviations described in FIG. In addition, Bs = BstBI, C = ClaI and Xh = XhoI were also used.   FIG. Incorporation of Hybrid GBD Gene into Gordonii Chromosome Is a series of restriction maps showing The map at the top is S. g in gordonii The chromosome structure around the tfG gene is shown. Other maps are scaled up to wild type (A ), Primary (C), secondary (E) and GBD+(G) shows the chromosome structure of the integrant. D NA fragments (B) and (D) are the heterodimer plasmids of FIGS. 3E and 3H. Prepared by digesting HindIII with HindIII and NorI, respectively. Restriction Lugment (F) Plasmid 38HGBDEm of FIG. 1CrPvuII digestion product.   FIG. Preliminary Fruit Demonstrating Integration of a Resident Plasmid into Gordoni FIG. Restriction sites are indicated by the same abbreviations as in FIGS. Further, N = NcoI And RV = EcoRV.   6A, B and C show the structure of the plasmid; gordonii cells Figure 4 shows integration of the hybrid GBD gene into a resident plasmid.   FIG. 6D shows the recombinant DNA sequence in more detail.   FIG. 6E shows the results of agarose gel electrophoresis. In each lane, M represents λ DNA.   Mixture of EcoRI-HindIII double digest and λDNA HindIII digest 1 is the early resident plasmid pPIOZ'18Specr, 2 and 3 and 4 and 5 Primary and secondary transformants, 2 and 4 and 3 and 5, respectively, were positive and negative pairs, respectively. 3 shows an illumination assembly.   FIG. 7 shows (on a continuous line) gtfD gene, gtfD gene (with probe DNA and And the 5 'and 3' flanking regions of the gtfD gene. m utans GS-5 dyeing 4 shows a restriction map of a color body structure. The restriction sites are as described in FIGS. 1, 3 and 5 above. (D) shows a non-unique DraI site and Nh = NheI.   FIG. 8 is a bar graph of the results of Example 3.   FIG. 9 shows a slide of the well array used in Example 4.   FIG. 10 shows galactose oxida of Dactylium dendroides. 1 shows a restriction map of the ribonuclease gene and integration of the gene fragment into the plasmid.   Figures 11 and 12 show subsequent steps to construct a plasmid containing the complete gene. Is schematically shown.   13 and 14 show the combination of the GBD gene and the galactose oxidase gene. 1 schematically shows the construction of an integrated plasmid.   FIG. 15 shows the results of the galactose oxidase activity assay.   FIG. 16 shows the results of the glucan binding assay.Example 1-Preparation of a fusion protein containing GBD   As shown in the restriction map of FIG. Mutans GS-5 staining The in vivo gene gtfD contains a 1.67 kb Xbal-Bam near its 3 'end. Includes gene for glucose binding domain (GBD) in HI fragment [Hondo, O .; Kato, C .; And Kuramitsu, H .; K . (1990) Nucleotide sequence of the Street ptococcus mutans gtfD Gene encoding th e Glucosyltransferase-S Enzyme, J Gen M microbiol 136: 2099-2105]. (A) Preparation of hybrid GBD gene. A system for secreting the GTF-I enzyme Characterizing the first 38 amino acid residues from the initiator Met S. The secretory domain from the mutans GS-5 gtfB gene has already been identified. (Infect Immun 61: 3745).   This domain (8) oriented in the opposite direction to the lacZ 'gene of pUC18 00bp HindIII fragment A plasmid called pUC1838Hind (FIG. 1A) containing Was. Next, XbaI-B of the gtfD gene (5) (FIG. 7) containing the GBD gene was used. XbaI-BamHI cleavage of the 3 'portion of the amHI fragment (1.67 kb) It was cloned into plasmid pUC1838Hind. 38HGBD obtained In the plasmid designated (FIG. 1B), the 3'- Read frame between HindIII site and 5'-XbaI site in GBD gene The system is the same as that of the polyclonal site (MCS) of pUC18. Therefore, G BD molecules are expressed in fusion with the GTF-I protein leader sequence. Negative pair As a control, digest the unique XbaI site, fill and recircularize, and read the GBD A plasmid was formed whose frame was out of frame with the signal sequence. Ue Stern blot analysis showed that E. coli harboring each plasmid. E. coli transformed cells It was confirmed whether GBD protein was present in the crude extract (data not shown). ).   The plasmid of FIG. 1B was further modified to include Em at its unique BglII site.rHeredity (38HGBDEmr, 6.3 kb, FIG. 1C). Then, S. described below. gordonii. (B) S.I. Incorporation of the hybrid GBD gene into the gordonii chromosome. p E. Res. coli-streptococcus Clone the fragment containing the hybrid GBD gene into a plasmid Tried to. This was unsuccessful and alternative cloning methods needed to be devised. Was. The method adopted is E.I. coli-streptococcus shuttle The hybrid GBD gene was directly transformed into S. cerevisiae without using rasmid. lead to Gordonii Was about to enter.   