JPH1036341A - Hapten compound of 4-methylthio-3,5-xylyl methylcarbamate, antibody and measurement - Google Patents
Hapten compound of 4-methylthio-3,5-xylyl methylcarbamate, antibody and measurementInfo
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- JPH1036341A JPH1036341A JP8189085A JP18908596A JPH1036341A JP H1036341 A JPH1036341 A JP H1036341A JP 8189085 A JP8189085 A JP 8189085A JP 18908596 A JP18908596 A JP 18908596A JP H1036341 A JPH1036341 A JP H1036341A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【本発明の属する技術分野】本発明は、4−メチルチオ
−3,5−キシリル メチルカルバマートのハプテン化
合物、抗原、抗体およびそのフラグメントに関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a hapten compound of 4-methylthio-3,5-xylylmethylcarbamate, an antigen, an antibody and a fragment thereof.
【0002】本発明はさらに、前記抗原または抗体もし
くはそのフラグメントを用いた免疫化学的測定方法に関
する。[0002] The present invention further relates to an immunochemical assay method using the antigen or antibody or a fragment thereof.
【0003】[0003]
【従来の技術】4−メチルチオ−3,5−キシリル メ
チルカルバマートは、以下の化学式II2. Description of the Related Art 4-Methylthio-3,5-xylylmethyl carbamate has the following chemical formula II
【化5】 で表される構造を有するカルバマート剤で、殺虫剤、殺
ダニ剤、殺ナメクジ剤として広く使用されている。一般
名をメチオカルブといい、ドイツのバイエル社によって
開発され、Draza、Mesurol等の商品名で市
販されている。メチオカルブは、果実や野菜等に発生す
るリン翅目、甲虫目、双翅目、同翅目、アザミウマ等の
害虫やダニ類・クモ類に対して優れた殺虫・殺ダニの活
性スペクトルを有し、またナメクジ、かたつむりなどの
駆除にも効果的に使用されている。Embedded image This is a carbamate having the structure represented by the following formula and is widely used as an insecticide, acaricide, and a slug. The generic name is methiocarb, developed by Bayer AG in Germany and marketed under the trade names Draza, Mesurol and the like. Methiocarb has an excellent insecticidal and acaricidal activity spectrum against insects and mites and arachnids such as insects such as the order Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Homoptera and Thrips which occur in fruits and vegetables. It is also used effectively to eliminate slugs and snails.
【0004】このようにメチオカルブは広く使用されて
いる有効な殺虫剤であるが、比較的毒性の高い化合物で
ある。また、本明細書に参考文献として取り込まれる
「ThePesticide Manual」,TENTH EDITION, Crop Prote
ction Publications によれば、メチオカルブのADI
は0.001mg/kg体重である。Although methiocarb is a widely used effective insecticide, it is a relatively toxic compound. Also incorporated herein by reference.
"ThePesticide Manual", TENTH EDITION, Crop Prote
According to ction Publications, ADI of methiocarb
Is 0.001 mg / kg body weight.
【0005】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。メチオカルブについても以下のように食品に残留す
る基準値が定められている:穀類、豆類、なたね、ナッ
ツ類(0.05ppm)、野菜類、果実類(0.05−
0.1ppm、ももは3ppm)(最新農薬の残留分析
法 農薬残留分析法研究班編集 中央法規出版)。環境
や食品に関する安全確保のためには、これらに含有され
るメチオカルブの量を迅速、かつ正確に測定することが
必要である。[0005] In recent years, there has been great social interest in pesticide residues in the environment such as soil, water, and the atmosphere, and post-harvest pesticides in imported agricultural products, which have recently increased in particular. For methiocarb, the standard values remaining in food are defined as follows: cereals, beans, rapeseed, nuts (0.05 ppm), vegetables, fruits (0.05-
0.1 ppm, 3 ppm in peach) (Edited by the latest pesticide residue analysis method Pesticide Residue Analysis Research Group) In order to ensure the safety of the environment and food, it is necessary to measure the amount of methiocarb contained therein quickly and accurately.
【0006】従来メチオカルブは、穀類、豆類、野菜、
果実等の試料から抽出した抽出物をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーで精製後、高速液体クロマトグラフィ
ー(HPLC)により分析されてきた。例えば、試料を
アセトンで抽出してジクロロメタン−ヘキサン(1:
1)に転溶し、更にその転溶物をヘキサン−アセトニト
リル分配して得たアセトニトリル層を濃縮してシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーで精製する。その溶出物を
オンラインでアルカリ加水分解後にo−フタルアルデヒ
ド(OPA)により蛍光性化合物に誘導体化できるポス
トカラムの高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で
分析する方法が採用されている。これらの方法は、試料
の調製が煩雑で多大の手間と時間を必要とし、分析に熟
練を有すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費
用を必要とする等の問題点がある。メチオカルブの測定
は、特に輸入農産物等の残留農薬の分析においては、短
時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精
度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備し
たメチオカルブの新規測定法が要求されてきている。Conventionally, methiocarb has been used for cereals, beans, vegetables,
Extracts extracted from samples such as fruits have been analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) after purification by silica gel column chromatography. For example, a sample is extracted with acetone, and dichloromethane-hexane (1: 1:
The acetonitrile layer obtained by dissolving the transferred substance in hexane-acetonitrile is concentrated and purified by silica gel column chromatography. A method has been adopted in which the eluate is analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC) using a post column that can be derivatized to a fluorescent compound with o-phthalaldehyde (OPA) after alkaline hydrolysis online. These methods have the problems that the preparation of the sample is complicated, requires a great deal of labor and time, has a high level of skill in analysis, and requires high costs for measuring devices and equipment. Measurement of methiocarb, especially in the analysis of residual agricultural chemicals such as imported agricultural products, requires the analysis of a huge number of samples in a short period of time, and is not only accurate but also simple, quick and economical. There is a need for a new method for measuring the provided methiocarb.
【0007】免疫化学測定法は、抗体が抗原を特異的に
認識する、抗原−抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫化学測定法におい
ては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵素、
放射性トレーサー、化学発光性および蛍光性標識、金属
原子およびゾル、安定遊離基、ラテックスならびにバク
テリオファージが適用されてきた。The immunochemical assay is a method for detecting an antigen based on an antigen-antibody reaction in which the antibody specifically recognizes the antigen. Due to its excellent accuracy, simplicity, rapidity, and economic efficiency, the immunochemical assay has recently been carried out. It's getting attention. In immunochemical assays, a wide variety of labels can be used as detection methods, for example, enzymes,
Radiotracers, chemiluminescent and fluorescent labels, metal atoms and sols, stable free radicals, latex and bacteriophages have been applied.
【0008】免疫化学測定法の中でも、酵素を使用する
酵素免疫測定法(EIA)は特に優れたものとして広く
使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての優
れた論評が、Tijssen P,“Practice and theory of enz
yme immunoassays" in Laboratory techniques in bioc
hemistry and molecular biology, Elsevier Amsterdam
New York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) により
提供されている。[0008] Among immunochemical assays, enzyme immunoassays (EIA) using enzymes have been widely used as particularly excellent ones. An excellent review of enzyme immunoassays can be found in Tijssen P, “Practice and theory of enz
yme immunoassays "in Laboratory techniques in bioc
hemistry and molecular biology, Elsevier Amsterdam
New York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990).
【0009】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、メチオカルブのような分子
量の小さい分子は通常動物に接種したとき免疫応答を引
き出すことができない。これら分子はより分子量の大き
な分子(高分子化合物)に結合させることによって初め
て一団のエピトープとして行動し、T細胞受容体の存在
下で免疫応答を起こし、その結果、一群のBリンパ球に
より抗体が産生される。このように高分子化合物と結合
させて初めて免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテ
ン」という。Generally, for a molecule having a large molecular weight,
By inoculating animals without further modification,
An appropriate immune response can be elicited to produce an antibody that recognizes the antigen. However, low molecular weight molecules, such as methiocarb, usually fail to elicit an immune response when inoculated into animals. These molecules only behave as a panel of epitopes by binding to higher molecular weight molecules (polymeric compounds) and elicit an immune response in the presence of the T cell receptor, which results in a group of B lymphocytes that produce antibodies. Produced. Molecules that produce immunogenicity only when bound to a polymer compound in this way are collectively called “haptens”.
【0010】しかし、小分子を高分子化合物と結合させ
たものを抗原としても、得られた抗体は望む分子を認識
しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない場合が
しばしばある。そのため、一般に小さい分子そのもので
はなく、結合に利用できる官能基と共にスペーサーアー
ム(結合手)を導入したものをハプテンとして使用する
必要がある。しかしその場合に、結合手/官能基の配
置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導入が適
切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体は得ら
れない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫しなけら
ばならない。メチオカルブについてはその必要性が非常
に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとより、抗
体を作成するためのハプテンも、本発明前には得られて
いなかった。However, even if a small molecule is bound to a high molecular compound as an antigen, the resulting antibody often does not recognize the desired molecule or has only a low affinity. For this reason, it is generally necessary to use not a small molecule itself but a hapten into which a spacer arm (bond) is introduced together with a functional group available for bonding. However, in such a case, a preferable antibody cannot be obtained unless one having been appropriately introduced in consideration of all problems such as the arrangement of the bond / functional group and the size of the bond is used. Appropriate introduction must be devised for each molecule. Despite the great need for methiocarb, the hapten for making the antibody as well as the appropriate antibody had not been obtained prior to the present invention.
【0011】[0011]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、メチオカル
ブに特異的に反応する新規な抗体を作製するための抗原
を構成する、ハプテン化合物を提供することを目的とす
る。An object of the present invention is to provide a hapten compound which constitutes an antigen for producing a novel antibody specifically reacting with methiocarb.
【0012】本発明は、また、抗原となる、前記ハプテ
ンと高分子化合物との結合体を提供することを目的とす
る。Another object of the present invention is to provide a conjugate of the hapten and a polymer compound, which serves as an antigen.
【0013】本発明は、さらに、メチオカルブに反応す
る新規な抗体もしくはそのフラグメント、およびその製
造方法を提供することを目的とする。[0013] Another object of the present invention is to provide a novel antibody or a fragment thereof that reacts with methiocarb, and a method for producing the same.
【0014】本発明は、さらにまた、前記抗体及びその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。[0014] It is still another object of the present invention to provide a hybridoma that produces the antibody and its fragment.
【0015】本発明は、さらに、前記ハプテン化合物ま
たは抗体を使用することを含む、メチオカルブまたはそ
の誘導体の免疫化学的測定法を提供することを目的とす
る。[0015] It is another object of the present invention to provide an immunochemical assay for methiocarb or a derivative thereof, which comprises using the hapten compound or the antibody.
