JPH1045764A - ４’−メチル置換フルオレセイン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）におい
ては、トレーサーによる偏光のスパンが大きいほど、ア
ッセイの精度および感度は優れている。本発明は、ＦＰ
ＩＡにおける性能を向上させることを課題とする。 【解決手段】 本発明では、環状アミンと直接に反応し
得てフルオレセイン分子と分析対象物との間の環状リン
カーを与えるフルオレセイン誘導体トレーサーを提供す
ることによりＦＰＩＡにおける精度および感度を向上さ
せた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般的には生物学
的液体中のリガンドの測定のための方法および試薬に関
するものである。特定的には、本発明は、蛍光偏光イム
ノアッセイにおけるトレイサー試薬として有用な新規な
種類の４’−メチル置換フルオレセイン接合体に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】血清試料中の薬剤濃度は、競合結合イム
ノアッセイによって測定され得る。試験試料中の薬剤等
の分析対象物（リガンドとも称される）の濃度測定のた
めの競合得結合イムノアッセイは、試験試料中のリガン
ドと、トレイサーと称される標識試薬との間の、リガン
ドおよびトレイサーに対して特異的な抗体上のレセプタ
結合部位の限られた個数についての競合に基づく。試料
中のリガンド濃度は、抗体に特異的に結合するであろう
トレイサーの量を決定する。生成されるトレイサー−抗
体接合体の量は、定量的に測定され得、かつ試験試料中
のリガンドの量に逆比例する。

【０００３】本発明の方法により測定可能なリガンドま
たは薬剤の例は、エストリオール、アドレノコルチコト
リピンホルモン（ＡＣＴＨ）、エストロン、コレステロ
ール、エストラジオール、コルチゾール、テストステロ
ン、プロゲステロン、ケノデオキシコール酸、ジゴキシ
ン、コール酸、ジギトキシン、デオキシコール酸、リソ
コール酸等のステロイド類並びにそのエステルおよびア
ミド誘導体；Ｂ−１２等のビタミン類、葉酸、チロキシ
ン、トリオドチロキシン、ヒスタミン、セロトニン、プ
ロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）、プロスタグランジンＦ
（ＰＧＦ）、プロスタグランジンＡ（ＰＧＡ）等のプロ
スタグランジン類；テオフィリン等の抗喘息薬；ドキソ
ルビシンおよびメソトレキセート等の抗新生物剤；ジソ
ピラミド、リドカイン、プロカインアミド、プロプラノ
ルオール、キニジン、Ｎ−アセチルプロカインアミド等
の抗不整脈剤；フェノバルビタール、フェニトイン、プ
リミドン、バルプロン酸、カルバマゼピン、フレカイニ
ドおよびエトスクシミド等の抗痙攣剤；ペニシリン類、
セファロスポリン類、エリスロマイシン、バンコマイシ
ン、ゲンタマイシン、アミカシン、クロラムフェニコー
ル、ストレプトマイシンおよびトブラマイシン等の抗生
物質；サリチレート等の抗関節炎剤；ノルトリプチリ
ン、アミトリプチリン、イミプラミンおよびデシプラミ
ン等の三環式化合物を含む抗鬱剤；等並びにそれらの代
謝物を含む。加えて、薬剤は、モルヒネ、ヘロイン、ヒ
ドロモフォン、オキソモルフォン、メタドン、コデイ
ン、ヒドロコドン、ジヒドロコデイン、ジヒドロヒドロ
キシコデイン、デキストロメトルファン、フェナゾシ
ン、ベンゾイルエクゴニン、テトラヒドロ−カンナビノ
イド（ＴＨＣ）、バルビツール酸塩、ベンゾジアゼピ
ン、リセルグ酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）、プロポキシ
フェン、フェンシリジン、アンフェタミン類、メタクア
ロンおよびそれらの代謝物等の乱用薬剤を含んでよい。
これらの物質は本発明の方法に従って分析されうる。加
えて、環境汚染物質が、本発明の方法により分析されう
る。環境汚染物質の例は、ポリ塩素化ビフェニル類（Ｐ
ＣＢ）、アトラジン、シマジン、テルブトリン、ｓ−ト
リアジン、アミトロール、トリフラリン、ノルフラジ
ン、ペルメトリン、シペルメトリン、パラコート、アラ
クロール、メトラクロール、クロルスルフロン、フェニ
ルウレア除草剤、アルドリン、クロルダン、エンドスラ
ン、パラチオン、ダイオキシン、２−アミノベンズイミ
ダゾール、ペンタクロロフェノール、ベンゾ−α−ピレ
ン、多芳香族環炭化水素（ＰＡＨ）等の農薬、除草剤、
殺虫剤、抗カビ剤、並びにそれらの代謝物を含む。

【０００４】蛍光偏光は（ＦＰ）、競合結合イムノアッ
セイにおいて生成されるトレーサー−抗体接合体の量を
測定するための定量手段を提供するものとしてイムノア
ッセイの分野で周知である（ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．５：２９９、１９６１参
照）。一般的に、蛍光偏光技術は、直線偏光により励起
された場合にフルオレセイン標識化合物が、その旋回率
に逆比例的関係を持つ偏光度の蛍光を放射する原理に基
づく。

【０００５】蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）にお
いて、蛍光偏光はリガンドまたは薬剤濃度の再現性を持
った関数であり、従って、治療的な薬剤モニターのため
の血清中のリガンドまたは薬剤濃度の定量的測定に好適
である。トレーサーと、測定されるべき薬剤に対して特
異的な抗体を含む血清と、薬剤を含まない患者血清とが
混合された場合に、ほとんどのトレーサーは抗体に結合
する。結果として、結合されたトレーサーが４８９ｎｍ
の偏光により励起された場合に５２０ｎｍの放射光は高
度に偏光された状態に維持される。しかしながら、患者
の試料中に薬剤が存在する場合には薬剤は抗体に対する
結合についてトレーサーと競合するであろう。従って、
より多くのトレーサーが未結合のまま残り、放射光は偏
光しない。

【０００６】本発明によるＦＰＩＡは、いずれの型の自
動化またはマニュアルＦＰＩＡであってもよい。好まし
くは、ＦＰＩＡは、特異的抗体に対する蛍光標識薬剤
（トレーサー）の結合を測定しうる自動化ＣＯＢＡＳ
ＦＡＲＡ ＩＩ（商標）化学システム（ロシュ・ダイア
グノスティク・システムズ、インク、ブランチブルグ、
ニュージャージー、米国）によって実施される（Ｄａｎ
ｄｌｉｋｅｒおよびＦｅｉｇｅｎ、ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．５：２９９、１９６
１参照）。

【０００７】ＦＰＩＡにおいて、結果はミリ偏光単位
（ｍＰ）により数量化され、これから標準曲線が決定さ
れ、またスパンが計算される。スパンは、遊離の薬剤が
抗体結合部位について結合トレーサーと競合する際の、
抗体に対するトレーサーのｍＰ単位（またはデルタｍ
Ｐ）で測定される最大および最小結合の間の差（または
デルタ）である。より大きいスパンは、ＦＰＩＡにおい
てより良い精度を与える。蛍光の偏光は、分析対象濃度
の上昇に伴って、規則的に減少する。デルタ値またはス
パンが大きいほど、アッセイの精度および感度は優れて
いる。試料中の薬剤濃度は、標準検量線との比較により
決定されうる。

【０００８】フルオレセイン標識化合物またはトレーサ
ーを調製しうる幾つかのフルオレセイン誘導体が知られ
ており、商業的に入手しうる。主なフルオレセイン誘導
体はフルオレセインの５または６位から誘導され（５位
については異性体Ｉ、また６位については異性体ＩＩと
も称される）、５−または６−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミジルカルボキシフルオレセイン、５−アミノメチル
フルオレセインまたは６−ジクロロ−１，３，５−トリ
アジン−２−イルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）を
含む。

【０００９】フルオレセインの４’位から合成されるフ
ルオレセイン誘導体も知られている。例えば、４’−ア
ミノメチルフルオレセインは、カルボキシル基を保持す
る薬剤誘導体またはリガンドに結合するための親核性試
薬として有用である（米国特許４，６１４，８２３号お
よび４，５１０，２５１号参照）。フルオレセインのア
ミノ基は、分析対象物のカルボキシル基と反応してペプ
チド結合を生じる。しかしながらこの方法は、環式基を
含む分析対象物が４’−メチル炭素原子に直接に結合す
ることを許容しない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
の一つは、環状アミンと直接に反応し得てフルオレセイ
ン分子と分析対象物との間の環状リンカーを与えるフル
オレセイン誘導体を提供することである。

【００１１】更に特定的には、本発明の目的は、親核中
心を有するリガンドに容易に接合することができる結合
基により修飾される改良された４’−メチル置換フルオ
レセイン誘導体を調製することである。また、本発明の
目的は、親核中心を有する結合基により修飾されたリガ
ンドに容易に接合することができる改良された４’−メ
チル置換フルオレセイン誘導体を調製することである。

【００１２】更に本発明の目的は、アミノ基を用いて容
易に除去され、而して薬剤誘導体に対するフルオレセイ
ンの結合を容易にすることができる脱離基を有する４’
−メチル置換フルオレセイン誘導体を調製することであ
る。４’−メチル置換フルオレセインそれ自体はアミノ
基により、好ましくは環状アミンとの反応により修飾さ
れうる。別法として、アミノ基は、４’−メチル置換フ
ルオレセインが結合され得る薬剤誘導体、最も好ましく
は環状アミン含有リンカーを有する薬剤誘導体の一部で
あり得る。

【００１３】本発明の更に別の目的は、ＦＰＩＡにおい
てより高精度および高感度をもたらす、より大きい動力
学的スパンを持ったフルオレセイントレーサーを調製す
るために使用され得る４’−メチル置換フルオレセイン
誘導体を提供することである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、式

【化５】 式中、Ｘはヒドロキシ、ハロゲンおよび式−Ｏ−ＳＯ₂
−Ｒを有するスルホン酸エステルからなる群から選択さ
れ、ここでＲは、−Ｃ₆ Ｈ₄ −ＣＨ₃ またはＣＨ ₃ であ
る、を有する新規な種類のフルオレセンス誘導体に関す
るものである。

【００１５】ハロゲン原子は、塩素原子、臭素原子およ
びヨウ素原子からなる群から選択される。好ましくはハ
ロゲン原子は、塩素または臭素原子であり、最も好まし
くは塩素原子である。