S. a target site for integrating the hybrid gene into the gordonii chromosome Then, S. internal 1.5 kb HindIII gene of the gordonii gtfG gene I chose a fragment. As shown in FIG. gordonii gt The fG gene spans three HindIII fragments. True of these The middle one was selected as the target fragment. The fragment and one adjacent Of the known plasmid pAM5010 [Sulavik , M .; Tardof, G .; And Clewell, D .; D. (1992) Id entification o fa Gene rgg while regulators expression  of glucosyltransferase and influence the SPP Phenotype of S.P. Gordonii Challi s, J.S. Bacteriol 174, 3577-3586]. . The plasmid pAM-S15 contains the 1.5 kb Hin of the pAM5010 insert. Contains the 3 'end of the dIII fragment.   As a first step, the intended S.D. transforming the Gordonii chromosome Before integration, the appropriate integration anchor site (anchor) for the selected target fragment  sites). To build intermediates for this To this end, a new "heterodimer" system was designed. This allows DNA fragmentation Insert between the 5 'and 3' flanking regions of the target site. You can enter.   This "heterodimer" system is generally described with reference to FIG. "Receptor" The plasmid referred to as is shown in FIG. 2A. The plasmid is shown as site A in FIG. Has a single PvuII site. First, include the anchor site. The target gene (FIG. 2F) is transformed into a receptor after appropriate conversion of a single PvuII site. Cloning into a plasmid, the plasmid shown in FIG. 2B is obtained. Then The PvuII site of another plasmid is ligated to the linker DNA to modify it, Thus, the resulting "rescue" plasmid, shown in FIG. Exclusive for restriction with enzyme B, present in the cloned state inserted into the rasmid Has a site that matches the site. 2B and 2C are both restriction enzymes Digest completely with B. Phosphatase treatment of the two obtained DNA fragments Without connecting. E. coli JM109. The combination of both antibiotics Purified from these transformed cells selected on LB agar plates containing Smid DNA contains two identical replication regions (p15Aori) as well as two different drugs A dimer containing a drug resistance marker (FIG. 2D). Therefore, this plasmid is It is called "heterodimer". Finally, the DNA fragment for integration is shown in FIG. When the heterodimer plasmid of D is digested with restriction enzyme A, it is easily prepared. This This allows a position between the 5 'and 3' flanking regions of the correct orientation of the target gene. The part called pRes is left You. The "Rescue" plasmid (E) was recircularized and E. coli And then separate. The structure of the insert in the rescued plasmid (FIG. 2E) is labeled Has a structure different from that of 5'-ABA-3 ', and 5'-BAB-3'. doing.   The procedure generally described above was used as shown in FIG.   To obtain a suitable integration anchor site, pResA similar to that of FIG. mpdBC (2.1 kb) and pResKmHindS-15 (3.5 kb) Two plasmids were constructed, referred to as (FIGS. 3A and 3D, respectively). Former The plasmid is S. mutf-derived gtfB gene and gtfC, respectively. Containing the 250 bp 5 'and 3' flanking regions of the gene And the latter, 1.5 kb of the gtfG gene from Gordinli (18) Contains an internal HindII fragment. Introduction of PstI linker DNA The unique ScaI site present in this insert in the latter plasmid is additionally Ps Converted to tI site. The plasmid pResAmpdBC shown in FIG. The structure inside MCS is     Not-Bel-Hind-Sph-Pst-5'-end-Bgl-     3'-end-Pst --- Bam / Bgl-Not Met.   At the unique BglII site of the insert, a BglII cut rescue plasmid, pResEmBgl (1.6 kb, FIG. 3B) was ligated. The heterodimer obtained -Plasmid pResAmpdBC: pResEmBgl (3.7 kb, FIG. 3C ) Was selected on LB agar plates supplemented with Amp and Em , E .; coli JM109 transformed cells. MCS of the plasmid The structure inside is     Not-BCl-Hind-Sph-Pst-5'-end-Bgl: pRe     sEmBgl: Bgl-3'-end-Pst --- Bam / Bgl-Not Met.   This heterodimer plasmid is digested with PstI and the 5 'and 3' 2.1 kb fragment containing pResEmBgl Fragment was gel purified. The fragment was digested with a PstI cut plasmid, pRes. KmHindS-15P (3.5 kb, FIG. 3D) and heterodimer plasmid And pResKmH indS-15P: pResEmdBC (5.6 kb, FIG. 3E) was isolated. This Digested with HindIII as shown in FIG. 4B. Fragment is obtained.   