JP3842919B2 - Chlorfenapyr hapten compound, antibody and assay - Google Patents

Description

【０００５】
で表される構造を有する、フェニルピロール系の殺虫剤である。
より詳細には、クロルフェナピルは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍａｎｕｓの産生するジオキサピロロマイシンを基に合成された、ピロール環を有する新規骨格の化合物である。ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｒｍｙｗｏｒｍ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）などの鱗翅目害虫、ｗｅｓｔｅｒｎ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ（Ｅｍｐｏａｓｃａ ａｂｒｕｐｔａ）などの半翅目害虫、ミナミキイロアザミウマなどのアザミウマ目害虫、ナミハダニなどのＴｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ属のハダニ、サビダニ類、ホコリダニ類といった幅広いスペクトラムの害虫やハダニ類に活性を有する。ワタ、野菜、果樹におけるこれら害虫に対しては１２５−５００ｇ ａ．ｉ．／ｈａで有効である。一方、ハダニの天敵である捕食性ダニの１種（Ｍｅｔａｓｅｉｕｌｕｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）に対する殺虫活性はハダニに対する殺虫活性と比較してかなり低く、実用上の悪影響は少ないと考えられている。
【０００６】
クロルフェナピルは経皮活性と経口活性を有するが、少なくとも鱗翅目害虫に対しては経口活性の方が強い。また、速効性は有機リン剤やピレスロイド剤に比べ劣るが、適度の残効性を持つ。ピレスロイド剤に抵抗性であるｓｏｙｂｅａｎｌｏｏｐｅｒ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）やｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍに対して感受性系統と変わらぬ活性を示すなど、既存剤との交差抵抗性はみられない。日本においてもコナガ、ハスモンヨトウ、シロイチモジヨトウ、ミナミキイロアザミウマ、ナミハダニ、カンザワハダニなどの難防除害虫に高い防除効果を示すことが知られている。作用機作はミトコンドリアにおける酸化的リン酸化の脱共役である（新農薬の開発展望 第７１頁および第７６頁−第７８頁、 １９９７年１１月２８日 （株）シーエムシー 発行）。
【０００７】
近年、土壌、水、大気等の環境中での残留農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハーベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられている。クロルフェナピルについては、環境庁による農薬登録保留基準値が、例えば、みかんで０．５ｐｐｍ、第二大粒果実類で１ｐｐｍ、小粒果実類で０．２ｐｐｍ、第二果菜類で１ｐｐｍ、第一葉菜類で１ｐｐｍ、第二葉菜類で３ｐｐｍ、根・茎類で０．１ｐｐｍ、てんさい０．５ｐｐｍ、茶５０ｐｐｍ等定められている（改訂３版 農薬登録保留基準ハンドブック 第２５８頁−第２６０頁、１９９８年９月２５日、化学工業日報社 発行）。よって、環境や食品に関する安全確保のためには、これらに含有される、クロルフェナピルの量を迅速かつ正確に測定することが必要である。
【０００８】
従来、例えば農作物中のクロルフェナピルは、果実、野菜、茶等から抽出し、精製した後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析されてきた。即ち、例えば、試料をアセトンで抽出し、ヘキサンに転溶した後、ヘキサン−ジエチルエーテルを溶媒として用いたケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィーで精製後、ＧＣで測定する方法等が採用されている。これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必要とし、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。クロルフェナピルの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきている。
【０００９】
免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適用されてきた。
【００１０】
免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ ０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載されている。
【００１１】
一般に、分子量が大きな分子については、それ以上修飾することなく動物に接種することにより、適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生させることができる。しかし、クロルフェナピルのような低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が産生される。このように高分子化合物と結合させて初めて免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。
【００１２】
しかし、低分子化合物を高分子化合物と結合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そのものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペーサーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫しなければならない。
【００１３】
クロルフェナピルについては、その必要性が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとより、そのような抗体を作製するためのハプテンも本発明前には得られていなかった。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、クロルフェナピルに反応する新規な抗体若しくは抗原と結合可能なそのフラグメント、及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ａｂ断片等を意味する。
【００１５】
本発明はその一態様において、クロルフェナピルに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。
本発明は、また、クロルフェナピルに反応性を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテン化合物を提供することを目的とする。
【００１６】
本発明は、さらに、クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を提供することを目的とする。
本発明は、さらにまた、前記抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメントを産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
【００１７】
本発明は、さらに、前記抗体若しくはそのフラグメント及び／又は前記クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を使用することを含む、クロルフェナピルの免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、クロルフェナピル又はその部分にスペーサーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能基を導入した、クロルフェナピルの誘導体をハプテンとして使用することにより、前記化合物に反応性を有する抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。
【００１９】
本発明の対象となるクロルフェナピルは、以下の式（２）：
【００２０】
【化４】

【００２１】
で表される構造を有する化合物である。
本発明の抗体は、例えば、クロルフェナピルの部分にスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させたものを抗原として用いることによって得ることができる。例えば、以下の式（１）：
【００２２】
【化５】

【００２３】
［式（１）中、
Ａ¹ないしＡ³は、同一であっても異なっていてもよく、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなるハロゲン原子、ＣＮ、ＣＦ₃、ならびに炭素数１ないし３のアルキル基からなるグループから選択され；
Ａ⁴は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩから選択されるハロゲン原子であり；そしてｍは、１ないし１０の整数である］
で表される構造を有する化合物を、抗体作製のためのハプテンとして使用する。
【００２４】
式（１）中、好ましくは、Ａ¹がＣＮであり、Ａ²がＢｒであり、Ａ³がＣＦ₃であり、Ａ⁴がＣｌである。好ましくは、ｍは５である。
本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン化合物と高分子化合物との結合体、クロルフェナピルに反応する抗体及びその作製方法、並びに該ハプテン化合物又は該抗体を用いるクロルフェナピルの免疫学的測定方法に関する。
クロルフェナピルハプテンの作製
式（１）で表されるクロルフェナピルハプテンは、公知の方法に従って製造することができる。限定するわけではないが、例えば以下のような方法を用いることができる。
【００２５】
例えば、Ａ²がＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩから選択されるハロゲン原子の場合、まず、以下の式（Ｚ１）：
【００２６】
【化６】

【００２７】
［式（Ｚ１）中、Ａ¹、Ａ³およびＡ⁴は先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物に、有機溶媒中、縮合剤の存在下、以下の式（Ｚ２）：
【００２８】
【化７】

【００２９】
［式（Ｚ２）中、
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩから選択されるハロゲン原子であり；
Ｐは、カルボキシル基の保護基であり；そして
ｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を反応させて、以下の式（Ｚ３）：
【００３０】
【化８】

【００３１】
［式（Ｚ３）中、Ａ¹、Ａ³、Ａ⁴、Ｐおよびｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を合成する。
式（Ｚ１）化合物は、公知の方法、例えば特開平１−１３５７０１の実施例５６および５７の記載に準じて合成することができる。
【００３２】
Ｐのカルボキシル基の保護基は公知のものでよく、具体例として、例えば、メチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチルシリルエチル基等を挙げることができる。
【００３３】
式（Ｚ３）の化合物合成のための有機溶媒としては、例えば、Ｎ．Ｎ−ジメチルホルムアミド、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロホルム、四塩化炭素、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド等を用いることができる。縮合剤としては、水素化ナトリウム、ナトリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート等を用いることができる。
【００３４】
反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは８０℃から１５０℃で、１０分から１５時間、好ましくは、１時間から５時間行う
次いで、式（Ｚ３）の化合物からＰで表されるカルボキシル基の保護基を除去することにより、以下の式（Ｚ４）：
【００３５】
【化９】