【００１６】式Ｉのフルオレセイン誘導体は、蛍光偏光
イムノアッセイにおいて使用されうる新規試薬の合成に
おける中間体として有用である。

【００１７】本発明は、蛍光偏光イムノアッセイにおけ
るトレーサーとして使用される環状リンカーを含む薬剤
−フルオレセイン接合体にも関する。

【００１８】本発明は、下記の図面を参照してより容易
に理解されるであろう。ここにおいて、化合物に続く番
号は、図１−９に示される化合物番号と関連している。

【００１９】図１は、出発材料、並びに４’−ヒドロキ
シメチルフルオレセイン：［ｒａｃ−４’−（ヒドロキ
シメチル）−３’，６’−ジヒドロキシスピロ［イソベ
ンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］−キサンテ
ン］−３−オン］（２）および４’−ピペラジニルメチ
ルフルオレセイン：［ｒａｃ−３’，６’−ジヒドロキ
シ−４’−（１−ピペラジニルメチル）スピロ［イソベ
ンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］−キサンテ
ン］−３−オン］（４）の合成に関連する中間体の式を
表す。

【００２０】図２は、出発材料、並びに環状リンカー含
有バルプロン酸ＰＦトレーサーである（５−［［［４−
［４−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピ
ロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］−
キサンテン］−４’−イル）メチル］−１−ピペラジニ
ル］−カルボニル］アミノ］−２−プロピル］ペンタン
酸（１１）の合成に関連する中間体の式を表す。

【００２１】図３は、出発材料、並びに非環状リンカー
含有バルプロン酸ＰＦトレーサーであるｒａｃ−５−
［［［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），９’［９Ｈ］キサ
ンテン］−６−イル）カルボニル］アミノ］−２−プロ
ピルペンタン酸（１３）の合成に関連する中間体の式を
表す。

【００２２】図４は、出発材料、並びにピペラジンを環
状リンカーとして含有するアンフェタミンＰＦトレーサ
ーである（Ｓ）−４’［［４−［［４−（２−アミノプ
ロピル）−フェニル）フェニル］スルホニル］−１−ピ
ペラジニル］メチル］−３’，６’−ジヒドロキシスピ
ロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］キサ
ンテン］−３−オン（１：１エピマー）（１９）の合成
に関連する中間体の式を表す。

【００２３】図５は、出発材料、並びに環状リンカーを
含有するアセトアミノフェンＰＦトレーサーである［ｒ
ａｃ−４−［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソス
ピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］
キサンテン］−４’−イル）メチル］−Ｎ−（４−ヒド
ロキシフェニル）−ガンマ−オキソ−１−ピペラジンブ
タミド（２６）の合成に関連する中間体の式を表す。

【００２４】図６は、出発材料、並びに非環状リンカー
を含有するアセトアミノフェンＰＦトレーサーである
［ｒａｃ−４−［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキ
ソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−［９
Ｈ］キサンテン］−４’−イル）メチル］アミノ］−Ｎ
−（４−ヒドロキシフェニル）−４−オキソブタンアミ
ド（２８）の合成に関連する中間体の式を表す。

【００２５】図７は、出発材料、並びに環状リンカーを
含有するチロキシンＰＦトレーサーである［（２Ｓ）−
４’−［［４−［２−アミノ−３−［４（４−ヒドロキ
シ−３，５−ジアイオドフェノキシ）−３，５−ジアイ
オドフェニル］−１−オキソプロピル］−１−ピペラジ
ニル］メチル］−３’，６’−ジヒドロキシスピロ［イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］キサンテ
ン］−３−オン（１：１エピマー）（３３）の合成に関
連する中間体の式を表す。

【００２６】図８は、出発材料、並びに環状リンカーを
含有するカルバマゼピンＰＦトレーサーである［Ｎ−
［［［１−［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソス
ピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）−９’−［９Ｈ］
キサンテン］−４’−イル）メチル］−４−ピペリジニ
ル］メチル］−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−５
−カルボキサミド（３７）の合成に関連する中間体の式
を表す。

【００２７】図９は、出発材料、並びに非環状リンカー
を含有するカルバマゼピンＰＦトレーサーであるＮ−
［（５Ｈジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン−５−イルカルボ
ニル）メチル］−Ｎ−３’，６’−ジヒドロキシ−３−
オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−
［９Ｈ］キサンテン］−５−イル］チオウレア・二水和
物（４０）の合成に関連する中間体の式を表す。

【００２８】本発明は、上記に定義される式（Ｉ）の新
規フルオレセイン誘導体に関する。後者において、好ま
しくはＸは、ヒドロキシである。従って、特に好ましい
フルオレセイン誘導体は、式、

【００２９】

【化６】

【００３０】を有する４’−ヒドロキシメチルフルオレ
セインである。

【００３１】上記化合物は、クロロメチルメチルエーテ
ルを使用し、メタンスルホン酸の存在下にてフルオレセ
インに施されるフリーデル−クラフツ反応により得られ
た。

【００３２】本発明の一側面のおいて、新規４’−フル
オレセイン誘導体は、環状リンカーと結合され得て、本
発明の新規な薬剤−フルオレセイントレーサーを形成す
る。

【００３３】例えば、４’−メチル置換フルオレセイン
誘導体は、ヒドロキシ脱離基を持つように修飾される。
親核性反応は、４’−フルオレセイン誘導体に対して、
環状アミンを使用し、有機塩基の存在下で行われ、環状
リンカーを持った４’−メチル置換フルオレセイン誘導
体を生じ、式、

【００３４】

【化７】

【００３５】式中、Ｒ₁ はＨ、または薬剤誘導体、例え
ばバルプロン酸もしくは式、

【００３６】

【化８】

【００３７】を有するバルプロン酸誘導体から選択され
る、化合物を生じる。

【００３８】得られる４’−メチル置換フルオレセイン
接合体は、次いで薬剤との反応に付されて、本発明の新
規薬剤−フルオレセイントレーサーを生じる。

【００３９】下記に例示されるように、本発明の新規
４’−メチル置換フルオレセイン誘導体は、フルオレセ
イン−薬剤接合体の調製において有用な試薬である。ヒ
ドロキシル基が親核性試薬と置換されることは一般的で
はない。驚くべきことに、Ｃ−４’位のヒドロキシル基
は、以下に記述されるように、多くの親核性基により除
去されうる。Ｃ−４’メチル基への、環状リンカー・ア
ームの採り入れは、蛍光偏光イムノアッセイにおいてよ
り大きいスパンを生じ、従って、よりすぐれた精度およ
び高い感度をもたらす。従って、環状リンカー・アーム
を含むトレーサーは、ＦＰＩＡにおける優れた試薬であ
る。

【００４０】

【発明の実施の形態】一実施態様において、親核性反応
は、４’−ヒドロキシメチルフルオレセインに対して、
ｔ−ブチル−１−ピペラジンカルボキシレートを使用
し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２，６−ルチ
ジンおよびヨウ化ナトリウムの存在下で１３０−１４０
℃にて行われ、［ｒａｃ−４−［３’，６’−ジヒドロ
キシ−３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３
Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−４’−イル］メチ
ル）−１−ピペラジンカルボキシル酸−１，１−ジメチ
ルエチルエステル（３）を生じる（図１）。トリフルオ
ロ酢酸を使用するｔ−ブチルカルバメート基（ｔ−Ｂｏ
ｃ）の脱保護は、式、

【００４１】

【化９】

【００４２】を有する４’−ピペラジニルメチルフルオ
レセイン（４）を生じる。

【００４３】４’−ピペラジニルメチルフルオレセイン
は、リガンドまたは薬剤と接合し得て、ＦＰトレーサー
を形成する。例えば、４’−ピペラジニルメチルフルオ
レセインは、環状リンカーを含むバルプロン酸ＦＰトレ
ーサーの調製のために使用される（図２）。該ピペラジ
ニルメチルフルオレセインは、バルプロン酸誘導体
（９）と結合されて、尿素（１０）の形成をもたらす。
トリフルオロ酢酸中におけるｔ−Ｂｏｃ基の脱保護は、
式、

【００４４】

【化１０】

【００４５】を有する環状リンカーを含むバルプロン酸
トレーサー、５−［［［４−［４−［（３’，６’−ジ
ヒドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１
（３Ｈ），９’−［９Ｈ］−キサンテン］−４’−イ
ル）メチル］−１−ピペラジニル］カルボニル］アミ
ノ］−２−プロピル］ペンタン酸（１１）を生じる。

【００４６】非環状リンカーを含むバルプロン酸の薬剤
−フルオレセイン接合体、ｒａｃ−５−［［［３’，
６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾ−
フラン−１（３Ｈ），９’［９Ｈ］キサンテン］−６−
イル）カルボニル］アミノ］−２−プロピルペンタン酸
（１３）も調製された。６−カルボキシ−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルは、アミノ官能基を有するバ
ルプロン酸誘導体（８）と結合された。トリフルオロ酢
酸中におけるｔ−Ｂｏｃ基の脱保護は、環状リンカーを
持たないバルプロン酸トレーサーを与えた。

【００４７】２種類のバルプロン酸トレーサー、５−
［［［４−［４−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−
オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−
［９Ｈ］−キサンテン］−４’−イル）メチル］−１−
ピペラジニル］−カルボニル］アミノ］−２−プロピ
ル］ペンタン酸（１１）およびｒａｃ−５−
［［［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），９’［９Ｈ］キサ
ンテン］−６−イル）カルボニル］アミノ］−２−プロ
ピルペンタン酸（１３）を、ポリクローナル抗血清（Ｃ
ＯＢＡＳ−ＦＰ試薬番号４４０６５）を使用して、ＣＯ
ＢＡＳ ＦＡＲＡ ＩＩ（登録商標）化学システムにて
評価した。検量曲線において測定されたスパン（デルタ
ｍＰ）は、非環状リンカーを含むトレーサー（１２１ｍ
Ｐ）と比較すると、環状リンカーを含むトレーサー（１
４６ｍＰ）についてより高かった。

【００４８】フルオレセイン誘導体は、環状アミンと直
接に反応し、フルオレセイン分子と分析対象物との間の
環状リンカーを与える。この型の分子設計は、一旦抗体
に結合した場合に環状リンカーを有する薬剤−フルオレ
セイン接合体の回転の自由度をより妨げ、環状リンカー
を持たずに合成された薬剤−フルオレセイン接合体より
も大きいスパンを与える。環状リンカーを有する新規な
トレーサーは、ＦＰＩＡにおいて使用される場合の標準
曲線の改良された動力学的範囲および向上した偏光を示
した。

【００４９】本発明は、また一般式、

【００５０】

【化１１】

【００５１】式中、Ｙはピペラジン、ホモピペラジン、
４−アミノメチルピペリジン、４−カルボキシピペリジ
ン、プロリンおよび３−カルボキシジヒドロピリジンか
らなる群から選択される環状リンカーであり；Ｑは、こ
こに記述される薬剤、治療薬または環境汚染物である、
を有する新規薬剤−フルオレセイン接合体を調製するた
めの、環状リンカーにより修飾された薬剤に直接に結合
する４’−メチル置換フルオレセイン誘導体に関する。