【0016】尚、本明細書において抗体の「フラグメン
ト」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばFab
断片等を意味する。As used herein, the term “fragment” refers to a part of an antibody capable of binding to an antigen, for example, Fab
It means a fragment or the like.
【0017】[0017]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、メチオカルブの−NHCH3部分を−N
H(CH2)nCOOH(nは1〜10の整数、好ましく
は3である)に変化させたメチオカルブ誘導体をハプテ
ンとして使用することにより、メチオカルブに特異的な
抗体が得られることを見いだし、本発明の完成に至っ
た。Means for Solving the Problems The present inventors have made intensive studies and found that the -NHCH 3 portion of methiocarb was replaced with -N.
It has been found that an antibody specific to methiocarb can be obtained by using a methiocarb derivative converted to H (CH 2 ) n COOH (n is an integer of 1 to 10, preferably 3) as a hapten. The invention has been completed.
【0018】即ち、本発明のハプテン化合物は、以下の
一般式IThat is, the hapten compound of the present invention has the following general formula I
【化6】 (nは1〜10の整数、好ましくは3である)で表され
る構造を有するメチオカルブ誘導体である。Embedded image (N is an integer of 1 to 10, preferably 3,).
【0019】本発明のメチオカルブ誘導体をハプテンと
して適当な高分子化合物と結合させたものを抗原として
用いることによって、メチオカルブに特異的な抗体を得
ることができる。An antibody specific to methiocarb can be obtained by using the methiocarb derivative of the present invention bound as a hapten with an appropriate polymer compound as an antigen.
【0020】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、メチオカルブに反応
する抗体およびその製造方法、ならびに該ハプテン化合
物または該抗体を用いるメチオカルブの免疫化学的測定
法に関する。The present invention relates to the hapten compound, a conjugate of the hapten compound and a polymer compound, an antibody reacting with methiocarb, a method for producing the same, and an immunochemical assay for methiocarb using the hapten compound or the antibody.
【0021】メチオカルブ誘導体の作製 一般式Iで表されるメチオカルブ誘導体は、公知の方法
に従って製造することができる。例えば、一般式IIIPreparation of Methiocarb Derivative The methiocarb derivative represented by the general formula I can be produced according to a known method. For example, the general formula III
【化7】 [式中、Rはカルボキシル基の保護基を表す。nは一般
式Iに同じ]で表されるエステル化合物から、Rで示さ
れるカルボキシル基の保護基を除去することにより製造
できる。Embedded image [In the formula, R represents a protecting group for a carboxyl group. n is the same as in general formula I] can be produced by removing the protecting group for the carboxyl group represented by R from the ester compound represented by the general formula I].
【0022】上記一般式III中、Rで示されるカルボ
キシル基の保護基は公知のものでよく、その具体例とし
て、例えばメチル基、エチル基、tert−ブチル基、
ベンジル基、p−メトキシベンジル基、トリクロロエチ
ル基、トリメチルシリル基、tert−ブチルジメチル
シリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリ
エチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチ
ルシリルエトキシメチル基等を挙げることができる。In the general formula III, the carboxyl-protecting group represented by R may be a known one, and specific examples thereof include, for example, methyl, ethyl, tert-butyl,
Examples thereof include a benzyl group, a p-methoxybenzyl group, a trichloroethyl group, a trimethylsilyl group, a tert-butyldimethylsilyl group, a tert-butyldiphenylsilyl group, a triethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, and a trimethylsilylethoxymethyl group.
【0023】Rで示されるカルボキシル基の保護基の除
去は、酸加水分解、アルカリ加水分解等の公知の方法で
行うことができる。The removal of the protecting group for the carboxyl group represented by R can be carried out by a known method such as acid hydrolysis and alkali hydrolysis.
【0024】例えば、該保護基がtert−ブチル基で
ある場合は、一般式IIIのエステル化合物を含む有機
溶媒に酸性触媒を加えて、好ましくは撹拌下で反応させ
ることにより行われる。有機溶媒としては、例えば、ベ
ンゼン等の芳香族炭化水素類、ジクロロメタン、1,2
−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、又はこれ
らの混合溶媒等を使用できる。酸性触媒としては公知の
もの、例えばトリフルオロ酢酸等のカルボン酸、p−ト
ルエンスルホン酸等のスルホン酸、塩酸、硝酸等の鉱酸
などが使用できるが、その中でもトリフルオロ酢酸が好
ましい。反応温度は、通常0−50℃程度、好ましくは
室温がよく、反応時間は通常2−24時間程度とすれば
よい。For example, when the protecting group is a tert-butyl group, the reaction is carried out by adding an acidic catalyst to an organic solvent containing an ester compound of the general formula III and reacting the mixture preferably under stirring. Examples of the organic solvent include aromatic hydrocarbons such as benzene, dichloromethane, and 1,2.
-A halogenated hydrocarbon such as dichloroethane, or a mixed solvent thereof can be used. As the acidic catalyst, known catalysts such as carboxylic acid such as trifluoroacetic acid, sulfonic acid such as p-toluenesulfonic acid, and mineral acids such as hydrochloric acid and nitric acid can be used. Among them, trifluoroacetic acid is preferable. The reaction temperature is usually about 0-50 ° C, preferably room temperature, and the reaction time is usually about 2-24 hours.
【0025】また、アルカリ加水分解の場合は、一般式
IIIのエステル化合物を、好ましくはメタノール、エ
タノール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等
の有機溶媒、又はこれらの有機溶媒と水との混合溶媒に
水酸化ナトリウム、水酸化リチウムまたは水酸化カリウ
ムを加えて、0℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室
温から50℃で、1−2時間撹拌反応させることにより
一般式Iのカルボン酸化合物を得ることができる。In the case of alkaline hydrolysis, the ester compound of the general formula III is preferably added to an organic solvent such as methanol, ethanol, tetrahydrofuran or ethylene glycol, or a mixed solvent of these organic solvents and water with sodium hydroxide. , Lithium hydroxide or potassium hydroxide, and the mixture is stirred at a temperature of 0 ° C. to the boiling point of the solvent, preferably at room temperature to 50 ° C. for 1-2 hours to obtain a carboxylic acid compound of the general formula I. .
【0026】更に、ベンジル基の除去は水素による接触
還元反応によっても行うことができる。Further, the removal of the benzyl group can also be carried out by a catalytic reduction reaction with hydrogen.
【0027】また、トリメチルシリル基、tert−ブチル
ジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、
トリエチルシリル基、トリイソプロピル基、トリメチル
シリルエトキシメチル基は、フッ化水素、テトラブチル
アンモニウムフルオリド、ピリジニウムフルオリド等の
フッ素イオンを発生させる試薬により特異的に除去でき
る。Further, a trimethylsilyl group, a tert-butyldimethylsilyl group, a tert-butyldiphenylsilyl group,
The triethylsilyl group, triisopropyl group, and trimethylsilylethoxymethyl group can be specifically removed by a reagent that generates fluorine ions such as hydrogen fluoride, tetrabutylammonium fluoride, and pyridinium fluoride.
【0028】なお、一般式IおよびIIIにおいて、n
は1〜10の整数、好ましくは3である。ここにおいて
nは反応物が実質上その整数で表されるという意味であ
る。In the general formulas I and III, n
Is an integer of 1 to 10, preferably 3. Here, n means that the reactant is substantially represented by its integer.
【0029】一般式IIIのエステル化合物は、種々の
方法によって合成することができる。The ester compound of the general formula III can be synthesized by various methods.
【0030】例えば、先ず、一般式IVFor example, first, general formula IV
【化8】 [Xはハロゲン原子(本明細書中、ハロゲン原子はF、
Cl、BrまたはIを意味する)を表す]で表されるア
ルコキシカルボニルハライドを、一般式VEmbedded image [X is a halogen atom (wherein the halogen atom is F,
Cl, Br or I) are represented by the general formula V
【化9】 [nは一般式Iに同じ]で表されるアミンと、不活性溶
媒中、塩基の存在下で反応させることにより、一般式V
IEmbedded image By reacting an amine represented by the formula [n is the same as in the general formula I] with an inert solvent in the presence of a base, a compound of the general formula V
I
【化10】 [nは一般式Iに同じ]で表される化合物を得る。不活
性溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジク
ロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエー
テル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、メ
チルエチルケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメ
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等が使用でき
る。好ましい溶媒は、ジクロロメタンである。塩基とし
ては公知のもの、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメ
チラート、ナトリウムエチラート、トリエチルアミン等
が挙げられる。好ましい塩基は、トリエチルアミンであ
る。反応温度はマイナス20−50℃、好ましくは0−
25℃で、反応時間は0.5−24時間、好ましくは0.
5−3時間である。Embedded image [N is the same as in the general formula I] is obtained. As the inert solvent, benzene, toluene, xylene, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, diethyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, acetone, methyl ethyl ketone, acetonitrile, ethyl acetate, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and the like can be used. A preferred solvent is dichloromethane. Known bases include, for example, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium methylate, sodium ethylate, triethylamine and the like. A preferred base is triethylamine. The reaction temperature is minus 20-50 ° C, preferably 0-
At 25 ° C., the reaction time is 0.5-24 hours, preferably 0.5 hour.
5-3 hours.
【0031】次に、得られた式VIの化合物を式VIINext, the obtained compound of the formula VI is converted to a compound of the formula VII
【化11】 で表されるメチオカルブフェノールと、不活性溶媒中、
弱塩基性触媒の存在下で反応させることにより式III
の化合物を得ることができる。不活性溶媒としては、ベ
ンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロ
ホルム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロ
フラン、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、
アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシド等が使用できる。好ましい溶媒は
アセトニトリルである。塩基性触媒としては、公知のも
の、例えば、1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウン
デク−7−エン(DBU)、1,5−ジアザビシクロ
[4.3.0]ノン−5−エン(DBN)、1,4−ジア
ザビシクロ[2.2.2]オクタン(DABCO)等が挙
げられる。反応温度はマイナス20−50℃、好ましく
は0−30℃で、反応時間は0.5−24時間、好まし
くは1−3時間である。Embedded image And in an inert solvent,
By reacting in the presence of a weakly basic catalyst, the compound of formula III
Can be obtained. As the inert solvent, benzene, toluene, xylene, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, diethyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, acetone, methyl ethyl ketone,
Acetonitrile, ethyl acetate, dimethylformamide,
Dimethyl sulfoxide and the like can be used. The preferred solvent is acetonitrile. Known basic catalysts include, for example, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU) and 1,5-diazabicyclo [4.3.0] non-5-ene. (DBN), 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO) and the like. The reaction temperature is minus 20-50 ° C, preferably 0-30 ° C, and the reaction time is 0.5-24 hours, preferably 1-3 hours.