Using S. HindIII digested plasmid, S. gordonii was transformed. The common region of the chromosome and DNA fragment where double crossover can occur is shown in FIG. 4A and FIG. The 5 'and 3' fragments of pAM-S15, shown in bold in B. The S. ctfG gene contains an integrated anchor site that replaces the ScaI site. go rdonii primary assembly (Emr, GTF-, FIG. 4C) was isolated after transformation. .   1.2 kb HindIII-BamHI fragment (3 ′ part of gtfD gene) FIG. 7) contains the HindIII-BglII digested plasmid pResAmpdB. C (FIG. 3A) and pResAmp3′GBDdC (3.0 kb) FIG. ) Got. The structure of the insert in this plasmid is     Not-Bcl-Hind-3'GBD-Bam / Bgl-3'end-P     st --- Bam / Bgl-Not Met.   Then, pResSpecHind (1.8 kb, FIG. 3) G) was cloned into the unique HindIII site of pResAmp3'GBDdC , Heterodimer pResAmp3'GBDdC: pResSpecHind ( 4.8 kb, FIG. 3H). The surrounding structure of the insert is     Not-Bcl-Hind: pResSpecHind: Hind-3 '     GBD-Bam / Bgl-3'-end-Pst --- Bam / Gbl-Not Met.   When this plasmid was digested with NotI, the fragment shown in FIG. Is obtained.   Contains the 5 'and 3' flanking regions of the gtfB and gtfC genes (FIG. 4C). S. Gordoni primary integrant after NotI digestion Transformation with rasmid (FIG. 3D), secondary integrant (Emr, Specr, 3 'GB D, FIG. 4E). Of chromosomes and DNA fragments where double crossovers can occur The common region is p15Aori and S.A. 3 ′ end of mutans gtfC gene It is. Finally, the integrant was digested with plasmid 38HGBD after PvuII digestion. Emr(Figure IC) to give the fragment shown in Figure 4D. The common region of chromosomes and DNA fragments where double crossings can occur is S. muta The 5 'end of the ns gtfB gene and the 3' end of the GBD gene. After transformation , Specr, Emr, GBD+Transformed cells were separated (FIG. 4G).   Using the negative control hybrid gene formed in the same manner as above, The corresponding GBD transformation was performed by substituting the XbaI site of the 38HGBD plasmid Transgenic cells were constructed. (C) Integration of a resident plasmid. A preliminary experiment was performed as described above, The GBD gene is derived from E. coli. coli shuttle plasmid pResEm749 Could not be cloned. S. gordonii is a strain. Later, chromosomal integration can be easily performed using appropriate linear DNA fragments. I was able to. This method is described in S.A. on plasmids that replicate in Existing DNA fragment [recombinant strain (recombination p. ) can be replaced after integration. Was measured and examined. This is shown in FIG. EmrAnd SpecrGene (Separately) pUC type KmrBamH of vector plasmid KmOZ'18 I site (Infe ct Immun 61: 3745). Km of this plasmidrThe gene is XhoI Since it is close to the site, this drug resistance gene is removed by digestion with XhoI, and After the filling-in reaction, a BglII linker was introduced. Was. In this shuttle plasmid pResEm749, ClaI and ScaI One of the sites was converted to a BamHI site after some DNA manipulations. st pVA380-I (2.5 kb BamHI file) active in reptococci Fragment, reference no. 7) derived this pResEm749 Separated from the body, gel purified and purified from E. coli. coli-streptococcus Toll plasmid, pPIOZ'18Emr(4.9 kb) and pPIOZ'18 Specr(5.1 kb) used for construction (pPI: integration of resident plasmid) . Then, S.I. gordonii competent cells are formed with each shuttle plasmid Transform, EmrAnd SpecrThe strain was isolated. Then, pPIOZ'18Emr Em withrThe strain was transformed into the BglII linearized plasmid dKmOZ'18Spec.rTrait in Converted. These are two regions in common (downstream of pUCori and lacZ '). And the double intersection has two homologous regions Can occur over an area. As a result, the S.V. gordon ii After selecting transformed cells, EmrGene is SpecrReplaced by genes Was. E. FIG. pPIOZ'18Spec already constructed using E. coli cellsrSha Spec that is indistinguishable from toll plasmidrPlasmid DN from transformed cells A was separated. SpecrS. gordonii with linear dKmOZ'18EmrD Similar results were obtained when transformed with NA (shown on the right hand side of FIG. 5). Was.   