【００３６】
［式（Ｚ４）中、Ａ¹、Ａ³、Ａ⁴およびｍは先に定義した通りである］
で表される構造を有する化合物を合成する。
カルボキシル基の保護基の除去は、アルカリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うことができる。
【００３７】
すなわち、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｚ３）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機溶媒に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム等の水溶液を加えて、０℃から溶媒の沸点、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０時間、好ましくは３０分から２時間撹拌反応させることにより式（Ｚ４）の化合物を得ることができる。
【００３８】
また、酸加水分解の場合は、式（Ｚ３）の化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃から溶媒の沸点、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応させることにより式（Ｚ４）の化合物を得ることができる。
【００３９】
更に、Ｐがベンジル基の場合、除去は水素による加水素分解によっても行うことができる。
更にまた、Ｐがシリル原子を含む基の場合、脱保護はテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬によっても行うことができる。
【００４０】
さらに、式（Ｚ４）の化合物に、有機溶媒中又は無溶媒で、塩素、臭素、塩化スリフリル、Ｎ−ブロモこはく酸イミド等のハロゲン化剤を反応させることにより、Ａ²がＣｌ又はＢｒから選択されるハロゲン原子である、式（１）の化合物を得ることができる。
【００４１】
有機溶媒としては、酢酸、四塩化炭素、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を用いることができ、鉄粉や塩化アルミニウム等の触媒を用いることにより、反応を促進することができる。反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から１５０℃で、１０分から５０時間、好ましくは、５時間から２０時間行う。
【００４２】
Ａ²がハロゲン原子以外の式（１）の化合物も、同様に公知の方法を用いて合成することができる。
上述したような製造方法によって得られた化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とすることができる。
【００４３】
以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うことができる。
クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体の作製
上述のように合成されたクロルフェナピルハプテンを適当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原若しくは固相化用抗原として使用する。
【００４４】
好ましい高分子化合物の例としては、スカシガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及びＢＳＡが好ましい。
【００４５】
クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．４２ ３０１−３０９（１９９４））、又は混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４ １０９０‐１０９４（１９５４））等の公知の方法によって行うことができる。
【００４６】
活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド活性化エステルを生成させる。
【００４７】
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」と言う）、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好ましくは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分から６時間、より好ましくは１時間から２時間である。
【００４８】
カップリング反応後、反応液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５℃から４０℃、反応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間から１６時間、より好ましくは１時間から２時間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製して、クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を得ることができる。
【００４９】
一方、混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反応により得られ、これを高分子化合物と反応させることにより目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基性化合物としては、例えば、トリブチルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
【００５０】
また、上記と同様の方法により、酵素等の標識物質をクロルフェナピルハプテンに結合させたものを、免疫学的測定方法において使用することができる。標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などがある。
ポリクローナル抗体の作製
クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を使用して、慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗体を作製することができる。例えば、クロルフェナピルハプテン／ＢＳＡ結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動物に免疫することによって得ることができる。免疫される動物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。
【００５１】
免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問隔で複数回行うことができる。
【００５２】
免疫した動物から血液を採取し、そこから分離した血清を用い、クロルフェナピルと反応するポリクローナル抗体の存在を評価することができる。
本発明においてクロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を免疫用抗原として得られた抗血清は、後述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度でクロルフェナピルと反応できる（実施例４）。
モノクローナル抗体の作製
クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作製することができる。
【００５３】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、少なくとも下記のような作業工程が必要である。
（ａ）免疫用抗原として使用するクロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体の作製
（ｂ）動物への免疫
（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製
（ｄ）ミエローマ細胞の調製
（ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハイブリドーマの選択的培養
（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングと細胞クローニング
（ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドーマの移植によるモノクローナル抗体の調製
（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載されている。
【００５４】
以下、本発明のクロルフェナピルに対するモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限されないことは当業者によって明らかであろう。
（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができる。
【００５５】
（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリンパ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
【００５６】
（ｄ）の工程に用いることのできるミエローマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１， １−７（１９８７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）（Ｎａｔｕｒｅ， ２７６，２６９−２７０（１９７８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５， １−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）（Ｎａｔｕｒｅ， ２７７，１３１−１３３，（１９７９））等を使用できる。
【００５７】
上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日に約１×１０⁶以上の細胞数を確保する。
【００５８】
（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も一般的に行われているのはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されている。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）による方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。
【００５９】
脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製したＨＡＴ培地の使用により行うことができる。
【００６０】
（ｆ）の工程では、選択されたハイブリドーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥＬＩＳＡ法により、クロルフェナピルに対する抗体活性を測定する。
【００６１】
さらに、測定によりクロルフェナピルに反応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いられる。
【００６２】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して安定して抗体価の得られたものを、抗クロルフェナピルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温器中）で培養するのが好ましい。
【００６３】
（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可能である。
【００６４】
これらにより得られた培養上清液あるいは腹水液を抗クロルフェナピルモノクローナル抗体として使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精製することにより抗クロルフェナピルモノクローナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせることにより実施できる。
【００６５】
以上のようにして得られた抗クロルフェナピルモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定することができる。
抗体によるクロルフェナピルの測定
本発明で使用する抗体によるクロルフェナピルの測定法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳＡ法が汎用されている。
【００６６】
クロルフェナピルの測定は、各種ＥＬＩＳＡ法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のような手順により行うことができる。
（ａ）まず、固相化用抗原であるクロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を担体に固相化する。
【００６７】
（ｂ）固相化用抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質によりブロッキングする。
（ｃ）これに各種濃度のクロルフェナピルを含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びクロルフェナピルに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体及び、クロルフェナピル−抗体複合体を生成させる。
【００６８】
（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のクロルフェナピルの量を決定することができる。
（ａ）工程において、固相化用抗原を固相化する担体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
【００６９】
固相化用抗原を担体に固相化させるには、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適している。
【００７０】
なお、担体に固相化させる抗原としては、抗体を作製したクロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他のハプテンと高分子化合物との結合体を固相化抗原として使用することも可能である。例えば、式（１）においてＡ¹、Ａ²、Ａ³、Ａ⁴又はｍが抗体作製用と相違する化合物を、固相化抗原として使用することもできる。さらに、式（１）に含まれない他のクロルフェナピル類似化合物を固相化抗原として使用することも可能である。
【００７１】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体）を固相化した担体において、クロルフェナピルハプテン部分以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分にブロッキング剤を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適量加え、約４℃で、１時間ないし５時間インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、ＰＢＳを用いることができる。
【００７２】
次いで（ｃ）工程において、クロルフェナピルを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化抗原及びクロルフェナピルと反応させることにより、固相化抗原−抗体複合体及びクロルフェナピル−抗体複合体が生成する。
【００７３】
この際、抗体としては、第一抗体として本願発明のクロルフェナピルに対する抗体を加え、更に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を順次加えて反応させる。
【００７４】
第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、好ましくは約２５℃で約１時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、ＰＢＳを用いることができる。
【００７５】
次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当である。担体に結合した第一抗体に好ましくは最終吸光度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。
【００７６】
次いで（ｄ）工程において担体に結合した第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からクロルフェナピルの量を算出することができる。
【００７７】
第二抗体に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並びに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はｏ−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
【００７８】
クロルフェナピルを添加しない反応溶液の吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のクロルフェナピルを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のクロルフェナピルの濃度を算出できる。
【００７９】
あるいはクロルフェナピルの測定は、例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。
（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を、担体に固相化する。
【００８０】
（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質により、ブロッキングする。
（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のクロルフェナピルを含む試料に、クロルフェナピルハプテンと酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。
【００８１】
（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。
（ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中のクロルフェナピルの量を決定する。
【００８２】
（ａ）工程においてモノクローナル抗体を固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ法において常用されるものを用いることができ、例えば９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートすることによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。
【００８３】
（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する試料中のクロルフェナピル並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。
【００８４】
（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテンの調製は、クロルフェナピルハプテンを酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。例えば、前述した活性化エステル法を採用することができる。調製した酵素結合ハプテンは、クロルフェナピルを含む試料と混合する。
【００８５】
なお、酵素等の標識物質に結合させるハプテンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したクロルフェナピルハプテン自体のみならず、式（１）で表される他のハプテンと高分子化合物との結合体を標識競合用抗原として使用することも可能である。例えば、式（１）においてＡ¹、Ａ²、Ａ³、Ａ⁴又はｍが抗体作製用と相違する化合物を、標識競合用抗原として使用することもできる。さらに、式（１）に含まれない他のクロルフェナピル類似化合物も、標識競合用抗原として使用可能である。
【００８６】
（ｄ）工程においてクロルフェナピルを含む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触させ、クロルフェナピルと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。クロルフェナピルを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用することができる。
【００８７】
さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプテンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより検量線からクロルフェナピルの量を算出することができる。
【００８８】
本発明のモノクローナル抗体４２Ｅ−１−１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において約０．００５ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でクロルフェナピルと反応する（実施例６、図１）。
【００８９】
さらに、前述したように直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において抗体作製用と異なるハプテンを標識競合用抗原として使用でき、その組み合わせによって直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において固有の反応性を示す。
本発明の抗体の交差反応性
上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を調べることができる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９０】
【実施例】
実施例１ クロルフェナピルハプテンの合成
【００９１】
【化１０】