【0032】また、一般式IIIのエステル化合物は、
次の方法によっても合成できる。The ester compound of the general formula III is
It can also be synthesized by the following method.
【0033】式VIIのメチオカルブフェノールと一般
式Vのアミンとを、溶媒中にて塩基及びハロ蟻酸エステ
ル類、ホスゲン、トリホスゲン等のカルボニル化剤の存
在下で反応させる。溶媒としては、例えば、酢酸メチ
ル、酢酸エチル等のエステル類、ジクロロエタン、ジク
ロロメタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トル
エン、キシレン等の芳香族炭化水素類、シクロヘキサノ
ン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等の
ケトン類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ドなどの非プロトン性極性溶媒、アセトニトリルやこれ
らの混合溶媒等の有機溶媒が好適に使用される。塩基と
しては公知のもの、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム等の炭酸塩無水物、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム等のアルカリ水酸化物、トリエチルアミン、ピリジ
ン、4−ジメチルアミノピリジン、2,4,6−コリジ
ン、トリエチルアミン、N−メチルモルホリン等の有機
塩基等が使用できるが、その中でもトリエチルアミンが
好ましい。反応温度は氷冷温度−室温付近とすればよ
く、反応時間は1−5時間程度とすればよい。The methiocarb phenol of the formula VII is reacted with an amine of the general formula V in a solvent in the presence of a base and a carbonylating agent such as haloformates, phosgene, triphosgene and the like. Examples of the solvent include esters such as methyl acetate and ethyl acetate; halogenated hydrocarbons such as dichloroethane and dichloromethane; aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene; and ketones such as cyclohexanone, methyl ethyl ketone and methyl isobutyl ketone. , Aprotic polar solvents such as dimethylformamide and dimethylsulfoxide, and organic solvents such as acetonitrile and a mixed solvent thereof are preferably used. Known bases include, for example, carbonate anhydrides such as sodium carbonate and potassium carbonate, alkali hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, triethylamine, pyridine, 4-dimethylaminopyridine, 2,4,6- Organic bases such as collidine, triethylamine and N-methylmorpholine can be used, and among them, triethylamine is preferable. The reaction temperature may be about ice-cold temperature-room temperature, and the reaction time may be about 1-5 hours.
【0034】あるいは、一般式IIIのエステル化合物
は、次の方法によっても合成できる。Alternatively, the ester compound of the general formula III can be synthesized by the following method.
【0035】式VIIのメチオカルブフェノールと塩基
とを数時間程度加熱撹拌してメチオカルブフェノールの
塩を生成させ、更に室温でカルボニル化剤を加えて、8
0−90℃程度の温度下に1時間程度反応させることに
より、以下の式VIII:The methiocarb phenol of the formula VII and the base are heated and stirred for about several hours to form a salt of methiocarb phenol.
By reacting at a temperature of about 0-90 ° C. for about 1 hour, the following formula VIII:
【化12】 で表されるメチオカルブフェノキシカルボニルクロリド
が製造される。塩基としては好ましくは炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム等の炭酸塩無水物、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム等のアルカリ水酸化物、トリエチル
アミン等の有機塩基が用いられる。またカルボニル化剤
としては、例えばクロロ蟻酸トリクロロメチル、ホスゲ
ン、トリホスゲン等を例示できる。次に一般式VIII
のメチオカルブフェノキシカルボニルクロリドを反応系
から単離精製し、上記一般式Vのアミンと反応させるこ
とにより、一般式IIIのエステル化合物が得られる。
この反応は上記VIの製造と同様の条件下で行うことが
できる。Embedded image To produce methiocarbphenoxycarbonyl chloride. As the base, a carbonate anhydride such as sodium carbonate and potassium carbonate, an alkali hydroxide such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, and an organic base such as triethylamine are preferably used. Examples of the carbonylating agent include trichloromethyl chloroformate, phosgene, triphosgene and the like. Next, the general formula VIII
Is isolated and purified from the reaction system and reacted with the amine of the above general formula V to obtain an ester compound of the general formula III.
This reaction can be performed under the same conditions as in the production of VI.
【0036】以上の製造法によって、化合物は結晶で得
られるので、必要ならばシリカゲルクロマトグラフイー
または再結晶操作を行うことにより、さらに高純度の精
製品とすることができる。Since the compound is obtained as crystals by the above-mentioned production method, if necessary, a purified product having higher purity can be obtained by performing silica gel chromatography or recrystallization operation.
【0037】以下、本発明の抗原、抗体の作製、および
免疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製
は、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法(日本
生化学会編)等に記載の公知の方法に従って行うことが
できる。Hereinafter, the preparation of the antigen and antibody of the present invention and the immunochemical assay will be described. In addition, these preparations can be performed according to a known method described in, for example, a course for sequencial chemistry experiment, immunobiochemical research method (edited by the Japanese Biochemical Society), and the like.
【0038】メチオカルブ誘導体−高分子化合物結合体
の作製 上述のように合成されたメチオカルブ誘導体は適当な高
分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用す
る。 Methiocarb derivative-polymer compound conjugate
The methiocarb derivative synthesized as described above is used as an immunizing antigen after binding to a suitable polymer compound.
【0039】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイのヘモシアニン、卵白アルブミン、ウシ血清アル
ブミン、ウサギ血清アルブミンなどがある。スカシガイ
のヘモシアニン及びウシの血清アルブミンが好ましい。Examples of preferred polymer compounds include keyhole limpet hemocyanin, ovalbumin, bovine serum albumin, rabbit serum albumin and the like. Keyhole limpet hemocyanin and bovine serum albumin are preferred.
【0040】メチオカルブ誘導体と高分子化合物との結
合は、例えば、混合酸無水物法(B.F.Erlanger et al.:
J.Biol.Chem. 234 1090-1094 (1954)),または活性化
エステル法(A.E. KARU et al.:J. Agric. Food Chem.
42 301-309 (1994))等の公知の方法によって行うこと
ができる。The binding between the methiocarb derivative and the polymer compound can be performed, for example, by the mixed acid anhydride method (BFErlanger et al .:
J. Biol. Chem. 234 1090-1094 (1954)) or the activated ester method (AE KARU et al .: J. Agric. Food Chem.
42 301-309 (1994)).
【0041】混合酸無水物法において用いられる混合酸
無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反応によ
り得られ、これを高分子化合物と反応させることにより
目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造され
る。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基
性化合物としては例えば、トリエチルアミン、トリメチ
ルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、N−メチルモ
ルホリン、DBN、DBU、DABCO等の有機塩基、
炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭
酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応
は、通常マイナス20℃−100℃、好ましくは0℃−
50℃において行われ、反応時間は5分−10時間、好
ましくは5分−2時間である。得られた混合酸無水物と
高分子化合物との反応は、通常マイナス20℃−150
℃、好ましくは5℃−100℃、より好ましくは10℃
−100℃において行われ、反応時間は5分−10時
間、好ましくは5分−5時間である。混合酸無水物法は
一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混合酸無水物
法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具
体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタ
ン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キ
シレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオ
キサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエ
ーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、
N,N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極
性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において使用さ
れるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチ
ル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸
エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方
法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子化合物
の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。The mixed acid anhydride used in the mixed acid anhydride method is obtained by a reaction between a carboxylic acid and a haloformate, and the resulting hapten-polymer compound conjugate is reacted with the polymer. Is manufactured. This reaction is performed in the presence of a basic compound. Examples of the basic compound include organic bases such as triethylamine, trimethylamine, pyridine, dimethylaniline, N-methylmorpholine, DBN, DBU, and DABCO;
Inorganic bases such as potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate and the like can be mentioned. The reaction is usually carried out at minus 20 ° C to 100 ° C, preferably at 0 ° C
The reaction is performed at 50 ° C., and the reaction time is 5 minutes to 10 hours, preferably 5 minutes to 2 hours. The reaction between the obtained mixed acid anhydride and the polymer compound is usually performed at −20 ° C.-150 ° C.
° C, preferably 5 ° C-100 ° C, more preferably 10 ° C
The reaction is carried out at -100 ° C, and the reaction time is 5 minutes to 10 hours, preferably 5 minutes to 5 hours. The mixed anhydride method is generally performed in a solvent. As the solvent, any solvent commonly used in the mixed acid anhydride method can be used. Specifically, halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform and dichloroethane, and aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene can be used. Hydrogens, diethyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, ethers such as dimethoxyethane, methyl acetate, esters such as ethyl acetate,
Aprotic polar solvents such as N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, hexamethylphosphoric triamide and the like; Examples of the haloformate used in the mixed acid anhydride method include methyl chloroformate, methyl bromoformate, ethyl chloroformate, ethyl bromoformate, and isobutyl chloroformate. The proportions of the hapten, the haloformate and the polymer compound used in the method can be appropriately selected from a wide range.
【0042】一方、活性化エステル法は、一般に以下の
ように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機
溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてN−ヒドロ
キシスクシンイミドと反応させ、N−ヒドロキシスクシ
ンイミド活性化エステルを生成する。On the other hand, the activated ester method can be generally carried out as follows. First, a hapten compound is dissolved in an organic solvent and reacted with N-hydroxysuccinimide in the presence of a coupling agent to produce an N-hydroxysuccinimide activated ester.
【0043】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、N,N−ジメチルホルムアミド(D
MF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジオキサ
ン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とN
−ヒドロキシスクシンイミドのモル比は好ましくは1:
10−10:1、より好ましくは、1:1−1:10、
最も好ましくは1:1である。反応温度は、0−100
℃、好ましくは5−50℃、より好ましくは22−27
℃で、反応時間は5分−24時間、好ましくは30分−
6時間、より好ましくは1−2時間である。As the coupling agent, an ordinary coupling agent commonly used in a condensation reaction can be used.
Dicyclohexylcarbodiimide, carbonyldiimidazole, water-soluble carbodiimide and the like. Examples of the organic solvent include N, N-dimethylformamide (D
MF), dimethyl sulfoxide (DMSO), dioxane and the like can be used. Hapten compound used in the reaction and N
The molar ratio of -hydroxysuccinimide is preferably 1:
10-10: 1, more preferably 1: 1-1: 10,
Most preferably, it is 1: 1. The reaction temperature is 0-100
° C, preferably 5-50 ° C, more preferably 22-27.