When these are observed, Gordonii cells It has been shown that post-transformation integration can also occur in the rasmid. Therefore, E. Specific plasmid structures that are unstable in E. coli cells Even if they are not linked in advance. can be constructed directly in the gordonii system. To implement this new method, pPIOZ'18Spec was used.r(FIGS. 5 and 6 A (shown in A.). gordonii SpecrTransforming cells Eco0109 linearized 38HGBDEm containing hybrid GBD gener(Figure 1C and FIG. 6B). Resident plasmid pPIOZ'18Spe crAnd EcoO109 linearized 38HGBDEmrHas two homologous domains (pU Cori and lacZ '), and the hybrid GBD gene is recombined. Later incorporated. Primary EmrAnalysis of plasmid DNA from transformed cells , Two types of plasmids in a single transformed cell: early plasmid and integration Only the presence of the plasmid (lanes 2 and 3) was indicated. Using these plasmids Secondary Em transformedrWith the isolate, a single plasmid, pPI38HGB DEmr(7.5 kb, lanes 4 and 5) was indicated. E. FIG. coli JM 109 was transformed with an integrated plasmid from the latter transformed cell, Em.r No colonies were obtained, indicating that this plasmid was E. coli. E. coli cells It indicates that it cannot be obtained. (D) Preparation of GBD fusion protein. S. gordonii transformed cells (GB D containing the plasmid or chromosomal copy of the fusion gene) The liquor was acetone precipitated and concentrated 50-fold and assayed for the presence of GBD. Already (Gene 69: 101-109) using an anti-GTF-S antibody Protein band of expected size (60 kd) by turn blot analysis And Secretion of smaller degradation products was confirmed. (E) E. Expression of GBD hybrid gene in E. coli. GBD, other tongue E. coli as a fusion protein containing a peptide derived from protein. E. coli be able to.   The XbaI fragment from the gtfD gene was transferred to plasmid pGD103X. Inserted into the frame. This is then combined with the first of GBD and β-galactosidase. It was expressed as a fusion with 13 amino acids. The fusion protein is biotinylated Dextran and fusion protein binding or fusion protein and dextran-se Binding to Farose beads followed by Western blot with anti-GTF-S serum Measures by elution and detection on the lot and easily binds to glucan. This way Has a cysteine residue in the fusion protein derived from β-galactosidase peptide. Incorporate. This allows covalent attachment of biotin or other detection molecules to GBD. Will be possible.   Further, E. For expression in E. coli, GBD is transformed into the pTOPE system (Nov agen, Madison, Wisconsin). Was. Got The fusion protein is E. coli. naturally biotinylated in E. coli, avidin columns It can be easily purified after absorption. After fusing the fusion protein with biotin, G BD was Factor Xa cut and the mixture was passed through a second avidin column It can later be released from the fusion protein.   The cell extract is applied to a Dextran-Sepharose column and 10 mM acetate buffer Elution with a gradient guanidine hydrochloride in solution (pH 6.0) to give GBD-β-galactosidase. Transform the E. coli peptidase fusion protein. E. coli. After this And dialyzed against a buffer without guanidine hydrochloride.Example 2-Binding of 6BD fusion protein to dextran a) Binding to biotinylated dextran. Biotinylated dextran (Pha enzyme-linked immunoassay for measuring dextran binding activity using Say (ELISA) was devised. That is: A protein sample (S. Gordoni type) is placed in a well of a microtiter plate. (50 μl of culture supernatant derived from a transformant), and incubate at 4 ° C. for 18 hours. I did it. The supernatant was discarded and the absorbed protein was washed three times with water. next, Add 200 μl of blocking buffer (acetate buffer containing 0.5% BSA) to each well. Solution; pH 6), incubate at 37 ° C for 1 hour, and wash as above. Was. Subsequent wells contain various concentrations of biotinylated dextran (Pharma). cia) and incubated for 10 minutes at room temperature. Next, loosen each well Washed with bumps as above. Thereafter, streptavidin (streptav) idin) peroxidase was added and incubated at RT for 5 minutes. Each c The contents of the well were removed and the absorbed material was washed as described above. Next, Peru A color reaction is generated by adding the oxidase substrate, Incubate for ~ 30 minutes and stop the reaction by adding 100 μl of 3N sulfuric acid I let it. Then, the absorbance of each solution was measured by ELISA plate reader. Measured at 10 nm.   