【００５２】好ましい実施態様において、Ｙはピペラジ
ン、ホモピペラジン、および４−アミノメチルピペラジ
ンからなる群から選択され；Ｑは、チロキシン、アセト
アミノフェン、アンフェタミン、およびカルバマゼピン
からなる群から選択される薬剤である。好ましくは、Ｙ
はピペラジンであり、かつＱはアンフェタミンまたはア
セトアミノフェンであるか、あるいはＹはホモピペラジ
ンであり、かつＱはチロキシンであるか、あるいはＹは
４−アミノメチルピペリジンであり、かつＱはカルバマ
ゼピンである。

【００５３】一般に、４’−メチル置換フルオレセイ
ン、好ましくは４’−ヒドロキシメチルフルオレセイン
の、ピペラジン、ホモピペラジンまたはピペリジンから
なる群から選択される環状リンカーを含む薬剤に対する
結合工程は、４’−ヒドロキシメチルフルオレセイン
を、ジメチルホルムアミド中で２，６ルチジンおよびヨ
ウ化ナトリウムの存在下、１２０℃〜１４０℃にて環状
リンカーを含む薬剤またはリガンドと反応させることを
含む。

【００５４】ピペラジンリンカーを含むアンフェタミン
ＦＰトレーサーは、ピペラジン環を有するアンフェタミ
ン誘導体を使用して合成され、（Ｓ）−２，２，２−ト
リフルオロ−Ｎ−［１−メチル−２−［４−（１−ピペ
ラジニルスルホニル）フェニル］エチル］アセタミド
（１７）を、ジメチルホルムアミド中にて２，６−ルチ
ジンおよびヨウ化ナトリウムの存在下で、１２０℃にて
４’−ヒドロキシメチルフルオレセインと反応に付し、
（Ｓ）−Ｎ−［２−［４−［［４−［（３’，６’−ジ
ヒドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１
（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−４’−イル）
メチル］−１−ピペラジニル］スルホニル］フェニル］
−１−メチルエチル］−２，２，２−トリフルオロアセ
タミドを、１：１エピマー混合物（１８）として生じる
（図４）。エタノール中におけるメチルアミンによる脱
保護によって、（Ｓ）−４’［［４−［［４−（２−ア
ミノプロピル）フェニル］スルホニル］−１−ピペラジ
ニル］メチル］−３’，６’−ジヒドロキシスピロ［イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］キサンテ
ン］−３−オン（１：１エピマー）（１９）が生成され
る。

【００５５】ピペラジンリンカーを含むアセトアミノフ
ェンＦＰトレーサーの合成には、出発材料としてｐ−ニ
トロフェノールを使用し、これをメトキシエトキシメチ
ルエーテル（２１）に変換した（図５）。保護されたニ
トロフェノールを、エタノール中で蟻酸アンモニウムお
よび１０％Ｐｄ−Ｃの存在下でアミノに還元し、４−
［（２−メトキシエトキシ）メトキシ］ベンズアミン
（２２）を得る。アミノ基をスクシニル化し、得られる
酸誘導体をピペラジンと結合した。ピペラジン基を含む
アセトアミノフェン誘導体を、４’−ヒドロキシメチル
フルオレセインと結合し、次いでトリフルオロ酢酸の存
在下でのメトキシエトキシメチルエーテルの脱保護によ
り、ｒａｃ−４−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−
オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−
［９Ｈ］キサンテン］−４’−イル）メチル］−Ｎ−
（４−ヒドロキシフェニル）ガンマ−オキソ−１−ピペ
ラジンブタミド（２６）を形成する。

【００５６】非環状リンカーを有するアセトアミノフェ
ンＦＰトレーサーの合成のため、ｐ−ニトロフェノール
をメトキシエトキシメチルエーテルにより保護した（図
６）。ニトロ基をエタノール中で蟻酸アンモニウムおよ
び１０％Ｐｄ−Ｃの存在下でアミノに還元し、４−
［（２−メトキシエトキシ）メトキシ］ベンズアミン
（２２）を得る。アミノ基をスクシニル化し、得られる
酸誘導体を４’−ヒドロキシメチルフルオレセインと結
合した。トリフルオロ酢酸の存在下でのメトキシエトキ
シメチルエーテル（２７）の脱保護により、ｒａｃ−４
−［［［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］キサン
テン］−４’−イル）メチル］アミノ］−Ｎ−（４−ヒ
ドロキシフェニル）−４−オキソブタンアミド（２８）
を生じた。

【００５７】２種類のアセトアミノフェンＦＰトレーサ
ーの性能を、ポリクローナル抗血清（ロット番号Ｐ３
４、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ、カリフォルニア）を使
用して、ＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡ ＩＩ（登録商標）化学
システムにて評価した。環状および非環状リンカーを含
むフルオレセインの４’−位において誘導されたアセト
アミノフェンＦＰトレーサーにより生成された検量線の
比較結果は、例３１に記述される様なアッセイプロトコ
ールを用いて得られ、下記表１に示されている。

【００５８】

【表１】

【００５９】表１に示されるように、環式基を有するア
セトアミノフェントレーサー、ｒａｃ−４−［（３’，
６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾフ
ラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−４’
−イル）メチル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）ガ
ンマ−オキソ−１−ピペラジンブタミド（２６）は、よ
り高いスパン（１５６．７ｍＰ）を有し、従って、非環
状リンカーを含むアセトアミノフェントレーサー、ｒａ
ｃ−４−［［［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ
スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］
キサンテン］−４’−イル）メチル］アミノ］−Ｎ−
（４−ヒドロキシフェニル）−４−オキソブタンアミド
（２８）（スパン、１１２ｍＰ）よりも偏光が大きい。
この結果は、環状リンカーを有するトレーサーが、ＦＰ
ＩＡにおいて選りすぐれた感度および精度を示すことを
例示している。

【００６０】リンカーとしてホモピペラジンを含むチロ
キシンＦＰトレーサーの合成のために、チロキシンをジ
−ｔ−ブチルジカルボネートで処理して、チロキシン誘
導体（３０）を得た（図７）。チロキシン誘導体（３
０）のカルボキシ基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルに活性化し、ホモピペリジンと結合した。ホモ
ピペリジン基を含むチロキシン誘導体（３１）を、４’
−ヒドロキシメチルフルオレセインと接合し、次いで脱
保護して、（２Ｓ）−４’−［４’−［［４−［２−ア
ミノ−３−［４（４−ヒドロキシ−３，５−ジアイオド
フェノキシ）−３，５−ジアイオドフェニル］−１−オ
キソプロピル］−１−ピペラジニル］メチル］−３’，
６’−ジヒドロキシスピロ［イソベンゾフラン−１（３
Ｈ）９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１：１エ
ピマー）（３３）を得た。

【００６１】該チロキシントレーサーを、ポリクローナ
ル抗血清（ＣＯＢＡＳ−ＦＰ試薬番号４４２００）を使
用し、ＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡ ＩＩ（登録商標）化学シ
ステムにより、例３１に示されるものと同様なプロトコ
ールにてＦＰＩＡにより評価した。下記の表２は、環状
リンカーを含む新規チロキシントレーサーを使用して検
量線について得たデータを示す。

【００６２】

【表２】

【００６３】表２に示されるように、新規チロキシント
レーサーの蛍光偏光は、チロキシン標準の増加に伴っ
て、規則的に減少し、試料中のチロキシンの定量測定の
ために好適な標準投与量応答曲線を生じる。従って、こ
のチロキシンＦＰトレーサーは、ＦＰＩＡにおいて有効
な試薬である。

【００６４】環状リンカーピペリジンを含むカルバマゼ
ピンＦＰトレーサーの合成において、Ｎ−カルバモイル
クロライド（３５）を、４−アミノメチルピペリジンと
結合させ、ピペリジン基を含むカルバマゼピン誘導体
（３６）を得た（図８）。このカルバマゼピン誘導体を
４’−ヒドロキシメチルフルオレセインと接合させて、
環状リンカーを含むカルバマゼピン誘導体、Ｎ−［［１
−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）−９’−［９Ｈ］キサ
ンテン］−４’−イル）メチル］−４−ピペリジニル］
メチル］−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−５−カ
ルボキサミド（３７）を得た。

【００６５】フルオレセインと薬剤分子との間の環状リ
ンカーの存在に加えて、フェノール環に隣接するリンカ
ー・アームの位置は、キラル性を生じ、これは薬剤−フ
ルオレセイン全体の回転を妨げてＦＰＩＡにおける標準
曲線の動力学的範囲を改善する。

【００６６】非環状リンカーを有するカルバマゼピンＦ
Ｐトレーサーの調製は、図９に例示されている。イミノ
スチルベンを、アルファ−ブロモアセチルブロマイドと
反応させて、ブロモ誘導体（３８）を得る。該ブロモ誘
導体をアンモニアおよびヨウ化ナトリウムと反応させて
アミノ含有カルバマゼピン誘導体（３９）を得る。該カ
ルバマゼピン誘導体を、５−フルオレセインイソチオシ
アネートと結合させて非環状リンカーを有するカルバマ
ゼピントレーサー、Ｎ−［（５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］
アゼピン−５−イルカルボニル）メチル］−Ｎ’−
３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ［イソベ
ンゾフラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］キサンテン］−
５−イル］チオウレア・二水和物（４０）を得る。

【００６７】カルバマゼピントレーサーを、ポリクロー
ナル抗体（ＣＯＢＡＳ−ＦＰ試薬番号４６２０６）を使
用し、例３１に示すと同様のアッセイプロトコールを使
用してＦＰＩＡにて評価した。環状および非環状リンカ
ーを含むカルバマゼピンＦＰにより生じる標準曲線の対
比は、図３に示される。

【００６８】

【表３】

【００６９】表３のデータは、フルオレセインのフェノ
ール環の一つを置換するカルバマゼピントレーサー（４
０）中の環状リンカーの存在が、フルオレセインの５位
において誘導された非環状リンカーを含むカルバマゼピ
ンＦＰトレーサー（スパン、１３５．９ｍＰ）と比較し
た場合に向上した偏光（スパン、１６７ｍＰ）を与え、
ＦＰＩＡにおいてより高い精度および正確さを与えるこ
とを示している。

【００７０】

【実施例】以下は、本発明の新規な４’−メチル置換フ
ルオレセイン誘導体の合成および蛍光偏光イムノアッセ
イのプロトコールを例示する非限定的な例である。表題
および例１−３０中の化合物の番号は、図１−９に示す
構造式を引用する。