【００９２】
６−［２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘキサン酸エチル（１）の合成
２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−５−トリフルオロメチルピロールは、特開平１−１３５７０１の実施例５６および５７の記載に準じて、２−（４−クロロフェニル）グリシン及び無水トリフルオロ酢酸より合成した。
【００９３】
次いで、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２０ｍｌ中の２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−５−トリフルオロメチルピロール１．４４ｇ（５．２ｍｍｏｌ）の溶液に６０％水素化ナトリウム０．２２ｇ（５．８ｍｍｏｌ）を室温下に徐々に加えた。１５分間撹拌後、６−ブロモヘキサン酸エチル１．４０ｇ（６．２ｍｍｏｌ）を加え、１４０℃で４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に１５０ｍｌの酢酸エチルと５０ｍｌの水を加え、分液した。酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製し、１．６０ｇ（収率７５％）の（１）を得た。
６−［２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘキサン酸（２）の合成
エタノール２０ｍｌ中の６−［２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘキサン酸エチル（１）０．６３ｇ（１．５ｍｍｏｌ）の溶液に、水１５ｍｌ中の水酸化ナトリウム０．６ｇ（１５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。室温で１時間撹拌した。減圧下にエタノールを留去し、残渣を希塩酸で酸性にし、酢酸エチル５０ｍｌで３回抽出した。酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し０．２７ｇ（収率４６％）の（２）を得た。
６−［４−ブロモ−２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘキサン酸（３）の合成
酢酸１ｍｌ中の６−［２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘキサン酸（２）０．２３ｇ（０．６０ｍｍｏｌ）と鉄粉１０ｍｇの溶液に撹拌下８０℃で臭素０．２９ｇ（１．８ｍｍｏｌ）を徐々に加え、さらに８０℃で１５時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に水５ｍｌを加え、酢酸エチル１５ｍｌで３回抽出した。酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣を分取用ＨＰＬＣ（ アセトニトリル：水＝７：３）で精製し１７ｍｇ（収率６．０％）の（３）を得た。
融点：１１５−１１７℃
上記クロルフェナピルハプテン（３）の¹Ｈ−ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシフトδ）を以下に示す。
【００９４】
【表１】
表１
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ） δ
１．０５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， １．２７（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），
１．４５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， ２．０５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），
３．９９（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂）， ７．６７（４Ｈ，ｍ，４Ａｒ：Ｈ），
１１．９７（１Ｈ，ｓ，ＣＯＯＨ）
実施例２ 免疫用抗原およびスクリーニング用抗原の作製
免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、クロルフェナピルハプテンとＢＳＡとの結合体を活性化エステル法を用いて作製した。
【００９５】
実施例１で作製したクロルフェナピルハプテン０．２ｍｍｏｌをＤＭＦ １．０ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド０．２ｍｍｏｌ及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド０．２ｍｍｏｌを加え、室温で３．５時間撹拌した。反応後、１００００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清と沈殿に分離した。
【００９６】
一方、ＢＳＡ ５０ｍｇを１４５ｍＭ ＮａＣｌ−０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２：以下「ＰＢＳ」と言う）５．０ｍｌに溶解し、ＤＭＦ １．０５ｍｌを加えた溶液を調製しておき、この溶液に上記の上清０．２５ｍｌを加え、４℃にて１６時間反応させた。反応後、蒸留水にて４℃で透析し、クロルフェナピルとＢＳＡとの結合体（以下、「クロルフェナピルハプテン／ＢＳＡ結合体」と言う）を調製した。以降、免疫用抗原として用いた。
【００９７】
また、同様の方法を用いて、クロルフェナピルハプテンとＲＳＡとの結合体（以下、「クロルフェナピルハプテン／ＲＳＡ結合体」と言う）、および、クロルフェナピルハプテンとＨＲＰとの結合体との結合体（以下、「クロルフェナピルハプテン／ＨＲＰ結合体」と言う）も作製した。
実施例３ 免疫感作
免疫にはＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例２で作製したクロルフェナピルハプテン／ＢＳＡ結合体１００μｇをＰＢＳ ５０μｌに溶解し、等量のフロイント完全アジュバンドと混合して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に接種した。さらに、４週間後にフロイント不完全アジュバンドを用いて前記と同様に調製した免疫用抗原を追加免疫した。また、６週間目に１８０μｌのＰＢＳに溶解したクロルフェナピルハプテン／ＢＳＡ結合体３０μｇをマウス尾静脈より追加免疫した。
実施例４ 抗血清のクロルフェナピルに対する反応性
実施例３におけるマウス尾静脈への接種直前、採血した抗血清を希釈調製して、以下に詳述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法にてクロルフェナピルを測定し、抗血清を評価した。
【００９８】
免疫用抗原と同様に、実施例２で調製したクロルフェナピルハプテン／ＲＳＡ結合体の溶液（０．５μｇ／ｍＬ）を５０μｌ／ウェルの量で９６ウェルマイクロプレートにコーティングし（２５ｎｇ／５０μｌ／ウェル）、４倍希釈したブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）でブロッキングしてアッセイ用プレートを作製した。次いで、抗血清１００００倍希釈液と、各種濃度のクロルフェナピルを含む２０％メタノール溶液とを等量混合し、その５０μＬを各ウェルに入れ、室温で１時間反応させた。
【００９９】
ＰＢＳで洗浄した後に、１０倍希釈のブロックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔａｇｏ社製）を５０μｌ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後に、２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ及び０．０２％の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌ／ウェルの量で加え、室温にて１０分間反応させて発色させた。
【０１００】
次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で加えて反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果の一例を表２に示す。
【０１０１】
【表２】

【０１０２】
表２より、クロルフェナピル１０００ｎｇ／ｍｌにおいて阻害反応が認められたことから、用いた抗血清はクロルフェナピルに対して反応性があることが確認された。
実施例５ ハイブリドーマの作製
実施例３に続いて、血清中の抗クロルフェナピル抗体活性が高くなったマウスの脾細胞と、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４）とを山下修二らの方法（組織細胞化学：日本組織細胞化学会編：学際企画．１９８６年）に従ってポリエチレングリコール法により融合し、培養した。実施例４と同様の方法でコーティング及びブロッキングしたプレートに細胞の増殖が認められた培養上清液をそれぞれ５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させた。
【０１０３】
ＰＢＳで洗浄した後、１０倍希釈のブロックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇｏ社製）を５０μｌ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後に、２ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ及び０．０２％の過酸化水素を含む０．１Ｍ クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌ／ウェルの量で加え、室温にて１０分間発色させた。
【０１０４】
次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で加えて、反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定し、反応性を示す細胞（ハイブリドーマ）を選抜した。次に、各ウェルのクロルフェナピルとの反応性を実施例４に記載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で調べ、目的の抗体を産生している細胞について限界希釈法によりクローニングを行った。その結果、数株のハイブリドーマが抗クロルフェナピル抗体を産生する細胞としてクローン化された。そのうちの４２Ｅ１−１−１を平成１１年３月１６日に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７３１１で、工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５ー００４６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。
実施例６ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるクロルフェナピルの測定
実施例５で得られたハイブリドーマ４２Ｅ１−１−１をマウスの腹腔に移植し、１０日ないし１５日後に得られた腹水を採取し、アフィニティークロマトグラフィーによりモノクローナル抗体４２Ｅ１−１−１を精製した。（以降、モノクローナル抗体は、これらを産生するハイブリドーマと同一の名称を用いる。）この４２Ｅ１−１−１抗体を用いて、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法にてクロルフェナピルの量を測定した。
【０１０５】
上記の４２Ｅ１−１−１抗体溶液（１０μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルの量で９６ウェルマイクロプレートに入れ、４℃で一晩静置してコーティングし、さらに４倍希釈のブロックエース（雪印乳業社製）でブロッキングを行い、アッセイ用のプレートを作製した。各濃度のクロルフェナピルを含む２０％メタノール溶液及び実施例２で作製したクロルフェナピルハプテン／ＨＲＰ結合体を含むＰＢＳ溶液の等量混合液を５０μｌずつ各ウェルに入れ、２５℃で１．５時間反応させた。
【０１０６】
反応後、ＰＢＳで洗浄した後、２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ及び０．０２％の過酸化水素を含むクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μＬずつ各ウェルに入れ、室温で１０分間静置して発色反応を行った。
【０１０７】
次に、１Ｎ硫酸を５０μＬずつ各ウェルに加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。この結果を図１に示した。この直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いると、本発明のモノクローナル抗体４２Ｅ１−１−１は、クロルフェナピルを０．００５ｎｇ／ｍｌないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲で測定することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体４２Ｅ１−１−１の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるクロルフェナピルの測定を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention relates to a hapten compound of 4-bromo-2- (4-chlorophenyl) -1-ethoxymethyl-5-trifluoromethylpyrrole-3-carbonitrile (hereinafter referred to as “chlorfenapyr” herein), an antigen Antibodies andCan bind to antigenAbout that fragment.
[0002]
  The present invention further includes the antigen, antibody andCan bind to antigenThe present invention relates to an immunological measurement method using the fragment.
[0003]
[Prior art]
Chlorfenapyr has the following formula (2):
[0004]
[Chemical Formula 3]