C., the reaction time is 5 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes
6 hours, more preferably 1-2 hours.
【0044】カップリング反応後反応液を遠心し、上清
液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、
例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当
該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸
アミド結合が生成される。反応温度は、0−60℃、好
ましくは5−40℃、より好ましくは22−27℃で、
反応時間は5分−24時間、好ましくは1−16時間、
より好ましくは1−2時間である。反応物を、透析、脱
塩カラム等によって精製して、メチオカルブ誘導体−高
分子化合物結合体を得ることができる。After the coupling reaction, the reaction solution is centrifuged, and the supernatant is added to a solution in which the high molecular compound is dissolved to cause a reaction.
For example, when the polymer compound has a free amino group, an acid amide bond is generated between the amino group and the carboxyl group of the hapten compound. The reaction temperature is 0-60 ° C, preferably 5-40 ° C, more preferably 22-27 ° C,
The reaction time is 5 minutes to 24 hours, preferably 1 to 16 hours,
More preferably, it is 1-2 hours. The reaction product can be purified by dialysis, a desalting column, or the like to obtain a conjugate of a methiocarb derivative-polymer compound.
【0045】また、上記と同様の方法により、高分子化
合物の代わりに酵素標識をメチオカルブ誘導体に結合さ
せたものを、免疫化学的測定方法において使用すること
ができる。In addition, in the same manner as described above, a compound in which an enzyme label is bound to a methiocarb derivative instead of a polymer compound can be used in an immunochemical assay.
【0046】ポリクローナル抗体の作製 メチオカルブ誘導体−高分子化合物結合体を使用して、
慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗体を
作製することができる。例えば、メチオカルブ誘導体−
ウシ血清アルブミン結合体をリン酸緩衝液(以下、「P
BS」という)に溶解し、フロイント完全アジュバント
または不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補
助剤と混合したものを、免疫原として動物を免疫化する
ことによって行う。免疫化される動物としては当該分野
で常用されるものをいずれも使用できるが、例えば、マ
ウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることがで
きる。Preparation of Polyclonal Antibody Using a methiocarb derivative-polymer compound conjugate,
The polyclonal antibody of the present invention can be prepared by a conventional method. For example, a methiocarb derivative-
The bovine serum albumin conjugate was added to a phosphate buffer (hereinafter referred to as “P
BS)) and admixed with adjuvants such as Freund's complete or incomplete adjuvant or alum, by immunizing the animal as an immunogen. As the animal to be immunized, any of those commonly used in the art can be used, and examples thereof include mice, rats, rabbits, goats, and horses.
【0047】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は1
回または適当な間隔で、好ましくは1週間ないし5週間
の間隔で複数回行うことができる。The administration method upon immunization may be any of subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, and intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferred. Immunity is 1
It can be performed multiple times or at appropriate intervals, preferably one to five weeks.
【0048】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用いて後述する方法によってメチオカル
ブと反応させ、ポリクローナル抗体の存在または力価を
評価することができる。[0048] Blood is collected from the immunized animal, and the serum separated therefrom is reacted with methiocarb by the method described below to evaluate the presence or titer of the polyclonal antibody.
【0049】ポリクローナル抗体によるメチオカルブの
測定 本発明で使用するポリクローナル抗体によるメチオカル
ブの測定法としては、放射性同位元素免疫測定法(RI
A法)、ELISA法(Engvall,E.,Meth. Ensymol., 7
0, 419-439 (1980))、蛍光抗体法、プラーク法、スポ
ット法、血球凝集反応、オクタロニー(Ouchter
lony)等の一般に抗体の検出に使用されている種々
の方法(「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、
株式会社R&Dプラニング発行、第30頁−第53頁、
昭和57年3月5日)が挙げられる。感度、迅速性、精
度、自動化等の観点からELISA法が好ましい。 Methiocarb by polyclonal antibody
Measurement As a method for measuring methiocarb using the polyclonal antibody used in the present invention, radioisotope immunoassay (RI
A method), ELISA method (Engvall, E., Meth. Ensymol., 7
0 , 419-439 (1980)), fluorescent antibody method, plaque method, spot method, hemagglutination, Ouchterony (Ouchter)
various methods generally used for the detection of antibodies ("hybridoma method and monoclonal antibody",
Published by R & D Planning Inc., pp. 30-53,
March 5, 1982). The ELISA method is preferred from the viewpoints of sensitivity, speed, accuracy, automation, and the like.
【0050】上述の測定は、例えば間接競合阻害ELI
SA法により、以下のような手順により行うことができ
る。(a)まず、抗原であるメチオカルブ−高分子化合
物結合体を担体に固相化する。(b)抗原が吸着してい
ない固相表面を抗原と無関係なタンパク質によりブロッ
キングする。(c)これに各種濃度のメチオカルブを含
む試料及びポリクローナル抗体を加え、該抗体を前記固
相化抗原および遊離メチオカルブに競合的に反応させ
て、抗体−固相化抗原複合体及び抗体−遊離メチオカル
ブ複合体を生成させる。(d)抗体−固相化抗原複合体
の量を測定することにより、予め作成した検量線から試
料中の遊離メチオカルブの量を決定することができる。The above-described measurement is performed, for example, by indirect competitive inhibition ELI.
According to the SA method, it can be performed according to the following procedure. (A) First, a thiothiocarb-polymer compound conjugate as an antigen is immobilized on a carrier. (B) Blocking the surface of the solid phase on which the antigen is not adsorbed by a protein unrelated to the antigen. (C) A sample containing various concentrations of methiocarb and a polyclonal antibody are added thereto, and the antibody is allowed to react competitively with the immobilized antigen and free methiocarb to form an antibody-immobilized antigen complex and an antibody-free methiocarb. Allow the complex to form. (D) By measuring the amount of the antibody-immobilized antigen complex, the amount of free methiocarb in the sample can be determined from a previously prepared calibration curve.
【0051】(a)工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ELISA法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の96穴マイクロプレートが挙げら
れる。In step (a), the carrier on which the antigen is immobilized is not particularly limited, and any carrier commonly used in the ELISA method can be used. For example, a 96-well microplate made of polystyrene may be used.
【0052】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、145mM NaClを含む10mM リン酸緩衝
液(pH7.2)の組成のものを挙げることができる。
緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通
常0.01−100μg/ml程度、好ましくは0.05
−5μg/mlが適している。また、担体として96穴
マイクロプレートを使用する場合には、20−150μ
l/ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーション
の条件にも特に制限はないが、通常4℃程度で一晩イン
キュベーションが適している。For immobilizing an antigen on a carrier, for example,
A buffer containing an antigen may be placed on a carrier and incubated. As the buffer, a known buffer can be used. For example, a buffer having a composition of 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) containing 145 mM NaCl can be used.
The concentration of the antigen in the buffer can be selected from a wide range, but is usually about 0.01 to 100 μg / ml, preferably about 0.05.
-5 μg / ml is suitable. When a 96-well microplate is used as a carrier, 20-150 μm
1 / well is desirable. Furthermore, the conditions for incubation are not particularly limited, but usually incubation at about 4 ° C. overnight is suitable.
【0053】(b)工程のブロッキングは、メチオカル
ブ−高分子化合物結合体を固相化した担体において、メ
チオカルブの部分以外に後で添加する抗体が吸着され得
る部分が存在する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的
で行われる。ブロッキング剤として、例えば、ウシ血清
アルブミン(BSA)やスキムミルク溶液を使用でき
る。あるいは、ブロックエース(「Block Ac
e」、雪印乳業社製、コードNo.UK−25B)等の
ブロッキング剤として市販されているものを使用するこ
ともできる。具体的には、限定されるわけではないが、
例えば抗原を固相化した部分にブロックエースを適量加
え、約4℃で、一晩インキュベーションした後、緩衝液
で洗浄することにより行われる。緩衝液としては特に制
限はないが、例えば、10mM リン酸緩衝液(pH
7.2)、0.8%(w/v)NaCl、0.02%(w
/v)KCl、0.02%(v/v)Tween20の
組成のものが適している。In the blocking in the step (b), the carrier to which the conjugate of the methiocarb-polymer compound is immobilized may have a portion to which the antibody to be added later can be adsorbed in addition to the methiocarb portion. It is performed for the purpose of preventing. For example, bovine serum albumin (BSA) or skim milk solution can be used as a blocking agent. Or, Block Ace (“Block Ac
e ", manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd., code No. A commercially available blocking agent such as UK-25B) can also be used. Specifically, it is not limited,
For example, an appropriate amount of block ace is added to the portion on which the antigen is immobilized, and the mixture is incubated at about 4 ° C. overnight, followed by washing with a buffer. The buffer is not particularly limited. For example, a 10 mM phosphate buffer (pH
7.2), 0.8% (w / v) NaCl, 0.02% (w
/ V) KCl and a composition of 0.02% (v / v) Tween 20 are suitable.
【0054】次いで(c)工程において、メチオカルブ
を含む試料とポリクローナル抗体を固相化抗原と接触さ
せ、抗体を固相化抗原及び遊離メチオカルブと反応させ
ることにより、固相化抗原−抗体複合体及び遊離メチオ
カルブ−抗体複合体が生成する。Next, in step (c), the sample containing methiocarb and the polyclonal antibody are brought into contact with the immobilized antigen, and the antibody is reacted with the immobilized antigen and free methiocarb, whereby the immobilized antigen-antibody complex and Free methiocarb-antibody complexes are formed.
【0055】この際、抗体としては、第一抗体としてポ
リクローナル抗体を加え、更に第二抗体として標識酵素
を結合した第一抗体に対する抗体を順次加えて反応させ
る。At this time, as the antibody, a polyclonal antibody is added as the first antibody, and an antibody against the first antibody to which a labeling enzyme has been added is sequentially added as the second antibody to react.
【0056】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、25℃程度で約1時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。洗浄液としては、10mM
リン酸緩衝液(pH7.2)、0.8%(w/v)Na
Cl、0.02%(w/v)KClの組成のものが好ま
しい。The first antibody is added after being dissolved in a buffer. Although not limited, the reaction may be performed at about 25 ° C. for about 1 hour. After the reaction is completed, the carrier is washed with a buffer to remove unreacted first antibody. 10 mM washing solution
Phosphate buffer (pH 7.2), 0.8% (w / v) Na
Cl and a composition of 0.02% (w / v) KCl are preferred.