Using this assay, the GBD fusion chromosomal integrant Hold S. Gordoni strains and sets expressing hybrid proteins Culture supernatants from control strains without the transgene were compared to each other. Table 1 The results show that strains harboring the GBD fusion protein gene were dose-dependent. Apparently secreted protein that binds to otinylated dextran It is. In contrast, the negative control strain does not show such activity. Example 3-Binding of GBD-biotin complex to bacteria a) Preparation of glucan binding domain-biotin complex. Targets plaque to other molecules In order to prove that GBD can be used to make For the binding to glucan-coated bacteria and plaque targeting Tested. In order to produce GBD-biotin, the amino acid cysteine is left behind. Through gene manipulation, the C or C structure of the protein (GBD usually lacks cysteine) May be introduced at the N-terminus. This operation adds an appropriate codon to the sequence of the GBD gene. Cysteine codon in the peptide sequence to be fused with GBD Can be done by adding In the experiments described here, cysteine was converted to GB D. a β-galactosidase peptide of a GBD fusion produced in E. coli Was added as part of the sequence.   Biotin was added to the GBD fusion protein by the method described previously (Anal. Bjoch). em. 149, p. 529, 1985). For this binding E. coli clone extract on GBD (Dextran-Sepharose column) Was purified with 0.3 mg of biotin-maleimide (Sigma). Was. At 37 ° C Incubate for 5 hours, dialyze for 18 hours against phosphate buffered saline, and Biotin was removed. The resulting biotinylated GBD is obtained by converting GBD into beads or fine beads. Cells and mix the mixture with an Ultra-free MC filter (Millipo). re) to allow binding of the complex to bacterial cells or dextran. Could be used for quantification. Wash the sample directly on the filter and use streptavidin Incubate with oxidase and use in ELISA reader Measure the absorbance of the color complex to determine the amount of GBD bound to cells or resin. I was able to. b) Measurement of binding   In order to measure the binding of GBD-biotin to glucan on the bacterial surface, dietary Streptococcus muta which is a producer of glucan derived from claus ns GS-5 with added glucose or sucrose as a carbohydrate source Grow in Todd Hewitt Broth. S. in sucrose m utans growth triggers the production of cell-associated glucans (Microbiol. Rev .. 44, pp. 331-384). In contrast, the above in glucose Bacterial growth triggers glucan production Does not happen.   After suspension growth at 37 ° C., the bacteria are washed with buffer and removed in the absence of GBD-biotin. Was resuspended in the presence. Bacteria are washed again with buffer, 0.1 M NaCl, mM MgClTwoAnd 0.1 M Tris containing 0.05% Triton α-100 Streptavidin peroxidase (Gi) dissolved in HCl (pH 7.5) bco / BRL). After washing, the cells were washed with a color reagent solution (1 mg / ml o-phenylenediamine HCl and 0.012% hydrogen peroxide Incubation with enoate buffer; pH 4.5). Thus, G Cell binding by BD-biotin was measured as absorbance at 410 nm after color development. . FIG. 8 shows the results. S. in a sucrose-containing medium Mutans Incubation Is induced by the production of bacterial glucan, the natural GBD binding site. Clearly, it promotes biotin binding. Grow in the presence of glucose The cells did not provide a significant amount of binding sites for GBD-biotin (i.e., , The cells did not produce glucan).Example 4-Binding of GBD-biotin to human plaque   This example demonstrates that GBD binds to plaque, but this binding is anti-GT Antibody F, which itself is an anti-species (ant) bound to a fluorescent marker. i-species) antibody. That is, binding is performed using a fluorescence microscope. And can be visualized on a slide.Method Sample preparation   Human plaque, 3 times with 10 ml of 5% sucrose gargle the day before plaque sampling Obtained from volunteers used. The volunteer also brushes his / her teeth 24 hours prior to plaque sampling. Did not. Plaque was immediately frozen after collection and stored at -20 ° C until use. tooth Scar was sonicated vigorously for 30 seconds in Ringer's solution containing 2% formalin. (0.5 second on, 0.5 second off in 1 second cycle). Dilute to 1mg / ml A 10 μl aliquot of the plaque suspension was pipetted into the eight samples shown in FIG. Was placed on a glass slide. Air dry the wells, then briefly bake and fix I let it.Sample processing   Slides were phosphoric acid containing 1% BSA and 0.05% Tween 20 Buffered saline (pH 7.2; block (King buffer) for 20 minutes to block Heterogeneous binding was reduced. Rinse solution by immersion in two continuous Ringer's baths Dropped. Then, the solution containing other reagents is added to the above buffer solution using the same operation. Was added. 