【００７１】全ての溶媒は、特記しない限りＦｉｓｈｅ
ｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｆｉｃ（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌ
ｄ，ＮＪ，米国）から購入した。シリカゲル６０ Ｆ２
５４プレートを使用する薄層クロマトグラフィーおよび
カラムクロマトグラフィー用のフラッシュ級シリカゲル
は、Ｅ．Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，Ｎ
Ｊ，米国）から得た。６−カルボキシフルオレセインお
よび４’−アミノメチルフルオレセインハイドロクロラ
イドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅ
ｎｅ，オレゴン、米国）から購入した。１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｅ
ＤＣ）、Ｌ−チロキシンおよびｄ−アンフェタミンサル
フェートは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ（セントルイス，ＭＯ，米国）から購入した。エ
チル ４−ブロモブチレートおよびジ−ｔ−ブチル ジ
カルボネートは、Ｆｌｕｋａ（スイス）から購入した。
他の全ての化学品は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（ミルウォーキー，ＷＩ，米国）か
ら購入した。

【００７２】例１ ｒａｃ−４’−（ヒドロキシメチル）−３’，６’−ジ
ヒドロキシスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），
９’−［９Ｈ］−キサンテン］−３−オン（２）の調製 ０．３ｍｌのメタンスルホン酸中の５０ｍｇ（０．１５
ｍｍｏｌ）のフルオレセイン溶液に、室温にて１３μｌ
（０．１６ｍｍｏｌ）のクロロメチルメチルエーテルを
添加した。混合物を室温にて４８時間撹拌した。該反応
混合物を、１０ｍｌの氷冷水中に注入した。黄橙色の固
体が沈殿し、これを濾別した。粗生成物を、８：１：１
のクロロホルム：メタノール：トルエンを使用する調製
用薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、２ｍｍ）によ
り精製し、２０ｍｇ（３７％）のｒａｃ−４’−（ヒド
ロキシメチル）−３’，６’−ジヒドロキシスピロ［イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］−キサン
テン］−３−オン（２）を得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭ
Ｓのデータは、化合物の同一性を確認した。化合物
（２）の構造的同定を確認するために、該化合物を対応
するトリアセテートに誘導した。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭ
Ｓのデータは、トリアセテートの同一性を確認した。ト
リアセテートの加水分解は、化合物（２）を生じた。

【００７３】例２ ｒａｃ−４−［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ
スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９
Ｈ］キサンテン］−４’−イル］メチル）−１−ピペラ
ジンカルボン酸−１，１−ジメチルエチルエステル
（３）の調製 ２ｍｌの無水ジメチルホルムアミド中のｒａｃ−４’−
（ヒドロキシメチル）−３’，６’−ジヒドロキシスピ
ロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］−
キサンテン］−３−オン］の溶液に、５０ｍｇ（０．２
６ｍｍｏｌ）のｔ−ブチル ピペラジンカルボキシレー
ト、次いで１００μｌ（０．８５ｍｍｏｌ）の２，６ル
チジンおよび１００ｍｇ（０．６６ｍｍｏｌ）のヨウ化
ナトリウムを添加した。該混合物を１２０℃にて３時間
加熱し、次いで室温まで冷却した。該混合物を減圧下で
濃縮した。残渣を、７：３のクロロホルム：メタノール
を溶離液として使用する調製用薄層クロマトグラフィー
にて精製し、１０ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ、３０％）
のｒａｃ−４−［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキ
ソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９
Ｈ］キサンテン］−４’−イル］メチル）−１−ピペラ
ジンカルボン酸−１，１−ジメチルエチルエステル
（３）を、橙赤色の粉末として得た。ＮＭＲ、ＩＲおよ
びＭＳのデータは、化合物の同一性を確認した。

【００７４】例３ ｒａｃ−３’，６’−ジヒドロキシ−４’−（１−ピペ
ラジニルメチル）スピロ［イソベンゾフラン−１（３
Ｈ），９’−［９Ｈ］−キサンテン］−３−オン（４）
の調製 ５ｍｌのトリフルオロ酢酸中の、４０ｍｇ（０．７５ｍ
ｍｏｌ）のｒａｃ−４−（３’，６’−ジヒドロキシ−
３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），
９’−［９Ｈ］キサンテン］−４’−イル］メチル）−
１−ピペラジンカルボン酸−１，１−ジメチルエチルエ
ステル（３）混合物を、室温にて１５分間撹拌した。該
混合物を減圧下で濃縮した。残留するトリフルオロ酢酸
を、３Ｘ５ｍｌのトルエンを用いて共沸により除去し
た。残る粗生成物を、メタノール中の１％トリエチルア
ミンを使用して薄層クロマトグラフィーにより精製し、
２０ｍｇ（０．４６ｍｍｏｌ、６３％）のｒａｃ−
３’，６’−ジヒドロキシ−４’−（１−ピペラジニル
メチル）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’
−［９Ｈ］−キサンテン］−３−オン（４）を、橙色固
体として得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化
合物の同一性を確認した。

【００７５】例４ テトラヒドロ−３−プロピルピリジン−２（１Ｈ）−オ
ンの調製 ３５ｍｌのテトラヒドロフラン中の、４．２ｇ（４２．
３ｍｍｏｌ）のδ−バレロラクタムの溶液を、アルゴン
雰囲気下で−７８℃に冷却した。この冷却した溶液に、
３２ｍｌのｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中の２．５Ｍ溶液、
８０ｍｍｏｌ）を、４０分間で滴々添加した。該反応混
合物を室温まで暖め、２時間磁気撹拌した。反応混合物
を０℃に冷却し、２０ｍｌのテトラヒドロフラン中の
３．８７ｍｌ（４２．５ｍｍｏｌ）の１−ブロモプロパ
ンを滴々添加した。反応混合物を室温まで暖め、磁気的
に１６時間撹拌した。該反応混合物を７５ｍｌの水にて
処理し、濃縮してテトラヒドロフランを除去した。残渣
を、３Ｘ２００ｍｌのジエチルエーテルにて抽出した。
有機層を合わせ、食塩水にて洗浄し、ＭｇＳＯ₄ にて乾
燥させて白色固体を得、これを石油エーテルから再結晶
して３．２ｇ（２２．６ｍｍｏｌ、５４％）のテトラヒ
ドロ−３−プロピルピリジン−２（１Ｈ）−オン（６）
を得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物の
同一性を確認した。

【００７６】例５ ｒａｃ−５−アミノ−２−プロピルペンタン酸モノハイ
ドロクロライド（７）の調製 ２．０ｇ（１４．１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロ−３−プ
ロピルピリジン−２（１Ｈ）−オン（６）および、１０
ｍｌの６Ｎ塩酸の混合物を、６時間還流させて加熱し、
室温まで冷却し、減圧下で濃縮した。残渣を、２Ｘ５０
ｍｌのトルエンを用いて共沸蒸留することにより、１．
９ｇ（１１．９ｍｍｏｌ、８４％）の５−アミノ−２−
プロピルペンタン酸モノハイドロクロライド（７）を淡
黄色オイルとして得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデー
タは、化合物の同一性を確認した。

【００７７】例６ ｒａｃ−５−アミノ−２−プロピルペンタン酸 １，１
−ジメチルエチルエステル（８）の調製 ７ｍｌのジオキサンの冷却した溶液に、０．７ｍｌの濃
Ｈ₂ ＳＯ₄ を滴々添加した。溶液は紫色に変わった。こ
の溶液に、７００ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ）の５−アミノ
−２−プロピルペンタン酸モノハイドロクロライド
（７）をゆっくり添加し、得られた溶液を圧力容器中に
移した。この溶液に１２ｍｌのイソブチレンを添加し、
得られた溶液を加圧下に、室温で２０時間、磁気的にゆ
っくり撹拌した。反応容器をドライアイスにて冷却し、
圧力を開放し、反応容器を室温まで暖めて過剰量のイソ
ブチレンを蒸発させた。反応混合物を、１００ｍｌの冷
水中に注入した。水性部分を２Ｘ１５０ｍｌのエーテル
にて抽出し、４Ｎ水酸化ナトリウムにてｐＨ１０に塩基
性化し、３Ｘ１００ｍｌの酢酸エチルにて抽出して、３
８０ｍｇ（１．７６ｍｍｏｌ、４９％）のｒａｃ−５−
アミノ−２−プロピルペンタン酸 １，１−ジメチルエ
チルエステル（８）を、オイルとして得た。ＮＭＲ、Ｉ
ＲおよびＭＳのデータは、化合物の同一性を確認した。

【００７８】例７ ｒａｃ−５−［［（４−ニトロフェノキシ）カルボニ
ル］アミノ］−２−プロピル］ペンタン酸−１，１−ジ
メチルエチルエステル（９）の調製 １ｍｌの水および１ｍｌのジクロロメタン中の１６０ｍ
ｇ（０．７４ｍｍｏｌ）のｒａｃ−５−アミノ−２−プ
ロピルペンタン酸 １，１−ジメチルエチルエステル
（８）の懸濁物に、１５３ｍｇ（０．７６ｍｍｏｌ）の
４−ニトロフェニルクロロホルメートおよび２６７ｍｇ
の重炭酸ナトリウムを０℃にて添加した。混合物を室温
にて一夜撹拌し、次いで５０ｍｌのジクロロメタンおよ
び３０ｍｌの水にて希釈した。有機部分を分離した。水
性部分を２Ｘ５０ｍｌのジクロロメタンにて抽出した。
有機部分を合わせ、２Ｘ５０ｍｌの５％重炭酸ナトリウ
ム、次いで５０ｍｌの水にて洗浄し、ＭｇＳＯ₄ にて乾
燥させ、濃縮した。残渣を、１：１の酢酸エチル：ヘキ
サンを溶離液として使用する調製用薄層クロマトグラフ
ィーにより精製し、１８５ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ、６
６％）のｒａｃ−５−［［（４−ニトロフェノキシ）カ
ルボニル］アミノ］−２−プロピル］ペンタン酸−１，
１−ジメチルエチルエステル（９）を、灰色がかった白
色固体として得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータ
は、化合物の同一性を確認した。