【0057】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてウサギ抗血清を用いる場合、酵素(例えば、ペ
ルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等)を結
合した抗ウサギIgGヤギ抗体を用いるのが適当であ
る。担体に結合した第一抗体に約1000−10000
倍、好ましくは最終吸光度が1.0−1.5となるように
希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には
緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は約
25℃で約1時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以
上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。ま
た、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二
抗体は不要である。Next, a second antibody is added. For example, when a rabbit antiserum is used as the first antibody, it is appropriate to use an anti-rabbit IgG goat antibody conjugated with an enzyme (eg, peroxidase or alkaline phosphatase). About 1000-10000 for the first antibody bound to the carrier
It is desirable to react the second antibody diluted so as to have a final absorbance of 1.0 to 1.5 times. Buffer is used for dilution. The reaction is carried out, but not limited to, at about 25 ° C. for about 1 hour, followed by washing with a buffer after the reaction. By the above reaction, the second antibody binds to the first antibody. Alternatively, a labeled first antibody may be used, in which case the second antibody is not required.
【0058】次いで(d)工程において担体に結合した
第二抗体の酵素と基質との反応によって発色する試薬を
加え、吸光度を測定することによって検量線からメチオ
カルブの量を算出することができる。Next, in step (d), a reagent that develops a color by the reaction between the enzyme of the second antibody bound to the carrier and the substrate is added, and the amount of methiocarb can be calculated from the calibration curve by measuring the absorbance.
【0059】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、基質として過酸化水素、発
色試薬としてo−フェニレンジアミンを使用することが
望ましい。限定されるわけではないが、発色溶液を加え
約25℃で約10分間反応させた後、4Nの硫酸を加え
ることにより酵素反応を停止させる。o−フェニレンジ
アミンを使用する場合、492nmの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、p−ニトロフェニルリ
ン酸を基質として発色させ、2NのNaOHを加えて酵
素反応を止め、415nmでの吸光度を測定する方法が
適している。When peroxidase is used as the enzyme that binds to the second antibody, it is preferable to use hydrogen peroxide as a substrate and o-phenylenediamine as a coloring reagent. Although not limited, the color reaction solution is added and reacted at about 25 ° C. for about 10 minutes, and then the enzymatic reaction is stopped by adding 4N sulfuric acid. If o-phenylenediamine is used, measure the absorbance at 492 nm. On the other hand, when alkaline phosphatase is used as the enzyme that binds to the second antibody, a method is used in which the color is developed using p-nitrophenyl phosphate as a substrate, the enzyme reaction is stopped by adding 2N NaOH, and the absorbance at 415 nm is measured. Is suitable.
【0060】モノクローナル抗体の作製 メチオカルブ−高分子化合物結合体を使用して、慣用化
された方法により本発明のモノクローナル抗体を作製す
ることができる。Preparation of Monoclonal Antibody The monoclonal antibody of the present invention can be prepared using a methiocarb-polymer compound conjugate by a conventional method.
【0061】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。In producing a monoclonal antibody,
At least the following work steps are required.
【0062】(a)免疫用抗原として使用するメチオカ
ルブ−高分子化合物結合体の作製 (b)動物への免疫用抗原の接種 (c)血液を採取、アッセイし、抗体産生細胞調製の時
期を決定することからなる抗体産生細胞の調製 (d)ミエローマ細胞の調製 (e)抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 (f)目的とする抗体を産生するハイブリドーマのクロ
ーニング (g)場合によってはモノクローナル抗体を大量に製造
するためのハイブリドーマの培養または動物へのハイブ
リドーマの移植 (h)製造されたモノクローナル抗体の生理活性または
標識試薬としての検定等(A) Preparation of a conjugate of methiocarb-polymer compound to be used as an antigen for immunization (b) Inoculation of an antigen for immunization to an animal (c) Blood is collected and assayed to determine the timing of preparation of antibody-producing cells (D) Preparation of myeloma cells (e) Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells (f) Cloning of hybridoma producing the desired antibody (g) Monoclonal antibody in some cases Culture of hybridomas or transplantation of hybridomas into animals to produce large quantities of (h) assay of the produced monoclonal antibodies for physiological activity or labeling reagents
【0063】モノクローナル抗体を産出するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス(Hybridoma Techniques),コールド
スプリング ハーバーラボラトリーズ(Cold Spring Ha
rbor Laboratory),1980年版)、細胞組織化学
(山下修二ら、日本組織細胞化学会編;学際企画、19
86年)に記載されている。Conventional methods for producing hybridomas producing monoclonal antibodies are described, for example, in Hybridoma Techniques, Cold
Spring Harbor Laboratories (Cold Spring Ha
rbor Laboratory), 1980 edition), Cell histochemistry (Shuji Yamashita et al., edited by the Japanese Society for Tissue and Cellular Chemistry; interdisciplinary project, 19
1986).
【0064】以下、本発明の抗メチオカルブモノクロー
ナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限されず、
例えば脾細胞以外の抗体産生細胞、ミエローマ細胞、他
の哺乳動物の抗体産生細胞、ミエローマ細胞が使用でき
ることは、当業者によって明らかであろう。Hereinafter, a method for producing the anti-methiocarb monoclonal antibody of the present invention will be described, but is not limited thereto.
For example, it will be apparent to those skilled in the art that antibody-producing cells other than splenocytes, myeloma cells, antibody-producing cells of other mammals, and myeloma cells can be used.
【0065】(a)−(c)の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。The steps (a) to (c) can be performed by a method substantially similar to the method described for the polyclonal antibody.
【0066】ミエローマ細胞としては、例えば、BAL
B/cマウス由来骨髄腫細胞株のP3/X63−Ag8
(X63)(Nature,256, 495-497 (1975))、P3/
X63−Ag8.U1(P3U1)(Current Topics.i
n Microbiology and Immunology, 81 1-7 (1987))、P
3/NSI−1−Ag4−1(NS−1)(Eur.J.Immu
nol., 6, 511-519 (1976))、Sp2/O−Ag14
(Sp2/O)(Nature276, 269-270 (1978))、FO
(J. Immuno. Meth., 35, 1-21 (1980))、MPC−1
1、X63.653、S194等の骨髄腫株化細胞、あ
るいはラット由来の210.RCY3.Ag1.2.3.
(Y3)(Nature 277, 131-133, (1979))等を使用で
きる。Examples of myeloma cells include BAL
P3 / X63-Ag8 of myeloma cell line derived from B / c mouse
(X63) (Nature, 256 , 495-497 (1975)), P3 /
X63-Ag8. U1 (P3U1) (Current Topics.i
n Microbiology and Immunology, 81 1-7 (1987)), P
3 / NSI-1-Ag4-1 (NS-1) (Eur. J. Immu
nol., 6 , 511-519 (1976)), Sp2 / O-Ag14
(Sp2 / O) (Nature 276 , 269-270 (1978)), FO
(J. Immuno. Meth., 35 , 1-21 (1980)), MPC-1
1, myeloma cell lines such as X63.653, S194, or rat-derived cell lines. RCY3. Ag 1.2.3.
(Y3) (Nature 277 , 131-133, (1979)) and the like can be used.
【0067】これらの株化細胞を、例えば8−アザグア
ニン培地で選択し、ヒポキサンチンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ欠損となった細胞株を用いる。そして、
IMDM(Iscove Modified Dulbecco's Medium)また
はDMEM(Dulbecco's MEM)で継代培養し、融合当日
に3×103以上の細胞数を確保する。These cell lines are selected, for example, on an 8-azaguanine medium, and a cell line deficient in hypoxanthine phosphoribosyltransferase is used. And
The cells are subcultured in IMDM (Iscove Modified Dulbecco's Medium) or DMEM (Dulbecco's MEM) to secure a cell count of 3 × 10 3 or more on the day of fusion.
【0068】抗体産生細胞はリンパ球であり、これは一
般には脾臓、胸腺、リンパ節、末梢血液またはこれらの
組み合わせからえることができるが脾細胞が最も一般的
に用いられる。The antibody-producing cells are lymphocytes, which can generally be obtained from the spleen, thymus, lymph nodes, peripheral blood or a combination thereof, with splenocytes being most commonly used.
【0069】最終免疫後、抗体産生が確認されたマウス
より抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出
し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞
と工程(d)で得られたミエローマ細胞の融合は公知の
方法、例えばミルスタイン(Milstein)らの方法(Meth
ods in Enzymology, 73, 3 (1981))等に準じて行うこ
とができる。現在最も一般的に行われているのは、融合
作業も簡単なポリエチレングリコール(PEG)を用い
る方法である。PEG法については、例えば、細胞組織
化学、山下修二ら(上述)に記載されている。あるい
は、電気処理(電気融合)による方法等を適宜採用する
こともできる(大河内悦子ら、実験医学 5.1315
−19、1987)。また、細胞の使用比率も公知の方
法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細胞
を3〜10倍程度用いればよい。After the final immunization, a site where antibody-producing cells are present, for example, a spleen is removed from a mouse in which antibody production has been confirmed, and spleen cells which are antibody-producing cells are prepared. Fusion of the spleen cells and the myeloma cells obtained in step (d) is performed by a known method, for example, the method of Milstein et al.
ods in Enzymology, 73 , 3 (1981)) and the like. At present, the method most commonly used is a method using polyethylene glycol (PEG), in which the fusion operation is also easy. The PEG method is described in, for example, Cell Histochemistry, Shuji Yamashita et al. (Supra). Alternatively, a method by electric processing (electric fusion) or the like can be appropriately adopted (Etsuko Okochi et al., Experimental Medicine 5.1315).
-19, 1987). In addition, the ratio of cells used may be the same as in a known method. For example, spleen cells may be used about 3 to 10 times with respect to myeloma cells.
【0070】抗体産生細胞とミエローマ細胞とが融合
し、抗体生産能および増殖能を獲得したハイブリドーマ
群の選択は、例えば、ミエローマ細胞株として8−アザ
グアニン耐性株を使用した場合、HAT培地の使用によ
り行うことができる。さらに、選択されたハイブリドー
マ群を含む培養上清の一部をとり、例えば上述したEL
ISA法により、メチオカルブに対する活性を測定す
る。The selection of a hybridoma group in which an antibody-producing cell and a myeloma cell are fused to obtain antibody-producing ability and proliferative ability is carried out, for example, when an 8-azaguanine-resistant strain is used as a myeloma cell strain, by using a HAT medium. It can be carried out. Further, a part of the culture supernatant containing the selected hybridoma group is taken and subjected to, for example, EL described above.
The activity on methiocarb is measured by the ISA method.