[0005]
It is a phenylpyrrole insecticide having a structure represented by
More specifically, chlorfenapyr is a novel skeletal compound having a pyrrole ring synthesized based on dioxapyrrolomycin produced by Streptomyces fumanus. Lepidopterous insects such as southern armyworm (Spodoptera eridiania), Tobacco budworm (Heliothis virescens), etc .; It is active on a broad spectrum of pests and spider mites, such as rust mites and dust mites. 125-500 g against these pests in cotton, vegetables, fruit trees a. i. Effective with / ha. On the other hand, the insecticidal activity against one species of predatory mite, which is a natural enemy of spider mites (Metaseiusulus occidentalis), is considerably lower than the insecticidal activity against spider mites, and is considered to have little practical adverse effects.
[0006]
Chlorfenapyr has transdermal activity and oral activity, but oral activity is stronger at least against lepidopterous pests. In addition, the fast-acting properties are inferior to those of organophosphorus agents and pyrethroid agents, but have moderate residual effects. There is no cross-resistance with existing agents, such as soybeanlooper (Pseudoplusia inclusions) and tobacco budworm, which are resistant to pyrethroids, exhibiting the same activity as sensitive strains. In Japan, it is also known to have a high control effect against hard-to-control pests such as Japanese black moth, Spodoptera litura, Shirochimojiyotou, Minami-kiiro-Thamima, Nami-Tani, and Kanzawa-tick. The mechanism of action is uncoupling of oxidative phosphorylation in mitochondria (Development of new pesticides page 71 and pages 76-78, November 28, 1997, issued by CMC Co., Ltd.).
[0007]
In recent years, there has been great social interest in residues of pesticide residues in the environment such as soil, water, and the atmosphere, and post-harvest pesticides of imported agricultural products that have recently increased especially. For chlorfenapyr, the Pesticide Registration Reservation Standard Value by the Environment Agency is, for example, 0.5 ppm for tangerines, 1 ppm for second large fruits, 0.2 ppm for small fruits, 1 ppm for second fruits, 1 ppm for first fruits 3 ppm for second leafy vegetables, 0.1 ppm for roots and stems, 0.5 ppm for sugar beet, 50 ppm for tea, etc. (Revised 3rd edition Pesticide Registration Retention Standard Handbook, pages 258-260, September 25, 1998) Issued by Nikkan Chemical Daily). Therefore, in order to ensure safety related to the environment and food, it is necessary to quickly and accurately measure the amount of chlorfenapyr contained therein.
[0008]
Conventionally, for example, chlorfenapyr in agricultural crops has been extracted from fruits, vegetables, tea, etc., purified, and then analyzed by gas chromatography (GC). That is, for example, a method is used in which a sample is extracted with acetone, dissolved in hexane, purified by magnesium silicate column chromatography using hexane-diethyl ether as a solvent, and then measured by GC. These methods have problems that sample preparation is complicated, requires a lot of procedures and time, requires skill in analysis, and requires high costs for measuring devices and equipment. The measurement of chlorfenapyr needs to produce an analysis result of a huge number of samples in a short time, and there is a demand for a new measurement method that is not only accurate but also simple, quick, and economical.
[0009]
The immunological measurement method is a method of detecting an antigen or antibody based on an antigen-antibody reaction in which the antibody specifically recognizes the antigen, and has recently attracted attention due to its excellent accuracy, simplicity, speed and economy. Have gathered. In immunological measurement methods, a great variety of labels, such as enzymes, radioactive tracers, chemiluminescent or fluorescent materials, metal atoms, sols, latexes, and bacteriophages have been applied as detection methods.
[0010]
Among immunological measurement methods, an enzyme immunoassay method (EIA) using an enzyme has been widely used as being particularly excellent in terms of economy and convenience. An excellent review of enzyme immunoassays is in Tijssen P, “Practice and theory of enzyme immunoassays” in Laboratories in Biotechnology, Biotechnology, Biotechnology, Biotechnology, Biotechnology, Biotechnology, Biotechnology, Biotechnology, and Biochemistry. Has been.
[0011]
In general, for a molecule having a large molecular weight, an antibody that recognizes an antigen can be produced by inducing an appropriate immune response by inoculating an animal without further modification. However, low molecular weight compounds such as chlorfenapyr usually cannot elicit an immune response when inoculated into animals. These molecules act as a group of epitopes for the first time by binding to an immunogenic macromolecular compound and cause an immune response in the presence of T cell receptors, resulting in the production of antibodies by a group of B lymphocytes. Is done. Molecules that generate immunogenicity only after binding to a polymer compound are collectively called “hapten”.
[0012]
However, even when an antigen obtained by binding a low molecular weight compound to a high molecular weight compound is used as an antigen, the obtained antibody often does not recognize the desired molecule or has a very low affinity. Therefore, in general, it is necessary to use a hapten that is not a low-molecular compound itself, but a spacer arm (bonding hand) introduced together with a functional group that can be used for bonding. However, in such a case, a preferable antibody cannot be obtained unless an antibody that has been appropriately introduced in consideration of all the problems such as bond / functional group arrangement and bond size is used. Appropriate introduction must be devised for each individual molecule.
[0013]
For chlorfenapyr, the necessity thereof was very high, but a hapten for producing such an antibody was not obtained before the present invention as well as an appropriate antibody.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
  The present invention provides a novel antibody that reacts with chlorfenapyr orCan bind to antigenIt is an object of the present invention to provide a fragment thereof and a production method thereof. In the present specification, the “fragment” of an antibody refers to a part of an antibody capable of binding to an antigen, such as F_abMeans a fragment.
[0015]
In one aspect thereof, the present invention provides a monoclonal antibody reactive to chlorfenapyr.
Another object of the present invention is to provide a hapten compound constituting an antigen for producing a novel antibody reactive to chlorfenapyr.
[0016]
  Another object of the present invention is to provide a conjugate of a chlorfenapyr hapten and a polymer compound.
  The present invention further provides the antibody orCan bind to antigenIt aims at providing the hybridoma which produces the fragment.
[0017]
Another object of the present invention is to provide a method for immunologically measuring chlorfenapyr, which comprises using the antibody or a fragment thereof and / or a conjugate of the chlorfenapyr hapten and a polymer compound.
[0018]
[Means for Solving the Problems]
As a result of extensive research, the present inventors have used a chlorfenapyr derivative or a chlorfenapyr derivative in which a functional group that can be used for bonding with a spacer arm and a polymer compound is introduced as a hapten. The present inventors have succeeded in obtaining an antibody having reactivity, and have completed the present invention.
[0019]
The chlorfenapyr that is the subject of the present invention is the following formula (2):
[0020]
[Formula 4]

[0021]
It is a compound which has a structure represented by these.
The antibody of the present invention can be obtained, for example, by using, as an antigen, a derivative in which a spacer arm and a functional group that can be used for conjugation are introduced into a chlorfenapyr moiety as a hapten and bound to an appropriate polymer compound. For example, the following formula (1):
[0022]
[Chemical formula 5]

[0023]
[In Formula (1),
A¹Or A^ThreeMay be the same or different and are halogen atoms consisting of F, Cl, Br and I, CN, CF_ThreeAnd a group consisting of alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms;
A^FourIs a halogen atom selected from F, Cl, Br or I; and m is an integer from 1 to 10]
A compound having the structure represented by is used as a hapten for antibody production.
[0024]
In formula (1), preferably A¹Is CN and A²Is Br and A^ThreeIs CF_ThreeAnd A^FourIs Cl. Preferably m is 5.
The present invention relates to the hapten compound, a conjugate of a hapten compound and a polymer compound, an antibody that reacts with chlorfenapyr and a method for producing the same, and an immunological measurement method for chlorfenapyr using the hapten compound or the antibody.
Preparation of chlorfenapyr hapten
The chlorfenapyr hapten represented by the formula (1) can be produced according to a known method. Although it does not necessarily limit, the following methods can be used, for example.
[0025]
For example, A²Is a halogen atom selected from F, Cl, Br or I, first, the following formula (Z1):
[0026]
[Chemical 6]

[0027]
[In the formula (Z1), A¹, A^ThreeAnd A^FourIs as defined above]
In the presence of a condensing agent in an organic solvent, a compound having the structure represented by the following formula (Z2):
[0028]
[Chemical 7]

[0029]
[In the formula (Z2),
X is a halogen atom selected from F, Cl, Br or I;
P is a carboxyl protecting group; and
m is as defined above]
Is reacted with a compound having the structure represented by the following formula (Z3):
[0030]
[Chemical 8]

[0031]
[In the formula (Z3), A¹, A^Three, A^Four, P and m are as defined above]
A compound having a structure represented by is synthesized.
The compound of formula (Z1) can be synthesized according to a known method, for example, according to the description in Examples 56 and 57 of JP-A-1-135701.
[0032]
The protecting group for the carboxyl group of P may be a known one. Specific examples include, for example, methyl group, ethyl group, tert-butyl group, benzyl group, p-methoxybenzyl group, 3,4-dimethoxybenzyl group, trichloroethyl. Group, trimethylsilyl group, tert-butyldimethylsilyl group, tert-butyldiphenylsilyl group, triethylsilyl group, triisopropylsilyl group, trimethylsilylethyl group and the like.
[0033]
Examples of the organic solvent for synthesizing the compound of formula (Z3) include N.I. N-dimethylformamide, benzene, toluene, xylene, chloroform, carbon tetrachloride, tetrahydrofuran, dioxane, acetone, acetonitrile, dimethyl sulfoxide and the like can be used. As the condensing agent, sodium hydride, sodium, sodium methylate, sodium ethylate and the like can be used.
[0034]
The reaction is carried out at a temperature between 0 ° C. and the boiling point of the solvent, preferably 80 ° C. to 150 ° C., for 10 minutes to 15 hours, preferably 1 hour to 5 hours.
Subsequently, by removing the protecting group of the carboxyl group represented by P from the compound of the formula (Z3), the following formula (Z4):
[0035]
[Chemical 9]