20 μg / ml of GBD was added, and then 50 to 50 μg / ml as shown in FIG. Usaki polyclonal anti-GTF-S antibody was added at a dilution of 2000-fold. No G BD wells and blank wells were used as controls.Detection of bound GBD   The fluorescence of the prepared slide was measured using a mercury lamp and surface irradiation (epiluminat). ion). A photo of a representative area of the slide was taken with the HS-400E Photographed using ktachrome film.result   Photographs of the fluorescence of treated plaque samples show that there is strong fluorescence in those samples. showed that. Although this fluorescence was significantly dependent on the GBD concentration used, the GBD Binding to plaque even in the presence of gingival proteins.Conclusion   These experiments show that GBD is concentration-dependent but intense, It has proven to bind to plaque in significant amounts. However, the fluorescence is no GBD There were some in the light. The reason for this is that anti-GTF-S antibodies naturally occur in plaque. Most likely, it is due to binding to existing GTF. these Results show the ability of GBD lacking the rest of the parent GTF molecule to bind glucan and human It is the best proof of your ability to target plaque.Example 5   Fruit that demonstrates binding to biofilms, analogs of plaque on teeth The experiment was performed. The operation was as follows. (A) S.P. mutans overnight culture in sterile microtiter plate cells , Which was incubated for 1 hour and then washed out (poured). off). (B) After rinsing with phosphate buffered saline (PBS), the plate was washed with 1%   Incubated with PBS solution for 2.5 hours. In both cases, the bacteria form a membrane It was thought that the membrane did not contain glucan when sucrose was used. (C) Plate was prepared using G5D manufactured according to Example 1C. The plate was incubated with the containing solution for 30 minutes, and then washed three times with PBS. (D) Plate with suspension of rabbit polyclonal antibody to GTF Incubated for 30 minutes, then rinsed with PBS. (E) binding the plate to horseradish peroxidase (HRP) enzyme For 30 minutes with a suspension of a complex comprising a goat anti-Usaki polyclonal antibody Cuvated and then washed 10 times with distilled deionized water.   If the membrane on the cell contains glucan, some of this glucan will Immobilize the GBD and thereby immobilize the antibodies of steps (d) and (e) Should be. The resulting complex is   Substrate: GBD: rabbit anti-GTF: anti-rabbit HRP Let's be.   Cells were supplied with a substrate that could be converted to a blue color by the HRP enzyme. . The rate at which the absorbance at 630 nm changed was measured.   When GBD or anti-GTF antibody was excluded, very little color development was observed. Did not. When the whole system was perfect In this case, the color development was 6 times. In step (b), replace sucrose with gluco When the base was used, very little color development was observed.   This suggests that GBD is S. cerevisiae in the presence of sucrose. mutans formed This indicates that it was successfully bound to the membrane (plaque model). Instead of sucrose When glucose was used, glucan was formed as proved by the comparative examples. Nothing was produced that could bind to GBD.   Dextran having a concentration of 1 mg / ml or more is added to the GBD solution used in step (c). Dextran is an alternative site for binding by GBD. Was. As a result, color development is suppressed, which means that GBD binds to dextran, This indicates that it was later removed by washing with dextran.Example 6   Galactose oxida from the fungus Dactylium dendroides Gene was inserted into plasmid pGAO (McPherson et al., J. Bi). ol. Chem. 267, pp. 8146-8152,1 992). BamHI- having a part of the leader sequence shown in an enlarged manner in FIG. The EcoRI fragment was cloned into the plasmid pUC118 to give the plasmid pUC GAOEB (FIG. 11) was produced. Next, the DdeI fragment was removed from this plasmid. And treated with Klenow fragment to form blunt ends, which are inactivated Insertion into SmaI site of plasmid pUC118Nar (W) containing acZ gene Entered. The resulting plasmid, pO5, was placed under the control of the lacZ promoter. It has a fragment of the toose oxidase gene.   