【0071】さらに、上述の測定によりメチオカルブに
反応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマ
のクローニングを行う。このクローニング法としては、
限界希釈により1ウェルに1個のハイブリドーマが含ま
れるように希釈する方法;軟寒天培地上に撒きコロニー
をとる方法;マイクロマニピュレーターによって1個の
細胞を取り出す方法;セルソーターによって1個の分離
する「ソータークローン」法等が挙げられる。限界希釈
法が簡単でありよく用いられる。Further, a hybridoma which is found to produce an antibody reactive with methiocarb by the above measurement is cloned. As this cloning method,
A method for limiting one hybridoma to one well by limiting dilution; a method for collecting colonies by spreading on a soft agar medium; a method for removing one cell with a micromanipulator; and a method for separating one cell with a cell sorter Clone "method and the like. The limiting dilution method is simple and often used.
【0072】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを1−4回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗メチオカルブモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。For the wells in which the antibody titer has been recognized, cloning is repeated 1-4 times, for example, by the limiting dilution method, and those with a stable antibody titer are selected as anti-methiocarb monoclonal antibody-producing hybridoma strains.
【0073】ハイブリドーマを培養する培地としては、
例えば、ウシ胎児血清(FCS)を含むDMEMまたは
IMDM等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例
えば二酸化炭素濃度5−7%程度及び37℃(100%
湿度中の恒温器中)で培養するが好ましい。The culture medium for culturing hybridomas includes:
For example, DMEM or IMDM containing fetal calf serum (FCS) is used. Hybridoma culture is performed, for example, at a carbon dioxide concentration of about 5-7% and at 37 ° C. (100%
(In a thermostat at humidity).
【0074】抗体を作製するための大量培養は大型培養
ビンを用いた回転培養等によって行われる。または、同
系統のマウス(例えば、上述のBALB/c)あるいは
Nu/Nuマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖さ
せ、腹水液より抗体を作製することも可能である。[0074] Large-scale culture for producing antibodies is performed by, for example, rotary culture using large culture bottles. Alternatively, antibodies can be produced from ascites fluid by growing hybridomas in the abdominal cavity of mice of the same strain (for example, BALB / c described above) or Nu / Nu mice.
【0075】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗メチオカルブモノクローナル抗体として使用
することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによ
る塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、IgG画分を集
め精製することにより抗メチオカルブモノクローナル抗
体を得ることができる。さらに精製が必要な場合には、
イオン交換カラム、DEAE−セファロースカラム、プ
ロテインA−セファロースカラム、HPLCなどの慣用
されている方法を使用してIgG画分を集める操作を1
回、または複数回行うことにより実施できる。The culture supernatant or ascites fluid obtained as described above can be used as an anti-methiocarb monoclonal antibody. Further, dialysis, salting out with ammonium sulfate, gel filtration, freeze-drying, etc. are performed to obtain an IgG fraction. By collecting and purifying, an anti-methiocarb monoclonal antibody can be obtained. If further purification is required,
The operation of collecting the IgG fraction using a commonly used method such as an ion exchange column, a DEAE-Sepharose column, a protein A-Sepharose column, HPLC, etc.
It can be carried out once or more than once.
【0076】以上のようにして得られた抗メチオカルブ
モノクローナル抗体は、例えば上述したELISA法な
どの公知の方法を使用して、イソタイプ、サブクラス、
抗体価等を決定することができる。The anti-methiocarb monoclonal antibody obtained as described above can be isolated from the isotype, subclass, or subclass using known methods such as the above-described ELISA method.
Antibody titers and the like can be determined.
【0077】本発明のモノクローナル抗体の一つ、MT
C1−33は非常に特異性が高く、メチオカルブとのみ
反応し、他のカルバマート系化合物である、3,4,5−
トリメタカルブ、XMC、キシリルカルブ、メトルカル
ブとは反応しない。モノクローナル抗体MTC1−33
を使用してメチオカルブの量を約0.01−約10nm
ol/mlの範囲で測定することができる(実施例9、
図2)。One of the monoclonal antibodies of the present invention, MT
C1-33 has a very high specificity, reacts only with methiocarb, and is another carbamate compound, 3,4,5-
Does not react with trimetacarb, XMC, xylylcarb, or metlcarb. Monoclonal antibody MTC1-33
Using about 0.01 to about 10 nm of methiocarb.
ol / ml (Example 9,
(Fig. 2).
【0078】本発明の方法により作製されたモノクロー
ナル抗体によるメチオカルブの測定 上述した方法によって得られた本発明のモノクローナル
抗体は、例えば免疫化学的測定法によりメチオカルブを
定量するために使用できる。免疫化学的測定法は、それ
ぞれの抗原物質に親和性を有する抗体が、特異的に反応
するという抗原抗体反応を応用したものであり、検出感
度も高く、抗原物質、抗体の定量を行うのに適してい
る。 Monochrome produced by the method of the present invention
Measurement of Methiocarb by Null Antibody The monoclonal antibody of the present invention obtained by the method described above can be used for quantifying methiocarb by, for example, an immunochemical assay. The immunochemical assay is an application of the antigen-antibody reaction, in which antibodies having an affinity for each antigenic substance react specifically.It has high detection sensitivity and is useful for quantifying antigenic substances and antibodies. Are suitable.
【0079】既に述べたように、免疫化学的測定法とし
ては、例えばRIA法,ELISA法、蛍光抗体法、血
液凝集反応法等があり、種々の点においてELISA法
が最も適している。As described above, examples of the immunochemical assay include the RIA method, the ELISA method, the fluorescent antibody method, the blood agglutination method, and the like, and the ELISA method is most suitable in various points.
【0080】本発明のモノクローナル抗体を用いたメチ
オカルブの測定は、例えば以下に述べるような直接競合
阻害ELISA法によって行うことができる。即ち、本
発明のメチオカルブと反応するモノクローナル抗体を、
固相に吸着させ、抗原と無関係なタンパク質により、該
抗体により吸着されていない固相表面を覆う。該表面を
洗浄後、試料ならびに酵素標識抗原または酵素標識した
メチオカルブを加え、反応させる。洗浄後、酵素基質を
加え、酵素活性を測定することにより、抗原の定量を行
うことができる。The measurement of methiocarb using the monoclonal antibody of the present invention can be performed by, for example, a direct competitive inhibition ELISA method as described below. That is, a monoclonal antibody that reacts with the methiocarb of the present invention,
Adsorb to the solid phase and cover the solid surface not adsorbed by the antibody with the protein unrelated to the antigen. After washing the surface, a sample and an enzyme-labeled antigen or enzyme-labeled methiocarb are added and reacted. After washing, the antigen can be quantified by adding an enzyme substrate and measuring the enzyme activity.
【0081】本発明のモノクローナル抗体の一つ、MT
C1−33は、直接競合阻害ELISA法でメチオカル
ブの量を0.001−10μg/ml、好ましくは0.
001−1μg/mlの範囲で測定できる(実施例8、
図1)。One of the monoclonal antibodies of the present invention, MT
For C1-33, the amount of methiocarb was 0.001 to 10 μg / ml, preferably 0.1 to 0.1 μg / ml, by direct competitive inhibition ELISA.
It can be measured in the range of 001-1 μg / ml (Example 8,
(Fig. 1).
【0082】以下、本発明の説明のために実施例を記載
するが、実施例は本発明の技術的範囲を制限するための
ものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易
に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本
発明の技術的範囲に含まれる。Hereinafter, examples will be described for describing the present invention, but the examples are not intended to limit the technical scope of the present invention. Those skilled in the art can easily modify and change the present invention based on the description in the present specification, and they are included in the technical scope of the present invention.
【0083】[0083]
【実施例】実施例1 メチオカルブハプテンの合成 EXAMPLES Example 1 Synthesis of Methiocarb Hapten
【化13】 Embedded image
【0084】(2)の合成 6.1 g(30 mmol)のクロロ蟻酸4−ニトロフ
ェニル(1)をジクロロメタン50mlに溶解し、氷冷
し、それに4−アミノ酪酸tert−ブチル4.8g
(30mmol)のジクロロメタン溶液20mlを滴下
し、更にトリエチルアミン3.0g(30mmol)の
ジクロロメタン溶液20ml滴下後、2時間撹拌した。
反応液を水で洗浄後、減圧濃縮してシリカゲルクロマト
グラフィー(n−へキサン:酢酸エチル=4:1から、
n−へキサン:酢酸エチル=1:1)で精製すると白色
結晶として7.7g(収率79%)の(2)を得た。 Synthesis of (2) 6.1 g (30 mmol) of 4-nitrophenyl chloroformate (1) was dissolved in 50 ml of dichloromethane, cooled with ice, and 4.8 g of tert-butyl 4-aminobutyrate was added thereto.
20 ml of a dichloromethane solution of (30 mmol) was added dropwise, and 20 ml of a dichloromethane solution of 3.0 g (30 mmol) of triethylamine was further added, followed by stirring for 2 hours.
The reaction mixture was washed with water, concentrated under reduced pressure, and chromatographed on silica gel (from n-hexane: ethyl acetate = 4: 1,
Purification with n-hexane: ethyl acetate = 1: 1) gave 7.7 g (79% yield) of (2) as white crystals.
【0085】(3)の合成 メチオカルブフェノール0.62g(3.7mmol)
をアセトニトリル50mlに溶解し、室温で1.26g
(3.9mmol)の(2)のアセトニトリル溶液10
mlを滴下した。溶液を氷冷して0.56g(3.7m
mol)の1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデ
ク−7−エン(DBU)のアセトニトリル溶液10 m
lを滴下した。そのまま氷冷下で1時間撹拌後、室温で
0.5時間撹拌した。反応液をそのまま濃縮して、その
濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー(n−へキサ
ン:酢酸エチル=4:1)で精製すると、無色透明の液
体として1.06g(収率81%)の(3)を得た。 Synthesis of (3) 0.62 g (3.7 mmol) of methiocarbphenol
Was dissolved in 50 ml of acetonitrile, and 1.26 g at room temperature.
(3.9 mmol) solution of (2) in acetonitrile 10
ml was added dropwise. The solution was cooled on ice and 0.56 g (3.7 m
mol) of 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU) in acetonitrile 10 m
1 was added dropwise. After stirring for 1 hour under ice cooling, the mixture was stirred at room temperature for 0.5 hour. The reaction solution is directly concentrated, and the concentrated solution is purified by silica gel chromatography (n-hexane: ethyl acetate = 4: 1) to give 1.06 g (yield 81%) of (3) as a colorless and transparent liquid. I got
【0086】メチオカルブハプテン(4)の合成 1.0g(2.8mmol)のハプテンエステル(3)
を100mlのジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ
酢酸10mlを加えて室温で3時間撹拌した。反応溶液
を減圧濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー(n−
へキサン:酢酸エチル=2:1)で精製すると、白色結
晶として0.40g(収率48%)のメチオカルブハプ
テン(4)を得た。 Synthesis of methiocarb hapten (4) 1.0 g (2.8 mmol) of hapten ester (3)
Was dissolved in 100 ml of dichloromethane, 10 ml of trifluoroacetic acid was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The reaction solution was concentrated under reduced pressure and subjected to silica gel chromatography (n-
Purification with hexane: ethyl acetate = 2: 1) yielded 0.40 g (yield 48%) of methiocarb hapten (4) as white crystals.