[0036]
[In the formula (Z4), A¹, A^Three, A^FourAnd m are as defined above]
A compound having a structure represented by is synthesized.
The removal of the protective group for the carboxyl group can be carried out by a known method such as alkali hydrolysis or acid hydrolysis.
[0037]
That is, in the case of alkaline hydrolysis, the compound of the formula (Z3) is preferably dissolved in an organic solvent such as methanol, ethanol, tetrahydrofuran, ethylene glycol, and then sodium bicarbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, lithium hydroxide, An aqueous solution such as sodium hydroxide or potassium hydroxide is added, and the mixture is reacted by stirring at 0 ° C. to the boiling point of the solvent, preferably 0 ° C. to 50 ° C., for 5 minutes to 10 hours, preferably 30 minutes to 2 hours. Can be obtained.
[0038]
In the case of acid hydrolysis, the compound of the formula (Z3) is preferably dissolved in an organic solvent such as acetic acid, formic acid, benzene, dichloromethane, 1,2-dichloroethane, and then hydrochloric acid, sulfuric acid, diethyl boron trifluoride. Add an ether complex, trifluoroacetic acid, trifluoromethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, etc., from 0 ° C. to the boiling point of the solvent, preferably 0 ° C. to 50 ° C., 5 minutes to 10 hours, preferably 1 hour to 5 hours The compound of the formula (Z4) can be obtained by stirring reaction.
[0039]
Further, when P is a benzyl group, the removal can also be performed by hydrogenolysis with hydrogen.
Furthermore, when P is a group containing a silyl atom, deprotection can also be performed with a reagent that generates a fluorine anion such as tetra-n-butylammonium fluoride or pyridinium fluoride.
[0040]
Further, by reacting the compound of the formula (Z4) with a halogenating agent such as chlorine, bromine, sulfuryl chloride, N-bromosuccinimide in an organic solvent or without solvent, A²A compound of formula (1) can be obtained wherein is a halogen atom selected from Cl or Br.
[0041]
As the organic solvent, acetic acid, carbon tetrachloride, chloroform, dioxane, tetrahydrofuran or the like can be used, and the reaction can be promoted by using a catalyst such as iron powder or aluminum chloride. The reaction is carried out at a temperature from 0 ° C. to the boiling point of the solvent, preferably from room temperature to 150 ° C., for 10 minutes to 50 hours, preferably 5 hours to 20 hours.
[0042]
A²A compound of the formula (1) in which is other than a halogen atom can be similarly synthesized using a known method.
The compound obtained by the production method as described above can be made into a purified product with higher purity by performing silica gel chromatography or recrystallization operation as necessary.
[0043]
Hereinafter, the preparation of the antigen and antibody of the present invention and the immunochemical measurement method will be described. These preparations can be carried out according to known methods, for example, methods described in secondary biochemistry experimental courses, immunobiochemical research methods (edited by the Japanese Biochemical Society) and the like.
Preparation of conjugates of chlorfenapyr hapten and polymer compound
The chlorfenapyr hapten synthesized as described above is bound to an appropriate polymer compound and then used as an immunization antigen or a solid phase antigen.
[0044]
Examples of preferable polymer compounds include mussel hemocyanin (hereinafter referred to as “KLH”), ovalbumin (hereinafter referred to as “OVA”), bovine serum albumin (hereinafter referred to as “BSA”), rabbit serum albumin. (Hereinafter referred to as “RSA”). KLH and BSA are preferred.
[0045]
The bond between chlorfenapyr hapten and the polymer compound is, for example, an activated ester method (AE KARU et al .: J. Agric. Food Chem. 42 301-309 (1994)) or a mixed acid anhydride method ( BF Erlanger et al .: J. Biol. Chem. 234 1090-1094 (1954)) and the like.
[0046]
In general, the activated ester method can be carried out as follows. First, a hapten compound is dissolved in an organic solvent and reacted with N-hydroxysuccinimide in the presence of a coupling agent to produce an N-hydroxysuccinimide activated ester.
[0047]
As the coupling agent, a common coupling agent commonly used in condensation reactions can be used, and examples thereof include dicyclohexylcarbodiimide, carbonyldiimidazole, and water-soluble carbodiimide. Examples of the organic solvent include dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as “DMSO”), N, N-dimethylformamide (hereinafter referred to as “DMF”), dioxane, and the like. The molar ratio of the hapten compound and N-hydroxysuccinimide used in the reaction is preferably 1:10 to 10: 1, more preferably 1: 1 to 1:10, most preferably 1: 1. The reaction temperature is 0 ° C to 100 ° C, preferably 5 ° C to 50 ° C, more preferably 22 ° C to 27 ° C, and the reaction time is 5 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 6 hours, more preferably 1 hour to 2 hours. It's time.
[0048]
After the coupling reaction, when the reaction solution is added to the solution in which the polymer compound is dissolved and reacted, for example, when the polymer compound has a free amino group, an acid amide bond is formed between the amino group and the carboxyl group of the hapten compound. Generated. The reaction temperature is 0 ° C. to 60 ° C., preferably 5 ° C. to 40 ° C., and the reaction time is 5 minutes to 24 hours, preferably 1 hour to 16 hours, more preferably 1 hour to 2 hours. The reaction product can be purified by dialysis, desalting column or the like to obtain a conjugate of chlorfenapyr hapten and a polymer compound.
[0049]
On the other hand, the mixed acid anhydride used in the mixed acid anhydride method is obtained by the reaction of a carboxylic acid and a haloformate ester, and reacts with a polymer compound to obtain a target hapten-polymer compound conjugate. Manufactured. This reaction is carried out in the presence of a basic compound. Examples of the basic compound include tributylamine, triethylamine, trimethylamine, N-methylmorpholine, pyridine, N, N-dimethylaniline, DBN, DBU, DABCO and other organic bases, potassium carbonate, sodium carbonate, potassium bicarbonate, carbonate Examples thereof include inorganic bases such as sodium hydrogen. The reaction is usually carried out at minus 20 ° C. to 150 ° C., preferably 0 ° C. to 100 ° C., and the reaction time is 5 minutes to 10 hours, preferably 5 minutes to 2 hours. The reaction between the obtained mixed acid anhydride and the polymer compound is usually carried out at minus 20 ° C. to 100 ° C., preferably 0 ° C. to 50 ° C., and the reaction time is 5 minutes to 10 hours, preferably 5 minutes to 5 hours. is there. The mixed acid anhydride method is generally performed in a solvent. As the solvent, any solvent conventionally used in the mixed acid anhydride method can be used. Specifically, ethers such as dioxane, diethyl ether, tetrahydrofuran and dimethoxyethane, and halogenated compounds such as dichloromethane, chloroform and dichloroethane. Hydrocarbons, aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, aprotic polar solvents such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and hexamethylphosphate triamide Is mentioned. Examples of the haloformate used in the mixed acid anhydride method include methyl chloroformate, methyl bromoformate, ethyl chloroformate, ethyl bromoformate, and isobutyl chloroformate. The ratio of the hapten, the haloformate and the polymer compound used in the method can be appropriately selected from a wide range.
[0050]
In addition, a substance obtained by binding a labeling substance such as an enzyme to chlorfenapyr hapten by the same method as described above can be used in an immunological measurement method. Examples of labeling substances include horseradish peroxidase (hereinafter referred to as “HRP”), enzymes such as alkaline phosphatase, fluorescent substances such as fluorescein isocyanate, rhodamine,³²P,¹²⁵There are radioactive substances such as I and chemiluminescent substances.
Production of polyclonal antibodies
The polyclonal antibody of the present invention can be produced by a conventional method using a conjugate of chlorfenapyr hapten and a polymer compound. For example, a chlorfenapyr hapten / BSA conjugate dissolved in a sodium phosphate buffer (hereinafter referred to as “PBS”) and mixed with Freund's complete or incomplete adjuvant, or an adjuvant such as alum, Can be obtained by immunizing animals. Any animal commonly used in the art can be used as the animal to be immunized, and examples thereof include mice, rats, rabbits, goats and horses.
[0051]
The administration method during immunization may be any of subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, and intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferred. Immunization can be performed once or multiple times at appropriate intervals, preferably at intervals of 1 to 5 weeks.
[0052]
Blood can be collected from the immunized animal, and the serum separated therefrom can be used to evaluate the presence of polyclonal antibodies that react with chlorfenapyr.
In the present invention, an antiserum obtained using a conjugate of chlorfenapyr hapten and a polymer compound as an antigen for immunization can react with chlorfenapyr at a concentration of at least about 1000 ng / ml in an indirect competitive inhibition ELISA method described below (Example 4). .
Production of monoclonal antibodies
The monoclonal antibody of the present invention can be produced by a known method using a conjugate of a chlorfenapyr hapten and a polymer compound.
[0053]
In producing a monoclonal antibody, at least the following working steps are required.
(A) Preparation of a conjugate of a chlorfenapyr hapten and a polymer compound used as an antigen for immunization
(B) Immunity to animals
(C) Blood collection, assay and preparation of antibody producing cells
(D) Preparation of myeloma cells
(E) Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells and selective culture of hybridomas
(F) Screening and cell cloning of hybridomas producing the desired antibody
(G) Preparation of monoclonal antibodies by hybridoma culture or hybridoma transplantation into animals
(H) Measurement of reactivity of prepared monoclonal antibody, etc.
Conventional methods for producing a hybridoma that produces a monoclonal antibody include, for example, Hybridoma Technologies, Cold Spring Harbor Laboratories (Cold Spring Harbor Laboratory, 1980 edition), cytohistochemistry (Shuji Yamashita et al., Japanese tissue cells). Chemistry Association, Interdisciplinary Planning, 1986).
[0054]
Hereinafter, a method for producing a monoclonal antibody against chlorfenapyr of the present invention will be described, but it will be apparent to those skilled in the art that the present invention is not limited thereto.
Steps (a)-(b) can be performed by a method substantially similar to the method described for the polyclonal antibody.
[0055]
The antibody-producing cells in step (c) are lymphocytes, which can generally be obtained from the spleen, thymus, lymph nodes, peripheral blood or combinations thereof, but splenocytes are most commonly used. Therefore, after the final immunization, a site where antibody-producing cells are present, such as the spleen, is removed from a mouse in which antibody production has been confirmed, and spleen cells are prepared.
[0056]
Examples of myeloma cells that can be used in the step (d) include the Balb / c mouse-derived myeloma cell line P3 / X63-Ag8 (X63) (Nature, 256, 495-497 (1975)), P3 / X63-Ag8. U1 (P3U1) (Current Topics. In Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1987)), P3 / NSI-1-Ag 4-1 (NS-1) (Eur. J. Immunol., 6, 511-). 519 (1976)), Sp2 / 0-Ag14 (Sp2 / 0) (Nature, 276, 269-270 (1978)), FO (J. Immuno. Meth., 35, 1-21 (1980)), MPC- 11, X63.653, S194 and other myeloma cell lines, or rat-derived 210. RCY3. Ag 1.2.3. (Y3) (Nature, 277, 131-133, (1979)) can be used.
[0057]
The above-described myeloma cells are subcultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) or Iskov's modified Dulbecco's medium (IMDM) containing fetal bovine serum, and about 1 x 10 on the day of fusion.⁶Ensure the number of cells above.
[0058]
The cell fusion in the step (e) can be performed according to a known method such as the method of Milstein et al. (Methods in Enzymology, 73, 3 (1981)). The method most commonly used at present is a method using polyethylene glycol (PEG). The PEG method is described in, for example, cytohistochemistry, Shuji Yamashita et al. As another fusion method, a method by electrical treatment (electrofusion) can also be employed (Okouchi Eiko et al., Experimental Medicine 5.1315-19, 1987). Other methods can be employed as appropriate. The ratio of the cells used may be the same as in known methods. For example, spleen cells may be used about 3 to 10 times with respect to myeloma cells.
[0059]
Selection of a hybridoma group in which spleen cells and myeloma cells are fused and has acquired antibody secretion ability and proliferation ability can be selected, for example, when a hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase-deficient strain is used as the myeloma cell line. Can be carried out by using a HAT medium prepared by adding hypoxanthine, aminopterin, and thymidine.
[0060]
In the step (f), a part of the culture supernatant containing the selected hybridoma group is taken, and the antibody activity against chlorfenapyr is measured by, for example, the ELISA method described later.
[0061]
Furthermore, cell cloning of a hybridoma that has been found to produce an antibody that reacts with chlorfenapyr by measurement is performed. As this cell cloning method, a method of diluting so that one hybridoma is contained in one well by limiting dilution, “a limiting dilution method”; a method of picking colonies on a soft agar medium; a single cell by a micromanipulator Extraction method: “sorter clone method” in which one cell is separated by a cell sorter can be mentioned. The limiting dilution method is simple and often used.
[0062]
For wells in which the antibody titer is recognized, for example, a clone in which cloning was repeated 1-4 times by the limiting dilution method and the antibody titer was stably obtained is selected as the anti-chlorfenapyr monoclonal antibody-producing hybridoma strain. As the medium for culturing the hybridoma, for example, DMEM or IMDM containing fetal calf serum (FCS) is used. The hybridoma is preferably cultured at, for example, a carbon dioxide concentration of about 5-7% and 37 ° C. (in a 100% humidity incubator).
[0063]
Mass culture for preparing the antibody in the step (g) is performed by a follow fiber type culture apparatus or the like. Alternatively, it is also possible to grow hybridomas in the peritoneal cavity of mice of the same strain (for example, the above-mentioned Balb / c) or Nu / Nu mice and prepare antibodies from ascites fluid.
[0064]
The culture supernatant or ascites fluid obtained from these can be used as an anti-chlorfenapyr monoclonal antibody, but further, dialysis, salting out with ammonium sulfate, gel filtration, lyophilization, etc. are performed, and the antibody fraction is collected and purified. An anti-chlorfenapyr monoclonal antibody can be obtained. Furthermore, when purification is required, it can be carried out by combining conventional methods such as ion exchange column chromatography, affinity chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC).
[0065]
The subclass, antibody titer, and the like of the anti-chlorfenapyr monoclonal antibody obtained as described above can be determined using a known method such as an ELISA method described later.
Measurement of chlorfenapyr with antibodies
Examples of the method for measuring chlorfenapyr using the antibody used in the present invention include radioisotope immunoassay (RIA method), ELISA method (Engvall, E., Methods in Enzymol., 70, 419-439 (1980)), fluorescent antibody Various methods ("hybridoma method and monoclonal antibody", published by R & D Planning Co., Ltd., page 30-53), which are generally used for antigen detection, such as a method, a plaque method, a spot method, an agglutination method, and octalony. Page, March 5, 1982). The ELISA method is widely used from the viewpoints of sensitivity and simplicity.
[0066]
Chlorfenapyr can be measured by the following procedure, for example, by indirect competitive inhibition ELISA among various ELISA methods.
(A) First, a conjugate of a chlorphenapyr hapten, which is an antigen for immobilization, and a polymer compound is immobilized on a carrier.
[0067]
(B) The solid phase surface on which the antigen for immobilization is not adsorbed is blocked with a substance unrelated to the antigen, such as a protein.
(C) A sample containing various concentrations of chlorfenapyr and an antibody are added thereto, and the antibody is allowed to react competitively with the immobilized antigen and chlorfenapyr to obtain an immobilized antigen-antibody complex and chlorfenapyr-antibody complex. Is generated.
[0068]
(D) By measuring the amount of the immobilized antigen-antibody complex, the amount of chlorfenapyr in the sample can be determined from a calibration curve prepared in advance.
In the step (a), the carrier for immobilizing the antigen for immobilization is not particularly limited, and any carrier commonly used in the ELISA method can be used. An example is a 96-well microtiter plate made of polystyrene.
[0069]
In order to immobilize the antigen for immobilization on the carrier, for example, a buffer solution containing the antigen for immobilization may be placed on the carrier and incubated. A well-known thing can be used as a buffer solution, For example, a phosphate buffer solution can be mentioned. The concentration of the antigen in the buffer can be selected from a wide range, but is usually about 0.01 μg / ml to 100 μg / ml, preferably 0.05 μg / ml to 10 μg / ml. When a 96-well microtiter plate is used as a carrier, it is preferably about 20 μl / well to 150 μl / well at 300 μl / well or less. Incubation conditions are not particularly limited, but overnight incubation is usually suitable at about 4 ° C.
[0070]
In addition, as an antigen to be immobilized on a carrier, not only a conjugate of the chlorphenapyl hapten and the polymer compound for which the antibody was produced, but also a conjugate of another hapten represented by the formula (1) and the polymer compound Can also be used as the immobilized antigen. For example, A in Formula (1)¹, A², A^Three, A^FourAlternatively, compounds in which m is different from that for antibody production can be used as the immobilized antigen. Furthermore, other chlorfenapyr-like compounds not included in the formula (1) can be used as the immobilized antigen.
[0071]
(B) Blocking of the process may include a portion on which an antigen (a conjugate of chlorfenapyr hapten and a polymer compound) is solid-phased to which an antibody to be added later can be adsorbed in addition to the chlorfenapyr hapten portion. It is done exclusively to prevent it. As a blocking agent, for example, BSA or skim milk solution can be used. Alternatively, commercially available blocking agents such as Block Ace (“Block-Ace”, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Code No. UK-25B) can also be used. Specifically, for example, but not limited to, a buffer solution containing a blocking agent in a portion where an antigen is immobilized (for example, 85 mM borate buffer solution (pH 8.0) containing 1% BSA and 60 mM NaCl). ] Is added, and the mixture is incubated at about 4 ° C. for 1 to 5 hours, and then washed with a washing solution. Although there is no restriction | limiting in particular as a washing | cleaning liquid, For example, PBS can be used.
[0072]
Next, in step (c), the solid phase antigen-antibody complex and the chlorfenapyr-antibody complex are prepared by bringing the chlorfenapyr-containing sample and the antibody into contact with the solid phased antigen and reacting the antibody with the solid phased antigen and chlorfenapyr. Produces.
[0073]
At this time, as an antibody, an antibody against chlorfenapyr of the present invention is added as a first antibody, and an antibody against a first antibody bound with a labeling enzyme is further added as a second antibody and reacted.
[0074]
The first antibody is dissolved in a buffer and added. Although not limited thereto, the reaction may be carried out at 10 to 40 ° C., preferably about 25 ° C. for about 1 hour. After completion of the reaction, the carrier is washed with a buffer solution to remove the first antibody that has not bound to the immobilized antigen. As the cleaning liquid, for example, PBS can be used.
[0075]
The second antibody is then added. For example, when a mouse monoclonal antibody is used as the first antibody, it is appropriate to use an anti-mouse-goat antibody conjugated with an enzyme (for example, peroxidase or alkaline phosphatase). The first antibody bound to the carrier is preferably reacted with the second antibody diluted so that the final absorbance is preferably 4 or less, more preferably 0.5 to 3.0. A buffer is used for dilution. Although it is not limited, the reaction is performed at room temperature for about 1 hour, and after the reaction, it is washed with a buffer solution. By the above reaction, the second antibody binds to the first antibody. Moreover, you may use the labeled 1st antibody, In that case, a 2nd antibody is unnecessary.
[0076]
Next, in step (d), the amount of chlorfenapyr can be calculated from the calibration curve by adding a chromogenic substrate solution that reacts with the labeling substance of the second antibody bound to the carrier and measuring the absorbance.
[0077]
When peroxidase is used as an enzyme that binds to the second antibody, for example, hydrogen peroxide and 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine or o-phenylenediamine (hereinafter referred to as “OPD”) A chromogenic substrate solution containing can be used. Although not limited thereto, the chromogenic substrate solution is added and allowed to react at room temperature for about 10 minutes, and then the enzyme reaction is stopped by adding 1N sulfuric acid. When 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine is used, the absorbance at 450 nm is measured. If OPD is used, the absorbance at 492 nm is measured. On the other hand, when alkaline phosphatase is used as the enzyme that binds to the second antibody, for example, color is developed using p-nitrophenyl phosphate as a substrate, 2N NaOH is added to stop the enzyme reaction, and the absorbance at 415 nm is measured. The method is suitable.
[0078]
With respect to the absorbance of the reaction solution to which chlorfenapyr is not added, the rate of decrease in the absorbance of the solution that has been added and reacted with the antibody is calculated as the inhibition rate. The concentration of chlorfenapyr in the sample can be calculated using a calibration curve prepared in advance based on the inhibition rate of the reaction solution to which chlorfenapyr of a known concentration is added.
[0079]
Alternatively, chlorfenapyr can also be measured by, for example, a direct competitive inhibition ELISA method using the monoclonal antibody of the present invention as described below.
(A) First, the monoclonal antibody of the present invention is immobilized on a carrier.
[0080]
(B) The surface of the carrier on which the antibody is not immobilized is blocked with a substance unrelated to the antigen, such as a protein.
(C) Separately from the above step, a mixture is prepared by adding an enzyme-bound hapten obtained by binding a chlorfenapyr hapten and an enzyme to a sample containing various concentrations of chlorfenapyr.
[0081]
(D) The mixture is reacted with the antibody-immobilized carrier.
(E) The amount of chlorfenapyr in the sample is determined from a calibration curve prepared in advance by measuring the amount of the immobilized antibody-enzyme linked hapten complex.
[0082]
The carrier for immobilizing the monoclonal antibody in the step (a) is not particularly limited, and those commonly used in the ELISA method can be used, and examples include a 96-well microtiter plate. The monoclonal antibody can be immobilized by, for example, placing a buffer solution containing the monoclonal antibody on a carrier and incubating. The composition and concentration of the buffer can be the same as in the indirect competitive inhibition ELISA method described above.
[0083]
(B) Blocking of the step is because there may be a portion where the chlorfenapyr and the enzyme-linked hapten in the sample to be added later are adsorbed independently of the antigen-antibody reaction in the carrier on which the antibody is immobilized. To prevent this. The blocking agent and the method thereof can be the same as the indirect competitive inhibition ELISA method described above.
[0084]
Preparation of the enzyme-linked hapten used in the step (c) is not particularly limited as long as it is a method of binding chlorfenapyr hapten to the enzyme, and any method may be used. For example, the activated ester method described above can be employed. The prepared enzyme-linked hapten is mixed with a sample containing chlorfenapyr.
[0085]
The hapten to be bound to a labeling substance such as an enzyme is represented not only by the chlorfenapyr hapten itself used for antibody production but also by the formula (1) as in the case of the immobilized antigen in the indirect competitive inhibition ELISA method. It is also possible to use a conjugate of another hapten and a polymer compound as an antigen for labeling competition. For example, A in Formula (1)¹, A², A^Three, A^FourAlternatively, a compound in which m is different from that for antibody production can also be used as an antigen for label competition. Furthermore, other chlorfenapyr-like compounds not included in the formula (1) can also be used as labeled competitive antigens.
[0086]
In the step (d), a sample containing chlorfenapyr and an enzyme-bound hapten are brought into contact with an antibody-immobilized carrier, and a complex of these and the immobilized carrier is produced by a competitive inhibition reaction between chlorfenapyr and the enzyme-bound hapten. Samples containing chlorfenapyr are diluted with an appropriate buffer before use. Although not limited, the reaction is carried out, for example, at room temperature for approximately 1 hour. After completion of the reaction, the carrier is washed with a buffer to remove the enzyme-bound hapten that did not bind to the immobilized antibody. For example, PBS can be used as the cleaning liquid.
[0087]
Furthermore, the amount of chlorfenapyr can be calculated from the calibration curve by adding a chromogenic substrate solution that reacts with the enzyme of the enzyme-bound hapten in the step (e) in the same manner as in the indirect competitive inhibition ELISA method described above.
[0088]
The monoclonal antibody 42E-1-1 of the present invention reacts with chlorfenapyr in a concentration range of about 0.005 ng / ml to 100 ng / ml, preferably 0.05 ng / ml to 10 ng / ml in a direct competitive inhibition ELISA method (implementation). Example 6, FIG. 1).
[0089]
Furthermore, as described above, a hapten different from that for antibody production can be used as a labeled competitive antigen in the direct competitive inhibition ELISA method, and the combination shows unique reactivity in the direct competitive inhibition ELISA method.
Cross-reactivity of antibodies of the invention
The cross-reactivity of the monoclonal antibody of the present invention can be examined by the above-described direct competitive inhibition ELISA method or indirect competitive inhibition method.
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these are not intended to limit the technical scope of the present invention. Those skilled in the art can easily modify and change the present invention based on the description of the present specification, and these are included in the technical scope of the present invention.
[0090]
【Example】
Example 1 Synthesis of chlorfenapyr hapten
[0091]
[Chemical Formula 10]