【００７９】例８ ５−［［［−４−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−
オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−
［９Ｈ］キサンテン］−４’−イル）メチル］−１−ピ
ペラジニル］カルボニル］アミノ］−２−プロピルペン
タン酸−１，１−ジメチルエチルエステル（１０）の調
製 ２０ｍｇ（０．０５２ｍｍｏｌ）の（３）に、１ｍｌの
ピリジンおよび１ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミドを添
加した。得られた溶液に、２６ｍｇ（０．０６８ｍｍｏ
ｌ）のｒａｃ−５−［［（４−ニトロフェノキシ）カル
ボニル］アミノ］−２−プロピル］ペンタン酸−１，１
−ジメチルエチルエステル（９）を添加した。得られた
混合物を、予め加温された油浴上で１２０℃にて３０分
間、加熱した。該反応混合物を室温まで冷却し、減圧下
で濃縮した。得られた残渣を、１：１の酢酸エチル：ヘ
キサンを使用する調製用薄層クロマトグラフィーにより
精製し、１０ｍｇ（０．０１４ｍｍｏｌ、２８％）の５
−［［［−４−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オ
キソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−
［９Ｈ］キサンテン］−４’−イル）メチル］−１−ピ
ペラジニル］カルボニル］アミノ］−２−プロピルペン
タン酸−１，１−ジメチルエチルエステル（１０）を得
た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物の同一
性を確認した。

【００８０】例９ ５−［［［４−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オ
キソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−
［９Ｈ］−キサンテン］−４’−イル）メチル］−１−
ピペラジニル］カルボニル］アミノ］−２−プロピルペ
ンタン酸（１１）の調製 １５ｍｇ（０．０２２ｍｍｏｌ）の５−［［［−４−
［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ［イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテ
ン］−４’−イル）メチル］−１−ピペラジニル］カル
ボニル］アミノ］−２−プロピルペンタン酸−１，１−
ジメチルエチルエステル（１０）に、２ｍｌのトリフル
オロ酢酸を添加した。該混合物を室温にて１５分間撹拌
した。得られた反応混合物を濃縮し、１０：２の酢酸エ
チル：メタノールを溶離液として使用する薄層クロマト
グラフィーにより精製し、８ｍｇ（０．０１３ｍｍｏ
ｌ、６１％）の５−［［［４−［４−［（３’，６’−
ジヒドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−
１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］−キサンテン］−４’−イ
ル）メチル］−１−ピペラジニル］カルボニル］アミ
ノ］−２−プロピル］ペンタン酸（１１）を得た。ＮＭ
Ｒ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物の同一性を確認
した。

【００８１】例１０ ｒａｃ−５−［［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オ
キソスピロ［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），９’−
［９Ｈ］キサンテン］−６−イル）カルボニル］アミ
ノ］−２−プロピルペンタン酸（１３）の調製 １ｍｌのジメチルホルムアミド中の５０ｍｇ（０．１３
ｍｍｏｌ）の６−カルボキシフルオレセインの溶液を０
℃に冷却した。これに、４０ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）
のジシクロヘキシルカルボジイミド、次いで３０ｍｇ
（０．２６ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド
を添加した。該混合物を、４℃にて２４時間撹拌し、１
ｍｌのピリジンおよび０．３ｍｌの乾燥ジメチルホルム
アミド中の５０ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）の（８）の溶
液を、滴々添加した。該反応混合物を室温にて６時間撹
拌し、濃縮した。残渣を６：４の酢酸エチル：クロロホ
ルムを使用する調製用薄層クロマトグラフィーにより精
製し、８０ｍｇのｒａｃ−５−［［［３’，６’−ジヒ
ドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾ−フラン−１
（３Ｈ），９’［９Ｈ］キサンテン］−６−イル）カル
ボニル］アミノ］−２−プロピル］ペンタン酸 １，１
−ジメチルエチルエステル（１２）得た。８０ｍｇの
（１２）に、３ｍｌのトリフルオロ酢酸を添加し、室温
にて１５分間撹拌した。該反応混合物を濃縮し、調製用
薄層クロマトグラフィー（シリカ、０．２５ｍｍ）によ
り精製して、４２ｍｇ（０．０８１ｍｍｏｌ、６２％）
のｒａｃ−５−［［［３’，６’−ジヒドロキシ−３−
オキソスピロ［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），９’
［９Ｈ］キサンテン］−６−イル）カルボニル］アミ
ノ］−２−プロピルペンタン酸（１３）を得た。ＮＭ
Ｒ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物の同一性を確認
した。

【００８２】例１１ （Ｓ）−Ｎ−（１−メチル−２−フェニルエチル） ト
リフルオロアセタミド（１５）の調製 ５５ｍｌのジクロロメタン中の１０ｇのｄ−アンフェタ
ミンサルフェート（１４）の懸濁物を、５４ｍｌの１Ｎ
水酸化ナトリウムにより処理した。有機層を分離し、水
性層を２Ｘ１００ｍｌのジクロロメタンにより抽出し
た。水性層のｐＨは、約７であった。５ｍｌの１Ｎ 水
酸化ナトリウム溶液を水層に添加した。次いで、水性層
を、２Ｘ５０ｍｌのジクロロメタンにより抽出した。全
ての有機層を合わせ、１００ｍｌの食塩水にて洗浄し、
ＭｇＳＯ₄ にて乾燥させ、濃縮して６．６ｇのアンフェ
タミン遊離塩基を得た。５０ｍｌの蒸留ジクロロメタン
中の６．６ｇ（４８．８ｍｍｏｌ）のアンフェタミン遊
離塩基の溶液に、４０ｍｌの無水トリフルオロ酢酸を、
アルゴン雰囲気下、０℃にて１時間で滴々添加した。該
混合物を室温にて１８時間撹拌した。該混合物に、１ｇ
の氷および２５０ｍｌのエーテルを添加した。有機層
を、２Ｘ１００ｍｌの水、１００ｍｌの飽和酢酸ナトリ
ウム、次いで１００ｍｌの水にて洗浄し、ＭｇＳＯ₄ に
て乾燥させ、８．３５ｇ（３６．７ｍｍｏｌ、７４％）
の（Ｓ）−Ｎ−（１−メチル−２−フェニルエチル）ト
リフルオロアセタミド（１５）を得た。ＮＭＲ、ＩＲお
よびＭＳのデータは、化合物の同一性を確認した。

【００８３】例１２ （Ｓ）−４−［２−［（トリフルオロアセチル）アミ
ノ］プロピル］ベンゼンスルホニルクロライド（１６）
の調製 ２００ｍｌのクロロホルム中の２．０ｇ（８．６４ｍｍ
ｏｌ）の（Ｓ）−Ｎ−（１−メチル−２−フェニルエチ
ル）トリフルオロアセタミド（１５）の溶液に、２４ｍ
ｌのクロロスルホン酸を０℃にて滴々添加した。混合物
を０℃にて４時間撹拌した。反応混合物を１００ｍｌの
氷水に注入し、３Ｘ２００ｍｌのクロロホルムにて抽出
した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムにて乾燥さ
せ、溶媒除去して２．５８ｇ（７．８２ｍｍｏｌ、９０
％）の（Ｓ）−４−［２−［（トリフルオロアセチル）
アミノ］プロピル］ベンゼンスルホニルクロライド（１
６）を白色固体として得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳの
データは、化合物の同一性を確認した。

【００８４】例１３ （Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［１−メチル
−２−［４−（１−ピペラジニルスルホニル）フェニ
ル］エチル］アセタミド（１７）の調製 ８５６ｍｇ（９．９ｍｍｏｌ）のピペラジンに、４０ｍ
ｌの新たに蒸留したテトラヒドロフラン、次いで８５０
μｌ（６．０９ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを添加し
た。混合物を室温にて撹拌した。２５ｍｌの新たに蒸留
したテトラヒドロフラン中の８３０ｍｇ（２．５１ｍｍ
ｏｌ）の（Ｓ）−４−［２−［（トリフルオロアセチ
ル）アミノ］プロピル］ベンゼンスルホニルクロライド
（１６）の溶液を、上記溶液に滴々添加した。該反応混
合物を室温にて１８時間撹拌し、次いで濾過した。濾液
を濃縮し、２００ｍｌの酢酸エチルに溶解し、２Ｘ１０
０ｍｌの水にて洗浄し、ＭｇＳＯ₄ にて乾燥させ、濃縮
した。残渣を、クロロホルム中の１０％メタノールを溶
離液として使用する薄層クロマトグラフィーにより精製
して、７８０ｍｇ（２．０５ｍｍｏｌ、８２％）の
（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［１−メチル
−２−［４−（１−ピペラジニルスルホニル）フェニ
ル］エチル］アセタミド（１７）を得た。ＮＭＲ、ＩＲ
およびＭＳのデータは、化合物の同一性を確認した。

【００８５】例１４ （Ｓ）−Ｎ−［２−［４−［［４−［（３’，６’−ジ
ヒドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１
（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−４’−イル）
メチル］−１−ピペラジニル］スルホニル］フェニル］
−１−メチルエチル］−２，２，２−トリフルオロアセ
タミド（１８）の調製 ６１ｍｇ（０．１６０ｍｍｏｌ）のｒａｃ−４’−（ヒ
ドロキシメチル）−３’，６’−ジヒドロキシスピロ
［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］−キ
サンテン］−３−オン（２）、１２５ｍｇ（０．３３ｍ
ｍｏｌ）の（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−
［１−メチル−２−［４−（１−ピペラジニルスルホニ
ル）フェニル］エチル］アセタミド（１７）、１５０ｍ
ｇ（１．０ｍｍｏｌ）のヨウ化ナトリウム、および４．
５ｍｌの無水ジメチルホルムアミド中の６００μｌ
（５．１５ｍｍｏｌ）の２，６ルチジンの混合物を、１
２０℃にて２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、メタ
ノール：ＴＨＦの１：１混合物を添加した。無機塩を濾
別し、濾液を濃縮した。残渣を、酢酸エチル中の５０％
クロロホルムを使用する薄層クロマトグラフィーにて精
製し、４１ｍｇの（Ｓ）−Ｎ−［２−［４−［［４−
［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ［イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテ
ン］−４’−イル）メチル］−１−ピペラジニル］スル
ホニル］フェニル］−１−メチルエチル］−２，２，２
−トリフルオロアセタミド（１：１エピマー）（１８）
（０．０５６ｍｍｏｌ、３５％）を、橙赤色の粉末とし
て得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物の
同一性を確認した。

【００８６】例１５ （Ｓ）−４’−［［４−［［４−（２−アミノプロピ
ル）フェニル］スルホニル］−１−ピペラジニル］メチ
ル］−３’，６’−ジヒドロキシスピロ［イソベンゾフ
ラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オ
ン（１９）の調製 ３１ｍｇ（０．０４２ｍｍｏｌ）の（Ｓ）−Ｎ−［２−
［４−［［４−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オ
キソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−
［９Ｈ］キサンテン］−４’−イル）メチル］−１−ピ
ペラジニル］スルホニル］フェニル］−１−メチルエチ
ル］−２，２，２−トリフルオロアセタミド（１８）
に、２ｍｌのメタノール、次いで２ｍｌのメタノール中
の飽和メチルアミンを添加した。該混合物を６０℃にて
２４時間加熱し、濃縮した。残渣を、８：２のクロロホ
ルム：メタノールを使用する薄層クロマトグラフィーに
より精製し、１０ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ、３８％）
の（Ｓ）−４’［［４−［［４−（２−アミノプロピ
ル）フェニル］スルホニル］−１−ピペラジニル］メチ
ル］−３’，６’−ジヒドロキシスピロ［イソベンゾフ
ラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オ
ン（１：１エピマー）（１９）を、橙赤色の粉末として
得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物の同
一性を確認した。