【0087】[0087]
【表1】1 H-NMR(CDCl3) 1.78−2.12(m,2H) 2.20(s,3H) 2.28−2.65(overlap,8H) 3.28(q,2H) 5.39(t,1H) 6.85(s,2H) 9.35−9.80(br,1H) 1 H-NMR (CDCl 3 ) 1.78-2.12 (m, 2H) 2.20 (s, 3H) 2.28-2.65 (overlap, 8H) 3.28 (q, 2H) 5.39 (t, 1H) 6.85 (s, 2H) 9.35-9.80 (br, 1H)
【0088】実施例2 免疫用抗原の作製 免疫原としてメチオカルブとスカシ貝へモシアニン(K
LH)との結合体を混合酸無水物法により作製した。実
施例1 によって作製されたハプテン化合物の7mgを
無水ジオキサン0.7mlに溶解し、10−12℃に冷
却した後、トリ−N−ブチルアミン 4μlおよびクロ
ロ蟻酸イソブチル24μlを添加し、10−12℃にて
30分間撹拌した(以下これをA液とする)。 Example 2 Preparation of Antigen for Immunization Methiocarb and keyhole limpet hemocyanin (K
LH) was prepared by a mixed acid anhydride method. After dissolving 7 mg of the hapten compound prepared in Example 1 in 0.7 ml of anhydrous dioxane and cooling to 10-12 ° C, 4 μl of tri-N-butylamine and 24 μl of isobutyl chloroformate were added, and the mixture was heated to 10-12 ° C. For 30 minutes (hereinafter referred to as solution A).
【0089】一方、蒸留水lmlにKLHを20mg溶
解し、0.5%NaHCO3 pH9.4を外液として一
晩透析した。透析後3000rpm、30分間遠心し得
られた上清1.5mlにA液をゆっくり添加した。4℃
にて2時間反応させた後、スパーテル1杯のグリシンを
添加してさらに4℃にて30分間撹拌することにより反
応を終了させた。この反応液を145mM NaCl−
10mMリン酸緩衝液(pH7.4:以下、PBSと
略)中で1週間透析して免疫用抗原を得た。このように
して得られたメチオカルブ−KLH結合体を免疫用抗原
として用いた。On the other hand, 20 mg of KLH was dissolved in 1 ml of distilled water, and dialyzed overnight using 0.5% NaHCO 3 pH 9.4 as an external solution. After the dialysis, the solution A was slowly added to 1.5 ml of the supernatant obtained by centrifugation at 3000 rpm for 30 minutes. 4 ℃
After reacting for 2 hours, one spatula of glycine was added, and the mixture was further stirred at 4 ° C. for 30 minutes to complete the reaction. This reaction solution was 145 mM NaCl-
Dialysis was performed for one week in a 10 mM phosphate buffer (pH 7.4; hereinafter, abbreviated as PBS) to obtain an antigen for immunization. The thiocarb-KLH conjugate thus obtained was used as an antigen for immunization.
【0090】実施例3 スクリーニング用抗原の作製 スクリーニング用抗原として実施例2と同様の方法によ
りメチオカルブハプテン−ウシ血清アルブミン(BS
A)結合体を得た。 Example 3 Preparation of Antigen for Screening As a screening antigen, a methiocarb hapten-bovine serum albumin (BS) was prepared in the same manner as in Example 2.
A) A conjugate was obtained.
【0091】実施例4 免疫感作 免疫用抗原として得られたハプテン−KLH結合体につ
いて、それぞれマウスに免疫をおこなった。免疫用抗原
100μgをPBS 100μlに溶解し、等量のフロ
イント完全アジュバントと混合した後、Balb/cマ
ウスに接種した。17日後にフロイント不完全アジュバ
ントを用いて調製した免疫用抗原を、前記と同様の操作
によりマウスに追加免疫をおこなった。また、41日後
にはPBSに溶解した免疫抗原をマウスに追加免疫し
た。 Example 4 Immunization Mice were immunized with the hapten-KLH conjugate obtained as an antigen for immunization. 100 μg of the antigen for immunization was dissolved in 100 μl of PBS, mixed with an equal amount of complete Freund's adjuvant, and inoculated into Balb / c mice. Seventeen days later, mice were boosted with the immunizing antigen prepared using Freund's incomplete adjuvant in the same manner as described above. Further, 41 days later, mice were boosted with an immunizing antigen dissolved in PBS.
【0092】実施例5 抗血清による測定 メチオカルブハプテン−BSA結合体の溶液(0.1μ
g/ml)を50μl/ウェルにて96ウェルプレート
にコーティングした。洗浄の後、4倍に希釈したブロッ
クエース(「Block Ace」:雪印乳業社製、コ
ードNo.UK−25B)でブロッキングした後、抗血
清希釈液と各種濃度のメチオカルブあるいはその類似化
合物を含む10%メタノール溶液とを等量混合し、その
100μlをウェルに入れ、37℃にて1時間反応させ
た。反応終了後、0.05% Tween20−PBS
にて1回洗浄の後、PBSを用いて5000倍希釈した
ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgGヤギ抗体(Cap
pel社製)を50μlずつ各ウェルに添加し 37℃
にて1時間反応させる。さらに反応終了後、0.05%
Tween20−PBSにて2回洗浄し、0.4mg/
ml o−フェニレンジアミン(OPD)、及び0.0
4%過酸化水素を含む0.05M リン酸クエン酸緩衝
液(pH4.5)を100μlずつ各ウェルにいれ室温
にて20分間放置し、発色させた。反応後、2N硫酸1
00μlを各ウェルに加え、反応を停止させた後、49
0nmの吸光度を測定した。 Example 5 Measurement with Antiserum A solution of methiocarb hapten-BSA conjugate (0.1 μm)
g / ml) was coated on a 96-well plate at 50 μl / well. After washing, after blocking with 4-fold diluted Block Ace (“Block Ace”, manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd., code No. UK-25B), 10 parts containing an antiserum diluent and various concentrations of methiocarb or a similar compound thereof are contained. % Methanol solution was mixed in an equal amount, 100 μl of the mixture was placed in a well, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction is completed, 0.05% Tween 20-PBS is used.
After washing once with a peroxidase-conjugated anti-mouse IgG goat antibody (Cap
(Pel, Inc.) was added to each well in an amount of 50 μl.
For 1 hour. After the reaction is completed, 0.05%
After washing twice with Tween 20-PBS, 0.4 mg /
ml o-phenylenediamine (OPD), and 0.0
100 μl of 0.05 M phosphate citrate buffer (pH 4.5) containing 4% hydrogen peroxide was added to each well, and allowed to stand at room temperature for 20 minutes to develop color. After the reaction, 2N sulfuric acid 1
After adding 00 μl to each well to stop the reaction,
The absorbance at 0 nm was measured.
【0093】実施例6 ハイブリドーマ細胞の作製 実施例4につづき、血清中の抗メチオカルブ抗体の活性
が高くなったマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞
(P3UI)とを電気融合法(大河内悦子ら、実験医
学、5、1315−1319、1987)にて細胞融合
をおこなった。細胞増殖が認められた培養上清液につい
て以下の方法でメチオカルブに対する抗体活性を調べ
た。メチオカルブハプテン−BSA結合体の溶液(0.
1μg/ml)を50μl/ウェルにて96ウェルプレ
ートにコーティングした。洗浄の後、4倍に希釈したブ
ロックエースでブロッキングした後、培養上清液と各種
濃度のメチオカルブあるいはその誘導体を含む10%メ
タノール溶液とを等量混合し、その100μlをウェル
に入れ、37℃にて1時間反応させた。反応終了後、
0.05% Tween20−PBS にて1 回洗浄の
後、PBSを用いて、5000倍希釈したペルオキシダ
ーゼ結合抗マウスIgGヤギ抗体(Cappel社製)
を50μlずつ各ウェルにて37℃で1時間反応させ
る。さらに反応終了後、0.05% Tween20−
PBSにて2回洗浄の後、0.4mg/ml o−フェ
ニレンジアミン(OPD)、及び0.04%過酸化水素
を含む0.05Mリン酸クエン酸緩衝液(pH4.5)
を100μlずつ各ウェルにいれ室温にて20分間放置
し、発色させた。反応後、2N硫酸100μlを各ウェ
ルに加え、反応を停止させた後、490nmの吸光度を
測定し、特異性のある抗体活性が認められたものを選抜
した。 Example 6 Preparation of Hybridoma Cells Continuing with Example 4, spleen cells of a mouse having high anti-methiocarb antibody activity in serum and mouse myeloma cells (P3UI) were electrofused (Etsuko Okochi et al. Cell fusion was performed in Experimental Medicine, 5, 1315-1319, 1987). The culture supernatant in which cell proliferation was observed was examined for antibody activity against methiocarb by the following method. Solution of methiocarb hapten-BSA conjugate (0.
1 μg / ml) was coated on a 96-well plate at 50 μl / well. After washing, after blocking with Block Ace diluted 4 times, equal amounts of the culture supernatant and 10% methanol solution containing various concentrations of methiocarb or its derivative are mixed, and 100 μl of the mixture is added to a well, and the mixture is placed at 37 ° C. For 1 hour. After the reaction,
After washing once with 0.05% Tween20-PBS, peroxidase-conjugated anti-mouse IgG goat antibody (Cappel) diluted 5000-fold with PBS.
Is reacted in each well at 37 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, 0.05% Tween 20-
After washing twice with PBS, 0.05 M phosphate citrate buffer (pH 4.5) containing 0.4 mg / ml o-phenylenediamine (OPD) and 0.04% hydrogen peroxide.
Was added to each well, and allowed to stand at room temperature for 20 minutes to develop color. After the reaction, 100 μl of 2N sulfuric acid was added to each well to stop the reaction, and the absorbance at 490 nm was measured, and those having specific antibody activity were selected.