[0092]
Synthesis of ethyl 6- [2- (4-chlorophenyl) -3-cyano-5-trifluoromethyl-1-pyrrolyl] hexanoate (1)
2- (4-Chlorophenyl) -3-cyano-5-trifluoromethylpyrrole is prepared according to the description in Examples 56 and 57 of JP-A-1-135701, and 2- (4-chlorophenyl) glycine and trifluoroacetic anhydride. More synthesized.
[0093]
A solution of 1.44 g (5.2 mmol) of 2- (4-chlorophenyl) -3-cyano-5-trifluoromethylpyrrole in 20 ml of N, N-dimethylformamide was then added to 0.22 g (5 .8 mmol) was gradually added at room temperature. After stirring for 15 minutes, 1.40 g (6.2 mmol) of ethyl 6-bromohexanoate was added, and the mixture was stirred at 140 ° C. for 4 hours. The reaction mixture was concentrated, and 150 ml of ethyl acetate and 50 ml of water were added to the residue for liquid separation. The ethyl acetate layer was washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated. The residue was purified by column chromatography (n-hexane: ethyl acetate = 5: 1) to obtain 1.60 g (yield 75%) of (1).
Synthesis of 6- [2- (4-chlorophenyl) -3-cyano-5-trifluoromethyl-1-pyrrolyl] hexanoic acid (2)
To a solution of 0.63 g (1.5 mmol) of ethyl 6- [2- (4-chlorophenyl) -3-cyano-5-trifluoromethyl-1-pyrrolyl] hexanoate (1) in 20 ml of ethanol in 15 ml of water A solution of 0.6 g (15 mmol) of sodium hydroxide was added. Stir at room temperature for 1 hour. Ethanol was distilled off under reduced pressure, the residue was acidified with dilute hydrochloric acid, and extracted three times with 50 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated. The residue was purified by silica gel chromatography (n-hexane: ethyl acetate = 3: 1) to obtain 0.27 g (yield 46%) of (2).
Synthesis of 6- [4-bromo-2- (4-chlorophenyl) -3-cyano-5-trifluoromethyl-1-pyrrolyl] hexanoic acid (3)
Stir to a solution of 0.23 g (0.60 mmol) 6- [2- (4-chlorophenyl) -3-cyano-5-trifluoromethyl-1-pyrrolyl] hexanoic acid (2) and 10 mg iron powder in 1 ml acetic acid. Then, 0.29 g (1.8 mmol) of bromine was gradually added at 80 ° C., and further stirred at 80 ° C. for 15 hours. The reaction mixture was concentrated, 5 ml of water was added to the residue, and the mixture was extracted 3 times with 15 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated. The residue was purified by preparative HPLC (acetonitrile: water = 7: 3) to obtain 17 mg (yield 6.0%) of (3).
Melting point: 115-117 ° C
Of the above chlorfenapyr hapten (3)¹Physical property data (chemical shift δ) by H-NMR is shown below.
[0094]
[Table 1]
Table 1
¹H-NMR (DMSO-D₆, 400 MHz) δ
1.05 (2H, m, CH₂), 1.27 (2H, m, CH₂),
1.45 (2H, m, CH₂), 2.05 (2H, t, CH₂),
3.99 (2H, t, CH₂), 7.67 (4H, m, 4Ar: H),
11.97 (1H, s, COOH)
Example 2 Production of antigen for immunization and antigen for screening
As an antigen for immunization and a screening antigen, a conjugate of chlorfenapyr hapten and BSA was prepared using an activated ester method.
[0095]
Dissolve 0.2 mmol of chlorphenapyr hapten prepared in Example 1 in 1.0 mL of DMF, add 0.2 mmol of N-hydroxysuccinimide and 0.2 mmol of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, Stir at room temperature for 3.5 hours. After the reaction, the mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes to separate into a supernatant and a precipitate.
[0096]
On the other hand, a solution prepared by dissolving 50 mg of BSA in 5.0 ml of 145 mM NaCl-0.01 M phosphate buffer (pH 7.2: hereinafter referred to as “PBS”) and adding 1.05 ml of DMF is prepared in advance. 0.25 ml of the supernatant was added to the reaction mixture, and reacted at 4 ° C. for 16 hours. After the reaction, dialyzed against distilled water at 4 ° C. to prepare a conjugate of chlorfenapyr and BSA (hereinafter referred to as “chlorfenapyr hapten / BSA conjugate”). Thereafter, it was used as an antigen for immunization.
[0097]
In addition, using a similar method, a conjugate of chlorfenapyr hapten and RSA (hereinafter referred to as “chlorfenapyr hapten / RSA conjugate”), and a conjugate of a conjugate of chlorfenapyr hapten and HRP (hereinafter “ A chlorfenapyr hapten / HRP conjugate ”was also prepared.
Example 3 Immunization
Balb / c mice were used for immunization. 100 μg of the chlorfenapyr hapten / BSA conjugate prepared in Example 2 was dissolved in 50 μl of PBS, mixed with an equal volume of Freund's complete adjuvant, and inoculated subcutaneously in Balb / c mice. Further, 4 weeks later, the immunization antigen prepared in the same manner as described above was boosted using Freund's incomplete adjuvant. At 6 weeks, 30 μg of chlorfenapyr hapten / BSA conjugate dissolved in 180 μl of PBS was boosted from the tail vein of the mouse.
Example 4 Reactivity of antiserum to chlorfenapyr
Immediately before inoculation to the mouse tail vein in Example 3, the collected antiserum was diluted, and chlorfenapir was measured by the indirect competitive inhibition ELISA method described in detail below to evaluate the antiserum.
[0098]
Similar to the antigen for immunization, a solution of chlorfenapyr hapten / RSA conjugate prepared in Example 2 (0.5 μg / mL) was coated on a 96-well microplate in an amount of 50 μl / well (25 ng / 50 μl / well), A plate for assay was prepared by blocking with 4-fold diluted Block Ace (“Block Ace”, Snow Brand Milk Products, Code No. UK-25B). Next, an equal volume of a 10,000-fold diluted antiserum and a 20% methanol solution containing various concentrations of chlorfenapyr were mixed, and 50 μL thereof was placed in each well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
[0099]
After washing with PBS, peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (manufactured by Tago) diluted 2000-fold with 10-fold diluted Block Ace was added in an amount of 50 μl / well and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 5.0) containing 2 mg / mL OPD and 0.02% hydrogen peroxide was added in an amount of 50 μl / well, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. Color was developed by reacting for a minute.
[0100]
Next, 1N sulfuric acid was added in an amount of 50 μl / well to stop the reaction, and the absorbance at 490 nm was measured. An example of the results is shown in Table 2.
[0101]
[Table 2]