【００８７】例１６ １−［２−メトキシエトキシ）メトキシ］−４−ニトロ
ベンゼン（２１）の調製 ２００ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）のナトリウムヒドリド
（油中の６０％分散物）に１０ｍｌのヘキサンを添加し
た。静置した後、ヘキサンをデカントした。残渣に１０
ｍｌの新たに蒸留したテトラヒドロフランを添加し、ス
ラリー混合物を０℃に冷却した。これに、２００ｍｇ
（１．４３ｍｍｏｌ）の４−ニトロフェノール（２０）
を、小分けした固体としてゆっくり添加した。該反応混
合物を０℃にて５分間撹拌し、１９７μｌ（１．７１ｍ
ｍｏｌ）の２−メトキシエトキシメチルクロライドを添
加した。混合物を室温にて１８時間撹拌した。該反応混
合物に、２５ｍｌの水をゆっくり添加し、該反応混合物
を５０ｍｌの酢酸エチルにより希釈した。有機部分を分
離し、水性層を２Ｘ５０ｍｌの酢酸エチルにて抽出し
た。有機層を合わせ、７Ｘ１００ｍｌの飽和炭酸ナトリ
ウム、次いで１００ｍｌの水にて洗浄した。酢酸エチル
層をＭｇＳＯ₄ により乾燥させ、濃縮して２２５ｍｇ
（０．９９ｍｍｏｌ、６９％）の１−［（２−メトキシ
エトキシ）メトキシ］−４−ニトロベンゼン（２１）を
淡黄色オイルとして得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデ
ータは、化合物の同一性を確認した。

【００８８】例１７ ４−［（２−メトキシエトキシ）メトキシ］ベンゼンア
ミン（２２）の調製 ２００ｍｇ（０．８８ｍｍｏｌ）の１−［（２−メトキ
シエトキシ）メトキシ］−４−ニトロベンゼン（２
１）、１００ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃおよび１０ｍｌの無
水エタノール中の５５０ｍｇ（８．７ｍｍｏｌ）の蟻酸
アンモニウムの混合物を、室温にて１８時間撹拌した。
反応混合物を１００ｍｌの無水エタノールにて希釈し、
Ｃｅｌｉｔｅ（商標）の小型パッドを通した。濾液を濃
縮し、８：２の酢酸エチル：ヘキサンを溶離液として使
用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製
し、１３０ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ、７５％）の４−
［（２−メトキシエトキシ）メトキシ］ベンゼンアミン
（２２）を得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、
化合物の同一性を確認した。

【００８９】例１８ ４−［［４−［（２−メトキシエトキシ）メトキシ］フ
ェニル］アミノ］−４−オキソブタン酸（２３）の調製 ８ｍｌのジクロロメタン中の５１０ｍｇ（２．５８ｍｍ
ｏｌ）の４−［（２−メトキシエトキシ）メトキシ］ベ
ンゼンアミン（２２）、および２ｍｌの無水ピリジン
（Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液に、３８０ｍｇ（３．８ｍｍ
ｏｌ）の無水コハク酸を小分けに添加した。該混合物を
室温にて１８時間撹拌した。該反応混合物に２０ｍｌの
メタノールを添加し、混合物を室温にて１８時間撹拌し
た。混合物を濃縮し、８：２のクロロホルム：メタノー
ルを溶離液として使用して調製用薄層クロマトグラフィ
ーにより精製し、４２０ｍｇ（１．４１ｍｍｏｌ、５５
％）の４−［［４−［（２−メトキシエトキシ）メトキ
シ］フェニルアミノ］−４−オキソブタン酸（２３）を
得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物の同
一性を確認した。

【００９０】例１９ Ｎ−［４−［（２−メトキシエトキシ）メトキシ］フェ
ニル］−ガンマ−オキソ−１−ピペラジンブタミド（２
４）の調製 ８ｍｌの無水ジメチルホルムアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）
中の４０７ｍｇ（１．３６ｍｍｏｌ）の４−［［４−
［（２−メトキシエトキシ）メトキシ］フェニルアミ
ノ］−４−オキソブタン酸（２３）の溶液に、０℃にて
３３９ｍｇ（１．６４ｍｍｏｌ）のジシクロヘキシルカ
ルボジイミドおよび２３６ｍｇ（２．０５ｍｍｏｌ）の
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを添加した。混合物を４
℃にて１８時間撹拌した。活性化エステルを、単離する
ことなくその場で続く反応に使用した。２０ｍｌの新た
に蒸留したテトラヒドロフラン中の、１．４ｇ（１６．
２ｍｍｏｌ）のピペラジンの溶液に、１．５ｍｌのトリ
エチルアミンを添加した。この混合物に、先に調製した
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液を室温にて
滴下添加し、混合物を室温にて２日間、磁気的に撹拌し
た。該反応混合物を濃縮した。残渣を、６：４の酢酸エ
チル：メタノールを使用するシリカゲルカラムクロマト
グラフィーにより精製して、３８４ｍｇ（１．０５ｍｍ
ｏｌ、７７％）のＮ−［４−［（２−メトキシエトキ
シ）メトキシ］フェニル］−ガンマ−オキソ−１−ピペ
ラジンブタミド（２４）を得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭ
Ｓのデータは、化合物の同一性を確認した。

【００９１】例２０ ｒａｃ−４−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキ
ソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９
Ｈ］キサンテン］−４’−イル）メチル］−Ｎ−（４−
ヒドロキシフェニル）−ガンマ−オキソ−１−ピペラジ
ンブタミド（２６）の調製 ２．５ｍｌのジメチルホルムアミド中の、３０ｍｇ
（０．０８２ｍｍｏｌ）のＮ−［４−［（２−メトキシ
エトキシ）メトキシ］フェニル］−ガンマ−オキソ−１
−ピペラジンブタミド（２４）および３５ｍｇ（０．０
９１ｍｍｏｌ）のｒａｃ−４’−（ヒドロキシメチル）
−３’，６’−ジヒドロキシスピロ［イソベンゾフラン
−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］−キサンテン］−３−オ
ン（２）の混合物に、２５０μｌ（２．１４ｍｍｏｌ）
の２，６−ルチジンおよび１００ｍｇ（０．６６ｍｍｏ
ｌ）のヨウ化ナトリウムを添加した。該混合物を、アル
ゴン雰囲気下で１４０℃にて３時間加熱した。反応を、
９：１クロロホルム：メタノールを溶離液として使用す
る薄層クロマトグラフィーによりモニターし、これは、
有意な量のＮ−［４−［（２−メトキシエトキシ）メト
キシ］フェニル］−ガンマ−オキソ−１−ピペラジンブ
タミド（２４）と共に新たな生成物の存在を示した。該
反応混合物に、追加の２５ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ）
の化合物（２）を添加し、該混合物を更に２．５時間加
熱した。該反応混合物を濃縮し、調製用薄層クロマトグ
ラフィーにより２回精製して、１５ｍｇ（０．０２１ｍ
ｍｏｌ、２６％）のｒａｃ−４−［（３’，６’−ジヒ
ドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１
（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−４’−イル）
メチル］−Ｎ−［［４−（２−メトキシエトキシ）メト
キシ］フェニル］−ガンマ−オキソ−１−ピペラジンブ
タミド（２５）を得た。１５ｍｇ（０．０２１ｍｍｏ
ｌ）の（２５）に、３ｍｌのトリフルオロ酢酸を添加
し、該混合物を室温にて３０分間撹拌した。得られた反
応混合物を濃縮し、９：１のクロロホルム：メタノール
を溶離液として使用して、薄層クロマトグラフィーによ
り精製して、７ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ、５４％）の
ｒａｃ−４−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキ
ソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９
Ｈ］キサンテン］−４’−イル）メチル］−Ｎ−（４−
ヒドロキシフェニル）−ガンマ−オキソ−１−ピペラジ
ンブタミド（２６）を得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳの
データは、化合物の同一性を確認した。

【００９２】例２１ ｒａｃ−４−［［［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オ
キソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−［９
Ｈ］キサンテン］−４’−イル）メチル］アミノ］−Ｎ
−（４−ヒドロキシフェニル）−４−オキソブタンアミ
ド（２８）の調製 ２．５ｍｌの無水ジメチルホルムアミド中の１２０ｍｇ
（０．４０ｍｍｏｌ）の４−［［４−［（２−メトキシ
エトキシ）メトキシ］フェニル］アミノ］−４−オキソ
ブタン酸（２３）の溶液に、８３ｍｇ（０．４０ｍｍｏ
ｌ）のジシクロヘキシル−カルボジイミドおよび６０ｍ
ｇ（０．５２ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドを、アルゴン雰囲気下で０℃にて添加した。得られた
混合物を４℃にて２４時間撹拌した。その場にて生成さ
れたＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、２ｍｌ
の乾燥ピリジン中の２５ｍｇ（０．０６２ｍｍｏｌ）の
４’−アミノメチルフルオレセインハイドロクロライド
の磁気的に撹拌される溶液に、アルゴン雰囲気下で滴々
添加した。得られた混合物を室温にて４８時間撹拌し、
減圧下で濃縮し、１５ｍｇ（０．０２３ｍｍｏｌ、３８
％）のｒａｃ−４−［３’，６’−ジヒドロキシ−３−
オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−
［９Ｈ］キサンテン］−４−イル）メチル］アミノ］−
Ｎ−［（４−［（２−メトキシエトキシ）メトキシ］フ
ェニル］−４−オキソブタンアミド（２７）を、橙色の
残渣として得た。１５ｍｇ（０．０２３ｍｍｏｌ）の
（２７）に３ｍｌのトリフルオロ酢酸を添加し、該混合
物を室温にて３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、
８：２のクロロホルム：メタノールを使用して薄層クロ
マトグラフィーにより生成し、８ｍｇ（０．０１４ｍｍ
ｏｌ、６７％）のｒａｃ−４−［［［３’，６’−ジヒ
ドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１
（３Ｈ）９’−［９Ｈ］キサンテン］−４’−イル）メ
チル］アミノ］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−４
−オキソブタンアミド（２８）を橙色の粉末として得
た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物の同一
性を確認した。