【0094】次に、選抜されたウェルの細胞について限
界希釈法を用いたクローニングをおこなった。その結
果、抗メチオカルブ抗体を産生するハイブリドーマ細胞
株をクローン化した。その1つである MTC1−33
を平成 8 年5月30日に寄託番号FERM P−15
660として工業技術院生命工学工業研究所(〒305
茨城県つくば市東1丁目1番3号)に寄託した。Next, the cells in the selected wells were cloned using the limiting dilution method. As a result, a hybridoma cell line producing an anti-methiocarb antibody was cloned. One of them is MTC1-33
No. FERM P-15 on May 30, 1996
660 as the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (¥ 305
Deposited at 1-3-1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture).
【0095】実施例7 メチオカルブハプテン化合物と
HRPとの結合体作製 実施例2と同様な混合酸無水物法により実施例1で作製
したメチオカルブハプテンとHRPとの結合体を作製し
た。1mgのメチオカルブハプテンを無水ジオキサン
0.2mlに溶解した後、トリ−N−ブチルアミン0.
5μl、クロロ蟻酸イソブチル0.3μlを添加し、1
0−12℃にて30分間撹拌した。(以下、これをA液
とする)一方、0.5%NaHCO3をNaOHでpH
9.4に調整した溶液1mlにHRP 5mgを溶解
し、A液をこの中に滴下した。4℃にて2時間撹拌し、
さらにグリシンを添加して30分間撹拌することにより
反応を終了させた。反応物をPBSにて透析することに
より、精製HRP結合メチオカルブハプテンを得た。 Example 7 Methiocarb hapten compound
Preparation of conjugate with HRP A conjugate of methiocarb hapten and HRP prepared in Example 1 was prepared by the mixed acid anhydride method similar to that in Example 2. After dissolving 1 mg of methiocarb hapten in 0.2 ml of anhydrous dioxane, 0.1 ml of tri-N-butylamine was dissolved.
5 μl and 0.3 μl of isobutyl chloroformate were added, and 1
Stirred at 0-12 ° C for 30 minutes. (Hereinafter, this is referred to as solution A) On the other hand, 0.5% NaHCO 3 is
5 mg of HRP was dissolved in 1 ml of the solution adjusted to 9.4, and the solution A was added dropwise thereto. Stir at 4 ° C for 2 hours,
Further, glycine was added and the mixture was stirred for 30 minutes to terminate the reaction. The reaction product was dialyzed against PBS to obtain a purified HRP-bound methiocarb hapten.
【0096】実施例8 直接競合法によるメチオカルブ
の測定 実施例6で得られたハイブリドーマ細胞(MTC1−3
3)をマウスの腹腔に移植し、10−15日後に得られ
た腹水を採取し、硫安分画法によりモノクローナル抗体
を分取し、以下の試験法にてメチオカルブを測定した。 Example 8 Methiocarb by Direct Competition Method
Measurement of hybridoma cells (MTC1-3 obtained in Example 6)
3) was transplanted into the abdominal cavity of a mouse, and the ascites fluid obtained 10 to 15 days later was collected, a monoclonal antibody was fractionated by ammonium sulfate fractionation, and methiocarb was measured by the following test method.
【0097】それぞれのモノクロ−ナル抗体溶液(10
μg/ml)を100μl/ウェルで96ウェルプレー
トに加え、4℃で一晩静置し、翌日4倍希釈したブロッ
クエースでブロッキングした後、メチオカルブ及び実施
例7で作製した適度に希釈されたHRP結合メチオカル
ブハプテンを含む10%メタノール−PBS溶液を50
μl/ウェルで加え、37℃で1時間静置した。反応終
了後、0.05% Tween20−PBSにて2回洗
浄の後、0.4mg/ml o−フェニレンジアミン
(OPD)、及び0.04%過酸化水素を含む0.05
Mリン酸クエン酸緩衝液(pH4.5)を100μlず
つ各ウェルにいれ室温にて20分間放置し、発色させ
た。反応後、2N硫酸100μlを各ウェルに加え、反
応を停止させた後、490nmの吸光度を測定した。そ
の結果を図1に示す。本発明の抗体MTC1−33は直
接競合阻害法においても、メチオカルブを測定すること
ができ、その測定範囲は0.001−1μg/mlであ
った。Each monoclonal antibody solution (10
(μg / ml) was added to a 96-well plate at 100 μl / well, allowed to stand at 4 ° C. overnight, blocked with Block Ace diluted 4 times the next day, and then diluted with methiocarb and the appropriately diluted HRP prepared in Example 7. 50% 10% methanol-PBS solution containing bound methiocarb hapten
The solution was added at μl / well and left at 37 ° C. for 1 hour. After the completion of the reaction, the plate was washed twice with 0.05% Tween 20-PBS, and then 0.05 mg containing 0.4 mg / ml o-phenylenediamine (OPD) and 0.04% hydrogen peroxide.
100 μl of M phosphate citrate buffer (pH 4.5) was added to each well, and allowed to stand at room temperature for 20 minutes to develop color. After the reaction, 100 μl of 2N sulfuric acid was added to each well to stop the reaction, and the absorbance at 490 nm was measured. The result is shown in FIG. The antibody MTC1-33 of the present invention was able to measure methiocarb by the direct competition inhibition method, and the measurement range was 0.001-1 μg / ml.
【0098】実施例9モノクロ−ナル抗体の評価 メチオカルブハプテンに由来する、クローン化したハイ
ブリドーマ MTC1−33の産生するモノクロ−ナル
抗体MTC1−33 について実施例8と同様の方法を
用いてカルバマート系化合物に対する反応性について調
べた。この結果を図2に示す。図2より、この抗体は非
常に特異性が高く、メチオカルブとのみ反応し、他のカ
ルバマート系化合物である3,4,5−トリメタカルブ、
XMC、キシリルカルブ、メトルカルブとは反応しな
い。モノクロ−ナル抗体MTC1−33は直接結合EL
ISA法でメチオカルブの量を0.01−10nmol
/mlの範囲で測定することができた。 Example 9 Evaluation of Monoclonal Antibody The monoclonal antibody MTC1-33 produced by the cloned hybridoma MTC1-33 derived from the methiocarb hapten was subjected to the carbamate-based method using the same method as in Example 8. The reactivity to the compound was examined. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 2, this antibody has very high specificity, reacts only with methiocarb, and has 3,4,5-trimetacarb, another carbamate compound.
Does not react with XMC, xylylcarb or metlcarb. Monoclonal antibody MTC1-33 is a direct binding EL
The amount of methiocarb was adjusted to 0.01-10 nmol by the ISA method.
/ Ml range.
【図1】 図1は、本発明のモノクローナル抗体MTC
1−33の直接競合阻害法によるメチオカルブの測定を
示す。FIG. 1 shows the monoclonal antibody MTC of the present invention.
1 shows the measurement of methiocarb by the direct competitive inhibition method of 1-33.
【図2】 図2は、モノクローナル抗体MTC1−33
の直接競合阻害法によるカルバマート系化合物の測定を
示す。FIG. 2 shows the monoclonal antibody MTC1-33.
1 shows the measurement of carbamate compounds by the direct competitive inhibition method.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/53 C12N 5/00 B 33/577 9282−4B 15/00 ZNAC //(C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 香川 康浩 東京都港区浜松町1丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡辺 和明 東京都港区浜松町1丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Agency reference number FI Technical indication location G01N 33/53 C12N 5/00 B 33/577 9282-4B 15/00 ZNAC // (C12P 21 / 08 C12R 1:91) (72) Inventor Yasuhiro Kagawa 1-27-114 Hamamatsucho, Minato-ku, Tokyo Inside the Institute for Environmental Immunity Technology (72) Inventor Kazuaki Watanabe 1-27 Hamamatsucho, Minato-ku, Tokyo No. 14 Inside the Institute for Environmental Immunity Technology
Claims (10)
有するハプテン化合物。1. The following formula I: [Wherein, n is an integer of 1-10].
プテン化合物。2. The hapten compound according to claim 1, wherein said n is 3.
物と高分子化合物との結合体。3. A conjugate of the hapten compound according to claim 1 and a polymer compound.
いることにより製造された、以下の式II: 【化2】 で表される構造を有する化合物に特異的な抗体、または
そのフラグメント。4. A compound of the following formula II, prepared by using the conjugate according to claim 3 as an antigen: An antibody specific to the compound having the structure represented by: or a fragment thereof.
載の抗体、またはそのフラグメント。5. The antibody according to claim 4, which is a monoclonal antibody, or a fragment thereof.
抗体、またはそのフラグメント。6. The antibody according to claim 4, which is MTC1-33, or a fragment thereof.
子化合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗
原を用いることにより、式II: 【化3】 で表される構造を有する化合物に特異的な抗体を製造す
ることを特徴とする、請求項4ないし6のいずれか1項
に記載された抗体またはそのフラグメントの製造方法。7. An antigen is prepared by binding a polymer compound to the compound according to claim 1 or 2, and the antigen is used to obtain a compound of the formula II: The method for producing an antibody or a fragment thereof according to any one of claims 4 to 6, wherein an antibody specific to the compound having the structure represented by is produced.
された抗体またはそのフラグメントを産生することを特
徴とする、ハイブリドーマ。8. A hybridoma which produces the antibody or a fragment thereof according to any one of claims 4 to 6.
託されている、請求項8に記載のハイブリドーマ。9. The hybridoma according to claim 8, which has been deposited under accession number FERM P-15660.
たは請求項4ないし6のいずれか1項に記載された抗体
またはそのフラグメントを利用することを特徴とする、
式II: 【化4】 で表される構造を有する化合物の免疫化学的測定法。10. Use of the compound according to claim 1 or 2, or the antibody or fragment thereof according to any one of claims 4 to 6,
Formula II: An immunochemical assay for a compound having the structure represented by:
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8189085A JPH1036341A (en) | 1996-07-18 | 1996-07-18 | Hapten compound of 4-methylthio-3,5-xylyl methylcarbamate, antibody and measurement |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP8189085A JPH1036341A (en) | 1996-07-18 | 1996-07-18 | Hapten compound of 4-methylthio-3,5-xylyl methylcarbamate, antibody and measurement |
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JPH1036341A true JPH1036341A (en) | 1998-02-10 |
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JP (1) | JPH1036341A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998041871A1 (en) * | 1997-03-14 | 1998-09-24 | William Harris | Antibody fragment configurations for detecting analytes |
-
1996
- 1996-07-18 JP JP8189085A patent/JPH1036341A/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998041871A1 (en) * | 1997-03-14 | 1998-09-24 | William Harris | Antibody fragment configurations for detecting analytes |
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