[0102]
From Table 2, since an inhibitory reaction was observed at 1000 ng / ml of chlorfenapyr, it was confirmed that the antiserum used was reactive to chlorfenapyr.
Example 5 Production of hybridoma
Following Example 3, spleen cells of mice with increased serum anti-chlorfenapyr antibody activity and myeloma cells (Sp2 / 0-Ag14) were prepared by the method of Shuji Yamashita et al. Ed .: Interdisciplinary planning. 1986), fused and cultured by polyethylene glycol method. Culture supernatants in which cell growth was observed were added to a plate coated and blocked in the same manner as in Example 4 in an amount of 50 μL / well, and reacted at room temperature for 1 hour.
[0103]
After washing with PBS, peroxidase-conjugated anti-mouse IgG goat antibody (manufactured by Tago) diluted 2000 times using 10-fold diluted Block Ace was added in an amount of 50 μl / well and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 5.0) containing 2 mg / ml OPD and 0.02% hydrogen peroxide was added in an amount of 50 μl / well, and 10 ml at room temperature was added. Color was allowed to develop for a minute.
[0104]
Next, 1N sulfuric acid was added in an amount of 50 μl / well to stop the reaction, the absorbance at 490 nm was measured, and cells (hybridoma) showing reactivity were selected. Next, the reactivity of each well with chlorfenapyr was examined by the indirect competitive inhibition ELISA described in Example 4, and the cells producing the target antibody were cloned by the limiting dilution method. As a result, several strains of hybridomas were cloned as cells producing anti-chlorfenapyr antibody. Of these, 42E1-1-1 was deposited on March 16, 1999 under the deposit number FERM P-17311, Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (1-3 Higashi 1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-0046) Deposited.
Example 6 Measurement of chlorfenapyr by direct competitive inhibition ELISA
The hybridoma 42E1-1-1 obtained in Example 5 was transplanted into the abdominal cavity of a mouse, the ascites obtained 10 to 15 days later was collected, and the monoclonal antibody 42E1-1-1 was purified by affinity chromatography. (Hereafter, the monoclonal antibody uses the same name as the hybridoma producing them.) Using this 42E1-1-1 antibody, the amount of chlorfenapyr was measured by the direct competitive inhibition ELISA method.
[0105]
The above 42E1-1-1 antibody solution (10 μg / ml) was placed in a 96-well microplate in an amount of 50 μl / well, allowed to stand overnight at 4 ° C., coated, and further diluted 4-fold with Block Ace (Snow Brand Milk Products). And the assay plate was prepared. 50 μl of an equal volume mixture of 20% methanol solution containing chlorfenapyr at each concentration and PBS solution containing chlorfenapyr hapten / HRP conjugate prepared in Example 2 was placed in each well and reacted at 25 ° C. for 1.5 hours. .
[0106]
After the reaction, the plate was washed with PBS, 50 μL of citrate-phosphate buffer solution (pH 5.0) containing 2 mg / mL OPD and 0.02% hydrogen peroxide was added to each well and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The color reaction was carried out.
[0107]
Next, 50 μL of 1N sulfuric acid was added to each well to stop the color reaction, and the absorbance at 490 nm was measured. The results are shown in FIG. Using this direct competitive inhibition ELISA method, the monoclonal antibody 42E1-1-1 of the present invention was able to measure chlorfenapyr in the range of 0.005 ng / ml to 100 ng / mL.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the measurement of chlorfenapyr by the direct competitive inhibition ELISA method of the monoclonal antibody 42E1-1-1 of the present invention.