Next, a NarI-XbaI fragment was extracted from the galactose oxidase gene. And inserted between the corresponding sites of the plasmid p05 shown in FIG. The complete galactose oxidase gene under the control of the lacZ promoter The plasmid pR3 having was constructed. Use this plasmid to smell E. coli To express galactose oxidase.   The DdeI fragment obtained from the 3 'end of the galactose oxidase gene was The fragment was treated to form a blunt end, which was used for plasmid pUC11 shown in FIG. 9 Hinc Insertion into the II site yielded plasmid pP4. Is it a plasmid similar to that of FIG. 1B? The GBD gene constructed in (a) of Example 1 was cut with XbaI-EcoRI. Cut out as a piece. This fragment was inserted into plasmid pP4, thus GBD fragment fused to a sequence derived from the 3 'end of the galactose oxidase gene The plasmid pS2 with the gene was created. Next, the galactose oxidase remains The GBD gene fused to the 3 'end of the gene was cut as a BamHI-EagI fragment. Out, and, as shown in FIG. 14, the plasmid was cut with BclI and EagI. Inserted into mid pR3. As a result, plasmid pU4 was obtained and used to transform E. coli. A fusion of a glucan binding domain fused to galactose oxidase. The combined protein was expressed.   Escherichia coli strains into which plasmids pS2, pR3 and pU4 have been introduced are cultured, Culture supernatants were assayed for galactose oxidase activity. Various concentrations Control solution containing galactose oxidase and solution containing only buffer Prepared as. FIG. 15 shows the results. From this figure, the plasmid pU4 was introduced. 10 μg / ml of galactose Suo Have a higher galactose oxidase activity than the control containing the oxidase. Can be found.   The above E. coli strain was also assayed for glucan binding activity by the procedure of Example 2. I did.   The results of these assays show that galactose oxidase and glucan-binding Shows that the fusion with the enzyme can exhibit enzyme function and bind to glucan .

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年５月１３日 【補正内容】請求の範囲 １．グルカンに対して特異的結合親和性を有し、亜鉛、錫、若しくは銅イオンに 対するキレート化剤、アビジン、ビオチン、殺菌薬、グリコシルトランスフェラ ーゼ酵素以外の酵素、並びに非酵素タンパク質及びペプチド（ここで、非酵素タ ンパク質及びペプチドは、抗体、抗体フラグメント、ヒスタチン、ラクトフェリ ン、デフェンシン、マガイニン、セクロピン、カチオン性抗バクテリオシン、及 びバクテリオシンから成る群から選択される）から成る群から選択される他の材 料に化学的に共有結合しているポリペプチドである、口腔内で使用するためのハ イブリッド材料。 ２．他の材料が歯の着色に対して活性である、請求項１に記載のハイブリッド材 料。 ３．他の材料が、トリクロサン、クロルヘキシジン、第四級アンモニウム化合物 、クロロキシレノール、クロロキシエタノール、及びチモールから成る群から選 択される殺菌薬である、請求項１に記載のハイブリッド材料。 ４．他の材料がオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ酵素である、請求項１に記載 のハイブリッド材料。 ５．グルカンに対して特異的結合親和性を有するポリペプ チドがグリコシルトランスフェラーゼのグルカン結合ドメインのクローンである 、請求項１に記載のハイブリッド材料。 ６．請求項１で規定されるハイブリッド材料を口中使用が許容可能なキャリヤー 賦形剤中に含有する、口腔内局所適用用組成物。 ７．０．０１〜１重量％の量のハイブリッド材料を含有する請求項６に記載の組 成物。 ８．２種類の口腔内局所適用用協働組成物を口中使用が許容可能なキャリヤー賦 形剤中に含有する製造物であって、第１の組成物が、グルカンに対して特異的結 合親和性を有し且つグリコシルトランスフェラーゼ酵素以外の目的材料に化学的 に共有結合しているポリペプチドを含有し、第２の組成物が前記目的材料に対し て特異的結合親和性を有する材料に化学的に共有結合した歯垢又は歯の着色に対 して有効な薬品を含有する、製造物。 ９．請求項１で規定されるハイブリッド材料、請求項６で規定される組成物、又 は請求項８で規定される製造物を、口内に局所適用することを含んで成る、歯垢 抑制方法。[Procedure for Amendment] Article 184-8 of the Patent Act [Date of Submission] May 13, 1996 [Details of Amendment] Claims 1. It has a specific binding affinity for glucan, chelating agents for zinc, tin, or copper ions, avidin, biotin, bactericides, enzymes other than glycosyltransferase enzymes, and non-enzymatic proteins and peptides (here The enzymatic protein and peptide are chemically bound to another material selected from the group consisting of antibodies, antibody fragments, histatin, lactoferrin, defensin, magainin, cecropin, cationic antibacteriocin, and bacteriocin). A hybrid material for use in the oral cavity, wherein the hybrid material is a specifically covalently linked polypeptide. 2. The hybrid material according to claim 1, wherein the other material is active for tooth coloring. 3. The hybrid material of claim 1, wherein the other material is a bactericide selected from the group consisting of triclosan, chlorhexidine, a quaternary ammonium compound, chloroxylenol, chlorooxyethanol, and thymol. 4. The hybrid material according to claim 1, wherein the other material is an oxidase or peroxidase enzyme. 5. The hybrid material according to claim 1, wherein the polypeptide having specific binding affinity for glucan is a clone of a glucan binding domain of glycosyltransferase. 6. A composition for topical application in the oral cavity, comprising a hybrid material as defined in claim 1 in a carrier vehicle acceptable for oral use. 7. The composition according to claim 6, comprising the hybrid material in an amount of 0.01 to 1% by weight. 