【００９３】例２２ （Ｓ）−４−［（４−ヒドロキシ−３，５−ジアイオ
ド）フェノキシ−３，５−ジアイオド］−α−
［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミ
ノ］ベンゼンプロパン酸（３０）の調製 １８ｍｌのジメチルホルムアミド中の４．５ｇ（５．８
ｍｍｏｌ）のＬ−チロキシン（２９）、４９５ｍｇ
（５．９ｍｍｏｌ）の重炭酸ナトリウムおよび１８ｍｌ
の水の磁気的に撹拌される混合物に、１８ｍｌのジメチ
ルホルムアミド中の１．２８ｇ（５．８ｍｍｏｌ）のジ
−ｔ−ブチルジカルボネートを滴々添加した。得られた
反応混合物を、４時間撹拌し、次いで高真空下で室温に
て濃縮した。残渣に４５ｍｌのメタノールを添加し、不
溶性の物質を濾別した。濾液に、１Ｎ塩酸（２０ｍｌ）
を沈殿生成が完了するまで添加した。固体を濾別し、空
気乾燥して４．２ｇ（４．８ｍｍｏｌ、８３％）の
（Ｓ）−４−［（４−ヒドロキシ−３，５−ジアイオ
ド）フェノキシ−３，５−ジアイオド］−α−
［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミ
ノ］ベンゼンプロパン酸（３０）を灰色がかった粉末と
して得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物
の同一性を確認した。

【００９４】例２３ （Ｓ）−［１−［（ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジア
ゼピン−１−イル）カルボニル］−２−［４−［（４−
ヒドロキシ−３，５−ジアイオド）フェノキシ］−３，
５−ジアイオドフェニル］エチル］カルバミン酸 １，
１−ジメチルエチルエステル（３１） ５５ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド（Ａｌｄｒｉｃｈ
密封、９９％）中の、１．８ｇ（２．０５ｍｍｏｌ）の
（Ｓ）−４−［（４−ヒドロキシ−３，５−ジアイオ
ド）フェノキシ−３，５−ジアイオドフェニル］−α−
［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミ
ノ］ベンゼンプロパン酸（３０）の磁気的に撹拌される
溶液に、５３９ｍｇ（４．６８ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド、次いで１．０２ｇ（５．３２ｍｍ
ｏｌ）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドを負荷した。混合物を室温にて２．
５時間撹拌し、次いで２０ｍｌの乾燥ピリジン中の３．
６ｇ（３６ｍｍｏｌ）のホモピペラジン溶液を、２５分
間で滴々添加した。得られた反応混合物を室温にて一夜
撹拌し、高真空下で濃縮した。得られたゴム状残渣に、
２５０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウム溶液を添加した。混
合物を濾過して２．５ｇの灰色がかった固体粗生成物を
得た。固体を、１：１のメタノール：クロロホルムを使
用するフラッシュカラムクロマトグラフィーにて精製
し、１．３ｇ（１．３５ｍｍｏｌ、６６％）の（Ｓ）−
［１−［（ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン−
１−イル）カルボニル］−２−［４−［（４−ヒドロキ
シ−３，５−ジアイオド）フェノキシ−３，５−ジアイ
オドフェニル］エチル］カルバミン酸 １，１−ジメチ
ルエチルエステル（３１）を、灰色がかった白色固体と
して得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物
の同一性を確認した。

【００９５】例２４ （２Ｓ）−４’−［［４−［２−アミノ−３−［４−
（４−ヒドロキシ−３，５−ジアイオドフェノキシ）−
３，５−ジアイオドフェニル］−１−オキソプロピル］
−１−ピペラジニル］メチル］−３’，６’−ジヒドロ
キシ−スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−
［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１：１エピマー）
（３３）の調製 ２ｍｌの無水ジメチルホルムアミド中の１２６ｍｇ
（０．１３１ｍｍｏｌ）の（Ｓ）−［１−［（ヘキサヒ
ドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン−１−イル）カルボニ
ル］−２−［４−［（４−ヒドロキシ−３，５−ジアイ
オド）フェノキシ−３，５−ジアイオドフェニル］エチ
ル］カルバミン酸 １，１−ジメチルエチルエステル
（３１）の溶液に、４００μｌ（３．４ｍｍｏｌ）の
２，６−ルチジン、２００ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）のヨ
ウ化ナトリウム、次いで５０ｍｇ（１３１ｍｍｏｌ）の
ｒａｃ−４’−（ヒドロキシメチル）−３’，６’−ジ
ヒドロキシスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），
９’−［９Ｈ］−キサンテン］−３−オン（２）を添加
した。混合物を１３０℃にて３時間加熱し、減圧下で濃
縮して、５２ｍｇ（０．０４８ｍｍｏｌ、３７％）の
（２Ｓ）−４’−［４’−［［４−［２−［（１，１−
ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ−３−［４（４
−ヒドロキシ−３，５−ジアイオドフェノキシ）−３，
５−ジアイオドフェニル］−１−オキソプロピル］−１
−ピペラジニル］メチル］−３’，６’−ジヒドロキシ
スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］
キサンテン］−３−オン（３２）を残渣として得た。５
２ｍｇ（０．０４８ｍｍｏｌ）の（３２）に、３ｍｌの
トリフルオロ酢酸を添加した。混合物を室温にて５分間
撹拌し、濃縮した。残渣を、８：２のクロロホルム：メ
タノールを使用して、調製用薄層クロマトグラフィーに
より２回精製し、１５ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ、２４
％）の（２Ｓ）−４’−［［４−［２−アミノ−３−
［４−（４−ヒドロキシ−３，５−ジアイオドフェノキ
シ）−３，５−ジアイオドフェニル］−１−オキソプロ
ピル］−１−ピペラジニル］メチル］−３’，６’−ジ
ヒドロキシ−スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）
９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オン（１：１エピマ
ー）（３３）を橙色粉末として得た。ＮＭＲ、ＩＲおよ
びＭＳのデータは、化合物の同一性を確認した。

【００９６】例２５ ５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン−５−カルボニルク
ロライド（３５）の調製 １００ｍｌのジクロロメタン中の２．８ｇのイミノスチ
ルベンの溶液を、１．５ｇのトリホスゲン、次いで３ｍ
ｌのピリジンにて処理し、室温にて一夜撹拌した。４０
％酢酸エチル−ヘキサンでの薄層クロマトグラフィー
は、一つの生成物の形成を示した。反応混合物を水にて
洗浄し、減圧下で濃縮した。残渣を１０％のエーテル／
ジクロロメタンを使用するクロマトグラフィーにかけ
て、３．２ｇの５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン−５
−カルボニルクロライド（３５）を、灰白色の粉末とし
て得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物の
同一性を確認した。

【００９７】例２６ Ｎ−（４−ピペリジニルメチル）−５Ｈ−ジベンズ
［ｂ，ｆ］アゼピン−５−カルボキサミド（３６）の調
製 １５ｍｌの無水ジメチルホルムアミド中の５１１ｍｇ
（２ｍｍｏｌ）の５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン−
５−カルボニルクロライド（３５）の溶液に、２８０μ
ｌのトリエチルアミン、次いで２．３ｇ（２．０ｍｍｏ
ｌ）の４−アミノメチルピペリジンを添加した。混合物
を室温にて一夜撹拌し、減圧下で濃縮した。残渣に２０
０ｍｌのジクロロメタンおよび１５０ｍｌの飽和重炭酸
ナトリウム溶液を添加した。有機層を分離し、水性層を
２Ｘ１００ｍｌのジクロロメタンにより抽出した。有機
層を合わせ、ＭｇＳＯ₄ により乾燥させて粗生成物を
得、これを９．５：０．５のメタノール：濃水酸化アン
モニウムを使用する薄層クロマトグラフィーにより精製
して、２種類の異性体生成物を得た。移動速度が遅い成
分を単離して、３５０ｍｇ（１．０４ｍｍｏｌ、５３
％）のＮ−（４−ピペリジニルメチル）−５Ｈ−ジベン
ズ［ｂ，ｆ］アゼピン−５−カルボキサミド（３６）を
灰白色の固体として得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデ
ータは、化合物の同一性を確認した。

【００９８】例２７ Ｎ−［［１−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキ
ソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）−９’−［９
Ｈ］キサンテン］−４’−イル）メチル］−４−ピペリ
ジニル］メチル］−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン
−５−カルボキサミド（３７）の調製 ３ｍｌの無水ジメチルホルムアミド中の３５ｍｇ（０．
１０４ｍｍｏｌ）のＮ−（４−ピペラジニルメチル）−
５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン−５−カルボキサミ
ド（３６）の溶液に、２００μｌ（１．７１ｍｍｏｌ）
の２，６−ルチジン、２００ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）の
ヨウ化ナトリウム、次いで４０ｍｇ（０．１０５ｍｍｏ
ｌ）のｒａｃ−４’−（ヒドロキシメチル）−３’，
６’−ジヒドロキシスピロ［イソベンゾフラン−１（３
Ｈ），９’−［９Ｈ］−キサンテン］−３−オン（２）
を添加した。混合物を１４０℃にて３時間撹拌し、減圧
下で濃縮した。残渣を、７：３：１の酢酸エチル：クロ
ロホルム：メタノールを溶離液として使用する薄層クロ
マトグラフィーにて精製し、不純物を含んだ橙色の生成
物を得た。これを、８：２のクロロホルム：メタノール
を溶離液として使用する薄層クロマトグラフィーにて精
製し、１５ｍｇ（０．０２２ｍｍｏｌ、２１％）のＮ−
［［１−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソス
ピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）−９’−［９Ｈ］
キサンテン］−４’−イル）メチル］−４−ピペリジニ
ル］メチル］−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−５
−カルボキサミド（３７）を橙色の粉末として得た。Ｎ
ＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物の同一性を確
認した。

【００９９】例２８ Ｎ−ブロモアセチルイミノスチルベン（３８）の調製 ２５０ｍｌクロロホルム中の６．０ｇ（０．０３ｍｍｏ
ｌ）のイミノスチルベンの溶液を、１００ｍｌの水中の
１０ｇ（０．０９ｍｍｏｌ）の炭酸ナトリウム溶液に添
加し、混合物を急速に撹拌した。この急速に撹拌される
溶液に、６．２ｇ（０．０３ｍｍｏｌ）のブロモアセチ
ルブロマイドを、滴下ロートにて滴々添加し、この時点
では２：１のＴＨＦ：ヘキサンを使用する薄層クロマト
グラフィー分析は反応が未完結であることを示した。追
加の１．０ｇ（０．００５ｍｏｌｅ）のブロモアセチル
ブロマイドを添加した。薄層クロマトグラフィーは、出
発材料が全部消費されたことを示した。クロロホルム層
を分離し、Ｎａ₂ ＳＯ₄ により乾燥させ、濃縮して、１
１．０ｇのＮ−ブロモアセチルイミノスチルベン（３
８）を淡黄色オイルとして得た。この材料は引き続く反
応に使用された。