Claims (11)

The following formula (1):

[In Formula (1),
A ¹ to A ³ may be the same or different and are selected from the group consisting of halogen atoms consisting of F, Cl, Br and I, CN, CF ₃ , and alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms. ;
A ⁴ is a halogen atom selected from F, Cl, Br or I; and m is an integer of 1 to 10]
The compound which has a structure represented by these. In the formula (1), ^{A 1} is CN, is ^{A 2} is Br, ^{A 3} is CF _3, a ^{A 4} is Cl, and m is 5 A compound according to claim 1.   A conjugate of the compound according to claim 1 or 2 and a polymer compound or a labeling substance. An antigen is prepared by binding the compound according to claim 1 or 2 and a polymer compound, and by using the antigen, the following formula (2):

An antibody reactive to a compound having the structure represented by formula (2) or a fragment thereof capable of binding to an antigen, wherein the antibody is reactive to the compound having the structure represented by Production method. An antibody produced by using the conjugate of claim 3 as an antigen, or an antibody reactive with the compound of formula (2) or a fragment thereof capable of binding to the antigen . 6. The antibody according to claim 5, which is a monoclonal antibody, or a fragment thereof capable of binding to an antigen . A monoclonal antibody 42E1-1-1, antibodies or fragments thereof capable of binding the antigen according to claim 5 or 6. A hybridoma producing the antibody according to any one of claims 5 to 7.   The hybridoma according to claim 8, which is deposited under the deposit number FERM P-17311. A method for immunological measurement of a compound represented by formula (2), wherein the antibody according to any one of claims 5 to 7 or a fragment thereof capable of binding to an antigen is used.   Furthermore, the immunoassay method of Claim 10 including using the compound of Claim 1 or 2, or the conjugate | bonding of Claim 3.

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