8. A product comprising two co-operative compositions for topical oral application in a carrier vehicle acceptable for oral use, wherein the first composition has specific binding affinity for glucan. A polypeptide having a specific binding affinity for the target material, the polypeptide comprising a polypeptide having a specific binding affinity for the target material other than the glycosyltransferase enzyme. A product containing a plaque or a drug effective for coloring a tooth, which is covalently bonded to the product. 9. A method for controlling plaque, comprising topically applying the hybrid material as defined in claim 1, the composition as defined in claim 6, or the product as defined in claim 8, to the mouth.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 シリング，カート・マシユー イギリス国、エル・64・６・テイー・キユ ー、ウイラル、パークゲイト、パドツク・ ドライブ・25──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Agency reference number FI (C12P 21/00 C12R 1:19) (72) Inventor Shilling, Kurt Massieux, UK, El 64.6・ Tay Kew, Wirral, Parkgate, Paddock Drive ・ 25

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．グルカンに対して特異的結合親和性を有し且つグリコシルトランスフェラー ゼ酵素以外の他の材料に化学的に共有結合しているポリペプチド。 ２．他の材料が歯垢の形成抑制効果を有する、請求項１に記載のポリペプチド。 ３．他の材料が殺菌薬である、請求項２に記載のポリペプチド。 ４．他の材料が歯の着色に対して活性である、請求項２に記載のポリペプチド。 ５．他の材料が、亜鉛、錫、若しくは銅イオンに対するキレート化剤、抗体、抗 体フラグメント、ヒスタチン、ラクトフェリン、デフェンシン、マガイニン、セ クロピン、カチオン性抗バクテリオシン、バクテリオシン、トリクロサン、クロ ルヘキシジン、第四級アンモニウム化合物、クロロキシレノール、クロロキシエ タノール、及びチモールから成る群から選択される、請求項２に記載のポリペプ チド。 ６．他の材料がビオチン及びアビジンから成る群から選択される、請求項２に記 載のポリペプチド。 ７．他の材料がペプチド結合により第１の前記ポリペプチ ドに結合した第２のポリペプチドである、請求項２に記載のポリペプチド。 ８．第２のポリペプチドが酵素である、請求項７に記載のポリペプチド。 ９．酵素がオキシダーゼ又はペルオキシダーゼである、請求項８に記載のポリペ プチド。 １０．ポリペプチドがグリコシルトランスフェラーゼのグルカン結合ドメインの クローンである、請求項１に記載のポリペプチド。 １１．請求項１で規定されるポリペプチドを口中使用が許容可能なキャリヤー賦 形剤中に含有する、口腔内局所適用用組成物。 １２．０．０１〜１重量％の量のポリペプチドを含有する請求項１に記載の組成 物。 １３．２種類の口腔内局所適用用協働組成物を口中使用が許容可能なキャリヤー 賦形剤中に含有する製造物であって、第１の組成物が、グリコシルトランスフェ ラーゼ酵素以外の目的材料に化学的に共有結合している請求項１に記載のポリペ プチドを含有し、第２の組成物が前記目的材料に対して特異的結合親和性を有す る材料に化学的に共有結合し た歯垢又は歯の着色に有効な薬品を含有する、製造物。 １４．口内に請求項１で規定されるポリペプチドを局所適用することを含んで成 る、歯垢抑制方法。[Claims] 1. Glycosyl transferer with specific binding affinity for glucan A polypeptide that is chemically covalently linked to other materials than the enzyme. 2. The polypeptide according to claim 1, wherein the other material has a plaque formation inhibitory effect. 3. 3. The polypeptide of claim 2, wherein the other material is a bactericide. 4. 3. The polypeptide of claim 2, wherein the other material is active for tooth coloring. 5. Other materials include chelating agents, antibodies, anti-tumors for zinc, tin, or copper ions. Body fragments, histatin, lactoferrin, defensin, magainin, Clopin, cationic antibacteriocin, bacteriocin, triclosan, black Luhexidine, quaternary ammonium compound, chloroxylenol, chloroxye The polypep of claim 2, wherein the polypep is selected from the group consisting of tanol, and thymol. Chid. 6. 3. The method of claim 2, wherein the other material is selected from the group consisting of biotin and avidin. The polypeptide mentioned. 7. The other material is the first said polypeptide by a peptide bond. 3. The polypeptide of claim 2, wherein said polypeptide is a second polypeptide bound to a peptide. 8. The polypeptide of claim 7, wherein the second polypeptide is an enzyme. 9. 9. The polypeptide according to claim 8, wherein the enzyme is oxidase or peroxidase. Puchido. 10. The polypeptide binds to the glucan binding domain of glycosyltransferase 2. The polypeptide of claim 1, which is a clone. 11. Claims 1. A polypeptide as defined in claim 1, which is acceptable for oral use. A composition for topical application in the oral cavity, which is contained in a form. 12. The composition according to claim 1, which comprises the polypeptide in an amount of 0.01 to 1% by weight. Stuff. 13. An orally acceptable carrier for two oral topical synergistic compositions. A product contained in an excipient, wherein the first composition comprises glycosyltransfer 2. The polypeptide according to claim 1, wherein the polypeptide is chemically covalently bonded to a target material other than the enzyme. The second composition has specific binding affinity for the target material. Chemically covalently binds A product containing a drug effective for coloring plaque or teeth. 14． Comprising topically applying a polypeptide as defined in claim 1 in the mouth. Plaque control method.
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