【０１００】例２９ ５−（アミノアセチル）−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］ア
ゼピン−ハイドロクロライド（３９）の調製 ２５ｍｌのクロロホルム中の２．２ｇ（７ｍｍｏｌ）の
粗製のＮ−ブロモアセチルイミノスチルベン（３８）の
溶液を、２５０ｍｌの凝縮液体アンモニアに、−３３℃
にて注意して添加した。反応混合物に、６．０ｇ（４０
ｍｍｏｌ）のヨウ化ナトリウムを添加し、混合物を−３
３℃にて２時間撹拌し、一夜蒸発させた。水−白色油状
溶液が残り、これに５０ｍｌの水を添加した。溶液を２
Ｘ１５０ｍｌのクロロホルムにて抽出した。溶媒をＮａ
₂ ＳＯ₄ により乾燥させ、蒸発させて透明なオイルを
得、これを塩酸で飽和した２５ｍｌのメタノール中に溶
解させた。得られた溶液を濃縮し、２５ｍｌのアセトニ
トリルを添加した。沈殿する固体物質を集め、１０ｍｌ
のアセトニトリルにて洗浄した。メタノール／エーテル
での再結晶は、１．８ｇ（６．２ｍｍｏｌ、９０％）の
５−（アミノアセチル）−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］ア
ゼピン−ハイドロクロライド（３９）を与えた。ＮＭ
Ｒ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物の同一性を確認
した。

【０１０１】例３０ Ｎ−［（５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン−５−イル
カルボニル）メチル］−Ｎ’−３’，６’−ジヒドロキ
シ−３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）
９’−［９Ｈ］キサンテン］−５−イル］チオウレア・
二水和物（４０）の調製 ７５ｍｌの乾燥メタノールおよび７５ｍｌの乾燥テトラ
ヒドロフランの混合物中の１．０ｇ（４ｍｍｏｌ）の５
−（アミノアセチル）−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼ
ピン−ハイドロクロライド（３９）の溶液を、１．４ｇ
（３．６ｍｍｏｌ）の５−フルオレセイン イソチオシ
アネート（異性体Ｉ）にて処理し、室温にて一夜撹拌し
た。溶媒を減圧下で除去し、残渣をクロロホルム中の１
２％メタノールを溶離液として使用するカラムクロマト
グラフィーにより精製して、８００ｍｇ（１．１８ｍｍ
ｏｌ、３５％）のＮ−［（５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］ア
ゼピン−５−イルカルボニル）メチル］−Ｎ’−３’，
６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾフ
ラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］キサンテン］−５−イ
ル］チオウレア・二水和物（４０）を、赤色固体として
得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳのデータは、化合物の同
一性を確認した。

【０１０２】例３１ 本発明の新規４’−メチルフルオレセイントレーサーを
使用する蛍光偏光イムノアッセイ 本発明の新規化合物の性能を、自動化ＣＯＢＡＳ ＦＡ
ＲＡ（登録商標）ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒ
ｇ，ＮＪ，米国）により、装置の操作マニュアルに従っ
てアッセイ試薬およびプロトコールを使用して測定し
た。例示のために、装置を、血清または血漿試料中のア
セトアミノフェンについての蛍光偏光測定に適合させ
た。

【０１０３】試薬構成： ａ）抗体試薬 ０．１％ナトリウムアジドおよび０．１％ウシガンマグ
ロブリンを含む０．１Ｍリン酸緩衝溶液ｐＨ７．５；抗
体は１：５〜１：４０に希釈 ｂ）トレーサー試薬 ０．１％ウシガンマグロブリンおよび０．１％ナトリウ
ムアジドを含む０．１Ｍリン酸緩衝溶液ｐＨ７．５；５
Ｘ１０^-7Ｍのトレーサー ｃ）アセトアミノフェン標準：正常ヒト血清中のアセト
アミノフェン０、１０、２０、５０、１００および２０
０μｇ／ｍｌの溶液

【０１０４】上記例に記述されたアセトアミノフェント
レーサーの各試料について； １）２００μｌの抗体試薬を３０μｌの標準溶液と混
合； ２）背景偏光の読み取りを行う； ３）５．２μｌのトレーサー試薬を添加； ４）混合物を３０秒間インキュベートする； ５）偏光の読み取りを行う；および ６）トレーサーのスパンを計算する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、出発材料、並びに４’−ヒドロキシ
メチルフルオレセイン：［ｒａｃ−４’−（ヒドロキシ
メチル）−３’，６’−ジヒドロキシスピロ［イソベン
ゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］−キサンテン］
−３−オン］（２）および４’−ピペラジニルメチルフ
ルオレセイン：［ｒａｃ−３’，６’−ジヒドロキシ−
４’−（１−ピペラジニルメチル）スピロ［イソベンゾ
フラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］−キサンテン］−
３−オン］（４）の合成に関連する中間体の式を表すフ
ローチャート。

【図２】 図２は、出発材料、並びに環状リンカー含有
バルプロン酸ＰＦトレーサーである（５−［［［４−
［４−［（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピ
ロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］−
キサンテン］−４’−イル）メチル］−１−ピペラジニ
ル］−カルボニル］アミノ］−２−プロピル］ペンタン
酸（１１）の合成に関連する中間体の式を表すフローチ
ャート。

【図３】 図３は、出発材料、並びに非環状リンカー含
有バルプロン酸ＰＦトレーサーであるｒａｃ−５−
［［［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），９’［９Ｈ］キサ
ンテン］−６−イル）カルボニル］アミノ］−２−プロ
ピルペンタン酸（１３）の合成に関連する中間体の式を
表すフローチャート。

【図４】 図４は、出発材料、並びにピペラジンを環状
リンカーとして含有するアンフェタミンＰＦトレーサー
である（Ｓ）−４’［［４−［［４−（２−アミノプロ
ピル）−フェニル）フェニル］スルホニル］−１−ピペ
ラジニル］メチル］−３’，６’−ジヒドロキシスピロ
［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］キサン
テン］−３−オン（１：１エピマー）（１９）の合成に
関連する中間体の式を表すフローチャート。

【図５】 図５は、出発材料、並びに環状リンカーを含
有するアセトアミノフェンＰＦトレーサーである［ｒａ
ｃ−４−［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピ
ロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キ
サンテン］−４’−イル）メチル］−Ｎ−（４−ヒドロ
キシフェニル）−ガンマ−オキソ−１−ピペラジンブタ
ミド（２６）の合成に関連する中間体の式を表すフロー
チャート。

【図６】 図６は、出発材料、並びに非環状リンカーを
含有するアセトアミノフェンＰＦトレーサーである［ｒ
ａｃ−４−［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソス
ピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］キ
サンテン］−４’−イル）メチル］アミノ］−Ｎ−（４
−ヒドロキシフェニル）−４−オキソブタンアミド（２
８）の合成に関連する中間体の式を表すフローチャー
ト。

【図７】 図７は、出発材料、並びに環状リンカーを含
有するチロキシンＰＦトレーサーである［（２Ｓ）−
４’−［［４−［２−アミノ−３−［４（４−ヒドロキ
シ−３，５−ジアイオドフェノキシ）−３，５−ジアイ
オドフェニル］−１−オキソプロピル］−１−ピペラジ
ニル］メチル］−３’，６’−ジヒドロキシスピロ［イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−［９Ｈ］キサンテ
ン］−３−オン（１：１エピマー）（３３）の合成に関
連する中間体の式を表すフローチャート。

【図８】 図８は、出発材料、並びに環状リンカーを含
有するカルバマゼピンＰＦトレーサーである［Ｎ−
［［［１−［３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソス
ピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）−９’−［９Ｈ］
キサンテン］−４’−イル）メチル］−４−ピペリジニ
ル］メチル］−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−５
−カルボキサミド（３７）の合成に関連する中間体の式
を表すフローチャート。

【図９】 図９は、出発材料、並びに非環状リンカーを
含有するカルバマゼピンＰＦトレーサーであるＮ−
［（５Ｈジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン−５−イルカルボ
ニル）メチル］−Ｎ−３’，６’−ジヒドロキシ−３−
オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ）９’−
［９Ｈ］キサンテン］−５−イル］チオウレア・二水和
物（４０）の合成に関連する中間体の式を表すフローチ
ャート。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 サルバトール ジョセフ サラモン アメリカ合衆国ニュージャージー州ストッ クトン，ヤード ロード 67 (72)発明者 ロバート サンドロ ウ アメリカ合衆国ニュージャージー州ウエス ト オレンジ，ラルフ ロード 25

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式、 【化１】 式中、Ｘはハロゲン、ヒドロキシまたは式−Ｏ−ＳＯ₂
   −Ｒを有するスルホネートエステルからなる群から選択
   され、ここでＲは、−Ｃ₆ Ｈ₄ −ＣＨ₃ またはＣＨ₃ で
   ある、を有する化合物。
2. 【請求項２】 Ｘが、ヒドロキシである請求項１に記載
   の化合物。
3. 【請求項３】 式、 【化２】 式中、Ｒ₁ はＨまたは薬剤誘導体である、を有する化合
   物。
4. 【請求項４】 Ｒ₁ がＨである請求項３に記載の化合
   物。
5. 【請求項５】 Ｒ₁ がバルプロン酸（ｖａｌｐｒｏｉｃ
   ａｃｉｄ）または式、 【化３】 を有するバルプロン酸誘導体である請求項３に記載の化
   合物。
6. 【請求項６】 式、 【化４】 式中、Ｙはピペラジン、ホモピペラジン、４−アミノメ
   チルピペリジン、４−カルボキシピペリジン、プロリン
   および３−カルボキシジヒドロピリジンからなる群から
   選択される環状リンカーであり；Ｑは、薬剤、治療薬ま
   たは環境汚染物である、を有する化合物。
7. 【請求項７】 Ｑが、アンフェタミン、アセトアミノフ
   ェン、チロキシンおよびカルバマゼピンからなる群から
   選択される薬剤である請求項６に記載の化合物。
8. 【請求項８】 Ｙがピペラジンであり、Ｑがアンフェタ
   ミンまたはアセトアミノフェンである請求項６に記載の
   化合物。
9. 【請求項９】 Ｙがホモピペラジンであり、Ｑがチロキ
   シンである請求項６に記載の化合物。
10. 【請求項１０】 Ｙが４−アミノメチルピペラジンであ
    り、Ｑがカルバマゼピンである請求項６に記載の化合
    物。